2003 - Учебный портал РУДН
advertisement
1 М.А КЕЛДЫШ, Ю.И. ПОМАЗКОВ ВИРУСЫ, ВИРОИДЫ И МИКОПЛАЗМЫ РАСТЕНИЙ Учебное пособие (Краткий курс) Москва Издательство Российского университета дружбы народов 2003 2 M.A. KELDISH, U.I. POMASKOV VIRUSES, VIROIDS AND MYCOPLASMAS OF PLANT (short course) Moscow 2003 3 ББК 44.7 К 34 Утверждено РИС Ученого совета Российского университета дружбы народов Рецензенты: доктор биологических наук Ф.У. Джалилов, доктор сельскохозяйственных наук Р.И.Словцов Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусы, вироиды и микоплазмы растений: К 34 / Учебное пособие.- М.: Изд-во РУДН, 2003 – с. 157: 7 ил. ISBN 5-209-01497-5 В соответствии с программой направления «Агрономия» и специализации «Интегрированная защита растений» в учебном пособии изложены сведения об основных наиболее вредоносных и широко распространенных фитовирусах, вироидах и фитоплазмах сельскохозяйственных культур. Особое внимание уделено трансмиссивным инфекциям и особенностям борьбы с ними. Даны практические рекомендации по применению защитных мероприятий на различных культурах, позволяющие снизить ущерб, причиняемый возбудителями. Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся в магистратуре и специализирующихся по защите растений. ББК 44,7 According to the program of direction "Agronomy" and the specialization "The integrated protection of plants " in the manual are stated the items of information about basic injury and widespread viruses, viroids and mycoplasmas of agricultural cultures. The special attention is given to transmissible infections and features of struggle with them. The practical recommendations for application of protective measures on various cultures allowing to lower damage from all types of ailments caused to plants by disease pathogens. The manual is intended for the students training in post graduate (magistrate) and those specializing in plant protection as Doctor of Plant Medicine. Издательство Российского университета дружбы народов, 2003 Келдыш М.А., Помазков Ю.И., 2003 4 Содержание Введение……………………………………………………………..9 О происхождении и эволюции возбудителей…………………….13 Общая характеристика патогенов………………………………...16 Фитовирусы……………………..………………………………16 Вироиды………………………………………………………...22 Фитоплазмы……………………..…………………………… 25 Отношение к физическим и химическим факторам……………..27 О взаимодействии возбудителей с растением…………………….31 Инфекционный процесс………………………………………..31 Патологическое воздействие на растение…………………….33 Особенности распространения и локализации……………….40 Пути распространения возбудителей……………………………..43 Механизм передачи возбудителей векторами……………… 43 Особенности циркуляции возбудителей ……….………….….51 Методы диагностики заболеваний и идентификации их возбудителей.……………………………………………………57 Штаммовый состав………………….……………………………...79 Таксономия вирусов, вироидов и фитоплазм …………………….82 Вирусоподобные аномалии у растений…………………………...85 Меры борьбы с вирусными, вироидными и фитоплазменными болезнями……………………………………………………………87 Болезни злаковых культур……………………………………..96 Болезни зернобобых культур…………………………………..99 Болезни картофеля…………………………………………….103 Болезни овощных и бахчевых культур………………………107 Болезни плодовых, ягодных культур и винограда…………..112 Болезни декоративных и цветочных растений………………117 Болезни субтропических и цитрусовых культур……………121 Болезни тропических культур………………………………...123 Лабораторно-практические занятия……………………………...126 Тема.1. Патология и симптоматика заболеваний……………126 Тема 2. Внутриклеточные включения и методы их обнаружения …………………………………………127 Тема 3. Морфология и строение вирусов, фитоплазм и вироидов……………………………………………128 Тема 4. Получение очищенных препаратов…. ……………..130 Тема 5. Физико-химические свойства возбудителей……….133 Тема 6. Получение диагностических сывороток…………...134 5 Тема 7. Фракционирование и разделение смешанных инфекций……………………………….135 Тема 8. Пути и способы распространения инфекции.. …….137 Тема 9. Классификация вирусов, вироидов и фитоплазм…..139 Литература………………………………………………………....141 Приложения………………………………………………………..143 Приложение 1. Классификация вирусов……………………..143 Приложение 2. Классификация вироидов…………………...145 Приложение 3. Классификация микоплазм………………….147 Приложение 4. Латинские обозначения вирусов, вироидов и фитоплазм………………………148 Приложение 5. Сокращенные обозначения визуальных признаков поражения………………………..150 Приложение 6. Рисунки к тексту……………………………. 151 6 The content Introduction … … … … … … … … … … … … … … … …… 9 About an origin and evolution of pathogens… … … …………. 13 General characteristic pathogens……………………………… 16 Viruses… … … … … … … …… ……………………….16 Viroids … … … … … … … … … … …………………..22 Phytoplasmas … … … … … …… … … … … … ……...25 The relation to the physical and chemical factors … ……………27 About interaction of viruses with a plant … … … … … … ……31 Infectious process … …………………………………….31 Pathological influence on a plant … … … … … ………..33 Features of distribution and localization … … …………. 40 Ways of distribution of pathogens … ………………………… 43 The mechanism of transfer of infections by vectors …….. 43 Features of circulation of pathogens … … …. … ……… .51 Methods of diagnostics of diseases and identification their pathogens……………………….. … … … … … … … … ….. 57 Strain structure … … … … … … …. … … … ……… … … .79 Taxonomy of viruses, viroids and phytoplasmas … ……….. … 82 Virus-like of anomaly at plants … … … … … ………………. .85 Measures of suppress with virus, viroids and mycoplasma diseases … … … ….. …………………………………………..87 Illnesses of cereal cultures … … … … … … …………….96 Illnesses cereal-leguminous of cultures … … … … … …..99 Illnesses of a potatoes … … … … … … … … ……….…103 llnesses vegetable and melon cultures … … … ……… 107 Illnesses fruit trees, small fruit and grapes … ……………112 Illnesses of decorative and flower plants … … … ……117 Illnesses of subtropical and citron cultures … ………….. 121 Illnesses of tropical cultures … … … … … … ………… 123 Laboratory employments … … … … … ……………………..126 Topic 1. A pathology and symptomatic of diseases…….. 126 Topic 2. Introcell of inclusion and methods them detection ………………………………………………… 127 Topic 3. Morphology and structure of viruses, phytopla and viroids … …………………………………………… 128 Topic 4. Reception of the cleared preparations ………… 130 Topic 5. Physic-chemical properties of pathogens……….133 Topic 6. Reception of diagnostic serums ………………...134 Topic 7. Fractionary and division the mixed infections .. 135 7 Topic 8. Ways and ways of distribution of an infection… 137 Topic 9. Classification of viruses, viroids and phytoplamas……………………………………………. .139 The literature … … … … … … ………………………………141 The supplements … … … … … … … … … … ……………..143 The supplement 1. Classification of viruses ………..… …143 The supplement 2. Classification viroids ………………….145 The supplement 3. Classification mycoplasmas …………..147 The supplement 4. Latin designations of viruses, viroids and phytoplasmas…………………………………………..148 The supplement 5. The reduced designations visual attributes of a defeat … … ………………………………..150 The supplement 6. The pictures to text…………………….151 8 То, что мы знаем, ограничено, то, чего мы не знаем – бесконечно. Л.Лаплас ВВЕДЕНИЕ Вирусы, микоплазмы и вироиды поражают все живые организмы. Они вызывают болезни у человека, животных, растений, насекомых, бактерий, часто вызывая массовые поражения, приводящие к тяжелым последствиям. К настоящему времени известно уже около 700 возбудителей вирусной этиологии и фитоплазм и более 30 вироидов. И их список постоянно пополняется. Последнее десятилетие характеризуется значительными изменениями эпидемиологической ситуации, вследствие антропогенного воздействия на экосистемы и входящие в них живые организмы. При этом уровень инфицирования растений (и других организмов) возбудителями этих групп, их вредоносность и распространение возрастают. Появляются новые формы с измененными свойствами, способные поражать более широкий набор видов. Формирование новых патологических связей становится типичным явлением. Меняется статус возбудителей. Их начинают рассматривать не только в качестве инфекционных агентов, но и как фактор, способный трансформировать биосистемы. Вирусы представляют собой удобную модель для многих исследований, связанных с изучением биологических процессов на молекулярном уровне, в том числе для выяснения механизмов наследственности, синтеза макромолекул - белков и нуклеиновых кислот, универсальных для всего живого. Такое отношение к вирусам (а в последние годы и к вироидам) обусловлено их уникальностью. Во-первых, вирусы наиболее мелкие биологические структуры, сочетающие в себе признаки живого и неживого, несущие всю необходимую информацию для собственного воспроизводства. Вместе с тем это сложные образования, состоящие из макромолекул нуклеиновой кислоты и белка, представляющие собой наглядный пример высшей ступени интеграции биологических структур, их целостности и упорядочености. 9 Весьма примечательна история их изучения (табл.1). Так, некоторые вирусные заболевания были известны задолго до открытия самих вирусов. Такие случаи отмечены в медицине и ветеринарии, когда не удавалось выделить возбудителей инфекционных болезней, вызывающих, например, бешенство у человека, ящур у животных, желтуху у шелковичных червей. Упоминания о бешенстве можно встретить еще в трудах Аристотеля, Гомера и Авиценны, а оспа была известна за 1200 лет до н.э. Разрабатывались, в ряде случаев эмпирически, и приемы защиты от этих опасных заболеваний. Так, еще в 1798 г. Дженнером была приготовлена вакцина против оспы. В 1886 г. в докладе французской Академии наук Пастер сообщал о спасении 350 человек от бешенства с помощью вакцины, полученной из высушенного мозга больных кроликов. Первое же описание симптомов вирусной болезни у растений сделано на цветах тюльпанов, в частности, пораженных пестролепестностью. Ни одно вирусное заболевание не было столь прекрасно проиллюстрировано, как пестролепестность тюльпанов, пораженные цветки которых старались изображать на своих натюрмортах голландские художники в 17 в. Это объяснялось просто. В то время подобные цветки были в моде и ценились весьма дорого. Из истории известны случаи, когда в обмен на одну зараженную луковицу давали вола, свинью, 1000 фунтов сыра и даже мельницу. Луковицы использовались и в качестве приданного. Некоторые голландские садоводы знали, что получить цветок с “полосатой” расцветкой можно, привив обычную луковицу на луковицу с пестролепестными признаками. Не случайно поэтому, что первые опыты по экспериментальной передаче вирусов от растения к растению описаны именно в Голландии. В 1886 г Адольф Майер, немец по национальности, работавший в этой стране, обнаружил, что мозаичную расцветку листьев на табаке можно вызвать путем инъекций в их жилки сока от мозаичных растений. Он отметил, что при кипячении сока инфекционность его утрачивается, и сделал вывод - возбудителем мозаики табака являются бактерии. И только в 1892 г. русский ученый Дмитрий Ивановский, подтвердив результаты опытов Майера, установил, что возбудитель мозаичного заболевания табака размножается только в живых тканях, не способен расти на искусственных питательных средах, не задерживается при фильтрации через бактериальные каолиновые фильтры Шамберлена, т.е. не является бактерией. Этому возбудителю в 1898 г. Мартином Бейеринком дано определение, как “инфекционное живое жидкое начало” (от латинского vivum 1 0 fluidum). По своему действию оно напоминало действие яда. Поэтому впоследствии инфекции такого рода стали называть фильтрующимися вирусами (от римского слова virus - яд). В 1898 г. было открыто первое вирусное заболевание у животных - ящур. Вскоре вирусы уже обнаружили на томатах, огурцах, злаковых культурах, плодовых и других растениях, у птиц, собак, бактерий. Однако об их строении еще долго ничего не было известно, так как частицы всех вирусов настолько малы, что их нельзя увидеть в световом микроскопе, разрешающая способность которого лежит выше 200 нм. Величина же самих вирусных частиц, как мы теперь уже знаем, варьирует в пределах значительно ниже этой величины. Таблица 1 Основные исторические этапы развития вирусологии Год 1886 1892 1895 1898 1898 1915 1927 1929 1931 1935 1937 1939 1941 Этап Демонстрация инфекционности мозаичной болезни табака Открытие нового инфекционного агента – возбудителя мозаики табака Обнаружение переносчика (цикадки) карликовости риса Возбудитель мозаики табака назван “вирусом” Открытие возбудителя ящура Открытие бактериофагов Открытие антигенных свойств у вирусов Обнаружение некротической реакции у растений на инфицирование вирусом табачной мозаики (ВТМ) Разработка метода выращивания вирусов в куриных эмбрионах Выделение ВТМ в кристаллической форме Установление нуклеопротеидной природы ВТМ Для изучения вирусов применен электронный микроскоп Открытие агглютинации эритроцитов вирусом гриппа 1 1 Автор А.Майер Д.Ивановский Fukushi, Hashimoto М.Бейеринк Ф.Лефлер, Фроги Тусорт Dvorak Holmes А.Вудроф, Е.Гудпэсчур Стенли Боуден, Пири М.Арден, Г.Руска Г.Херст Продолжение т а б л и ц ы 1 1949 Использование культуры тканей для поддержания вируса (полиомиелита) 1955 Реконструкция инфекционного ВТМ 1956 Открытие инфекионности у РНК ВТМ 1957 1967 Открытие интерферона и его антивирусных свойств Разработка метода негативного контрастирования препаратов для электронной микроскопии Определение функциональных свойств белка и РНК Определение аминокислотной последовательности белка ВТМ Определение нуклеотидной последовательности НК вируса Открытие микоплазм 1967 Открытие вироидов 1957 1958 1960 1962 Д.Эндерс, Т.Уэллер, Ф.Роббинс ФренкельКонрад Гирер, Шрамм, ФренкельКонрад А.Айзекс, Д.Линдеман С.Бреннер, Д.Хорн Гирер, Мукди Андерер и др. Уайтфельд Ю.Дои, К.Ера, М.Теренака, Х.Асуяма В.Stollar, T.Diener, W.Raymer В течение продолжительного периода усилия ученых было сосредоточено на изучении симптоматики заболеваний различных культур, способах передачи возбудителей, их свойств, методов диагностики и особенностей развития. И лишь в 1927 г. были выполнены первые опыты по выделению вирусов, в результате которых получен полуочищенный препарат ВТМ. Следует подчеркнуть, что многие классические работы, в частности, по изучению химического состава возбудителей проведены именно на растительных вирусах. В 1935 г. американский ученый Стенли, используя химические методы, сумел очистить и получить в кристаллическом состоянии ВТМ. Работы Стенли положили начало 1 2 исследованиям вирусов in vitro. В последующие 20 лет в кристаллическом виде получены еще 15 вирусов. Проведя анализ кристаллов ВТМ, английские биохимики Боуден и Пири обнаружили в препарате до 25% фосфора, принадлежащего НК. Таким образом, впервые было показано, что вирусы состоят из белка и нуклеиновой кислоты, т.е. являются нуклеопротеидами. Роль НК, как носителя инфекционности, впервые продемонстрирована Хергии и Чейзом в 1952 г. на примере бактериофага. Было найдено, что в клетки инфицируемых бактерий попадает лишь ДНК фага, но не белок. Через четыре года Гирер и Шрамм (ФРГ) и Френкель-Конрад (США) доказали способность РНК ВТМ индуцировать типичные симптомы заболевания на табаке от этого возбудителя после ее инъекции в листья. Отмечен синтез новых молекул РНК и белка вируса. В дальнейшем были определены общие принципы строения вирусов, последовательность аминокислот в белке и нуклеотидов в НК. До 1967 г. возбудители фитоплазменных и вироидных заболеваний входили в группы так называемых “желтух”, в соответствии со специфическими визуальными проявлениями – пожелтением, хлорозом листовых пластинок, или вирусоподобных инфекций. В настоящее время “Вирусология” является важным разделом биологической науки. Ее объекты - вирусы, которые и дали название указанной дисциплине, и открытые значительно позже вироиды и фитоплазмы, которые наряду с собственной значимостью в качестве возбудителей вредоносных заболеваний растений играют исключительную роль для познания важнейших универсальных биологических механизмов. О ПРОИСХОЖДЕНИИ И ЭВОЛЮЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ Представления, касающиеся возникновения и эволюционного развития возбудителей рассматриваемых групп, до сих пор являются дискуссионными. Достоверные суждения и окончательные выводы по этому вопросу затруднены, во-первых, в связи со значительной гетерогенностью их популяций в целом, вариабельностью структуры, и, во-вторых, с отсутствием объективных временных характеристик эволюции и палеонтологических маркерных данных. Вместе с тем имеющаяся информация о строении, свойствах и функциях, в частности, вирусов из различных систематических групп, их взаимодействии с другими организмами свидетельствует о том, что они прошли длительный исторический путь развития. При трактовке проблемы происхождения вирусов высказаны самые 1 3 различные в том числе и диаметрально противоположные точки зрения. Одни считают, что вирусы произошли от экзогеннореликтовых доклеточных жизненных форм, другие утверждают об эндогенном их возникновении во взаимосвязи с существованием клеточных организмов. Гипотезы об экзогенном происхождении вирусов придерживались такие ученые, как А.Е.Проценко, К.С.Сухов, допускавшие, что возбудители этой группы представляют собой реликтовые формы неклеточных организмов, которые приобрели способность к паразитированию. Слабым местом этих воззрений остается отсутствие фактов, свидетельствующих о наличии свободноживущих неклеточных форм в природе. Высокоразвитый механизм облигатного паразитирования, химический состав и особенности репликации также не дают оснований считать, что в эволюционном отношении вирусы относятся к примитивным доклеточным формам жизни. Большее распространение получила гипотеза, связывающая происхождение вирусов с клеточными организмами. В частности, высказывается предположение, что вирусы возникли в результате деградации паразитических клеточных организмов, например, таких, как бактерии, фитоплазмы. Сторонники такой регрессивной теории происхождения считают, что именно в результате процессов внутриклеточного паразитизма происходило упрощение их строения и функций, приведшее к возникновению вирусов. Эта гипотеза не является бесспорной. Высказывается ряд соображений о том, что, если, например, вирусы возникли из микроорганизмов, локализованных в теле членистоногих и со слюной могли попадать в растения, то, очевидно, таким путем должны были возникнуть и нематофильные возбудители. В доказательство гипотезы происхождения вирусов вследствие дегенерации более высокоорганизованных клеточных форм приводятся также факты о некотором сходстве отдельных вирусов с фрагментами клеток, в которых они присутствуют, по внешнему виду и размерам. Известно также, что вирусы используют в процессе своей репродукции структуры клетки-хозяина. В подтверждение возможности такого хода эволюции приводятся данные об утрате некоторыми патогенными бактериями отдельных ферментных систем. Ряд ученых, обращая внимание на внешнее сходство между рибосомами растительных клеток и РНК-содержащими вирусами, высказало предположение, что вирусы могут представлять собой гены хозяина, вышедшие из-под контроля клетки. Считается, что различные нормальные компоненты клетки могут переноситься в 1 4 клетки других видов, приобретая при этом свойства патогенности. В частности, в клетках прокариотов существуют самые различные структуры, несущие генетическую информацию, в том числе вирусы бактерий, содержащие ДНК. Более того, выявлено сходство отдельных участков динуклеотидов у мелких ДНК-содержащих вирусов и клеток-хозяев млекопитающихся, на основании чего делается вывод об их связи с нормальными клеточными компонентами. Существует также гипотеза о том, что вирусы и вироиды растений и позвоночных возникли в результате мутаций регуляторных РНК, и что вироиды представляют собой именно аномальную РНК. Таким образом, несмотря на отсутствие прямых доказательств о происхождении вирусов и вироидов, различную логическую и фактическую достоверность существующих на этот счет теорий и гипотез, несомненно, что возбудители данной группы претерпели длительный путь эволюционного развития. Более того, в свете современного уровня биологических знаний представляется возможной не только прямая и обратная связь вирусов с патогенными компонентами, но и их определяющая роль в эволюции органической жизни. В настоящее время считается бесспорной способность генома некоторых вирусов и вироидов интегрироваться с генетическим аппаратом клетки. Эта форма взаимодействия возбудителей заболеваний и клетки хозяина характеризуется длительным сосуществованием обоих геномов, что обеспечивает их сохранение и репродукцию в природе. Уже получены данные о структуре геномов многих интеграционных вирусов, механизмах их интеграции с геномом клетки. Особый интерес представляет информация о сходстве некоторых вирусов, поражающих человека и животных, с трансмиссивными генетическими элементами про- и эукариот. Такие элементы могут резко изменять экспрессию клеточных генов, в которые они встраиваются. До недавнего времени считалось, что подобный феномен не свойствен вирусам растений. Однако открытие фермента ревертазы показало возможность интеграции с геномом и РНК-содержащих вирусов. При переходе в автономное, а затем и в интегрированное состояние с новым геномом вирусы и вироиды приобретают способность передавать генетическую информацию различным хозяевам из разнообразных растительных сообществ и индуцировать эволюцию геномов. 1 5 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕНОВ Фитовирусы Строение, биологические особенности развития и функциональные способности вирусов позволяют выделять их в обособленную группу органоидов. Специфический тип организации и строения вирусов не имеет аналогов среди клеточных организмов. По своему химическому составу, как нуклеопротеиды, и размерам они ближе всего напоминают рибосомы, но отличаются от последних по строению и функциям. Не имея собственной белоксинтезирующей системы и ферментов энергетического обмена, вирусы с помощью собственной НК (они содержат только один ее тип – РНК или ДНК) индуцируют синтез своих структурных белков, используя каталитическую систему рибосом хозяина. Популяция вируса одного вида, так же как и его потомство, гетерогенно и состоит из собрания разных по массе молекул, проявляя тем самым характерную для биологических объектов вариабельность. Молекулы вирусной нуклеиновой кислоты в растворе не имеют фиксированной конфигурации. Каждый возбудитель имеет строго постоянную форму и строение «зрелой» частицы. Вирусы паразитируют в клетках, используя их каталитическую и энергетическую системы. Они способны индуцировать синтез ферментов, способствующих их репродукции. Цикл репродукции вирусов в клетках растения-хозяина при участии его ферментов завершается образованием зрелых инфекционных частиц – вирионов. Считается, что их форма определяется строением белковой оболочки, которая состоит из отдельных белковых молекул. Эти структурные вирусные белки выполняют также защитную функцию, изолируя геном от различных воздействий факторов внешней среды. Зрелые частицы приспособлены для сохранения вне клетки и для проникновения в новые ткани, организмы. По своей структуре и форме вирусы подразделяются на спиральные вирионы (палочковидные и нитевидные), изометрические (сферические) и бацилловидные (рис.1). Размеры частиц колеблются в широких пределах (табл. 2). Изучение строения вирусов проводится с помощью электронной микроскопии, физико-химических и иммунологических методов, методом рентгеноструктурного анализа, основанном на явлении дифракции лучей 1 6 при прохождении через кристаллические структуры. Было показано, что палочковидные и нитевидные вирусы состоят из белковых субъединиц, расположенных спирально вокруг оси частиц. Вирионы палочковидных вирусов имеют вид жесткого негнущегося цилиндра, а частицы нитевидных имеют форму эластичных тяжей. Таблица 2 Форма и размеры некоторых фитовирусов Возбудители Вирус мозаики табака Вирус огуречной мозаики - 2 Вирус метельчатости верхушки картофеля Вирус раннего побурения гороха У– вирус картофеля Вирус мозаики сои Вирус желтухи свеклы Вирус мозаики салата Вирус мозаики костра Вирус некроза табака Вирус бронзовости томатов Вирус штриховатости риса Вирус мозаики люцерны Форма вириона Палочковидная Палочковидная Палочковидная Размер, нм 300 х 18 300 х 15 300 х 17 Палочковидная 215 х 25 Нитевидная Нитевидная Нитевидная Нитевидная Изометрическая Изометрическая Изометрическая Изометрическая Бацилловидная Вирус деформации побегов какао Бацилловидная 740 х 11 748 х 15 1250 х 10 747 х 15 28 26 80 29 58 х 18, 52 х 18 42 х 18 130 х 28 Типичным представителем палочковидных вирусов является ВТМ, который имеет длину 300 нм и ширину 15 нм. Диаметр осевого канала составляет у него 4 нм. Каждому витку спирали соответствует 16 1/3 субъединицы. Всего в частице содержится 2130 субъединиц. Шаг спирали равен 2,3 нм. Длина отрезка равного 3 виткам составляет 6,9 нм, что соответствует расстоянию, через которое располагается идентичная белковая субъединица вдоль по длине частицы. Экспериментально определена молекулярная масса субъединиц, составляющая 17400. Молекула нуклеиновой кислоты располагается внутри спирали между субъединицами. Молекулярная масса РНК составляет 2,06106 и представлена одной 1 7 полинуклеотидной цепью из 6300 нуклеотидных остатков. Каждая молекула белка связана с 3 нуклеотидными остатками. Вирионы других палочковидных вирусов в целом имеют структуру аналогичную ВТМ, отличаясь по некоторым показателям. Например, некоторые штаммы характеризуются строением, когда не все субъединицыю пространственно эквивалентны друг другу. У вируса погремковости табака период идентичности равен 3 оборотам спирали. Шаг спирали составляет 2,5 нм и на каждый виток приходится 25 1/3 субъединицы. Для вируса штриховатой мозаики ячменя период идентичности в структуре вириона равен 5 оборотам, а шаг основной спирали - 2,6 нм. Вирусы нитевидной формы также построены на основе спиралевидной упаковки белковых субъединиц и РНК. Шаг сирали составляет от 3,3 до 3,7 нм. Связи между субъединицами белка у таких вирусов обеспечивают эластичность спирали без нарушений молекулярной структуры. Частицы сферических вирусов, по данным рентгеноструктурного анализа, построены на основе кубической симметрии. Субъединицы сгруппированы и называются капсомерами. Они могут состоять из 5 и 6 субъединиц и называются поэтому соотсветственно пентамерами или гексамерами. Тримеры и димеры встречаются редко. Капсиды сферических вирусов относятся к икосаэдрическому типу симметрии с 12 вершинами, где сходятся углы 5 треугольников с 20-ю гранями и 30-ю ребрами. Например, частица вируса сателлита, диаметр которой всего 17 нм, содержит 60 белковых субъединиц, сгруппированных в 12 пентамеров. Вирионы бромовирусов (25 нм в диаметре) состоят из 180 субъединиц, включенных в 12 пентамеров и 20 гексамеров. Вирионы более крупных вирусов также обладают икосаэдрической симметрией. Так, возбудитель мозаики цветной капусты, размером 45-50 нм в диаметре, содержит 72 капсомера, вирус раневых опухолей клевера (70 нм) имеет по 92 капсомера в наружном и внутреннем слоях. Содержание нуклеиновых кислоты у таких вирусов колеблется в пределах 15-45%. Они могут иметь одно - или двухтяжную РНК или ДНК. Анализ химического состава вирусов показывает, что они содержат углерод, водород, азот, фосфор, кислород, серу и зольные элементы. По этим показателям они принципиально не отличаются от нуклеопротеидов, входящих в состав растений, животных или микроорганизмов, паразитами которых являются (табл. 3). Вместе с тем, данные общего химического анализа свидетельствуют о значительном разнообразии вирусов. 1 8 Таблица 3 Химический состав некоторых вирусов растений (по Bawden) Вирус Углерод Табачной Водород Содержание, % Азот Фосфор Сера Зольные элементы 0,2 2,5 50 7 16,6 0,53 49 7 16,4 0,45 - 2,2 50 - 16,0 0,4 - 3,0 53 6,7 16,2 1,4 0,6 - мозаики Х– картофеля У– картофеля Мозаики люцерны В отличие от клеток живых организмов, они содержат, как указывалось, в своем составе не две формы НК, а лишь одну-либо РНК, либо ДНК. Соответственно у вирусов роль хранителя генетической информации в равной степени могут выполнять РНК и ДНК, тогда как у клеточных организмов первая выполняет функции ее переноса, а вторая - хранения наследственной информации. Вирусные НК выполняют три функции – репликации, транскрипции и трансляции. Репликативные функции обеспечиваются однотяжной (+) цепью РНК, обладающей инфекционностью. После попадания ее в ткани растения с помощью его фермента РНК-полимеразы (репликаза) строится комплементарная + цепи вируса – цепь РНК, которая, в свою очередь, служит матрицей для синтеза новых молекул + цепей РНК вируса. Последняя фактически функционирует как mРНК, участвуя в синтезе вирусных белков при использовании рибосом клеток растения-хозяина. Подавляющее большинство вирусов содержат в своем составе белок, НК и ионы металла, и только небольшая группа, кроме того, липиды и углеводы. Белки вирусов относятся к типу высших белков - глобулинов. Они состоят из аминокислот естественного L – ряда (16 - 18 аминокислот). Д–аминокислот в составе описанных к настоящему времени вирусов не обнаружено. Аномальных аминокислот также не выявлено. Состав аминокислот видоспецифичен. Для белка вируса характерна высокая степень вариабельности. Поэтому даже у штаммов одного вируса выявляются значительные различия (как 1 9 количественные, так и качественные) в аминокислотном составе. Последовательность аминокислот для ряда белковых оболочек растительных вирусов, которые состоят из полипептидных цепей, уже известна. Она определяет вторичную и третичную структуры белка. Число аминокислотных остатков в белковых молекулах колеблется в пределах от 150 до 600 и более. Простые вирусы, типичным представителем которых является ВТМ, содержат в своем составе один тип полипептидных цепей. При общем содержании белка в его частице, равном 38,10 дальтон, в ее состав входит 2320 пептидных цепей с молекулярным весом 18270, содержащих 158 аминокислотных остатков. В построении каждой полипептидной цепи участвуют 16 различных аминокислот. С-концевой аминокислотой в пептидной цепи ВТМ является треонин, а N концевая группа замаскирована и представлена ацетилированным серином. Белковый компонент неповрежденных вирусных частиц устойчив к действию протеолитических ферментов. У сложных вирусов, обладающих несколькими белками, пептидные цепи гетерогенны. Нуклеиновые кислоты вирусов растений, преимущественно рибозного типа, содержат 4 азотистых основания, углеводный компонент и фосфатные группы. РНК и ДНК различаются по составу углеводов и отдельных пиримидиновых оснований. Пуриновые основания (аденин и гуанин) входят в молекулы обоих нуклеиновых кислот. Обе они содержат и цитозин. Кроме того, в состав РНК входит урацил и молекула углевода - рибоза, а в ДНК - тимин и молекула дезоксирибозы. РНК представлена цепью нуклеотидов (нуклеотид = нуклеозид + фосфат, где нуклеозид = основание: аденин, гуанин, цитозин или урацил + углевод). В составе РНК ВТМ обнаружено также железо. Большинство вирусов растений содержат одноцепочечную РНК. Зарегистрированы и вирусы с двухтяжной РНК (вирус раневых опухолей клевера, вирус карликовости риса) и с ДНК (вирус мозаики цветной капусты). Содержание в них нуклеиновых кислот варьирует, например, у изометрических вирусов в пределах 15 - 45%, у палочковидных оно составляет около 5% и у бацилловидных - всего 1%. Молекулярная масса НК в среднем составляет 2.106, но может колебаться от 0,4∙106 у вируса- сателлита до 15,5∙106- у вируса раневых опухолей клевера. РНК ВТМ содержит 7900 нуклеотидов с молекулярной массой около 2 500 000 (Молекулярная масса белка и НК приводится в углеродных единицах=1/12 массы изотопа С12 , равной 1,6610-24 г). 2 0 Целый ряд вирусов представлен однородным геномом и содержит одну молекулу РНК. Вместе с тем зарегистрированы вирусы, имеющие многокомпонентную его структуру, у которых РНК нескольких типов с различной молекулярной массой. Например, для вируса кольцевой пятнистости малины характерно наличие двух типов частиц - с одной молекулой РНК (м.м. 2,4.106) и двумя - (м.