1.Соматический эмбриогенез

Оглавление
1.Соматический эмбриогенез ........................................................................................................... 1
2.Особенности соматического эмбриогенеза у хвойных видов .................................................... 4
Использованные платформы ............................................................................................................ 7
Список использованных источников............................................................................................. 10
1.Соматический эмбриогенез
Соматический
эмбриогенез
определяется
как
многоэтапный
регенерационный процесс, начинающийся с образования эмбриональносуспензорной массы, и далее проходящий через стадии образования эмбрио,
созревания и регенерации ювенильного растения (стадия прорастания)1.
Данный тип клонального микроразмножения характеризуется тем, что
соматические зародыши развиваются асексуально - вне зародышевого мешка из
соматических
клеток
представляет
собой
культивируемых
биполярную
тканей.
структуру,
у
Соматический
которой
зародыш
одновременно
развиваются апексы стебля и корня. Соматические клетки культивируемых
тканей экспланта (зиготические зародыши) при определенных условиях
стимуляции превращаются в зиготоподобные, дающие начало структурам,
которые состоят из длинных асимметричных клеток, деление которых приводит
к образованию эмбриональной трубки и инициали (процесс идентичный
зиготическому эмбриогенезу).
Первое описание соматического эмбриогенеза было проведено Стюардом
в 1957 году. Он наблюдал глобулярные, сердцевидные, торпедовидные стадии
развития соматического зародыша в культуре каллусных клеток моркови. В
настоящее время соматический эмбриогенез используется как один из методов
клонального микроразмножения покрытосеменных и голосеменных растений2.
Согласно Гальперину и Ветхереллу, формирование эмбриоидов в
культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта
дедифференцируются. На этом этапе необходимо в среду ввести ауксины,
которые стимулируют превращение дедифференцированных клеток экспланта
в
эмбриональные.
На
следующей
стадии
происходит
формирование
эмбриоидов из эмбриональных клеток. Для этого следует уменьшить
концентрацию ауксина или полностью исключить его из питательной среды 3.
Фуджимура и Комамине, отмечая ингибирующий эффект ауксина на 2-й
стадии развития соматического зародыша, предлагают два объяснения этому
явлению: нарушение критической концентрации эндогенного ауксина или
изменение
внутриклеточного
градиента
распределения
ауксина4.
В соответствии с рекомендациями Мурасиге при микроразмножении
растений через соматический эмбриогенез необходимо каллус вначале
культивировать
на
питательной
среде,
содержащей
2,4-Д
(2,4-
дихлорфеноксиуксусная кислота). Затем его перенести в среду без ауксина или
содержащую
невысокие
его
концентрации5.
Но имеющиеся на сегодняшний день данные не дают серьезных поводов
для универсальных рекомендаций. Оказалось, что для индукции соматического
эмбриогенеза, в равной степени, как и для индукции органогенеза, у различных
видов растений необходимы разные регуляторы роста.
Например, по Рамаувату и Ариа6, стимуляция бесполого эмбриогенеза в
каллусных клетках эфедры удается только при использовании высоких
концентраций цитокининов. Согласно Лакшмисита и др.7, образование
эмбриоидов в стеблевом каллусе Santalum album можно вызвать введением в
питательную среду гибберелловой кислоты в концентрации 1,44-5,76 мкм. Для
индукции соматического эмбриогенеза в культуре тканей хлопчатника
требуется 0,45 мкм 2,4-Д, а для дифференциации эмбриоидов у некоторых
видов пальм следует вносить 2,4-Д в концентрации 452 мкм.
Развитие зародышеобразных структур начинается с обособления одной из
каллусных клеток, оболочка, которой значительно утолщается. Клетка
обогащается цитоплазмой (становится менее вакуолизированной), ядро ее
увеличивается в объеме, и хроматин собирается в резко очерченные глыбки.
Такая клетка делится, образуя двуклеточный предзародыш, после чего
соматический зародыш развивается по пути аналогичному при половом
размножении.
