Титова В.И., Козлов А.В. Методы оценки функционирования

ФГБОУ ВПО
НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
КАФЕДРА АГРОХИМИИ И АГРОЭКОЛОГИИ
Титова В.И., Козлов А.В.
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ
МИКРОБОЦЕНОЗА ПОЧВЫ,
УЧАСТВУЮЩЕГО В ТРАНСФОРМАЦИИ
ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА
НИЖНИЙ НОВГОРОД, 2011
ФГБОУ ВПО
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
Кафедра агрохимии и агроэкологии
Титова В.И., Козлов А.В.
Методы оценки функционирования
микробоценоза почвы,
участвующего в трансформации
органического вещества
Научно-методическое пособие
Нижний Новгород, 2012
УДК 631.46 : 631.427 : 631.417.2
ББК 40.30
Т 45
ISBN 978-5-903180-67-7
Титова В.И., Козлов А.В. Методы оценки функционирования микробоценоза почвы, участвующего в трансформации органического вещества: Научнометодическое пособие / Нижегородская с.-х. академия. – Нижний Новгород,
2012. – 64 с.
Пособие содержит описание методов определения численности и биологической активности основных групп микроорганизмов, участвующих в трансформации органического вещества почвы. Дана классификация почвенной
микрофлоры, разобраны принципы ее существования, показаны направления
динамики гетеротрофного микробоценоза почвы в связи с изменениями в условиях окружающей среды и химическом составе органического вещества, описаны основные деструкционно-синтетические функции и способы их количественного учета. Материал сопровождается теоретическими пояснениями как
по анализируемым объектам, так и по методам анализа.
Пособие предназначено для освоения методики микробиологических
и биохимических исследований почвы и рассчитано на студентов, аспирантов
и специалистов агроэкологического профиля.
Печатается по решению редакционно-издательского совета Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии.
Рецензенты:
И.Е. Постнов, докт. биол. наук, профессор,
зав. кафедрой защиты растений
Нижегородской ГСХА
К.Д. Дятлова, докт. пед. наук,
профессор кафедры биохимии
и физиологии растений
Нижегородского ГУ им. Лобачевского
ISBN 978-5-903180-67-7
© Титова В.И., Козлов А.В., 2012
© Нижегородская государственная
сельскохозяйственная академия, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ….…………………………………………………………………………………….......4
1. СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ……………………………….......5
1.1. Общая классификация почвенных микроорганизмов ………………………………...5
1.2. Эколого-трофическая классификация микрофлоры почвы………………………......7
2. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ,
РАЗЛАГАЮЩИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЫ...12
2.1. Учет численности аммонифицирующей микрофлоры………………………………..12
2.2. Протеолитическая активность почвы…………………………………………………..14
3. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ,
РАЗЛАГАЮЩИХ БЕЗАЗОТИСТЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ПОЧВЫ….19
3.1. Учет численности амилолитической микрофлоры……………………………………21
3.2. Инвертазная активность почвы……………………………………………….…………21
3.3. Учет численности целлюлолитической микрофлоры………………………………...26
3.4. Целлюлолитическая активность почвы………………………………………………..29
4. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ
ПРОМЕЖУТОЧНОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ………………………..34
4.1. Учет общей численности олиготрофных микроорганизмов почвы………………...35
4.2. Учет численности олигонитрофильной микрофлоры………………………………...35
4.3. Учет численности олигокарбофильной микрофлоры………………………………...36
5. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРЕОБРАЗУЮЩИХ
СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ…………………………37
5.1. Учет численности микроорганизмов-деструкторов гумуса………………………….40
5.2. Полифенолоксидазная активность почвы……………………………………………...42
5.3. Пероксидазная активность почвы……………………………………………………….47
6. УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ,
УЧАСТВУЮЩИХ В СИНТЕЗЕ ГУМУСА ПОЧВЫ……………………………………….49
6.1. Учет численности грибов…………………………………………………………………50
6.2. Учет численности актиномицетов……………………………………………………….51
7. ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ОБОГАЩЕННОСТИ ПОЧВЫ МИКРООРГАНИЗМАМИ
И РАСЧЕТ ЭКОЛОГО-ТРОФИЧЕСКИХ ИНДЕКСОВ ПОЧВЫ………………………...53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………………..59
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ………………………………………………………….60
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК……………………………………………………….......63
3
ВВЕДЕНИЕ
Современное сельское хозяйство стремится к получению высоких урожаев
сельскохозяйственных культур с приемлемым качеством продукции. Причем
возделывание последних уже давно не ограничивается традиционным севом
в полевых условиях. Широкое распространение овощеводства закрытого грунта,
малообъемной культуры и культуры гидропоники, выращивания в условиях точного полива или на искусственных грунтах, – все эти и многие другие методы
растениеводства все больше внедряются в нынешние способы расширения пищевой промышленности страны.
Несмотря на это, как традиционное полеводство, так и практически все современные способы получения урожаев культурных растений, так или иначе, основываются на использовании субстрата для выращивания. Последний может
представлять собой обычную почву, торф, а также различные грунты природного
или искусственного происхождения, основная масса которых сложена органическим веществом.
Главным компонентом почв и традиционных грунтов является органическая часть, поскольку в технологии выращивания культур она обеспечивает растения элементами роста и развития, создает для корней оптимальные условия
кислотности и буферности, а также выполняет многие другие функции.
Формирование органической составляющей в почве происходит при непосредственном участии микроорганизмов, многостороннее действие которых
на предшествующие растительные и животные остатки невозможно описать
в виде нескольких биохимических реакций. Причиной тому является как очень
сложный химический состав органического вещества, так и совокупность численности и большого разнообразия его перерабатывающей микрофлоры.
На сегодняшний день возрастающая потребность прикладной агрохимии
в методах диагностики пищевого режима почвы дошла до изучения микробиологической стороны доступности элементов питания и, в частности, до изучения
микрофлоры, участвующей в трансформации органического вещества, поскольку
именно оно может определять как потенциальное содержание, так и подвижность
питательных веществ растений. Кроме того, изучение микрофлоры различных
трофических уровней процесса переработки органической части почвы позволяет
понять ее общее состояние как компонента экосистемы.
Пособие содержит описание методов определения численности и биохимической активности микроорганизмов, участвующих в трансформации органического вещества почвы, что поможет исследователю оценить характер изменений
в пашне как в системе питания сельскохозяйственных культур.
4
1. СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ
Микробное сообщество почвы является сложной системой взаимодействующих организмов, чрезвычайно разнообразной и многочисленной по количеству
обитающих видов, выполняемым функциям и отношению к окружающей среде.
Предпосылкой формирования относительно постоянного и устойчивого микробного пула в почвах различных географических широт послужила многовековая
эволюция педосферы в меняющихся условиях окружающей среды. Ежегодные
колебания температуры воздуха и наличия свободной влаги, а также количества
свежего органического вещества привели к формированию таких условий жизни
микроорганизмов, в которых они зачастую пребывали в физиологическом стрессе, что и побудило почвенный микробоценоз к ведению активной борьбы за факторы жизни.
Основная роль микроорганизмов в формировании и развитии почв Земли
сводится к соединению в педосфере двух главных круговоротов вещества –
большого геологического и малого биологического, в результате чего вещество
планеты изменяется по общему биогеохимическому пути “органическое вещество – минеральное – органическое – минеральное…”.
Биогеохимические процессы минерализации мертвого органического вещества растений и животных до конечных продуктов (Н2О, СО2, СО, СН4, NH3, N2,
Н2 и т.д.) с их возвратом в атмосферу идут при обязательном участии различных
групп микроорганизмов, населяющих почву. Не случайно около 90% всего углекислого газа на Земле образуется из органических веществ при их микробном
разложении и только 10% приходится на долю дыхания высших организмов и деятельности человека. Высвобождение углекислого газа, исходного для фотосинтетического процесса, замыкает глобальную цепь превращения вещества планеты
и, тем самым, движение материи не приостанавливается.
Общее предназначение и, вместе с тем, разносторонняя деятельность позволяют всю совокупность микроорганизмов почвы классифицировать по многим
признакам, но наиболее универсальные градации представлены в виде их общей
и эколого-трофической классификации.
1.1. Общая классификация почвенных микроорганизмов
Несмотря на крайне сложную и до конца нераскрытую организацию микроскопической жизни в почве, всю совокупность почвенных микроорганизмов
условно классифицируют по двум основным признакам: по цитологическому
(клеточному) признаку и по виду их основной деятельности в почве (функциональному признаку). Вместе с тем, примеры приведенных классификаций не
5
охватывают всего почвенного микробонаселения, а указывают только на основные его виды, так или иначе участвующие в преобразовании органического вещества.
1. Классификация по клеточному признаку:
а). Неклеточные формы жизни – вирусы (Virus), вироиды (Viroides) и фаги
(Phages): не способны к самостоятельной жизни в почве вне клеток других организмов, поскольку являются паразитами как растений, животных и человека
(вирусы и вироиды), так и микроорганизмов (фаги). Их роль в почвенных процессах сводится скорее к регулированию численности и биохимической активности прочих микроскопических обитателей почвенного покрова;
б). Клеточные формы жизни:
 доядерные формы – прокариоты (Procaryotae): археи или архебактерии
(Mendosicutes); истинные бактерии (Eubacteria), в т.ч. цианобактерии
(Cyanobacteria), актиномицеты (Actinomyces) и другие группы. Выполняют самые разнообразные биохимические реакции в почве, в том числе
участвуют в преобразовании неорганических веществ (архебактерии), вызывают гниение мертвой растительной и, главным образом, животной массы (многие из истинных бактерий), проводят фотосинтез и образуют первичное органическое вещество (цианобактерии), образуют пигментные вещества и компоненты гумуса (актиномицеты);
 ядерные формы – эукариоты (Eucaryotae): грибы (Mycota), в т.ч. низшие,
высшие и дрожжи; микроскопические водоросли (Algae); простейшие
(Protozoa); лишайники (Lichenes) и другие группы. Грибы участвуют в деструкции всех, в том числе трудноразлагаемых веществ почвы (лигнин,
смолы, клетчатка, дубильные вещества, гумус, искусственные полимеры,
нефтепродукты и т.п.) и, при этом, образуют пигменты, имеющие значение
в гумусообразовании. Микроскопические водоросли проводят фотосинтез
и дополнительно насыщают почву органическим веществом. Роль простейших в почве состоит, главным образом, в изменении численности клеток прокариотных микроорганизмов. Лишайники как симбиотические организмы грибов и микроскопических водорослей способны участвовать
в фотосинтезе, насыщая почву органическим веществом, а также способны
разлагать компоненты минералов.
2. Классификация по функциональному признаку:
6
а). Синтетики (продуценты) – вне зависимости от способа питания главная
их роль в почве состоит в биохимическом образовании определенных компонентов, значимых для формирования органического вещества почвы:
 бактерии-азотфиксаторы (связывая молекулярный азот воздуха, образуют
аммиак (NH3) и белковые вещества);
 микроскопические водоросли (осуществляя фотосинтез, образуют молекулярный кислород (О2) и первичные органические вещества – углеводы);
 пигментированные бактерии, актиномицеты и грибы (синтезируя пигменты, участвуют в образовании гумуса почвы);
б). Деструкторы (редуценты) – также вне зависимости от способа питания
главная их роль в почве состоит в разложении определенных веществ, как органических, так и минеральных:
- органотрофы – разлагают преимущественно органическое вещество:
 аммонификаторы (разлагают белковые вещества почвы);
 амилолитики (разлагают углеводные соединения почвы);
 целлюлозо-, лигнино-, пектинолитики;
 гумусоразлагающие микроорганизмы;
 углеводородредуцирующие и другие виды деструкторов;
- литотрофы – преобразуют преимущественно неорганическое вещество:
 нитрификаторы (преобразуют NH4+ в NO3–);
 денитрификаторы (преобразуют NO3– в N2↑);
 сульфатредуцирующие (преобразуют различные соединения серы);
 фосфорные, силикатные, металлоокисляющие и другие виды.
1.2. Эколого-трофическая классификация микрофлоры почвы
Почвенные микроорганизмы в большей или меньшей степени являются
космополитами, но за счет их микрозонального развития в почве, при появлении
в среде обитания какого-либо субстрата, они, так или иначе, начинают его преобразование. В таком случае говорят о выполнении местной микрофлорой, сформировавшейся в той или иной микрозоне, определенной функции, которая проявляется в изменении качественных и количественных свойств самой почвы (например, плодородия пашни определенной территории).
Общие теоретические положения о разделении почвенного микробоценоза
и о его экологическом характере были высказаны еще в учении академика
С.Н. Виноградского, которое позднее развил и дополнил выдающийся ученыймикробиолог Е.Н. Мишустин. В итоге сформировалось единое представление об
7
экологических нишах почвенной микробиоты, которое разбивает всю ее совокупность на 4 условных группы микроорганизмов: зимогенная, олиготрофная, автохтонная и автотрофная микрофлора.
Первые три группы микроорганизмов относятся к гетеротрофам (органотрофам), которые в своем питании нуждаются в готовом органическом веществе. В свою очередь, автотрофная микрофлора способна образовывать органическое вещество в собственных клетках и для этого использует в питании вещества неорганической природы. Поэтому многие из автотрофных микроорганизмов почвы являются литотрофами.
Зимогенная микрофлора (от греч. zyme – закваска, genes – рождающий) – в
обычном состоянии почвы (неудобренность или промежуток времени между поступлениями растительных остатков в почву) небольшая по количеству группа
микроорганизмов, которая, как правило, дает резкий подъем своей численности
в момент поступления свежего органического вещества, так как специализируется на разложении легкодоступных органических соединений растительного и животного происхождения. Из бактерий в эту группу входят представители р. Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, из грибов – р. Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Cladosporium, в том числе дрожжевые формы р. Lypomyces, Cryptococcus, Candida
и многие другие виды микроорганизмов.
Олиготрофная микрофлора (от греч. oligos – немного, trophe – питание)
составляет бóльшую часть почвенного микронаселения, представители которого
усваивают питательные вещества из растворов с низкой концентрацией как азотсодержащих (олигонитрофилы), так и безазотистых углеродсодержащих органических (олигокарбофилы) соединений. Названная “микрофлорой рассеяния”, эта
группа, по сути, является преемницей минерализационного процесса, активируемого зимогенной микрофлорой, и завершает разложение остатков свежего органического вещества. Сюда входят многие бактерии р. Hyphomicrobium, Ancalomicrobium, Prosthemicrobium, Stella, Seliberia, Caulobacter, Renobacter и другие роды
и виды.
Зимогенная и олиготрофная часть микробоценоза почвы объединяется в
общую группу сапротрофных микроорганизмов (или сапротрофов), поскольку
перерабатывают мертвое органическое вещество остатков растений и животных
различной степени разложенности.
