Влияние микрорельефа верхового торфяника на структуру и функции бактериальных сообществ
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. Ломоносова ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ кафедра биологии почв Влияние микрорельефа верхового торфяника на структуру и функции бактериальных сообществ INFLUENCE OF MICRORELIEF PEATBOG ON THE STRUCTURE AND FUNCTIONS OF BACTERIAL COMMUNITIES Дипломная работа студентки пятого курса Юрченко Е. Н. Научные руководители: к.б.н., в.н.с. Добровольская Т. Г. к.б.н., н.с. Якушев А. В. Оппонент: к.б.н.,с.н.с. Семёнова Т. А. лаборатория экологических функций почв ИПЭЭ РАН им. А. Н.Северцова Москва 2015 1 Оглавление Введение........................................................................................3 I. Обзор литературы 1. Микрорельеф верховых болот……………………………….5 2. Структура и функции бактериальных сообществ верховых торфяников………………………….......................................11 II. Объекты и методы 1.Объекты………………………………………………………..25 2. Методы………………………………………………………...27 III. Результаты и обсуждение 1. Распределение численности бактерий по профилю торфяников…………………………………………………...32 2. Таксономическая структура бактериальных сообществ в разных элементах микрорельефа ………………………….34 3. Характеристика доминирующих таксонов бактерий..........36 4. Оценка физиологического разнообразия бактерий гидролитического блока в очёсе сфагнума на кочке и в микропонижении……………………………………………….39 Заключение ……………………………………………………......45 Выводы ……………………………………………………….........48 Список литературы………………………………………………..49 2 Введение Верховые болота на территории нашей страны по площади и запасам торфа преобладают над всеми другими типами болот. Верховые торфяники, обладая высокими запасами жизнеспособной микробной биомассы, характеризуются низкими темпами минерализации торфа. Анализ причин медленной деструкции торфа изложен в монографии сотрудников нашего факультета. Однако следует обратить внимание на малоизученную, интересную особенность структуры верховых торфяников, сложившуюся в процессе их образования и заключающуюся в формировании различных форм микрорельефа – кочек, ровных поверхностей и микропонижений. Если почвоведами описаны и изучены свойства и определён возраст торфа в этих отложениях, то микробиологи не изучали и не сравнивали таксономический состав микроорганизмов в разных элементах микрорельефа. В результате целью нашей работы было - оценить влияние микрорельефа на численность и структуру бактериальных сообществ верхового торфяника. Задачи исследования Определить численность бактерий в различных элементах микрорельефа на основании микробиологического посева. Определить таксономическую структуру бактериальных сообществ на кочках и в микропонижениях. Выделить доминантов и определить их родовую принадлежность на основании метода секвенирования 16 S рРНК. С помощью комплексного структурно-функционального метода оценить метаболическую готовность к росту исследуемых бактериальных популяций на полимерах и их максимальную удельную скорость роста Выделить культуры бактерий-гидролитиков и провести их идентификацию 3 I. Обзор литературы 1. Микрорельеф верховых болот Микрорельеф — мелкие формы земной поверхности, занимающие незначительные площади, измеряемые метрами, десятками и сотнями квадратных метров, с колебаниями относительных высот в пределах 1 м (западины, блюдца, кочки, бугорки и т. д.) Микрорельеф вызывает перераспределение тепла и влаги, но на небольших расстояниях. Он создает особый микроклимат и различную степень увлажнения почв при одинаковом количестве атмосферных осадков. Очень часто микрорельеф определяет резкие различия в почвообразовании. Микрорельеф в начале периода изменяется значительно медленнее других компонентов биогеоценоза. При развитии торфонакопления его участие возрастает, и особенно сильно на верховой фазе «растущий торфяник». Усиливающееся влияние микрорельефа на торфонакопление приводит к прекращению последнего. Рельеф оказывается единственным из компонентов биогеоценоза, роль которого возрастает именно на зрелых фазах торфонакопления, когда остальные факторы стабилизировались или отключились; он сопровождает процесс до конца и прерывает его. На многих верховых болотах, особенно крупных, образуется своеобразный микрорельеф – повышения высотой 20–30 см и понижения. Повышения имеют вид нерегулярно разбросанных среди понижений кочек от небольших (10-30 см) до более крупных (1-5) м. Другую форму имеют гряды. Они обычно сильно вытянуты в длину, часто извилистые, шириной от 0,5 до 2,3 м и длиной иногда более 10 м. Между грядами располагаются понижения. Понижения, занятые растительными сообществами с преобладанием сфагновых мхов, называются мочажинами. Нередко в понижениях стоит вода, в которой иногда кое-где плавают кувшинки, – это уже озерки. 4 Закономерное чередование повышений и понижений на болотах называют комплексом. Детальная характеристика формирования структуры микрорельефа дана в обзоре В.В. Панова (2005). Ниже будут приведены наиболее значимые фрагменты из этого обзора. По ориентации отмерших фрагментов стеблей мха можно установить траекторию движения дернины за несколько лет. Преемственность перемещения зависит от скорости наклона стволиков мха за определенный период. Чем больше скорость, тем меньше степень преемственности, вплоть до распада дернины на отдельные особи. Это наблюдается при уменьшении плотности дернины и при увеличении увлажнения местообитания. По данным П. К. Воробьева (1965) масса области головок мха больше массы области дернины с наклонно расположенными стеблями. Естественно, если дернина находится в разуплотненном состоянии при высоком стоянии уровня воды, то будет наблюдаться оседание дернины. В случае дефицита влаги будет наблюдаться рост плотности дернины и высокая морфологическая устойчивость дернины за счет жесткости каркаса из сомкнутых головок мха (Смоляницкий, 1977). Направление движения мхов в горизонтальном направлении достаточно просто определять по наклону стеблей трав, особенно при наличии стереопары плановой фотосъемки поверхности болота. Известно (Метс, 1978; Воробьев, 1979; Кузьмин,1980), что амплитуда колебаний уровня воды способствует развитию дифференциации микрорельефа. Повышения микрорельефа менее подвижны при колебаниях уровня воды, чем понижения. В результате с ростом амплитуды колебания уровня воды структурная связь между соседним повышением и понижением микрорельефа уменьшается. Сфагновая дернина является основой не только развития микрорельефа, но и его регуляции. Однако объяснить устойчивость микроформ микрорельефа в плане болота свойствами только сфагнового покрова нельзя. В рамках биологического подхода Н. Я. Кац (1936) выделяет следующие причины развития микрорельефа: видовые различия роста сфагнового покрова, 5 различие скорости роста мхов в одинаковых условиях, использование кустарничков и деревьев как опоры для роста дернин, способность лишайников и печеночников задерживать и дифференцировать рост дернин. В рамках гидрологического подхода (Аболин, 1928; Богдановская- Гиенэф, 1936; Иванов, 1956) исследуется влияние характера динамики воды, ее химического состава и способности мхов отвечать изменению этих факторов. Однако прямолинейной связи между водно-минеральным режимом и видовым составом мохового покрова нет, если не рассматривать при этом структурных особенностей подстилаемого субстрата (Иванов, 1988). Основную роль в формировании комплексов при изменении структуры верхнего слоя болота отдают механическим, термическим и т.п. факторам. Одним из факторов образования микрорельефа может быть неравномерное распределение снега на поверхности болота (Гришин, 1977). По мнению И. И. Краснова (1943), к образованию комплексов может приводить солифлюкция оттаявшей массы торфа в верхнем слое торфяной залежи. Значительным фактором, который способствует развитию микрорельефа, является неравномерное уплотнение торфа в мочажинах и на повышениях (Кац и др., 1936). В рамках биохимического подхода можно выделить мнение Л. Я. Смоляницкого (1981) о комплексе как результате разгрузки внутризалежных вод в процессе саморегуляции торфяного болота. В результате происходит поясная евтрофикация поверхности в соответствии с ее формой и направлением стекания вод с болотного массива. Евтрофикация разрушает метаболизм мхов. Это приводит к деградации сфагнового покрова и образованию мочажин. Основной причиной возникновения грядово– мочажинного комплекса В. К. Бахнов (1986) считает дифференциацию почвенного профиля ложа болота. Болотный массив рассматривается как торфяной купол, в котором происходят деформации, вызванные напряжением торфяного тела под воздействии массы тела, газообразования внутри залежи и образования вторичных водоемкостей после выхода газа на поверхность (Богдановская-Гиенэф, 1969). Учитывая, что во всех гипотезах 6 основой является структурно-функциональная связь между отдельными частями: растительного покрова, растительностью и верхней частью залежи; верхней частью залежи и остальной; остальной залежью и дном болота, предлагается выделить структурно-функциональный подход в решении проблемы развития микрорельефа. Микрорельеф поверхности болота состоит из микроформ: кочек, гряд, мочажин и т.