м. по 1,4.106). Более того, описаны вирусы с разным содержанием НК, вирионы которых различны и по размерам (вирусы погремковости табака, мозаики люцерны). Так, вирус мозаики люцерны имеет частицы от почти изометрической до бацилловидной или палочковидной с закругленными концами (пулевидной формой). При ширине 19-20 нм их длина составляет 16, 42, 52 и 58 нм. Каждый тип частицы содержит РНК определенной молекулярной массы (от 0,33∙106 до 1,31∙106). Имеются данные, что капсиды ряда вирусов окружены мембраной, содержащей липиды. К этой группе относится вирус желтой карликовости картофеля, вирус бронзовости томатов, а также вирусы с бацилловидной или пулевидной формой частиц, например, вирус разрастания жилок салата и вирус пожелтения жилок осота. Количественный и качественный состав липидов оболочки у разных вирусов неодинаков. Их содержание может достигать 20% общей массы. Для ряда вирусов была доказана клеточная природа некоторых фракций липидов. В связи с этим, очевидно, вариабельность состава и содержания их обусловлена и условиями репродукции вирусов в различных растениях-хозяевах. В структуре всех вирусов присутствуют ионы металлов (К, Na, Ca, Mg, Mn, Cu), часто в значительных количествах. Их содержание может достигать нескольких миллиграммов на грамм вирусной массы. Способность вирусов находится в кристаллическом состоянии, имея 2– и 3–мерную структуру подобно химическим веществам, сохраняющим свои биологические свойства, и отсутствие подобных аналогов среди клеточных организмов вызывает много споров относительно того, можно ли их вообще считать живыми организмами. В качестве аргументов, говорящих за то, что их следует рассматривать как простейшие формы жизни, выдвигаются следующие: 1) поскольку по химическому составу они относятся к нуклеопротеидам, а белок присущ всему живому; 2) вирусы способны к вопроизводству. Причем их репродукция представляет собой процесс развития, состоящий из ряда последовательных превращений. Большинство вирусов не имеет своих ферментов, и решающая роль в репродукции принадлежит ферментам, 2 1 образующимся в зараженной клетке под их воздействием; 3) вирусы подвержены наследственной изменчивости; 4) вместе с тем, структура их белка и нуклеиновой кислоты видоспецифична; 5) вирусы – облигатные паразиты и проявляют свою патогенность, инфекционность, не имея собственной энергетической системы. Вироиды Возбудители этого класса патогенов были открыты в 1967 г. T.Diener и W.Raymer, экспериментально доказавшими, что причиной заболевания картофеля веретеновидностью клубней является низкомолекулярная РНК. Вироиды представляют собой наиболее примитивную форму патогенов, наименьшую из известных по размерам и не способных самостоятельно кодировать синтез специфических белков. Их сравнительно небольшая молекула состоит из односпиральной, ковалентно замкнутой структуры с участками из двуспиральных сегментов. Молекулярная масса их обычно не превышает 150 Кдальтон. Вироидная РНК реплицируется автономно за счет биосинтетических механизмов хозяина. По определению Т.Diener, “вироиды могут рассматриваться как примитивные агенты, которые не достигли ни генетической сложности, чтобы индуцировать в восприимчивых хозяевах новый биосинтетический механизм для собственной репликации, ни способности кодировать специфичный белок оболочки”. Следует отметить, что еще до открытия вироидов, для вирусов была известна способность существовать в виде свободной РНК внутри клетки, которая рассматривалась в качестве сателлитной формы. Более того, считалось, что их белковая оболочка играет защитную роль для НК, предохраняя последнюю от разрушающего действия нуклеаз. К тому же, как показали эксперименты, вироидная РНК, обладает высокой стабильностью к химическим и физическим факторам. Число обнаруживаемых заболеваний на растениях, вызываемых вироидами, постоянно расширяется. Если в 1987 г. их насчитывалось 13, то в настоящее время выявлено около 30 возбудителей этой группы, причем только на плодовых культурах - 8. Вредоносность вироидов достаточно ощутима (табл. 4). Например, на Филиппинах только от заболевания на пальмах “каданг-каданг” потери достигают 16,6 млн долларов в год. Таким образом, вироиды относятся к экономически значимым патогенам растений, которые при интенсификации использования биоресурсов, проявляют тенденцию к распространению. Борьба с ними в основном сводится к 2 2 проведению профилактических и фитосанитарных мероприятий, ограничивающих их вредоносность и продвижение в новые регионы, в первую очередь, путем использования устойчивых сортов и оздоровленного посадочного и посевного материала. Таблица 4 Распространение и вредоносность некоторых вироидов Вироид ВВКК Страна Россия Украина Канада Распростра Потери, нение,% % 8,6-10 70-90 10,2 60-97 8-14 20-90 17-24 55 49-75 ВЭЦ США Кадангкаданг ВКХ ВКХМ Филиппины 9,1-61 Канада, США Япония 50-100 17 ВСОА Израиль, Африка Мексика, Китай 27,3-50 ВКЛ 16 30 Автор, год Леонтьева, 1978 Singh et al, 1971 Bevington, Bacon, 1977 Price, 1958 Dimock, 1947 Yamamoto et al, 1970 Graca et al, 1983, 1985 Orozco, 1983, Tien Po et al, 1987 - ВВКК - вироид веретеновидности клубней картофеля, ВЭЦ - вироид экзокортиса цитрусовых, ВКХ - вироид карликовсти хризантем, ВКХМ - вироид карликовости хмеля, ВСОА - вироид солнечного ожога авокадо, ВКЛ - вироид карликовости лопуха. При изучении морфологических свойств вироидов обнаруживаются 2 формы структур - линейные (37-50 нм) и кольцевые (до 100 нм), обладающие инфекционностью. Линейных молекул в препаратах содержится значительно больше (до 70%). В присутствиии ионов Mg++ кольцевые структуры способны превращаться в линейные. 2 3 В настоящее время у большинства известных вироидов определена нуклеотидная последовательность, в том числе и у отдельных их штаммов. У разных возбудителей число нуклеотидов в молекуле колеблется от 246 до 371. Анализ их состава, наряду с различиями, выявил высокую степень гомологичности (69-83%) в строении некоторых возбудителей, что позволяет дать предварительную оценку систематического положения вироидов. Механизмы репликации вироидов в настоящее время еще окончательно не выяснены. Наиболее вероятным является то, что репликация происходит в ядре клетки с кольцевых вироидных РНК матриц при участии фермента репликазы растения-хозяина. С образующихся минус-цепей комплементарных РНК копируются плюс-цепи, которые после их разрезания и кольцевания формируют молекулы вироидной РНК. Именно последняя, как показано экспериментально, ответственна за возникновение патологического процесса de novo вне связи со специфическими белками. Заболевание у растений при вироидной инфекции может протекать латентно и с проявлением визуальных признаков. Оно сопровождается анатомическими изменениями паренхимных клеток и проводящих тканей, разрушением их клеточных стенок и мембран, что приводит к нарушению ритмичности работы устьиц, фракционного состава воды в листьях, замедлению оттока ассимилянтов. К основным типам симптомов относятся карликовость, деформация и эпинастия, что, вероятно, обусловлено нарушениями метаболизма и баланса ростовых веществ. Так, показано, что при поражениях ВЭЦ в растениях индуцируется синтез ауксиноподобных веществ, снижается уровень содержания в тканях эндогенных гиббереллинов. Одновременно измененяется уровень других гормонов - абсцизовой и индолил-уксусной кислот. Несмотря на то, что визуальный и индикаторный методы остаются на сегодняшний день наиболее распространенными при первичной диагностике вироидных заболеваний, окончательный вывод об их причине и природе возбудителей делается на основе электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), определяющего подвижность инфекционной РНК, и молекулярной гибридизации, чувствительность которой, например, при выявлении возбудителя солнечного ожога авокадо, составляет 0,3-0,5 нг в препарате и 16-27 нг в соке анализируемого растения. По вопросу о происхождении вироидов существует несколько гипотез. Это - результат трансформации их из низкомолекулярных 2 4 ядерных РНК в результате мутации с приобретением инфекционных свойств, продукт деградации вирусов или преобразований их РНК, видоизмененный геном растения-хозяина, и, наконец, следствие инфицирования высших растений прокариотами. В частности, для некоторых из них имеются косвенные подтверждения. Например, известно, что при фракционировании в акриламидном геле препаратов отдельных вирусов выделяются вирусоподобные РНКs сходные с вироидами. Круг растений, поражаемых вироидами, постоянно расширяется. Так, среди восприимчивых к вироиду веретеновидности клубней картофеля, кроме пасленовых, обнаружено более 100 видов, вироид экзокортиса цитрусовых способен инфицировать 14 видов цитрусовых культур, 2 – сложноцветных и 20 видов пасленовых. Их распространение от растения к растению происходит механически с соком, вегетативно при прививках, с помощью повилик, через семена, пыльцу, например вироид солнечного ожога авокадо от 1 до 4% случаев, тлями, в частности вироид карликовости лопуха Myzus persicae. Фитоплазмы В настоящее время выявлено более 100 видов фитоплазм, являющихся возбудителями более 300 различных заболеваний растений. Они имеют широкое распространение практически во всех районах земледелия и отличаются большой вредоносностью. Например, такие заболевания, как столбур пасленовых, стабборн цитрусовых, желтая карликовость риса, желтуха персика и усыхание груши способны вызывать снижение урожая на 50-85% и даже полное вырождение пораженных растений. В значительной степени это связано с аномалиями клеточных структур, и в частности разрушением хлоропластов и снижением активности фотосинтеза. В качестве патогенов растений фитоплазмы были обнаружены в тканях кукурузы японскими исследователями в 1967 г. Ранее фитоплазменные заболевания относились к вирусным инфекциям типа желтух. В пораженных растениях фитоплазмы часто встречаются в смешанных инфекциях с вирусами, вироидами, риккетсиеподобными организмами. Например, в тканях томатов, пораженных столбуром, в клетках флоэмы можно часто наблюдать частицы фитоплазмы и ВТМ. Они имеют общие способы распространения, циркуляции и сходные приемы защиты. Тем не 2 5 менее это - обособленная группа мелких организмов (их минимальный размер около 220 нм), что позволяет использовать для их выделения мембранные фильтры с порами 220 – 850 нм. Они относятся к прокариотам, содержат ДНК и РНК, но обладают незначительной генетической информацией (в 2 раза меньшей, чем у бактерий), лишены настоящей клеточной стенки (они окружены 3-х слойной цитоплазматической мембраной толщиной около 100 нм). Их форма отличается высоким поли – и плеоморфизмом. На ультратонких срезах пораженных тканей можно наблюдать округлые, овальные и нитевидные структуры с диаметром в пределах 300 – 800 нм. В их цитоплазме содержится большое количество рибосом бактериального типа, нити НК. Ядерная мембрана отсутствует. Фитоплазмы обладают способностью к росту и культивированию на бесклеточной среде, образуя на ней специфические округлые колонии (0,5-2 мм) типа“ яичницыглазуньи”(рис.2), что является их диагностическим признаком. Геном, размер которого колеблется в зависимости от таксономической принадлежности от 4-6,8·108 Д до 8-17·108 Д, содержит двухтяжную ДНК и РНК. Развитие возбудителей ингибируется под действием антибиотиков тетрациклинового ряда и в присутствии иммунной сыворотки. В отличие от бактерий они не чувствительны к пенициллину. Им свойствен множественный тип репродукции: почкованием, сегментацией цепочечных форм и нитевидных структур, образованием элементарных телец в материнских частицах и бинарным делением. Цитоплазматическое деление происходит синхронно с репликацией генома. Фитоплазмы не переносятся механически с соком пораженных растений и через семена. Поэтому для доказательства инфекционности, в первую очередь, используется метод прививки на восприимчивые виды здоровых растений или индикаторы, например, наиболее чувствительный для фитоплазм барвинок, который специфично реагирует на заражение изменением окраски и формы цветка и общим хлорозом листьев. В ряде случаев для создания «биологического мостика» между анализируемым образцом и индикатором используются виды повилик Cuscuta sp. Переносчиками фитоплазм в естественных условиях являются различные виды цикадок, светоносок и листоблошек (табл. 5). Косвенным тестом для определения зараженности растений является использование обработок (обычно опрыскивание растений или добавление в искусственную среду при их культивировании) антибиотиков тетрациклинового ряда, после которых происходит 2 6 ингибирование их репродукции. В частности, у обработанных растений наблюдается маскировка признаков заболевания. Таблица 5 Фитоплазмы различных культур и их переносчики Заболевание Желтуха астр Карликовость Rubus Филлодия клевера Пожелтение листьев Phormium sp. Позеленение плодов цитрусовых Переносчик Цикадки – Macrosteles fascifrons Цикадки - Macropsis fuscula Цикадки – Eusceles plebejus Светоноски - Oliarus atkinsoni Листоблошки - Diaphorina citri ОТНОШЕНИЕ К ФИЗИЧЕСКИМ И ХИМИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ Исследования вопросов, связанных с оценкой воздействия различных факторов на инфекционность вирусов (а также вироидов и фитоплазм), имеют большое значение, поскольку сведения о механизмах этих процессов используются при разработке практических мероприятий, направленных на защиту растений от этой группы патогенов и снижение причиняемого ими ущерба. Точка предельного разведения (ТПР) - один из показателей, характеризующих проявление основного свойства вирусов и вироидов - их инфекционности in vitro (т.е. вне растения) при предельном разведении инокулюма. Ее величина зависит от концентрации воздбудителя и вида заражаемого растения, а также условий инокуляции. Обычно для разных возбудителей она находится в пределах 10-9-10-1. Точка термической инактивации (ТТИ) - представляет собой ту температуру, при которой в течение 10 мин еще сохраняется инфекционность возбудителей. Для различных их видов значение ТТИ колеблется от 42 до 105С. Так, точка термической инактивации вируса бронзовости томатов составляет 42 С, вируса табачной мозаики - около 95С, а вируса коровьего гороха – 103С. Наиболее устойчивы к действию повышенных температур вироиды. Например, вироид карликовости хризантем сохраняет инфекционности при кипячении. В зависимости от условий выделения возбудителей (рН 2 7 среды, наличие инактивирующих примесей др.), его концентрации и вида анализируемого растения этот показатель может меняться. Различия в термоустойчивости возбудителей используют в качестве одного из показателей при характеристике их свойств, а также для разделения их смесей в препаратах. Время сохранения инфекционности. Экстракты или вытяжки из пораженных растений выстаивают при комнатной температуре (20), определяя через соответствующие промежутки времени инфекционность. Период ее сохранения равен отрезку времени, в конце которого по результатам анализа она исчезает. Этот показатель у разных возбудителей варьирует и зависит от условий проведения теста и их вида. Так, вирус мозаики яблони может сохранять инфекционность в соке не более 1 часа, тогда как ВТМ до 1 года и более. Механические воздействия. Вирионы различных вирусов способны разрушаться под действием давления. Происходит их коагуляция и высвобождение РНК. Легче подвержены механическим воздействиям вирусы с удлиненной формой частицы. На их структуру и инфекционность оказывает влияние и ультразвуковая вибрация. В результате процессов кавитации палочковидные вирусы разрушаются. Радиация. Рентгеновские лучи вызывают инактивацию вирусов в результате ионизации вирионов. Многие из них утрачивают инфекционность под действием ультрафиолетовых лучей. Инактивация в ряде случаев наблюдается уже при дозах облучения, которые не влияют на основные физические, химические и серологические свойства вирусов. Механизм инактивации возбудитей под действием УФ лучей до конца еще не раскрыт. Повидимому, поглощение энергии приводит к разрушению химических связей. Величина рН. Действие рН среды на стабильность вирусов, которая определяется связями РНК и капсидного белка, зависит от температуры, ее ионного состава и присутствия различных веществ. Так, вирус кольцевой пятнистости табака инактивируется при значениях рН ниже 6,0, а У-вирус картофеля - ниже 4,5. В более широких пределах рН (от 2, до 9,5) сохраняет свою инфекционность ВТМ; разрушение его наблюдается при рН 11, частицы которого диссоциируются на отдельные компоненты. Для вируса бронзовости томата свойствен более узкий диапазон стабильности рН (6,0-9,5). Замораживание-оттаивание. Многие вирусы способны долго сохранять инфекционность при хранении в замороженном 2 8 состоянии. Лабильные же вирусы инактивируются в этих условиях. Степень устойчивости к этому фактору зависит от вида вируса и условий его хранения (в листьях, соке или в форме очищенного препарата). Чередование циклов замораживания и оттаивания приводит к утрате инфекционности практически у всех вирусов. В лиофилизированном же состоянии сохраняются даже лабильные возбудители. Диссоциирующие агенты. Преимущественно воздействуют на водородные связи. К ним относятся, в первую очередь, детергенты, фенол, мочевина, уксусная кислота, щелочи. Некоторые агенты, например фенол, вызывают денатурацию белка. Стабильность вирионов взаоимообусловлена свойствами вируса, типом ионов и их концентрацией. Активно денатурирует вирусные белки мочевина. Ее действие основано на ослаблении водородных связей и гидрофобных взаимодействий в молекулах белков. В концентрированном растворе мочевины ВТМ и ряд других вирусов деградируют и утрачивают инфекционные и серологические свойства. Инактивация Х-вируса картофеля связана с разделением РНК и белка. Органические соединения. Вызывают денатурацию вирусного белка и растворение липидов у сложных вирусов. В их число входят органические кислоты, синтетические полиэлектролиты, полиамины. РНК инактивируется и при воздействии различных алкилирующих агентов (окись этилена, пропилена, диметилсульфат). Высокой активностью, как инактиватор вирусов, обладает формальдегид. Азотная кислота. Вызывает разрушение вирусных частиц вследствие дезаминирования оснований. Окисляющие факторы. Чувствительность вирусов к окислительным системам среды дифференцирована. Наиболее устойчивы такие вирусы, как ВТМ и вирус некроза табака (ВНТ), тогда как вирусы бронзовости томата, мозаики яблони и другие лабильные возбудители легко инактивируются под действием различных продуктов окисления. Таннины. Содержатся в листьях большого числа видов кустарниковых и древесных растений, в частности, из сем. розоцветных, рутовых и др. Действие таннинов связано с инактивацией вирусных частиц за счет образования с ними нерастворимых комплексов. Устойчивость к ним различается в зависимости от вируса и соотношения в среде его частиц и таннинов. Ферменты. В некоторых случаях под действием протеолитических ферментов происходит частичный протеолиз вирионов, который не влияет на их инфекционность. С другой 2 9 стороны, отдельные возбудители, например Х-вирус картофеля, способны разрушаться в присутствии трипсина и пепсина, утрачивая свою инфекционность и серологическую активность. Ферменты, действующие на РНК. РНК ВТМ без белковой оболочки чрезвычайно чувствительна к панкреатической рибонуклеазе. Более того, при высоких концентрациях этого фермента происходит инактивация даже интактного вируса. Вирусная РНК восприимчива и к действию клеточных нуклеаз. Регуляторы роста. Способны вызывать снижение концентрации вирусов в растениях и маскировку симптомов заболевания, например, при использовании β-индолилмасляной кислоты и гибберелловой кислоты. Однако, действие ростовых веществ не однозначно и определяется видом вируса, состоянием растенияхозяина и условий их применения. Так было обнаружено стимулирующее действие кинетина на синтез РНК и белка в листьях различных видов растений. Вместе с тем это соединение ингибировало репродукцию таких возбудителей, как вирус бронзовости томата и вирус некроза табака. Антитела. При смешивании специфической сыворотки с вирусами происходит нейтрализация их инфекционности, в первую очередь, за счет образования преципитирующего комплекса “антиген-антитело”. Этот процесс обратим и при разбавлении суспензии инфекционность может частично восстанавливаться. Взаимодействие антител со структурным белком блокирует освобождение РНК на ранних стадиях инфекционного процесса и препятствует адсорбции вируса на структурных элементах клетки. Вещества из высших растений. Многие виды высших растений содержат вещества, способные ингибировать репродукцию вирусов. Причем уровень снижения инфекционности в основном определяется наследственными свойствами вида, инокулированного определенным возбудителем. Следует отметить, что механизм ингибиторов на различных этапах развития растения-хозяина и при разных сочетаниях в комплексе “вирус-растение” не одинаков. Так, одни и те же соединения могут подавлять инфекционный процесс, образуя с вирусами комплексы, либо нет. Выявлены соединения растительного происхождения, которые вызывают инактивацию вирусов при непосредственном контакте. 3 0 О ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ С РАСТЕНИЯМИ Инфекционный процесс На протяжении своего развития растения постоянно контактируют с различными вирусами, вироидами и фитоплазмами. Однако далеко не всегда происходит их заражение. Для инфицирования растительного организма названные возбудители, которые являются облигатными внутриклеточными паразитами, должны прежде всего проникнуть в клетку. Проникновение в клетку. Клеточные мембраны непроницаемы для многих даже низкомолекулярных соединений. Поэтому при нанесении инокулюма, содержащего, например, вирус даже в высокой концентрации, на неповрежденную поверхность листа восприимчивого растения заражения не произойдет. Фитовирусы, не имея собственной ферментативной системы, не могут преодолеть клеточной стенки. Проникновение вирусов в клетку происходит либо с помощью переносчиков (насекомые, клещи, нематоды, грибы) и повилики, либо через механические повреждения и поранения. При участии в заражении векторов вирус легче и быстрее попадает непосредственно в клетки, в том числе проводящей системы. При механическом же заражении инфекция вначале попадает в клетки эпидермиса, откуда после репродукции и накопления перемещается в мезофилл и другие ткани по эктодесмам - цитоплазматическим тяжам. Установлена корреляция между количеством эктодесм и восприимчивостью растений к вирусам. В частности, было показано, что плотность их на единицу листовой поверхности у устойчивых сортов значительно меньшая, чем у поражаемых. Дальнейшее проникновение вируса в клетку связывается с функциями плазмолеммы, на которой частицы могут случайно адсорбироваться. На участках ее мембран, где имеются неровности, вероятность адсорбции вирусных частиц значительно выше. Репродукция вирусов. Вирусы отличаются по способу размножения от других микроорганизмов. Для них характерен раздельный способ репродукии белка и НК, которые затем собираются в целую частицу. Уже после попадания вируса в клетку происходит процесс депротеинизации НК, т.е. освобождение ее от белковой оболочки на рецепторах, расположенных на мембранах, специфичных для конкретного возбудителя. Показано, что на 3 1 начальном этапе (около 3 часов) этого процесса, продолжительность которого определяется строением белковой оболочки, некоторые факторы среды, например понижение температуры и действие различных ферментов, не оказывают существенного влияния. Репродукция вирусов - последовательный процесс образования дочерних вирусных белков, НК и формирования зрелых вирионов, отсутствующих в незараженной клетке. Синтез вирусных белков и НК в инфицированной клетке взаимосвязаны, но может проходить неодновременно и на разных участках цитоплазмы или ядра. Механизм репродукции у вирусов с однотяжной и двухтяжной РНК и ДНК дифференцирован. В первом случае на матрице самой вирусной РНК (репликативная форма) из рибонуклеозидитрифосфатов синтезируется белок - фермент полимераза, которая осуществляет синтез минус-цепи РНК с комплементарной нуклеотидной последовательностью. Другими словами, происходит образование новых копий вирусной РНК. При репликации вирусов с двуспиральной РНК для образования специфического фермента обязательно присутствие одноцепочечных вирусных m-РНК. У сложных вирусов имеющаяся минус-цепь РНК не обладает способностью выполнять функции РНК-полимеразы. Синтез ее осуществляется с помощью другой РНК-транскриптазы, содержащейся в капсиде таких вирусов. Более того, у многокомпонентных возбудителей фрагменты генома различаются по своим функциям. Например, у вируса мозаики люцерны лишь РНК верхнего (легкого) компонента кодирует синтез белка его оболочки. Вместе с тем для возникновения инфекционного процесса необходимо участие всех 4 фрагментов генома. Матрицей при синтезе белка у РНК-содержащих вирусов могут служить некоторые формы информационных РНК (вирусная РНК, плюс-цепь, комплементарная минус-цепь). Молекулы их, образующие комплексы с рибосомами клетки, несут необходимую генетическую информацию для синтеза полипептидных цепей вирусных белков, которые формируются на специфичных фрагментах РНК. Одна молекула РНК может быть связана с несколькими десятками рибосом - полисомой, обеспечивающей синтез вирусных белков. Их аминокислотный состав не отличается от клеточных белков. В результате синтетических процессов в зараженной клетке образуется и накапливается (до начала образования зрелых вирионов) определенное количество НК и белков, являющихся предшественниками инфекционных частиц. Механизм их 3 2 формирования у вирусов с разной структурой не одинаков. У вирусов со спиральной симметрией, типичным представителем которых является ВТМ, формирование вириона осуществляется посредством спонтанной агрегации путем самосборки. Белковые субъединицы реполимизируются с образованием вирусных частиц. Тип укладки субъединиц определяется строением белка, а размеры частицы - НК, которая также обеспечивает стабилизацию белковой капсиды. У простых сферических вирусов, которые также формируются самосборкой, форму вириона определяет строение самих белковых субъединиц. Предполагается, что образование сложных вирусов определяется специфическим взаимодействием молекул НК со структурными белками. Распространение вирусов по растению, их переход из одной клетки в другую осуществляется по плазмодесмам. Патологическое воздействие на растение Вирусы, вироиды и фитоплазмы вызывают различные патологические изменения у поражаемых растений, которые затрагивают (особенно при системных инфекциях) практически все процессы, регулирующие их рост и развитие. Внешние симптомы заболеваний. Визуально влияние вирусной инфекции на растение проявляется в виде различных признаков местного и системного характера - мозаик, некрозов, кольцевых пятнистостей, задержки или, наоборот, стимуляции ростовых процессов. Симптомы не всегда специфичны. Их проявление варьирует в зависимости от вида возбудителя или растения, действия экологических факторов, сопутствующих инфекций. Реакция на заражение может иметь бессимптомный (латентный) характер. При острой форме заболевания возможен летальный исход. Некоторые проявления вирусной инфекции сходны с признаками, индуцируемыми возбудителями грибной или бактериальной природы, токсинами членистоногих и нематод, а также физиологическими нарушениями. Выделяются следующие типы внешних признаков проявления вирусных заболеваний: нарушения роста и развития растений, изменения формы и размеров различных органов, изменения окраски листьев, цветков, плодов, образование некрозов. Мозаики - относятся к наиболее распространенным и характерным симптомам вирусных заболеваний. В зависимости от 3 3 расположения и формы рисунка, его цветовой гаммы отмечают целый ряд их разновидностей (желтая, белая, жилковая, полосатая мозаики, кольцевая пятнистость, пестролистность, сетчатость, линейный узор и т.д.). Для всех типов мозаик характерно изменение окраски листьев, лепестков цветка или плодов, семян, связанные с нарушениями пигментации. Хлороз. Этот признак, подобно мозаике, также представлен различными типами проявления - от пожелтения, например, только верхних кончиков листьев (верхушечный), или их краев (краевой), тканей между жилками (межжилковый) или всей листовой пластинки (общий хлороз). Некрозы. Можут проявляться как самостоятельный признак, свидетельствующий о поражениях вирусами, либо представлять собой заключительную фазу патологического процесса после появления симптомов мозаики или хлороза. Наблюдается варьирование по приуроченности к различным органам, форме и окраске. Так, некрозы могут иметь черный, бурый, красный или белесый цвет, приобретать округлый, неправильный или угловатый вид, форму штрихов, полос, черточек или концентрических пятен. Увядание. Признаки обнаруживаются, как правило, в случаях поражения сосудистой или корневой систем, а также как результат вторичного действия стрессовых факторов (пониженные или повышенные температуры среды, передозировки минеральных элементов питания, сопутствующие инфекции или вредители). Деформация. Симптомы обусловлены различными физиологобиохимическими нарушениями, наступившими вследствие инфицирования растений. Наиболее типичными являются деформации побегов, листьев, цветков, плодов, проявления морщинистости, курчавости, нитевидности, скручивания листовых пластинок. Своеобразный симптом, деформирующий орган, представляют новообразования на корнях, стеблях и листьях с обратной стороны (энации). Некоторые вирусы вызывают разрастание или увеличение отдельных органов (верхушечной почки, жилок, чашелистиков, листьев). Задержка роста. При ослаблении или полном прекращении роста растений возникают признаки карликовости. Ингибирование роста и развития отдельных органов приводит, например, к мелкоплодности, бессемянности. Израстание. Характерный признак при фитоплазменных инфекциях. Встречается и как результат вирусных поражений. При этом часто наблюдается пролиферация вегетативных и генеративных 3 4 органов. У больного растения образуется большое количество боковых побегов (“ведьмины метлы”). Из одного узла может формироваться несколько стеблей. Части цветка превращаются в листоподобные образования, а их общее число увеличивается (филлодия). Типичными симптомами при фитоплазменных заболеваниях, кроме отмеченного ранее израстания, являются задержка роста и проявление карликовости, вследствие ингибирования ростовых процессов. Распространены различные виды деформаций на листьях (например курчавость), побегах, плодах и цветках. Побеги при поражениях фитоплазмами становятся хрупкими, число их может возрастать, междоузлия укорачиваются. Весьма распространены такие характерные, специфические признаки, как позеленение и пролиферация цветков, а также тотальный хлороз растений. Визуальное проявление признаков при вирусных заболеваниях весьма разнообразно. Оно варьирует в динамике развития инфекционного процесса. Так, обычно вирусы наиболее четко и резко проявляются на молодых, вновь образующихся листьях в период активного роста растений. На возрастно более старых листьях они менее заметны или полностью пропадают. При оптимальных условиях питания и, напротив, при дефиците тех или иных элементов может наблюдаться как прямая, так и обратная корреляция со степенью проявления симптомов, тип и интенсивность которых в большой мере определяются характером метаболизма растения-хозяина и уровнем репродукции вируса. Влияние температуры и освещенности также зависит от вида хозяина и поражающего его возбудителя. Например, на многолетних растениях, в частности, плодовых и ягодных, при повышенных температурах (25-30С) может наблюдаться маскировка внешних признаков заболевания. Именно поэтому в регионах с теплым климатом часто можно даже наблюдать эффект массового временного “выздоровления”. Вместе с тем резкое повышение температуры, как стрессовый фактор, может привести к летальному исходу. Оптимальной для проявления признаков вирусного поражения считается диапазон температур в пределах 16-25С. Уровень освещенности способен также изменять проявление морфологических признаков болезни, усиливая или ослабляя их. Так, ВТМ только в условиях слабой освещенности вызывает на томате специфические признаки папоротниковидности. Типичные признаки заболеваний образуются при освещении оптимальном для жизнедеятельности самого растения-хозяина. Однако при 3 5 искусственном заражении с целью повышения эффективности инфицирования растения на первом этапе предварительно следует даже притенять. Признаки болезни могут видоизменяться и при комплексном поражении. Физиологические изменения. Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами растений, лишены собственной функции обмена веществ. При репродукции они используют ферменты, субстрат и энергию инфицированной клетки, прямо или косвенно влияя на большинство физиологических процессов растения-хозяина (обмен веществ, активность ферментов, дыхание, проницаемость мембран, содержание и реализация функций регуляторов роста, фотосинтез). Например, вирусы, используя белоксинтезирующую систему хозяина, способны изменять процессы формирования клеточных органелл (в частности, рибосом и полисом), участвуя в перераспределении количественных соотношений между ними, а также влияя на их состояние. При вирусной инфекции происходят такие изменения метаболизма у растений, которые обычно наблюдаются при их старении. Воздействия вирусов могут различаться по специфичности и продолжительности в зависимости от вида возбудителя, растения и фазы его развития, а также стадии заболевания. Влияние вирусов на активность дыхания поражаемого растения определяется особенностями их репродукции и защитными свойствами хозяина. Как правило, максимальный уровень репродукции совпадает с повышением интенсивности дыхания. Уже через несколько часов после заражения растений наблюдается его активизация, которая увеличивается при появлении видимых патологических признаков. По мере стабилизации концентрации вирусных частиц происходит снижение уровня дыхания. При ряде хронических, медленнотекущих и латентных инфекциях можно наблюдать даже снижение уровня дыхания по сравнению с нормой. Наибольшая стимуляция дыхания отмечается при развитии местной некротической реакции после инфицирования. Вирусная инфекция приводит и к нарушениям ферментативных систем растения-хозяина. Возбудители способны вызывать повышение активности окислительных ферментов (оксидаза, пероксидаза, полифенолоксидаза), рибонуклеазы, подавление каталазы. Их активность особенно проявлялась непосредственно в обесцвеченных участках. В пораженных тканях значительно повышается и уровень содержания дегидраз. 