Зародыши, развившиеся в результате соматического эмбриогенеза,
свободно лежат в полостях, образованных разрушающимися вокруг них
каллусными клетками, и могут быть легко выделены из ткани. Если поместить
такие зародыши на среду без стимуляторов роста, они способны образовать
корневую систему и побег.
У голосеменных растений соматический эмбриогенез был индуцирован
значительно позже, при этом первым представителем, у которого он был
получен, является Picea abies8. У хвойных к настоящему времени соматические
зародыши и растения-регенеранты получены у 16 видов рода Pinus, у 11 видов
рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix,
а также у Pseudotsuga menziesii9. В качестве источника соматических клеток для
индукции
соматического
эмбриогенеза
у
хвойных
используются
мегагаметофиты, зрелые и незрелые зародыши и их отдельные органы
(семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений10, а также сегменты
вегетативных побегов зрелых деревьев11. На этот момент имеется много
фактических данных по изучению морфологических,
физиологических,
цитогистологических и молекулярных особенностей формирования и развития
морфогенных каллусов различного происхождения (эмбриональной массы) у
представителей семейства сосновых1213. Однако до сих пор не разработан
комплексный цитофизиологический подход и не полностью решены те аспекты
фундаментальной проблемы морфогенеза (тотипотентность, детерминация и
компетентность, дифференциация и дедифференциация), которые можно
решить на примере именно соматического эмбриогенеза как модельной
системы. Отсутствуют работы по сравнению цитогистологического статуса
морфогенных (эмбриональной массы) и неморфогенных каллусов различного
происхождения во всей динамике их развития, вплоть до вызревания
соматических зародышей и растений-регенерантов. Далеким от окончательного
решения остается вопрос о сходстве и различии морфогенеза полового и
соматического зародышей в естественных условиях и в культуре in vitro.
Недостаточна
сравнительная
информация
по
анатомии
и
морфологии
проростков, возникших из половых и соматических зародышей. Необходима
разработка способов управления путями соматического эмбриогенеза в
контролируемых условиях культуры in vitro.
2.Особенности соматического эмбриогенеза у хвойных видов
Методы микроклонального размножения через органы, ткани или клетки
разработаны для многих видов растений и находят широкое коммерческое
применение. Однако для многих хвойных видов микроклональное размножение
in vitro пока еще не достигнуто, либо достигнуто, но требует дальнейшей
оптимизации
на
всех
этапах
процесса
для
повышения
темпов
микроразмножения и, следовательно, пока малопригодно для коммерческого
использования14.
На индукцию эмбриогенного отклика влияет несколько факторов:
основные
компоненты
среды,
воздействие
экзогенных
растительных
регуляторов роста, физические условия культивирования.
Ауксины и цитокинины необходимы для индукции и пролиферации
эмбриональной ткани, тогда как развитие ранних соматических зародышей
происходит при изъятии этих компонентов из среды, так как в их присутствии
ткани
новообразованного
зародыша
вновь
могут
подвергнуться
дедифференцировке. Дальнейший рост и развитие ранних соматических
эмбрионов до стадии созревания требует присутствия абсцизовой кислоты15.
Существует много публикаций относительно большого разнообразия в
частотах инициации соматического эмбриогенеза среди различных семейств
хвойных видов16171819.
Считается, что в частоте инициации и морфогенетическом отклике
генотип играет основную роль. Способность к соматическому эмбриогенезу
часто ограничена только несколькими генотипами в пределах вида, сокращая
возможности селекционного отбора. Проблемой, связанной в основном с
древесными видами является использование во многих случаях в качестве
эксплантов только зиготических эмбрионов вместо тканей взрослых деревьев.
Несмотря
на
то,
что
использование
зародышевых
эксплантов
в
микроразмножении не совсем оправдано для селекционного отбора лучших
форм деревьев, (так как полное развитие их генетических потенций
практически неизвестно) выбор в качестве эксплантов зиготических зародышей
позволяет избежать трудностей, возникающих при использовании тканей
взрослого растения20.
Кроме
эмбриональной
генотипа,
в
компетенции
значительной
тип
и
мере
стадия
определяют
развития
степень
экспланта.