п., которые могут образовывать закономерное определяется чередование составом и на поверхности. структурой Различие растительности, микроформ структурой и функционированием субстрата растительного покрова. Отрицательные микроформы характеризуются наличием большого линейного прироста мхов – основного строительного материала микрорельефа болот, но меньшим приростом фитомассы. На высоких элементах микрорельефа эта связь обратная (Боч, Мазинг, 1979). В процессе торфонакопления эта разница оказывает влияние на дифференциацию микрорельефа болота в связи с режимом увлажнения, испарения и саморегуляцией сфагновой дернины. Кроме того, продуктивность сфагнового покрова более независима от условий среды, чем линейный прирост (Илометс, 1981). Учитывая, что время жизни мхов на повышениях больше, можно сказать, что повышение микрорельефа следовательно, более стабильно структурно-функциональная во связь времени, и, повышений микрорельефа с торфяным субстратом выше, и они меньше подвержены изменчивости при колебании климатических параметров (Илометс, 1981). Можно предполагать, что повышения микрорельефа оказывают большее влияние на регуляцию роста торфяного тела, чем понижения, способствуя возникновению и развитию неоднородности торфяной залежи, которая влияет на распределение воды в торфяной залежи. Влияние гидрологического режима на развитие микрорельефа состоит в том, что для каждого элемента микрорельефа формируется собственный режим увлажнения. В результате в понижении возникает более неуплотненный субстрат. Это приводит к тому, что, в мочажине процесс разложения 7 растительных остатков идет быстрее, торф под грядой более уплотнен из-за меньшей влажности и большей массы над уровнем воды. Значительное уплотнение добавляется в зимний период. Повышения микрорельефа меньше подвержены колебаниям и образуют более жесткое структурное целое с торфяной залежью, чем понижения. В итоге меняется водопроводимость торфяной залежи и верхнего слоя болота. Эволюция микроформ имеет как непрерывный, так и прерывистый характер. Пульсация границ микроформ в процессе торфонакопления, направленное смещение границ микроформ без изменения их площади и прерывание развития микроформ на противоположный тип являются проявлением саморегуляции микрорельефа в условиях меняющейся среды. Каждый из указанных процессов изменения микрорельефа отражает степень изменения среды по отношению к характеру сложившегося микрорельефа. Учитывая, что болотный массив обладает целостным функционированием, то развитие микрорельефа должно быть согласованным по площади всего массива. В результате развитие микрорельефа находится под контролем особенностей роста болотного массива в целом, а основная причина, определяющая эту связь – механическое перемещение моховых дернин по поверхности торфяного болота. Методика проведения плановой съемки опубликована в работе В.В. Панова (1991). В результате построения геометрических моделей поверхности болота с сечением рельефа через 1,25 см установлены три зоны. Зона повышения микрорельефа отличается преобладанием Sphagnum fuscum. У нее собственная ориентация перемещения дернин, независимая от направлений их перемещения в остальных зонах. Преобразующая зона – ее отличие в ярком характере перемещения дернин ее составляющих. Это связано с тем, что здесь существуют оптимальные условия для развития дернины из S. cuspidatum. Дернины понижения микрорельефа обладают минимальной плотностью мохового покрова. Это зона с повышенным увлажнением и преобладанием линейного прироста особей мха (в данном 8 случае S. сuspidatum) над общей продуктивностью дернины. В результате дернины понижения обладают минимальной конкурентной способностью. Форма водного зеркала тоже играет активную роль в «строительстве» поверхности торфяного тела, а не только является функцией формы торфяного тела. То, что при зарождении микрорельефа часто не наблюдается видового различия мхов, отмечала И.Д. Богдановская-Гиенэф (1969). В естественных условиях появление микроформ следует считать статистически возможным или хаотичным, но их организация и селекция естественными процессами ведет к характерным и закономерным периодическим структурам в виде ориентированных гряд и мочажин. Это определяет характер саморегулирования ростом болотного массива и его водного режима. Пространственная неоднородность торфяной почвы, наличие кочек, гряд, мочажин, озерков, ровных местоположений, т.е. различных элементов микрорельефа обусловливают особенности формирования потоков СО2 с поверхности болот в атмосферу. Без оценки последних нельзя предвидеть последствия разных видов пользования болотами для изменения их биосферных функций. Интенсивность круговорота веществ выше в грядах и ниже в мочажинах, которые часть периода наблюдений залиты водой (эмиссия равна нулю), а зимой лед на их поверхности становится препятствием для выхода СО2. Скорость эмиссии СО2 растет в ряду: мочажины – ровная поверхность – гряды. Ровные поверхности эмиссируют СО2 в 2 раза, а кочки – в 3 раза больше чем мочажины, в теплое время года. В холодный период соотношение для ровных поверхностей и мочажин сохраняются, но поток диоксида углерода с кочек в 5 раз больше чем с мочажин при значительно меньших скоростях эмиссии, чем в теплое время (Глухова и др. 2014). 9 2. Структура и функции бактериальных сообществ верховых торфяников Проблема сохранения болот как резервуаров аккумуляции больших запасов углерода (следовательно, и кислорода) напрямую связана и с проблемой сохранения бактериального разнообразия на планете. Несмотря на то, что анализ бактериальных сообществ торфяных почв проводится уже более полувека, остается еще много вопросов, на которые предстоит ответить микробиологам. Главные из них – какие же группы и таксоны бактерий преобладают в торфяниках разного генезиса, какие экологические функции они способны осуществлять в специфической среде обитания, в которой процессы микробной деструкции блокированы высокой степенью обводнённости, низкими температурами, кислотностью, анаэробиозом, токсичностью сфагнолов и т.д. В последние годы появился ряд обзоров (Головченко и др., 2005,2008., Добровольская и др.,2005, 2009, 2012., Головченко и др., 2010., Dedysh, 2011) в которых обобщены результаты исследований по изучению бактериальных сообществ торфяных почв. Мы будем приводить примеры, касающиеся оценки бактериального разнообразия олиготрофных верховых торфяников и их сравнения с низинными торфяниками. На примере торфяных почв показано, как менялись представления о разнообразии бактериальных сообществ этих почв в соответствии с эволюцией методов – от традиционных культуральных до молекулярно-биологических. Приводятся данные о новых филотипах, родах и видах бактерий, адаптированных к росту в кислой среде и низкой температуре, свойственных болотным экосистемам. Наиболее многочисленными среди идентифицированных в торфе бактерий являются представители филогенетических групп Proteobacteria, Acidobacteria и Actinobacteria. В группе Proteobacteria доминировать в различных образцах торфа могут представители любого класса: Alpha-, Beta-, Gamma- или Deltaproteobacteria. Представители филогенетических групп 10 Bacteroidetes, Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chloroflexi и Firmicutes чаще упоминаются исследователями как минорные компоненты сообщества. Если определить филогенетическую принадлежность бактерий верховых торфяников, выделенных методом посева на питательные среды, то в доминанты также выходят Proteobacteria (30 родов из 51), затем следуют Actinobacteria, далее Bacteroidetes и минорными компонентами являются Firmicutes, Acidobacteria и Planctomycetes (табл. 1). Табл. 1 Филогенетическая принадлежность бактерий сфагновых болот по данным метода посева на питательные среды Название рода Proteobacteria: Alpha: Asticcacaulis, Brevundimonas, Caulobacter, Hyphomicrobium, Methylocapsa, Methylocella, Methylocystis, Prosthecomicrobium, Rhodomicrobium, Sphingomonas; Beta: Achromobacter, Alcaligenes, Aquaspirillum, Burkholderia, Chromobacterium, Rhodoblastus, Rubrivivax; Gamma: Acinetobacter, Aeromonas, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Rahnella, Serratia, Vibrio; Delta: Myxococcus, Corallococcus, Polyagnum Actinobacteria: Arthrobacter, Cellulomonas, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces Bacteroidetes: Cytophaga, Sporocytophaga, Flavobacterium, Pedobacter, Chryseobacterium, Mucilaginibacter, Chitinophaga Acidobacteria: Terriglobus Planctomycetes: Schlesneria, Singulisphaera Количество родов В процентах от общего числа родов 30 59 8 15 7 14 1 2 2 4 11 Firmicutes: Bacillus, Paenibacillus, Clostridium Итого: 3 51 6 100 Высокая численность ацидобактерий, выявляемая при прямом анализе торфа из верховых торфяников, свидетельствует о том, что эти почвы являются одной из благоприятных природных экониш для этой группы бактерий. Ацидобактерии выживают в торфяниках, используя различные гетерополисахариды, которые освобождаются в результате деструкции сфагнума и других растительных остатков. При этом они способны осуществлять свои функции при низких температурах и в кислой среде, что характерно для верховых болот (Pankratov et al.,2008). При использовании метода FISH для анализа филогенетического разнообразия бактерий в болотных экосистемах было установлено, что планктомицеты могут быть одной из численно доминирующих групп бактерий в верхних слоях сфагновых болот бореальной зоны (Куличевская и др., 2006., Dedysh et al., 2006). Планктомицеты являются медленно растущими и трудно культивируемыми организмами. Для выделения их чистых культур был разработан новый подход, заключающийся в соче тании различных методов: накопительных культур; культурального и метода FISH. Выделенные из торфа изоляты представляли собой новые таксоны планктомицетов, о чем свидетельствовал низкий уровень сходства последовательностей их генов 16S рРНК с таковыми у известных культур этой группы. Они могли существовать