Автохтонная микрофлора (от греч. autochtoes – абориген, местный, коренной, исконный) представляет собою исходное сообщество микроорганизмов
неудобренной почвы, характерное для конкретного ее типа, изначально в ней
развивающееся и постоянно в ней присутствующее. По сути это потенциальный
запас микроорганизмов любой почвы. Данная группа включает в себя множество
8
представителей различных таксономических классов, которые в условиях естественного биоценоза завершают минерализацию труднодоступных органических
соединений растительных и животных остатков и участвуют в процессах их гумификации, а в условиях агроценоза, где наблюдается минимальное поступление
органического вещества и повышена аэрация почвы, минерализуют гумусовые
вещества как единственный источник углеродной пищи. Поэтому автохтонную
часть почвенного микробного сообщества в зависимости от складывающихся
условий окружающей среды рассматривают как в качестве синтетиков гумуса,
так и в качестве его деструкторов. Из автохтонных микроорганизмов наиболее
подробно изучены бактерии р. Nocardia и р. Pseudomonas. Также в эту группу относят некоторые виды р. Flavobacterium, Arthrobacter, Micromonospora, Mycobacterium, Rhodotula и другие виды.
Автотрофная микрофлора (от греч. autos – сам, trophe – питание) – микроорганизмы, трансформирующие неорганические соединения почвы. В эту
группу входят нитрифицирующие бактерии (р. Nitrosomonas, Nitrovibrio и другие), разрушители минералов почвы – литотрофы (р. Metallogenium, Bacillus mucilaginous, siliceous) и многие другие виды микробиоты.
Понимание роли микрофлоры в эволюции и формировании почвы связано
со знанием ее метаболизма. По типу питания строгих зимогенных микроорганизмов или олиготрофов в почве не существует. Причиной тому послужило ее микрозональное состояние, создающееся вокруг единичных сообществ микроорганизмов, которое диктует свой способ питания.
Известно, что клетки микробов собраны в микроколонии, которые изолированы друг от друга большими пространствами почвенных пор, прослоек воды,
органического и минерального вещества, поэтому могут развиваться сравнительно индивидуально. Например, в условиях наличия свежего органического вещества на поверхности почвенной частицы в нем активно развивается зимогенная
микрофлора. Следом за типичными сапротрофами на оставшейся части органического вещества будут развиваться олиготрофы. Но при этом внутри самóй частицы, где практически нет запаса органической пищи, развиваются только олиготрофы и автотрофы (рис. 1.1 и 1.2).
Для более полного познания особенностей жизни микробоценоза почвы
академиком Д.Г. Звягинцевым были сформулированы принципы взаимного существования почвенных микроорганизмов.
Принцип запаса микроорганизмов (принцип формирования в почве микробного пула) – в почве всегда имеется избыточный запас микробов, не обеспеченных для полноценной жизнедеятельности органическим веществом и другими
9
элементами питания. В условиях данного лимитирующего фактора развитие
и размножение микроорганизмов зачастую происходит сравнительно медленно.
По этой причине почву также называют местообитанием с рассеянным пищевым
достатком. С другой стороны, микробный пул – это не только огромная численность, но и весьма большое разнообразие. По микробному генофонду почва является самым богатым субстратом на Земле и среди прочих местообитаний выживаемость всего комплекса микроорганизмов в условиях неблагоприятной окружающей среды максимальна именно в почве.
Рис. 1.1. Микрозональное развитие бактерий
(по Звягинцеву, 2005)
Рис. 1.2. Микрозональное развитие грибов
(по Звягинцеву, 2005)
Принцип запаса микробных метаболитов – несмотря на то, что микроскопическая жизнь в почве протекает медленно, только часть общего количества
микроорганизмов находится в состоянии глубокого покоя (в виде эндоспор и
анабиотических (некультивируемых) форм бактерий, спор актиномицетов и грибов). Причиной тому служит то, что в почве постоянно поддерживается запас
легкодоступных органических веществ. В частности, главную роль в питании
микроорганизмов играет запас внеклеточных метаболитов, который способствует
выживанию микробных клеток в неблагоприятных условиях.
Данный запас представлен некоторым количеством сахаров, органических
кислот и спиртов, аминокислот, пуриновых, пиримидиновых оснований и другими соединениями. Этот запас не дает погибнуть микробам в периоды, когда в
почву или в конкретную ее микрозону не поступают свежие органические вещества. Кроме того, почва обладает механизмом поддержания запаса метаболитов
на необходимом уровне. Он основывается на накоплении внеклеточных гидролитических ферментов, благодаря работе которых запас простых органических веществ пополняется в результате гидролиза гумуса и других устойчивых органических полимеров, имеющихся в почве.
10
В итоге запас гидролитических ферментов обеспечивает запас простых органических веществ, а последний дает возможность существования в почве колоссального пула микроорганизмов.
Принцип дублирования выполняемых функций – все физиологобиохимические процессы почвы строятся на существовании нескольких функционально дублирующих друг друга видах микроорганизмов. Например, нитрификацию в почве проводят представители восьми основных родов микроорганизмов
(р. Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio, Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus), а функцию разложения органического вещества способно выполнять бесчисленное множество видов почвенного микробонаселения.
Принцип обратимости микробиологических процессов – любой процесс
превращения вещества в почве микроорганизмы ведут в двух взаимно противоположных направлениях: разрушение белков, сахаров, целлюлозы, хитина и одновременное их образование в собственных клетках.
Принцип ненасыщенности комплекса почвенных микроорганизмов – риск
мгновенной гибели чужеродных микроорганизмов (например, микрофлоры применяемых биопрепаратов, а также патогенных видов микроорганизмов, для которых основным местом обитания является живое растение или животное), попадающих в почву, достаточно мал, поскольку почва является благоприятной средой обитания. По этой причине микробы биопрепарата какое-то время активно
развиваются и действуют, а возбудитель болезни растения (животного) не погибает и сохраняется в покоящейся форме.
В то же время внесенный инородный микроорганизм никогда не займет
доминирующего положения среди автохтонной части микробоценоза, поскольку
не приспособлен к существованию в данных условиях. Вследствие этого биопрепараты имеют свой период активного действия, а фитопатогенные виды микробов в почве практически неактивны и сохраняются в цистах или спорах до изменения условий жизни (попадание возбудителя болезни в растение-хозяина).
В целом нельзя говорить о строгой организации почвенного микробоценоза
и абсолютной дифференциации микроорганизмов по выполняемым функциям.
Однако можно констатировать, что почвенные микроорганизмы во всей совокупности по-разному реагируют на изменения окружающей среды и, в частности,
на количество и химические особенности поступающей для них пищи. Вследствие этого изменяется структура и численность микробного пула почвы, которое
неизбежно отражается на показателях ее плодородия.
11
2. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЫ
Среднее количество бактерий в почве составляет примерно 70% от всех
почвенных микроорганизмов, актиномицетов – 30%, грибов – 1-3% от объема
микрофлоры. В зависимости от складывающихся условий каждая из этих групп
выполняет в почве определенную роль, а конечный результат их деятельности
будет определяться особенностями взаимоотношений между функциональными
единицами микробоценоза (микробными консорциями) и изменением вещественного состава почвы.
В целом же функциональный подход к учету деятельности микрофлоры
почвы складывается из индивидуального изучения количества и биологической
активности каждой микробной группы, что имеет большое значение в комплексной оценке агроэкосистем.
В условиях агроценоза основной массой ежегодно поступающего в почву
органического вещества являются растительные остатки сельскохозяйственных
культур, органические удобрения и сидераты, вещественный состав которых
складывается, в основном, из азотсодержащих и безазотистых компонентов. Вместе с накопленной микробомассой все количество мертвого органического вещества растений подвергается процессу минерализации.
Известно, что разложение органических соединений азота выполняется,
главным образом, аммонифицирующими микроорганизмами. В дальнейшем соединения азота перерабатываются нитрифицирующей и денитрифицирующей
группами почвенного микробоценоза. Безазотистые органические вещества разлагаются по типу кислородного окисления и сбраживания амилолитиками, целлюлолитиками и прочими группами микроорганизмов зимогенной части микробоценоза почвы. Все эти процессы приводят к пополнению почвы биогенными
элементами, доступными для растений.
2.1. Учет численности аммонифицирующей микрофлоры
Процесс разложения органического азотсодержащего вещества почвы
начинается с аммонификации.
Аммонификация – разложение белковых соединений растительных, животных остатков и органических удобрений, которое протекает под действием протеолитических экзоферментов (протеаз) и сопровождается выделением аммиака.
При наличии в почве свежего органического вещества аммонифицирующая
микрофлора становится самой многочисленной и таксономически разнообразной.
12
Поэтому в таких условиях данная группа микроорганизмов временно занимает
нишу зимогенной части микробоценоза почвы.
Численность аммонификаторов, представленных аэробными и анаэробными прокариотами, плесневыми грибами, актиномицетами и прочими видами микрожизни, может достигать 1010 колониеобразующих единиц (КОЕ) и выше.
Образующийся в результате жизнедеятельности этой группы микроорганизмов аммиак, а также промежуточные продукты распада белков (амины, аминокислоты и их производные) способны усваиваться растениями в качестве источников главного элемента питания – азота. Поэтому учет численности аммонифицирующей микрофлоры и протеолитической активности почвы является
важным этапом в микробиологической оценке состояния плодородия пашни
и в почвенно-экологическом мониторинге сельскохозяйственных земель.
Общую численность аммонифицирующей микрофлоры учитывают чашечным методом посева на мясо-пептонный агар (МПА) или методом предельных
разведений с посевом на пептонную воду (ПВ).
Посев на чашки с МПА производят из одного разведения почвенной суспензии на выбор (от 10–5 до 10–8) в зависимости от содержания органического
вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем большее ее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек
проводят в термостате при +28°С, подсчет выросших колоний проводят на второй-четвертый день после посева.
Приготовление мясо-пептонного агара проводят в соответствии с методикой, изложенной на упаковке готового сухого препарата МПА. Автоклавирование приготовленной питательной среды проводят при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 20-30 мин.
Посев в пробирки с ПВ (по 5 мл среды на пробирку) производят из нескольких (3х-4х и более) разведений почвенной суспензии (от 10–2 до 10–8). Диапазон
высеваемого разведения выбирают также в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность
почвы, тем более широкий интервал ее разведения необходимо взять для посева).
В качестве микробиологического отклика аммонификаторов ожидают и
фиксируют помутнение среды в пробирках, появление пузырьков NH3↑ и посинение лакмусовой бумаги в парах воздуха пробирки. Инкубацию пробирок проводят в термостате при +28°С, учет – на второй-четвертый день после посева.
Приготовление пептонной воды ведут следующим образом: к 1 л дистиллированной воды прибавляют 5 г пептона, размешивают стеклянной палочкой,
ставят на асбестовую сетку, доводят до кипения и, помешивая, кипятят 15 мин
13
на медленном огне. Затем в горячий раствор вносят навески веществ:
MgSO4•7H2O – 0,5 г, КН2РО4 – 1 г, К2НРО4 – 1 г и NaCl – 0,5 г. Соли полностью
растворяют перемешиванием, затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,0 атм. в течение 25 мин.
После подготовки питательных сред производят посев почвенной суспензии в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний на чашках Петри (на МПА) или микробиологический отклик в пробирках (на ПВ) и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
Методика посева почвенной суспензии на чашки и пробирки, а также расчет и оценка численности микрофлоры почвы подробно изложены в учебнометодическом пособии Титовой В.И., Козлова А.В. “Методы учета численности
и биомассы микроорганизмов почвы” – Н. Новгород: НГСХА, 2011. – 40 с.
2.2. Протеолитическая активность почвы
В связи с тем, что с повышением плодородия почвы наиболее тесно связана
активность ферментов азотного режима и, в частности, ферментов протеаз, значимость определения протеолитической активности почвы, в том числе и вырабатываемой аммонифицирующей микрофлорой, очень высока. Поэтому биохимическую активность разложения азотсодержащего органического вещества
в почве оценивают по ее протеолитической активности, то есть по активности
гидролитических ферментов класса протеаз.
Протеазы – класс экзоферментов микробного и растительного происхождения, катализирующих гидролитическое расщепление белков растительных, животных остатков и органических удобрений до полипептидов и, далее до аминокислот, действуя на пептидную связь по принципиальной схеме:
14
Амины, аминокислоты и образующийся из них аммиак способны усваиваться культурными растениями и в целом влиять на азотный режим почвы, что,
несомненно, важно в оценке продуктивности пахотных земель.
Определение протеолитической активности почвы
по Галстяну и Арутюнян
Принцип метода
Метод основан на способности протеолитических ферментов почвы расщеплять белковый субстрат до аминокислот с последующим определением их
количества с помощью нингидрина. В качестве субстрата используют желатин.
По количеству образующихся из желатина аминокислот судят о протеолитической активности почвы, которая выражается в мг глицина/1 г почвы за 24 ч.
Для оценки уровня протеолитической активности почвы в схему опыта
вводятся следующие варианты:
1) почва без субстрата (без желатина): показывает естественную протеолитическую активность почвы. Определяется количество глицина (К1), которое образуется из имеющегося в почве свежего азотсодержащего органического вещества. По сути это активность собственно фермента,
имеющегося в почве на момент определения;
2) почва с субстратом (с добавлением желатина): показывает потенциальную протеолитическую активность почвы. Определяется количество
глицина (К2), которое образуется из заведомо увеличенного количества
органического вещества за счет добавления желатина. По сути это биохимическая активность аммонифицирующей микрофлоры, вырабатывающей протеолитические ферменты для разложения субстрата;
3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность определения результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, использующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество глицина и других аминокислот (К3), которые могут содержаться в воде
и реактивах.
Ход работы
В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических
колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.
1). Вариант 1.
Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
15
на 100 мл, приливают 0,5 мл толуола и 10 мл фосфатного буфера (рН 7,4). Колбу
закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно
перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию
в термостат при +30°С на одни сутки.
2). Вариант 2.
Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 100 мл, приливают 0,5 мл толуола и 10 мл 1% раствора желатина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +30°С на одни
сутки.
Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности
и расчета Kw.
3). Вариант 3.
В коническую колбу на 100 мл приливают 0,5 мл толуола и 10 мл 1% раствора желатина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение
30 мин. на ротаторе.
По окончании инкубации в колбы всех вариантов опыта приливают
по 0,5 мл 0,1 n раствора H2SO4 и 3 мл 20% раствора Na2SO4 для осаждения белков. Полученные суспензии в колбах перемешивают в течение 5 мин. на ротаторе, переливают в три центрифужные пробирки и центрифугируют со скоростью
6000 об./мин. в течение 10 мин. Затем в три мерные колбы на 50 мл отбирают
по 5 мл центрифугатов и приливают в каждую по 1 мл 2% раствора нингидрина,
приготовленного на ацетоне. Смесь встряхивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. В течение нагревания раствор приобретает синефиолетовый оттенок. Окрашенный раствор в каждой колбе доводят до метки дистиллированной водой и колориметрируют при λ = 540 нм (фотоколориметр
ФЭК-56М, светофильтр 6) в кюветах на 5 мм.
Выбор искомого показателя протеолитической активности почвы и, соответственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме,
представленной в таблице 2.1.
