Инструкции - ИнтерЛабСервис

ИНСТРУКЦИЯ
по применению тест-системы «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза
Chlamydophila psittaci методом полимеразной цепной реакции
(организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») для выявления ДНК
возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci в биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух форматах:
Формат EPh – для выявления ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов
амплификации в агарозном геле.
Формат FRT – для выявления ДНК возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени».
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1
Форматы и формы выпуска тест-системы.
Формат EPh
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») формат EPh, рассчитанная на
проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1 включает:
- «ДНК-сорб-В» вариант 50 – комплект реагентов для выделения ДНК из
клинического материала;
- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК
Chlamydophila psittaci;
- «ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции
продуктов амплификации в агарозном геле.
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК
Chlamydophila psittaci.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК
Chlamydophila psittaci и электрофоретическую детекцию.
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Chlamydophila
psittaci. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты
реагентов для экстракции ДНК, электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» (test-system «CHLA-PSIT») формат FRT, рассчитанная на
проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 1 из 21
Форма 1 включает:
- «РИБО-преп» вариант 50 – комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из
клинического материала;
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК
Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени».
Форма 2 включает:
- «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК
Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени».
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования,
включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК
Chlamydophila psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Chlamydophila
psittaci с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для
проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для
экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
1.1 Комплект реагентов «ДНК-сорб-В» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор
1 флакон, 15,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 1
1 флакон, 15,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 2
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Сорбент универсальный
1 пробирка, 1,25 см3 (мл)
ТЕ-буфер для элюции ДНК
1 пробирка, 5,0 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию ДНК из 50 проб, включая контроли.
1.2 Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 состоит из следующих компонентов:
Раствор для лизиса
1 флакон, 15,0 см3 (мл)
Раствор для преципитации
1 флакон, 20,0 см3 (мл)
Раствор для отмывки 3
1 флакон, 25,0 см3(мл)
Раствор для отмывки 4
1 флакон, 10,0 см3(мл)
РНК-буфер
4 пробирки по 1,2 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на экстракцию РНК/ДНК из 50 проб, включая
контроли.
1.3 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R состоит из следующих
компонентов:
ПЦР-смесь-1-R ХЛА-ПСИТ, раскапана под воск
в пробирки объемом 0,5 или 0,2 см3 (мл)
55 пробирок по 0,005 см3(мл)
ПЦР-смесь-2 blue
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
Минеральное масло для ПЦР
1 пробирка, 2,0 см3 (мл)
К–
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ПКО Chlamydophila psittaci
1 пробирка, 0,1 см3(мл)
ОКО
1 пробирка, 1,2 см3 (мл)
1.4 Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F состоит из следующих
компонентов:
ПЦР-смесь-FL ХЛА-ПСИТ
1 пробирка, 0,6 см3 (мл)
ПЦР-буфер-С
1 пробирка, 0,3 см3 (мл)
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 2 из 21
Полимераза (TaqF)
К+ Chlamydophila psittaci / STI
К–
1 пробирка, 0,03 см3 (мл)
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
1 пробирка, 0,2 см3 (мл)
Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
ВКО-FL
1 пробирка, 1,0 см3 (мл)
ОКО
1 пробирка, 1,2 см3 (мл)
1.5 Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 состоит из следующих компонентов:
Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с
бромидом этидия
1 флакон, 50,0 см3 (мл)
Агароза для электрофореза ДНК
2 флакона по 1,7 г
Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из
расчета 100 мл геля – 5 рядов по 24 лунки).
Упаковка и маркировка.
На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с
указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе),
номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные
застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают)
этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в
комплект, количества пробирок (флаконов) каждого компонента, количества препарата в
каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления,
срока годности.
Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На
каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой
указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы,
перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок
годности, условия хранения, обозначения настоящих ТУ/СТО, надпись «Для животных». В
каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.
2
Транспортирование и хранение.
Тест-систему транспортировать при температуре от 2 °С до 8 °С не более 5 суток. При
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Комплект реагентов «ДНК-сорб-В», «РИБО-преп» хранить при температуре от 2 °С до 25 °С.
Формат EPh. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R хранить при
температуре от 2 °С до 8 °С, комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 °С до
25 °С в защищенном от света месте.