в широком дипазоне рН и температуры (Kulichevskaya et al., 2007, 2008). Примером комплексного подхода к изучению разнообразия и функционирования бактериальных комплексов торфяников может служить работа (Куличевская и др., 2007), в которой изучался состав бактериального сообщества, развивающегося при разложении сфагнума в лабораторном эксперименте. Молекулярный анализ выявил численное доминирование представителей филогенетических групп Alphaproteobacteria, Actinobacteria, и 12 Planctomycetes. Доля планктомицетов возрастала на конечных этапах разложения сфагнума. Численность Firmicutes и Bacteroidetes, считающиеся главными агентами бактериальной деструкции, была незначительной. Наиболее интересными представляются выводы авторов о функциональной роли бактерий, относящихся к филогруппам Alphaproteobacteria и Planctomycetes. Изоляты протеобактерий из этих филумов были способны использовать галактуронат – единственное обнаруженное в воде торфяника низкомолекулярное органическое соединение, а планктомицеты – целый ряд гетерополисахаридов. деструкции При полимеров в дальнейшем сфагновых изучении болотах роли было бактерий показано, в что представители филумов Bacteroidetes и Betaproteobacteria осуществляют процесс разложения пектина, а Bacteroidetes и Alphaproteobacteria – ксилана в кислых олиготрофных болотах. Был также описан новый род бактерий Mucilaginibactor gen nov., представители которого были способны к гидролизу пектина, ксилана, ламинарина и хондроитина в диапазоне рН 4.5 6 и температуре от 2 до 30°С (Pankratov et al., 2007).Типичным компонентом микробного комплекса сфагновых болот являются бактерии рода Burkholderia. Большинство штаммов рода Burkholderia, выделенных из торфа, были филогенетически близки к видам B. glathei, B. phenazinium, B. fungorum и B. caryophylli, представители которых являются типичными обитателями почв и ризосферы растений. В качестве источников углерода и энергии «болотные» изоляты использовали широкий спектр субстратов, включающий органические кислоты, сахара, полиспирты, а также некоторые ароматические соединения. Все изученные штаммы были способны к росту на безазотистых средах и развивались в диапазоне рН 3.5-7.4 и температуры 3-37°С с оптимумом при рН 5-7 и 11-23°С, что характеризует их как умеренно ацидофильных, психроактивных, азотфиксирующих микроорганизмов, адаптированных к условиям обитания (Белова и др., 2006). Исследования метаногенных микроорганизмов в торфяниках были инициированы возросшим интересом к проблеме глобального потепления и к 13 оценке роли болот в продукции одного из главных парниковых газов – метана. Выделение и изучение культур метаногенов осложнено их высокой чувствительностью к кислороду. Все известные на данный момент метаногенные организмы являются строгими анаэробами, принадлежащими к домену Archaea. Применение молекулярных методов позволило идентифицировать представителей метаногенного сообщества сфагновых болот. В очёсе сфагнового мха были обнаружены археи семейств Methanomicrobiaceae, Methanocarpusculaceae и Methanoplanaceae, в глубоких слоях торфяника – археи рода Methanosarcina (Upton et al., 2000). Из сфагнового болота Бакчарское (Западная Сибирь), были выделены новые представители как известных порядков Methanomicrobiales, Methanosarcinales, Methanobacteriales и Methanococcales, так и тех, которые не получены ещё в культурах (Sizova et al., 2003). Было установлено протекание в анаэробных слоях торфа как водородного, так и ацетокластического метаногенеза, был выделен в чистую культуру ацидофильный метаноген, представляющий новый вид рода Methanobacterium (Kotsyurbenko et al., 2007). Число ацидофильных метаногенных архей, полученных в чистых культурах пока не велико, но подходы к их выделению уже разработаны, что, несомненно, ускорит накопление знаний об этой группе организмов в верховых торфяниках. Применение метода FISH позволило идентифицировать представителей метанокисляющего сообщества верховых торфяников и установить их численность (106-107 клеток г-1 сырого торфа). Состав сообществ метанотрофов в географически удалённых верховых торфяниках бореальной зоны оказался сходным и включал, в основном, популяции ацидофильных метонотрофов II типа – Methylocella palustris, Methylocapsa acidiphila и Methylocystis heyeri (Dedysh et al., 2001,2007). В обзоре С.Н.Дедыш (Dedysh, 2011) даётся перечень всех известных в настоящее время родов ацидобактерий, планктомицетов и метилобактерий. 14 Таким образом, в торфяных почвах обитают и функционируют представители самых разных групп бактерий, включающих как гидролитиков, так и олиготрофов, как метаногенов, так и метилобактерий, как органотрофов, так и фототрофов. При этом применение широкого арсенала методов, как традиционных классических, так и современных молекулярно-биологических, позволяет повысить эффективность обнаружения и идентификации бактерий из торфяников. Так, классические микробиологические методы необходимы для выделения чистых культур; изучения метаболического ультраструктуры клеток потенциала и т.д. идентификации бактериальных популяционной численности; и физиологии; Молекулярные клеток в in исследования методы situ; в установлении помогут определении в их таксономической принадлежности и т.д. Один из возможных подходов к оценке бактериального разнообразия почв методом посева был предложен на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ. Его принцип заключался в том, чтобы не стараться описать разнообразие всех групп и таксонов бактерий, что практически невозможно, а выбрать в качестве модельной группу бактерий, все представители которой способны расти на одной питательной среде. При этом становится возможным определение доли разных таксонов бактерий, учитываемых на используемой среде, т.е. анализ сообщества на основании использования различных общепринятых синэкологических показателей. Модельная группа считается выбранной удачно, если удалось установить особенности структуры бактериальных комплексов, отражающие адаптацию бактерий к условиям, складывающимся в определенном типе почвы, экосистемы или природно-климатической зоны. В качестве такой удачной модельной группы для изучения бактериального разнообразия в почвах разных типов был выбран комплекс сапротрофных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий, растущих на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде (Добровольская и др., 1989), 15 участвующих в конвейерной переработке растительных остатков. Показатели обилия (абсолютные и относительные) для отдельных родов бактерий приведены в работах (Головченкои др., 1993,2005., Добровольская и др, 2002,2005). Среди как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий были обнаружены представители всех эколого-трофических групп: гидролитики, копиотрофы и олиготрофы. Доля гидролитиков в торфяниках не превышала 30%. Их численность, относительное обилие и разнообразие были выше там, где происходит более активная деструкция растительных остатков, т.е. в низинных торфяниках. В верховых торфяниках гидролитический комплекс представлен значительно беднее, что может быть дополнительным аргументом при объяснении факта медленной деструкции растительных остатков в них. Анализ верховых торфяников Западной Сибири и Тверской областей позволил установить, что таксономическая структура бактериальных сообществ в олиготрофном торфянике во все сроки анализа была монодоминантной (Кухаренко, 2011). В качестве доминантов выделялись типичные гидробионты – подвижные протеобактерии, представленные родами Aquaspirillum и Comamonas. Их доля составила в среднем 75%. Однако в результате идентификации этих культур молекулярно-биологических методов с на секвенированием основе ДНК все исследованные 20 штаммов оказались принадлежащими к разным видам рода Pseudomonas : Ps. fluorescens, Ps. koreensis, Ps. mandelii, Ps. lini, Ps. gingeri, Ps. putida. В сухой и теплый период (июнь) в качестве минорных компонентов выделялись так же бациллы, которые составили около 15%, миксобактерии и цитофаги — 10% . Во влажном месяце июле и в августе единственным доминантом во всех горизонтах олиготрофной торфяной почвы были псевдомонады. Таким бактериальные образом, в сообщества протеобактериями, верховых торфяниках представлены, характерными для в Западной основном, водных Сибири подвижными сред. Бактерии 16 гидролитического комплекса составляют 20%. Всего из низинных торфяников было выделено 9 таксонов, а из верховых — 5. В дождливый период как в верховом, так и в низинном торфяниках преобладали типичные обитатели водной фазы — аэробные протеобактерии родов Aquspirillum, Comamonas, и Pseudomonas. В глубоких слоях олиготрофной торфяной почвы были обнаружены факультативно-анаэробные бактерии, доля которых составила в среднем 30%. Помимо типичных гидробионтов из евтрофной торфяной почвы были выделены бактерии порядка Myxococcales и целлюлозоразрушающие бактерии группы Flavobacterium-Cytophaga. Они являлись доминантами в верхнем слое почвы (70%).