3 6 При поражениях вирусами меняется гормональный баланс у растений. Такие симптомы вирусных заболеваний, как угнетение роста, карликовость, израстание связаны с изменением содержания ростовых веществ (ауксины, цитокинины, гиббереллины). При мозаике и хлорозе патологические изменения, затрагивающие хлоропласты, приводят к разрушению хлорофилла, содержание которого может снижаться на 5-50%, в хлоротичных участках листовой пластинки даже в 20 раз. В результате падает фотосинтетическая активность. Влиянию вирусов подвержены также синтез и транспорт углеводов. Наблюдаются количественные и качественные изменения в составе углеводов в различных тканях и органах. Отмечаются нарушения азотного обмена, приводящие к разрушению белков хозяина и подавлению их нормального синтеза. С началом репродукции вируса падает содержание небелкового азота. Постоянных различий в содержании отдельных аминокислот не наблюдалось. Наиболее выражено увеличение концентрации аспарагина и глютамина. Возрастает также содержание фосфора нуклеиновых кислот, изменяется концентрация аскорбиновой кислоты, некоторых пигментов и минеральных веществ. При вирусных поражениях наблюдаются и значительные нарушения водного режима. В зависимости от характера инфекции и фазы заболевания скорость транспирации и содержание воды в тканях снижается или повышается. Таким образом, вирусы вызывают первичные нарушения метаболизма, связанные с их репликацией, и вторичные изменения в организме хозяина, сходные с ускоренными процессами его старения. Анатомические и цитологические изменения. К основным типам анатомических изменений можно отнести некротизацию (отмирание) тканей, гиперплазию (разрастание тканей при избыточном делении клеток), гипоплазию (подавление дифференциации и роста клеток). Например, подавление функции дифференциации клеток паренхимы наблюдается при мозаичных заболеваниях в хлоротичных участках. Они приобретают форму, сходную с клетками губчатой паренхимы, и толщина листовой пластинки уменьшается. Такой возбудитель, как вирус курчавости верхушки сахарной свеклы вызывает гиперплазию клеток флоэмы и ксилемы, образование избыточного количества ситовидных трубок. Редукция органов и клеток наблюдается при инфицировании растений вирусом закукливания овса. Целый ряд вирусов способен стимулировать формирование опухолей и различных новообразований (выпуклости, бородавки, выросты, 3 7 энации, галлы). Так, при заражениях вирусом раневых опухолей клевера симптомы проявляются в виде опухолей на стеблях, листьях и корнях, вследствие активизации деления меристематических клеток флоэмы и паренхимы. В результате пролиферации тех же клеток, но при болезни “фиджи” на сахарном тростнике образуются галлы. С избыточным ростом ксилемы связаны признаки деформации побегов какао. Известны возбудители, оказывающие патологическое воздействие на сосудистую систему. Так, при поражении вирусом короткоузлия винограда в сосудах ксилемы появляются барьеры; при инфицировании вирусом желтой карликовости ячменя наблюдается накопление каллозы в ситовидных трубках, отмирание и разрушение клеток флоэмы. Под воздействием вирусов, например вируса погремковости табака, могут происходить изменения митохондрий и их агрегация. При некоторых вирусных заболеваниях наблюдается варьирование числа, формы, размера и структуры ядер. Например, при поражениях махорки вирусом бронзовости томатов в клетках паренхимы число ядер увеличивается в 3-5 раз по сравнению с нормой. Однако наиболее характерным цитопатическим эффектом при инфицировании является образование включений, обнаруживаемых в различных частях растений, гемолимфе и эпителиальных клетках переносчиков в световом или электронном микроскопах (см. рис.3). В настоящее время известно более 100 вирусных заболеваний, при которых образуются различные виды включений. Для каждого вируса характерен определенный их тип (табл. 6). Как правило, встречаются включения в двух формах - кристаллы и аморфные образования (Х-тела). Они подразделяются на 4 условных типа: включения, видимые в световом микроскопе (кристаллические образования, состоящие из упорядоченно расположенных вирусных частиц; аморфные образования, содержащие вирусные частицы и некоторые компоненты клетки, образования, состоящие из видоизмененных клеточных органелл), и структуры, обнаруживаемые только в электронном микроскопе (НК, структурный белок вируса и другие белки). Включения обычно локализуются в цитоплазме, однако их можно обнаружить и в ядрах различных органов (корнях, листьях, стеблях и цветках) и тканях (клетках эпидермиса, мезофилла, паренхимы, флоэмы). Они варьируют по размерам. Например, при заражении Х-вирусом картофеля в растениях табака включения по 3 8 величине не превышают размеры клеточного ядра, тогда как в самом картофеле они занимают около половины всей клетки. Таблица 6 Типы включений при некоторых вирусных заболеваниях Возбудитель Тип включений Вирус мозаики Игловидные кристаллы озимой пшеницы Вирус табачной Гексагональные призмы мозаики Х-тела Локализация Клетки эпидермиса и паренхимы листьев Вирус кольцевой пятнистости табака Вирус гравировки табака Вирус мозаики свеклы Вирус мозаики сахарного тростника Вирус мозаики кукурузы Вирус мозаики гвоздики Вирус пестролепестно сти тюльпана У-вирус картофеля Х-тела Клетки листьев Зернистые Х-тела 8-гранные бипирамидные пластинчатые кристаллы Веретеновидные паракристаллы Амебовидные Х-тела “-”-”-”-” Цитоплазма и ядра клеток эпидермиса Клетки флоэмы Клетки эпидермиса и паренхимы “-”-”-”-” Клетки листьев эпидермиса эпидермиса Гранулярные Х-тела без “-”-”-”-” вакуолей Стекловидные Х-тела Клетки эпидермиса листьев Вакуолярные Х-тела Эпидермис листа и лепестков Округлые Х-тела, Различные ткани цилиндрические и округлые паракристаллы Вирус фиджи Вакуолярные зернистые Клетки флоэмы сахарного Х-тела тростника Вирус карлиКрупные вакуолярные Х- Клетки эпидермиса ковости риса тела листьев 3 9 Продолжение т а б л и ц ы 6 Вирус мозаики лука Гомогенные Х-тела Вирус мозаики Изометрические гороха кристаллы “-”-”-”-” Ядро и цитоплазма эпидермиса Один и тот же вирус даже в одной клетке может формировать включения разных типов. Например, вирус мозаики томатов (томатный штамм ВТМ) образует гексагональные кристаллические пластинки, веретеновидные паракристаллы или плоские структуры, состоящие из палочек, тогда как при поражениях вирусом гравировки табака в цитоплазме наблюдаются зернистые включения, а в ядре тех же клеток - кристаллы. Форма включений зависит и от вида инфицируемого растения. Так, вирус закукливания овса образует в клетках овса игольчатые кристаллы, а в тканях пырея ползучего - веретеновидные. При целом ряде заболеваний встречаются включения в виде аморфных Х-тел. Они могут иметь вакуоли. С помощью электронного микроскопа в их структуре, в частности при поражениях ВТМ обнаруживаются элементы эндоплазматических сетей, рибосомы, вирусные частицы и широкие нити. Размеры и число Х-тел значительно варьирует в зависимости от штамма возбудителя и вида клетки. Особенности распространения и локализации Распространение возбудителей по растению. Наиболее полно механизмы перемещения исследованы у вирусов, они продвигаются в растениях по проводящим тканям и от клетки к клетке в паренхимных тканях по плазмодесмам. При этом их распространение может осуществляться как зрелыми вирионами, так и посредством НК. Еще в 1959 г. было показано, что размеры плазмодесм достаточны для прохождения по ним зрелых вирусных частиц. Однако прямые доказательства удалось получить лишь через 8 лет с помощью электронной микроскопии. В частности, в плазмодесмах клеток паренхимы Beta vulgaris был обнаружен вирус желтухи сахарной свеклы. Впоследствии в плазмодесмах различных растений выявлены и другие вирусы. Скорость распространения их таким путем значительно варьирует в зависимости от типа клеток, размера плазмодесм, вида возбудителя и направления его перемещения. Так, показано, что ВТМ перемещается из верхнего 4 0 эпидермиса в нижний со скоростью 8 мкм/час. В целом на основании данных многих исследований был сделан вывод о том, что расстояние в один слой клеток вирус преодолевает в течение 4-7 ч. Большинство вирусов вызывают системное поражение у восприимчивых растений. Это предполагает достаточно быстрое распространение инфекции по различным тканям и органам. Передвижение вирусов на большие расстояния происходит по проводящей системе- флоэме или ксилемным тканям. Классические эксперименты, результаты которых свидетельствуют о возможности транспорта вирусов по сосудистой системе, проведены Самуэлем еще в начале 40-х г. Так, было показано, что желтый штамм ВТМ после локальной репродукции вблизи точки инокуляции перемещается по средней жилке листа и вызывает системную инфекцию. Тест на инфекционность выявил направление движения ВТМ в растениях томата от верхушечного листа сначала к корням и затем к молодым листьям. Возрастно более старые листья инфицировались позднее. При этом скорость распространения вируса находилась в прямой зависимости от возраста растения. Данные о возможности передвижения вирусов по флоэме были получены при экспериментах по искусственному блокированию ее путем окольцовывания стеблей. В этих случаях отмечалось замедление или полное прекращение перемещения возбудителей. Вместе с тем частицы различных вирусов обнаружены на срезах ситовидных трубок и экссудатах из флоэмы. Скорость передвижения вирусов по флоэме не превышает для ВТМ 1,5 см/ч, тогда как у вируса курчавости верхушки сахарной свеклы она достигает 150 см/ч. Таким образом, распространение по ситовидным элементам флоэмы происходит в сотни раз быстрее, чем от клетки к клетке. Оно осуществляется с током питательных веществ в направлении движения протоплазмы сосудистой системы. Передвижение же по ксилеме было впервые продемонстрировано на примере вируса южной мозаики фасоли после инокуляции растений методом прививки. Отмечено, что возбудитель распространялся как вверх, так и вниз по ксилеме. Наличие различных транспортных форм у вирусов и способность их к передвижению обеспечивает возможность системного поражения растений. Содержание возбудителей в различных тканях. Концентрация различных патогенов в органах и тканях растений и их переносчиков значительно варьирует. Например, известно, что в листьях, почках и цветках вирусы накапливаются в значительно большей 4 1 концентрации, чем в других их частях, а в семенах большинства видов могут отсутствовать вовсе. Она зависит от особенностей репродукции возбудителя в конкретном хозяине. На накопление того или иного вируса, несомненно, оказывают влияние возраст растения, способ его инфицирования и складывающиеся экологические условия для развития. Например, содержание вируса желтой карликовости ячменя составляет от 25 до 100 мкг/л клеточного сока, тогда как ВТМ накапливается в листьях табака до концентрации более 2 г/л. В то же время в растениях томата его количество падает в 5-10 раз. В корнях большинство вирусов содержится в меньшей (по сравнению с другими органами растений) концентрации. Наибольшее накопление вирионов при системной инфекции наблюдается в молодых листьях. Их концентрация представляет переменную величину в зависимости от времени формирования листьев после заражения. Даже на отдельных пластинках листьев или лепестках, различающихся по интенсивности проявления симптомов мозаичных заболеваний, наблюдается значительное варьирование концентрации возбудителей. В целом, например, уровень содержания вируса желтой мозаики турнепса в стеблях, корнях и черешках листьев в 10-20 раз меньший, чем в самих листьях. Вирусы приурочены к определенным тканям. Так, вирус тристецы цитрусовых в основном локализован во флоэмных тканях. Как правило, в наиболее высокой концентрации они содержатся в паренхимных и флоэмных тканях, и в меньшей степени - в ксилеме. В апикальной меристеме возбудители практически отсутствуют. Однако размер свободной от вируса зоны меняется при различных сочетаниях “вирус-растение” и может составлять величины порядка 0,1-1,0 мм. Причины, определяющие отсутствие или низкую концентрацию вирусов в меристематических тканях, до конца не выяснены. Возникновение таких безвирусных участков объясняют разной скоростью роста апексов и распространения вирусов, интенсивностью деления клеток и отсутствием дифференцированной проводящей системы. Это практически исключает возможность попадания инфекции в апикальную меристему, поскольку первые ее фиксируемые элементы расположены в отрыве от основного тяжа проводящей ткани. В качестве факторов, препятствующих проникновению вирусов в меристему, могут выступать и малые размеры ее плазмодесм или низкая скорость движения протоплазмы. 4 2 За зоной апикальной меристемы концентрация вирусов может возрастать в направлении более возрастно-зрелой ткани. Для ряда комбинаций “вирус-хозяин” зона, аналогичная апексу по содержанию вирионов, обнаруживается у кончиков корней зараженных растений. Значительно более низкие концентрации вирусов характерны и для каллюсных культур. Например, ВТМ обнаруживался лишь в 40% тестированных клеток. Таким образом, распределение инфекции по растению не является равномерным. Особенно это характерно для многолетних и, в частности, древесных видов растений. ПУТИ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ Механизм передачи возбудителей векторами Фитопатогенные вирусы, вироиды и фитоплазмы тесно связаны с переносчиками, которые являются основными, а во многих случаях и единственными агентами их расселения в природе. Первое сообщение о способности вирусов распространяться насекомыми появилось еще в 1916 г. В частности, экспериментально было доказано, что тля Aphis gossypii является переносчиком вируса огуречной мозаики. В настоящее время в число векторов входят представители самых разнообразных семейств насекомых (Aphididae, Chrysomelidae, Curculionidae, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera, Lepidoptera, Cicadinea, Miridae, Pieridae, Piesmidae, Thysanoptera, Thripidae), клещей и нематод (Longidoridae, Xiphinema, Trichodorus, Paratylenchus). Кроме того, в переносе инфекции участвуют и некоторые грибы, в частности, из родов Olpidium, Spongospora и Polymyxa. В настоящее время вывлено около 20 вирусов, в распространении которых они участвуют. Так, вирус Хкартофеля переносится Synchytrium endobioticum, вирус мозаики озимой пшеницы - Polymуxa graminis, вирус некроза табака и вирус некроза огурца - Olpidium brassicae. Для некоторых из них характерна четкая специфичность передачи. Например, показано, что одна форма гриба Spongospora subterranean - f.sp.nasturtii - переносит сферический вирус желтой крапчатости кресса водяного, а другая S. s. f.sp. subterranean - передает нитевидный вирус метельчатости верхушки картофеля. Обычно возбудители переносятся векторами из одной таксономической группы. Однако собрано немало фактов, свидетельствующих о том, что некоторые из них, например вирус 4 3 кольцевой пятнистости табака, способны распространяться переносчиками, представителями которых являются виды из разных родов, семейств, отрядов и классов (табл. 7). Эффективность передачи инфекции различными векторами (тлями, алейродидами, цикадками, псиллидами, жуками, щитовками, Таблица 7 Вирусы, фитоплазмы, вироиды и их переносчики Переносчик Возбудитель Отряд/порядок/семейство Вид Y-вирус картофеля Homoptera/Aphididae Myzus persicae, (potato virus Y) Aphis fabae, A. nasturtii Вирус курчавости Homoptera /Aleyrodidae Bemissia tabaci листьев табака (tobacco leaf curl virus) Вирус бронзовости Thysanoptera/Threipidae Thrips tabaci томатов (tomato spotted wilt virus) Вирус мозаики Acariformes /Eriophyidae Aceria tulipae, костра (brome Dorylaimida/ Dorylaimidae Xiphinema coxi, mosaic virus) Вирус некроза Chytrydiales/Olpidiaceae Olpidium табака (tobacco brassicae necrosis virus) Вирус погремковос Dorylaimida/Trychodoridae Trychodorus ти табака (tobacco pachydermus rattle virus) Вирус деформации Homoptera/Pseudococcidae Planococcoides побегов какао njalensis (cacao swollen shoot virus) Фитоплазма Cicadelloidea/Cixidae Hyalesthes столбура «-«-«- /Cicadellidae obsoletus пасленовых Aphrodes bicinctus 4 4 Продолжение т а б л и ц ы 7 Вироид ветереновид Hemiptera/Miridae ности клубней картофеля (potato Coleoptera/Chrysomelidae spingle tuber viroid) Adelphocoris lineolatus Leptinotarsa desemlineata, Epithrix cucumeris а также клещами и нематодами) зависит прежде всего от особенностей их питания, строения ротового аппарата, особенно видов с его колюще-сосущим типом, который прекрасно приспособлен для инокуляции. Их стилеты настолько тонки, что при прокалывании растительной ткани практически не повреждают ее. Активность распространения переносимой инфекции определяется также высоким потенциалом размножения многих векторов, широким набором кормовых растений, большой подвижностью, непрерывным питанием, а также присущей многим переносчикам (тлям, клопам, нематодам, клещам и др.) жизненной схемой: периодическими миграциями и циклическим чередованием растений-хозяев. Наибольшей активностью среди переносчиков в распространении возбудителей заболеваний, вследствие значительного радиуса миграций (табл.8), отличаются тли, наименьшей – нематоды и почвенные грибы. Та б л и ц а 8 Радиус миграции некоторых видов переносчиков Переносчик Тли Цикадки, псиллиды Клещи Нематоды Грибы Радиус миграции, м минимальный 100 50 максимальный 1500 и более 150-200 5 1,5 1,5 20 5-10 3 4 5 В естественных условиях радиус разлета подавляющего числа особей тлей обычно не превышает 100-120 м, в пределах которого и сосредоточивается до 70-90% всех заражаемых ими растений. Отдельные экземпляры переносчиков способны заражать растения и на расстоянии 1 км и более от места первичной инфекции. Поэтому пространственная изоляция новых посадок, питомников от существующих промышленных насаждений, лесных массивов составляет в среднем 1,5 км, но не менее 500 м. Фитопатогенные вирусы в зависимости от характера взаимоотношений с векторами делятся на две группы – персистентные или циркулятивные (сохраняющиеся и способные к репродукции в их теле после попадания через стенку кишечника в гемолимфу) и неперсистентные (не сохраняющиеся в организме переносчиков). К последним, так называемым стилетным, относят возбудителей, которые передаются механически в результате загрязнения стилета адсорбирующимися на нем частицами при питании переносчика. Выделяется также группа полуперсистентных возбудителей, занимающая промежуточное положение, т. е. проявляющих свойства как стилетных, так и циркулятивных вирусов. Они обычно приобретаются переносчиком в течение 10 мин питания на донорном растении. Эффективность их передачи возрастает с увеличением экспозиции. Стилетными вирусами тли инфицируются в течение 10-60 сек. во время пробных проколов больных растений. С увеличением продолжительности питания на здоровом растении вирофорность тлей снижается. Такие возбудители передаются без латентного периода и обычно сохраняются менее часа у питающихся и не более нескольких часов у непитающихся или мигрирующих форм переносчика. Известно, что в слюне тлей содержится ряд ингибиторов вирусов, что определяет избирательную передачу инфекции этими насекомыми. Вероятно, помимо слюны существенную роль играет также сама морфология стилетов. С помощью сканирующего электронного микроскопа выявлены различия в строении вершины стилетов, имеющихся у отдельных видов, форм и даже особей, в частности у тлей, определяющие уровень адсорбции вирусных частиц. Взаимодействие стилетных вирусов с переносчиком не отличается специфичностью и в большинстве случаев один вирус передается несколькими видами. Тли питаются соком из клеток ксилемы и проводящей системы растений. Поэтому важное значение имеет глубина их залегания и 4 6 степень защищенности механическими элементами. Тли прокалывают своим стилетом стенки эпидермиса и направляют его между клетками в сторону периферической части флоэмы. Оболочка ситовидных элементов флоэмы состоит из целлюлозы и пектиновых элементов и даже при значительной толщине остается нелигнифицированной. Найдено, что для приобретения вирофорности тлям M.avenae необходим сравнительно более длительный контакт с флоэмой, чем для инокуляции. Изучение механизма приобретения вируса при взаимодействии тлей, их стилетов с тканями растений, показало, что развитие патологического процесса совпадает с последней фазой внутриклеточного прокола, периодом переваривания содержимого растительной клетки, хотя первичная инокуляция происходит уже при введении в ткани слюнных секретов. Успех инфицирования зависит от продолжительности питания вектора на донорском и акцепторном растениях. С увеличением длительности питания возрастает концентрация вирусных частиц, поступающих в организм тлей. Дольше сохраняется и способность к переносу инфекции. Например, при питании тлей на растениях, зараженных BЖКЯ, максимальная способность к передаче вируса наблюдалась через 12 ч. Развитие инфекционного процесса во многом определяется количеством первичного инокулюма, попавшего в растение при заражении. В серии тестов с тремя клонами R.padi и двумя клонами M.avenae в течение 11 дней изучались временные параметры приобретения и передачи ими вируса желтой карликовости ячменя. Установлено, что, если их питание продолжалось на больном растении более 5 дней, вирофорность и титр вируса снижаются. Однако способность тлей к заражению растений изолятом ВЖКЯ сохранялась до 11 дней. Перенос вируса возможен даже одной вирофорной особью тлей, хотя развитие патологического процесса в этом случае идет более медленно, в частности, инкубационный период увеличивается на 3-5 дней, а признаки заболевания проявляются сравнительно слабее. С увеличением инфекционной нагрузки (в 3-6 раз) практически в корреляционной зависимости возрастала и интенсивность симптомов. Однако скорость распространения инфекции изменялась незначительно. Существенные различия по этим показателям наблюдались, если первоначальная нагрузка составляла 10-30 особей/растение. Дальнейшее увеличение численности вектора до 50-60 тлей/растение не влияло на развитие инфекционного процесса. 4 7 Эпидемиологическое изучение особенностей распространения MAVизолятов ВЖКЯ при участии различных клонов тлей R.padi обнаружило, что изолят MAV-2, например, переносится всеми выявленными в регионе 17 клонами тлей, тогда как MAV-1 оказался неспособным передаваться 8 из них. Однако с увеличением числа вирофорных тлей на растениях (до 8 особей/раст.) после искусственной подсадки различия исчезали, что свидетельствует о роли инфекционной нагрузки. Выявлена прямая корреляция между концентрацией вирусов и уровнем инфицирования растений. Известно, что концентрация возбудителей может варьировать в различных тканях и органах разных видов и даже одного растения. Более того, найдено, что чем выше титр возбудителей в тканях кормового растения, тем интенсивнее питаются на них переносчики. В зависимости от их концентрации изменяется и продолжительность питания. Еще большее значение этот показатель имеет при передаче возбудителей несвойственными векторами. Вместе с тем показано, что содержание вируса в тканях донорного растения не является единственным фактором, который лимитирует его приобретение и последующий перенос переносчиком, а определяется целым рядом показателей (температура, влажность, условия культивирования и др.). В частности, отмечена различная эффективность передачи RMV R.padi и M.avenae при разных температурах. Считается, что при повышении температуры увеличение случаев позитивной передачи инфекции происходит за счет более активного перемещения вируса через клеточные мембраны. Например, при 15ºС и влажности 70-85 % (в период приобретения и распространения вируса) уровень передачи составляет 6-11,5 %, а при повышении температуры до 30ºС – соответственно 15-30,5 %. Причем показано, что влияние температуры на эффективность передачи часто специфично для определенных комбинаций штамм-вектор. Основным фактором, определяющим векторную специфичность, очевидно, является химический состав слюнных выделений, вырабатываемых железами переносчиков. Анализ особенностей распространения возбудителей на примере 5 видов тлей, включая эффективных и неэффективных переносчиков и 2 изолятов ВЖКЯ показал, что эксклюзивный механизм, характерный, например, для MAV, отличается от механизма, существующего в системе RPV M.avenae, способностью к переносу которого обладают лишь отдельные биотипы вида. В частности, при изучении различий в транспорте передаваемого (MAV) и непередаваемого (RPV) 4 8 M.avenae изолятов отмечено, что MAV-вирионы способны адсорбироваться на базальной плазмалемме в везикулах придаточных слюнных желез клеточной цитоплазмы и реализоваться через апикальную плазмалемму в слюнные каналы и протоки. С другой стороны, RPV-вирионы также обнаруживались на базальной пластинке, но оказались неспособными связываться с рецепторами слюнных желез переносчика. У эффективных векторов возбудители обычно быстро проникают в гемолимфу и остаются в ней, циркулируя в полости тела. Иногда же инфекция (при большой концентрации в тканях кормового растения либо при более продолжительном периоде питания на зараженном доноре) сразу попадает в слюнные железы, в результате чего эффективность передачи может возрастать даже у неэффективных переносчиков. Исследованиями ультраструктуры вирофорных особей тлей R.padi, питающихся на растениях ячменя, зараженных BЖКЯ, вирусные частицы были обнаружены в полости кишечника в трубчатых везикулах и рецептосомах цитоплазмы клеток, эпителии задней кишки и в придаточных слюнных железах тлей. Обнаружение вирусных частиц, адсорбированных на апикальной мембране задней кишки и на углублениях в базальной мембране придаточных слюнных желез, указывает на то, что вирусные частицы проникают в эти клетки путем эндоцитоза, опосредованного рецепторами. После инокуляции уже через 2 дня во флоэме овса в цитоплазме клеток, а через 4-5 дней в ядрах и других структурных элементах обнаружены белковые оболочки ВЖКЯ. Вероятно, что экспрессия белка происходит в цитоплазматических рибосомах с вирусной РНК, а в ядрах белковые оболочки появляются на более поздних стадиях инфекционного процесса. Таким образом, очевидно, что транспорт возбудителей обеспечивается комплексом механизмов, где не последнюю роль играют особенности их взаимодействия со слюнными железами переносчиков. Активность распространения инфекции зависит также и от вида вектора, его возрастной стадии, заселяемой культуры, места обитания, поведенческих особенностей векторов, присутствия их естественных врагов, типа взаимоотношений вирус-вектор (табл. 9). Так, эффективность передачи вирусов тлями в полевых условиях может варьировать от десятых долей процента до 50% и более. Именно поэтому возможность образования первичных очагов поражений, а также возникновения эпифитотий в значительной степени зависит от особенностей биологии переносчиков (время их 4 9 миграции, динамика численности, наличие резерваторов инфекции и кормовых растений и т.д.) и характера их взаимоотношений с возбудителями. Установлена положительная корреляции между численностью тлей-переносчиков и активностью распространения вирусов на различных культурах, в частности, в годы, когда на растениях образуются их большие колонии, как правило, увеличивается и степень поражения их трансмиссивными возбудителями. Передаче инфекции от ее первичных очагов способствуют мигрирующие формы переносчиков. Вместе с тем отмечено, что при питании на больном растении вирофорность приобретает лишь определенное число их особей. Например, у мигрирующих тлей, образующихся на больных растениях, ослабленных в результате питания на них большого числа бескрылых стадий и имеющих низкий титр вируса, вообще инфицируется довольно мало особей. При оценке их вирофорности в зависимости от возраста было отмечено, что молодые нимфы быстрее и эффективнее приобретают, например, вирус красных листьев филярии, чем взрослые. У молодых особей и латентный период короче, чем у взрослых. Таблица 9 Эффективность переноса вирусов разными стадиями тлей Переносчик Aphis fabae Rhopalosiphum padi Стадия Вирус Личинки Основательницы Крылатые Ремигранты Личинки Основательницы Крылатые Личинки Основательницы Крылатые У-вирус картофеля ВПЖК* У-вирус картофеля * вирус пожелтения жилок крыжовника. 5 0 Число растений инокулированных/заболевших шт. % 12/10 83 10/7 70 9/4 44 9/5 55 15/6 40 11/6 54 6/1 16 11/6 54 13/7 53 14/1 7 На уровень распространения инфекций значительное влияние оказывает и время миграции векторов. Например, показано, что ранние перелеты (в годы со сравнительно теплыми зимами) тлейпереносчиков приводят к более сильному развитию инфекции. Особенности циркуляции возбудителей Известно, что стабильность любых экосистем в условиях антропогенного стресса в значительной мере обусловлена адаптивным потенциалом и генетической инертностью составляющих ее организмов. С этих позиций роль трансмиссивных инфекций (вирусов, вироидов, фитоплазм и др.) связана с их влиянием на динамику развития, взаимоотношения и реализацию продуктивных возможностей видов растительных сообществ. В последние годы появляется все больше фактов, свидетельствующих о расширении ареалов наиболее вредоносных возбудителей, распространении комплексных и латентных инфекций, появлении новых их форм с измененной патогенностью. Трансмиссивные виды возбудителей болезней растений являются неотъемлемой частью любой экосистемы, которые на разных этапах своего развития находятся в тесном взаимодействии с различными ее компонентами. Скрининг, проведенный на видовом и родовом уровнях, выявил на широком круге растений большое количество их неспецифических представителей из различных таксономических групп. Так, например, на Graminea обнаружены вирусы огуречной мозаики, мозаики люцерны, желтой мозаики фасоли и кольцевой пятнистости малины. Освоение и расширение круга новых хозяев происходит преимущественно с помощью многоядных неспециализированных векторов (полифагов). В частности, найдено, что вирус пестролепестности тюльпанов циркулирует в биоценозе, используя виды Nicotiana tabacum и Padus pensylvanica при участии тлей Myzus persicae, вирус мозаики сои передавался Aphis fabae на Laburnum alpinum и Caragana arborescens. Возросло число патогенов, переносимых нематодами и почвенными грибами. С другой стороны, непрерывность циркуляции инфекции в естественных условиях обеспечивается наличием в ценозах полноценных в трофическом отношении для переносчиков и восприимчивых к распространяемым ими возбудителям видов растений при их постоянном контактировании между собой. Однако возможность заражения в каждом конкретном случае определяется целым рядом дополнительных факторов. 5 1 Существующие в природе равновестные отношения между возбудителем и хозяином, в частности вирусом и растением, как результат совместного эволюционного развития, характеризуются латентной формой инфекции. Нарушения такого состояния происходит время от времени при стрессовых воздействиях факторов среды обитания (климатических, антропогенных и др.). Это приводит к изменениям синхронности функционирования системы “вектор-возбудитель-хозяин” ее стабильности при использовании традиционных растений, интенсивности и направленности циркуляции. Не случайно, что при бесконтрольной интродукции растений возбудители, передающиеся через семена, зачастую завозятся на территории, где они ранее не встречались. К новой среде обитания легче адаптируются виды, для которых свойствен (или генетически предрасположен) широкий спектр поражаемых растений. Они лучше приспособлены к сохранению в природе, особенно если в числе восприимчивых к ним видов обнаруживаются многолетние или однолетние с накладывающимися периодами вегетации растения, а также растения, инфекция у которых передается через семена. Очевидно, что создание искусственных сообществ растений (ботсады, коллекции) с большим набором видов способствует этим процессам. Так, при анализах в коллекциях рода Rosa и Sorbus число обнаруживаемых вирусов и степень поражения ими видов, сортов почти в 6 раз превышает таковые показатели в монокультурах. Трансформируется и проявление внешних признаков. В частности, латентную форму инфекции сохранили в этих условиях около 50% возбудителей. Таким образом, по характеру проявления заболевания можно судить об изменениях в равновесных отношениях в системе “возбудитель – растение”. В этой связи периодически возникающие эпифитотии можно рассматривать как результат нарушенных (под влиянием различных антропогенных факторов, отдельных стрессоров) сбалансированных в ней взаимодействий. При этом наблюдается скачкообразная деградация популяции (возможен даже летальный исход), например, поражаемых растений, вирусов, не сохраняющихся, как известно в большинстве случаев вне живой клетки, либо переносчиков вследствие утраты кормовых хозяев (преимущественно для специализированных видов). В природе подобные случаи, если и возникают, носят единичный, локальный характер, и экосистема быстро восстанавливает равновесные отношения между составляющими ее компонентами, демонстрируя тем самым свою способность к саморегуляции и буферности, а также их 5 2 многоступенчатые механизмы. В значительной степени развитие этого процесса определяется пластичностью и адаптивными свойствами вовлеченных видов. Уже выявлены новые патологические связи для вирусов, переносимых нематодами, в результате освоения ими новых кормовых растений. Показано, что большей адаптивной способностью обладают возбудители, имеющие несколько способов распространения, например, с помощью семян и пыльцы, многоядных переносчиков и семян и т.