Формат FRT. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F (кроме ПЦРсмеcи-FL ХЛА-ПСИТ, ПЦР-буфера-С и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от
2 °С до 8 °С. ПЦР-смеcь-FL ХЛА-ПСИТ, ПЦР-буфер-С и полимеразу (TaqF) хранить при
температуре от минус 24 °С до минус 16 °С. ПЦР-смеcь-FL ХЛА-ПСИТ хранить в
защищенном от света месте.
3
4
Срок годности тест-системы – 12 месяцев с даты изготовления.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
5
Формат EPh. Метод обнаружения ДНК Chlamydophila psittaci основан на
экстракции ДНК из биологического материала, проведении амплификации полученной
ДНК и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Формат FRT. Метод обнаружения ДНК Chlamydophila psittaci основан на экстракции
ДНК из биологического материала совместно с ДНК экзогенного неконкурентного
внутреннего контрольного образца (ВКО), проведении амплификации полученной ДНК и
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 3 из 21
гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме «реального
времени». Результат амплификации ДНК Chlamydophila psittaci регистрируется на канале
JOE/Yellow, результат амплификации экзогенного ВКО регистрируется на канале
флуоресценции FAM/Green. Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать
основные этапы ПЦР-анализа (экстракцию ДНК и проведение амплификации ДНК).
III. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность
Комплект для
Вид биологического материала
экстракции
ДНК
мазки со слизистых, суспензии
органов и тканей, суспензии
«ДНК-сорб-В»
помета
мазки со слизистых, суспензии
органов и тканей, суспензии
«РИБО-преп»
помета
Комплект для
амплификации
и детекции
Аналитическая
чувствительность, ГЭ/мл1
«ПЦР-комплект»
вариант 50R
5х103
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F
1х103
Аналитическая специфичность
Отсутствуют неспецифические реакции при тестировании образцов следующих
микроорганизмов: вирус инфекционного бронхита кур, вирус болезни Ньюкасла, вирус
гриппа А, Brucella suis; Brucella abortus; Brucella ovis; Brucella canis; Brucella melitensis;
Haemophilus parasuis; Actinobacillus pleuropneumoniae; Bordetella bronchiseptica; Pasterella
multocida; Leptospira interrogans; Listeria monocytogenes; Mycobacterium bovis,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium; Mycobacterium paratuberculosis;
Mycoplasma hyopneumoniae; Mycoplasma hyorhinis; Mycoplasma hyosynovia; Mycoplasma
mycoides;, Mycoplasma meleagridis; Mycoplasma gallisepticum; Mycoplasma sinovia;
Escherichia coli; Campylobacter jejuni; Campylobacter fetus; Clostridium perfringens; Klebsiella
pneumoniae; Lawsonia intracellularis; Pseudomonas aeruginosa; Salmonella choleraesuis;
Salmonella dublin; Shigella flexneri; Staphylococcus aureus; Streptococcus suis; Yersinia
enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis.
При проведении тестирования данной панели штаммов, а также образцов ДНК
человека, свиньи, КРС, собаки, кошки, овцы, разных видов птиц неспецифических реакций
выявлено не было.
IV. ПОРЯДОК ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ
6
7
7.1
7.2
7.3

1
Тест-система «ХЛА-ПСИТ» предназначена для выявления ДНК Chlamydophila psittaci
в биологическом материале от птиц методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Взятие, транспортирование и хранение материала для исследования.
При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования
необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней
среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
Материал от каждого животного берут отдельными инструментами.
Взятие материала для исследования:
мазки со слизистых оболочек (конъюнктивы, ротоглотки, клоаки) берут сухими
стерильными зондами с ватными тампонами. После взятия материала тампон (рабочую
часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с
500 мкл стерильного физиологического раствора или фосфатного буфера. Конец зонда
отламывают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки.
Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
Количество геномных эквивалентов микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца биологического материала.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 4 из 21


7.4
8
8.1
8.2
8.3
9
помет птиц берут в стерильные контейнеры в количестве 1–3 г. В связи с
непостоянным выделением возбудителя у инфицированной птицы, рекомендуется
исследовать не менее трех образцов от одной и той же особи, взятых в течение 4–
5 сут.
фрагменты тканей и органов (легкие, селезенка, печень и др.) помещают в
стерильный контейнер.