16
2.1. Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов
анализируемых образцов при определении протеолитической активности
Раствор сравнения
№
Искомый показатель
Раствор измерения
п/п
(холостой раствор)
1
актуальная (естественная)
протеолитическая активность (АПА)
2
потенциальная
протеолитическая активность (ППА)
раствор почвы,
заложенной
без желатина (К1)
раствор почвы,
заложенной
с желатином (К2)
раствор
реактивов (К3)
раствор
реактивов (К3)
Построение калибровочного графика
Навеску 0,1 г химически чистого глицина растворяют в дистиллированной
воде в мерной колбе на 100 мл: в 1 мл полученного рабочего раствора будет содержаться 1 мг глицина. Затем берут 6 мерных колб на 50 мл, приливают в каждую определенный объем рабочего раствора в соответствии с таблицей 2.2, затем
добавляют по 1 мл раствора нингидрина, встряхивают и ставят на кипящую водяную баню. Нагревание растворов проводят до появления устойчивой синефиолетовой окраски различной интенсивности, которая проявляется, как правило, через 2-10 мин. с начала нагревания. Затем доводят до метки и проводят колориметрирование калибровочных растворов относительно холостого раствора,
приготовленного на дистиллированной воде (в дополнительную мерную колбу на
50 мл приливают 10 мл дистиллированной воды, добавляют 1 мл 2% раствора
нингидрина, ставят на кипящую водяную баню примерно на 10 мин., затем доводят до метки и перемешивают).
2.2. Исходные данные для построения калибровочного графика
№
колбы
1
2
3
4
5
6
Объем рабочего
раствора глицина, мл
1
2
4
6
8
10
Содержание глицина,
мг/50 мл
1,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Отсчет по прибору
По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат
откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровочных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации
глицина (мг/50 мл).
17
Расчет результатов анализа
Полученное по графику содержание глицина (мг/50 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном без желатина, пересчитывают в актуальную протеолитическую активность почвы по следующей формуле:
АПА = А1 • V1 • Kw / V2 • m
(1)
где АПА – актуальная протеолитическая активность почвы,
мг глицина/1 г абс.-сух. почвы за 24 ч.;
А1 – количество глицина опытного образца К1,
найденное по калибровочному графику, мг/50 мл;
V1 – общий раствор после инкубации почвы,
из которого берется аликвота, мл (V1 = 14 мл);
V2 – аликвота, взятая на анализ, мл (V2 = 5 мл);
m – навеска почвы, г (m = 2 г);
Kw – поправка на влажность почвы, рассчитываемая по формуле:
Kw = (100 + W) / 100
(2)
где W – влажность почвы, %.
Полученное по графику содержание глицина (мг/50 мл) в анализируемом
образце почвы, заложенном с желатином, пересчитывают в потенциальную протеолитическую активность почвы по формуле (3):
ППА = А2 • V1 • Kw / V2 • m
(3)
где ППА – потенциальная протеолитическая активность почвы,
мг глицина/1 г абс.-сух. почвы за 24 ч.;
А2 – количество глицина опытного образца К2,
найденное по калибровочному графику, мг/50 мл и т.п.
Образец
почвы
Навеска
почвы, г
№
m
2
2
почва
почва + желатин
ФОРМА ЗАПИСИ
Количество
Отсчет
Объем
глицина,
по
аликвонайденное
приты, мл
по графику,
бору
мг/50 мл
V2
–
А
5
А1 –
5
А2 –
18
Протеолитическая активность,
мг глицина / 1 г
почвы за 24 ч.
Оценка
активности
ПА
табл. 7.3
АПА –
ППА –
Реактивы
1) раствор желатина 1%: 1 г желатина растворяют в 99 мл фосфатного буфера при нагревании на асбестовой сетке;
2) фосфатный буфер (рН = 7,4): готовят из раствора А (5,938 г
Na2HPO4•2Н2О растворяют в дистиллированной воде в колбе на 500 мл
и доводят до метки) и раствора Б (0,908 г КН2РО4 растворяют в дистиллированной воде в колбе на 100 мл и доводят до метки), смешивая в химическом стакане 400 мл раствора А и 100 мл раствора Б;
3) раствор H2SO4 0,1 n: 2,8 мл конц. H2SO4 (пл. 1,84) вливают в 500 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л, осторожно перемешивают
и доводят водой до метки;
4) раствор Na2SO4 20%: 20 г сульфата натрия растворяют в 80 мл дистиллированной воды при нагревании на асбестовой сетке;
5) раствор нингидрина 2%: 1 г нингидрина растворяют в стакане в 50 мл
ацетона. Непосредственно перед анализом 47,5 мл ацетонового раствора
нингидрина смешивают в химическом стакане с 0,5 мл концентрированной
(ледяной) уксусной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Полученный
раствор используется только в свежеприготовленном виде;
6) глицин, х.ч.;
7) толуол, х.ч.
Определение численности аммонифицирующей микрофлоры в почве и
определение почвенной протеолитической активности является важным звеном
в комплексной микробиологической оценке биохимической активности как целинных, так и окультуренных земель сельскохозяйственного производства.
3. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ БЕЗАЗОТИСТЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ПОЧВЫ
Одновременно с активной жизнедеятельностью аммонифицирующих микроорганизмов, принимающих участие в разложении белков и их производных,
в почве существуют целые популяции микробиоты, деятельность которых
направлена на деструкцию безазотистых компонентов почвенного органического
вещества. К данным группам микробоценоза относят многие виды неспоровых
бактерий, большинство микроскопических плесневых грибов, некоторые актиномицеты, лишайники и другие формы почвенной микрожизни.
В то же время известно, что процессы разложения таких безазотистых органических веществ почвы, как крахмал, клетчатка, гемицеллюлоза, пектины, та19
нины и прочие, напрямую зависят от наличия в почвенном растворе доступного
азота, поскольку последний принимает участие как в построении клеточных стенок данных микроорганизмов, так и в формировании ими выделяемых ферментов
(амилаз, инвертаз, целлюлаз и других), разрушающих безазотистые полимеры.
Усваивая минеральный азот, данные микроорганизмы получают дополнительную
энергию для разложения небелковых компонентов почвенного органического
вещества.
Поэтому изучение процессов минерализации безазотистых органических
веществ почвы начинают с учета численности микроорганизмов, способных иммобилизировать неорганические формы азота.
Иммобилизация – процесс микробиологического связывания минерального
азота, образующегося в результате аммонификации белковых веществ растительных остатков и органических удобрений.
Процесс иммобилизации азота почвенной микрофлорой играет значительную роль в превращениях как азотсодержащих, так и безазотистых веществ.
Известно, что при разложении каждых 100 г органического вещества растительных остатков (или в среднем 50 г углерода) аммонификаторы на синтез
белка своих клеток используют примерно 2 г почвенного азота (C : N = 25 : 1).
При содержании азота в органическом веществе разлагающейся растительной
биомассы менее 2% (C : N > 25 : 1) он, таким образом, может быть полностью
иммобилизирован (связан) в клетках микроорганизмов, а при более высоком его
содержании (C : N < 25 : 1) в почву будет выделяться свободный аммиак, который затем преобразуется в нитрат-ион (обе формы азота подвижны и способны
к миграции). Именно поэтому навоз и другие органические удобрения животного
происхождения насыщают почву аммиачным азотом, так как соотношение C : N
в них очень узкое (C : N ≈ 5 : 1).
В то же время внесение в почву соломы в качестве органического удобрения может приводить к азотному голоданию сельскохозяйственных культур, так
как за счет широкого соотношения в соломе углерода и азота (C : N ≈ 50 : 1) аммонифицирующая микрофлора для обеспечения своей жизнедеятельности и деструкции соломы начинает использовать почвенный азот.
Учитывая, что до 25% минерального азота удобрений может быть иммобилизировано в клетках микробов и какое-то время пребывать в недоступном для
растений состоянии, следует признать, что явление микробного распределения
неорганических соединений азота в почве очень важно для оценки его доступности в питании культурных растений. Это дает возможность принять квалифицированные решения по улучшению питания растений, рекомендуя к внесению уг20
лерод- или азотсодержащие вещества, а также снизить (или предотвратить) газообразные потери азота из почвы в окружающую среду (атмо- и гидросферу).
Именно поэтому в рассмотрение микробиологического преобразования безазотистых компонентов удобрений и почвы следует включать методы, позволяющие учесть численность и продуктивность микрофлоры, способной усваивать
минеральные формы азота.
3.1. Учет численности амилолитической микрофлоры
Общую численность амилолитической микрофлоры, участвующей в разложении безазотистых соединений почвы и, одновременно с этим, обеспечивающей
иммобилизацию азота, учитывают чашечным методом посева на крахмалоаммиачный агар (КАА).
Посев на чашки с КАА проводят из одного на выбор разведения почвенной
суспензии (от 10–4 до 10–6) в зависимости от содержания органического вещества
в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее
большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят
в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый
день после посева.
Приготовление КАА производят путем последовательного растворения
в 1 л дистиллированной воды следующих реактивов: крахмал – 10 г, (NH4)2SO4 –
2 г, К2НРО4 – 1 г, MgSO4•7H2O – 1 г, NaCl – 1 г, СаСО3 – 3 г, агар-агар – 20 г. Соли и агар полностью растворяют нагреванием на асбестовой сетке и перемешиванием. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 20-30 мин.
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество
колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
3.2. Инвертазная активность почвы
Определение инвертазной (инвертолитической) активности почвы, помимо
ферментов инвертаз, вырабатываемых корнями растений, также основано на учете биохимических особенностей микроорганизмов-иммобилизаторов минерального азота, поскольку его усвоение данной микрофлорой сопровождается разложением углевода крахмала.
После разрушения крахмала до олиго- и дисахаров, амилолитическая микробиота начинает продуцировать ферменты глюкозидгидролазы (инвертазы),
способные расщеплять ди-, три- и полисахариды по гликозидным связям до мономеров по принципиальной схеме:
21
Так как углеводов и близких к ним соединений в почвенном органическом
веществе, микробных клетках и растительных остатках достаточно много
(до 60% биомассы растительных остатков составляют углеводы), а их гидролиз
невозможен без наличия свободного аммиачного азота, определение активности
глюкозидгидролазных ферментов (в частности, активности инвертазы) позволяет
одновременно судить как о способности к преобразованию углеводов растительных остатков, так и о иммобилизирующей способности микробоценоза почвы.
Определение инвертазной активности почвы является одним из главных
критериев оценки ее общей биологической активности. Уровень инвертолитической активности отражает содержание в почве легкогидролизуемых углеводов,
которые служат энергетическим материалом для многих почвенных гетеротрофов.
Определение инвертазной активности почвы
по Купревичу и Щербаковой
Принцип метода
Метод основан на способности глюкозы и фруктозы, образующихся при
гидролизе сахарозы, восстанавливать медь, содержащуюся в реактиве Феллинга.
По количеству образовавшейся закиси меди (Cu2O) определяют содержание моносахаров в растворе. Поскольку катализатором деструкции данных сахаров
в почве является именно инвертаза, то по количеству образующихся гексоз и судят об инвертазной активности почвы, которая выражается в мг глюкозы /
1 г почвы за 24 ч.
22
Для оценки уровня инвертазной активности почвы в схему опыта вводятся
следующие варианты:
1) почва без субстрата (без сахарозы): показывает естественную инвертазную активность почвы. Определяется количество глюкозы и фруктозы
(К1), которое образуется из имеющегося в почве углеводистого органического вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося в почве на момент определения;
2) почва с субстратом (с добавлением сахарозы): показывает потенциальную инвертазную активность почвы. Определяется количество глюкозы
и фруктозы (К2), которое образуется из заведомо увеличенного количества органического вещества за счет добавления сахарозы. По сути это
биохимическая активность амилолитической микрофлоры, вырабатывающей инвертолитические ферменты для разложения субстрата;
3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность определения результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, использующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество глюкозы и других моносахаров (К3), которые могут содержаться в воде
и реактивах.
Ход работы
В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических
колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.
1). Вариант 1.
Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 100 мл, добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9) и 4 капли толуола. Колбу
закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое перемешивают круговыми движениями и ставят на суточную инкубацию в термостат
при +30°С.
2). Вариант 2.
Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 100 мл, добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9), затем приливают 15 мл
8% раствора сахарозы и 4 капли толуола. Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое перемешивают круговыми движениями
и ставят на суточную инкубацию в термостат при +30°С.
23
Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности
и расчета Kw (формула (2)).
3). Вариант 3.
В коническую колбу на 100 мл приливают 15 мл 8% раствора сахарозы, затем добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9) и 4 капли толуола. Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение
30 мин. на ротаторе.
После инкубации содержимое колб всех вариантов доводят до кипения на
асбестовой сетке, затем полученные суспензии фильтруют в три конических колбы. Далее берут три стеклянных бюкса, взвешивают каждый на аналитических
весах с точностью до 0,001 г, затем из колб с фильтратами отбирают в соответствующий бюкс по 8 мл полученной жидкости и приливают в каждый по 6 мл
свежеприготовленного реактива Феллинга. После этого бюксы ставят на асбестовую сетку, содержимое доводят до кипения и кипятят в течение 2 мин.
Далее бюксы с полученными кроваво-красными взвесями снимают с сетки
и отстаивают в течение 1 часа для осаждения осадка закиси меди (Cu2O). Затем
осторожно, не взбалтывая, из каждого бюкса пипеткой с резиновой грушей удаляют надосадочную жидкость, после чего осадок закиси меди на дне бюксов
дважды промывают горячей дистиллированной водой из промывалки, максимально удаляя промывную воду из бюкса пипеткой. Затем бюксы с влажными
осадками помещают в сушильный шкаф и сушат до постоянного веса при +70°С.
Выбор искомого показателя инвертазной активности почвы и, соответственно, арифметическое вычисление необходимой массы осадка Cu2O находят
по разности масс осадков закиси меди согласно схеме, представленной в таблице 3.1.
3.1. Схема математического сравнения масс осадков оксида меди (I)
анализируемых образцов при определении инвертазной активности
№
п/п
1
2
Искомый показатель
актуальная (естественная)
инвертазная
активность (АИА)
потенциальная
инвертазная
активность (ПИА)
Уменьшаемое значение
массы осадка Cu2O
Вычитаемое
значение массы
осадка Cu2O
масса осадка Cu2O для почвы,
заложенной без сахарозы (К1)
масса осадка Cu2O
из реактивов (К3)
масса осадка Cu2O для почвы,
заложенной с сахарозой (К2)
масса осадка Cu2O
из реактивов (К3)
24
Полученную разность в массах осадков закиси меди переводят в массу элементной меди Cu (умножением на коэффициент 0,888), затем переводят в массу
меди из объема взятой на анализ аликвоты (8 мл) на весь объем исходного раствора (20 мл). После чего по таблице 3.2 высчитывают количество глюкозы, соответствующее найденному количеству меди.