д. Так, наличие у возбудителей, в частности, из групп NEPO и ILAR, таких свойств практически гарантирует выживание популяций в естественных условиях при стрессовых воздействиях и блокировании отдельных путей циркуляции, повышая их конкурентность. Поэтому они обычно занимают доминирующее положение в ценозах. Наглядная трансформация пищевых потребностей отмечена у колорадского жука за счет расширения круга повреждаемых видов за пределами сем. Solanaceae. При оценках фитосанитарного состояния разных растительных ассоциаций обнаруживается, что важнейшие параметры развития отдельных популяций, в частности патогенность особей, характер их взаимодействия с компонентами составляющих их комплексов динамичны и меняются под влиянием абиотических и антропогенных факторов. Так, выявлена дифференциация по указанному признаку у смешанных трансмиссивных инфекций, паразитирующих на Rosaceae, Gramineae, Lugiminosae, Saxifragaceae и представителях других семейств, произрастающих в условиях искусственных ценозов. Наблюдается увеличение степени варьирования комбинаций при смешанных инфекциях, их аддитивный эффект на поражаемость (или устойчивость) в пределах вида, и в итоге - изменение характера проявления заболеваний, круга восприимчивых и устойчивых к возбудителям и их переносчикам растений. Например, у ряда афидофильных вирусов выявлены неспецифические виды векторов, кормовые связи которых, изменяющиеся в результате адаптационных процессов, мутаций и других механизмов, значительно расширяют круг растений-хозяев, вовлекаемых в патологический комплекс. Так, на нарциссах обнаружено 16 новых вирусов из 10 таксономических групп. Для вируса огуречной мозаики зарегистрирована способность к передаче неспецифическими видами тлей Macrosiphum rosae, Myzus cerasi, для вируса желтой мозаики фасоли - Aphis fabae. То же показано в отношении ВЖКЯ для A. fabae и A.pomi, У-вируса картофеля - для A. pomi и Crуptomyzus ribis. У Sitophilus granarius при стрессовых 5 3 воздействиях на вид отмечено проявление зачатков каннибализма и др. Другими словами, наблюдаемая трансформация биологических возможностей и свойств возбудителей и их переносчиков влияет на характер циркуляции инфекции, приводит к перераспределению популяций, их ареалов и уровня доминирования в ценозах. Более того, известно, что распространяемые возбудители сами играют роль фактора изменчивости. Известно, что переносчики предпочитают питаться на зараженных растениях. Происходящие в больных растениях изменения биохимического состава, в частности по содержанию свободных аминокислот и углеводов, способствуют их развитию. Так, найдено, что M.avenae интенсивнее питается именно на инфицированных изолятом MAV ВЖКЯ растениях овса. Более того, наблюдается даже стимуляция развития переносчиков, питающихся на таких растениях. Например, на пораженных растениях ускоряется развитие нематод-переносчиков, повышается их плодовитость, что стимулирует процесс естественного отбора модификаций, обладающих большей вирофорностью и способностью к передаче смешанных инфекций. Возникновению комплексных поражений, расширению их ареалов способствует именно многоядность векторов, а суммарное действие сочленов комплекса позволяет преодолевать устойчивость растений. При этом в круг поражаемых попадают виды из различных семейств, используемых переносчиками в качестве кормовых растений, что обеспечивает распространяемому ими возбудителю возможность филогенетического расширения их спектра. В результате влияние, оказываемое вирусами, фитоплазмами, на состояние и метаболизм растительных тканей, как пищевого субстрата, способно стимулировать освоение новых кормовых видов переносчиками, изменять их поведенческие реакции. С другой стороны, при неблагоприятном изменении метаболизма, например азотистых соединений, наоборот, индуцируется образование крылатых форм у тлей, которые вынуждены мигрировать с первичного кормового растения в поисках более подходящего субстрата. С их помощью и происходит распространение инфекции. Часто даже кратковременное пребывание векторов на промежуточных хозяевах, особенно инфицированных, способствует адаптации и освоению новых видов растений. Поэтому расширение ареалов происходит преимущественно путем освоения переносчиками новых видов в периоды миграций при поиске подходящего субстрата и пробных уколах. 5 4 Потенциальные возможности векторов выявляются при искусственных подсадках видов на различные растения, в том числе и несвойственные. Например, для 5 видов цикадок (Aphrodes bicinctus, Edwardsiana rosae, Gavesella pellucida, Laodelphax striatella, Macropsis fuscula) круг растений, используемых в качестве кормовых, в 2-3 раза больший, чем в естественных условиях. Наглядной иллюстрацией таких процессов может служить эрозия приуроченности (специализации) вируса шарки сливы (plum pox virus) к представителям рода Prunus Mill. За последние 30 лет возбудитель при участии тлей с широким кругом кормовых растений (сначала известных 3 видов - Myzus persicae, Phorodon humuli и Brachicaudus cardui, затем выявленных еще и Aphis fabae, A.gossуpii, A. spiraecola) освоил целый ряд видов (Nicotiana sp., Chenopodium sp., Pisum sativum, Solanum melongena и др.) и за пределами указанного рода. С помощью ПЦР уже выявлен маркерный 243 фрагмент из белковой оболочки вириона, общий для филогенетически разных изолятов, но с определенной приуроченностью к их распространению отдельными видами тлейпереносчиков. С другой стороны, очевидно, что распространение возбудителей с помощью пыльцы и семян ограничено пределами лишь одного рода. Однако этот путь передачи инфекции находится в меньшей зависимости от действия факторов среды, так как популяции патогенов обладают большей стабильностью (некоторые из них способны сохраняться в семенах до 6 лет) и жизнеспособностью. Вот почему в этой связи при определении возможных путей циркуляции и сохранения возбудителей и переносчиков важнейшее место отводится выявлению их основных и промежуточных хозяев. В круг видов растений, поражаемых какимлибо вирусом, обязательно входят многолетние или двухлетние растения, которые могут рассматриваться как основные хозяева данного возбудителя. Многие переносчики используют многолетние растения в качестве кормовых. Не случайно поэтому возбудитель и его вектор могут находиться на одном и том же виде растения, что способствует распространению инфекции. Из наблюдаемых в природе можно выделить 4 основных схемы циркуляции трансмиссивных инфекций (см. рис.4), первая - это когда вектор и переносимый возбудитель паразитируют на древесных видах растений, вторая – когда они используют только травянистые виды (их многолетние и однолетние формы), и третья травянистые и древесные и, наконец, их сочетание. Комбинации подобных сообществ многообразны. В процесс циркуляции 5 5 вовлекаются ранее несвойственные виды, в том числе и филогенетически отдаленные. В искусственных ценозах, особенно там, где сосредоточены растения из различных географических областей, эти процессы резко ускоряются. В частности, отмечены случаи, когда специализированные виды переносчиков на несвойственных хозяевах распространяли возбудителей с большей эффективностью. При этом очевидно, что обязательным условием стабильного функционирования патологической системы является участие при ее циркуляции многолетних форм растений, взаимосвязь с которыми поддерживается с помощью многоядных видов переносчиков. Более того, изучение их трофических связей показало, что развитие популяций векторов в искусственных ценозах способствует повышению уровня полифагии. Выявленные закономерности позволяют объяснить, почему наибольшей эффективностью, обладают те приемы защиты растений, которые тем или иным способом нарушают непрерывность циркуляции комплекса “возбудитель - вектор“. Так, внедрение в производство растений или их искусственных ассоциаций, устойчивых к его компонентам, химические обработки, использование оздоровленного материала способны ограничивать развитие популяций (например, снижать численность вектора, особенно его мигрирующих стадий, и следовательно, распространение и переносимых возбудителей). Например, переход на культивирование малоотпрысковых и штамбовых сортов малины привело к подавлению популяции цикадки Macropsis fuscula переносчика фитоплазмы rubus stunt, младшие возраста которой развиваются при высокой (почти 100% влажности) на ее поросли. Сходная картина наблюдается и с состоянием комплекса «Phytophtus ribis – возбудитель reversion ribis”. Таким образом, анализ трансмиссивных инфекций, компоненты которых принадлежат таксонам разной эволюционной продвинутости и функционирующие в различных экосистемах, свидетельствует о вариабельности их свойств (биологических, серологических, векторных). Выявлены факты распространения и репродукции несвойственных возбудителей в растениях различного филогенетического спектра, адаптации к ним их векторов, взаимообусловленных отношений между ними, способствующие изменению устойчивости поражаемых растений, что обеспечивается каскадным набором регуляторных механизмов, действующих, как показано, на разных уровнях генетической экспрессии. 5 6 МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ИХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ В комплексе защитных мероприятий по борьбе с вирусными, вироидными и фитоплазменными заболеваниями важное место отводится приемам ранней и объективной диагностики, позволяющим оценить состояние растения, выявить и выбраковать пораженные или отобрать здоровые экземпляры для размножения при производстве посадочного или семенного материала. Своевременное обнаружение патологий позволяет с большей эффективностью проводить противоэпидемиологические мероприятия, предупреждая распространение инфекций и снижая тем самым причиняемый ими ущерб. Основным доказательством того, что выявляемые больные образцы заражены возбудителями этой группы, является заключение об их инфекционности. Это, например, может быть сделано с помощью различного типа прививок, при использовании повилик, переносчиков (насекомых, клещей или нематод), а для механически передающихся патогенов и биологическим титрованием. Существуют и другие методы тестирования: серологические, электронно-микроскопические, гистологические и т.д. Во многих диагностических тестах, используемых при анализах, находят отражение свойства самого возбудителя, реакции растений на инфицирование и особенности взаимодействия возбудителя с переносчиками. Их набор, сочетание и последовательность применения при установлении природы заболевания определяются конкретной ситуацией и поставленными задачами. Конечная цель диагноза - дать заключение о состоянии анализируемого растения и причинах его заболевания. В задачу же идентификации входит определение каким (или какими) из известных возбудителей заражено растение. В обоих случаях при этом могут использоваться одинаковые методы и показатели. Однако их выбор делается на основании предварительного вывода о типе поражения, а также вида анализируемого растения. Именно поэтому особое внимание уделяется визуальным признакам заболевания. Определение поражений по внешним признакам. Вирусы, вироиды и фитоплазмы вызывают нарушения нормального роста и развития растений. Визуально их патологическое действие проявляется, как известно, в виде различных симптомов местного или системного характера - мозаик, некрозов, кольцевых пятнистостей, хлорозов, задержки или, наоборот, усиления ростовых 5 7 процессов. При внешнем осмотре и выявляются растения, имеющие те или иные признаки и отклонения от нормы. При вирусных инфекциях наиболее распространены различные типы мозаик (обыкновенная, междужилковая, сетчатая, желтая, мраморная, полосатая и кольцевая), хлороза (общий, междужилковый, краевой и верхушечный), некрозов (местный, системный, внутренний и верхушечный) и деформаций. При фитоплазмозах более выражены и характерны для этой группы инфекций признаки реверсии, позеленения и пролиферации цветков, израстания и общей карликовости, развивающейся вследствие подавления ростовых процессов. Распространены различные виды деформаций на листьях, побегах, цветках и плодах. Часто наблюдается их измельчение. Побеги становятся хрупкими, число их может возрастать, междоузлия укорачиваются. Развивается общий хлороз растений. Естественно, так же как и в случаях других инфекционных заболеваний, симптомы встречаются в различных сочетаниях, изменяются в динамике, в зависимости от экологических факторов, вида и сорта поражаемого растения. Для растений, инфицированных вироидами, характерно проявление симптомов карликовости (у хризантем и лопуха), веретеновидности клубней (у картофеля) и деформации побегов (при экзокортисе цитрусовых). Проявление визуальных признаков варьирует в зависимости от вида возбудителя, сорта растения, климатических условий, под влиянием сопутствующих инфекций (при комплексном поражении) и других факторов. Внешний осмотр растений с целью повышения надежности и достоверности заключения об их состоянии проводят в течение вегетации дважды. Первое обследование делают весной - в начале лета, когда лучше заметны признаки заболеваний на листьях (различные мозаики, деформации, некрозы), на побегах (израстание, прекращение роста), цветках (изменение окраски и реверсия). Повторный анализ проводится по признакам, проявляющимся на плодах, ягодах, клубнях, корнеплодах и других органах в период их созревания. В эти же сроки выявляются болезни, при которых наблюдается вторичный рост, преждевременное сбрасывание листьев и усыхание. Симптомы не всегда специфичны. Некоторые из них, такие, как посветление жилок, крапчатость, деформация листьев, хлороз, напоминают проявления, возникающие при других заболеваниях и повреждениях, в том числе и неинфекционных. Так, развитие хлороза и сетчатости листьев отмечаются и при функциональных 5 8 нарушениях, в частности, при недостатке некоторых микроэлементов в почве, на которой выращивается культура. Однако ряд заболеваний имеет характерные признаки, например, образование пигментных колец на косточках плодов сливы и абрикоса при оспе (шарке) слив. К недостаткам метода следует отнести то, что с его помощью не удается выявить скрытые (латентные) формы инфекции. Тем не менее визуальный анализ дает основание для предварительного диагноза и выводов о природе заболевания. В сомнительных случаях, а также при выявлении скрытых инфекций он дополняется другими методами - индикаторным, серологическим и т.д. Таким образом, выбор методов диагноза, различающихся, как известно, по степени чувствительности и точности, определяется типом поражений и условиями проведения анализа. Индикаторный диагноз. Как отмечалось, основным доказательством поражения растений вирусами, фитоплазмами или вироидами следует считать выявление их инфекционности. Это можно сделать несколькими способами, например, с помощью различного рода прививок на донорские растения, при использовании повилики, переносчиков (насекомых, клещей или нематод), а для механически передающихся возбудителей также биологическим титрованием. Во всех указанных случаях перенос инфекции от анализируемого растения осуществляется на индикаторные растения - их восприимчивые виды и сорта. Передача прививкой. Метод может применяться для всех известных возбудителей (вирусы, фитоплазмы и вироиды). Однако подбор индикаторных растений для каждого из них различен. На подвои, в качестве которых используют восприимчивые к конкретным возбудителям формы растений, прививают части органов (черешки листьев, почки, побеги, кусочки тканей и др.) с анализируемых образцов. По признакам, развивающимся на индикаторах (или их отсутствию) делают заключение о состоянии растений. В зависимости от вида растения, его возраста и размера, сроков анализа применяют различные способы прививок. К наиболее распространенным способам прививки относятся окулировка почкой, копулировка (зеленым или одревесневшим черенком, верхушкой побега, черешком листа, кусочком коры) и сближение (аблактировка) стеблей. Выбор их зависит от сроков проведения диагноза, состояния и вида привоя и подвоя. Окулировка применяется в период после окончания роста побегов, в конце июля-начале августа. В сроки, когда кора плохо отслаивается, но ростовые процессы продолжаются, хорошие 5 9 результаты дает прививка щитком. Прививка кусочком коры наиболее простой метод, который можно использовать в течение всей вегетации. Поэтому он особенно ценен при диагностических работах в условиях закрытого грунта. Широко распространен способ прививки врасщеп (копулировка зеленым или одревесневшим черенком), применяемый в период активного роста растений. Прививку черешком листа можно проводить в любое время вегетации до опадения листьев. От способа и срока индикаторных прививок зависит длительность инкубационного периода, а следовательно, и оперативность диагностики. Резко сокращаются сроки анализа, если прививки делаются в начале вегетации. Известен ряд специальных приемов, провоцирующих и ускоряющих проявление признаков на индикаторах, например, обрезка побегов у акцепторного растения (на 2-3 почки выше прививки), использование черенков (или почек), хранившихся не менее двух месяцев при температуре 4-5о С, т.е. прошедших стадию физиологического покоя. С помощью индикаторов значительно ускоряется (до 8 месяцев вместо 3 лет) диагноз заболеваний, признаки которых проявляются на плодах. В частности, для этого используют черенки с плодовыми почками. По реакции на индикаторах дается заключение о состоянии проверяемых образцов. К разновидности данного метода можно отнести использование повилик - паразитических растений в качестве “биологических мостиков” между индикатором и проверяемым растением. С помощью этого метода можно выявлять скрытые формы инфекции в анализируемых растениях, в том числе поражения фитоплазмами, которые не передаются механическим путем. Биологическое титрование. В основе теста лежит способность некоторых вирусов и вироидов передаваться от растения к растению механически с соком. Анализ, продолжительность которого составляет от 3 до 15 дней, лучше всего проводить весной в начале вегетации. Для этого с растений берут одну весовую часть тканей (молодые листья, почки без кроющих чешуй, лепестки, соскобы камбия с побегов и др.) и гомогенезируют с раствором, содержащим стабилизирующие соединения. Их выбор, состав и концентрация зависят от конкретного возбудителя. Полученным инокулюмом с помощью кусочка поролона, марлевым тампоном, шпателем или щеткой натирают листья травянистых индикаторов, специфично реагирующих на инфицирование, предварительно опыленных 6 0 порошком карборунда. В качестве индикаторов используются травянистые растения, чувствительные к определенным возбудителям. Метод позволяет выявлять скрытые инфекции, но только механически передающихся патогенов. Его целесообразно применять до начала вегетации, используя оранжереи. Продолжительность анализа около 2-3 недель (см. рис. 5). Реакция на травянистых индикаторах, рекомендуемых для диагностики, не всегда является специфичной. Сходные симптомы способны вызывать на одном и том же индикаторе разные возбудители. Поэтому при идентификации выявленных инфекций вводят дополнительные индикаторы, обладающие характерной реакцией на заражение, и привлекают другие тесты, в том числе серологические. Серологическая диагностика. Иммунологические методы определения зараженности организмов начали использоваться значительно раньше в медицине, чем в растениеводстве на растениях, инфицированных вирусами, хотя их способность индуцировать в теле животных образование антител обнаружено Двораком еще в 1927 г. Таким образом, было показано, что многие возбудители и даже отдельные химические элементы структуры их частиц (обычно белковые фракции) являются активными антигенами. В 1937 г. М.Дунин, Т.Федотова и Н.Попова предложили для определения вирусов в растениях в качестве тест-анализа использовать реакцию агглютинации в капле клеточного сока после смешивания ее со специфической сывороткой (капельный метод), в основе которого лежит способность образовывать комплекс “антиген - антитело”. В результате методика, вследствие своей простоты, достаточной точности и быстроты проведения анализов, нашла широкое применение в фитопатологии, селекции и семеноводстве различных культур при решении разнообразных задач, например, при ранней диагностике поражений, в том числе и скрытой инфекции, дифференциации возбудителей, вызывающих сходные симптомы, по различиям в их антигенных свойствах, определения их концентрации и локализации в тканях и т. д. Однако использование “капельного” метода выявило целый ряд его недостатков: проявление спонтанных реакций агглютинации (даже в случаях отсутствия инфицирования), недостаточная чувствительность и специфичность (в частности, при анализах возбудителей, имеющих антигенное сродство, либо, наоборот, обладающих серологически разными белками в оболочке, например, 6 1 у вирусов желтой карликовости картофеля и пожелтения салаталатука, или даже разными частицами, как у вируса некроза табака,). В дальнейшем были разработаны более совершенные методы. Наибольшей надежностью и чувствительностью среди них отличаются иммунодиффузия в агаровом геле, агглютинация с латексом, иммуноферментный анализ и различные их модификации (см. рис. 6). В настоящее время, благодаря простоте выполнения анализов, возможностям их автоматизации и массовых определений иммуноферментный метод (ИФА или ELISA) стал одним из самых распространенных в научных исследованиях и диагностике. Чувствительность достигает 1 нг (нанограмм) определяемого количества. По способу выполнения анализа различают гомогенный и твердофазный варианты ИФА. Весь процесс условно можно разделить на 3 последовательные стадии. На первой - при иммунохимической реакции формируется комплекс АГ - АТ, адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с ним АТ (антитело) взаимодействуют с АГ (антиген) или каким-либо другим анализируемым белком. Несвязавшиеся компоненты отмывают. На втором этапе в комплекс вводят метку – АГ (антитела), конъюгированные с ферментом и специфичные к анализируемым белкам возбудителя. Третья стадия – выявление метки с помощью индикаторной ферментной реакции. Существует несколько схем проведения анализа. При твердофазном методе антитела (обычно фракция иммуноглобулинов из специфической сыворотки) или антигены адсорбируют в течение 18-20 ч при 4ºС на поверхности ячеек полистироловых микроплат (“твердая фаза”). Связывание происходит в результате ”пассивной адсорбции” за счет гидрофобного взаимодействия и зависит от концентрации белка в растворе и ионной силы буфера, температуры среды и времени реакции. Незафиксировавшиеся компоненты реакции удаляются многократным (обычно 3-разовым) отмыванием буферным раствором с добавлением детергента, например, тритона Х-100. Затем в лунки в зависимости от выбранного способа ИФА вносят анализируемые образцы. При “непрямом” методе - вирусные препараты, вытяжки, экстракты из растений (почек, листьев, лепестков, камбия и др.) и при “сэндвич”-методе (обычно применяется для анализа поливалентных антигенов), при котором на поверхность лунок адсорбируют при 37º 1 ч антигены, - 6 2 специфические антитела (р-р иммуноглобулинов с концентрацией 35 мкг/мл). Далее в соответствии со схемой анализа снова отмывают ячейки плашек от веществ, не вступивших в реакцию. После этого в ячейки вносят по 0,2 мл конъюгата иммуноглобулина с ферментом (пероксидаза, галактозидаза или щелочная фосфотаза и др.) и инкубируют при 37ºС 1 ч (при непрямом способе – меченные ферменты). Платы отмывают буфером с Тритоном и добавляют в лунки для прекращения реакции и окрашивания продуктов реакции смесь 0,0015% Н2О2 (перекись водорода) и 0,08% 5аминосалициловой кислоты (при использовании пероксидазы) или пара-нитрофенилфосфат (если берется щелочная фосфатаза). Через 30 мин на абсорциометре определяют (обычно при длине световой волны 405 – 490 нм) оптическую плотность продуктов окисления (концентрацию возбудителя в пробе) с учетом фоновой плотности контрольных образцов. В ряде случаев по чувствительности “непрямой” метод превосходит “сэндвич” - вариант в 2-6 раз. Кроме того, с его помощью удается одновременно диагностировать более широкий спектр штаммов вирусов, используя одну штаммоспецифическую сыворотку. Более того, наличие родственных антигенов у разных возбудителей позволяет использовать сыворотки, приготовленные к одному из них, для выявления зараженности другими вируами. Однако идентификация по серологическим свойствам в этих случаях, при которой, в первую очередь, учитываются индивидуальные особенности возбудителей, затрудняется. Анализу растений на зараженность вирусами “непрямым” методом иногда препятствует иммобилизация их антигенов на твердом носителе под воздействием компонентов клеточного сока, приводящая к неспецифическим реакциям. В свою очередь, “сэндвич”-вариант отличается большей специфичностью, хотя и не позволяет определять серологически неидентифицированные штаммы вирусов при использовании одной штаммоспецифической сыворотки. В настоящее время разработаны и предложены модификации методов, в частности “непрямого”, для ингибирования влияния компонентов сока на протекающие реакции. Это достигается использованием твердых носителей (полистироловых плат), уже предварительно сенсибилизированных фрагментами кроличьих АТ или протеина А золотистого стафилококка с интактными иммуноглобулинами, полученных путем специальной обработки, например пепсином, и содержащим активные группы в молекуле, ориентированные наружу и способные специфически связываться с вирусом. Нормальные клеточные 6 3 компоненты в этом случае не сорбируются и легко удаляются из ячеек при их отмывании. Для специальных исследований, например, при определении фракционного состава вирусных белков, при изучении комплексных инфекций, иммунологические процедуры сочетаются с различными физико-химическими методами – электрофорезом, электронной микроскопией и центрифугированием. Так, широко распространенный метод “вестерн-блот” позволяет с высокой разрешающей способностью, чувствительностью и специфичностью анализировать персистирующие в растениях вирусы. Метод включает три этапа. На первом – проводится электрофоретическое разделение вирусных белков в полиакриамидном геле в присутствии детергента - додецилсульфата натрия. Под действием электрополя белковые молекулы движутся к катоду со скоростью обратно пропорциональной их молекулярной массе. В результате исходный образец (растительные экстракты или вирусный препарат) разделяется на фракции с одинаковыми молекулами, молекулярную массу которых определяют с помощью стандартных маркеров (стабильные белки с известной молекулярной массой от 12 до 200 кД), разгоняемых в том же гелеевом блоке и тех же условиях. Вторая стадия – электрофоретический перенос (электроблотинг) разделенных белков из геля на твердую нитроцеллюлозную подложку и на третьей – полученную реплику (блот) подвергают иммуноферментному анализу. Следует иметь в виду, что в присутствии ДДС-Na часть белков может изменять и даже утрачивать свои антигенные свойства, которые частично денатурируют в ходе переноса их из геля на нитроцеллюлозу в присутствии метанола и после обработок блота неионными детергентами. В основе иммуносорбентной электронной микроскопии лежит способность вирусных частиц специфически сорбироваться из капли анализируемого клеточного сока или вирусосодержащих растворов на покрытые антителами сетки-подложки. С помощью этого метода удается обнаруживать в 100-1000 раз большее количество вирусных частиц. Традиционные серологические методы оказались малопригодны в случаях с вироидной инфекцией, поскольку последние представлены низкомолекулярной одноцепочечной РНК, не обладающей достаточной собственной иммуногенностью. Поэтому для получения точной информации об их видовой принадлежности привлекают 6 4 иные диагностические показатели: характер проявления на индикаторах, физико-химические свойства и др. При анализах фитоплазменных инфекций, наряду с указанными методами, используют реакцию ингибирования их роста в условиях культивирования на искусственных средах с помощью специфических сывороток. В частности, после наложения бумажных дисков, пропитанных антисывороткой, на твердую питательную среду, на которую высеваются тестируемые виды, наблюдается подавление развития родственных организмов. В организме животных антитела (после введения антигена) вырабатываются в основном лимфацитами и плазматическими клетками лимфатических узлов, селезенки и костного мозга. Они представляют собой сывороточные белки глобулиновой фракции. Их можно обнаружить во всех циркулирующих жидкостях тела животного. Свойством связываться с антигеном, вызвавшим их образование, обладают сравнительно небольшие молекулы иммуноглобулинов с трехмерной структурой (коэффициент седиментации 6,6S и мол. вес – 1,5·105). Приготовление сывороток. При получении сывороток используют препараты достаточно высокой степени чистоты и однородности, свободные от различных антигенно-активных примесей. Для иммунизации (введение антигена) можно брать любых здоровых животных (позвоночных) лошадей, баранов, крыс, мышей и т.д. Однако чаще в этих целях используются кролики, которые при однократном отборе крови могут дать от 20 до 40 мл сыворотки. Ее титр зависит от дозы вводимого антигена (она обычно колеблется в пределах 500-1000 мкг), его чистоты, способа иммунизации (внутривенное, внутримышечное, подкожное или их сочетания), числа инъекций, срока взятия крови, применения веществ, стимулирующих образование антител (адьювантов). Внутривенно препараты вводятся без адьювантов. Иммунизация, как правило, проводится дробно в течение 2-4 нед. возрастающими дозами антигена. Интервал между инъекциями, в зависимости от первичной дозы, составляет 3-7 дней. Часто применяют комбинированные схемы иммунизации, особенно в случаях, когда антигенные свойства возбудителя недостаточно изучены. Например, для ряда вирусов практикуются дробные способы иммунизации: чередование подкожных и внутрикожных инъекций малыми дозами антигена. Через 10 – 14 дней после последней иньекции проводят отбор крови (при использовании кроликов - из ушной вены). Для увеличения титра антител иногда через 40 - 150 дней проводят реиммунизацию 6 5 животных тем же антигеном. Однако в этом случае возможно снижение специфичности образующихся антител. В диагностических сыворотках независимо от способа их приготовления обычно содержится смесь антител, различающихся по специфичности (и чувствительности). Вследствие этого, для повышения объективности анализов используют моноклональные антитела, которые готовят путем инкубирования сыворотки с бесконечно размножающимися опухолевыми (миеломными) клетками мышей в смеси с их В-лимфацитами. В результате чего формируется новая популяция плазматических клеток (гибридом), которые приобретают способность сами самостоятельно продуцировать специфические антитела. После отделения последние используются при производстве диагностикумов. Исследование серологических взаимоотношений между различными видами (штаммами) является одним из объективных критериев определения таксономической принадлежности фитоплазм. Для получения антисыворотки используют бульонную культуру возбудителей в логарифмической фазе роста. При анализах, наряду с универсальными (латекс-тест, связывание комплемента, иммунноферментный анализ и др.) применяется метод, основанный на реакции ингибирования роста. Причем наибольшее практическое распространение получила методика наложения бумажных дисков, пропитанных иммунной сывороткой, на твердую питательную среду непосредственно после высева на нее тестируемых объектов. Микроорганизмы (вид, штамм), рост которых прекращался в местах соприкосновения с дисками, тестировались с учетом специфичности антисыворотки, использованной для их пропитки. В последнее время для диагностики (и идентификации) вирусов рекомендуется использовать в качестве антигенов их рекомбинантные белки, что значительно удешевляет технологию получения антисывороток и исключает трудоемкие операции по выделению вирусных препаратов и очистке их от различных примесей (белки растений, близкородственные вирусы). Процесс приготовления сывороток включает 3 этапа: клонирование генов, кодирующих структуру белковых оболочек и их экспрессия в E. сoli; очистку получаемых рекомбинантных белков на хромотографических колонках с Ni-нитрилотриацетатной агарозой (Ni-NTA) и приготовление к ним сыворотки. Гистологический анализ. При некоторых инфекциях в клетках пораженного растения, различных тканях переносчика (слюнных железах, жировом теле, эпителии кишечника и др.) образуются 6 6 включения. Их легко обнаружить в световом микроскопе после специальной обработки или окрашивания. Включения могут иметь форму паракристаллов (вирус закукливания овса, вирус мозаики турнепса), нитевидных (вирус желтухи свеклы), игловидных (ВТМ) или аморфных (вирус Х-картофеля) образований. Они не всегда специфичны, в частности, при поражениях ВТМ наблюдается формирование игловидных и гексагональных паракристаллов наряду с аморфными включениями. Характерное образование в тканях больных растений включений различного типа, в том числе видимых в световом микроскопе, часто используется в диагностических целях. Так, обнаружение в пульпе, мацерированной мякоти плодов томата игловидных паракристаллов свидетельствует о зараженности образцов ВТМ. При анализах для выявления включений готовят препараты (временные или постоянные) из тканей растений (нижнего или верхнего эпидермиса листьев, тонких срезов разных органов, наружных листовых или стеблевых волосков и.т.