Материалы доставляют в лабораторию в течение суток, сохраняя при температуре от
2 °С до 8 °С. Допускается хранение материала при температуре от минус 24 °С до
минус 16 °С в течение 7 суток, при температуре не выше минус 68 °С – в течение
длительного времени. Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание
материала.
Подготовка исследуемого материала.
Из помета птиц готовят 10 % суспензию на стерильном физиологическом растворе
или фосфатном буфере. Суспензии помета и мазки с клоаки центрифугируют при
150 g (1,5 тыс. об/мин на центрифуге MiniSpin, Eppendorf, Германия) в течение 5 мин.
Экстракцию ДНК проводят из 100 мкл надосадочной жидкости.
Мазки со слизистых конъюнктивы и ротоглотки исследуют без предварительной
подготовки.
Пробы тканей и органов гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых
ступок и пестиков или автоматического гомогенизатора, затем готовят 10 % суспензию
на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2–3 мин и 50 мкл верхней фазы
суспензии используют для экстракции ДНК.
V. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА
Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).
Формат FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).
Для работы требуются следующие материалы и оборудование.
9.1 ЗОНА 1 – для экстракции ДНК из исследуемого материала:
 стерильный
ламинарный
шкаф
(например,
«БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2»,
«Ламинарные системы», Россия).
 твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 °С до 100 °С
(например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
 вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия).
 микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например,
«MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
 центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например «ТЭТА-2»,
«Биоком», Россия).
 отдельный набор электронных или механических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например,
Axygen, США).
 одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки на 1,5 мл (например, Axygen, США).
 штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и
наконечников (например, Axygen, США).
 холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 С.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 5 из 21



отдельный халат и одноразовые перчатки.
емкость для сброса наконечников.
комплект средств для обработки рабочего места.
9.2 ЗОНА 2 – для проведения амплификации ДНК:
 Формат EPh: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-Технология», Россия,
или эквивалентный.
 Формат FRT: амплификатор (например, Rotor-Gene 3000/6000, Corbett Research,
Австралия; Rotor-Gene Q, QIAGEN, Германия, или iCycler iQ или iQ5, Bio-Rad,
США)
 ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
 центрифуга/вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
 набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
 Формат FRT: одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл
(например, Axygen, США).
 штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок объемом
0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 холодильник от 2 °С до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 С
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
 емкость для сброса наконечников.
 комплект средств для обработки рабочего места.
9.3
Формат EPh: ЗОНА 3 – для детекции продуктов амплификации методом
электрофореза в агарозном геле:
 камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например,
SE-2, «Хеликон», Россия).
 источник постоянного тока с напряжением 150 – 460 В (например, «Эльф-4», «ДНКТехнология», Россия).
 ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например,
«Биоком», Россия).
 видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например,
«Биотест-1», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; BioRad,
США).
 аквадистиллятор.
 холодильник от 2 °С до 8 °С.
 микроволновая печь для плавления агарозы.
 колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления
агарозы на 250 мл.
 мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).
 штатив для пробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
 отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10–
40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).
 одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).
 пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид
этидия.
 отдельный халат и одноразовые перчатки.
10
Порядок работы
10.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 6 из 21
Экстракция ДНК при помощи комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» для формата EPh:
Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре
от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60–65 °С до полного растворения кристаллов.
Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный
и положительный контроли экстракции). Внести в каждую пробирку по 300 мкл
лизирующего раствора. Промаркировать пробирки. В пробирки с лизирующим
раствором внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с фильтром. В пробирку
отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 100 мкл ОКО. В пробирку
положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО
Chlamydophila psittaci.
Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С в
термостате. Процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба
растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при
максимальных оборотах и использовать для экстракции ДНК надосадочную жидкость, перенеся
ее в новую пробирку.
Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку
отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента
универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и
оставить в штативе на 5 мин.
Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в
течение 30 с. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя
вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный
центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить
надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и
отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при
10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный
отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.
Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, удалить надосадочную
жидкость полностью.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5–10 мин для подсушивания
сорбента универсального (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе.
Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение
1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить до 4 ч при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно
при температуре от минус 24 С до минус 16 С.
Экстракция ДНК при помощи комплекта реагентов «РИБО-преп» для формата FRT:
Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 °С до 8 °С) прогреть при
температуре 65 °С в термостате до полного растворения кристаллов.