3.2. Количество глюкозы (мг), эквивалентное количеству меди (мг)
(по Петербургскому, 1963)
Медь
Глюкоза
Медь
Глюкоза
Медь
Глюкоза
Медь
Глюкоза
20,4
22,4
24,3
26,3
28,3
30,2
32,2
34,2
36,2
38,2
40,1
42,1
43,9
45,8
47,7
49,6
51,5
53,4
55,3
57,2
59,1
60,9
62,8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
64,6
66,5
68,3
70,1
72,0
73,8
75,7
77,5
79,3
81,1
82,9
84,7
86,4
88,2
90,0
91,8
93,6
95,4
97,1
98,9
100,6
102,3
104,1
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
105,8
107,6
109,3
111,1
112,8
114,5
116,2
117,9
119,6
121,3
123,0
124,7
126,4
128,1
129,8
131,4
133,1
134,7
136,3
137,9
139,6
141,2
142,8
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
144,5
146,1
147,7
149,3
150,9
152,5
154,0
155,6
157,2
158,8
160,4
162,0
163,6
165,2
166,7
168,3
169,9
171,5
173,1
174,6
176,2
177,8
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
Расчет результатов анализа
Пример: закладывали опыт на определение потенциальной инвертазной активности почвы. В ходе опыта в бюксе опытного варианта № 2 образовалось
40,5 мг осадка закиси меди, в бюксе контрольного варианта № 3 – 0,5 мг осадка.
Искомое количество осадка закиси меди составит 40 мг (40,5 – 0,5 = 40,0). Пересчитаем это количество в массу чистой меди: 40 × 0,888 = 35,52 мг. Оно соответствует 8 мл реактива Феллинга, а 20 мл реактива будет соответствовать 88,8 мг
меди (35,52×20 / 8 = 88,8). По таблице 3.2 находим два числа, между которыми
располагается эта величина: 88,2 мг меди эквивалентно 46 мг глюкозы, а 90,0 мг
– 47 мг глюкозы. Находим разницу: 90,0 - 88,2 = 1,8 мг меди. Следовательно, 1 мг
25
глюкозы (47 - 46 = 1 мг) соответствует 1,8 мг меди, а 1,2 мг (90,0 - 88,8 = 1,2 мг)
будет соответствовать 0,67 мг глюкозы (1,2×1,0 / 1,8 = 0,67).
Таким образом, искомая величина глюкозы, отвечающая 88,8 мг меди, составится из следующих слагаемых: 46 мг + 0,67 мг = 46,67 мг.
Полученный результат делим на 2 для пересчета на 1 г почвы и умножаем
на поправку влажности почвы Kw (формула (2)).
Конечная оценка значения инвертолитической активности почвы производится с использованием таблицы 7.3.
Образец почвы
№
почва
почва + сахароза
ФОРМА ЗАПИСИ
Вес
Количество
Навеска Объем
осадка
глюкозы,
почвы, аликвоCu2O,
найденное
г
ты, мл
мг
по таблице, мг
m
V
–
табл. 3.1
2
8
2
8
Инвертазная
активность,
мг глюкозы / 1 г
почвы за 24 ч.
ИА
АИА –
ПИА –
Оценка
активности
табл. 7.3
Реактивы
1) раствор сахарозы 8%: 8 г сахарозы растворяют в 92 мл дистиллированной
воды;
2) ацетатный буфер (рН 4,9): раствор А – 136,1 г ацетата натрия растворяют
в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Раствор Б – 82 мл конц. HCl (пл.
1,19) растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Ацетатный
буфер приготавливают смешиванием 50 мл раствора А и 16 мл раствора Б,
затем смесь доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на
250 мл;
3) реактив Феллинга: раствор А – 40 г CuSO4•5H2O растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Раствор Б – 200 г сегнетовой соли
C4H4O6KNa•4H2O растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г
NaOH или KOH и доводят до 1 л. Реактив Феллинга – непосредственно перед анализом растворы А и Б смешивают в химическом стакане в соотношении 1:1;
4) толуол, х.ч.
3.3. Учет численности целлюлолитической микрофлоры
Из всего разнообразия безазотистых органических соединений, попадающих в почву естественным или агрохимическим путем, наибольшее значение
в питании сельскохозяйственных культур имеют компоненты, содержащие цел26
люлозу и ее производные, которые чаще всего (или прежде всего) определяют
численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов.
Целлюлоза (клетчатка) – наиболее распространенное углеродное соединение, синтез которого в масштабах биосферы занимает первое место: более 50%
от всего синтезируемого органического вещества. Продуцентами целлюлозы,
в основном, являются высшие растения, а также некоторые грибы (класса Oomycetes) и редкие виды бактерий (уксуснокислые р. Acetobacter).
Разложение целлюлозы, являющейся доминирующим компонентом почвенного органического вещества, растительных остатков и удобрений, является
одним из основных звеньев в цепи превращения органических соединений почвы.
Кроме того, микробная минерализация безазотистых органических веществ в пахотном слое, как весьма длительный и энергоемкий естественный деструкционный процесс, является одним из самых масштабных в педосфере, играет очень
важную роль в круговороте углерода и, в первую очередь, в процессе его возврата в атмосферу в виде СО2 как сырья для процесса фотосинтеза.
Разложение клетчатки как сложный комплексный процесс совершается при
участии как минимум двух групп микроорганизмов: во-первых, истинных бактерий, миксобактерий и актиномицетов, ферменты которых действуют на субстрат
при контакте клеточной поверхностью; во-вторых, грибной микрофлоры, более
продолжительное воздействие которой обеспечивается выделяемыми ею в виде
экзоферментов целлюлазами, разрушающими клетчатку.
В целом развитие целлюлозоразрушающих микроорганизмов резко повышается при попадании в почву растительных остатков, соломы и других грубых
органических веществ, что, как следствие, приводит к микробной иммобилизации
от 40 до 80% минерального азота (в том числе и азота удобрений) с последующим сохранением его от вымывания. Кроме того, с процессом деструкции целлюлозных компонентов напрямую связано образование гумусовых веществ почвы и формирование почвенной структуры.
Агротехническая нагрузка на пашню ускоряет минерализацию клетчатки,
вследствие чего активизируется почвенное дыхание и приземный слой воздуха
насыщается углекислым газом. Это способствует оптимизации углеродного питания культурных растений. Поэтому изучение жизнедеятельности целлюлолитической микрофлоры имеет столь же важное значение, как и изучение микроорганизмов, трансформирующих соединения азота в почве.
Численность целлюлолитических микроорганизмов учитывают чашечным
методом или методом предельных разведений с посевом на агар или среду Гетчинсона-Клейтона (АГК или СГК).
27
Посев на чашки с агаром Гетчинсона-Клейтона производят из одного разведения почвенной суспензии на выбор (от 10–4 до 10–6) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше
окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +30°С, подсчет выросших колоний проводят на восьмой-десятый день после посева.
Приготовление АГК производят следующим образом: к 1 л дистиллированной воды поочередно прибавляют и растворяют при нагревании на асбестовой
сетке следующие реактивы: NaNO3 – 2,5 г, К2НРО4 – 1 г, MgSO4•7H2O – 0,3 г,
NaCl – 0,1 г, CaCl2•4H2O – 0,1 г, FeCl3•6H2O – 0,01 г, агар-агар – 15 г. Соли и агар
полностью растворяют перемешиванием стеклянной палочкой. Затем к нагретой
среде при непрерывном помешивании добавляют 5 г порошка натриевой соли
карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na) и продолжают мешать до полного растворения реактива. Если такового нет в наличии, то его заменяют навеской 10 г
фильтровальной бумаги, предварительно замоченной в стакане в 100 мл дистиллированной воды и вручную разрыхленной стеклянной палочкой до состояния
однородной волокнистой массы.
После полного растворения и равномерного распределения волокон бумаги
по среде с помощью индикаторной бумаги и 10% раствора NaOH уравновешивают рН среды до 7.0, доводят ее до кипения, разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 30 мин.
Посев в пробирки на среду Гетчинсона-Клейтона (по 5 мл среды на пробирку) производят из нескольких (3х-4х и более) разведений почвенной суспензии
(от 10–2 до 10–6), также в зависимости от содержания органического вещества в
почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем более
широкий интервал ее разведения необходимо взять для посева). Литровый состав
данной среды аналогичен среде чашечного метода за исключением из состава
КМЦ-Na или фильтровальной бумаги, а также агара.
Учет микробиологического отклика целлюлолитиков, выращиваемых на
жидкой среде Гетчинсона-Клейтона с применением фильтровальной бумаги вместо КМЦ-Na, имеет свои особенности.
После розлива питательной среды в пробирки и ее заражения почвенной
суспензией, в каждую пробирку опускается узкая полоска стерильной фильтровальной бумаги длиной 7-8 см и шириной 0,5 см, половина которой должна находиться над поверхностью среды. Стерилизацию бумаги проводят в сушильном
шкафу при +105°С в течение 2х ч. (нарезанные полоски перед стерилизацией заворачивают в небольшой лист крафт-бумаги).
28
Если же в качестве источника целлюлозы используется введенная в состав
питательной среды соль КМЦ-Na, то полоски фильтровальной бумаги в анализе
не нужны и после заражения среды почвенной суспензией закрытые пробирки
сразу помещаются в термостат. Инкубацию проводят при +28°С, учет – на десятый-четырнадцатый день после посева.
В качестве микробиологического отклика целлюлолитиков ожидают и фиксируют помутнение среды в пробирках, появление желтых и оранжевых пятен
как в объеме столбика среды, так и на его поверхности, разрушение фильтровальной бумаги на границе жидкости с воздухом.
После подготовки питательных сред производят посев почвенной суспензии в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний на чашках Петри (на АГК) или микробиологический отклик в пробирках (на СГК) и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
3.4. Целлюлолитическая активность почвы
Учет целлюлолитической активности почвы проводят по учету активности
гидролитических ферментов целлюлаз, продуцируемых многими группами почвенного микробоценоза.
Определение целлюлолитической активности почвы
по Багнюку и Щетинской
Принцип метода
Метод основан на способности целлюлолитических ферментов почвы расщеплять углеводные полимеры до глюкозы с последующим определением ее количества с помощью антрона. В качестве субстрата используют натриевую соль
карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). По количеству образующейся из КМЦ-Na
глюкозы судят о целлюлолитической активности почвы, которая выражается
в мкг глюкозы/10 г почвы за 48 ч.
Для оценки уровня активности целлюлолитических ферментов в схему
опыта вводятся следующие варианты:
1) почва без субстрата (без КМЦ-Na): показывает естественную целлюлолитическую активность почвы. Определяется количество глюкозы (К1),
которое образуется из имеющегося в почве безазотистого органического
вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося
в почве на момент определения;
2) почва с субстратом (с добавлением КМЦ-Na): показывает потенциальную целлюлолитическую активность почвы. Определяется количество
глюкозы (К2), которое образуется из заведомо увеличенного количества
29
органического вещества за счет добавления КМЦ-Na. По сути это биохимическая активность целлюлолитической микрофлоры, вырабатывающей фермент целлюлазу для разложения субстрата;
3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность определения результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, использующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество глюкозы и других соединений (К3), которые могут содержаться в воде и реактивах.
Ход работы
В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических
колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.
1). Вариант 1.
Навеску свежей почвы 10 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 100 мл, приливают 1,5 мл толуола и 5 мл ацетатного буфера (рН 5,5). Колбу
закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно
перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию
в термостат при +35°С на двое суток.
2). Вариант 2.
Навеску свежей почвы 10 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 100 мл, приливают 1,5 мл толуола, 5 мл ацетатного буфера (рН 5,5) и 5 мл
1% раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). Колбу закрывают корковой
или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +35°С
на двое суток.
Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности
и расчета Kw (формула (2)).
3). Вариант 3.
В коническую колбу на 100 мл приливают 1,5 мл толуола, 5 мл ацетатного
буфера (рН 5,5) и 5 мл 1% раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). Колбу
закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение
30 мин. на ротаторе.
30
После инкубации содержимое колб доводят до кипения на асбестовой сетке, затем во все три колбы приливают по 3 мл насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов и встряхивают в течение 1 мин. После этого анализируемые растворы фильтруют (фильтр «белая лента») в три мерных колбы на 50 мл, затем фильтраты в каждой колбе доводят до метки дистиллированной водой. После чего берут три пробирки и из полученных рабочих растворов в мерных колбах переносят
в соответствующую пробирку 2 мл жидкости, в каждую из которых затем осторожно добавляют по 4 мл антронового реактива и перемешивают.
Через 20 мин. полученный изумрудно-зеленый раствор исследуемых образцов колориметрируют при λ = 551 нм (фотоколориметр ФЭК-56М, светофильтр 6) в кюветах на 10 мм.
Выбор искомого показателя целлюлолитической активности почвы и, соответственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме,
представленной в таблице 3.3.
3.3. Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов
анализируемых образцов при определении целлюлолитической активности
Раствор
Раствор сравнения
№
Искомый показатель
п/п
измерения
(холостой раствор)
1
актуальная (естественная)
целлюлолитическая активность (АЦА)
2
потенциальная
целлюлолитическая активность (ПЦА)
раствор почвы,
заложенной
без КМЦ-Na (К1)
раствор почвы,
заложенной
с КМЦ-Na (К2)
раствор
реактивов (К3)
раствор
реактивов (К3)
Построение калибровочного графика
Навеску 0,02 г химически чистой глюкозы растворяют в дистиллированной
воде в мерной колбе на 100 мл: в 1 мл полученного стандартного раствора будет
содержаться 0,2 мг (200 мкг) глюкозы. Затем в 6 конических колб приливают по
10 мл стандартного раствора, разбавляя его определенным объемом дистиллированной воды (таблица 3.4) и перемешивают. Объем колб подбирают в соответствии с получаемым после смешивания растворов объемом жидкости.
После этого берут 6 пробирок, в каждую пробирку из соответствующей
колбы приливают по 2 мл полученного рабочего раствора, затем добавляют по
5 мл антронового реактива и через 20 мин. проводят колориметрирование калибровочной серии относительно холостого раствора, приготовленного на дистиллированной воде (в дополнительную пробирку приливают 2 мл дистиллированной
воды и добавляют 5 мл антрона).
31
3.4. Исходные данные для построения калибровочного графика
№
колбы
1
2
3
4
5
6
Исходный объем
стандартного раствора
глюкозы, мл
10
10
10
10
10
10
Объем
воды, мл
390
190
90
56
40
30
Содержание глюкозы
в рабочем растворе,
мкг/2 мл
10
20
40
61
80
100
Отсчет
по
прибору
По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат
откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровочных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации
глюкозы (мкг/2 мл).
Расчет результатов анализа
Полученное по графику содержание глюкозы (мкг/2 мл) в анализируемом
образце почвы, заложенном без КМЦ-Na, пересчитывают в актуальную целлюлолитическую активность почвы по следующей формуле:
АЦА = А1 • V1 • 10 • Kw / V2 • 1000 • m
(4)
где АЦА – актуальная целлюлолитическая активность почвы,
мкг глюкозы/10 г абс.-сух. почвы за 48 ч.;
А1 – количество глюкозы опытного образца К1,
найденное по калибровочному графику, мкг/2 мл;
V1 – общий раствор после инкубации почвы, мл (V1 = 50 мл);
V2 – аликвота, взятая на анализ, мл (V2 = 2 мл);
10 – коэффициент пересчета на 10 г почвы;
m – навеска почвы, г (m = 10 г);
1000 – коэффициент пересчета мкг в мг;
Kw – поправка на влажность почвы, рассчитываемая по формуле (2).