д.), которые окрашивают, например, кислым фуксином, для контрастирования и лучшего наблюдения. При экспресс-диагностике поражений вирусом мозаики озимой пшеницы применяют 0,1 н раствор HCl, под действием которого в клетках высечек из листьев, помещенных в каплю реактива, выпадают игловидные кристаллы. При диагностике фитоплазм, для изучения их морфологических признаков также достаточно широко применяются различные методы световой микроскопии: просмотр препаратов в темном поле из жидкой среды, анализ микротомных срезов зараженных тканей, в частности флоэмных, на основе флюоресценции ДНК при ее окрашивании специфическим красителем 4,6-диамидино-2фенилиндолом (см. рис. 3). Электронная микроскопия. C помощью электронного микроскопа (просвечивающего или сканирующего) возможно изучение морфологии возбудителей болезней, определение их размеров и внутреннего строения, особенностей взаимодействия с клеткой, этапов репродукции. Способы приготовления препаратов для этих целей различаются в зависимости от вида возбудителя и растенияхозяина. В частности, применяются разные приемы стабилизации частиц, препятствующие процессам агрегации или деградации, и их контрастирования солями тяжелых металлов (золото, платина, уран) путем напыления в вакууме или специальной химической обработки, при которой используются такие соединения, как фосфорновольфрамовая кислота (1-2%), уранилацетат (1%), молибдат аммония 6 7 (2%), вольфрамат натрия и др. При негативном контрастировании объект обрабатывается веществами с высокой электронной плотностью, которые очерчивают его контуры, а в некоторых случаях и внутренние структуры (белковые субъединицы, центральный канал, например, у палочковидных, нитевидных и бацилловидных вирусов). В качестве объектодержателя (подложки) применяется специальная медная сеточка, на которую наносится коллодиевая, формваровая или угольная пленка. Последняя обладает наибольшей прочностью под электронным пучком. Препараты контрастируют, например, напылением металлов (платина, золото). Метод сравнительно дорог. После разработки упрощенных методов приготовления вирусных препаратов, в частности метода погружения и использовании эксудативных выделений, появилась возможность получать экспресс-информацию о наличии возбудителя в тканях анализируемого растения с помощью электронной микроскопии. Этим методом легко удается диагностировать заболевания, вызываемые вирусами с нитевидной, палочковидной и бацилловидной формой частиц. При анализах сферических вирионов иногда возможны некоторые трудности из-за примесей неспецифических структур, близких по размерам и оптическим свойствам вирусным частицам, например различных клеточных фрагментов, при использовании недостаточно очищенных растительных препаратов. Более того, поскольку размеры частиц у разных вирусов со сферической формой достаточно близки, данные электронномикроскопического анализа при идентификации возбудителей выступают как дополнительные показатели. Из-за присутствия примесей неспецифических структур анализ поражений возбудителями со сферической формой частиц проводят, как правило, после предварительной очистки препаратов. Операции по выделению и очистке, в частности с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сульфата цезия, электрофореза в ПААГ или хроматографии, являются обязательными при подготовке и просмотре вироидных препаратов. При оценке же зараженности образцов, когда не имеет значение определение вида возбудителя, диагноз с привлечением этого метода может проводиться. Оптимальный срок отбора образцов для анализа - листьев и побегов - приходится на начало вегетации и плодов - на период их созревания. От собранных частей растений (листьев, черешков, побегов и др.) получают срезы (2-3 шт.), которые для контрастирования помещают 6 8 в каплю 2% фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0). Затем оттянутой пипеткой переносят небольшое количество вытяжки на подложки-сетки с пленкой, подсушивают, удаляя избыток суспензии фильтровальной бумажкой, и просматривают под микроскопом. Электронная микроскопия относится к наиболее достоверным методам идентификации фитоплазм. При анализах ультратонких срезов пораженных тканей определяют и особенности их локализации. Для получения срезов с растений, имеющих специфические признаки заболеваний типа карликовости, реверсии цветков и хлороза листьев, выбирают участки тканей, где концентрация возбудителей наибольшая (жилки листьев, цветоножки, флоэма стеблей). Кусочки тканей (около 1 мм) фиксируют в 5% растворе глютаральдегида (по Миллонигу), промывают в буфере (рН 7,2) и обрабатывают 2% четырехокисью осмия в течение 2-3 ч. После повторной промывки тканей и их обезвоживания (путем проводки через спирт, ацетон и их смесь) объект пропитывают и заливают специальными смолами (эпоны или аралдиты) и после полимеризации в желатиновых капсулах используют для приготовления срезов на ультрамикротоме, например, фирмы LKB. Полученные срезы контрастируют (цитрат свинца и др.), помещают на сеточки (с большими ячейками), покрытые формваровой пленкой и просматривают под электронным микроскопом. Широкое применение, особенно при изучении морфологии спироплазм, получил Transfer - метод, основанный на технике переноса микроорганизмов из жидкой культуры на агар и затем после инкубации на препаративную сетку для просмотра в электронном микроскопе. Для большей эффективности выявления антигенно-активных структур, а также дифференциации морфологически сходных возбудителей, иногда применяется дополнительная обработка (“активация”) специфической антисывороткой подложек перед их погружением в анализируемую суспензию. В последнее время для исследования морфологии возбудителей используется сканирующий электронный микроскоп, разрешающая способность которого составляет около 50 нм. С его помощью частицы образца просматриваются объемно под разными углами зрения. Физико-химические тесты. При идентификации возбудителей сведения об их свойствах, на основании которых проводится определение видовой принадлежности, получают при изучении 6 9 очищенных препаратов. В качестве исходного материала для их выделения обычно используются растительные экстракты из восприимчивых видов, способных накапливать в своих тканях вирусы и вироиды в высоких концентрациях, но в которых отсутствуют (или содержатся в минимальных количествах) вещества, ингибирующие их репродукцию или непосредственно разрушающие их частицы. Такие растения-доноры выращиваются в условиях изоляции для предотвращения их заражения посторонними патогенами. При очистке препаратов применяют разные методы - химические, физические, иммунологические, инструментальные. При химических технологиях концентрирование и выделение вирусов проводят, осаждая их специфическими реагентами, например, этанолом, сульфатом аммония и др. При очистке для разрушения балластных белков и нуклеиновых кислот используют некоторые ферменты трипсин, нуклеазу и др. Денатурации нормальных компонентов клетки, увеличению выхода вирусной массы, в частности стабильных возбудителей, способствуют термическая обработка суспензий, вытяжек и глубокое замораживание растительного материала. Удаление посторонних белковых примесей достигается также эмульгированием экстрактов с различными неполярными растворителями. При получении препаратов лабильных возбудителей используют более мягкие приемы избирательной адсорбции вирусов на специфических сорбентах и гель-фильтрации на молекулярных ситах (сефадексы, агароза и др.), позволяющие проводить фракционирование суспензий в зависимости от размера молекул. В результате из смеси удаляются низкомолекулярные примеси. При использовании хроматографии на агаровых колонках удается добиться высокой степени очистки вирусных препаратов на завершающих этапах их производства. Для удаления низкомолекулярных фракций и солей может применяться и диализ через различные мембраны. Очистку вирусных препаратов от рибосом и сопутствующих растительных белков часто проводят с помощью бентонита или этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА). Для стабильных вирусов иногда применяют метод осаждения их в изоэлектрической точке, в основе которого лежит способность вирусных белков образовывать с солями обратимые комплексы. Растворение последних в нейтральных растворах с последующим переосаждением позволяет удалять из экстрактов основные белки растений, отличающиеся по своим электрохимическим свойствам от вирусных. 7 0 На всех этапах выделения и производства очищенных вирусных препаратов соблюдаются условия, способствующие сохранению инфекционности и интактного состояния вирионов (рН среды, низкие температуры). Для этого используются буферные системы разной ионной силы и солевые добавки, обеспечивающие в среде присутствие дивалентных катионов, например, Са2+ или Мg2+. Величина ионной силы буферного раствора и его рН - фактор специфичный, варьирующий в зависимости от свойств вируса. Для ингибирования инактивирующего действия различных соединений (фенольных, фенолоксидазы и др.) используют вещества, относящиеся к восстановителям, например, сульфит и тиогликолят натрия. При очистке некоторых вирусов (мозаики яблони, огурца, некротической кольцевой пятнистости сливы и др.) для этих целей применяются вещества из группы хелатов, реагирующих с катионами меди, входящей в состав полифенолоксидазы, такие как диэтилдитиокарбамат натрия. Нейтрализация действия таннинов осуществляется добавлением синтетических полимеров, например поливинилпирролидона, или соединений никотина. Для анализа белков фитоплазм иногда используют метод электрофореза в полиакриламидном геле. Вироиды, как известно, обладают способностью к самогибридизации вследствие высокой степени внутренней комплементарности (до 70%). Поэтому при их диагностике используют методы гибридизации (dot – spot) на нитроцеллюлозной бумаге, где тестируемая в соке анализируемого растения или очищенных препаратах РНК вироида гибридизируется с РНК из больных растений с известной этиологией, меченной Р32. Для гибридизации с РНК вироида может также использоваться комплементарная кДНК, техника получения которой предусматривает вначале выделение и клонирование рекомбинантной ДНК. Данная методика впервые была апробирована для диагноза болезни «каданг-каданг» и вироида веретеновидности клубней картофеля. Микробиологический анализ. Прямым методом идентификации фитоплазм является выделение их в чистую культуру (с последующими операциями по выполнению триады Коха). В настоящее время разработаны составы питательных сред для культивирования фитоплазм (отвар сердечной мышцы крупного рогатого скота, дрожжевой экстракт и различные сыворотки) В последнее время многие фирмы предлагают стандартные среды для их выращивания, диагностики и поддержания в культуре. При их 7 1 культивировании и получении чистой культуры важнейшее значение приобретают операции многократной фильтрации через мембранные фильтры (для отделения от L-форм бактерий) с последующим высевом на плотную, затем и жидкую среду. Центрифугирование. Различные методы центрифугирования (дифференциальное, градиентное и т.д.) широко используются как на начальных этапах очистки при удалении фрагментов клеток растения-хозяина и низкомолекулярных примесей, так и для концентрирования возбудителей и получения препаратов высокой степени чистоты. Метод дифференциального центрифугирования разделяет частицы по их массе в гравитационном поле. Скорость их осаждения определяется размерами. При чередовании низкоскоростного центрифугирования (5-10 тыс. об./мин) из суспензий вначале удаляются клеточные фрагменты, ядра, митохондрии. Затем при 3065 тыс.об./мин. в осадок выпадают вирусные частицы и часть клеточного белка. Его низкомолекулярные фракции остаются в надосадке. При ресуспендировании осадка и повторных циклах центрифугирования получаемые препараты освобождаются от денатурировавших белков растений и нерастворимых балластных веществ. Зонально-скоростное центрифугирование (или центрифугирование в градиенте плотности) чаще используется при выделении нестабильных, особенно в отношении гидродинамических воздействий, частиц. С его помощью по скорости седиментации в растворах веществ (сахароза, альбумин, глицерин, CsCl, Cs2SO4 и др.) с заданной плотностью определяются такие параметры возбудителей, как размеры, плотность и молекулярная масса. В каждом конкретном случае для приготовления градиентов отбираются вещества, обладающие химической инертностью, различающиеся по вязкости и плотности с выделяемыми объектами. Исходную анализируемую смесь наносят тонким слоем на поверхность градиента в пробирке. Для центрифугирования используются специальные бакет-роторы с горизонтальным размещением пробирок, позволяющим достичь максимальных угловых скоростей седиментации. Большим преимуществом метода является то, что с его помощью при одном цикле центрифугирования удается разделить все компоненты образца, различающиеся по плавучей плотности, каждый из которых образует свою зону. Время, за которое объекты достигают дискретного положения и образуемые 7 2 ими зоны просматриваются в проходящем свете, составляет от 1 до 10 ч. Коэффициент седиментации (S) расчитывается по формуле: S = v/w2r, из которой видно, что скорость оседания (v) пропорциональна величине w2r, где w – угловая скорость вращения ротора (в рад.с) и r – радиус вращения. Она зависит от температуры, плотности и вязкости растворителя. Скорость оседания по отношению к угловой скорости вращения ротора весьма мала. Поэтому для выражения константы седиментации используется специальная единица Сведберг (S), за 1 единицу которой принята 1·10-13 с. При сравнениях разных объектов значения их коэффициентов седиментации приводятся к стандартным условиям (вода, 20°С), обозначаемые как S20,w . Электрофоретический анализ. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по молекулярной массе, пространственной конфигурации, вторичной структуре и электрическому заряду. Сущность его заключается в том, что вирионы и вироидная РНК, различные их фракции, обладающие суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависит от рН среды, движутся в направлении катода или анода. В качестве среды для электрофореза обычно используются полиакриламидные (ПААГ) и агарозные гели. Изменяя их концентрацию можно получать гели с разной поростностью. Скорость перемещения макромолекул определяется их размерами и величиной заряда. Ее величина при заданном рН называется электрофоретической подвижностью. В результате анализа препараты разделяются на зоны, состоящие из одинаковых молекул, мигрирующих в геле с одинаковой скоростью. При проведении электрофореза для наблюдения за движущимися зонами в исходный препарат добавляют инертный краситель, молекулы которого имеют идентичный с фракционируемыми макромолекулами заряд. В результате зоны становятся видимыми. После разделения их фиксируют и окрашивают специфическими для белков и НК красителями. Для проведения электрофореза используют приборы с вертикальным или горизонтальным расположением носителей геля (трубок, пластин). В настоящее время метод относится к наиболее доступным и надежным для отделения РНК вироидов от суммарной и, следовательно, их диагностики. Анализ состоит из операций по суммарному выделению РНК из растительных тканей и 7 3 последующему ее разделению в ПААГ. Его продолжительность около 2-3 сут. Чувствительность метода составляет около 510-11 мг (при биологическом титровании она выше-410-4 мг). Существует несколько электрофоретических методов диагноза вироидов, различающихся по продолжительности его выполнения. Предпочтение чаще отдается более эффективным из них, которые способны обеспечить проведение массовых анализов. В частности предлагается следующая пропись: 0,5 г листьев анализируемого растения (картофель, томаты) гомогенизируют с 1,5 мл буфера (20 мл 0,1 М тетраацетата натрия + 10 мл 4 М NH4OH + 60 мл 10 М LiCl + 50 мл дистиллированной воды). Экстракт, полученный путем отжимания мезги с помощью специальных щипцов и марли, собирают в пробирку, в которую добавляют 2 мл холодного свежеперегнанного фенола с 10% m-креозолом и 0,1% 8гидрохсихинолином, и перемешивают. Затем центрифугированием при 9 тыс. об/мин в течение 10 мин из него отделяют водную фазу, добавляют 2 объема этанола, перемешивают и инкубируют при -20ºС 30 мин. Преципитирующуюся НК осаждают центрифугированием при 10 тыс. об./мин в течение 10 мин. Полученный осадок растворяют в 0,1 мл стерильной дистиллированной воды с добавлением капли 20% сахарозы с бромфеноловым синим красителем, служащим маркером, и используют для электрофореза. Его проводят на пластинах 5% полиакриламидного геля при 100V и температуре 15ºС в течение времени, пока маркер не продвинется от старта на 9-10 см (обычно около 4 ч). Гель окрашивают 0,1% раствором толуидинового голубого (12 ч). Затем от красителя пластины отмывают (2-3 смены воды) и проводят оценку результатов. Для идентификации отдельных компонентов анализируемого образца, например, вирусных нуклеопротеидов, в колодцы, нарезаемые в горизонтальной пластине агара или ПААГ параллельно их движению, вводят специфическую сыворотку, содержащую антитела к компонентам, входящим в состав исследуемой смеси. Они, диффундируя в направлении оси движения фракций в электрическом поле, реагируют с комплементарными белками, образуя видимые полосы преципитации (см. рис.7). Эта модификация метода, под названием - иммуноэлектрофорез, чаще применяется при анализах вирусных инфекций, а также идентификации микоплазменных белков. С помощью электрофореза при использовании стандарных веществ с известной молекулярной массой (цитохром С – 12500, белок ВТМ – 17500, яичный альбумин – 7 4 45000, бычий сывороточный альбумин - 67000 и др.) можно определять и молекулярную массу неизвестных соединений. Молекулярная гибридизация. В 1985 г. Кэри Б. Мюллис предложил метод амплификации (ampliphication – увеличение, усиление) заранее выбранного участка ДНК в пробирке, по существу являющийся методом клонирования in vitro. Метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР, от англ. Polymerase Chain Reaction, PCR). ПЦР позволяет избирательно амплифицировать интересующий участок ДНК в миллионы раз за несколько часов, используя в качестве стартового материала сложные смеси ДНК и РНК. ПЦР является оригинальным методом экспоненциального увеличения специфической последовательности ДНК in vitro с помощью ДНК-синтеза. Специфичность метода обеспечивается с помощью пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных концевым группам нуклеотидов участка с интересующей нас последовательностью, который используется для амплификации. В основу этого метода положена способность отдельных фрагментов НК репродуцироваться путем молекулярного клонирования. С помощью вектора, способного распознавать комплементарные структуры, из анализируемых сложных смесей захватываются родственные фрагменты НК, которые в присутствии ДНК-полимеразы на матрице одноцепочечнойДНК копируются и накапливаются в концентрациях в десятки миллионов раз больших (до микрограммовых количеств), чем их содержание в исходной смеси, если они присутствовали в виде небольшого числа копий. Размеры фрагментов при этом могут составлять от 100 до нескольких тысяч нуклеотидных пар. Это достигается тем, что в каждом цикле (их может быть 25-30) вновь образующиеся ДНК служат матрицей для синтеза в последующем. 7 5 Метод чувствителен и способен определять весьма незначительные количества ДНК патогенов в самых различных материалах (почвенных вытяжках, растительной ткани или соке). Теоретически с его помощью можно выявить присутствие даже одной молекулы ДНК. При анализе РНК ее используют вначале в качестве матрицы при обратной транскрипции с участием ревертазы, и затем образующиеся кДНК (комплементарные ДНК) подвергаются стандартной амплификации. Этот метод секвенирования ДНК вследствие высокой специфичности и чувствительности получил широкое распространение при диагностике инфекций и в генной инженерии. Например, при анализах растений, пораженных вироидом солнечного ожога авокадо, возбудитель обнаруживался в препаратах уже при концентрации 0,3-0,5 нг, а в соке - 16-27 нг. Анализ состоит в основном из трех последовательных процедур: подготовки исследуемой пробы, которая в большинстве случаев сводится к выделению из нее ДНК или РНК, собственно ПЦР и идентификации конечного продукта - амплифицированной ДНК. Амплификация ДНК проводится с помощью термостабильной (выделенной из бактерий термофилов (Thermus aquaticus), живущих в геотермических источниках) ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы). Этот фермент проявляет относительную стабильность при температуре «плавления» молекулы ДНК и, следовательно, устраняет необходимость повторного введения фермента после каждого цикла синтеза, что сокращает стоимость ПЦР и позволяет автоматизировать термические циклы. Использование ДНКполимеразы из термофильных бактерий T. aquaticus, которая проявляет максимальную активность при 70 и способна выдерживать кратковременное нагревание при 95, позволяет осуществлять последовательные циклические операции по гибриди- 7 6 зации определяемого фрагмента НК с праймерами (при 50-60), его размножению в присутствии полимеразы (при 70) и денатурации побочных продуктов НК (при 90-94). Taq-полимераза осуществляет синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с ограниченных двумя олигонуклеотидными праймерами «затравок». Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Очевидно, что для амплификации интересующей области ДНК необходимо иметь хотя бы минимальную информацию об ее концевых участках с тем, чтобы подобрать соответствующие праймеры. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Каждая из вновь образующихся молекул ДНК с помощью одного из праймеров может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК. Для этого надо лишь денатурировать синтезированные в результате первой стадии реакции двухцепочечные молекулы ДНК, дать возможность праймерам комплементарно присоединиться к ДНК и осуществить элонгацию. Эти три операции составляют цикл ПЦР и приводят к удвоению количества ДНК в образце. Следует обратить внимание на то, что любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза новых молекул ДНК, выбранных для амплификации (такие молекулы образуются уже после второго цикла ПЦР). Поэтому ПЦР будет приводить к экспоненциальному росту количества именно таких, ограниченных с двух сторон праймерами молекул ДНК. Следовательно, теоретически за 20 циклов ПЦР можно получить амплификацию заданного участка в 2020 раз, т.е. примерно в миллион раз. Вследствие этого метод и получил название полимеразной цепной реакции. В то же время примеси - длинные пограничные копии ДНК, способные синтезироваться только с «исходных родительских цепей» ДНК, за те же 20 циклов могут образовать лишь 20 таких копий каждой из родительских цепей, что пренебрежительно мало по сравнению с количеством основного продукта. 7 7 Практическая сторона анализа выглядит достаточно просто. В пробирке смешиваются ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимераза. Циклическое изменение температуры реакционной смеси: денатурация (94С) – гибридизация праймера (обычно 40-60С) – элонгация (72С) обеспечивает протекание ПЦР. Эффективность метода такова, что достаточно взять десятую часть реакционной смеси, даже в том случае, если исходное количество нужной ДНК в пробе было исчезающе малым, чтобы по прошествии 25-30 циклов амплификации с помощью электрофореза в агарозе увидеть окрашенный бромистым этидием ДНК-продукт. Для проведения анализа необходимо иметь 5 основных реагентов: а) фермент Taq-ДНК-полимераза; б) пару олигонуклеотидных праймеров; в) 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP); г) копируемую ДНК; д) ионы Mg. В качестве дополнительных компонентов используются буферный раствор и минеральное масло. Присутствие специфического ПЦР-продукта (амплифицированной ДНК) в подавляющем большинстве случаев выявляется электрофоретически при разделении полученной смеси на агарозном или полиакриламидном гелях, содержащих в качестве красителя бромистый этидий. Для определения необходимо около 20 нг ДНК, специфичность которой подтверждается при сравнении занимаемого ею после разгона положения (и размеров пятна) с маркерными фрагментами и ДНК-стандартом. В качестве праймеров служат синтетические олигонуклеотиды длиной 20-25 звеньев, комплементарные концевым нуклеотидам выявляемого участка. Для копирования диагностируемого фрагмента молекулы последние должны ограничиваться известными последовательностями нуклеотидов, с которыми и гибридизируются праймеры, ориентируясь 3' – концами навстречу друг другу и в сторону клонируемой последовательности. При комбинировании пар праймеров удается проанализировать в одном препарате НК большое число различных фрагментов. Обычно через 25-30 циклов амплификации (клонирования) после электрофореза в агарозе (или полиакриламидном геле) реакционной смеси и окрашивания бромистым этидием проводят определение видовой принадлежности исследуемого образца. Специфичность метода как раз и определяется подбором пары синтетических праймеров, способных встраиваться в цепь с диагностируемыми и синтезируемыми участками ДНК. 7 8 Существенным недостатком и технической сложностью метода является необходимость получения информации о нуклеотидной последовательности определяемого фрагмента молекулы ДНК, и в частности на его концевых участках, для подбора имеющихся (или синтеза новых) комплементарных ему праймеров. С другой стороны, именно использование двух различных праймеров резко повышает специфичность реакции. Подбор эффективных праймеров для ПЦР - процесс эмпирический. Однако соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения праймеров, пригодных для использования. 1. Выбирают праймеры с содержанием GC50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с неординарными последовательностями. 2. Необходимо избегать последовательностей с устойчивыми вторичными структурами. Для изучения вторичных структур очень полезны компьютерные программы, разработанные специально для их изучения, и программы построения дот-матриц гомологий. 3. Ограниченные праймерами “затравки” проверяют на комплементарность друг другу. Очевидно, что праймеры, отжигающиеся друг с другом, не смогут участвовать в амплификации интересующей последовательности. Хотя большинство “затравок” с большей или меньшей эффективностью способны работать, бывают случаи, когда и синтезированные праймеры совершенно не пригодны для амплификации желаемых последовательностей. Причина этого явления пока еще не ясна. Во многих случаях простой сдвиг последовательности “затравки” на несколько оснований “вверх” или “вниз” решает проблему. ШТАММОВЫЙ СОСТАВ При идентификации любых возбудителей используется целый ряд показателей, характеризующих размер, форму, строение и физикохимические свойства их частиц, тип индуцируемых признаков у поражаемых растений, вид переносчиков и особенности взаимоотношений с ними. Возникающие в результате изменчивости генетические варианты одного возбудителя, обладающие одинаковой морфологией и биохимическим составом, но различающиеся по структуре белков и вследствие этого по таким свойствам, как вирулентность, серологическая специфичность, электрофоретическая подвижность и 7 9 отношение к температурному фактору, имеющие несовпадающий круг поражаемых видов и переносчиков, называются его штаммами. Штамм - как таксономическая категория - отражает существующее внутривидовое разнообразие возбудителей. Отмеченные признаки, используемые для характеристики штаммов, весьма изменчивы. Уже имеется обширная информация о штаммах и факторах, влияющих на процессы их образования и распространения. Например, найдено, что степень распространения по годам, в том числе и доминирующих штаммов, различна. Причем штамм RMV ВЖКЯ обычно присутствовал в качестве одного из компонентов при смешанных инфекциях. Этому способствует, очевидно, то, что наиболее высокий процент передачи инфекции тлями наблюдается в тех случаях, когда в инокулюме присутствует более, чем один штамм. Известные штаммы вируса желтой карликовости ячменя (ВЖКЯ) составляют две серологические группы (табл.10). К первой относятся 3 штамма: MAV, передаваемый M.avenae, PAV, распространяемый M. аvenae и R.padi и SGV, переносчиком которого является S.graminum. Во вторую группу включены два штамма: RPV, передаваемый тлей R.padi и RMV - R.maidis. С помощью ИФА в дальнейшем были обнаружены 4 серотипа PAV, RPV, RMV и MAV с преобладанием в анализируемых образцах двух первых - PAV и RPV. Т а б л и ц а 10 Доминирующие векторы и штаммы BЖКЯ Векторы R.padi, M.avenae, M.dirhodum, R.maidis R.maidis, S.graminum, R.padi, M.dirhodum, M.avenae R.padi, M.avenae, M.dirhodum R.maidis, R.padi, R.padi, S.graminium, M.dirhodum,M.avenae R.maidis R.padi Штаммы Автор вируса PAV, MAV, Harbert, 1990; Burnet, RPV Mazzalama,1990; Gildow, 1990 PAV, MAV RPV, Ramirez, 1990; Dubin, 1984 PAV, RPV, Johnstone et al., 1990 MAV RMV, PAV, Wanjama, 1990; Alyamani, MAV Hill, 1990; Von Wechmer, 1990 RMV Mohlooji, Moxoui, 1990 PAV MAV, Mohlooji, Moxoui, 1990 8 0 Продолжение т а б л и ц ы 10 R.padi, S.graminium, M.avenae R.padi, M.avenae, M.dirhodum MAV, PAV PAV, MAV Nikolenko, Melinchenko, 1985 RPV, Tosic1991; Plumb, 1990 Кроме различий в серологических свойствах между ними выявлены различия и в строении генома. Это позволило выделить их как обособленные виды, сохранив за штаммами первой группы название ВЖКЯ, а представителей второй – объединить под названием вирус желтой карликовости злаков (сereal yellow dwarf virus). Выявлен RPV-серотип, аналогичный PAV-векторному фенотипу. Всего описаны фенотипы 41 штамма, имеющие сходство по серологическим и векторным свойствам. Подобная комплементарность свидетельствует о длительном взаимодействии их геномов во времени. На этой основе с помощью вектора, например Myzus persicae уже выявлены гены, определяющие устойчивость к вирусу оспы, в частности, у трансгенных клонов сливы. Таким образом, выполненые работы по сравнительному генетическому анализу, изучению особенностей взаимодействия между белками вирионов и мембранами разных органов показывают, что характер взаимодействия различных штаммов возбудителей и рас переносчика, дифференциация их по специфичности и вирофорности в значительной мере определяются существующей географической разобщенностью их геномов и различиями адаптивного потенциала. Исследования, подтверждающие данное положение, наиболее полно проведено на примере штаммов BЖМЯ, хотя уже собраны факты и по другим возбудителям. Вместе с тем считается, что векторный фенотип штаммов BЖМЯ не может быть полностью охарактеризован из-за большого числа его потенциальных векторов. К настоящему времени выявлено 98 видов тлей, которые могут служить потенциальными переносчиками BЖМЯ, из них 13 видов являются общими для зерновых культур (овса, пшеницы, ячменя и кукурузы). Подобные различия в переносе штаммов отмечены и для других векторов, в частности нематод. Показано, что штамм вируса погремковости табака, изолированного с этой культуры, обычно 8 1 распространяется видом Trichodorus similes, для других штаммов возбудителя, поражающих другие растения, зарегистрированы в качестве переносчиков виды T. рrimitivus, T.cylinricus и T. viruliferus. ТАКСОНОМИЯ ВИРУСОВ, ВИРОИДОВ И ФИТОПЛАЗМ Первые попытки систематизации вирусов относятся к 20-30-м г.г. нынешнего столетия, Они преследовали в основном цели инвентаризации возбудителей болезней. Обычно им присваивалось название, исходя из приуроченности к определенному растению и характера внешних симптомов. Так, Джонсоном (1927) предложено обозначать вирусы по растению-хозяину с добавлением порядкового номера, например для ВТМ - табачный вирус 1. Позже в качестве классификационных критериев привлекались и другие признаки: отношение вирусов к насекомым (Стори, 1931), свойства интерференции (Кункель, 1935), способы распространения в природе и круг поражаемых видов растений (Джонсон, Хогган, 1935), физико-химические показатели, температура инактивации, величина предельного разведения и сохранения инфекционности in vitro, устойчивость к химическим реагентам (Джонсон, 1935). В частности, система, основанная на указанных критериях, охватывала около 50 вирусов, преимущественно передающихся механическим путем. В 1937 г. К.