Факультативно-анаэробные бактерии удалось выделить из верховых торфяников после жаркого лета в результате запуска сукцессии с увлажнением почвы. При этом вначале на чашках выросли только энтеробактерии, представленные принадлежность бактерий видом Rahnella aquatilis. Видовая была определена на основе секвенирования рДНК. Их доля колебалась на протяжении сукцессии (30 суток), но в среднем оставалась не ниже 20% (Кухаренко, 2011). Следует ометить, что выявление именно этих является энтеробактерий из олиготрофной случайным, представители рода торфяной Rahnella почвы не выделялись из сфагновых мхов и другими исследователями. Было показано, что разные виды бактерий рода Rahnella, в том числе и Rahnella aquatilis, ассоциированы со мхами Sphagnum fallax и Sphagnum magellanicum (Opelt et al., 2007). Результаты экспериментов показали, что как дождливая погода, так и сильная засуха и жара оказывают значительное влияние на состояние бактерий в обоих типах торфяников. При стираются те контрастные различия повышенной в влажности таксономической структуре прокариот, которые характерны для олиготрофной и евтрофной торфяных почв (Добровольская и др., 2005). Высокие температуры и недостаточное увлажнение в результате засухи и жары оказывают стресс на бактерии торфяников, приводя к серьезной перестройке в таксономической структуре 17 прокариотных комплексов. На основе полученных данных можно сделать вывод о меньшей устойчивости бактериального сообщества верховых торфов, чем низинных, к экстремальной засухе и жаре. Итак, бактериальные комплексы торфяников отличает высокая доля бактерий-гидробионтов, представленных микроаэрофильными спириллами (род Aquaspirillum) и факультативно-анаэробными энтеробактериями родов Klebsiella, Proteus, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas. Процентное содержание бактерий-гидробионтов варьирует от 44 до 90% в поверхностных горизонтах и от 64 до 96% – в глубоких слоях торфяников. Все эти бактерии являются типичными копиотрофами, которые усваивают лишь водорастворимые мономеры. К копиотрофам относятся также минорные (не более 5% от общего числа бактерий, выделяемых на используемой среде) представители бактериального сообщества торфяников, представленные родами Azospirillum, Pseudomonas, Xanthomonas, Achromobacter, Chromobacterium, Methylobacterium, Janthinobacterium, Xanthomonas, Azotobacter, Beijerinckia. Все выделенные штаммы рода Beijerinckia принадлежали к одному виду – Beijerinckia mobilis. Следует отметить способность бактерий этого рода расти при низких приуроченность именно значениях в pH этих бактерий среде, отсюда к верховым и понятна переходным торфяникам, в то время как их близкий “родственник”– Azotobacter – обнаруживали лишь в высокозольных низинных торфяниках, характеризующихся нейтральной реакцией среды. Доля гидролитиков в торфяниках не превышала 30%. Их численность, относительное обилие и разнообразие были выше там, где происходит более активная деструкция растительных остатков, т.е. в низинных торфяниках. В верховых торфяниках гидролитический комплекс представлен значительно беднее, что может быть дополнительным аргументом при объяснении факта медленной деструкции растительных остатков в них. Видовой состав бацилл оказался специфичным для торфяников. Вопервых, они были представлены преимущественно факультативно18 анаэробными видами, адаптированными к пониженному содержанию кислорода в болотных экосистемах. Во-вторых, доминировали пигментные формы, приуроченные, как известно, к растениям, в том числе и мхам. Анализ функций бактерий сапротрофного блока в верховых торфяниках (Добровольская и др., 2012) позволил установить, что в этих олиготрофных почвах практически отсутствуют или выделяются в качестве минорных компонентов целлюлолитические прокариоты, характерные для низинных торфяников – это цитофаги, миксобактерии, целлюломонады. Лишь некоторые виды бацилл и клостридий, выделяемые из сфагновых торфов, способны к деструкции целлюлозы. Было установлено, что бактерии, идентифицированные как виды Janthinobacterium agaricum, Janthinobacterium lividum, Bacillus cereus и Bacillus firmus-lentus, выделенные из олиготрофной торфяной почвы, обладают хитинолитической активностью. Эта функция бактерий представляется особенно значимой, учитывая доминирование грибов в микробной биомассе олиготрофных торфяников, клеточные стенки которых содержат хитин. Культуры бактерий, выделенные из торфяных почв, проявили антагонизм по отношению к микроскопическим грибам из этих же почв. Некоторые штаммы бацилл оказали антагонистическое действие на грибы, типичные для верховых болот (Penicillum, Umbelopsis, Absidia). Зоны подавления роста составили до 7 мм. Таким образом, между бактериями и грибами, обитающими в торфяниках, могут складываться антагонистические взаимоотношения, что может влиять на их функционирование в разных микролокусах торфяников и, возможно, в целом в болотных экосистемах. Преобладающие в верховых торфяниках протеобактерии являются олиготрофами и копиотрофами и не способны расщеплять труднодоступные полисахариды, однако могут проводить другие процессы. Так было установлено, что бактерии родов Pseudomonas и Aquaspirillum обладают липазной, лецитиназной и протеазной активностью, бактерии рода Alcaligenes – лецитиназной. 19 Наличие фенолоксидазной активности было зафиксировано для бактерий родов Aquaspirillum и Alcaligenes. Проявление фенолоксидазной активности имеет особое значение, так как полимерные фенольные соединения, накапливающиеся в больших количествах в сфагновых болотах, являются ингибиторами энзимов. При окислении полифенолов теряется их токсичность. Проверка нитрогеназной активности основных представителей грамотрицательных бактерий, а также разных видов бацилл, выделенных из торфяных почв, показала их относительно высокую активность. При этом азотфиксация в этих культурах была выше при низкой температуре культивирования (4–60С), чем при 250С. Доминирующие в верховых торфяниках бактерии оказались устойчивыми к тем сфагнолам, которые содержатся в сфагновых экстрактах и ингибируют рост бактерий из других биотопов, в том числе патогенных бактерий (Добровольская и др., 2012). Таким образом, бактерии, обитающие в верховых торфяниках, адаптированы к тем неблагоприятным условиям, которые складываются в олиготрофных торфяниках, и способны осуществлять разнообразные функции. В результате изучения влияния механического измельчения сфагнума на состав и функции бактериальных сообществ (Юрченко, 2013., Добровольская и др., 2014) нами были обнаружены новые таксоны бактерий. В бактериальных сообществах зелёного мха во всех вариантах опыта на начальных этапах в качестве монодоминанта были выявлены бактерии вида Agrobacterium radiobacter. Бактерии этого вида – типичные эпифитные бактерии, питающиеся продуктами экзоосмоса растений. В варианте со мхом, измельчённом ножницами, через 14 суток появились в качестве второго доминанта бактерии вида Janthinobacterium agaricum. В качестве субдоминанта (24%) были так же выделены бациллы. В сосуде, где хранился мох, измельчённый предварительно в блендере, хитинолитические бактерии выше названного вида стали монодоминантами – их доля составила 79%. Доля агробактерий уменьшилась до 16%. Через 90 суток измельчённом ножницами, как так и блендером, доля во мхе, бактерий 20 Janthinobacterium agaricum составила уже 87%. Это хитинолитические бактерии, которые были обнаружены первоначально на агариковых грибах, а затем в гидроморфных почвах северных регионов (Кухаренко и др., 2010). Представители других родов бактерий выделялись в качестве минорных компонентов. На 120 сутки в измельчённом сфагнуме продолжали доминировать хитинолитики, в качестве второго доминанта появились стрептомицеты (26%), отнесённые на основании идентификации с помощью молекулярно-биологических методов к виду Streptomyces purpurascens. Следует так же отметить смену доминирующих в нативном образце сфагнума видов агробактерий: вместо бактерий вида Agrobacterium radiobacter были обнаружены представители вида Agrobacterium rhizogenes (94%). Таким образом, механическое измельчение сфагнума привело к резкой перестройке в структуре бактериальных сообществ как зелёного мха, так и его очёса. Оно заключается в смене агробактерий (в нативных образцах) являющихся эккрисотрофами, разными бактериями гидролитческого комплекса – хитинолитическими бактериями Janthinobacterium agaricum и стрептомицетами - Streptomyces purpurascens. Возможно, что это связано с процессом разрушения гиф грибов при измельчении сфагнума, в результате чего становится доступным как хитин, так и другие вещества, входящие в состав клеток микромицетов. В последние годы появились исследования, в которых были изучены эндофитные бактериальные популяции сфагновых мхов (Щербаков, 2014). В результате было установлено, что в составе эндофитных бактериальных сообществ встречаются многие таксономические группировки, которые характерны и для эпифитных эккрисотрофных бактерий сфагновых мхов. Были обнаружены разные таксономические ветви. Класс Gammaproteobacteria (порядок Enterobacteriales) включал представителей родов Serratia, Enterobacter и ряд других. Не менее заметной таксономической ветвью были представители порядка Burkholderiales, 21 представленные семейством Oxalobacteraceae, род Collimonas, и семейством Burkholderiaceae, род Филум Burkholderia. Bacteroidetes представлен родами Flavobacterium, Pedobacter, Chryseobacterium. К наиболее крупной таксономической ветви следует отнести представителей Pseudomonadaceae, численность которых достигала 50% от всех выделенных изолятов бактерий. Среди характерных видов Pseudomonas следует отметить Ps. poae. Для разных видов сфагновых мхов были выявлены различия в соотношении представителей родов Pseudomonas и Collimonas. Так, представители Pseudomonas составляли наиболее многочисленную рода группировку эндофитных бактерий S. magellenicum, в то время как для S. fallax популяция псевдомонад была не столь многочисленна, большую долю составляли представители родов Collimonas и Flavobacterium. Итак, было установлено, что в компонентном составе эндофитных гетеротрофных бактериальных сообществ сфагновых мхов различного географического происхождения преобладают представители родов Pseudomonas, Serratia, Burkholderia, Flavobacterium, Collimonas, Stenotrophomonas. При этом бактерии сфагновых мхов обладают комплексом свойств, которые играют важную роль не только в жизни растения-хозяина, но и могут быть использованы в практических целях. Штаммы бактерий, выделенные из тканей сфагновых мхов, способны активно взаимодействовать с высшими растениями сельскохозяйственного значения и оказывать положительное влияние на их рост и развитие. Показано, что сфагновые мхи являются депозитарием биотехнологически-ценных бактерий. Из 400 выделенных изолятов -240 штаммов обладали фунгицидной и 120 штаммов бактерицидной активностью против широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов, более 100 штаммов были способны продуцировать ИУК и ее производные, что обеспечивало биоконтрольные ростстимулирующие эффекты в процессе функционирования и симбиоза между сфагновыми мхами и эндофитными бактериями, населяющими их ткани. 