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно
закрывающимися крышками (включая отрицательный контроль экстракции).
Внести в каждую пробирку по 300 мкл раствора для лизиса и по 10 мкл ВКО-Fl (для
варианта FRT). Промаркировать пробирки.
В пробирки с раствором для лизиса и ВКО-FL внести по 50–100 мкл исследуемых
проб, используя наконечники с фильтрами. В пробирку отрицательного контроля (ОК)
экстракции внести 100 мкл ОКО.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 7 из 21
Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 С
в термостате.
Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на
вортексе.
Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при
13 тыс об/мин.
Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный
отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки,
осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3–5 раз. Можно провести процедуру
одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе
сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив.
Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1–2 мин на микроцентрифуге.
Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и
осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1–2 мин на микроцентрифуге.
Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя
вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы.
Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания
осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты).
Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в
термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на
микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к
постановке ПЦР.
Очищенную ДНК можно хранить до 4 ч при температуре от 2 °С до 8 °С или длительно
при температуре от минус 24 С до минус 16 С.
10.2 ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации участка ДНК.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант 50 R и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле с
использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. приложение 1.
Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
вариант FRT-50 F см. приложения 2, 3.
VI. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
11
Работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-72/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод
полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом
ветеринарии.
12
Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в
Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы и реактивы в зону, в которой была
проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе
дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть
строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.
Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие
помещения лаборатории.
13
Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время
работы с образцами и реактивами.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 8 из 21
14
Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром.
15
Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать
в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть
использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой
соли дихлоризоциануровой кислоты).
16
Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы,
пинцеты),
использованные
для
гомогенизации,
выдерживаются
в
растворе
дезинфицирующего
средства
(например,
0,2 %
раствор
натриевой
соли
дихлоризоциануровой кислоты) в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в
течение 30 минут, моются водопроводной водой с поверхностно-активными моющими
средствами и после отмывания в проточной и деионизованной воде высушиваются в
сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 С.
17
Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до
начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в
течение 30 мин.
П. п. 18 выполняется только для варианта EPh
18
При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться
защитным экраном или защитной маской.
19
Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.
Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 9 из 21
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Формат EPh
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И УЧЕТ
РЕЗУЛЬТАТОВ
I. ЭТАП 2 (зона № 2). Проведение амплификации.
В комплекте реагентов для амплификации «ПЦР-комплект» применяется «горячий
старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой
воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при
95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.
Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.
Порядок работы:
А. Подготовка пробирок для амплификации
Подготовить необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R ХЛА-ПСИТ для
амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.
На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна
проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R ХЛА-ПСИТ.
Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При
использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не
добавлять.
В подготовленные пробирки под масло или непосредственно на масло, используя
наконечники с фильтром, внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контролей
этапа экстракции.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл реагента К–.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО
Chlamydophila psittaci.
Б. Проведение амплификации
Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейке
амплификатора достигнет 95 С, поставить программу на паузу, поместить пробирки в
ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок
кратким центрифугированием на вортексе (1–3 с).
Таблица 1. Программа для амплификации ДНК Chlamydophila psittaci
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке):
GeneAmp PCR
Omn-E (Hybaid);
System 2700 (Applied
«Терцик» («ДНКBiosystems); PalmMaxyGene (Axygen)
Технология»)
Cycler (Corbett
Research)
темпе- время циклы темпе- время циклы темпе- время циклы
цикл
ратура
ратура
ратура
0
95°С пауза
95 °С пауза
95 °С пауза
1
1
1
1
95°С 5 мин
95 °С 5 мин
95 °С 5 мин
30 с
95°С 10 с
95 °С 10 с
95 °С
2
41
41
45 с
42
61°С 10 с
61 °С 25 с
61 °С
45 с
72°С 10 с
72 °С 25 с
72 °С
3
1
1
1
72°С 1 мин
72 °С 1 мин
72 °С 1 мин
4
хранение
хранение
хранение
10°С
4 °С
10 °С
Амплификаторы с
матричным
регулированием
температуры:
«Ампли-3» («Биоком»);
Biometra; MiniCycler,
PTC-100 (MJ Research)
темпе- время циклы
ратура
пауза
95°С
5 мин
1
95°С
1 мин
95°С
1 мин
41
61°С
1 мин
72°С
1 мин
1
72°С
хранение
10°С
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 10 из 21
После окончания реакции пробирки отправить в помещение для детекции продуктов
ПЦР (зону 3).