Полученное по графику содержание глюкозы (мкг/2 мл) в анализируемом
образце почвы, заложенном с КМЦ-Na, пересчитывают в потенциальную целлюлолитическую активность почвы по формуле (5):
ПЦА = А2 • V1 • 10 • Kw / V2 • 1000 • m
где ПЦА – потенциальная целлюлолитическая активность почвы,
мкг глюкозы/10 г абс.-сух. почвы за 48 ч.;
А2 – количество глюкозы опытного образца К2,
найденное по калибровочному графику, мкг/2 мл и т.п.
32
(5)
Образец
почвы
Навеска
почвы, г
№
m
10
10
почва
почва + КМЦ-Na
ФОРМА ЗАПИСИ
Количество ЦеллюлолитичеОбъем
Отсчет
глюкозы,
ская активность,
аликвопо
найденное
мкг глюкозы /
ты, мл прибору по графику,
10 г почвы
мкг/2 мл
за 48 ч.
V2
–
А
ЦА
2
А1 –
АЦА –
2
А2 –
ПЦА –
Оценка
активности
табл. 7.3
Реактивы
1) раствор карбоксиметилцеллюлозы (натриевая соль) 1%: 1 г порошка
КМЦ-Na растворяют в 99 мл дистиллированной воды при нагревании
на асбестовой сетке и непрерывном помешивании;
2) ацетатный буфер (рН 5,5): раствор А – 1,15 мл конц. уксусной кислоты
растворить в колбе на 100 мл и довести до метки водой. Раствор Б – 2,72 г
трехводного ацетата натрия (CH3COONa•3H2O) растворить в колбе на
100 мл и довести до метки водой. Ацетатный буфер готовят смешиванием
8,9 мл раствора А и 41,9 мл раствора Б в колбе на 1 л с доведением до метки дистиллированной водой;
3) насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов: реактив порционно (примерно по 10 г) всыпают в кипящую дистиллированную воду и растворяют
помешиванием стеклянной палочкой. Затем раствор квасцов продолжают
кипятить и растворять реактив до тех пор, пока на стенках внутри химического стакана не будет видна явная кристаллизация вещества. Необходимо
помнить, что раствор после остужения быстро кристаллизуется, поэтому
его нужно использовать горячим;
4) антроновый реактив: к 2,5 мл дистиллированной воды осторожно приливают 50 мл конц. H2SO4 (пл. 1,84) и дают остыть в холодильнике. После
охлаждения в раствор вносят 0,1 г антрона, растворяют и оставляют на 4 ч.
на льду в морозильной камере. Полученный реактив длительному хранению не подлежит, поэтому должен быть использован в день приготовления;
5) толуол, х.ч.
Комплексный учет численности и биологической активности как амилолитических, так и целлюлолитических микроорганизмов позволяет более наглядно
проследить за скоростью и направленностью процесса разложения безазотистого
органического вещества почвы и привнесенных удобрений, поскольку показывает особенности деструкционого процесса, и тем самым характеризует степень
33
разложенности крахмала, целлюлозы и их производных как главных составляющих неспецифических компонентов почвенного органического вещества.
4. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ
В процессе разложения органической части почвы, как естественного происхождения в виде растительного опада и остатков животных, так и привнесенного в нее извне в виде органических удобрений, количество простых соединений достаточно быстро уменьшается за счет активного развития аммонифицирующей, амилолитической и других функциональных видов микроорганизмов, входящих в общую группу зимогенной микрофлоры.
По мере снижения концентрации в почве простых сахаров, белков и низкомолекулярных жирных кислот рост и развитие первичных гидролитиков замедляется и на смену им приходит микрофлора олиготрофной группы. Сюда входят,
как правило, неспоровые микроорганизмы, зачастую с необычной морфологией,
которые, в отличие от зимогенных гидролитиков, длительное время живут в почве и, по сути, составляют группу основных утилизаторов органического вещества
на конечной стадии его превращения. Причиной тому является способность олиготрофов жить и питаться в условиях с низкой концентрацией доступных компонентов пищи.
С другой стороны, существует условное разделение олиготрофной микробиоты почвы на олигонитрофилов, ассимилирующих из почвенного раствора малые количества азотистых соединений, и олигокарбофилов, способных усваивать
углеродсодержащие вещества.
Данная градация олиготрофной части почвенного микробоценоза позволяет
дифференцированно оценить переработку промежуточного вещества почвы
по элементам, значимым с точки зрения агроэкологических исследований – углероду и азоту.
Такой подход в исследованиях дает возможность проследить за степенью
деструкции органического вещества, оценить направление микробиологической
и сукцессионной стадии развития почвы и, в целом, охарактеризовать общую
напряженность микробной переработки и подготовки вещества для процесса гумификации.
34
4.1. Учет общей численности олиготрофных микроорганизмов почвы
Общую численность всей олиготрофной микрофлоры почвы учитывают
чашечным методом посева на почвенный агар (ПА), приготовленный из той почвы, на которой проводят соответствующие агрохимические и иные исследования.
Посев на чашки с почвенным агаром производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10–2 до 10–4) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят
на пятый-десятый день после посева.
Если в программе исследований заложено изучение нескольких почвенных
разностей, то почвенный агар приготавливают из каждого типа почвы, который
требуется изучить. Но, при этом, при сравнении полученных результатов в качестве эталонной численности всех олиготрофов данной почвенно-климатической
зоны выбирают численность на ПА, полученную из наиболее плодородной почвы
этой зоны.
Приготовление ПА производят смешиванием 1 кг исследуемой почвы с 1 л
0,1% раствора Na2CO3. Полученную суспензию доводят до кипения на асбестовой
сетке, охлаждают и фильтруют через фильтр «белая лента» и кусок ваты. Затем
к фильтрату добавляют 0,5 г СaCO3, 0,2 г К2HPO4 и 20 г агар-агара, растворяют
при нагревании на асбестовой сетке и перемешивании стеклянной палочкой, затем приливают дистиллированной воды до 1 л и снова доводят до кипения. Затем
среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют
при давлении 2 атм. в течение 30 мин.
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество
колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
4.2. Учет численности олигонитрофильной микрофлоры
Олигонитрофилы – часть олиготрофных микроорганизмов, способных расти в условиях незначительного количества доступного азота в почвенном растворе. Именно поэтому, а также за счет наличия в геномном аппарате особых генов,
обуславливающих способность к фиксации азота воздуха, многие из них являются несимбиотическими азотфиксаторами (диазотрофами) и способны фиксировать атмосферный азот, который в последующем используют в своем питании.
Поскольку процесс фиксации азота олигонитрофилами сложен и достаточно энергозатратен, он запускается только в том случае, когда концентрация аммиака в почвенном растворе крайне низкая. В подобной ситуации диазотрофы,
35
поскольку имеют мощную ферментную систему, помимо азотфиксации начинают
разлагать гумусовые соединения почвы, в частности азотистые компоненты гуминовых и фульвокислот гумуса.
Поэтому учет численности олигонитрофилов позволяет не только определить способность почвенного микронаселения к несимбиотической фиксации
азота воздуха, что используется в снабжении растений доступными формами азота, но и проследить за активностью разложения гумусовых соединений.
Общую численность олигонитрофилов почвы учитывают чашечным методом посева на агар Эшби (АЭ).
Посев на чашки с агаром Эшби производят из одного на выбор разведения
почвенной суспензии (от 10–2 до 10–4) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность
почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый день после посева.
Приготовление агара Эшби производят следующим образом: к 1 л дистиллированной воды поочередно прибавляют и растворяют при нагревании на асбестовой сетке следующие реактивы: сахароза – 20 г, К2SО4 – 0,1 г, К2НРО4 – 0,2 г,
MgSO4•7H2O – 0,2 г, NaCl – 0,2 г, CaCО3 – 5 г и агар-агар – 20 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием стеклянной палочкой, затем приливают
1 мл раствора микроэлементов по Федорову и доводят до кипения.
Приготовление раствора микроэлементов по Федорову производят следующим образом: к 1 л дистиллированной воды поочередно прибавляют и растворяют при медленном нагревании на асбестовой сетке и перемешивании стеклянной палочкой следующие реактивы: Н3ВО3 – 5,0 г, (NH4)2MoO4•2H2O – 5,0 г,
ZnSO4•7H2O – 0,2 г, КCl – 0,5 г, NaBr – 0,5 г и Al2(SO4)3•18Н2О – 0,3 г.
Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 30 мин.
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество
колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
4.3. Учет численности олигокарбофильной микрофлоры
Олигокарбофилы – другая часть олиготрофных микроорганизмов, способных развиваться в условиях незначительного содержания доступных углеродсодержащих соединений в почвенном растворе.
36
Данная подгруппа олиготрофов обладает высокой окислительновосстановительной ферментативной активностью и, поэтому, по биохимической
принадлежности наиболее приближена к автохтонной части микробоценоза почвы. В условиях минимального количества или полного отсутствия доступного углерода в почвенном растворе олигокарбофилы начинают трансформировать свободные и новообразованные фракции гумуса и, тем самым, участвовать в преобразовании специфического органического вещества почвы и изменять ее гумусовой режим.
Общую численность олигокарбофилов почвы учитывают чашечным методом посева на водный агар по Эрскову (голодный агар – ГА).
Посев на чашки с голодным агаром производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10–2 до 10–4) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят
на пятый-десятый день после посева.
Приготовление голодного агара (ГА) производят растворением в 1 л дистиллированной воды 20 г агар-агара при нагревании на асбестовой сетке и перемешивании стеклянной палочкой. Раствор доводят до кипения, разливают по
колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм.
в течение 30 мин.
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество
колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
Таким образом, проведение исследований по учету численности олигонитрофильных микроорганизмов позволяет проследить за степенью и направленностью разложения промежуточного органического вещества почвы и, в целом,
за состоянием почвенной среды как резервуара первичных компонентов гумификации.
5. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРЕОБРАЗУЮЩИХ СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ
Автохтонная группа микроорганизмов характеризуется как коренная или
собственно почвенная микрофлора, которая стоит последней в ряду деструкторов
37
поступающего в почву органического вещества и во многом определяет синтез
и распад гумусовых соединений.
Гумус является одним из специфических органических соединений почвы,
слагающим ее плодородие, а его содержание находится в тесной зависимости
от биохимического состояния почвы.
К автохтонной группе почвенного микробоценоза относят те микроорганизмы, которые способны в качестве единственного источника питания или
наряду с другими источниками использовать гумусовые вещества. Данная группа
микрофлоры при нормальном питательном режиме (целина, почвы естественных
лесов и лугов) не доминирует в почве, так как в ней всегда имеется определенный
запас легкоразлагаемого органического вещества, который способствует активному развитию другой группы микробоценоза (сапротрофной). Кроме того,
за счет химической сложности большинству развивающихся в таких условиях сапротрофных микроорганизмов агрономически ценный гумус недоступен.
За счет уменьшения количества привносимых растительных остатков в пахотные почвы по сравнению с целиной изменяется степень их гумификации. Поначалу это может приводить к относительному увеличению содержания фракций
гумуса, более устойчивых к микробному разложению, поскольку менее устойчивые начинают разлагаться активизированной автохтонной микрофлорой. Дальнейшее освоение сельскохозяйственных земель ведет к возрастанию доли автохтонных микроорганизмов, что, в итоге, влечет за собой еще более интенсивную
минерализацию гумуса.
Наиболее активное развитие автохтонов и, как следствие, усиление разложения гумусовых компонентов наблюдается в условиях высокого дефицита поступающего в почву легкоразлагаемого органического вещества (неудобряемая
пашня, техногенно нарушенные земли).
В целом, к внешним условиям, усиливающим процесс деструкции гумуса
почвы относят:
1) смену сезонов года: весной и осенью происходит всплеск численности
микроорганизмов, использующих легкогидролизуемое органическое
вещество (сапротрофная часть), а в летнее время активнее развивается
микрофлора, использующая собственно гумусовые компоненты (автохтонная часть);
2) структуру севооборота: в почве под пропашными культурами гумусовые
компоненты разлагаются более интенсивно, по сравнению с почвами,
занятыми культурами, растущими сплошным покровом;
3) усиление аэрации почвы при частой культивации и перепашке;
4) паровой режим содержания полей;
38
5) одностороннее внесение минеральных, особенно азотных, удобрений;
6) полное отсутствие каких-либо удобрений при выращивании культур.
В результате многолетних исследований было установлено, что к автохтонной группе микробоценоза почвы относятся многие представители бактерий
р. Pseudomonas, Nocardia, Bactoderma, Micromonospora и Arthrobacter. Поскольку
у таких видов микроорганизмов, в отличие от зимогенной микрофлоры, слабо
выражена протеолитическая активность, данная микробиота не способна усваивать элементы питания из легкодоступного органического вещества. Эти микроорганизмы способны использовать только специфические органические компоненты почвы различной степени гумификации как источник энергии, углеродного и азотного питания.
Функцию активного участия в разложении гумуса также приписывают
многим другим представителям почвенного микробоценоза. Это некоторые виды
родов Actinomyces, Aerobacter, Bacillus, Bacterium, Clostridium, Flavobacterium,
Mycobacterium, Mycococcus, Rhodotornia, Rhodotorula и другие виды.
Одним из главных участников деструкции гумуса почвы является грамположительный актиномицет рода Nocardia, представленный палочковидными
и кокковидными формами и дающий на твердых средах характерные колонии
с мицелиальным налетом (воздушными гифами). Именно этому микроорганизму
приписывается основная роль в разложении гуминовых и фульвокислот гумуса,
поскольку у многих видов нокардий отсутствуют простые гидролитические ферменты (протеазы, липазы, амилазы и инвертазы), что и ограничивает их участие
в ассимиляции свежих органических остатков.
С другой стороны, за счет продуцирования более активной системы редоксферментов (пероксидазы и полифенолоксидазы) на долю нокардий выпадает использование наиболее устойчивых продуктов распада органического вещества –
восков, смол, углеводородов, ароматических (лигнин) и гетероциклических соединений и их производных.
Современные представления о роли нокардий в трансформации гумуса
почвы позволяют определять не только их общую численность по количеству
выросших колоний на чашке, но также по видовому разнообразию и доминированию видов определять состояние специфического органического вещества
и направленность процесса его синтеза-распада в почве. В таблице 5.1 представлена схема развития некоторых видов рода Nocardia и возможные пути изменения гумусового режима почвы.
39
5.1. Возможное изменение гумусового режима почвы
в зависимости от видового состава нокардий в почве
Доминантный
Возможные условия
Гумус как
вид
активизации развития
источник…
рода Nocardia
- бессменный пар;
- отсутствие
N. rubra
углерода
органических удобрений;
и азота
N. corallina - чрезмерная агротехническая
нагрузка на почву
- удобрение культур
углерода
N. mucosum азотными туками;
- отсутствие известкования почвы
- выращивание культур
сплошного сева с мощной корневой
азота
N. symbiotica системой (озимые зерновые, травы);
- целинные земли, территории
естественных биогеоценозов
Изменения
гумусового
режима почвы
чрезмерная активизация разложения
гумуса почвы
разложение гумуса
превосходит его медленный синтез
синтез гумуса
превосходит его медленное разложение
Таким образом, учет численности автохтонной микрофлоры почвы может
сопровождаться не только констатацией количества микроорганизмов, способных разлагать гумусовые соединения, но и по распределению различных их видов дает возможность проследить за степенью деструкции специфического органического вещества почвы и, как следствие, предположить возможные пути преобразования гумуса.