22 Таким образом, разными авторами изучены таксономическая структура и функции эпифитных и эндофитных бактерий в сфагновых мхах, их очёсах и всего профиля верховых торфяников. Выявлены их полезные свойства, в коллективной монографии (Добровольскаяи др., 2013) детально проанализирован анализ причин медленной деструкции верхового торфа. Однако, несмотря на особую структуру микрорельефа верховых торфяников, микробиологи не изучали и не сравнивали структуру бактериальных сообществ в разных элементах микрорельефа олиготрофных болот. 23 II. Объекты и методы исследования 1. Объекты исследования Объектом исследования была олиготрофная остаточно-эутрофная торфяная почва под сосняком кустарничково-пушицево-сфагновым, являющаяся постоянной пробной площадью Западно-Двинского лесоболотного стационара Института лесоведения РАН в Тверской области (56º с.ш., 32º в.д.). Исследуемый торфяник (мощностью 1,5 м) сложен верховыми, переходными и низинными торфами и подстилается в различной степени оглеенными песками. Степень разложения торфа зависит от ботанического состава и варьирует по профилю от 14 до 40%. Краткая характеристика свойств исследуемого торфяника приведена в табл. 2. 24 Табл. 2 Характеристика свойств исследуемых торфяников Фитоценоз Сосняк кустарничков о-осоковосфагновый Глубина, Степень см разложения торфа, % Ботанический состав торфа Зольность, % 0-6 --- Живой мох (Sphagnum magellanicum) --- 6-14 --- Очёс мха (Sphagnum magellanicum) --- 12-20 14 Sphagnum angustifolium (торф) 3,7 20-50 16 Sphagnum magellanicum (торф) 2,8 50-100 46 Древесно-травяной переходный торф 2,0 100-130 40 Осоковый низинный торф 3,6 130-150 --- Оглеенные пески --- Результаты нивелировки поверхности показали, что микропонижения занимают 52 %, ровные поверхности 31 % и микроповышения (кочки) 17 % площади. Высота кочек 30-35см. Образцы сфагнума, очеса и торфянистых горизонтов отбирались в августе 2014 года из трех кочек и трех вариантов микропонижений. 25 2. Методы исследования Метод посева Численность и таксономический состав бактерий сапротрофного блока определяли методом посева на глюкозо-пептонно-дрожжевую среду (ГПД). Для исследования брали 1 г образца и помещали в колбу со 100 мл стерильной воды. Далее для десорбции клеток торфяную суспензию обрабатывали на ультразвуковом диспергаторе Bandelin Sonopuls HD 2070 в течение 2 мин при мощности 50%. Для ингибирования грибов в среду добавляли 50 мг нистатина на 0,5 л среды. По полученным данным определяли численность бактерий, выраженную количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г сухой почвы. Основных представителей бактерий выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов до рода проводили на основании морфологических, культуральных признаков (Определитель бактерий Берджи, 1997; Лысак и др., 2003). Идентификацию доминирующих таксонов бактерий проводили по результатам секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, была использована программа BLAST. Комплексный структурно-функциональный метод Физиологическое анализировали разнообразие комплексным бактериальных структурно-функциональным сообществ методом, разработанным А.В. Якушевым (Якушев, 2015). Схема анализа представлена на рис. 1. 26 Комплексный Комплексный структурнометод функциональный метод 1 Рост по оптической плотности определяли на ИФА Sunrise (длины волн 620 нм 2 5 3 7 8 6 2,4E9 9 2,2E9 КОЕ/мл=2,2*10 * OD 2 2E9 r =0,75 n=14 1,8E9 1,6E9 1,4E9 1,2E9 1E9 8E8 6E8 4E8 2E8 0 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 Оптическая плотность, 620 нм КОЕ/мл 4 Оптическая плотность, 620 нм 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Кукушкин лён кочка Цитофаги и флавобактерии актиномицеты 0 50 Сфагнум кочка Сфагнум понижение Бациллы актиномицеты 100 150 200 Время, ч Рис. 1. Схема проведения эксперимента: 1 – навеска мха; 2 –суспензия в пробирке для вортэксирования; 3- культуральная планшета, инокулированная суспензией; 4 – чашка Петри с микроорганизмами, выделенными из исходной суспензии; 5 – имунно_ферментный анализатор “Sunrise”; 6 – кривые роста оптической плотности в ячейках планшеты, построенные ИФА; 7 – микроорганизмы, выросшие на чашке Петри после посева из питательной среды, на которой развилась ассоциация микроорганизмов; 8 – линейная корреляционная зависимость концентрации бактерий в суспензии С(OD620), от оптической плотности (OD620) при высеве из лунок на “универсальную” ГПД сред, объем выборки – 150, r2 = 0.52. Все процедуры проводили с соблюдением стерильности. Каждый раз при проведении анализа предусмотрен контроль на стерильность. Гомогенизацию и десорбцию микроорганизмов с твердых субстратов проводили в водной суспензии (1 : 10) в течение 20 мин при 2000 об./мин на встряхивателе “вортэкс” модель “Multi Reax” фирмы “Heidolph”. Крупнодисперсные образцы предварительно измельчали ( разрезали очёс мха 27 ножницами). Для подавления роста грибов в суспензию вносили антигрибной антибиотик нистатин 0.05%. Избыток частиц субстрата удаляли центрифугированием при 3200 g 5 мин. Концентрацию и состав культивируемых микроорганизмов в исходном субстрате определяли высевом из супернатанта на агаризованную среду общепринятым способом. Супернатант добавляли по 100 мкл в ячейки 96 - луночной плоскодонной культуральной планшеты с крышкой, в которую уже был внесен набор различных жидких питательных сред по 100 мкл. Исследовался гидролитический бактериальный блок, поэтому в качестве жидких сред были использованы следующие полимеры: нуклеиновая кислота, белок казеин и кератин, твин-20, полисахариды декстран, инулин, хитин, карбоксиметилцеллюлолза (КМЦ), ксилан, крахмал, пектин. Хитин, кератин, пектин, казеин, крахмал стерилизовались автоклавированием при 0,5 атм. А остальные субстраты фильтровали через мембранные фильтры, с диаметром пор 0.22 мкм. Чтобы не принять за рост на органическом веществе питательной среды рост за счет побочных веществ инокулируемой суспензии исследуемого образца, необходим контрольный вариант питательной среды без ростового субстрата. Для предотвращения испарения воды из ячеек, планшет с боков закрывали лентой парафилм (parafilm). Планшет помещали в имунноферментный анализатор (ИФА) (“Sunrise” фирмы “Tecan”), который автоматически регистрирует рост микроорганизмов по оптической плотности (при 620 нм) в динамике, с периодическим встряхиванием планшеты. Для поддержания температуры прибор помещали в климатическую камеру. Температура была стандартная для почвенной микробиологии - 25°С. На 68 100 и 204 ч роста были сделаны посевы на агаризованную ГПД среду, чтобы выяснить состав ассоциаций, развившихся на полимерах. Идентификация бактерий проводилась по культурально - морфологическим признакам и их родовую принадлежность определяли на основании метода секвенирования фрагмента гена, кодирующего нуклеотидную последовательность 16S рибосомальной РНК. По данным посева из ячеек строили калибровочное 28 уравнение, позволяющее пересчитать оптическую плотность в концентрацию клеток микроорганизмов. Рост периодической смешанной культуры (ассоциации микроорганизмов) в ячейках описывали комплексной моделью, разработанной для чистой культуры (Якушев, 2015). Экспериментально задавали концентрацию субстрата s0, определяли зависимость роста биомассы х от времени t и параметры x0. По этим данным в программе “Statistica 8” рассчитывали параметры γ и μm. Удельное физиологическое разнообразие, определяемое по факту роста в тех или иных физиологических условиях в жидкой питательной среде в расчете на 1 г субстрата. В данной работе теоретически интерпретировался только участок подготовки микроорганизмов к росту (лаг-фаза) и фаза экспоненциального роста (рис.2). Рис.2. Участок кривой роста используемый для расчёта кинетических параметров бактериальных ассоциаций. Эта модель может быть записана в форме системы дифференциальных уравнений. 29 или в виде одного интегрального уравнения: x x0 (1 0 0 e m t ) В модели экспериментальные данные это x – концентрация клеток в среде, x0 -исходная концентрация в суспензии культивируемых бактерий и tвремя, а параметры модели это μm и ρ0. μ - это удельная скорость роста микроорганизмов, то есть скорость роста единицы обилия микроорганизмов (биомассы, численности). μm - максимальная удельная скорость роста. ρ функция физиологического состояние растущей культуры, отражающая отличие в лаг-фазе удельной скорости роста μ от μm. Параметр ρ0 характеризует физиологическое состояние в момент интродукции (то есть в почве). Метаболическая готовность к росту (γ) – это фактически готовность микроорганизма к росту на конкретной среде. Мы полагаем, что метаболическая готовность к росту определяется физиологическим состоянием. Поскольку значения ρ0 нулевого колеблются на несколько порядков, поэтому необходимо логарифмировать ρ0 и прибавить заведомо большое число (100), чтобы получить прямую зависимость с метаболической готовностью. Таким образом гамма-безразмерная величина 100 ln( 0 ). 