Смит создал каталог вирусных заболеваний, в основу которого положил род первичного растения-хозяина. Однако при подобной систематике в одну группу попадали возбудители, различающиеся между собой по важнейшим свойствам. Существенный вклад в создание классификации вирусов внес Холмс (1939, 1948), который предложил биноминальную систему их латинских названий, например для ВТМ - Mormor tabaci, и выделил вирусы растений, бактерий и животных в третий мир живой природы -“Vira”. В основу их классификации были положены лишь два критерия - реакция растений на инфицирование и способ передачи возбудителя, что также сохраняло возможность попадания в одну группу вирусов с разными свойствами. И в последующие годы предпринимались неоднократные попытки создания номенклатурной системы вирусов (Беннет, 1943, Боуден, 1943, Рыжков, 1952, Сухов, 1956, Брандес, Беркс, 1965, Проценко, 1966 и др.). Выдвигались и обсуждались различные критерии для разработки оптимальной классификации, причем их значимость определялась, естественно, состоянием изученности вирусов в тот период времени. К настоящему времени создание 8 2 единой номенклатуры вирусов еще нельзя считать законченной и специалисты руководствуются системой, предложенной Международным комитетом по таксономии вирусов (Arch.Virol., 1998). По мере накопления информации в различных областях вирусологии систематические критерии дополняются и совершенствуются. За низшую систематическую единицу фитовирусов принят “штамм”. Определение “вид” (Сухов,1966, Проценко 1966, 1970) вначале не получило широкого распространения, очевидно, вследствие недостаточной надежности критериев, характеризующих видообразование в этой группе патогенов. Однако в 1995 г. решением Исполкома при Международном комитете по таксономии вирусов в их номенклатуру внесены изменения, в которой уже появились такие понятия, как семейство, род и вид. На основе новых данных об их структуре и экспрессии геномов, биологических свойствах выделены 29 родов, часть которых объединены в таких семействах, как Caulimoviridae, Closteroviridae, Luteoviridae, Geminiviridae, Circoviridae и др. В семействе Potyviridae обособлены 3 новых рода. Некоторые роды фитовирусов введены в качестве сочленов в семейства, известные для возбудителей грибов, животных и человека (сем. Reoviridae, Rhabdoviridae, Partiviridae и Bunyaviridae). Вместе с тем для многих вирусов (более 250) принадлежность к тому или иному семейству остается еще не выясненной. Вирусы объединяются в роды на основе наиболее значимых признаков: - тип нуклеиновой кислоты, входящей в состав вируса (ДНК или РНК), - величина молекулярной массы (млн дальтон) и число тяжей (одно- или двухцепочечные), процентное содержание НК в частице, - состав и размеры структурных белков, - морфология вирусных частиц (форма и размеры), - антигенные свойства, - отношение к температуре, - специализация, - способы передачи инфекции, - внешние признаки заболевания. Для обозначения рода используются латинские наименования ее типичного представителя. Например, вирус табачной мозаики (Tobacco mosaic virus) является представителем рода Tobamo (см. прил. 1). Число возбудителей, относящихся к тому или иному роду, 8 3 может быть различно: от 1 представителя (Alfamovirus, Enamovirus) до 170 (Potyvirus). В ряде публикаций применяют криптограммы, в которых в закодированном виде содержатся сведения о свойствах вирусов (Harrison, 1978). Они состоят из четырех пар показателей, отражающих тип нуклеиновой кислоты (Р-РНК или Д-ДНК) /число цепей в молекуле; молекулярный вес НК (млн дальтон) /содержание НК в %; форму вириона/форму нуклеокапсида (С - сферическая, Е удлиненная, Х - сложная, V - удлиненная с параллельными сторонами и закругленными концами, Е- сходная структура, но с не закругленными концами.); вид инфицируемого хозяина/тип переносчика (Ар - тли, Ас - клещи, Аи - цикадки, N - нематоды, О нет переносчика, * - информация отсутствует). Так, криптограмма ВТМ выглядит как R/1;2/5;E/E;S/0. В настоящее время в соответствии с достигнутым уровнем знаний выделено более 50 родов вирусов (см. прил.1). Более того, на основании существующей информации уже делаются попытки создавать генеалогические древа отдельных семейств, например Geminiviridae. Характерным для вироидов является сходство их первичной и вторичной структуры. В частности, анализ выявил высокую степень гомологичности (69-83%) в последовательности нуклеотидов у ВАКТ, ВЭЦ, ВКХ, ВВКК и ВТПМ. Кроме того, у них обнаруживается ряд общих свойств, таких, как неспособность РНК метилироваться и транслироваться, наличие идентичного фрагмента из 18 пуриновых оснований в центральной части молекулы. Выявленные элементы сходства и различия у возбудителей позволили выделить группу ВВКК (по типичному представителю) из нескольких вироидов, а также ВСОА и ВПКК, которые на сегодня включают по одному члену. В настоящее время предложена классификация вироидов, в которой выделено 9 групп (см. прил.2). В качестве таксономических показателей использованы такие признаки и свойства, как: наличие в структуре центрального фрагмента CDN-viroid или НН-viroid в концевой (головной) ее части, РНК-полимеразная зависимость репликации ДНК или рибосомоподобный аутокатализ РНК, отношение к РНК-азе хозяина и РНК-лигазе, синтез по схеме РНКРНК или РНК-ДНК-РНК. Особо выделен класс вироидов, так называемых сателлитных РНКs, репликация которых определяется вирусом помощником (helper virus). Длине молекул отводится незначительная роль. 8 4 Фитоплазмы объединены в класс Mollicutes (см. прил.3), хотя и составляют весьма гетерогенную группу организмов. Их классификацию нельзя считать завершенной, поскольку многие представители остаются вне этого таксона из-за сложностей с культивированием на бесклеточных средах и все еще относятся к фитоплазмоподобным (или вирусоподобным) инфекциям. На основании пищевых потребностей выделены два порядка Mycoplasmatales, представители которых нуждаются в холестерине, и Acholeplasmatales, для которых он не является необходимым. К семейству Mycoplasmataceae относятся стеринзависимые факультативные анаэробы, в том числе несколько видов, выделенных из растений. Представителям семейства Spiroplasmataceae также свойственна зависимость от стеринов. Они обладают большой подвижностью, благодаря наличию в цикле развития специфических спиралевидных форм. Среди наиболее известных заболеваний, вызываемых возбудителями этой группы можно назвать стабборн цитрусовых (Citrus stubborn), карликовость кукурузы (Corn stunt) и кокосовой пальмы (Cocos stunt). Развитие фитоплазм из семейства Acholeplasmataceae протекает без стеринов. Среди наиболее вредоносных заболеваний, вызываемых ими, можно отметить столбур томатов, курчавую мелколистность шелковицы, филлодию клевера. Эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфические изменения морфогенеза. ВИРУСОПОДОБНЫЕ АНОМАЛИИ У РАСТЕНИЙ Внешние признаки, возникающие при инфицировании растений вирусами, вироидами и фитоплазмами не всегда специфичны, так как напоминающие их проявления могут быть вызваны другими факторами. В частности, избыточная концентрация гормонов может вызывать нарушения их роста и развития. Например, при попадании на листья даже небольших количеств (до 3 мг/л) соединений 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), 2,4 ДМ (2,4дихлорфеноксимасляная кислота) и других, близких по действию ауксинам и используемых на практике в качестве гербицидов, наблюдается появление симптомов деформации листьев (скручивание, сморщивание, образование эпинастий, ненормальное жилкование), образование каллюса и растрескивание коры у побегов. Степень повреждения зависит от стадии развития растения, его 8 5 отдельных органов в момент попадания вещества и его концентрации. Кроме того, различия в токсичности гербицидных регуляторов роста наблюдаются также между их гомологами уксусной и пропионовой кислот. Наиболее чувствительны и быстрее реагируют на воздействие ауксиновых веществ молодые органы и меристематические ткани (верхушки побегов, пробуждающиеся почки, формирующиеся листья и плоды). Их передвижение по растению характерно для ауксинов и идет в направлении от верхушки к основанию. Другие регуляторы роста – гиббереллины способны стимулировать рост растений с признаками некоторых форм карликовости (инфекционной и генетической). Таким образом, очевидно, что различные гормональные препараты, гербициды могут индуцировать симптомы, напоминающие признаки поражения вирусами. Наиболее распространены симптомы угнетения роста, курчавости, нитевидности и папортниковидности листьев (рис. 7). Очень часто при вегетативном размножении происходит накопление и отбор различных проявлений типа пестролистности, изменения окраски плодов и других органов, являющихся, по сути, химерами (стабильными или периодическими), возникающими при спонтанных мутациях как результат генных, хромосомных, соматических перекомбинаций. Кодируемые дефекты, например связанные с редукцией хлорофилла, сохраняются, если они являются летальными для растений. Так, при различных генетических нарушениях часто можно наблюдать симптомы мозаичного характера типа пестролепестности, сходные с вирусными поражениями (см. рис.8). Образование опухолей, внешне не отличимых от вызываемых вирусом раневых опухолей клевера, способны индуцировать бактерии Agrobacterium tumefasciens. Имитация вирусных симптомов возникает также при питании на растениях насекомых с колюще-сосущим ротовым аппаратом (цикадок, червецов, тлей, клопов). Так, при повреждениях листьев тлями можно наблюдать признаки мозаики, морщинистости, скручивания их пластинки. Эриофидные клещи вызывают крапчатость на молодых листьях, а при высокой их численности, например на клевере, способны индуцировать признаки “ведьминых метел”. Некоторые токсины, вырабатываемые представителями Homoptera при питании, могут стать причиной задержки роста растений и образования листоподобных выростов на листьях. При недостатке тех или иных питательных веществ развивается аномальная окраска листьев и даже некротические проявления. При 8 6 этом наблюдается общее пожелтение листовой пластинки, хлороз различного типа - вдоль или между жилок, краевые и междужилковые некрозы. У некоторых видов растений симптомы мозаики, хлороза, посветления жилок, свойственных вирусным и вироидным болезням, появляются на молодых листьях от резкой смены температуры. При ее нормализации они на вновь отрастающих побегах постепенно исчезают. Нарушения пигментации возникают и под влиянием некоторых физиологических факторов, при технологических нарушениях возделывания растений. Например, при поливе холодной водой в жаркую солнечную погоду появление рисунка типа кольцевой пятнистости является следствием попадания капель на листья и резкого изменения температуры в тканях. Вместе с тем основной отличительной чертой подобных аномалий является то, что они не инфекционны и не способны распространяться от растения к растению. Именно поэтому, факты обнаружения патологических изменений, сходных с симптомами вирусных и другого рода инфекционных поражений, предъявляют особые требования к методам диагностики, необходимой для объективного заключения о причинах и природе выявляемого заболевания для своевременной организации защитных мероприятий. МЕРЫ БОРЬБЫ С ВИРУСНЫМИ, ВИРОИДНЫМИ И ФИТОПЛАЗМЕННЫМИ БОЛЕЗНЯМИ Указанные заболевания отличаются большой вредоносностью, вызывая значительные потери урожая, снижая морозостойкость и качество посадочного и семенного материала. При сильном поражении отдельные сорта и виды вытесняются из сортимента и вырождаются. Несмотря на то, что вопросы профилактики и оздоровления от этой группы инфекций для многих культур разработаны, актуальность их сохраняется. Это связано с происходящими изменениями в технологиях их возделывания, структуре фитоценозов и экологии. Учитывая высокую вирулентность многих возбудителей, наличие переносчиков и широкого круга поражаемых видов среди древесных, овощных, бобовых, технических культур, снижение причиняемого ими ущерба способен обеспечить только комплекс мероприятий. Например, в ряде случаев цветочные культуры выращивают в культурообороте с овощными растениями. В связи с этим при разработке защитных 8 7 мероприятий необходимо учитывать видовой состав возбудителей, поражающих ту или иную культуру, особенно те их виды, которые обладают широким спектром хозяев, такие как вирусы огуречной и табачной мозаики, мозаики резухи и мозаики люцерны, характерные для большинства овощных, цветочных растений, а в некоторых случаях и представителей дикорастущей флоры. Более того, при планировании и реализации защитных мероприятий необходимо учитывать трофические связи патогенов, обитающих в конкретных агроценозах, а также их поведение в полях севооборота. До недавнего времени стратегия борьбы с вредными организмами была ориентирована на уничтожение нежелательных популяций, главным образом, с помощью химических средств, кратность применения и нормы внесения которых неуклонно возрастали, тогда как устойчивость вредоносных организмов к пестицидам повышалась. Эти и другие негативные обстоятельства привели к необходимости переоценки методологии защиты растений. Принципиально новой теоретической базой ее стало представление о полевых растительных сообществах и, в частности, о взаимоотношениях между культурой и вредными организмами в агроландшафтных системах земледелия. Она основана на принципе регулирования численности вредящих организмов, т.е. поддержания их популяций на таком уровне, при котором они не наносят экономического ущерба. Такая система мероприятий по интегрированной защите растений предусматривает: - биорациональное конструирование агроландшафта, способного влиять на уровень распространения и циркуляцию доминирующих и потенциально опасных возбудителей трансмиссивных инфекций и их переносчиков, - использование приемов ранней диагностики с целью систематического мониторинга за поведением вредных видов и прогноза их развития, - карантин и сертификацию посадочного и семенного материала для предупреждения заноса возбудителей в новые районы, входящие в комплекс профилактических приемов; - контроль за источниками инфекции (удаление и уничтожение больных растений, их остатков, борьба с сорняками, дезинфекция почвы, субстрата, семян, а также оздоровление посадочного и посевного материала); - подбор участков для выращивания культурных растений и периодическая борьба с переносчиками физическими, химическими и биологическими способами; 8 8 - селекцию и выращивание устойчивых сортов и гибридов. Широкое распространение вирусных, вироидных и фитоплазменных заболеваний, отсутствие приемов массового оздоровления пораженных ими растений в полевых условиях обусловливают особые требования к производству здорового посадочного материала. Технологические схемы и организационные принципы систем производства такого материала у различных культур, несмотря на имеющиеся особенности, одинаковы. Они включают следующие обязательные этапы и операции: отбор исходных растений без внешних признаков заболевания, обеззараживание с использованием методов термотерапии и культуры апикальных меристем, контроль за состоянием растений в процессе выращивания, их размножением и репродукцией в питомниках в условиях защиты от повторных заражений. К числу необходимых сведений, на основе которых определяется целесообразность применения тех или иных приемов, являются данные о видовом составе возбудителей и их переносчиков на произрастающих в регионе растениях, особенностях взаимодействия их в смешанных и сопряженных инфекциях. Для получения здорового материала вегетативно размножаемых растений используют чувствительные и объективные методы диагноза и идентификации возбудителей (серологические, биологические и молекулярные и др.), что необходимо для оптимального подбора терапевтических приемов их элиминации (термотерапия, химиотерапия, культура тканей или их сочетаний). Химиотерапию используют при оздоровлении в целях подавления репродукции возбудителей и снижения их концентрации в тканях, особенно меристематических, а также для предохранения получаемых растений от вторичного заражения. Обычно для этих целей применяют рибавирин (виразол) и ДНТ - [5-азадигидроурацил (2,4-диоксидигидро-1,3,5-триазин)]. Меристемные ткани растений часто не содержат вирусов. Техника оздоровления растений, основанная на выделении апикальных меристем, постоянно совершенствуется. Практически важным оказалось использование присущей культуре ткани способности к морфогенезу и регенерации целого растения для оздоровления от вирусов и быстрого клонального размножения уникальных генетических форм, новых хозяйственноценных сортов растений. Микроразмножение в культуре ткани имеет ряд преимуществ: 8 9 - коэффициент размножения выше, чем при обычных методах; - рост растений в течение всего года; - метод размножения in vitro экономичен, большое число растений можно выращивать на относительно небольших площадях; - оздоровление растений от вирусов и патогенных микроорганизмов; - возможность выращивать растения, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно. Микроразмножение в условиях in vitro дает возможность контролировать многие факторы внешней среды: температуру, влажность, продолжительность и интенсивность светового дня, состав питательных веществ. Фитосанитарные мероприятия и мониторинг развития различных инфекций в целях прогноза предусматривают проведение периодических осмотров плантаций, отбор проб растений и иммунологическую диагностику с учетом факторов, определяющих начало и длительность лёта переносчиков, особенно преобладающих видов. Чем тщательнее они проводятся, тем легче контролировать скорость распространения возбудителей. Данные мониторинга позволяют определять как биологическую, так и экономическую целесообразность планируемых мер, направленных на максимальное снижение ущерба и подавление природной популяции насекомыхпереносчиков. В природе существует определенное равновесие между возбудителем и растением, характеризующееся латентной формой инфекции, что особенно наглядно проявляется при поражениях дикорастущих видов. Это является отражением процессов их совместного эволюционного развития. Обычно нарушения такого равновесия происходят время от времени в результате стрессовых воздействий, например, при резких климатических изменениях и влиянии некоторых антропогенных факторов. Другими словами, бессимптомное течение заболевания определяется не только генетическими особенностями сорта, вирулентностью возбудителя, но и условиями их взаимодействия между собой. К агрономическим приемам, позволяющим снижать причиняемый ущерб даже при массовом поражении растений, относятся: выращивание их на высоком агрофоне. Это предусматривает своевременное внесение удобрений в оптимальных дозах, использование биологически активных веществ (регуляторы роста растений, ингибиторы инфекций и др.). Следует учитывать, что избыточное внесение, например, азота снижает устойчивость растений к заболеваниям, выносливость к заселению многими 9 0 вредителями, в том числе и переносчиками. Для улучшения состояния растений на первых этапах развития часто проводят предпосадочную дезинфекцию посевного (или посадочного) материала от сопутствующих инфекций, а также обеззараживание почвы пестицидами или биопрепаратами против нематод и грибной инфекции. В начале вегетации, в период цветения и перед уборкой рекомендуются 3-кратные внекорневые подкормки растений микроэлементами. Необходимо также систематическое проведение мероприятий по борьбе с сорняками, которые служат резерваторами инфекции. Важнейшим профилактическим приемом является борьба с насекомыми-переносчиками. Следует соблюдать оптимальные сроки посева и уборки, при которых растения «уходят» от переносчиков заболеваний. В целях экономии химических средств и меньшего загрязнения ими окружающей среды целесообразно применять выборочные (в очагах) и краевые обработки. Оптимальные сроки их проведения определяются в зависимости от видового состава переносчиков, особенностей их развития, кормовых связей, условий циркуляции возбудителей. Однако следует иметь в виду, что иногда химические препараты оказываются недостаточно эффективными, например против тлейпереносчиков, поскольку не способны обеспечить 100% их гибель, а высокий репродуктивный потенциал позволяет им быстро восстанавливать свою численность (в условиях подавления в результате обработки их паразитов и хищников). Более того, частая сменяемость поколений стимулирует быстрое появление у тлей форм, резистентных к химическим препаратам. Поэтому в борьбе с переносчиками начинают использовать инсектициды природного происхождения, в частности пиретрины, характеризующиеся высокой эффективностью даже в малых концентрациях - 0,001%, или авермектины, способные подавлять функции репродуктивных органов насекомых, феромоны тревоги тлей, эффективная доза которого не превышает 1г/га. Их использование определяется экономической целесообразностью с учетом экологической безопасности. Вместе с тем при выявлении карантинных объектов допускается тотальное применение химических обработок. Химическая борьба с переносчиками остается одним из наиболее эффективных способов защиты здоровых растений от заражения трансмиссивными возбудителями. Использовать инсектициды целесообразно при определенном уровне численности переносчиков. Поэтому химические обработки насаждений проводят на основе 9 1 результатов их мониторинга с учетом времени появления первых особей и плотности популяций. Применение инсектицидов особенно целесообразно для уничтожения переносчиков, которые передают вирус персистентно и способны заражать растения длительное время. Практика химической борьбы с ними знает немало примеров успешной защиты культуры. Так, в Австралии обработка ячменя против переносчиков вируса желтой карликовости ячменя при использовании фосфорорганических препаратов позволила снизить количество больных растений с 67 до 36% и получить прибавку урожая 0,5 т/га. При этом наибольший эффект наблюдался тогда, когда источник инфекции находился на обрабатываемом поле, а не перманентно заносился извне. Поскольку многие возбудители имеют переносчиков, то выбор наиболее эффективных приемов зависит от сведений о сроках их миграции, динамике численности популяций в течение года и за период в несколько лет, степени вирофорности. Эти данные, полученные в результате мониторинга, позволяют прогнозировать развитие и распространение заболеваний. Тем не менее, достаточная эффективность обеспечивается лишь комплексом мер, направленных на снижение численности переносчиков и тем самым – на предохранение от перезаражения оздоровлеённого материала с сохранением его высокой продуктивности. Одним из важных рычагов регуляции численности вредоносных популяций и управления их адаптивной изменчивостью в агроэкосистемах является использование устойчивых к переносчикам инфекции культур, их сортов и гибридов. В этой связи особую ценность приобретают те их формы, которые обладают комплексной устойчивостью сразу к нескольким видам. Именно поэтому в любой системе защиты растений важное место отводиться их использованию. Найдено, что виды растений, проявляют разную устойчивость, которая может проявляться на отдельных этапах патологического процесса: при проникновении инфекции в клетки растений, репродукции ее в тканях и распространении патогена по растению. В частности, устойчивость растений к механическому заражению вирусами обусловлена тем, что листья многих растений имеют 4 защитных слоя: эпикутикулярный воск, кутикулу, кутинизированный слой с вкраплениями воска, пектиновый слой. Кроме того, клетки растений защищены толстой целлюлозной оболочкой, содержащей вещества, способные инактивировать вирусные частицы. Поэтому селекция на устойчивость и внедрение в производство вновь создаваемых непоражаемых сортов 9 2 предупреждает возникновение эпифитотий у растений. Однако устойчивость их к одному патогену, как правило, не обеспечивает требуемый уровень защиты, поскольку при комплексных инфекциях, состав которых меняется в зависимости от географической зоны, резко возрастает вредоносность, вследствие аддитивного эффекта. Поэтому особую ценность представляют сорта рсатений, обладающие групповой устойчивостью. Использование таких сортов может значительно снизить активность распространения инфекции. Таким образом, селекция растений на их устойчивость к патогенам является действенной мерой для предупреждения эпифитотий. Причем особое значение приобретает устойчивость к переносчикам, с персистентным типом взаимодействия с возбудителями. В результате растения, устойчивые к переносчикам, часто остаются свободными и от заражения распространяемыми ими возбудителями. Отбор селекционных форм с такими свойствами проводится на основе типичного параметра - антибиоза или непривлекательности растений для переносчика и контролируется моно- или олигогенно. Данный тип устойчивости наследуется, как правило, специфически и не действует в отношении других видов. Так, при экспериментальном заселении 4 образцов сорго 8 клонами S.graminum показано, что антибиоз и степень повреждения ими растений дифференцированы в зависимости от генотипа хозяина, т.е. антиксеноз и антибиоз являются различными способами проявления одних и тех же взаимодействующих пар генов растения-хозяина и насекомого. При этом найдено, что толерантность и антибиоз не взаимосвязаны. Отмечается положительная корреляция между степенью поврежденности, предпочитаемостью растений и плодовитостью насекомых. Кроме плодовитости, сорта могут оказывать влияние на продолжительность цикла развития и скорость роста переносчиков. При совместном обитании двух и более видов тлей, например, R.padi и M.avenae, наблюдается уменьшение плодовитости одного из конкурирующего за субстрат вида. Этот факт рассматривается как влияние интродуцированной толерантности растений. Основные успехи в создании устойчивых сортов зерновых культур к указанным объектам связаны с использованием доминатного гена Yd2, обнаруженного у высокогорного эфиопского ячменя. Для более эффективного выявления Yd2 с помощью ПЦР используется диагностический маркёр. Особое место в современной селекции занимает выведение межродовых и межвидовых гибридов. Уже получены устойчивые и 9 3 толерантные сорта ячменя и пшеницы, в том числе 56-хромосомный пшенично-элимусный амфидиплоид. Высокий уровень устойчивости к вирусу желтой карликовости ячменя отмечен у представителей Agropyron и гибридов с его участием. Выявленная низкая концентрация вируса, по-видимому, обусловлена подавлением репродукции на клеточном уровне. Устойчивость к этому вирусу была зарегистрирована также на некоторых многолетних видах Hordeum, Thinopyrum, Leymus, Elytrigia, Elumys, Pascopyrum. В пределах 7 видов Triticeae обнаружены иммунные и высокоустойчивые образцы. Иммунные линии Agrotricum line ok7211542 (2n=56) и Triticum aestivum ok7211542 (2n=44) к PAV-серотипу вируса желтой карликовости ячменя получены в 1994 г. Высокий уровень устойчивости при низкой концентрации вируса в растительных тканях был зарегистрирован у Thinopyrum spp. Линии, классифицированные как устойчивые, были выделены у Triticum aestivum (L.), Th. рonneum и Agropyron dongatum. Значительное влияние на поражаемость, распространение и степень вредоносности оказывает также агротехника возделывания культивируемых сортов. Например, при высеве 5 гибридов сладкой кукурузы, восприимчивых к вирусу желтой карликовости ячменя, в середине – конце июня с оптимальной густотой стояния (3,5-4,0 млн раст./га) их поражаемость значительно снизилась. Это связано с тем, что на изреженных всходах зерновых создаются более благоприятные температурные условия и влажность среды обитания для насекомых-переносчиков. С другой стороны, озимая пшеница, посеянная в ранние сроки (первую-вторую декады сентября), поражалась вирусами на 10-14% сильнее. Существенную роль в распространении возбудителей играют предшественники в севообороте. Так, например зерновые культуры сильнее всего поражаются после колосовых предшественников, так как большинство вирусов, поражающих зерновые злаки, сохраняются и циркулируют, используя в качестве растений-хозяев злаковые травы, в том числе сорные виды (куриное просо, гумай, овсюг и др.), особенно многолетние. Поэтому целесообразно избегать размещения зерновых рядом с лугами и пастбищами, а также по многолетним травам в севообороте. Следует иметь в виду, что всходы падалицы также могут служить в осенний период источником и накопителем инфекции. В связи с этим до появления всходов падалицы поля, освобожденные от яровых и особенно озимых, следует продисковать или провести лущение и вспашку. 9 4 Общеизвестны факты, свидетельствующие о том, что уровень минерального питания растений влияет на выживаемость, скорость развития и плодовитость переносчиков. Например, при внесении повышенных доз удобрений, особенно азота, резко (почти в 1,5-2 раза) возрастает численность тлей. С другой стороны, при сбалансированных схемах удобрений наблюдается повышение устойчивости к ним растений и ограничение их размножения. Для пролонгации такого действия рекомендуется осенью при посеве вносить в почву гранулированные с фосфамидом формы минеральных удобрений, которые имеют более длительный период действия на насекомых (до нескольких недель). При изучении влияния различных концентраций двух форм азота (NO3 и NH4) на проявление признаков заболеваний и компоненты урожая установлено, что при внесении NH4 отмечается более сильное проявление симптомов и редукция урожая, чем после обработки NO3. В среднем потери урожая на овсе и пшенице, например, от вируса желтой карликовости ячменя достигали 45-46%. В последние годы для снижения ущерба от вирусных болезней расширяется применение их ослабленных и латентных форм, в частности, путем искусственного инфицирования растений, например, овощных (томаты, огурцы) в закрытом грунте, на ранних этапах их развития, предохраняя тем самым от заражения вредоносными агрессивными штаммами того же возбудителя. Уже показана экономическая эффективность использования слабовирулентных штаммов ВТМ. Преиммунизация основана на явлении “интерференции”, когда организм зараженный слабым штаммом приобретает устойчивость к вторичному инфицированию сильным штаммом того же возбудителя. Этот метод апробирован для защиты цитрусовых от вируса тристецы и какао от возбудителя деформации побегов. Однако его применение связано с определенным риском, так как сохраняется опасность мутации штаммов в более вредоносные патотипы. Более того, при смешанных инфекциях, например при поражениях томатов ВМТо и Х-вирусом картофеля, возможно усиление вредоносности за счет синергизма сочленов комплекса. 9 5 Важно иметь в виду, что стратегия защиты растений в каждом конкретном регионе определяется такими важнейшими факторами, как состав патологических комплексов, структура популяций возбудителей и их изменчивость во времени, поскольку в условиях антропогенного пресса их показатели (динамика распространения, патогенность и др.) количественно и качественно меняются. Наблюдается формирование новых паразитарных комплексов. Стимулируется развитие видов и особей, обладающих свойствами большей пластичности и адаптивности, реализации которых способствуют состав флоры биоценозов, наличие источников инфекции. Вирусы, вироиды и фитоплазмы, как облигатные паразиты, настолько тесно связаны с растением-хозяином, что уничтожение большинства из них становится возможным только вместе с гибелью инфицированных ими клеток. Поэтому основными защитными мероприятиями, применяемыми в борьбе против этих групп патогенов, являются профилактические, которые или препятствуют заражению, или ограничивают развитие инфекции до уровня, не приносящего экономически значимых потерь для сельскохозяйственных культур. Болезни злаковых культур Несмотря на многочисленность возбудителей, обнаруживаемых на злаковых растениях в каждом конкретном регионе, экономическое значение имеют, как правило, лишь доминирующие и трансмиссивные формы, что связано со специфическими условиями их сохранения и циркуляции. В частности, необходимо учитывать условия, которые способствуют (или, наоборот, препятствуют) распространению инфекции, например, определяемые трофическими особенностями векторов. Так, из 23 зарегистрированных видов тлей-переносчиков вируса карликовости кукурузы, только 7 используют ее в качестве кормового растения. Следовательно, возможность участия остальных видов в циркуляции возбудителя зависит от наличия в регионе их кормовых хозяев среди представителей сорной и культурной растительности. Как видно из табл. 11, целый ряд заболеваний имеет сходные симптомы, например, по такому признаку, как полосчатая мозаика на листьях. Поэтому для объективного диагноза необходимо привлекать, кроме визуальных, и другие его методы – серологические, индикаторные и др. 9 6 Т а б л и ц а 11 Основные болезни злаковых культур Возбудитель Вирус мозаики озимой пшеницы Вирус полосатой мозаики пшеницы Вирус желтой карликовости ячменя Симптомы* Переносчики Вирусы Psammotettix striatus, Macrosteles laevis ПМ, Х, Aceria tulipae, A. ЗР,СК tritici, A. tossichella Хозяева М, Р, ЗР, Ячмень, вейник овес, просо, рожь, мышей Культурные и дикие злаки ПЛ, ЗР, Rhopalosiphum К maidis, Macrosiphum granarium М, Н Не известны, передается через семена ПМ, К, Myzus persicae, и ДМ др. более 30 видов Ячмень, пшеница, кукуруза, овес, рис, дикие злаки Вирус штриховатой мозаики ячменя Вирус карликовой мозаики кукурузы Вирус мозаики КП, ПМ костра Вирус штриховатости риса Голубой карликовости Желтой карликовости риса Ячмень, пшеница, овес, реже дикие злаки Кукуруза, сорго, гумай, сахарный тростник, суданская трава, Xiphinema coxi, X. Культурные и рaraelongatum, дикие злаки жуки Diabrotica sp., клещи Aceria tulipae КП, СМ, Lаodelphax Дикие злаки К striatellus Фитоплазмы РЦ, К, Возможно, СК цикадки Macrosteles laevis ЗР, Х, К Nephotettix apicalis, N.impicticeps 9 7 Пшеница, овес Рис Продолжение т а б л и ц ы 11 Задержки роста ЗР, К, Х кукурузы Закукливания злаков Dalbulus maidis, D. Elimetus L. striatellus К, ЗР, Х Кукуруза Культурные и дикие злаки * М – мозаика, Р – розеточность, ЗР – задержка роста, ПЛ – пожелтение (покраснение) листьев, К – кустистость, ПМ – полосчатая мозаика, хлороз, Н – некрозы, СК – стерильность колоса, СМ – стерильность метелки, КП - крапчатая пятнистость, ДМ – деформация метелок, РЦ – реверсия цветков. Кроме указанных, в настоящее время на зерновых культурах зарегистрирован целый ряд потенциально опасных возбудителей, таких как: вирус огуречной мозаики, вирус мозаики резухи, вирус желтой мозаики фасоли и др. Меры борьбы. Для снижения ущерба от возбудителей вирусной и фитоплазменной природы используют приемы, повышающие сопротивляемость растений заболеваниям: оптимальные сроки высева культуры и высокий агрофон при ее выращивании, проведение фитосанитарных мероприятий на полях (уничтожение падалицы и сорняков как резерваторов инфекции и кормовых хозяев для переносчиков, соблюдение севооборотов, использование здорового семенного материала против возбудителей, передающихся через семена, соблюдение пространственной изоляции от других посевов злаковых и многолетних трав (не менее 500 м). Использование устойчивых сортов. Найдено, что выведение и внедрение таких сортов относится к эффективным и экономически выгодным методам борьбы с вирусами и их переносчиками. Например, межродовые гибриды пшеницы: пшенично-пырейные и пшенично-элимусные (ПЭГ–691, ПЭГ-686 и др.) показали высокую устойчивость к комплексу вредоносных возбудителей, таких как вирус мозаики костра, отличающийся высокой стабильностью и контагиозностью, и передающийся с семенами вирус штриховатой мозаики ячменя. Химическая защита посевов от переносчиков до начала их миграции. 