5.1. Учет численности микроорганизмов-деструкторов гумуса
Общую численность автохтонной группы микробоценоза, способной усваивать гумусовые компоненты почвы, учитывают чашечным методом посева на
нитритный агар по Теппер (НА).
Посев на чашки с нитритным агаром производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10–2 до 10–4) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят
на пятый-десятый день после посева.
Приготовление нитритного агара (НА) производят растворением в 1 л дистиллированной воды следующих реактивов: NaNO2 – 1 г, К2HPO4 – 0,5 г,
MgSO4•7H2O – 0,5 г, NaCl – 0,5 г, Na2CO3 – 1 г, FeSO4•7H2O – 0,4 г, агар-агар –
20 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием и нагреванием на асбестовой сетке. Затем к раствору приливают 5 мл гумата натрия или гумата калия
и доводят до кипения. После чего среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 2 атм. в течение 30 мин.
40
По окончании инкубации чашки достают из термостата, определяют общее
число колоний и пересчитывают его в численность КОЕ автохтонной микрофлоры почвы. Если требуется, то дополнительно определяют видовой состав микроорганизмов.
По культуральным признакам вырастающих на нитритном агаре колоний
дифференцируют следующие роды и виды микроорганизмов, наиболее типичные
формы колоний которых представлены на рисунке 1.3.
а
б
в
г
Рис. 1.3. Характерный рост колоний автохтонной микрофлоры на нитритном агаре
(по Теппер, 1993): а – Nocardia, б – Arthrobacter, в – Micromonospora, г – Bactoderma
р. Nocardia – колонии пастообразные, слизистые или сухие и складчатые,
по периферии которых образуется ватообразная зона в виде мицелиального ободка. В центре колонии чаще преобладают фрагментированные гифы, поэтому сама
колония имеет бархатистую поверхность. Колонии могут быть бесцветными, белыми, серыми, лимонно-желтыми, желтыми, оранжевыми, рыжими, розовыми,
красными, пурпурными или коричневыми.
р. Arthrobacter – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, плоские или слегка
приподнятые, чаще бесцветные, иногда могут иметь зеленовато-желтый оттенок.
41
По периферии колонии образуется кружевной или складчатый ободок, у отдельных представителей рода края колоний могут быть зазубренные.
р. Micromonospora – колонии мелкие и, как правило, полностью погружены в питательную среду. На поверхности агара кольцеобразно или радиально
располагаются бесцветные или темноокрашенные комочки слизи.
р. Bactoderma – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, имеют вид белой или
розоватой бархатистой пленки. В центре колония складчатая, а по периферии –
стекловидная; край колонии, как правило, волнистый или лопастной.
Среди рода нокардий (р. Nocardia), участвующих в трансформации гумуса
почвы, по культуральным признакам вырастающих на среде колоний можно различить основные виды:
N. rubra – колонии мелкие, округлые, 1,5-3,0 мм в диаметре, одиночные,
как правило сухие, плоские, с неправильным, лопастным или фестончатым краем.
Мицелиальный ободок для рода rubra характерен, но развит слабо. Для данного
рода отличительным признаком является немного переливающаяся бархатистая
кроваво-красная окраска колоний.
N. corallina – колонии очень мелкие, округлые, 1-2 мм в диаметре, с куполообразной поверхностью, при росте на среде собраны в грозди и напоминают
скопления мелких шариков. Мицелиальный ободок для рода corallina не типичен.
Окраска колоний, как правило, молочно-белая, ярко-желтая или красная.
N. mucosum – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, неправильной формы.
Цвет колоний бледный, серый, белый и другие оттенки бледного цвета. Мицелиальный ободок у данного рода, как правило, присутствует. Отличительным признаком вида mucosum является наличие слизистой капсулы вокруг колонии.
N. symbiotica – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, различных светлых
цветов, складчатые и сухие, по периферии которых образуется заметный мицелиальный ободок.
5.2. Полифенолоксидазная активность почвы
В микробиологической части синтеза гумусовых веществ принимают участие микробные редокс-ферменты полифенолоксидазы, а в процессах минерализации гумуса – пероксидазы. Все они относятся к классу оксидоредуктаз.
Как правило, с увеличением содержания гумуса активность полифенолоксидазы постепенно повышается, а активность пероксидазы – резко снижается.
Комплексная оценка активности обоих окислительно-восстановительных ферментов дает более полную картину о биохимическом состоянии гумуса, посколь42
ку позволяет соотнести интенсивность образования гумусовых компонентов почвы и их деструкции.
Определение полифенолоксидазной активности почвы
по Галстяну
Ферменты полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Они катализируют окисление определенных фенолов до хинонов в присутствии кислорода воздуха, которые в дальнейшем при конденсации с аминокислотами и пептидами образуют
первичные молекулы гуминовых кислот гумуса:
Принцип метода
Метод основан на способности полифенолоксидазных ферментов почвы
окислять фенольный субстрат до хинонов с последующим определением их количества с помощью эфира. Действующим окислительным началом является
кислород воздуха. В качестве субстрата используют пирогаллол. По количеству
образующегося пурпурогаллина судят о полифенолоксидазной активности почвы
(ПФА), которая выражается в мг пурпурогаллина/100 г почвы за 30 мин.
Для оценки уровня активности полифенолоксидазных ферментов почвы
в схему опыта вводятся следующие варианты:
1) почва без субстрата (без пирогаллола): показывает естественную полифенолоксидазную активность почвы. Определяется количество пурпурогаллина (К1), которое образуется из имеющегося в почве органического
вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося
в почве на момент определения;
2) почва с субстратом (с добавлением пирогаллола): показывает потенциальную полифенолоксидазную активность почвы. Определяется количество пурпурогаллина (К2), которое образуется из заведомо увеличенного
количества органического вещества за счет добавления пирогаллола. По
сути это биохимическая активность автохтонной микрофлоры, вырабатывающей фермент полифенолоксидазу для разложения органического
субстрата и образования гумусовых веществ;
43
3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность определения результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, использующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество пурпурогаллина и других соединений (К3), которые могут содержаться в воде и реактивах.
Ход работы
В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических
колбах на 250 мл закладывают три варианта опыта.
1). Вариант 1.
Навеску свежей почвы 5 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 250 мл, приливают 0,5 мл толуола и 100 мл 1% раствора K2SO4. Содержимое
колбы встряхивают на ротаторе в течение 20 мин, после чего фильтруют.
Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата
почвы и добавляют 10 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхивают, плотно закрывают пробкой и ставят на 30мин. инкубацию в термостат при
+30°С. За время инкубации колбы достают из термостата и осторожно встряхивают 2 раза.
2). Вариант 2.
Навеску свежей почвы 5 г, просеянную через сито с диаметром ячеек
в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
на 250 мл, приливают 0,5 мл толуола и 100 мл 1% раствора K2SO4. Содержимое
колбы встряхивают на ротаторе в течение 20 мин, после чего фильтруют.
Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата
почвы и добавляют 10 мл свежеприготовленного 1% раствора пирогаллола. Содержимое колбы встряхивают, плотно закрывают пробкой и ставят на 30 мин. инкубацию в термостат при +30°С. За время инкубации колбы достают из термостата и осторожно встряхивают 2 раза.
Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности
и расчета Kw (формула (2)).
3). Вариант 3.
В коническую колбу на 250 мл приливают 0,5 мл толуола и 100 мл
1% раствора K2SO4. Содержимое колбы встряхивают на ротаторе в течение
5 мин, после чего фильтруют.
44
Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата
и добавляют 10 мл свежеприготовленного 1% раствора пирогаллола. После чего
колбу плотно закрывают пробкой и ставят на 30мин. встряхивание.
По окончании инкубации во все три колбы добавляют по 5 мл 20% раствора H2SO4 и перемешивают. Затем порционно (по 10 мл) содержимое каждой колбы доводят диэтиловым (серным) эфиром до метки. После каждой прилитой порции эфира колбу сильно встряхивают. Затем растворы переносят в делительные
воронки, закрывают пробками и многократно встряхивают. В результате встряхивания в делительной воронке образуется два слоя несмачивающих друг друга
жидкостей. Нижний водный слой жидкости осторожно сливают в стакан через
краник в воронке, после чего оставшийся желто-зеленый эфирный слой сливают
в кювету на 20 мм и колориметрируют при λ = 490 нм (фотоколориметр
ФЭК-56М, светофильтр 5).
Выбор искомого показателя полифенолоксидазной активности почвы и, соответственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме,
представленной в таблице 5.2.
5.2. Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов
анализируемых образцов при определении
полифенолоксидазной активности
Раствор сравнения
№
Искомый показатель
Раствор измерения
п/п
(холостой раствор)
1
2
актуальная (естественная)
полифенолоксидазная активность
(АПФА)
потенциальная
полифенолоксидазная активность
(ППФА)
раствор почвы,
заложенной
без пирогаллола (К1)
раствор почвы,
заложенной
с пирогаллолом (К2)
раствор
реактивов (К3)
раствор
реактивов (К3)
Построение калибровочного графика
Навеску 0,75 г химически чистого бихромата калия (K2Cr2O7) растворяют
в мерной колбе в 1 л 0,5 n раствора HCl, что по интенсивности окраски будет соответствовать окраске, получаемой растворением 5 мг пурпурогаллина в 50 мл
серного эфира. В результате чего 1 мл полученного рабочего раствора будет соответствовать 0,005 мг пурпурогаллина. Затем берут 6 мерных колб на 50 мл
и в соответствии с таблицей 5.3 в каждую приливают определенный объем рабочего раствора и доводят раствор до метки дистиллированной водой. Затем проводят колориметрирование калибровочных растворов относительно дистиллированной воды.
45
5.3. Исходные данные для построения калибровочного графика
№
колбы
1
2
3
4
5
6
Объем рабочего
раствора K2Cr2O7, мл
0,1
0,5
1,0
10,0
20,0
30,0
Содержание пурпурогаллина,
мг/50 мл
0,0005
0,0025
0,005
0,050
0,100
0,150
Отсчет
по прибору
По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат
откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровочных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации
пурпурогаллина (мг/50 мл).
Расчет результатов анализа
Полученное по графику содержание пурпурогаллина (мг/50 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном без пирогаллола, пересчитывают в актуальную
полифенолоксидазную активность почвы по следующей формуле:
АПФА = А1 • V1 • 100 • Kw / V2 • m
(6)
где АПФА – актуальная полифенолоксидазная активность почвы,
мг пурпурогаллина/100 г абс.-сух. почвы за 30 мин.;
А1 – количество пурпурогаллина опытного образца К1,
найденное по калибровочному графику, мг/50 мл;
V1 – общий раствор почвы, мл (V1 = 100 мл);
V2 – аликвота, взятая на анализ, мл (V2 = 20 мл);
100 – коэффициент пересчета на 100 г почвы;
m – навеска почвы, г (m = 5 г);
Kw – поправка на влажность почвы, рассчитываемая по формуле (2).
Полученное по графику содержание пурпурогаллина (мг/50 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном с пирогаллолом, пересчитывают в потенциальную полифенолоксидазную активность почвы по формуле (7):
ППФА = А2 • V1 • 100 • Kw / V2 • m
где ППФА – потенциальная полифенолоксидазная активность почвы,
мг пурпурогаллина/100 г абс.-сух. почвы за 30 мин.;
А2 – количество пурпурогаллина опытного образца К2,
найденное по калибровочному графику, мг/50 мл и т.п.
46
(7)
Реактивы
1) раствор пирогаллола 1%: 1 г порошка 1,2,3-пирогаллола (С6Н6О3) растворяют в 99 мл дистиллированной воды. Раствор нестойкий и хранению
не подлежит;
2) раствор К2SO4 1%: 10 г сульфата калия растворяют в 990 мл дистиллированной воды;
3) раствор Н2SO4 20%: 10,8 мл чистой H2SO4 (пл. 1,84) растворяют в 80 мл
дистиллированной воды;
4) раствор HCl 0,5 n: 41,0 мл конц. HCl (пл. 1,19) растворяют 500 мл дистиллированной воды, налитой в мерную колбу на 1 л. Затем раствор перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой;
5) диэтиловый (серный) эфир, х.ч.;
6) бихромат калия, х.ч.;
7) толуол, х.ч.
Образец
почвы
Навеска
почвы, г
Объем
аликвоты, мл
№
m
5
V2
20
ФОРМА ЗАПИСИ
Количество
Отсчет пурпурогаллипо
на, найденное
прибору
по графику,
мг/50 мл
–
А
А1 –
5
20
А2 –
почва
почва +
пирогаллол
Полифенолоксидазная активность,
мг пурпурогаллина /
100 г почвы
за 30 мин.
ПФА
АПФА –
Оценка
активности
табл. 7.3
ППФА –
5.3. Пероксидазная активность почвы
Ферменты пероксидазы, наряду с полифенолоксидазами, участвуют в синтезе и распаде гумусовых соединений ароматического ряда. Они катализируют
окислительное действие всевозможных органических перекисей, выделяющихся
в почву в результате жизнедеятельности микроорганизмов и корней высших растений. Тем самым происходит преобразование некоторых фенолов, аминов и гетероциклов до хинонов и их производных в присутствии свободного кислорода
перекисных соединений:
47
Определение пероксидазной активности почвы
по Галстяну
Принцип метода
Метод основан на способности пероксидазных ферментов почвы окислять
фенольный субстрат до хинонов и их производных с последующим определением
их количества с помощью эфира. Действующим окислительным началом является свободный кислород перекиси водорода. В качестве субстрата также используют пирогаллол. По количеству образующегося пурпурогаллина судят о пероксидазной активности почвы (ПРА), которая выражается в мг пурпурогаллина/100 г почвы за 30 мин.
Ход работы
Проведение анализа, построение калибровочного графика и расчет полученного количества пурпурогаллина производят аналогично анализу почвы
по определению полифенолоксидазной активности за одним исключением.
В начале опыта к 20 мл приготовленного фильтрата почвы (варианты 1 и 2)
или раствору реактивов (вариант 3) помимо добавления 10 мл свежеприготовленного раствора пирогаллола приливается также 2 мл 0,5% раствора перекиси водорода. Дальнейшая часть анализа полностью идентична определению активности
полифенолоксидазы почвы.
Образец
почвы
Навеска
почвы, г
Объем
аликвоты, мл
№
m
5
V2
20
ФОРМА ЗАПИСИ
Количество
Отсчет пурпурогаллипо
на, найденное
прибору
по графику,
мг/50 мл
–
А
А1 –
5
20
А2 –
почва
почва +
пирогаллол
Пероксидазная
активность,
мг пурпурогаллина /
100 г почвы
за 30 мин.
ПРА
АПРА –
Оценка
активности
табл. 7.3
ППРА –
Реактивы
1) раствор перекиси водорода 0,5%: 0,1 мл 30% перекиси водорода растворяют в 20 мл дистиллированной воды.