Для
большинства видов хвойных, особенно относящихся к роду Pinaceae, незрелые
зиготические
зародыши
являются
лучшим
материалом
для
индукции
соматического эмбриогенеза21.
Выбор в качестве эксплантов зиготических зародышей обусловлен,
прежде всего, требованием наличия ювенильного состояния у исходной
растительной
ткани.
Как
правило,
попытки
культивирования
зрелых
дифференцированных тканей хвойных являются неудачными. Проблема
заключается в том, что выделение какой-либо части ткани экспланта
сопровождается раневой реакцией, следствия которой: продукция летальных
доз фенолов и оксидатов, а также осмотический шок. Всего этого может быть
достаточно для того, чтобы убить эксплант. Кроме того данная ткань не
является ювенильной – это препятствует реализации тотипотентности клетки ее
дифференцировке в культуре ткани. Например, в экспериментах с Pinus oocarpa
и Pinus patula из протопластов клеток формировался только каллус, что
указывает на наличие своего рода «физиологической памяти», унаследованной
от исходных клеток22.
В экспериментах по соматическому эмбриогенезу Pinus strobus было
показано, что степень эмбриональной инициации зависела от стадии развития
зиготического эмбриона. Наибольшая степень инициации отмечена для тех дат
сбора, которые соответствуют пре- и посткливажной стадиям эмбиогенеза, до
выявления лидерного зародыша23. Также, для Picea glauca степень инициации
снижается с 60% для незрелых зародышей, до 10% для зрелых зародышей24.
Таким образом, предпочтительнее вводить в культуру in vitro именно незрелые
зиготические зародыши, хотя это и сопровождается рядом проблем, связанных
с трудностями выделения экспланта, его стерилизацией, высоким процентом
гибели.
Особенный
генетического
интерес
контроля
представляет
соматического
изучение
различных
эмбриогенеза,
осуществлять на всех этапах регенерации растения.
который
ступеней
можно
Использованные платформы
1. Klimaszewska K. Plant regeneration in Stone pine (Pinus pinea L.) by somatic
embryogenesis // Plant Cell Tissue Organ Culture. 2009. V. 98. p. 165–178.
http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11240-009-9549-3?LI=true
2. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза
растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
3. Halperin W., Wetherell D. F. Adventive embryony in tissue cultures of the
wild carrot, Daucus carota // Amer. I. Bot., 1964, 51, № 3, p. 274-283.
http://www.jstor.org/discover/10.2307/2440296?uid=2597744&uid=3738936&
uid=2&uid=3&uid=2597160&uid=5911272&uid=67&uid=62&sid=21101515
85256
4. Fujimura T., Komamine A. Involvement of endogenous auxin in somatic
embryogenesis in a carrot cell suspension culture // Ztschr. Pflanzenphysiol.,
1979, 95, № 1, p. 13-19.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044328X79800239
5. Murashige T. Clonal clops through tissue culture: Plant Tissue Cult. and Its
Bio-technol. Appl., B. etc.: Spring. – Verl., 1977, p. 392-403.
6. Ramawat K. G., Arya H. C. Growth and morphogenesis in callus cultures of
Ephedra gerardiona // Phytomorphology, 1976, 26, № 4, p. 395-403.
7. Lakshmi S. G., Raghava Ram N. V., Vaidyanathan C. S. Differentiation of
embryoids and plantlets from shoot callus of sandalwood. // Plant Sci Lett.,
1979, 15, № 3, p. 265-270.
8. Chalupa W. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured
immature and mature embryos of Picea abies (L.) // Karst. Com. Inst. For.
Cech. 1985. V. 14. p. 57-63.
9. Klimaszewska K., Cyr D. R. Conifer somatic embryogenesis: I. Development
//
Dendrobiology.
2002.
V.
48.
p.
31-39.
http://www.idpan.poznan.pl/index.php/content/-vol-48/361-4831-39.html
10.Lelu M. A., Klimaszewska M. A., Charest P. J. Somatic embryogenesis from
immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and 45 needles of
somatic plantlets of Larix // Can. J. For. Res. 1994. V. 24. № 1. p. 100-106.