30 III. Результаты и обсуждение 1. Распределение численности бактерий по профилю торфяников Численность бактерий, определённая методом посева, мало изменялась по профилю почвы, как в кочках, так и в микропонижениях (рис. 3, 4). В микропонижениях численность бактерий изменялась от 2 *104 в очёсе сфагнума до 4,1*105 в торфянистом горизонте на глубине 20-35см. И лишь в слое торфа 35-50см, являющимся переходным от сфагнового к древесно-травяному, плотность бактериальных популяций увеличивалась до 9*105 КОЕ/г. В целом концентрация бактерий была на 1-2 порядка выше в кочках, чем в микропонижениях. Полученные данные коррелируют с выводами, полученными (Глухова Т.В., Вомперский С.Э., 2014) об эмиссии СО2 из разных элементов микрорельефа верхового болота. Было установлено, что ровные поверхности выделяют СО2 в 2 раза, а кочки – в 3 раза больше, чем мочажины, в теплое время года. В холодный период соотношение для ровных поверхностей и мочажин сохраняются, но поток диоксида углерода с кочек в 5 раз больше чем с мочажин (при значительно меньших скоростях эмиссии, чем в теплое время). 31 Рис. 3. Распределение численности бактерий по профилю кочки Рис. 4. Распределение численности бактерий по профилю микропонижения 32 Полученные данные коррелируют с выводами, полученными Глуховой Т.В., Вомперским С.Э. (2014) об эмиссии СО2 из разных элементов микрорельефа верхового болота. В составе бактериальных сообществ во всех исследованных образцах из разных элементов микрорельефа доминировали аэробные протеобактерии. 2. Таксономическая структура бактериальных сообществ в разных элементах микрорельефа В бактериальных сообществах мхов (сфагнума и кукушкиного льна) и их очёсов на кочках доминировали протеобактерии, однако, при движении вниз по профилю, по мере увеличения степени деструкции торфа, начинали встречаться бактерии гидролитического блока, представленные бациллами и актиномицетами. Их доля колебалась от 2 до 20% (рис.5). Бактериигидролитики были представлены бациллами и актиномицетами. Сходная картина наблюдалась и в микропонижениях, однако там, при выраженном преобладании протеобактерий, доля гидролитиков достигала более 40 % на глубинах от 3 до 20см. В более глубоких горизонтах 20-35см и 35-50 см бактерии гидролитического комплекса не были обнаружены (рис. 6). 33 Распределение различных групп бактерий по профилю кочки сфагнум с купола кочки очес сфагнума с купола кочки Глубина, см кукушкин лен с купола кочки очес кукушкиного льна с купола кочки Протеобактерии сфагнум у основания кочки Бациллы очес сфагнума у основания кочки Актиномицеты 5-15 см Другие 15-35 см 35-45 см 45-55 см 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Доля, % Рис.5. Распределение различных групп бактерий по профилю кочки Распределение различных групп бактерий по профилю микропонижения сфагнум Глубина, см очес сфагнума Протеобактерии 3-10 см Бациллы Актиномицеты 10-20 см 20-35 cм 35-50 cм 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Доля, % Рис. 6. Распределение различных групп бактерий по профилю микропонижения 34 3. Характеристика доминирующих таксонов бактерий На основании молекулярно-биологического метода был определён родовой состав протеобактерий. Доминанты среди протеобактерий были представлены 4 родами: Pseudomonas, Acinetobacter, Dyella, Burkholderia. Дендрограммы для этих родов представлены на рисунках 7, 8, 9, 10. Рис. 7. Дендрограмма выделенной культуры Pseudomonas Рис. 8. Дендрограмма выделенной культуры Acinetobacter 35 Рис. 9. Дендрограмма выделенной культуры Dyellа Рис. 10. Дендрограмма выделенной культуры Burkholderia Представители первых трех родов относятся классу γ–Proteobacteria, порядку Pseudomonadales, но к разным семействам. Род Burkholderia относится к классу β–Proteobacteria (табл. 3). Бактерии всех перечисленных родов являются аэробами и относятся к эколого-трофической группе копиотрофов, не способных к гидролизу сложных полимеров. Некоторые из этих бактерий (Pseudomonas, Burkholderia) считаются типичными представителями сфагновых болот и упоминаются во многих работах как русских, так и зарубежных исследователей. О выделении из сфагновых болот бактерий Acinetobacter и Dyella ранее не сообщалось. 36 Табл. 3 Таксономическое положение доминирующих родов протеобактерий Название рода Класс Порядок Семейство Pseudomonas γProteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Acinetobacter γProteobacteria Pseudomonadales Moraxellaceae Dyella γProteobacteria Pseudomonadales Xanthomonadaceae Burkholderia β– Proteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Табл. 4 Распределение бактерий разных родов по профилю торфяников Положение в рельефе Кочка Кочка Кочка Кочка Кочка Кочка Кочка Микропонижение Микропонижение Микропонижение Микропонижение Микропонижение Микропонижение Горизонт/глубина, см сфагнум с основания кочки очес сфагнума с купола кочки 5-15 см 5-15 см 15-35 см 35-45 см 45-55 см сфагнум (0-3 см) 3-10 см 3-10 см 10-20 см 20-35 см 35-50 см Название рода Доля, % Pseudomonas 70 Acinetobacter Acinetobacter Burkholderia Burkholderia Burkholderia Burkholderia Dyella Burkholderia Acinetobacter Acinetobacter Acinetobacter Acinetobacter 85 1 65 85 88 78 59 15 7 21 31 37 37 Представители родов Acinetobacter и Burkholderia присутствовали во всех типах рассматриваемого микрорельефа как в очёсе, так и в торфянистых горизонтах. В большинстве случаев они были доминантами. На кочке доля буркхольдерий составляла 65-88% от общего количества протеобактерий, в микропонижении они были обнаружены лишь в очёсе (15%). Акинетобактер доминировал в очёсе сфагнума кочки, в микропонижении его доля колебалась от 7 до 37%, увеличиваясь с глубиной. Представители родов Dyella и Pseudomonas были обнаружены живом сфагнуме, для Pseudomonas только в это была кочка, для Dyella – микропонижение (табл. 4). 4. Оценка физиологического разнообразия бактерий гидролитического блока в очёсе сфагнума на кочке и в микропонижении Оценка физиологического разнообразия гидролитического бактериального комплекса проводилась по доле сред с полимерами на которых наблюдался рост при инокуляции суспензией исследуемых образцов (рис. 11). На рис. 11 видно, что физиологически более разнообразный блок гидролитиков в очёсе сфагнума на кочке (рост был на всех полимерах) по сравнению с понижением (рост наблюдался не на всех средах). Роста не было на трудноразлагаемых полимерах - хитине и целлюлозе, а так же на инулине (запасном углеводе сложноцветных растений) и кератине (животном белке). Следует отметить, что теоретически нижний предел обнаружения для метода - 100 клеток /г исходного субстрата. Полученные данные указывают на потенциальную способность бактериального гидролитического комплекса кочки гидролизовать более широкий спектр полимеров, чем в понижении. Это может быть связано с тем, что микроорганизмы кочки в процессе своей жизни контактируют со многими полимерами высших растений, которые растут помимо сфагнума на кочке, а также с грибами. 38 100 Доля сред с полимерами на которых наблюдался рост,% 95 90 85 80 75 70 65 60 55 Очес сфагнума с кочки Очес сфагнума аимиимттими из понижения Рис.11 . Оценка физиологического разнообразия комплекса гидролитических бактерий На рис. 12 приведен пример кривых периодического роста бактериальных ассоциаций на полимерах. По данным посева на 2-3 сутки в гидролитическом ядре ассоциации доминировали флавобактерии, цитофаги, а через неделю преобладали бациллы и актиномицеты. При этом во все сроки наблюдения, помимо гидролитиков, выделялись бактерии, относящиеся к группе копиотрофов и олиготрофов. Если из исходной суспензии очеса при посеве на чашки с ГПД выделялось 8 типов колоний бактерий, то при высеве из этих же суспензий после инкубирования их на 12 средах с полимерами, общее число выделенных типов колоний бактерий увеличилось в 6 раз. Из ячеек, содержащих среды с целлюлозой и хитином, нам удалось выделить в чистые культуры и определить до рода эти бактерии. 39 Оптическая плотность, 620 нм 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Кукушкин лён кочка Цитофаги и флавобактерии актиномицеты 0 Сфагнум кочка Сфагнум понижение Бациллы актиномицеты 50 100 Время, ч 150 200 Рис.12. Кривая периодического роста ассоциаций бактерий на полимерах. В качестве примера выбран Твин -20. На целлюлозе доминировали представители рода Cytophaga, на хитине – Chitinophaga. Таксономическое положение родов этих бактерий иллюстрирует таблица 5. Табл.5 Таксономическое положение доминирующих родов бактерий гидролитического комплекса Название рода Cytophaga Филум Класс Семейство Bacteroidetes Cytophagia Cytophagaceae Chitinophaga Bacteroidetes Sphingobacteria Sphingobacteriales Дендрограмма одного из штаммов, обладающих хитинолитической активностью, изображена на рис.13. 