Таким образом, проведение учета общей численности микроорганизмов,
трансформирующих гумусовые вещества почвы, их дифференцированная оценка
по доминирующим видам, а также определение ферментативной активности процессов синтеза и разложения специфических веществ в почве, позволяют ком48
плексно подойти к проблеме урегулирования гумусового режима пашни
и ее плодородия в целом.
6. УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ,
УЧАСТВУЮЩИХ В СИНТЕЗЕ ГУМУСА ПОЧВЫ
Гумификация является длительным и сложным физико-биохимическим
процессом формирования особой группы высокомолекулярных органических
кислот, образующихся из продуктов разложения, главным образом, растительных
остатков.
Известно, что с большей или меньшей скоростью, зависящей от химического состава растительного материала и условий окружающей среды, до 70-80% поступающего в почву опада растений в конечном итоге минерализуется до простых веществ и лишь 20-30% преобразуется до гумусовых соединений.
С другой стороны известно, что в микробной массе среднее соотношение
C : N составляет примерно 6.6 : 1.0, то есть имеет относительно высокую долю
азота. Вследствие этого бóльшая часть органического вещества микробомассы
(3/4) легко минерализуется, высвобождая усвояемые растениями формы азота
и только 1/4 преобразуется в гумус.
Функция преобразования растительных остатков в гумус присуща многим
микроорганизмам микробного пула, имеющим не гидролитический, а окислительно-восстановительный ферментативный аппарат. В частности, к таковым относится часть автохтонной группы микробоценоза, участвующая в неполной деструкции сложных высокомолекулярных соединений (клетчатка, хитин, лигнин,
смолы, полифенолы и другие вещества). Сюда относят некоторые прокариоты
р. Nocardia, Arthrobacter и Pseudomonas, плесневые грибы р. Aspergillus, Penicillium и другие.
Среди представителей всей почвенной микроскопической жизни занимаемая грибами и актиномицетами эколого-трофическая ниша вызывает особый интерес, поскольку их деятельность в почве невозможно охарактеризовать в виде
нескольких выполняемых функций. Изначально являясь сапротрофными, обе
группы микробиоты способны к усвоению самых разнообразных органических
и минеральных соединений, порой труднодоступных к усвоению обычными гнилостными бактериями. В частности, они могут выполнять такие специфические
для микроорганизмов реакции, как гетеротрофная нитрификация, образование
пигментных веществ и другие.
Поэтому изучение динамики их численности позволяет судить не столько
о ходе какого-то определенного минерализационного процесса на пути к процес49
су синтеза гумусовых веществ, сколько об общем течении деструкции почвенного вещества и о состоянии экосистемы в целом.
6.1. Учет численности грибов
Особенности нитчатого (мицелиального) строения тела грибных микроорганизмов, высокая скорость его роста, а также наличие активной полиферментной системы обусловливают распределение грибницы в огромных почвенных
массах и распространение ее на больших площадях. Вследствие этого происходит
очень активное и более менее равномерное действие грибных ферментов на растительные остатки и почвенные частицы, что приводит к достаточно быстрой
трансформации вещества и повышению доступности биогенных элементов
для растений.
В целом, грибы считаются жесткими всесторонними деструкторами вещества почвы, но, при этом, различным классам микроскопических грибов (микромицетов) присуща своя предрасположенность к химическому составу пищевого
субстрата. Путем регуляции почвообразовательных процессов, состава органического вещества почвы, ее оструктуренности, кислотности и подвижности элементов питания в почвенном растворе, микромицеты осуществляют значимую работу в формировании плодородия целинных и окультуренных земель.
В вопросе о роли микромицетов в синтезе гумусовых веществ особое внимание привлекают виды, способные продуцировать темноокрашенные пигменты
типа меланинов – полимеров фенольной природы. Меланины являются сложными химическими образованиями, которые формируются в клетках многих микроорганизмов, но больше всего меланинов продуцируется гифами и репродуктивными органами (спорами) грибов.
Меланины представляют собой высокополимерные соединения черного
и коричневого цвета с молекулярной массой в несколько тысяч или десятков тысяч а.е.м., образующиеся при ферментативном окислении фенолов и индолов
(пирокатехина, тирозина, диоксииндола и т.п.) с последующей полимеризацией
продуктов окисления.
Наибольшее количество меланинов и других видов пигментов образуют
грибы р. Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Cenococcum, Cladosporium, Dicoccium, Diplococcium, Fusarium, Helmintosporium, Mucor, Mycogone, Nadsoniella,
Penicillium, Stahybotris, Stemphylium и других родов, содержание которых может
достигать 2-3% на сухую биомассу мицелия.
С другой стороны, в 10 см слое почвы на площади 1 м2, сформировавшемся
под травянистой растительностью, накапливается около 60 г грибного мицелия,
а в почве под лесом эта масса может достигать 100-120 г/м2. С учетом того, что
50
общая доля грибов в микробном пуле почвы составляет в среднем 5% от объема
всей микрофлоры, количество меланинов, поступающих с мицелием в почву,
может достигать значительных размеров. Это дает основания считать грибной
меланиногенез одним из основных источников гумусообразования почвы.
В почве грибы представлены самыми разнообразными по пищевым потребностям видами, поэтому универсальной питательной среды для их учета
не существует. Кроме того, при учете численности грибов создается ряд трудностей. В частности, подготовка почвы к анализу приводит к дроблению грибного
мицелия на большое количество отдельных частей, в результате чего споры и обрывки гифов перемешиваются между собой и поэтому дифференцированно
учесть их невозможно. Поэтому при количественном учете грибов говорят не об
их численности в целом, а о числе колониеобразующих единиц грибных зачатков.
Наибольшую численность КОЕ грибных зачатков почвы обнаруживают,
учитывая их чашечным методом посева на агар Чапека-Докса (АЧД).
Посев на чашки на агар Чапека-Докса производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10–4 до 10–6) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят
на пятый-десятый день после посева.
Приготовление агара Чапека-Докса производят путем последовательного
растворения в 1 л дистиллированной воды следующих реактивов: сахароза – 30 г,
NaNO3 – 3 г, KH2PO4 – 1 г, MgSO4•7H2O – 0,5 г, FeSO4•7H2O – 0,01 г, KCl – 0,5 г,
СаСО3 – 3 г, агар-агар – 20 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием и нагреванием на асбестовой сетке, доводят до кипения. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении
1,5 атм. в течение 30 мин.
Непосредственно перед розливом среды по чашкам Петри к 1 л расплавленной стерильной среды Чапека-Докса приливают 4 мл стерильной концентрированной молочной кислоты.
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают общее количество колоний грибов и выделяют число пигментированных (окрашенных) колоний, и пересчитывают их в численность КОЕ/1 г почвы.
6.2. Учет численности актиномицетов
Актиномицеты представляют собой сообщество прокариотных микроорганизмов, состоящее из восьми различных по строению и выполняемым функциям
51
в почве таксономических групп: проактиномицеты (нокардиоморфные), актиномицеты с многогнездными спорангиями, актинопланы, стрептомицеты и их близкие роды, мадуромицеты, термомоноспоровые и их близкие роды, термоактиномицеты и группа прочих родов. Всех их объединяет особое морфологическое
строение: наличие мицелия, подобного мицелию грибов. Но в отличие от мицелия последних, мицелий актиномицетов гораздо тоньше в диаметре слагающих
его гиф. Масса 1 мг мицелиальной колонии актиномицета может иметь общую
протяженность мицелия более 1000 м.
До 70-80% актиномицетов, обитающих в почве, имеют особенность продуцирования пигментов, из них около 50% видов способны выделять пигменты бурого и черно-бурого цвета меланоидного типа. Меланоиды актиномицетов представляют собой новообразованные гуминоподобные вещества, близкие к почвенным гуминовым и фульвокислотам. Кроме того, аминокислотный состав этих
веществ достаточно разнообразен (до 17 аминокислот) и схож с таковым гумуса
почвы.
За счет наличия у лучистых грибков широкого спектра ферментов они считаются полисапротрофными микроорганизмами. При этом всех ярче у актиномицетов выражена протеолитическая, амилолитическая и инвертазная активность. Поэтому изучение численности данной группы микроорганизмов в почве,
подобно учету грибов, позволяет судить об общем состоянии агроэкосистемы в
целом, а также о скорости процесса гумификации растительных остатков.
Численность лучистых грибков почвы учитывают чашечным методом посева на агар Гаузе № 1 (АГ-1).
Посев на чашки на агар Гаузе № 1 производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10–4 до 10–6) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят
на восьмой-десятый день после посева.
Приготовление агара Гаузе № 1 производят путем последовательного растворения в 1 л дистиллированной воды следующих реактивов: крахмал – 20 г,
КNO3 – 1,0 г, K2HPO4 – 0,5 г, MgSO4•7H2O – 0,5 г, FeSO4•7H2O – 0,01 г,
NaCl – 0,5 г, агар-агар – 20 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием и нагреванием на асбестовой сетке, доводят до кипения. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении
1,5 атм. в течение 30 мин.
52
После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспензии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество
колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.
Таким образом, определение численности актиномицетов и микроскопических грибов позволяет учесть ту миксотрофно-экологическую группу микроорганизмов, которая активна не только в отношении утилизации практически всего
спектра природных и искусственных органических и минеральных соединений,
попадающих в почву, но и способна к участию в образовании специфического
органического вещества почвы – гумуса.
7. ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ОБОГАЩЕННОСТИ ПОЧВЫ МИКРООРГАНИЗМАМИ И РАСЧЕТ ЭКОЛОГО-ТРОФИЧЕСКИХ ИНДЕКСОВ ПОЧВЫ
Определение численности и биологической активности различных групп
микроорганизмов, участвующих в трансформации органического вещества почвы, является важным этапом в комплексной оценке как небольшой территории
земель, будь то земли растениеводческого или животноводческого хозяйства, так
и почв целых биогеоценозов, в том числе затронутых негативной деятельностью
человека.
На этапе построения программы исследований по проведению оценки состояния плодородия почвы относительно ее микробиологических свойств, прежде всего, определяются с выбором параметров численности и биологической активности той или иной группы микробоценоза почвы (табл. 7.1), изыскание которых позволит исследователю выявить наиболее полную микробиологическую характеристику почвы и состояние ее органического вещества. Последний аспект
имеет большое значение в принятии грамотного решения в вопросе урегулирования плодородия почв агро- и естественных экосистем.
Полученные значения численности микроорганизмов той или иной группы
микробного сообщества почвы, определенные методом посева или методом предельных разведений, оцениваются в соответствии со шкалой ориентировочной
обогащенности, приведенной в таблице 7.2, в соответствии с которой выделяется
пять степеней насыщенности почвы микроорганизмами, участвующими в переработке различного органического вещества почвы.
53
7.1. Краткая информация к описательной характеристике микробонаселения почвы
Экологическая группа микробоценоза почвы и контролируемый
Питательная среда
ею процесс превращения органического вещества
для учета численности
зимогенная экологическая ниша
мясопептонный агар МПА
аммонифицирующая микрофлора:
разложение азотсодержащего органического вещества почвы
пептонная вода ПВ
амилолитическая микрофлора:
крахмало-аммиачный агар
разложение безазотистого органического вещества почвы
КАА
из группы олигосахаридов и крахмала
целлюлолитическая микрофлора:
агар (среда) Гетчинсонаразложение безазотистого органического вещества почвы
Клейтона АГК (СГК)
из группы полисахаридов и целлюлозы
олиготрофная экологическая ниша
олиготрофная микрофлора:
общая деструкция органического вещества почвы промежуточной
почвенный агар ПА
степени разложенности и его подготовка к процессу гумификации
олигонитрофильная микрофлора:
деструкция азотистых компонентов гуминовых и фульвокислот гумуса агар Эшби АЭ
и проведение в почве несимбиотической азотфиксации
олигокарбофильная микрофлора:
глубокая минерализация органического вещества почвы
голодный агар ГА
и начало его гумификации
автохтонная экологическая ниша
автохтонная микрофлора:
разложение, трансформация и продуцирование
нитритный агар НА
гумусовых веществ почвы
миксотрофно-синтетическая экологическая ниша
грибы:
актиномицеты:
трансформация всевозможных компонентов
органического вещества почвы и продуцирование пигментов гуминоподобного типа
Биохимическая активность,
единицы измерения
протеолитическая активность,
мг глицина / 1 г почвы за 24 ч.
инвертазная активность,
мг глюкозы / 1 г почвы за 24 ч.
целлюлолитическая активность,
мкг глюкозы / 10 г почвы за 48 ч.
–
–
–
полифенолоксидазная и пероксидазная активность, мг пурпурогаллина/100 г почвы за 30 мин.
агар Чапека-Докса АЧД
–
агар Гаузе-№ 1 АГ-1
–
7.2. Шкала оценки степени обогащенности почвы микроорганизмами
Степень обогащенности
почвы микрофлорой
I
II
III
IV
V
очень бедная
бедная
средняя обогащенность
богатая
очень богатая
Количество микроорганизмов почвы, определенных
культивированием на различных питательных средах,
млн. ед./1 г абсолютно-сухой почвы
КАА, АГК, СГК,
МПА, ПВ
ПА, ГА, НА
АЭ, АЧД, АГ-1
<1
<2
<5
1–2
2–4
5–6
3–5
5 – 10
7 – 12
6 – 10
11 – 20
13 – 30
> 11
> 21
> 30
В таблице 7.3 приведена шкала сравнительной оценки биохимической активности почвы, основанной, в том числе и на деятельности микроорганизмоворганотрофов, которые продуцируют ферменты для процесса трансформации
почвенного органического вещества.
7.3. Шкала сравнительной оценки биохимической активности почвы
Показатель
I
очень
слабая
Степень активности
II
III
IV
слабая
средняя
3,1-5,0
V
очень
высокая
высокая
Протеолитическая активность,
мг глицина / 1 г / 24 ч.
<1,0
1,0-3,0
Инвертазная активность,
мг глюкозы / 1 г / 24 ч.
<5,0
5,0-15,0
15,1-50,0 50,1-150,0
>150,0
Целлюлолитическая активность,
мкг глюкозы / 10 г / 48 ч.
<10,0
10,0-20,0 20,1-50,0 50,1-100,0
>100,0
Полифенолоксидазная активность,
мг пурпурогаллина / 100 г / 30 мин.
<10,0
10,0-20,0 20,1-30,0 30,1-40,0
>40,0
Пероксидазная активность,
мг пурпурогаллина / 100 г / 30 мин.
<5,0
5,0-10,0
>30,0
5,1-8,0
10,1-20,0 20,1-30,0
>8,0
Сравнение полученных значений ферментативной активности почвы с данной шкалой и сопоставление их с численностью микрофлоры, перерабатывающей
органическую часть почвы, позволяет комплексно оценить темпы и общую
напряженность микробиологической деятельности почвенно-биотического комплекса.
В агроэкологических исследованиях почвенной микробиоты, помимо определения общей численности различных групп микробоценоза и учета биохимической активности почвы, также производят расчет эколого-физиологических индексов и коэффициентов, которые позволяют проследить за особенностями взаи55
моотношений отдельных групп микроорганизмов, участвующих в общем процессе разложения органического вещества почвы.