11.Malabadi R. B., Van Staden J. Somatic embryogenesis from vegetative shoot
apices of mature trees of Pinus patula // Tree Physiology. 2005. V. 25. p. 1116. http://treephys.oxfordjournals.org/content/25/1/11.short
12.Белорусова А. С., Третьякова И. Н. Особенности формирования
соматических зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические
аспекты // Онтогенез. 2008. – Т. 39. - №2. – С. 1-10.
13.Третьякова И. Н., Ижболдина М. В. Особенности роста эмбриогенного
каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского //
Хвойные бореальной зоны. – 2008.
http://forest-culture.narod.ru/HBZ/Stat_08_1-2/tretyakova.pdf
14.Bonga J. M., Klimaszewska K. K., von Aderkas P. Recalcitrance in clonal
propagation, in particular of conifers // Plant Cell Tiss Organ Cult. 2009. V.
100. P. 241–254.
http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11240-009-9647-2?LI=true
15.Von Arnold S, Sabala I., Bozhkov P. et al. Developmental pathways of somatic
embryogenesis // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2002. V. 69. P. 233–249.
http://link.springer.com/article/10.1023/A%3A1015673200621
16.Cheliak WM, Klimaszewska K. Genetic variation in somatic embryogenic
response in open-pollinated families of black spruce // Theor Appl Genet.
1991. V. 82. P. 185–190.
http://link.springer.com/article/10.1007/BF00226211
17.Garin E., Isabel N., Plourde A. Screening of large numbers of seed families of
Pinus strobus L. for somatic embryogenesis from immature and mature zygotic
embryos // Plant Cell Rep. 1998. V. 18. P. 37–43.
http://link.springer.com/article/10.1007/s002990050528
18.Miguel C., Goncalves S., Tereso S. et al. Somatic embryogenesis from 20
open-pollinated families of Portuguese plus trees of maritime pine // Plant Cell
Tissue
Organ
Cult.
2004.
V.
76.
P.
121–130.
http://link.springer.com/article/10.1023%2FB%3ATICU.0000007253.91771.e
3?LI=true
19.Pullman G.S., Johnson S. Somatic embryogenesis in loblolly pine (Pinus taeda
L.): improving culture initiation rates // Ann Sci. 2002. V. 59. P. 663–668.
http://link.springer.com/article/10.1007/s00299-003-0673-y
20.Bonga JM, von Aderkas P. In vitro culture of trees // Kluwer Academic
Publishers, 1992.
http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-84175-0_12
21.Lelu-Walter MA, Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Simplified and
improved somatic embryogenesis for clonal propagation of Pinus pinaster
(Ait) // Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 767–776.
http://link.springer.com/article/10.1051/forest/2008079
22.Attree S.M., Dunstan D.I., Fowke L. Initiation of embryogenic callus and
suspension cultures, and improved embryo regeneration from protoplasts of
white spruce (Picea glauca) // Can J Bot. 1989. V. 67. P. 1790–1795.
http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b89-227#.UNmQSezF83o
23.Finer J.J., Kriebel H.B., Becwar M.R. Initiation of embryogenic callus and
suspension cultures of eastern white pine (Pinus strobus L) // Plant Cell Rep.
1989. V. 8. P. 203–206.
http://link.springer.com/article/10.1007%2FBF00778532?LI=true
24.Park Y.S. Implementation of conifer somatic embryogenesis in clonal forestry:
technical requirements and deployment considerations // Ann For Sci. 2002. V.
59. P. 651–656.
http://www.afs-journal.org/articles/forest/abs/2002/05/24/24.html
Список использованных источников
1. Klimaszewska K. Plant regeneration in Stone pine (Pinus pinea L.) by somatic
embryogenesis // Plant Cell Tissue Organ Culture. 2009. V. 98. p. 165–178.
2. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза
растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
3. Halperin W., Wetherell D. F. Adventive embryony in tissue cultures of the wild
carrot, Daucus carota // Amer. I. Bot., 1964, 51, № 3, p. 274-283.
4. Fujimura T., Komamine A. Involvement of endogenous auxin in somatic
embryogenesis in a carrot cell suspension culture // Ztschr. Pflanzenphysiol., 1979,
95, № 1, p. 13-19.