Образцы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в
течение недели при температуре от 2 °С до 8 °С и длительно при температуре от минус 24 °С
до минус 16 °С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до
комнатной температуры для размягчения воска).
II. ЭТАП 3 (зона 3). Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в
агарозном геле.
Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении
сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.
А. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля
Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести
дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.
ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним
следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на
кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть
соответствующий участок водой.
Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать
специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).
Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из
термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением
колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления
агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин.
Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время
плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из
микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить
колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до
кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до
температуры 65–70 С.
Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.
Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
Толщина геля должна быть около 0,6 см.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из
него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки
должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к
положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм
сверху.
Б. Порядок работы
Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать изпод слоя масла по 10–15 мкл проб и внести в лунки геля (необходимо использовать новый
наконечник для каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно
представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.
Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к
положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE-2
(«Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» (ЗАО «НПФ ДНК Технология»)
параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время
электрофореза – 18–20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом
составляет 10 В/см.
По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину
длины геля – 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор,
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 11 из 21
расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере
с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.
ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны
быть защищены маской или стеклянной пластиной!
В. Дезактивация буфера и гелей.
Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также
использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с
требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами».
III. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на
электрофореграмме специфической полосы амплифицированной ДНК.
В образце обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если в дорожке, соответствующей
этой пробе присутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 1033 п.н. большей
или меньшей интенсивности.
В образце не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если в дорожке,
соответствующей этой пробе, отсутствует специфическая светящаяся полоса на уровне
1033 п.н.
Кроме полосы на уровне 1033 п.н., в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые
полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные результаты для положительных и отрицательных контролей экстракции
ДНК и амплификации, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных
реакций (см. табл. 2).
Таблица 2. Оценка результатов анализа контролей
Контрольный
образец
ПК
ОК
К–
К+
Контролируемый этап ПЦРанализа
Экстракция ДНК
Экстракция ДНК
ПЦР
ПЦР
Специфическая полоса 1033 п.н. на
электрофореграмме
Есть
Нет
Нет
Есть
В дорожках, соответствующих положительным контролям (ПК и К+), должны быть
яркие специфические светящиеся полосы на уровне 1033 п.н.
В дорожках, соответствующих отрицательным контролям (ОК и К–), не должно
быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже
уровня 100 п.н.
Если в дорожках положительных контролей (ПК и К+), отсутствует специфическая
светящаяся полоса на уровне 1033 п.н., необходимо повторить амплификацию для всех
образцов, в которых не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci.
Появление специфической полосы 1033 п.н в любом из отрицательных контрольных
образцов (ОК, К–) указывает на контаминацию реактивов или проб. В этом случае
результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить
ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры
по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 12 из 21
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Формат FRT
ПРОВЕДЕНИЕ
АМПЛИФИКАЦИИ
И
ДЕТЕКЦИИ
ПРОДУКТОВ
АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ
Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q (QIAGEN,
Германия)
А.
Подготовка пробирок для амплификации.
Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.
- Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL ХЛА-ПСИТ, перемешать на вортексе и
сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
- Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-FL ХЛАПСИТ, ПЦР-буфер-С, полимеразу (TaqF) из расчета на каждую реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-FL ХЛА-ПСИТ
 5 мкл ПЦР-буфера-С
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
- Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в пробирки на 0,2 мл.
- Используя наконечник с фильтром в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл
ДНК исследуемых образцов или контроля этапа экстракции2.
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль ПЦР (К-) – внести в пробирку 10 мкл реагента К-.
б) положительный контроль ПЦР (К+) – внести в пробирку 10 мкл К+
Chlamydophila psittaci / STI.
Б.
Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала на приборе
Rotor-Gene:
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ротор амплификатора
Rotor-Gene (ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для
программирования положения проб в амплификаторе). Запрограммировать прибор.
Программирование амплификатора:
Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу RotorGene версии 6, с прибором Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q – программу Rotor-Gene 6000
версии 1.7 (build 67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и
программного обеспечения, указаны в следующем порядке: для прибора Rotor-Gene
3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 (Rotor-Gene Q) / для
русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.
 Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
 Выбрать тип ротора. Поставить отметку в окошке рядом с надписью No Domed 0.2 ml
Tubes/Locking ring attached/Кольцо закреплено.
 Нажать кнопку Next/Далее.
 Выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Для
прибора Rotor-Gene 6000 должно быть отмечено окошко 15 l oil layer volume/15 μL
объем масла/воска.
 Нажать кнопку Next/Далее.
 В верхней части окна нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля.
При экстракции ДНК с помощью комплекта «ДНК-сорб B» необходимо избегать попадания сорбента
универсального в реакционную смесь.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 13 из 21
2
 Задать следующие параметры эксперимента:
Этап
Температура, °С
Время
Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
95
15 мин
-
1
95
60
72
95
10 c
20 с
10 с
10 с
55
20 с
FAM/Green,
JOE/Yellow
Hold/ Удерж.
температуры
Cycling/
Циклирование
Cycling/
Циклирование
5
40
72
10 с
 Нажать дважды кнопку OK/Да.
 В нижней части окна нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation/Опт.уровня сигн. В
открывшемся окне нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детекмых, выбрать функцию: Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimisation
Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Для обоих
каналов установить параметры Min Reading/Миним. Сигнал – 5Fl и Max
Reading/Максим. Сигнал – 10Fl. Окно закрыть, нажав кнопку Close/Закрыть.
 Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.
 Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически
сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо
запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку Edit
samples/Правка образцов (в нижней правой части основного окна). Все исследуемые
образцы и контроли обозначить как Unknown/Образец.
В. Анализ результатов
Анализ результатов амплификации ВКО (канал FAM/Green):
 Нажать
в
меню
кнопку
Analysis/Анализ,
выбрать
режим
анализа
Quantitation/Количественный, нажать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A. Green,
Show/Показать.
 Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
 В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть
активирована кнопка Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррек. уклона.
 Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear
scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по
умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log
scale/Лог.шкала).
 В меню основного окна More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов установить
значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) – 10%.
 В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.05.
В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся
значения Ct.
Анализ результатов амплификации специфического участка ДНК Chlamydophila
psittaci (канал JOE/Yellow):
 Нажать
в
меню
кнопку
Analysis/Анализ,
выбрать
режим
анализа
Quantitation/Количественный, нажать кнопку Cycling A. JOE/Cycling A. Yellow,
Show/Показать.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 14 из 21
 Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.
 В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть
активирована кнопка Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррек. уклона.
 Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear
scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по
умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log
scale/Лог.шкала).
 В меню основного окна More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов установить
значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) – 10%.
 В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0.1.
В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся
значения Ct.
Г. Учет результатов
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в
соответствующей графе в таблице результатов).
В образце обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы значение
Ct на канале JOE/Yellow менее 37.
В образце не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы по
каналу JOE/Yellow значения Сt отсутствуют (кривая флуоресценции не пересекает
пороговую линию), а по каналу FAM/Green определено значение Ct, не превышающее 33.
Результат анализа сомнительный, если для данной пробы на канале JOE/Yellow
получено значение Ct больше 37, а значение Ct по каналу FAM/Green не превышает 33. В
этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца,
начиная с этапа экстракции ДНК. В случае повторения результата или получения значения
Ct менее 40, считать, что ДНК Chlamydophila psittaci обнаружена.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует)
значение порогового цикла Ct по каналу JOE/Yellow, и по каналу для флуорофора
FAM/Green значение Сt также не определено (отсутствует) или превышает 33. В этом
случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца,
начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные результаты для положительного и отрицательного контролей
амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с
таблицей оценки результатов контрольных реакций (см. табл. 3).
Таблица 3. Оценка результатов анализа контролей
Контроли
ОК
К–
K+

Значение Сt по каналу
Контролируемый
этап анализа
FAM/Green
JOE/Yellow
Экстракция ДНК
ПЦР
ПЦР
< 33
Нет значений
< 30
Нет значений
Нет значений
< 30
Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла Ct по каналу
JOE/Yellow отсутствует или превышает граничное значение, указанное в таблице 3,
необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена
ДНК Chlamydophila psittaci.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 15 из 21

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля
экстракции ДНК на канале JOE/Yellow и/или для отрицательного контроля ПЦР (К–)
на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или
образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются
недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с
этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 16 из 21
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
Формат FRT
ПРОВЕДЕНИЕ
АМПЛИФИКАЦИИ
И
ДЕТЕКЦИИ
ПРОДУКТОВ
АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ
iCycler iQ и iCycler iQ5 (Bio-Rad, США)
А. Подготовка пробирок для амплификации
Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.
Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL ХЛА-ПСИТ, перемешать на вортексе и
сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.
Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-FL ХЛАПСИТ, ПЦР-буфер-С, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:
 10 мкл ПЦР-смеси-FL ХЛА-ПСИТ
 5 мкл ПЦР-буфера-С
 0,5 мкл полимеразы (TaqF)
Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и
внести по 15 мкл в пробирки на 0,2 мл.
Используя наконечник с фильтром, в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл
ДНК
исследуемых
образцов.
(Необходимо избегать попадания сорбента
универсального в реакционную смесь).
Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль (К–) – внести в пробирку 10 мкл К–.
б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл К+ Chlamydophila
psittaci / STI.
Б. Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала
Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не
менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
Открыть программу iCycler.
Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного
сигнала:
 Для прибора iCycler iQ5 в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку
Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. В опции
Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех
пробирках по каналам FAM и JOE. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип
крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную
схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.
 Для прибора iCycler iQ в окне Edit Plate Setup модуля Workshop в опции Samples: Whole
Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя
каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать
измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE.
Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с
расширением .pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана).
Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 17 из 21
Задать программу амплификации:
Этап
Температура, °С
Время
Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
95
15 мин
-
1
95
60
72
95
55
72
10 c
25 с
25 с
10 с
25 с
25 с
FAM, JOE
Hold/ Удерж.
температуры
Cycling/
Циклирование
Cycling/
Циклирование
5
40
 Для прибора iCycler iQ5 в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create
New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку
Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой
программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке
Users).
 Для прибора iCycler iQ выбрать опцию Edit Protocol модуля Workshop. Задать параметры
амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа
указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол,
задав имя файла в окне Protocol Filename (Chla-psit.tmo) и нажав кнопку Save this
protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с
этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав
нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate
setup.
Поместить предварительно подготовленные для проведения ПЦР пробирки в модуль в
соответствии с заданной схемой.
Запустить выполнение выбранной программы Chla-psit с заданной схемой планшета.
 Для прибора iCycler iQ5 перед запуском выполнения программы следует проверить
правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate
Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант
Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название
эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного
эксперимента) и нажать OK.
 Для прибора iCycler iQ перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует
проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для
измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source.
Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать
кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически
сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
После окончания программы приступить к анализу результатов.
В. Анализ результатов
 Запустить программу и открыть файл с результатами эксперимента. Для этого:
 Для прибора iCycler iQ5 выбрать нужный файл с данными анализа в окне Data File
модуля Workshop и нажать кнопку Analyze.
 Для прибора iCycler iQ в модуле Library активировать окно View Post-Run Data. В
окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyze
Data.
 Анализ результатов проводится по каналам FAM и JOE. Результаты обрабатывают для
каждого канала по отдельности, активируя кнопку с названием соответствующего
флуорофора.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 18 из 21
 В режиме анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по
умолчанию) поочередно для каждого канала установить пороговую линию, двигая ее
курсором при нажатой левой кнопке мыши, на уровне 10-20 % от максимального уровня
флуоресценции на последних циклах амплификации. При этом пороговая линия должна
пересекать только S-образные кривые накопления сигнала положительных образцов и
контролей на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции,
переходящего в линейный подъем и не пересекать базовую линию.
 Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку PCR Quant (iCycler iQ) или
кнопку Results (iCycler iQ5).
Дальнейший учет результатов проводят, используя полученные значения Ct.
Г. Учет результатов
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей
графе в таблице результатов).
В образце обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы значение Ct
на канале JOE менее 37.
В образце не обнаружена ДНК Chlamydophila psittaci, если для данной пробы по каналу
JOE значения Сt отсутствуют (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию), а
по каналу FAM определено значение Ct, не превышающее 33.