40 Рис 13. Дендрограмма выделенной культуры рода Chitinophaga Из ячеек с разными полимерами постоянно выделялись так же бациллы и актиномицеты. Среди бацилл доминировали представители таких широко распространённых видов как Bacillus cereus, Bac. subtilis и Bac. lentus-firmus. Представители последнего вида, имеющие ярко жёлтую окраску, являются характерными для болот, что было показано ранее другими исследователями. Таким образом, применённый нами комплексный метод может быть использован для скрининга гидролитически бактерий из природных местообитаний, в том числе и с практическими целями. На рис. 14 и рис. 15 представлены результаты определения максимальной удельной скорости роста и метаболической готовности к росту ассоциаций на полимерах (не отдельно по полимерам, а объединённые 41 вместе). Наша гипотеза состоит в том, что доля метаболически готовых к росту на полимерах ассоциаций отражает действительную готовность к потреблению полимеров in situ. Из рис. 14 следует, что метаболическая готовность к потреблению полимеров выше в сфагнуме на кочке, по сравнению с понижением. Доля быстрорастущих ассоциаций отражает долю r-стратегов в сообществе очёса. Из рис. 15 следует, что доля и этих бактерий выше в кочке. Median; Whisker: 25%-75% Метаболическая готовность к росту 100 99 98 97 96 95 94 93 92 91 90 Сфагнум очёс апррор понижение Сфагнум очёс кочка Рис. 14. Метаболическая готовность к росту на полимерах бактериальных ассоциаций (). 42 Median; Whisker: 25%-75% Максимальная удельная скорость роста, ч-1 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Сфагнум очёс Сфагнум очёсаппррппр кочка понижение Рис.15. Максимальная удельная скорость роста бактериальных ассоциаций на полимерах 43 Заключение В результате проделанной работы было установлено, что численность бактерий, определённая методом посева на 2 порядка выше в кочках, чем в микропонижениях. Это согласуется с повышенной эмиссией СО2 из кочек. По данным Глуховой с соавторами (Глухова и др., 2014) это превышение может составлять 2-5 раз. Кроме того, учитывая, что время жизни мхов на повышениях больше, можно сказать, что повышение микрорельефа более стабильно во времени. Всё это в сочетании с большей концентрацией кислорода в кочках, по сравнению с микропонижениями, свидетельствует о более благоприятных для развития и функционирования микроорганизмов условиях в кочках. Говорить о разной степени деструкции торфа в разных элементах микрорельефа практически невозможно, учитывая очень низкую скорость разложения верхового торфа в целом. Из приведённых нами данных следует, что даже на глубине 50 см степень деструкции сфагнового торфа составляет всего лишь 16%. И только в нижележащих горизонтах с переходным древесно-травяным типом торфа она приближается к 50%. Однако кроме сложных полимеров, входящих в состав сфагнума, которые с трудом поддаются гидролизу микроорганизмами, в тканях живого мха присутствует большая органического вещества. фракция легкодоступного для микробов Легко гидролизуемые и водорастворимые соединения составляют 42-52% в сфагновых мхах. Углеводы составляют 4080% органической массы растений. Известно, что в зелёных субапикальных сегментах сфагнума содержатся азот, фосфор и калий, причём в довольно значительных концентрациях. У сфагновых мхов наблюдается большое содержание разнообразных органических кислот: щавелевая, яблочная, янтарная, лимонная и др. (Montenegro et al., 2009). Таким образом, развивающиеся на поверхности и внутри клеток сфагнума бактерии могут потреблять эти вещества. Недаром, как установлено многими авторами и подтверждено в наших исследованиях, в верховых торфах доминируют 44 протеобактерии, среди которых преобладают копиотрофы и олиготрофы – т.е. те бактерии, которые не способны к гидролизу сложных полимеров, но растут на сахарах, органических кислотах, аминокислотах. Представляется так же интересным обсудить таксономический состав выделенных нами бактерий на родовом уровне. Во-первых, представители родов Pseudomonas, Flavobacterium, Burkholderia, Dyella были выделены и другим автором (Щербаков, 2014) из сфагнума в качестве эндофитных бактерий. Эти бактерии формируют специфические микрониши внутри тканей и рассматриваются им в качестве характерных обитателей гаметофитов сфагнума. Присутствие протеобактерий во внутренних тканях облегчает использование ими различных водорастворимых соединений. Вовторых, следует отметить работы исследователей (Warmink et al., 2009), в которых сообщается о том, что бактерии рода Burkholderia обнаружены в почвах, в том числе и торфяных, в микосфере, которая колонизирована сапротрофным макромицетным грибом Lyophyllum sp. Штамм Burkholderia terrae BS001 выделялся среди немногих бактерий, способных к миграции на растущем мицелии сапротрофного макромицета Lyophyllum sp. Karsten. Этот штамм не только сам мигрировал вдоль мицелия, но и помогал перемещаться другим бактериям, таким как Dyella japonica BS003. Совсем недавно было обнаружено, что эта способность к миграции не ограничивается только одним видом, но распространяется на нескольких близких видов рода Burkholderia (Nazir et al., 2012). Таким образом, учитывая большое количество грибов в живом сфагнуме и его очёсе, можно предположить и положительные взаимодействия между грибами и бактериями родов Burkholderia и Dyella, выделенными нами из торфяных почв. Вышеназванные авторы сообщили не только об отсутствии антагонистических отношений между этими протеобактериями и грибами. Ими было установлено, что ассоциированные с 45 грибами бактерии Burkholderia terrae защищают грибы от антагонистических агентов. Установленная нами высокая потенциальная способность бактериальных комплексов из очёса сфагнума и торфянистых горизонтов кочки использовать широкий спектр полимерных субстратов свидетельствует о более разнообразном составе бактерий-гидролитиков в этом типе микрорельефа. Не случайно нами выделены из очёса сфагнума кочек бактерии, разлагающие целлюлозу (Cytophaga) и хитин (Chytinophaga). Это связано, по-видимому, и с более разнообразными растениями на кочках, в том числе и травянистыми, грибами, содержащими целюлозу, хитин. Вероятно, этим же объясняется рост бактериальных комплексов из очёса сфагнума кочки на инулине, являющимся запасным веществом сложноцветных, и кератине (белке животных). Таким образом, функции исследуемых нами эпифитных и сапротрофных бактерий, обитающих в верховых торфяниках, достаточно разнообразны. Поскольку среди доминирующих бактерий преобладают протеобактерии, в основном, они сводятся к использованию таких простых веществ как сахара, органические кислоты, аминокислоты. К гидролизу более сложных полимеров (хитин, целлюлоза, кератин) готовы бактериальные сообщества очёса сфагнума, растущего на кочках. 46 Выводы 1. Численность бактерий эпифитно-сапротрофного комплекса, определённая методом посева, мало изменялась по профилю почвы, как в кочках, так и в микропонижениях. Однако в целом она была на два порядка выше в кочках, чем в микропонижениях 2. В бактериальных сообществах кочек и микропонижений доминируют протеобактерии. Доля бактерий гидролитического комплекса колебалась от 2 до 20% в кочках и достигала почти 40% в некоторых горизонтах в микропонижениях. Бактерии-гидролитики были представлены бациллами и актиномицетами. 3. С помощью молекулярно-биологического метода было выявлено доминирование среди протеобактерий представителей родов Pseudomonas, Acinetobacter, Dyella, Burkholderia. Все они являются аэробными бактериями, относящимися к эколого-трофической группе копиотрофов. 4. При использовании комплексного структурно-функционального метода установлена потенциальная способность бактериального комплекса очёса сфагнума кочках гидролизовать более широкий спектр полимеров, чем в понижениях. Доля сред с полимерами, на которых наблюдался рост, уменьшалась в понижении за счёт таких трудно разлагаемых субстратов как хитин и целлюлоза. 5. Метаболическая готовность к росту на полимерах и доля быстрорастущих бактерий оказались выше в бактериальных комплексах кочках, по сравнению с микропонижениях. 6. Посев из сред с полимерами позволил расширить спектр бактерий гидролитиков в очёсе сфагнума за счёт представителей группы флавобактерии-цитофаги и бактерий рода Chitinophaga. 47 Список литературы 1. Аболин Р.И. К вопросу о классификации болот Северо-3ападной области //Материалы по опытному мелиоративному делу. М., 1928. Т. 2. С. 3–55. 2. Бахнов В.К. Биогеохимические аспекты болотообразовательного процесса. Новосибирск: Наука, 1986. 193 с. 3. Богдановская-Гиенэф И.Д. Образование и развитие гряд и мочажин на болотах //Советская ботаника, 1936. № 6. С. 35–52. 4. Богдановская-Гиенэф И.Д. Типы внутризалежной воды //ГГИ, 1959. Вып. 39 (93). С. 80–95. 5. Богдановская-Гиенэф И.Д. Закономерности формирования сфагновых болот верхового типа (на примере Полистово-Ловатской болотной системы). Л.: Наука, 1969. 185 с. 6. Боч М.С., Мазинг В.В. Экосистемы болот СССР. Л.: Наука, 1979. 188 с. 7. Воробьев П.К. Исследование физических характеристик деятельного го ризонта неосушенных болот //Тр. ГГИ. Л., 1965. Вып. 126. С. 65–96. 8. Воробьев П.К. Приведение экспериментальных характеристик деятельно- го слоя залежи к расчетной поверхности микроландшафт //Тр. ГГИ. Л., 1979. Вып. 261. С. 90–95. 9. Глухова Т.В., Вомперский С.Э., Ковалев А.Г. Годовая эмиссия СО2 олиготрофных болот южнотаёжной зоны ЕТР с учётом микрорельефа //Почвоведение. 2014. №1. С. 48-57. 10. Головченко Микробиологические А.В., Добровольская основы оценки Т.Г., торфяника Звягинцев как Д.Г. профильного почвенного тела //Вестник Томского государственного педагогического университета. 2008. № 4 (78).Серия: Биологические науки. С. 46-53. 48 11. Головченко А.В., Панкратов Т.А., Добровольская Т.Г., Кухаренко О.С. Торфяные почвы как банк бактериального разнообразия // Труды Института экологического почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова “Роль почв в биосфере”. 2010. Выпуск 10. С. 181-209. 12. Головченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г. и др. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем // Почвоведение. 1993. № 10. С. 78-89. 13. Головченко А.В., Санникова Ю.В., Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г. Сапротрофный бактериальный комплекс верховых торфяников Западной Сибири // Микробиология. 2005. Т. 74. № 4. С. 545-551. 14. Гришин И.С. Влияние снежного покрова на формирование микрорельефа торфяных месторождений верхового типа их природных комплексов // Изучение состава и свойств торфа в целях его использования в народном хозяйстве. М., 1977. С 109–123. 15. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.:ИКЦ “Академкнига”, 2002. 282 с. 16. Добровольская Т.Г., Головченко А.В. Эколого-таксономическая структура бактериальных сообществ лесных почв гидроморфного ряда // Вестник МГУ. Сер. 17. почвоведение. 1999. № 1. С. 55-58. 17. Добровольская Т.Г., Головченко А.В., Звягинцев Д.Г. и др. Функционирование микробных комплексов верховых торфяников – анализ причин медленной деструкции торфа. М. КМК. 2013. 128с. 18. Добровольская Т.Г., Головченко А.В. , Кухаренко О.С., Якушев А.В., Семёнова Т.А., Инишева Л.И. Структура микробных сообществ верховых и низинных торфяников Томской области // Почвоведение. 2012. № 3. С. 317326. 19. Добровольская Т.Г., Головченко А.В., Панкратов Т.А., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Оценка бактериального разнообразия почв: эволюция подходов и методов // Почвоведение. 2009. № 10. С. 1222-1232. 49 20. Добровольская Т.Г., Головченко А.В., Якушев А.В., Манучарова Н.А., Юрченко Е. Н. Влияние механического измельчения сфагнума на структуру и физиологическое состояние бактериальных сообществ // Микробиология. 2014. Т.83. № 6. С. 712-721. 21. Добровольская Т.Г., Кухаренко О.С., Головченко А.В. Особенности таксономического состава бактериальных комплексов торфяников разного генезиса // Болота и Биосфера. Материалы 4-ой научной школы. 12-15 сентября 2005г. Томск. С. 164-169. 22. Добровольская Т.Г., Кухаренко О.С., Павлова Н.С., Кураков А.В. Функции бактерий сапротрофного блока в верховых торфяниках /Материалы докладов V1 Съезда общества почвоведов им. В.В. Докучаева. ПетрозаводскМосква. 13-18 августа 2012г. книга.2. С. 335-336. 23. Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В. Методы выделения иидентификации почвенных бактерий. М.: МГУ. 1989. 40 с. 24. Иванов К.Е. Образование грядово-мочажинного микрорельефа как следствие условий стекания влаги с болот //Вестник. ЛГУ, 1956. № 12. Вып.2. С. 58-72. 25. Иванов К.Е. Трофность среды обитания растительного покрова болот и гидролого–географический метод оценки некоторых ее показателей //Тр. ГГИ, 1988. Вып. 333. С. 3–20. 26. Илометс М.А. Изучение динамики прироста сфагнума и сфагнового тор- фа в целях стратиграфического расчленения торфяной залежи //Автореф. дисс. кан. г.-м. наук. Таллинн, 1981, 21 с. 27. Кац Н.Я., Кирилович М., Лебедева Н. Движение поверхности сфагновых болот и формирование их микрорельефа //3емлеведение, 1936. Т. 38. Вып. 1. С. 1–34. 28. Краснов И.И. О болотной солифлюкции и трансгрессии болот на среднем и северном Урале и прилегающих равнинах //Изв. ВГО, 1943. №1. С. 34– 37. 50 29. Кузьмин Г.Ф. Развитие олиготрофных болотных систем и перспективы их использования //Автореф. дисс…. к. г. н. Л., 1980. 21 с. 30. Куличевская И.С., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Выявление представителей Planctomycetes в сфагновых болотах с использованием молекулярных и культуральных подходов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 3. С. 389-396. 31. Куличевская И.С., Белова С.Э., Кевбрин В.В., Дедыш С.Н., Заварзин Г.А. Анализ бактериального сообщества, развивающегося при разложении сфагнума // Микробиология. 2007. Т. 76. № 5. С. 702-710. 32. Кухаренко О.С. Структура и активность бактериальных комплексов верховых и низинных торфяных почв автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.03 – микробиология. МГУ. ф-т почвоведения. 2011. 33. Лысак Л.В., Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М.:МАКС Пресс. 2003. 120с. 34. Метс Л. О. О движении воды и развитии микрорельефа в грядово- озерковом комплексе верховых болот //Уч. зап. Тартуского ун-та, 1978. № 440. С. 46–55. 35. Определитель бактерий Берджи. М.: “Мир”, 1997. Т. 1. 436с., Т. 2. 362с. 36. Панов В.В. Об организации болотных морфосистем на основе стереофо- тограмметрического метода наблюдений //Болота охраняемых территорий: проблемы охраны и мониторинга: Тр. 11-го Всес. семин.-экскур. болотоведов. Л., 1991. С. 100–103. 37. Панов В.В. Структурно-динамические особенности развития микрорельефа моховых болот// Болотные экосистемы севера Европы: разнообразие, динамика, углеродный баланс, ресурсы и охрана: Материалы международного симпозиума. Петрозаводск. 30 августа – 2 сентября 2005 г. Карельский научный центр РАН. С. 2006 – 2010. 51 38. Смоляницкий Л.Я. Некоторые закономерности формирования дернин сфагновых мхов //Бот. журн., 1977. № 9. Т. 52. С. 1269–1272. 39. Смоляницкий Л.Я. Метаболическая организация выпуклых олиготрофных болот //Антропогенные изменения, охрана растительности болот и прилегающих территорий. Мн.: Наука и техника, 1981. С. 206–210. 40. Щербаков А.В. Эндофитные сообщества сфагновых мхов как источник бактерий - эффективных ассоциантов сельскохозяйственных. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.03 – Микробиология. Санкт-Петербург – 2014. 41. Якушев А.В., Кухаренко О.С., Добровольская Т.Г. Влияние комплекса биологически активных веществ сфагнума на рост бактерий, выделенных из различных биотопов международным // Материалы участием всероссийского “Биологически симпозиума активные с вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее” М.: Макс Пресс. 2011. С. 148. 42. Якушев А.В. Комплексный струтурно-функциональный метод характеристики микробных популяций // Почвоведение. 2015. №4. С. 429446. 43. Dedysh S.N. Cultivating Uncultured Bacteria from Northern Wetlands: Knowledge Gained and Remaining Gaps // Front Microbiol. 2011; 2: 184. 44. Dedysh S.N., Belova S.E., Bodelier P.L.E. et al. Methylocystis heyeri sp.nov., a novel type II methanotrophic bacterium possessing ‘signature’ fatty acids of type I methanotrophs // IJSEM. 2007. V. 57. P. 472-479. 45. Dedysh S.N., Derakshani M., Liesack W. Detection and enumeration of methanotrophs in acidic Sphagnum peat by 16S rRNA fluorescence in situ hybridisation, including the use of newly developed oligonucleotide probes for Methylocella palustris // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4850-4857. 52 46. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E. et al. Phylogenetic analysis and in citu identification of bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72 (3). P. 2110 - 2117. 47. The Procaryotes //Berlin: Springer-Verlag. 1981. V. 1. 1102 p., V. 2. 1168 p 48. Kotsyurbenko O.R., Friedrich M.W., Simankova M.V. et al. Shift from acetoclastic to H2-dependent methanogenesis in a West Siberian peat bog at low pH and isolation of an acidophilic Methanobacterium strain // Appl. Environ. Microbiol. 2007. doi:10.1128/AEM.02413-06. 49. Kulichevskaya I.S., Ivanova A.O., Baulina O.I. et al. Singulisphaera acidiphila gen. nov., sp. nov., a non-filamentous, isosphaera-like Planctomycete from acidic northern wetlands // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 11861193. 50. Kulichevskaya I.S., Ivanova A.O., Belova S.E. et al. Schlesneria palidicola gen. nov., sp. nov., the first acidophilic member of the order Planctomycetales, from Sphagnum-dominated boreal wetlands // Int. J. Syst.Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2680-2687. 51. Montenegro G., Portaluppi M.C, Salas F.A., Diaz M.F. Biological properties of the Chilean nativemoss Sphagnum magellanicum // Biol.Rev. 2009. V. 42. № 2. P. 233-237. 52. Nazir R., Tazetdinova DI, van Elsas JD. Burkholderia terrae BS001 migrates proficiently with diverse fungal hosts through soil and provides protection from antifungal agents // Front Microbiol. 2014. V.11. №5. P. 598. 53. Opelt K, Chobot V, Hadacek F, Schönmann S, Eberl L, Berg G. Investigations of the structure and function of bacterial communities associated with Sphagnum mosses. Environ Microbiol. 2007; 91:2795–2809. 54. Pankratov T.A., Serkebaeva Y.M., Kulichevskaya E.S. et al. Substrate–induced growth and isolation of Acidobacteria from acidic Sphagnum peat // The ISME Journal. 2008. V. 2. P. 551-560. 53 55. Pankratov T.A., Tindall B.J., Liesack W., Dedysh S.N. Mucilaginibacter paludis gen. nov., sp. nov. and Mucilaginibacter gracilis sp. nov., pectin-, xylanand laminarin-degrading members of the family Sphingobacteriaceae from acidic Sphagnum peat bog // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. 2349-2354. 56. Sizova M.V., Panikov N.S, Tourova T.P. and Flanagan P.W. Isolation and characterization of oligotrophic acido-tolerant methanogenic consortia from a Sphagnum peat bog // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 45. P. 301-315. 57. Upton M., Hill B., Edwards C. et al., Combined molecular ecological and confocal laser scanning microscopic analysis of peat bog methanogen populations //FEMS Microbiol. Letters. 2000. V. 193. P. 275-281. 58. Warmink J. A. and. van Elsas J. D. Migratory Response of Soil Bacteria to Lyophyllum sp. Strain Karsten in Soil Microcosms // Appl Environ Microbiol. 2009. V. 75. № 9. P. 2820–2830. Хотелось бы выразить благодарность д.б.н. Манучаровой Наталье Александровне за помощь при идентификации бактерий молекулярно-биологическими методами. А также к.б.н. Головченко Алле Владимировне за предоставленные образцы и описание объектов. 54