5. Murashige T. Clonal clops through tissue culture: Plant Tissue Cult. and Its Biotechnol. Appl., B. etc.: Spring. – Verl., 1977, p. 392-403.
6. Ramawat K. G., Arya H. C. Growth and morphogenesis in callus cultures of
Ephedra gerardiona // Phytomorphology, 1976, 26, № 4, p. 395-403.
7. Lakshmi S. G., Raghava Ram N. V., Vaidyanathan C. S. Differentiation of
embryoids and plantlets from shoot callus of sandalwood. // Plant Sci Lett., 1979, 15,
№ 3, p. 265-270.
8. Chalupa W. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured
immature and mature embryos of Picea abies (L.) // Karst. Com. Inst. For. Cech.
1985. V. 14. p. 57-63.
9. Klimaszewska K., Cyr D. R. Conifer somatic embryogenesis: I. Development //
Dendrobiology. 2002. V. 48. p. 31-39.
10. Lelu M. A., Klimaszewska M. A., Charest P. J. Somatic embryogenesis from
immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and 45 needles of
somatic plantlets of Larix // Can. J. For. Res. 1994. V. 24. № 1. p. 100-106.
11. Malabadi R. B., Van Staden J. Somatic embryogenesis from vegetative shoot
apices of mature trees of Pinus patula // Tree Physiology. 2005. V. 25. p. 11-16.
12. Белоруссова А. С., Третьякова И. Н. Особенности формирования
соматических зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические
аспекты // Онтогенез. 2008. – Т. 39. - №2. – С. 1-10.
13. Третьякова И. Н., Ижболдина М. В. Индукция соматического эмбриогенеза
у кедра сибирского // Хвойные бореальной зоны. – 2008.
14. Bonga J. M., Klimaszewska K. K., von Aderkas P. Recalcitrance in clonal
propagation, in particular of conifers // Plant Cell Tiss Organ Cult. 2009. V. 100. P.
241–254.
15. Von Arnold S, Sabala I., Bozhkov P. et al. Developmental pathways of somatic
embryogenesis // Plant Cell Tissue Organ Cult. 2002. V. 69. P. 233–249.
16. Cheliak WM, Klimaszewska K. Genetic variation in somatic embryogenic
response in open-pollinated families of black spruce // Theor Appl Genet. 1991. V.
82. P. 185–190.
17. Garin E., Isabel N., Plourde A. Screening of large numbers of seed families of
Pinus strobus L. for somatic embryogenesis from immature and mature zygotic
embryos // Plant Cell Rep. 1998. V. 18. P. 37–43.
18. Miguel C., Goncalves S., Tereso S. et al. Somatic embryogenesis from 20 openpollinated families of Portuguese plus trees ofmaritime pine // Plant Cell Tissue
Organ Cult. 2004. V. 76. P. 121–130.
19. Pullman G.S., Johnson S. Somatic embryogenesis in loblolly pine (Pinus taeda
L.): improving culture initiation rates // Ann Sci. 2002. V. 59. P. 663–668.
20. Bonga JM, von Aderkas P. In vitro culture of trees // Kluwer Academic
Publishers, 1992.
21. Lelu-Walter MA, Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Simplified and improved
somatic embryogenesis for clonal propagation of Pinus pinaster (Ait) // Plant Cell
Rep. 2006. V. 25. P. 767–776.
22. Attree S.M., Dunstan D.I., Fowke L. Initiation of embryogenic callus and
suspension cultures, and improved embryo regeneration from protoplasts of white
spruce (Picea glauca) // Can J Bot. 1989. V. 67. P. 1790–1795.
23. Finer J.J., Kriebel H.B., Becwar M.R. Initiation of embryogenic callus and
suspension cultures of eastern white pine (Pinus strobus L) // Plant Cell Rep. 1989.
V. 8. P. 203–206.
24. Park Y.S. Implementation of conifer somatic embryogenesis in clonal forestry:
technical requirements and deployment considerations // Ann For Sci. 2002. V. 59. P.
651–656.