Результат анализа сомнительный, если для данной пробы на канале JOE получено
значение Ct больше 37, а значение Ct по каналу FAM не превышает 33. В этом случае
требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с
этапа экстракции ДНК. В случае повторения результата или получения значения Ct менее
40, считать, что ДНК Chlamydophila psittaci обнаружена.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует)
значение порогового цикла Ct по каналу JOE, и по каналу для флуорофора FAM значение Сt
также не определено (отсутствует) или превышает 33. В этом случае требуется повторно
провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и
отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки
результатов контрольных реакций (см. табл. 4).
Таблица 4. Оценка результатов анализа контролей
Значение Сt по каналу
Контролируемый
Контроли
этап ПЦР-анализа
FAM
JOE
ОК
Экстракция ДНК
< 33
Нет значений
КПЦР
Нет значений
Нет значений
K+
ПЦР
< 30
< 30

Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла Ct по каналу
JOE отсутствует или превышает граничное значение, указанное в таблице 4,
необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена
ДНК Chlamydophila psittaci.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля
экстракции ДНК на канале JOE и/или для отрицательного контроля ПЦР (К–) на
любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В
этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными.
Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а
также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 19 из 21
Лист вносимых изменений
Редакция
Место внесения
изменений
По всему тексту
26.03.08
28.04.08
23.08.08
05.08.11
VV
25.01.13
VN
26.04.13
ОМ
Суть вносимых изменений
Уточнены названия реагентов.
Удален прибор «GeneAmp PCR System 2400», «Applied
Biosystems». Добавлен прибор «GeneAmp PCR System 2700»,
«Applied Biosystems».
п. Транспортирование
Уточнены условия хранения тест-системы.
и хранение
п. Порядок
Уточнены материалы и оборудование, требуемые для
проведения ПЦР
работы.
Изменен объем фасовки реагента ПКО ДНК Chlamydophila
п. Общие положения
psittaci.
Уточнены термины и сокращения. Комплект реагентов
По всему тексту
«АмплиСенс» заменен на «ПЦР-комплект».
Титульный лист
Внесена новая печать
назначение тест-системы добавлено отдельным пунктом 1
п. Общие положения объем реагентов указан в см3
Изменен объем фасовки реагента ОКО на 1,2 см3
п. Транспортирование Срок годности тест-системы изменен с 6 на 12 месяцев с
и хранение
даты изготовления
раздел «Принцип проведения реакции» переименован в
Принцип метода
«Принцип метода»
«Порядок проведения ПЦР» переименован в «Проведение
Проведение ПЦРПЦР-анализа»
анализа
Уточнен перечень и названия применяемого оборудования
Таблица 1.
Программа для
Добавлена программа амплификации для прибора
амплификации ДНК
«Maxygene», изменена программа амплификации.
Chlamydophila
psittaci
Меры личной
Добавлены меры личной профилактики
профилактики
Добавлено: «Рекомендовано к регистрации в Российской
Федерации ФГУ «ВГНКИ»
«С утверждением настоящей инструкции инструкция,
утвержденная Россельхознадзором 19.09.2007 года,
По тексту
утрачивает силу»
Увеличено количество пунктов в связи с внесенными
дополнениями
«Выделение» заменено на «Экстракция»
Отрицательный контроль экстракции заменен с «ОК» на
«В–»
По тексту
Удален регистрационный номер и печати
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Добавлены формы комплектации 1 и 2
Общие положения
Изменены единицы измерения объемов реагентов с см3 на
см3 (мл)
Изменены
каталожные
номера
VET-2-R0,2-К;
Нижний колонтитул VET-2-R0,5-К вместо каталожных номеров VET-2-R0,2;
VET-2-R0,5
Нижний колонтитул
Формат и форма вынесены перед каталожным номером
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 20 из 21
Редакция
17.10.13
ME
Место внесения
изменений
По тексту
Нижний колонтитул
Суть вносимых изменений
Инструкция приведена в соответствие с шаблоном
Добавлен формат FRT
Изменена нумерация разделов
Добавлены приложения 1, 2 и 3
Добавлен раздел «Аналитические характеристики»
ПКО ДНК Chlamydophila psittaci заменен на ПКО
Chlamydophila psittaci
ДНК-буфер (0,5 мл) заменен на К– (0,2 мл)
В– заменено на ОК
Добавлено «Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K»
Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-2-R0,5-К; VET-2-R0,2-К;
Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-2-FRT-K / Дата изменения: 17.10.13 / стр. 21 из 21