9 8 Болезни зернобобовых культур Вирусные и фитоплазменные болезни занимают среди других патогенов основное место по экономическому ущербу, причиняемому зернобобовым культурам. В различных регионах мира выявлено более 20 возбудителей этой группы (табл. 12). Отмечается достаточно высокая степень поражения посевов (до 8090%). Продуктивность заболевших растений по сравнению со здоровыми резко падает: на 30-90% снижается число формирующихся бобов, на 50-80% - масса семян и на 20-50% - их количество. Под влиянием инфекции ухудшается качество семян за счет снижения содержания на 12-20% белка и на 2-3% жира. Специфической особенностью большинства вирусов, поражающих бобовые растения, является их способность передаваться с семенами, а некоторых и через пыльцу (обыкновенная мозаика и южная мозаика фасоли). Поэтому роль семенной инфекции в эпидемиологии у бобовых культур весьма велика, поскольку даже незначительное число больных растений в поле, появляющихся сразу после посева, создает первичный очаг, с которого с помощью переносчиков возбудители передаются здоровым растениям. Зарегистрированные на них фитоплазмы, в частности широко распространенный в разных регионах возбудитель позеленения лепестков (филлодия) клевера, этими способами не переносятся. Кроме отмеченных в таблице возбудителей, на зернобовых культурах встречаются вирус кольцевой пятнистости табака, вирус задержки роста сои, вирус крапчатости бобов, вирус огуречной мозаики, вирус некроза табака, вирус мозаики табака, вирус карликовости сои и др., имеющие меньшее экономическое значение. Т а б л и ц а 12 Вирусные и микоплазменные болезни зернобобовых Возбудитель Симптомы* Вирус мозаики арахиса ПМ, ПЖ, Х Переносчики Вирусы M. persicae, A. craccivora, Rh. maidis, Orosius argentata 9 9 Хозяева Арахис Продолжение т а б л и ц ы 12 Вирус желтой мозаики фасоли КЛ, П, Д, М, НЛ, В Ac. рisum, A.fabae, M. persicae, Macrosiphum euphorbiae, Brachycaudus helichrysi A. fabae, A. rhamni, A. laburni, A. gossypii, и др. Вирус мозаики люцерны М, ДЛ, ЗР, К, ПЖ, Н Вирус мозаики сои М. ДЛ, В, ЗР Aphis glycines, A. craccivora, A laburni, A.fabae, A.frangulae, A. medicaginis, Ac.рisum, Aulacorthum solani Вирус обыкновенной мозаики фасоли М, ПЖ, ДЛ, “Ведьминой метлы” (карликовости) люцерны ИЛ, РЦ, К, И Acyrthosiphon pisum, Aphis fabae, A. laburni, A.medicaginis, A.craccivora, Myzus persicae, Cavariella aegopodii и др. Фитоплазмы Orosius argentatus, Platymoides acutus, Cyamophyla medicaginis 1 0 0 Виды Fabaceae, Lathyrus sp., Chenopodium sp., Gladiolus sp., Papaver somniferum более 200 видов из 47 сем-в, в том числе люцерна, картофель, перец, томаты, горох, арахис и др. Свыше 100 видов, в том числе соя, Ph. vulgaris, Vicia faba, Vigna sinensis, Lupinus sp. Виды Fabaceae, Chenopodium, Nicotiana, Cucumis sativus и др. Люцерна, клевер, вигна, фасоль, арахис, бобы и др. Продолжение т а б л и ц ы 12 Филлодии клевера ЗР, К, РЦ, ИЛ Aphrodes bicinctus, Клевер, Stellaria A. albifrons media, Xanthium spinosum, Cichorium intybus, Convolvulus arvensis, L. odoratus, Plantago major, Taraxacum officinale * ПЖ - посветление жилок, ДЛ – деформация листьев, Н – некрозы, НЛ– нитевидность листьев, В – вздутия на листовой пластинке, КЛ – крапчатость листьев, ИЛ – измельчение листьев, И – израстание, К - кустистость. Меры борьбы. Ощутимый ущерб, наносимый вирусами и фитоплазмами, предполагает включение в технологию возделывания зернобобовых культур элементов защиты от них. Выбор приемов определяется биологическими свойствами возбудителя, вектора и самого растения. Их подразделяют на профилактические и терапевтические. Организация защитных мероприятий предполагает три основных направления: получение здорового семенного материала, использование сортов, устойчивых к вирусам и их переносчикам, и профилактическая защита посевов от переносчиков. Известно, что переносчики обеспечивают возбудителям устойчивую циркуляцию в естественных условиях, которая в значительной степени определяет уровень распространения заболеваний и возможность сохранения инфекции, ее накопление на промежуточных хозяевах. Поэтому возделывание устойчивых сортов, в частности, к переносчикам, ограничивает эти процессы. Особенно перспективным представляется выведение и использование сортов, не передающих инфекцию через семена. Не меньшее значение в противовирусной защите имеет производство здорового посевного материала. На первом технологическом этапе проводят калибровку семян по величине и форме, обладающих повышенной биологичекой активностью, с учетом сортовых особенностей. При появлении всходов после посева проводят визуальный контроль и удаляют растения с 1 0 1 признаками болезни. Оставшиеся - проверяют на скрытое заражение с помощью диагностических сывороток. Собранные семена используют для закладки посевов 1-го года в питомнике, где также проводят указанный контроль и браковку. В качестве терапевтического метода оздоровления отдельных партий семян от лабильных мозаичных вирусов (вирус мозаики люцерны, вирус мозаики арахиса) рекомендуется их прогревание при 70-80С в течение 1-2 часов. В результате зараженность семян по сравнению с контролем снижается на 21-100%. При их использовании урожай возростает на 0,06- 0,23 т/га. Особое место в современных системах защиты занимает химическая борьба с переносчиками. Для обоснования выбора технологической схемы обработок необходимо обладать информацией об их видовом составе, характере взаимодействия с возбудителями и кормовыми растениями. На раннем этапе развития в целях защиты растений от переносчиков семена перед посевами опудривают инсектицидами (сайфос, дисистон и др.). Однако наиболее эффективной остается обработка посевов внутрирастительными инсектицидами в период вегетации. Поэтому для планирования таких мероприятий необходимо знать динамику развития доминирующих в конкретной местности видов, сроки миграции, круг их кормовых растений. Целесообразно первую обработку проводить до массового лета переносчиков, т.е. при попадании в ловушки маркерных видов, начинающих миграцию на 3-5 дней раньше других. Показана высокая эффективность краевых и выборочных (в очагах) обработок. Не меньшее влияние на интенсивность распространения инфекции оказывают и некоторые технологические приемы выращивания. Так, показано, что при ранних сроках посева соя слабее поражается мозаичными вирусами, чем при поздних. Это объясняется тем, что в этом случае восприимчивый период развития растений (фаза цветения - начало образования бобов) проходит до массового размножения и миграции переносчиков. Семенные участки рекомендуется пространственно удалять (не менее 1 км) от посевов бобовых культур, особенно многолетних (клевера, люцерны, донника), свеклы, табака и других, являющихся кормовыми растениями для переносчиков и резерваторами для многих возбудителей. С этих позиций важное значение имеет регулярное уничтожение сорной растительности, включая обочины полей. 1 0 2 Указанные приемы требуют существенной корректировки в связи использованием интенсивных технологий в конкретных экологических условиях. Болезни картофеля Картофель относится к важнейшим сельскохозяйственным культурам. Роль его в решении мировой продовольственной проблемы очень велика из-за высокой потребительской и питательной ценности. Однако значительные потери урожая картофеля, которые вызывают различные вирусы, вироиды и фитоплазмы, могут достигать 60-90%. Реакция сортов картофеля на инфицирование не одинакова, несмотря на то, что практически все они при заражении снижают урожай и крахмалистость клубней. Большинство современных сортов относятся к толерантным, являясь скрытыми носителями инфекции, которая способна активизироваться при неблагоприятных условиях выращивания и вызывать существенное снижение продуктивности растений. При этом многие заболевания картофеля проявляются визуально обычно в виде разнообразных мозаик, деформаций, хлорозов, угнетения роста, отмирания отдельных участков тканей и целых органов. Еще большая дифференциация наблюдается при поражениях разными возбудителями. Так, падение продуктивности при поражениях растений вирусом X картофеля обычно составляет 21-23%, достигая на сорте Ора 30,8%, вирус М картофеля снижал урожай в зависимости от сорта на 28,7- 41,7%. При комплексных поражениях потери резко возрастают. У растений, пораженных одновременно Х и М-вирусами, продуктивность снижается на 53,5-60,8%, а Х, М и Увирусами – на 83,7%, т.е. они практически не дают урожая. Обнаруженные на картофеле многочисленные возбудители легко распространяются с клубнями, а вироид веретеновидности, вирус Т картофеля и андийский латентный вирус картофеля - еще и через семена. Имеется сообщение о передаче вироида веретеновидности клубней пыльцой. В настоящее время только число идентифицированных вирусов, поражающих культуру, достигает двух десятков (табл. 13). Поэтому при отсутствии надлежащего контроля, а также при использовании «случайного» посадочного материала происходит их накопление, в том числе наиболее вредоносных комплексных инфекций. 1 0 3 Т а б л и ц а 13 Вирусные, вироидные и микоплазменные болезни картофеля Возбудитель М- вирус S-вирус Y-вирус L-вирус Симпт о-мы* Переносчики Хозяева Вирусы СЛ, Д, Mysodes persicae, Более 20 видов ММ, Macrosiphum КЛ, Н solanifolii Physalis glabripes, Vicia cracca, Mentha dahurica, Certemisia manshurica, Equisetum arvense, Conv. arvensis, P. major, Thlaspi arvense, M. persicae, Barbarea orthoceras, М, ДЛ Aphis nasturtii, Matricaria inodora, Aulacоrthum solani Humulus japonicus, Galeopsis bifida, Solanum nigrum, Ch. album, Commelina communis, Impatiens nolitangere, Ambrosia artemisiifolia М, A. nasturtii, A. Н,ПЖ, fabae, Au.solani, более 160 видов ДЛ M.persicae и др. Lupinus luteus, Impatiens balsamina, Huoscyamus niger, Sonchus arvense, A.fabae, Au. solani Solanum ДЛ, Х, M.persicae, Lygus acanthoideum, S. АО pratense, Epilachna mauritianum, Sirsium vigintioctomaculata arvense, Am. lividus, Cotyledon barbeyi, Ranunculus arvensis, R.repens, Melandrium album 1 0 4 Продолжение т а б л и ц ы 13 Вироиды Веретеновидности клубней ДЛ, Н, Разные виды тлей, ВК Disonycha triangularis, Epithrix cucumeris, Systena elongata, Leptinotarsa decemliniata, Lygus pratense Картофель, томаты, петуния, табак, цитрусовые, Scopolia sinensis Х, СЛ, H.obsoletus, АО, К, H.mlokosieviczi, Aphrodes bicinctus, Euscelis plebejus, M.laevis К, И, Возможно ИЛ, псиллиды Картофель, томаты, цикорий, кресскрупка, вьюнок, бодяк Фитоплазмы Столбурного увядание Круглолистности Картофель * СЛ – скручивание листьев, ММ – межжилковая мозаика, КЛ крапчатость листьев, АО – антоциановая окраска, Н – некрозы, ВК – веретеновидность клубней, И – израстание, ИЛ – измельчение листьев. Кроме возбудителей, отмеченных в табл. 13, на картофеле зарегистрированы вирус мозаики люцерны, вирусы А, R и F картофеля, табачной мозаики, черной кольцевой пятнистости томатов, раттл-вирус табака и вирус пятнистого увядания томата и многие другие. Меры борьбы. Современная система защиты картофеля от вирусных, вироидных и фитоплазменных болезней складывается из следующих основных элементов: выведение устойчивых сортов, оздоровление растений от возбудителей и получаемого от них посадочного материала, их ускоренное размножение, защита семеноводческих посадок от нового заражения с помощью переносчиков. В настоящее время известны следующие методы оздоровления: термотерапия, регенерация растений из верхушечных меристем, использование химиотерапии, получение трансгенных устойчивых форм методами генной инженерии, которые получили широкое распространение именно на картофеле. Комплекс методов 1 0 5 борьбы с переносчиками вирусов картофеля включает химический и биологический методы, агротехнические и фитосанитарные мероприятия. Только картофельные вирусы переносятся более 30 различными видами тлей (табл. 14). Последние являются важным звеном в их циркуляции и в значительной мере определяют интенсивность распространения и развития заболеваний, а следовательно, и выбор защитных мероприятий. Т а б л и ц а 14 Динамика лета некоторых видов тлей на картофеле (Тульская обл. Богословское, 1999 г.) Май Июнь Июль Август Сентябрь Декады Вид 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 2 3 Myzodes persicae - - - + + + + + + + - - - - - Aphis fabae - - - + + + + + + + + + - - - A.pomi - - - - + + + + + + + + + + + A. gossypii - - - - - + + + + + - - - - - A. nasturtii A. frangulae Brevycoryne brassicae Aulacorthutum solani Macrosiphum solanifolii Cryptomyzus ribis Amphorophora rubi Rhopalosiphum padi Phorodon cannabis - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - + + + + + + + - - - - - - - - - - - + + + + - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - - - - + + + + - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - + + + + - - - - Всего: 0 0 0 3 7 8 9 11 13 12 10 6 1 1 1 1 0 6 1 Например, число и сроки пестицидных обработок зависят от количества поколений и начала миграции. Активность переноса определяется биологическими особенностями переносчиков (тлей, цикадок, нематод): скоростью их размножения, подвижностью при миграции и чередованием кормовых растений-хозяев, строением ротовых органов и характером питания. Известно, что многие виды сорных растений, служащие кормовыми хозяевами для насекомых- переносчиков, являются очагами и переносимой ими инфекции. Поэтому целесообразно размещать посадки картофеля, его семеноводческие участки в пространственной изоляции (на расстоянии не менее 500 м) от других насаждений пасленовых, овощных и плодовых культур, приусадебных участков, по предшественникам (однолетние и многолетние травы, озимые зерновые и зернобобовые), которые ограничивают их развитие. С другой стороны, нарушение агротехники возделывания картофеля, когда эта культура длительное время выращивается на одних и тех же землях, а семенные участки соседствуют с производственными посадками и огородами, которые зачастую являются очагами инфекции, приводит к быстрому перезаражению вновь завозимого семенного материала. Болезни овощных и бахчевых культур На овощных культурах зарегистрировано значительное число вирусных и фитоплазменных инфекций как в открытом, так и закрытом грунте, которые отличаются большой вредоносностью (табл. 15). Так, на томатах, особенно в южных районах, распространено такое заболевание, как стрик, вызываемое комплексной инфекцией (ВТМ, Х- и У-вирус картофеля, ВОМ и раттл-вирус в различных сочетаниях), массовое развитие которого определяется наличием очагов среди сорной и дикорастущей растительности и численностью переносчиков. Вирус мозаики огурца (ВОМ) широко распространен во всем мире, преимущественно в районах с умеренным климатом. Зарегистрирован на многих овощных, технических, плодовых, цитрусовых и цветочных культурах, сорных и других растениях. Меры борьбы. Практически все вирусные фитоплазменные заболевания, обнаруженные на овощных и бахчевых культурах, передаются с посадочным и некоторые с семенным материалом. При бесконтрольном его размножении интенсивность распространения возбудителей может стать выше, чем в естественных условиях. 1 0 7 Оздоровление пораженных растений или инактивация возбудителей in vivo невозможны. Поэтому борьба с заболеваниями определяется, в первую очередь, мерами профилактики. Кроме того, чтобы получить здоровые растения и сохранить в таком состоянии в течение всего времени их эксплуатации, ограничить убытки, обусловленные инфекцией, обычно необходим целый комплекс различных мероприятий. Так, для предупреждения заноса возбудителей из других регионов особенно при интродукции новых видов растений следует соблюдать карантинные меры. Отбор и получение оздоровленного посадочного материала основа для создания здоровых насаждений. Защите от инфекций служат все мероприятия по ликвидации источников заражения, применения всех известных способов, препятствующих ее распространению, отбор культивируемых видов и сортов, устойчивых или толерантных. К профилактическим мероприятиям можно отнести весь комплекс приемов, предупреждающих (или ограничивающих) распространение возбудителей заболеваний, создание таких условий для вегетации растений, при которых болезнь не развивается: это своевременная посадка в оптимальные сроки; соблюдение оптимальных расстояний между растениями; квалифицированный уход; соответствующая для данной культуры норма внесения удобрений; правильный выбор участка, соблюдение севооборота, плодосмена и пространственной изоляции от источников инфекции; борьба с сорняками в междурядьях и на обочинах - резерваторами многих возбудителей и местами обитания переносчиков; удаление с плантаций больных растений и растительных остатков после вегетации; борьба с переносчиками особенно до начала их миграции на поля (особенно тщательно пестицидами обрабатываются обочины). Т а б л и ц а 15 Основные болезни овощных и бахчевых культур Возбудитель Вирус огуречной мозаики Вирус мозаики лука Симптомы* Переносчики Хозяева Вирусы М, ДЛ, Различные виды Sysymbrium officinale, ЗР тлей Medicago sp., Cirsium sp. ПМ, Aceria tulipae Лук ДЛ 1 0 8 Продолжение т а б л и ц ы 15 Вирус некроза табака Вирус бронзовости томатов Вирус аспермии томатов Вирус мозаики свеклы ЗР, М, Грибы Olpidium Х Огурцы, картофель, фасоль, и др. БП, БК, ЗР Около 200 видов из более 40 сем-в Вирус табачной мозаики М, ШЛ, НЛ, НП, ЗР М, ПЖ Вирус мозаики цветной капусты Столбура Thrips tabaci ПЖ, К, Различные ДЛ, Н тлей М, СЛ виды Томаты, огурцы, виды табака и др. Myzus persicae, Свекла, Chenopodium Macrosiphum sp. euphorbiae, Aphis fabae Не выявлен Свыше 500 видов Brevicorine brassicae Виды капусты, редис и Barbarea sp. Фитоплазмы Х, НЛ, H.obsoletus, Томаты, перец, АО, H.mlokosieviczi, баклажаны и многие РЦ Aphrodes bicinctus, виды сорняков, Euscelis plebejus, M.laevis * ШЛ – штриховатость листьев, НП – внутренний некроз плодов, БП – бурая пятнистость, БК – бурые кольца, К – карликовость, ДЛ – деформация листьев. Необходимым условием, обеспечивающим эффективность указанных мероприятий, является проведение их на основе информации о путях циркуляции и механизмах передачи возбудителей, которая касается трех этапов: это - сведения о функционировании и поведении возбудителей и их векторов вне растения, особенностях их развития и способностях к инфицированию новых организмов. 1 0 9 Особое внимание следует обратить на возбудителей, имеющих природную очаговость (NЕРО-группа, ВОМ и др.). Поскольку полностью искоренить природные очаги болезней не удается, то применяются меры для защиты растений от попадания инфекции на вновь закладываемые плантации, с использоваем приемов агротехники, борьбы с переносчиками, возделывание устойчивых сортов. Профилактика болезней, не связанных с природными очагами, сводится к ограничению возможности передачи инфекции с семенным и посадочным материалом (особенно это касается луковичных и клубнелуковичных растений). Для высадки используют более жизненный посадочный материал, например более крупные луковицы, поскольку от пораженных растений они зачастую мелкие. Для посева необходимо использовать здоровые семена. От поверхностной инфекции рекомендуется их обеззараживание 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия в течение 30 мин или 20% HCl с последующей промывкой в проточной воде. В ряде случаев их фракционируют в 5% растворе NaCl по удельному весу, что способствует выбраковке щуплых семян, инфицированных ВТМ и Х–вирусом картофеля. Современная технология получения оздоровленного посадочного материала включает в себя выделение - отбор здоровых исходных растений путем тестирования (методом индексации, серологически и др.). В случае отсутствия исходных здоровых растений используют ряд методов для их получения. К ним относятся: термотерапия; выращивание апикальных меристем на искусственных питательных средах, подавление инфекции с помощью химических веществ - ингибиторов, способных подавлять репродукцию возбудителей в живом растении. К ним относятся, в частности, антивирусные соединения - производные пурина и пиримидина, особенно 2-тиоурацила и 8-азогуанина, которые способны встраиваться непосредственно в вирусные частицы, лишая их возможности к дальнейшей репродукции. При использовании любого метода за растениями ведется непрерывный контроль и тестирование на наличие инфекции. В случае выявления больных растений их отбраковывают. Надо отметить, что ни один из методов не дает полного оздоровления, поэтому очень важно использовать их в комплексе. Так, применение культуры апикальной меристемы в сочетании с хемотерапией или термотерапии с хемотерапией и культурой меристемы значительно повышает число эксплантов, свободных от возбудителей. 1 1 0 На практике применяют два типа тепловой обработки, которые обусловлены разным физиологическим состоянием возбудителя и растения-хозяина. При первом типе обрабатывают покоящиеся стадии растений (клубни, луковицы, черенки, семена). Успешные результаты зависят от того, насколько температурный порог устойчивости клеток растения отличен от температуры инактивации возбудителя. Обычно рекомендуется прогрев при температуре от 35 до 54С и время обработки от нескольких минут до нескольких часов. В качестве теплоносителя используют горячую воду или воздух. В последнее время стали чаще применять нагревание воздухом, поскольку оно меньше повреждает растения. При втором типе проводят тепловую обработку активно растущих растений. Растения содержат от 2 нед. до 8-12 мес. в изолированных камерах с контролируемым освещением и влажностью при температуре 35-40С. Точный механизм действия термотерапии недостаточно изучен, но косвенные доказательства указывают на то, что нарушается соотношение между синтезом и разрушением вирусов в клетке растения. Существуют различные способы повышения устойчивости к вирусам, вироидам и фитоплазмам за счет регуляции их взаимоотношений с растением. В настоящее время известно два таких способа: преиммунизация (“вакцинация”) - инфицирование растений слабопатогенными штаммами возбудителей или индукция устойчивости к ним с помощью биологически активных веществ. Так, в тепличных условиях для снижения потерь от вируса табачной мозаики предложен метод искусственного заражения возделываемых сортов томата на самых ранних фазах их развития его слабопатогенными штаммами, в частности S7 и V-69. Показано, что после такой обработки растения предохраняются от инфицирования сильнопатогенными формами вируса, заболевание протекает в легкой форме, в результате чего удается получить от 15 до 30% дополнительного урожая. Имеется предположение, что интерфероноподобная противовирусная реакция у растений связана с деятельностью их фитогормональной и других регуляторных систем. Определенный интерес представляет использование некоторых препаратов, например, иманина, полученного из растений зверобоя обыкновенного (Hypericum perforatum), способных ингибировать репродукцию вирусов. Против заболеваний, вызванных неповирусами, в систему защитных мероприятий добавляются операции для борьбы с 1 1 1 нематодами. В него включаются истребительные, лечебнопрофилактические, организационно-хозяйственные и агротехнические мероприятия. Наиболее эффективными являются химические меры борьбы - фумигация почвы и внесение нематицидов. Из фумигантов к наиболее эффективным относится ДД, а также Ди-трапекс, карбатион, тиазон (диазомет), 1,3дихлорпропен, дибромэтан, телон, метибромид, немагон, хлорпикрин и некоторые другие. Среди гранулированных нематицидов системного действия хорошо себя зарекомендовали темик, немафос, немакур П, видат, ланнейт, гетерофос в сочетании с дазометом и другие. Известно проявление нематоцидного действия и некоторыми фунгицидами, например, отмечено, что беномил (бенлат) способен подавлять размножение нематод и снижать их вредоносность. Следует отметить, что на сегодняшний день применение препаратов нематоцидного действия достаточно дорогостоящее мероприятие и его рекомендуют для закрытого грунта и маточных участков. Поэтому весьма перспективным для защиты от нематод-переносчиков следует считать использование устойчивых сортов и видов растений. В результате широких испытаний уже выделены и рекомендованы производству целый ряд сортов, устойчивых, например к вирусу мозаики арбуза, томатов, к возбудителю внутреннего некроза плодов и др. Болезни плодовых, ягодных культур и винограда Известно, что при инфицировании плодовых и ягодных культур широко и повсеместно распространенными вирусами, вироидами и фитоплазмами их продуктивность падает на 3-4%, а на восприимчивых сортах - на 70-90% (табл. 16). Часто наблюдается гибель ослабленных инфекцией растений под действием вторичных факторов, в частности, после повреждений морозами, при недостатке влаги и высокой температуре. Существенной особенностью возбудителей, поражающих плодовые и ягодные культуры, является большая (около 9 мес. до нескольких лет) продолжительность бессимптомного периода после первичного инфицирования, хроническая форма заболевания и неспособность в естественных условиях переноситься механическим путем при контактах больного и здорового растений. Распространение инфекции происходит в основном при вегетативном размножении, случайном срастании, с помощью переносчиков и реже - с семенами (около 10) и пыльцой (5 1 1 2 возбудителей). Это создает определенные диагностические трудности для контроля за состоянием плантаций, выявления и отбора здоровых маточных образцов для размножения. Характер географического распределения возбудителей отличается неравномерностью, что определяется условиями развития и миграционной активностью переносчиков, наличием восприимчивых видов, сортов, а также системой фитосанитарных мероприятий, проводимых в конкретных регионах. Характерной особенностью многолетних растений является то, что для них свойственны поражения комплексными инфекциями. Например, в растениях винограда одновременно могут присутствовать вирусы короткоузлия, черной кольцевой пятнистости томатов и резухи. Фитоплазме каменистости плодов, вызывающей на абрикосе хлоротическое скручивание листьев, часто сопутствует вирус мозаики резухи. Т а б л и ц а 16 Вирусные, вироидные и микоплазменные болезни плодовых и ягодных культур Возбудитель Симптомы* Вирус мозаики яблони Вирус бороздчатости ствола Вирус оспы слив М, ПЖ Вирус крапчатости листьев малины ЗР, ЯВ Переносчики Вирусы Х, Не устновлен Не известен Хозяева Виды Malus Виды Malus, Pyrus, Cydonia, Nicotiana, Phaseolus КО, ЛУ, Myzus persicae, Виды Prunus, Pisum, БК, Aphis gossipii, Nicotiana A. spiraecola, A. fabae, Phorodon humuli, Brachycaudus cardui К, КП, Aphis idaei Виды Rubus ДЛ 1 1 3 Продолжение т а б л и ц ы 16 Вирус хлороза жилок Вирус кольцевой пятнистости малины Вирус короткоузлия винограда ПЖ КО, Э Aphis idaei Виды Rubus Amphorophora rubi Longidorus Более 50 видов elongatus СЛ, ИЛ, Xiphinema index АО, Э Виноград, виды Chenopodium sp., Cucumis sp., Nicotiana sp. и др. Вироиды КарликоПП вости хмеля РастрескивРП ания плодов яблони Ямчатости Н, ЯП плодов Пролиферации яблони Абрикос, миндаль, груша, персик, слива Яблоня, груша Яблоня Фитоплазмы И, ИЛ, Не известен СЛ, Х Виды Malus, Cidonia, Catharanthus roseus Каменистости СЛ, ИП Не устновлен плодов Поникания СЛ, АО Cacopsylla pyri ветвей БЖ, ЗР, ПФ, ИП Груша, абрикос, айва Реверсии смородины Израстания малины Позеленения лепестков земляники Виды Pyrus, Malus РЦ, К Phytoptus ribis Виды Ribes И, РЦ, Macropsis fuscula Aphrodes bicinctus Виды Rubus К, РЦ 1 1 4 Виды Trifolium, cicutarium Fragaria, Erodium * Э – энации на жилках листьев, ИЛ – изреживание листьев, И – израстание (пролиферация), ПВ – поникание (гутаперчевость) ветвей, БЖ – побурение крупных жилок, ПФ – побурение и некроз флоэмы, ЯВ - ямчатость ветвей и ствола, ИП – измельчение плодов, ПП – пятнистость плодов, РП – растрескивание плодов, ЯП ямчатость плодов, КО – кольцевая пятнистость, ЛУ – линейный узор. Визуальная диагностика не всегда дает ответ о видовой принадлежности возбудителя, вследствие сходства некоторых призаков поражения. Например, на косточковых культурах часто встречаются болезни, отдельные симптомы которых идентичны вызываемым вирусом оспы слив (шарка). Поэтому в сомнительных случаях и при идентификации возбудителей необходимо проводить дополнительную экспертизу с использованием растенийиндикаторов, электронной микроскопии, серологических методов и т.д. Для выявления поражений фитоплазмами предложен чувствительный и специфический метод ПЦР-диагноза. Уже подобраны и апробированы праймеры, обладающие групповой и видовой специфичностью ко многим возбудителям. В частности, с помощью пары праймеров fAT/rPRUS эффективно выявляется фитоплазма каменистости плодов, а при использовании R16F/R2, fU5/rU3 или f01/r01 - поникания ветвей. Последняя, как показал анализ, принадлежит к группе желтухи астр. Некоторые возбудители этой группы не получили широкого распространения вследствие недостаточной адаптивной способности. Например, ослабленные растения земляники, пораженные фитоплазмой, вызывающей позеленение лепестков, не способны переносить низкие температуры и отмирают в течение зимы, самоуничтожая тем самым источники инфекции. Значительное место по площади и численности занимают возбудители, которые кроме основного растения-хозяина способны поражать широкий круг видов среди плодовых и ягодных, разнообразных представителей овощных, технических и декоративных растений: вирус мозаики резухи, вирус огуречной мозаики, вирус мозаики табака. Сюда входят как культурные, так и дикие виды, встречаемые в природе. К возбудителям с относительно узкой специализацией можно отнести большинство фитоплазм, вирус мозаики яблони и др. Меры борьбы. Все вирусные, вироидные и фитоплазменные болезни, обнаруженные на плодовых и ягодных растениях, 1 1 5 передаются с посадочным материалом при вегетативном размножении. Поэтому все системы защиты насаждений от возбудителей этой группы предусматривают выпуск оздоровленных саженцев. Различные агроприемы (внекорневые подкормки микроэлементами, химическая борьба с переносчиками и др.) способны лишь снижать потери от болезней, приводить к кратковременной маскировке внешних симптомов, ограничивать скорость распространения возбудителей, но не вылечивать пораженное растение. Системы производства посадочного материала предусматривают этапы оздоровления вегетативного и семенного материала от возбудителей и различных стадий переносчиков. Для этого применяют методы термо- и химиотерапии, приемы зеленого черенкования, в частности, на смородине от почкового клеща и малине от цикадки Macropsis fuscula. Выбор технологических приемов определяется видовым составом экономически значимых для региона возбудителей и векторов, а также фитосанитарным состоянием насаждений. Например, при большой численности в почве нематод – переносчиков из родов Longidorus, Xiphinema и Trichodorus проводится ее предпосадочная дезинфекция с применением нематоцидов. Отобранные внешне здоровые растения подвергаются индикаторному анализу для выявления скрытой инфекции и, если необходимо, термическому обеззараживанию. Наилучшие результаты по оздоровлению вегетативного материала получаются при суховоздушном способе термообработки, который дифференцируется в зависимости от сорта и вида обеззараживаемого растения, его состояния, условий выращивания и свойств поражающего его возбудителя. Например, после выдерживания растений малины при температуре 36-38ºС, большинство образующихся в этот период побегов (до 60%) освобождались от мозаичных возбудителей. Максимум выхода здоровых побегов совпадает по времени с их интенсивным ростом, который стимулируется повышенной температурой. Показана возможность обеззараживания верхушек побегов яблони от вироида растрескивания плодов после прогревания растений в течение 70 дней при 38ºС. В настоящее время используются термокамеры, позволяющие понижать температуру прикорневой зоны, что обеспечивает лучшее выживание растений, подвергающихся обработке, и их побегообразование. Побеги, сформировавшиеся в процессе термообработки, отделяют, укореняют и высаживают в 1 1 6 профумигированную почву. После индексации те из них, которые не проявили признаков поражения, переводятся в категорию суперэлиты и используются для размножения. Растения высаживаются на изолированном участке в предварительно обеззараженную почву. Суперэлитные маточные растения ежегодно обновляются (ягодные культуры – на 30-40%, плодовые – на 1020%). Вводятся новые сорта, более продуктивные клоны. В целях профилактики от повторных заражений, кроме периодических химических обработок инсектицидами и акарицидами, суперэлитные растения выращиваются в специальных групповых изоляторах из капрона, марли и других материалов, исключающих занос инфекции с помощью переносчиков. Размноженная элита передается в специализированные питомники для репродукции. Обязательным условием является профилактическая защита насаждений от переносчиков. Питомники целесообразно пространственно удалять (на 1,5-2 км) от промышленных плантаций. Календарные планы химобработок составляются на основании данных об особенностях развития их в конкретном регионе, сведениях о начале и длительности периода расселения мигрирующих стадий. Болезни декоративных и цветочных растений Число зарегистрированных вирусов, фитоплазм и вироидов на цветочных и декоративных растениях весьма велико. Так, только возбудителей вирусной природы выявлено более 80. Многие из них способны поражать садовые, овощные и технические культуры. В свою очередь, наряду со специфическими и узкоспециализированными их формами цветочно-декоративные растения часто инфицируются полигостальными возбудителями (табл.17). К ним относятся вирусы табачной и огуречной мозаики, некроза табака, раттл (вирус погремковости табака) и вирус мозаики резухи, У- и S-вирус картофеля и многие др. Такие возбудители сохраняются как в основных, так и в промежуточных растениях-хозяевах. Широко распространены смешанные инфекции, чему способствуют применяемые технологии вегетативного размножения декоративных растений и многочисленные контакты с вирофорными переносчиками в процессе культивирования. Вирусы, идентифицированные на цветочных культурах в составе патокомплексов, могут персистировать как в визуальной, так и в латентной форме. 