а) Коэффициент минерализации и иммобилизации Мишустина
При определении численности КОЕ аммонификаторов (на МПА) и иммобилизаторов азота (на КАА) дополнительно рассчитывают коэффициент минерализации и иммобилизации Мишустина. Он определяется отношением численности микроорганизмов, учтенных посевом на крахмало-аммиачном агаре (КАА)
и характеризующих процесс преобразования аммиачного азота, к численности
микробов, учтенных посевом на мясо-пептонном агаре (МПА), характеризующих
превращение белковых веществ почвы.
Данный коэффициент показывает степень развития амилолитической части
почвенного микробоценоза и, соответственно, ее активность в трансформации
углеводов почвы и связывании свободного азота. Чем он выше (> 1), тем иммобилизационные процессы протекают интенсивнее, что говорит либо об очень
большой обеспеченности почвы аммиачным азотом (это может являться следствием сильного развития аммонификаторов), либо о появлении в почве бедного
азотом органического вещества (солома, кора и т.п.). Последнее явление, в свою
очередь, может активизировать развитие олиготрофной и автохтонной групп
микробоценоза, что в итоге влечет за собой повышение численности амилолитиков, так как в результате работы олиготрофов в почвенный раствор высвобождается какое-то количество аммиака. В условиях агроценоза слишком большое значение коэффициента Мишустина (> 3-5) может косвенно свидетельствовать о повышении скорости разложения специфического органического вещества почвы –
гумуса.
б) Индекс педотрофности Никитина
Индекс педотрофности по Никитину – отношение числа микроорганизмов,
растущих на почвенном агаре (ПА), к числу микроорганизмов, растущих на богатых органических средах (например, на МПА). Показывает степень развития
микроорганизмов, как относящихся к коренному микронаселению почвы (автохтонная часть), так и участвующих в новообразовании гумусовых соединений. Повышение индекса педотрофности также показывает степень сродства неспецифической органической части почвы исконному почвенному веществу – гумусу.
Считается, что чем выше данный индекс, тем более биогеоценоз приближен к
естественным ценозам изучаемой почвенно-климатической зоны и обладает
большей устойчивостью к негативным воздействиям со стороны различных антропогенных вмешательств.
56
в) Индекс олиготрофности Аристовской
Индекс олиготрофности по Аристовской – отношение численности микроорганизмов, учтенных на разбавленных средах (НА и ГА), к численности на
полноценных средах (МПА и КАА). Показывает активность олиготрофной части
микробоценоза почвы. Повышение данного индекса в целом может свидетельствовать о замедлении процессов деструкции органического вещества и о переходе изучаемого биоценоза в более устойчивое состояние, стремящееся к состоянию климаксной системы.
в) Биохимический коэффициент накопления гумуса по Муромцеву
Биохимический коэффициент накопления гумуса по Муромцеву – численное
отношение полифенолоксидазной активности почвы к пероксидазной активности. Данный коэффициент показывает темпы биохимического образования и
накопления гумуса в почве. Считается, что с повышением коэффициента Муромцева усиливается интенсивность переработки органического вещества и повышается синтез гуминовых и фульвокислот почвы.
Определение численности отдельных групп микробоценоза почвы, участвующих в различных стадиях переработки органического вещества (принципиальная схема деятельности почвенных гетеротрофов на рис. 1.4) и определение
биологической активности почвы, так или иначе связанной с учитываемыми
группами микроорганизмов, являются значимым этапом микробиологической характеристики агробиоценоза, поскольку позволяет судить о направленности преобразования вещества в почве, степени гумусированности растительных и иных
остатков и, в целом, об этапе развития почвы исследуемой почвенноклиматической территории.
57
СО2
Растительные
остатки
NH4
NO3
N2
Минеральные
удобрения
Навоз
дыхание
Свежая
органическая
биомасса
аммонификация
Зимогенная
микробная
ниша
нитрификация
денитрификация
- сахара
- пептиды
- липиды
- олигомеры
NН4+
NО3–
биохимическое упрощение остатков
Промежуточное
органическое
вещество
гумификация
вещества
Олиготрофная
микробная
ниша
- детрит
- хитин
- смолы
- пектины
- полимеры
образование структур гумуса
Специфическое
органическое
вещество
Автохтонная
микробная
ниша
поликонденсация
и полимеризация
- гуминовые
кислоты
- фульвокислоты
- гумины
- негидролизуемые
остатки
Гумус
выщелачивание вещества
Рис. 1.4. Принципиальная схема функционирования гетеротрофной части
почвенного микробоценоза
58
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Большое значение в функционировании агроэкосистемы имеет часть микробного населения почвы, которая питается органическим веществом – гетеротрофы. Данное функциональное ядро любого микробоценоза кроме выполнения
роли поддержания круговорота вещества и энергии в педосфере упрощает сложную органическую составляющую пашни до простых соединений, которая в последствии используется культурными растениями в своем питании.
Задача современной агрохимии вместе с сельскохозяйственной микробиологией состоит в изучении особенностей формирования и трансформации органического вещества как одного из главных компонентов почвы. Микробиологическая переработка растительных остатков и органических удобрений во многом
определяет пищевой режим в почве, поскольку формирует не только резерв доступных элементов питания, но и специфические компоненты гумуса.
Поэтому изучение состояния микробоценоза пашни как “живого” потенциала биогенных элементов должно включать методы определения численности
гетеротрофных микроорганизмов и биологической активности почвы, во многом
основанной на их жизнедеятельности. Логично выбирая совокупность исследуемых параметров микробного превращения органического вещества, исследователь получает более информативную картину о состоянии благополучия почвы
и агроэкосистемы в целом.
59
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ
Автотрофы – организмы, использующие в своем питании углекислоту
воздуха в качестве главного или единственного источника углерода. В зависимости от источника энергии, используемого автотрофами для усвоения СО2, различают фотоавтотрофы, которые используют энергию солнечного света (например,
цианобактерии) и хемоавтотрофы, использующие энергию, полученную за счет
окисления неорганических соединений. К хемоавтотрофам почвы относят большинство литотрофов, которые аккумулируют энергию при окислении минеральной части почвы (например, нитрифицирующие и сероредуцирующие бактерии,
металлоокисляющие и т.п.).
Агар (агар-агар) – реактив, представляющий собой смесь полисахаридов
сложного состава (агарозы и агаропектина). Агар получается из некоторых морских водорослей, (например, анфельции), при растворении в горячей воде образует гель и используется, главным образом, как отвердитель питательных сред.
Ассоциация микробного пула – сообщество популяций двух и более родов
или видов микроорганизмов почвы, объединенных в микробоценозе выполнением единой функции (например, ассоциация нитрифицирующих микроорганизмов
почвы, состоящая из восьми основных родов бактерий-нитрификаторов).
Гетеротрофы – организмы, использующие в своем питании готовое органическое вещество, то есть органическую форму углерода. Подавляющее большинство микроорганизмов почвы является гетеротрофами.
Инкубация (инкубирование) – культивирование микроорганизмов на средах
при определенной температуре в течение фиксированного времени.
Климаксная система – экологическая система в зрелом, устойчивом, равновесном состоянии (например, еловый лес в тайге, дубрава в зоне широколиственных лесов, микробоценоз почвы под природным заливным лугом или в старом, непроходимом лесу).
Консорция – функциональная единица микробоценоза, состоящая из множества различных систематических единиц микроорганизмов и имеющая цель
трансформации вещества почвы до того состояния, утилизация которого была бы
возможной за счет следующей консорции микроорганизмов почвы. По сути,
по мере разложения вещества почвы одна консорция микроорганизмов сменяется
другой.
Космополит – вид, широко распространенный по земному шару, обитающий в почвах всех широтных зональностей. Нередко данный термин употребляется в смысле относительной всеядности всего почвенного микробоценоза.
60
Культивирование – выращивание микроорганизмов на питательных средах
при определенных условиях (температура, доступ воздуха, время и т.д.).
Культура микроорганизмов – развившиеся в результате культивирования
на твердой или жидкой питательной среде микроорганизмы. Культура накопительная – вся выращенная на среде микробомасса является потомством клеток
преимущественно одного вида; культура чистая – потомством клетки только одного вида.
Культуральные признаки – морфологические признаки определенного микроорганизма, по которым его возможно идентифицировать до рода, а иногда до
вида. Культуральными признаками микроорганизмов, вырастающих на твердых
питательных средах, является внешний вид колоний, их размер и цвет, характер
края, консистенция микробной массы и так далее. При выращивании методом
укола с посевом на пробирку к таковым относятся цвет и характер роста микробной массы в толще столбика среды, а также степень ее разложения. При выращивании на жидких средах – цвет и внешний вид образующихся пленок, характер
выделений (запах, пузырьки газа и т.д.).
Литотрофы – автотрофная часть микробного пула почвы, у которой синтез органического вещества из СО2 воздуха обеспечивается энергией окисления
или восстановления неорганических веществ (аммиака, нитрита, элементной серы, сероводорода, молекулярного водорода, минералов почвы). Например, нитрификаторы, “силикатные” бактерии и т.д.
Микробиологический пересев (пассирование) – перенесение in vitro уже выращенной культуры микроорганизмов из одной среды на новую стерильную среду с целью продолжения роста и развития данной культуры микроорганизма.
Микробиологический посев – внесение клеток микроорганизмов или какоголибо исследуемого материала (образец почвы, проба воды, мяса и т.п.) на (или в)
стерильную питательную среду с целью получения чистой или накопительной
культуры.
Микробиологический отклик – определенное изменение какого-либо параметра питательной среды или субстрата, которое говорит о явном присутствии
искомого микроорганизма на (или в) среде и о выполнении им своей биохимической функции.
Микробный пул – наиболее полное количество микроорганизмов определенной почвы. Иначе говоря, под микробным пулом понимают все количество
микроорганизмов почвы, но всегда имеют в виду, что данное определение несколько условно, поскольку определение численности всех микроорганизмов
почвы на настоящий момент невозможно.
61
Микробный ценоз почвы, микробоценоз – совокупность микроорганизмов,
населяющая определенный участок почвы с более или менее однородными условиями и функционирующая как единое целое в трансформации органических
и минеральных веществ данного биогеоценоза. Микробоценоз является саморегулирующейся системой, но в то же время является подсистемой биогеоценоза
или экосистемы.
Миксотрофы – микроорганизмы, способные питаться как готовым органическим веществом, так и синтезировать его в собственных клетках за счет поглощения веществ только неорганического происхождения.
Органотрофы – гетеротрофная часть микробного пула почвы, у которой
синтез собственного органического вещества обеспечивается энергией окисления
органических веществ других организмов. Например, микроорганизмыаммонификаторы и целлюлолитики.
Паразиты – гетеротрофная часть микробного пула почвы, антагонистически использующая в своем питании живое органическое вещество. При этом, паразиты используют живой организм хозяина как среду обитания. Среди почвенных микроорганизмов паразиты встречаются в симбиотических организмах лишайников (гриб паразитирует на микроскопической водоросли), а также во многих бактериях, грибах и актиномицетах под паразитарным действием вирусов и
фагов.
Питательная среда – определенный субстрат, на котором способны расти
и развиваться микроорганизмы. Количество питательных сред, используемых
в разных отраслях микробиологии и медицины, достигает 1500 видов.
Популяция микробного пула – совокупность особей микроорганизмов одного вида. В почвенной микробиологии термины микробной ассоциации и микробной популяции почвы нередко приравнивают и употребляют как синонимы.
Санитарное состояние почвы – совокупность физико-химических и биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности
в эпидемическом и гигиеническом соотношениях.
Сапротрофы – гетеротрофная часть микробного пула почвы, использующая в своем питании мертвое органическое вещество посредством постепенного
выедания. Многие из почвенных микроорганизмов ведут сапротрофный образ
жизни и, в зависимости от степени разложенности привнесенных растительных и
животных остатков в почву, делятся на группы зимогенных и олиготрофных
микроорганизмов.
Сукцессия микробных сообществ – закономерная смена сообществ микроорганизмов в микробоценозе почвы при его продвижении в развитии к устойчивому (климаксному, стационарному) состоянию.
62
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Добровольская, Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. – М.: ИКЦ
“Академ-книга”, 2002. – 282 с.
2. Емцев, В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М.: Дрофа, 2006.
– 444 с.
3. Звягинцев, Д.Г. Биология почв / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. –
М.: Изд-во МГУ, 2005. – 445 с.
4. Красильников, Н.А. Лучистые грибки (высшие формы). – М.: Наука, 1970. –
535 с.
5. Коничев, А.С. Биохимия и молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова. – М.: Дрофа, 2008. – 359 с.
6. Лях, С.П. Микробные меланины / С.П. Лях, Е.А. Рубан. – М.: Наука, 1972. –
321 с.
7. Марфенина, О.Е. Микробиологические аспекты охраны почв. – М.: Изд-во
МГУ, 1991. – 118 с.
8. Методы почвенной микробиологии и биохимии [под ред. Д.Г. Звягинцева]. –
М.: Изд-во Моск. ун-та, 1980. – 224 с.
9. Мирчинк, Т.Г. Почвенная микология. – М.: Наука, 1976. – 230 с.
10.Мишустин, Е.Н. Ассоциации почвенных микроорганизмов. – М.: Наука, 1975.
– 108 с.
11.Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1 и Т. 2. / Под ред. Г.А. Заварзина.
– М.: Мир, 1997. – 801 с.
12.Практикум по биологии почв [под ред. Д.Г. Звягинцева]. – М. Издательство
МГУ, 2002. – 120 с.
13.Практикум по микробиологии [под ред. А.И. Нетрусова]. – М.: Издательский
центр «Академия», 2005. – 608 с.
14.Почвенная микробиология [под ред. Д.И. Никитина]. – М.: Колос, 1979. –
316 с.
15.Современная микробиология. В 2-х т. Т. 1 и Т. 2. / Под ред. Й. Ленгелера. – М.:
Мир, 2009. – 1152 с.
16.Теппер, Е.З. Микроорганизмы рода Nocardia и разложение гумуса. – М.:
Наука, 1976. – 200 с.
17.Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова,
Г.И. Переверзева. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
18.Титова, В.И. Агро- и биохимические методы исследования состояния экосистем / В.И. Титова, Е.В. Дабахова, М.В. Дабахов. – Н. Новгород, Изд-во
ВВАГС, 2011. – 170 с.
19.Титова, В.И. Методы учета численности и биомассы микроорганизмов почвы /
В.И. Титова, А.В. Козлов. – Н. Новгород: НГСХА, 2011. – 40 с.
20.Пошон, Ж. Почвенная микробиология / Ж. Пошон, Г. де Баржак. – М.: Изд-во
иностр. лит-ры, 1960. – 560 с.
21.Хазиев, Ф.Х. Ферментативная активность почв. – М.: Наука, 1976. – 180 с.
63
Титова Вера Ивановна
Козлов Андрей Владимирович
Методы оценки функционирования
микробоценоза почвы, участвующего
в трансформации органического вещества
Научно-методическое пособие
Редактор О.Ф. Костина
Корректор Т.Н. Калиниченко
Подписано в печать 19.12.2011 г.
Формат 60×841/16. Печать офсетная. Печ. листов 4,0
Тираж 100 экз. Заказ № 43
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
603107, Нижний Новгород, проспект Гагарина, 97
__________________________________________________________
Типография НГСХА