1 1 7 Т а б л и ц а 17 Трансмиссивные возбудители декоративных растений Возбудитель Симптомы* Вирус мозаики нарцисса Вирус желтой полосатости нарцисса ПМ, ИЛ Вирус желтой мозаики фасоли Вирус мозаики резухи Вирус некроза табака Вирус крапчатости гвоздики Вирус огуречной мозаики Вирус пестролепестности тюльпана КО, ПМ Вирус мозаики фрезии М, ДЦ ПМ, ДЛ ДЛ, ЗР Переносчики Вирус Не установлен Хозяева Более 30 видов из 15 сем-в A.fabae, A.solani, Нарциссы Myzus cerasi, Ac.pisum Macrosiphum rosae, M.euphorbiae, A.fabae, Гладиолус и более 50 M. persicae и др. видов из разных сем-в X.diversicaudatum Более 200 видов Н, ДЛ Зооспоры Olpidium brassicae Около 100 видов из 37 сем-в КЛ, ЛП Не выявлен Гвоздика М, ЛП Около 20 видов Более 100 видов из тлей разных сем-в ЛП,П МДЛ, ЗР A.fabae, A.solani, Тюльпаны, лилии A.gossypii, M.persicae, Mac.euphorbiae, Aul.circumflexum Не установлен Фрезия 1 1 8 Продолжение т а б л и ц ы 17 Вирус погремковости табака Вирус бронзовости томатов К,ЗР, Trichodorus sp., Более 100 видов Н, ДЛ, Paratrichodorus sp. ДЦ Thrips tabaci Около 200 видов из более 40 сем-в Фитоплазмы Желтухи астр М, Х, Macrosteles Астры, хризантемы, ДЛ, К, fascifrons, Agallia цинии и др. из 40 РЦ quandripunctata сем-в A.bicinctus Вироиды Карликовости хризантемы К, ИЛ, Не установлены ИЦ Сем. Compositae * ДЦ – деформация цветков, ЛП – пестролепестность, ИЦ – измельчение цветков. Меры борьбы. Оздоровление декоративных и цветочных культур от поражающих их возбудителей in vivo на сегодняшний день невозможно. Поэтому борьба с ними определяется, в первую очередь, профилактикой. Так, для предупреждения заноса первичной инфекции, особенно новых возбудителей для региона, следует соблюдать карантинные мероприятия. К профилактическим можно отнести весь комплекс приемов, предупреждающих распространение инфекции: оптимальный выбор участка открытого грунта, правильная и своевременная посадка здоровым посадочным материалом, соблюдение рекомендованных схем размещения растений, квалифицированный уход за ними, соответствующая для культуры норма внесения удобрений, соблюдение севооборота, борьба с сорняками, резерваторами инфекции и обработка мест обитания многих переносчиков, химическая борьба с ними до начала периода миграции, удаление (при периодическом осмотре) заболевших растений, послеуборочных остатков с поля. Особое внимание уделяется борьбе с нематодами-переносчиками NEPOвирусов, и, в частности, как наиболее эффективным приемам химическим мерам (предпосадочная фумигация почвы и внесение 1 1 9 нематоцидов в период вегетации растений). Таким образом, очевидно, что профилактика поражений, не связанных с природной инфекцией, сводится к ограничению распространения возбудителей с семенным и посадочным материалом. Современная технология получения здорового материала предусматривает отбор исходных растений без признаков заболеваний, их тестирование на наличие скрытой формы инфекции и, при отсутствии здоровых образцов, применение методов обеззараживания: термотерапии или выращивания апикальных меристем на искусственных питательных средах. В последнем случае часто используют химические вещества ингибиторы репродукции возбудителей (например, для вирусов производные пурина и пиримидина). Применение культуры апикальной меристемы в сочетании с хемотерапией (или термотерапией) значительно повышает число получаемых эксплантов, свободных от инфекции. При термическом обеззараживании растения помещают в термокамеры, где поддерживается температура 37ºС, освещенность 5000 лк, фотопериод 14-18 ч в сутки и относительная влажность воздуха 90%. Продолжительность термотерапии зависит от вида возбудителя и растения. Например, экспозиция обеззараживания гвоздики составляет 10-12 нед. Эти биотехнологические методы весьма удобны и экономичны для оздоровления и быстрого размножения хозяйственно-ценных растений. Для снижения вредоносности заболеваний используют также устойчивые сорта и виды растений. Особую ценность представляют те из них, которые не поражаются комплексом возбудителей и не заселяются переносчиками. Таким образом, оптимальная система защитных мероприятий на современном этапе предполагает формирование таких агроценозов, в частности цветочных, в которых имеется возможность управления механизмами, регулирующими численность вредных организмов. Она включает следующие основные этапы: направленное формирование коллекций, экспозиций, способных ограничивать скорость распространения и непрерывность циркуляции свойственных и «новых» возбудителей и переносчиков; удаление из посадок, коллекций и экспозиций восприимчивых видов и сортов, оздоровление тех из них, которые представляют ценность для генофонда, перевод дублирующих образцов в генные банки; 1 2 0 внедрение системы оздоровления при производстве посадочного и семенного материала (с периодическим тестированием, термо- и химиотерапией, культурой меристемы и т.д.); проведение профилактических мероприятий, предотвращающих распространение инфекции; соблюдение карантинных требований; тщательная выбраковка больных и ослабленных растений в течение вегетационного периода; фитосанитарное тестирование; биологический и химический контроль за развитием переносчиков; введение устойчивых сортов и видов, а также экземпляров с латентной реакцией; - профилактика грибных и бактериальных заболеваний; - борьбу с сорняками как резерваторами инфекции и кормовыми растениями для переносчиков; - введение севооборотов (для однолетних с ежегодной сменой участка и многолетних обычно 1 раз в три года), исключая из них виды растений, являющихся промежуточными хозяевами для возбудителей и их переносчиков. Суммируя изложенное, можно заключить, что выбор приемов интегрированной защиты растений проводится на основе анализа особенностей функционирования системы “возбудительпереносчик-хозяин”. Болезни субтропических и цитрусовых культур Фитоплазменные инфекции (особенно возбудители стабборна и грининга) относятся к наиболее вредоносным, способным на 10-40% ограничивать продуктивность цитрусовых культур (табл.18). Т а б л и ц а 18 Урожайность мандарина в зависимости от степени поражения гринингом (Непал, оп. ст. Покхар) Состояние деревьев Здоровое Пораженное в слабой степени Пораженное в сильной степени 1 2 1 Ср. урожайность (за 4 года) кг/дерево т/га 67,5 18,2 27,2 7,4 13,4 3,6 У плодов, собранных с больных деревьев, изменяется также ряд биохимических показателей (падает содержание сахаров, увеличивается кислотность). В настоящее время зарегистрировано более 20 различных возбудителей вирусных, вироидных и фитоплазменных заболеваний (табл. 19). Они встречаются повсеместно. Передаются с посадочным материалом и при участии насекомых-переносчиков. На цитрусовых культурах обнаруживаются и несвойственные возбудители, например, вирус Х картофеля, вирус некроза табака, штаммы вируса коровьего гороха, а также вироид веретеновидности картофеля, который вызывает признаки экзокортиса. Т а б л и ц а 19 Вирусные, вироидные и микоплазменные болезни цитрусовых культур Возбудитель Симптомы* Вирус тристезы ПЖ, ЯВ, ЗР, ИП, НФ Экзокортиса Стабборна Грининга Переносчики Хозяева Вирусы Toxoptera aurantii, Мандарины T. citricidis, Aphis pomi, A.spiraecola, A.gossypii, M.persicae Вироиды ЗР, Не установлены Лимон, апельсин, ОК, Х мандарин и др. Фитоплазмы Х, ИЛ, Eusceles plebejus, Виды цитрусовых, ДП, ЗР E.insisa, Circulifer Trifolium sp., Vinca tenellus, rosea, Alium sp., Scaphytopius Sisymbrium irio, nitridus Cynodon dactylon Х, ЗР, Diaphorina citri, Виды цитрусовых ЗП Trioza erytreae * НЦ – несвоевременное цветение, ДП – деформация плодов, ЗП – позеленение плодов, ЯВ – ямчатость ветвей, НФ – некроз флоэмы, ЗР – задержка роста, ОК – отслаивание коры. Меры борьбы. Самыми радикальными приемами, снижающими потери урожая, являются использование здорового привойного и подвойного материала при производстве саженцев. Отбор маточных 1 2 2 деревьев для этого проводят в ранневесенний период, когда визуально легче обнаружить признаки поражений. В качестве подвоев (особенно в районах массового распространения инфекции) рекомендуются такие виды, как цитранж, троер, карризо, мексиканские лаймы и другие, для которых характерна толерантная форма реакции на инфицирование. В случаях отсутствия здоровых растений проводится термическое обеззараживание исходных форм. Для этого саженцы помещают в термокамеры, где поддерживается постоянная температура 38-40ºС в течение 3 нед. Образующиеся в этот период новые побеги используют в качестве привоя. Опрыскивания антибиотиками тетрациклинового ряда (15-50 мг/л) обеспечивают лишь временное улучшение состояния, обрабатываемых деревьев, маскировку симптомов, увеличение урожая, но не их выздоровление. Наиболее перспективным следует считать использование устойчивых сортов. Уже имеются сообщения о выведении устойчивых и толерантных сортов апельсина, мандарина и лимона. Так, оценка различных сортов апельсина выявила устойчивые к гринингу: Новаленсия, Яффа, Руби, Хитекар и др. Однако эффективность рассмотренных мероприятий снижается, если на плантациях возделываются восприимчивые формы, если имеются источники инфекции и присутствует переносчик. Поэтому любая профилактическая система защиты предусматривает обязательное применение инсектицидов и приемы биологического контроля против насекомых-переносчиков. Болезни тропических культур На растениях, возделываемых в тропических странах, повсеместно (табл. 20) встречаются многие полигостальные возбудители. Например, на сахарном тростнике выявлялись такие как вирус желтой карликовости ячменя, вирус мозаики люцерны, вирус мозаики резухи, вирус S картофеля и др., распространение которых происходит с помощью переносчиков (тлей, цикадок, нематод) Более того, недавно показана возможность инфицировавание этой культуры при участии неспецифических векторов, например, тлей A.fabae и Hyalopterus pruni. С другой стороны, показано, что вирус мо заики сахарного тростника родственен вирусу мозаики кукурузы, а вирус мозаики папайи – мозаике арбуза. 1 2 3 Меры борьбы. Культивирование восприимчивых сортов, преимущественно вегетативное размножение многих культур способствуют накоплению инфекции в потомстве, приводят к их массовому поражению и, в конечном итоге, снижению урожайности. Различные агроприемы, включающие борьбу с переносчиками и растениями-резерваторами инфекции, могут ограничивать скорость распространения возбудителей и тем самым снижать причиняемый ими ущерб. Однако существенного повышения продуктивности удается достичь лишь при использовании здорового посадочного материала. Т а б л и ц а 20 Основные болезни тропических культур Возбудитель Вирус мозаики сахарного тростника Вирус мозаики папайи Вирус “банчи топ” банана Вирус вздутия побегов какао Cолнечного ожога авокадо Симптомы* Переносчики Вирусы ПМ, Х, M.persicae, Aphis ДЛ maidis, A.craccivora, A.gossypii, Toxoptera draminum, Cerolina cyperi, Rh.maidis М, КП Виды тлей Р, ДЛ, ЗЛ ВП, КЛ, Х, ДЛ Pentalonia nigronervosa Pseudococcus njalensis, Planococcus citri Вироиды ПМ, Х, Не известен ПС, ПВ Хозяева Виды Saccharum, кукуруза, сорго, просо и др. Папайя Банан Какао, виды Cola, Theobroma bicolor, Ceiba pentandra Авокадо * Р – розеточность листьев, ЗЛ – зеленая полосчатость листьев, ВП – вздутие побегов, КЛ – красная пятнистость листьев, ПС – полосчатость стеблей, ПВ – поникание ветвей, ПМ – полосчатая мозаика. 1 2 4 Наиболее перспективным методом получения посадочного материала, свободного от большинства патогенов, в настоящее время считается сочетание методов термо- или химиотерапии с методом культуры апикальных меристем in vitro. Успех операции по оздоровлению зависит от особенностей культуры, сорта, степени их зараженности и свойств патогенов, регенерационных способностей выделяемых меристем, используемых питательных сред и других факторов. Например, известно, что размер экспланта определяет их приживаемость и дальнейшее развитие. В то же время, чем меньше размер вычленяемой меристемы, тем больше гарантия, что в ее клетках нет возбудителя, его инфекционных фрагментов, но тем труднее получить из нее целое регенерированное растение. 1 2 5 ЛАБОРАТОРНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Тема 1. Патология и симптоматика заболеваний Материалы и оборудование. Бинокуляры, микроскопы, санный микротом с замораживающим столиком, чашки Петри, предметные стекла, пипетки, препаравальные иглы, опасные бритвы, фильтровальная бумага, красители – Рандорфа - Навашина, конго красный (0,5%), гематоксилин (1%), лакмоид (0,5%). Листья табака, лебеды, дурмана, гомфрены с мозаичными и некротическими признаками поражения. Клубни картофеля с некротическими проявлениями. Первичный анализ зараженности растений инфекционными заболеваниями проводится на основе визуального осмотра. Именно с этого начинается изучение выявляемых патологий. При этом в случае проявления специфических симптомов удается определять видовую принадлежность возбудителя. Однако часто такой диагноз, вследствие варьирования признаков на разных сортах и видах растений и, наоборот, их сходства при болезнях, вызываемых разными причинами, не всегда объективен. Поэтому в сомнительных случаях используются другие методы диагноза. Симптомы вирусных, вироидных и фитоплазменных заболеваний подразделяются по типу поражений (мозаики, хлорозы, некрозы, деформации, подавление роста, израстания и др.). Задание 1. Систематизировать по типам поражений различные поражения вирусами, вироидами и фитоплазмами. Ход работы. По гербарным образцам (или предложенному набору заболеваний) сгруппировать их по типам симптомов. Выделив среди них специфические признаки, составить определительную таблицу. Определение зараженности растений по анатомоморфологическим изменениям тканей, наблюдаемых на срезах под световым микроскопом, применяется редко. Однако результаты такого анализа приобретают особое значение в случаях, когда необходимо дать подтверждение диагноза, проведенного другими методами, а также для характеристики особенностей развития патологического процесса при оценке реакции тканей растения на инфицирование. При отдельных заболеваниях, например, зарегистрированных на цитрусовых культурах, развиваются достаточно четкие нарушения структуры и окраски тканей, 1 2 6 позволяющие судить об их состоянии. Для лучшего выявления изменений применяют окраску срезов, получаемых при гистологических анализах. Так, при диагнозе на тристезу их готовят на замораживающем микротоме (толщина срезов около 15 ммк), фиксируют в растворе Рандофа-Навашина и окрашивают одной из красок: конго красный+лакмоид или гематоксилин+лакмоид. При поражениях наблюдаются некроз клеток флоэмы, их сегментация, уменьшение размеров вакуолей и, наоборот, увеличение цитоплазмы. Задание 2. Провести анализ клубней картофеля с признаками некроза. Известно, что некроз клубней картофеля, проявляющийся в виде ржаво-бурых пятен в их мякоти, может возникать при вирусных инфекциях и как функциональное расстройство под влиянием неблагоприятных условий выращивания культуры (фосфорное голодание, повышенная температура почвы, недостаток влаги и др.). Ход работы. Бритвой делают тонкие срезы некротизированных тканей клубня, которые переносят на предметное стекло в каплю воды, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Отсутствие зерен крахмала в некротизировавшихся и окружающих их живых клетках свидетельствует о фунциональном заболевании картофеля, так как отмирание клеток наступает в результате их голодания. При вирусной инфекции некротизация происходит вследствие реакции сверхчувствительности. Поэтому крахмальные зерна в них сохраняются. Тема 2. Внутриклеточные включения и методы их обнаружения Материалы и оборудование. Микроскоп МБИ-1. Предметные и покровные стекла. Глазные скальпели и пинцеты. 0,1 н HCL. Раствор кислого фуксина. Растения картофеля или табака и томатов, зараженные соответственно вирусом Х картофеля и вирусом табачной мозаики. При различных вирусных инфекциях в тканях больных растений, преимущественно в клетках эпидермиса и волосках листьев и стеблей, обнаруживаются характерные включения. Их выявление позволяет в ряде случаев достаточно просто и быстро диагностировать заболевание. Обычно они представляют собой скопления вирусных частиц, имеющих форму паракристаллов, нитей 1 2 7 или аморфных тел. Например, вирус закукливания овса образует петлевидные паракристаллы. Задание 3. Определить зараженность растений табака (или томата) вирусом табачной мозаики по включениям. Ход работы. Пинцетом сдирают кусочек эпидермиса с листа от зараженного ВТМ растения табака или томатов и помещают его в каплю 0,1 н раствора соляной кислоты. Под микроскопом в клетках легко обнаруживаются гексагональные призмы, представляющие собой упорядоченные упаковки вируса. Для контрастирования включений препарат можно окрашивать различными красителями: кислым фуксином или метил-грюн-пиронином. Кристаллы приобретают красно-фиолетовую окраску. Окраску можно делать прижизненную либо после фиксации тканей 2% трихлоруксусной кислотой, 1% пикриновой кислотой или фиксатором Карнуа (30 мл абсолютного спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл хлороформа). Тема 3. Морфология и строение вирусов, фитоплазм и вироидов Материалы и оборудование. Сетка для приготовления подложек (или готовые подложки), чашки Петри, раствор формвара (2%) или коллодия (1%), растворы ФВК (2%) или уранил-ацетата (2%), предметные стекла, опасные бритвы, фильтровальная бумага, листья и черешки растений, инфицированных вирусами и фитоплазмой, ультрамикротом, электронный микроскоп, глютаральдегид (5%), фосфатный буфер (рН 7,2), четырехокись осмия (2%), этиловый спирт (95º), ацетон, набор метил-бутил-метакрилатов или эпонов. Задание 4. Приготовить пленку-подложку для электронной микроскопии. Ход работы. Для приготовления пленок используют материалы прозрачные для электронного луча и обладающие необходимой прочностью (коллодий, формвар, кварц, углерод и др.). Наиболее просты методы получения пленок с помощью 2% растворов коллодия или формвара (поливинилформальдегид). На дно воронки с горизонтальными стенками и краном снизу помещают стеклянный фильтр, а на него фильтровальную бумагу, на которой раскладывают специальные сеточки, применяемые для микроскопии. Затем ее заполняют водой на 1-2 см выше уровня бумаги. Пипеткой на поверхность воды наносят каплю раствора 1 2 8 коллодия в амилацетате (или амиловом эфире уксусной кислоты). Через 2-3 мин полученную пленку снимают, удаляя вместе с ней возможные пылинки с поверхности, и вновь наносят 1 каплю. Открыв (после испарения растворителя) кран воронки, воду сливают. В результате пленка ложится на сеточки. Их подсушивают и переносят в чашки Петри (или специальные пеналы). Методика приготовления формваровой пленки несколько проще. В 2% раствор формвара в хлороформе на 5-10 сек. опустить чистое стекло. Затем его вынимают и высушивают (около 1 мин). Образовавшуюся пленку скальпелем (или лезвием бритвы) надрезают по краям стекла, которое и погружают под углом в сосуд с водой. Пленка остается на поверхности воды. На нее пинцетом размещают сетки. Под них подводится предметное стекло и сетки с пленкой вынимаются, подсушиваются и используются по назначению. Задание 5. Приготовить препарат для электронной микроскопии. Ход работы. На сетку-подложку с приготовленной пленкой наносят каплю вирусной суспензии, экссудата с зараженных листьев или исследуемых препаратов. Избыток жидкости через 1 мин удаляют уголком фильтровальной бумаги и подсушивают. Затем наносят каплю контрастирующих растворов (2% фосфорновольфрамовая кислота, рН 7,0-7,2 или 2% уранилацетат), которую через 1 мин отсасывают кусочком фильтровальной бумаги. Препараты готовы для просмотра. Задание 6. Приготовить ультратонкие срезы с пораженных микоплазмами растений для электронной микроскопии. Ход работы. Фитоплазменные заболевания удается диагностировать, анализируя ультратонкие срезы пораженных тканей. Для этого используют проводящие ткани побегов, жилки и черешки листьев, где концентрация возбудителей наивысшая. Кусочки размером 1-1,5 мм вырезают скальпелем, фиксируют при комнатной температуре в течение 1,5 часов в 5% глютаральдегиде в фосфатном буфере (рН 7,2). Затем анализируемый материал промывают в том же буфере и 4 ч фиксируют в 2% четырехокиси осмия при 4С, после чего образцы обезвоживают путем последовательной проводки через возрастающие концентрации этилового спирта и ацетона и помещают в частично полимеризованную смесь метил-и бутил-метакрилатов (1:4) или эпоны. Срезы готовят на ультрамикротоме. Их контрастируют в течение 2 ч в 2% уранилацетате и затем 30 мин в растворе лимонно-кислого 1 2 9 свинца. После переноса срезов на подложки их просматривают в электронном микроскопе на наличие во флоэме полиморфных структур фитоплазм. Тема 4. Получение очищенных препаратов Материалы и оборудование. Центрифуга (до 20 тыс.об./мин), хлороформ, фосфатный буфер (рН 7,5), 0,01 М и 0,005 М ЭДТА, 0,1 н NaOH, NH2SO4, сифонные трубочки, целлофан для диализа, ультрацентрифуга, шприцы (1мл, 5 мл), 0,01 М трис-HCL буфер (рН 7,6), центрифужные или аналитические весы, катушка ниток, отвертка, додецилсульфат натрия (3%), свежеперегнанный водонасыщенный фенол, бентонит (1%), прибор для электрофореза в ПАГ, трис-ацетатный буфер (рН 7,0), толуидиновый синий (0,1% раствор в смеси с 50% метанолом и 0,5% уксусной кислотой), метанол, леденая уксусная кислота, спектрофотометр с ультрафиолетовым фильтром, набор для приготовления ПАГ, 0,01 М трисацетатный буфер (рН 7,5). Очищенные препараты (вирусы, вироиды и фитомикоплазмы) используются при изучении физико-химических свойств возбудителей, строения их частиц. Как облигатные внутриклеточные паразиты они накапливаются при репродекции в тканях живых клеток. Поэтому для их выделения пораженные ткани разрушают гомогенизацией, растиранием, размельчением или ферментативным воздействием (например, лизоцимом). Полученные суспензии осветляют от клеточных фрагментов и примесей. В ряде случаев эту операции совмещают с концентрированием препаратов. Для этого используются различные методы, в частности основанные на принципах экстракции, фильтрации и центрифугирования. Задание 7. Получить из зараженных растительных образцов суспензию ВТМ. Ход работы. Навеску (100 г) из предварительно замороженных листьев табака, зараженных вирусом табачной мозаики, измельчить в гомогенизаторе с добавлением 100 мл 0,1 н фосфатного буфера (рН 7,5) с 0,01 М ЭДТА. Полученную массу отжимают через 4-слойную марлю. Суспензию с помощью 0,1 н NaOH доводят до рН 7,0-7,5, разливают по центрифужным пробиркам и осветляют от крупных клеточных фрагментов при 0-5С в течение 20 мин и 3-5 тыс. об./мин. В полученный надосадок добавляют 1/10 по объему части хлороформа, встряхивают и снова цетрифугируют 10 мин при тех же оборотах. Верхний слой экстракта осторожно отделяют от осадка и 1 3 0 хлороформа, окрашенного пигментами. Полученную суспензию используют для получения очищенных прпаратов вируса. Задание 8. Получить вирусный препарат методом дробного высаливания. Ход работы. В вирусную суспензию при помешивании вносят NH2SO4 (до 15% насыщения). После растворения соли смесь выдерживают 30 мин при 18-20С. Выпавший осадок балластных веществ удаляют центрифугированием (3 тыс. об./мин в течение 20 мин). К полученному надосадку вновь добавляют NH2SO4 до 30% насыщения и оставляют в холодильнике на 12 ч для осаждения вируса. Верхний слой (примерно 2/3) с помощью сифонной трубочки удаляют, а нижний - центрифугируют (6 тыс. об./мин - 15 мин). Осадок из вирусных паракристаллов суспендируют в 20 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,5) с 0,005 М ЭДТА. Суспензию диализируют в том же буфере или дистиллированной воде в течение 24 час (при 2-3-кратной смене диализирующей жидкости. Затем содержимое центрифугируют (15 тыс. об./мин - 10 мин) для удаления нерастворимых фракций. Надосадок используют для повторного высаливания в целях лучшей очистки препарата. В этом случае к суспензии добавляют при помешивании насыщенный раствор сульфата аммония (1:1 по объему) и ставят на лед (15-30 мин) до полной кристаллизации вируса. Образовавшиеся паракристаллы осаждают центрифугированием (6 тыс. об./мин в течение 20 мин). Осадок ресуспендируют в 5 мл 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,5) и снова центрифугируют (15 тыс. об./мин - 10 мин) для удаления балластных веществ. Полученный полуочищенный вирусный препарат используют для анализов. Задание 9. Получить вирусный препарат методом дифференциального центрифугирования. Ход работы. В центрифужные пробирки, закрываемые специальными крышками, наливают шприцом через винтовые отверстия полуочищенную осветленную суспензию вируса и уравновешивают на цетрифужных (или аналитических) весах. Затем крышки герметизируют с помощью ключа и закрывают смотровые окна в них винтовыми тефлоновыми пробками, используя отвертку. Пробирки вновь проверяют на равновестность и попарно супротив размещают в роторе, который закрывают крышкой. Режим осаждения обычно составляет 90 мин при 105000 g (1 g=981 см/сек2). После окончания операции пробирки извлекаются из ротора и верхний жидкий слой их содержимого сливают. Оставшийся осадок 1 3 1 ресуспендируют в 5-10 мл 0,01 М трис-HCL буфера (рН 7,6). Полученный опалесцирующий раствор осветляют от нерастворимых фрагментов путем низкоскоростного центрифугирования (15 тыс.об./мин в течение 10 мин). Для приготовления препаратов высокой чистоты обычно проводят 3-4 цикла центрифугирования. Задание 10. Выделить вироидную РНК из пораженных растений. Методы выделения вироидов по мере их изучения постоянно совершенствуются. Однако существо ряда процедур сохраняется. Это - фенольная депротеинизация гомогенатов, содержащих нуклеопротеидные структуры клетки, удаление 2-метоксиэтанолом полисахаридов, осаждение 2 М LiCL высокомолекулярных РНК, разрушение ДНК с помощью фермента дезоксирибонуклеазы и, наконец, выделение собственно вироидной РНК из суммарной низкомолекулярной клеточной. Ход работы. Навеску свежих (или замороженных) листьев картофеля, зараженного вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК), гомогенизируют в 2-3 объемах 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5) с добавлением (2:1 по объему) смеси свежеперегнанного водонасыщенного фенола+хлороформа (1:1), детергента (3% додецилсульфат натрия) и ингибитора нуклеаз бентонита (1%). Полученную массу фильтруют через капроновую ткань и центрифугируют (10 тыс. об./мин - 10 мин) для удаления нерастворимых фрагментов. С помощью сифонной трубочки отбирают верхний водный слой надосадка, содержащий суммарную НК, которую преципитируют этанолом (1:2 по объему). Осадок ресуспендируют в равном по объему количестве буфера (рН 7,5). Полученный препарат разгоняют с помощью электрофореза в 7,5% ПАГ, приготовленном на трис-ацетатном буфере (рН 7,0) для цилиндрических и на трисглициновом (рН 7,0) для пластинчатых гелей. Электрофорез при 20С и 4 мА на трубку длится 10-14 ч (для пластинчатых гелей при напряжении 70 -100 V - 4-5 ч). Фракции РНК распределяются в соответствии с их Rf. Для лучшего их наблюдения гели окрашиваются толуидиновым синим (0,1% раствор в смеси с 50% метанолом и 0,5% уксусной кислотой в течение 1 ч). Вироидная РНК располагается в зоне 0,55-0,57, а ssРНК-0,62-0,65. Последняя часто используется в качестве маркера при электрофорезе суммарных РНК. Вироидную зону вырезают и помещают в отмывающий раствор (смесь 40% метанола и 1% уксусной кислоты), объем которого 10-20 раз больше объема геля. Для удаления краски проводят 3-5 смен промывочной жидкости. Затем гели гомогенизируют в глициновом буфере при 4С и 1 3 2 выстаивают при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 10 ч, после чего центрифугируют при 20 тыс. об./мин - 15 мин. Надосадок сливают и РНК осаждают охлажденным этанолом (1:2). После центрифугирования осадок растворяют 0,01 М трисацетатном буфере (рН 7,5). Концентрацию выделенной РНК определяют на спектрофотометре СФ-4 в ультрафиолетовом спектре (при 260 нм) по коэффициенту экстинции, равной 20 в кювете толщиной 1 см. Для предотвращения деградации РНК все манипуляции с экстрагированием и очисткой проводятся при пониженных температурах (4С). Тема 5. Физико-химические свойства возбудителей Материалы и оборудование. Водяная баня, термостат, термометр, очищенные вирусные препараты (Х картофеля и ВТМ), штативы, пробирки, индикаторные растения (гомфрена Gomphrena globosa для Хвируса картофеля и Nicotiana glutinosa для ВТМ). Задание 11. Определить длительность сохранения инфекционности вируса Х картофеля при комнатной температуре (20ºС). Ход работы. Подговить суспензию вируса, разлить ее в 5 пробирок и оставить на 1, 2, 3, 4 и 5 дней соответственно при 20ºС. Используя специфический индикатор – гомфрену (Gomphrena globosa) - с некротической реакцией на инфицирование, провести биологическое титрование путем натирания его листьев (предварительно опудренных карборундом) образцами с разным сроком выдерживания. По наличию и числу некрозов на листьях индикаторов сделать заключение о длительности сохранения инфекционности вируса Х картофеля при 20ºС. Задание 12. Определить точку термической инактивации (ТТИ) ВТМ и вируса Х картофеля. Ход работы. Суспензию вирусов в пробирках помещают в водяную баню при температурах 70, 75, 80, 85, 90, 95ºС на 1 мин. Затем проводят инфицирование с помощью биологического титрования соответствующих индикаторных растений прогретыми образцами. Через 5-7 дней по образующимся некрозам (или их отсутствию) судят о температурном пороге инактивации возбудителей. 1 3 3 Тема 6. Получение диагностических сывороток Материалы и оборудование. Холодильник, кролики породы Шиншила, очищенные вирусные препараты (ВТМ и ВМК), шприцы на 1 и 5 мл, ксилол, спирт, вата, цилиндры на 100 и 250 мл, стеклянные палочки, пенициллиновые пузырьки, ампулы. Несмотря на разработку и внедрение новых чувствительных методов определения зараженности (ПЦР, ИФА), ряд серологических тестов (реакция преципитации в геле, иммуноэлектрофорез и др.) все еще остаются в арсенале. Это объясняется сравнительной простотой и дешевизной их использования. Поэтому производство диагностических сывороток для растениеводства продолжает оставаться востребованным. Схемы иммунизации могут быть различными. Обычно производят 4-5 инъекций антигена по 0,5-4 мл внутривенно, подкожно или внутримышечно с 2-4-дневными интервалами. Выбор способа введения антигена зависит от его качества (степени агрегации, токсичности, наличия примесей и др.). Для повышения титра сыворотки после перерыва (через 1,5 - 2 нед.) следует повторная реиммунизация в больших дозах (до 4 мл). Чаще для этих целей используют различные адьюванты (Фрейда, альгинат натрия, желатин, ланолин и др.). Задание 13. Приготовить диагностическую сыворотку к вирусу табачной мозаики (или вирусу мозаики костра). Ход работы. Для получения иммунных сывороток лучше использовать кроликов одной породы – шиншилла и возраста. Вес животных около 2, 5 кг. В ушную вену шприцом параллельно уху, начиная с его вершины, вводят 0,5 – 1 мл очищенного препарата вируса табачной мозаики (или вируса мозаики костра). Для лучшего набухания вен их предварительно протирают ваткой, смоченной в ксилоле, слегка перетянув основание уха. Затем место укола обрабатывают спиртом. Наиболее часто употребляемая схема иммунизации состоит из 6 инъекций с интервалом в 1 день с начальной дозой антигена 0,5 мл и конечной - 4,0 мл. Проиммунизированных животных с помощью ушных номеров инвентаризируют. Контроль за состоянием иммунизируемых животных проводится путем их взвешивания. В случаях, если их вес по сравнению с предыдущей операцией падает более чем на 100 г, время отдыха животных увеличивается до 3 дней. Забор крови (до 40 мл за один 1 3 4 раз) осуществляется через 10 - 11 дней после последней инъекции. Обычно проводится 2-3 забора. Для этого после дезинфекции поверхности уха спиртом (70%) делают надрез бритвой краевой вены. Полученную кровь на 2 ч помещают в термостат при 37ºС. Образовавшийся сгусток осторожно отделяют стеклянной палочкой от стенок сосуда, а прозрачную сыворотку сливают и переносят в холодильник при температуре +1 - +3ºС. Отстоявшуюся сыворотку сливают в стерильную колбу, подвергают осветлению от оставшихся свернувшихся фрагментов крови с помощью центрифугирования (при 3000 – 3500 об./мин, определяют ее титр (титром называется предельное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается реакция с гомологичным антигеном), При определении титра сыворотки разводят стерильным физиологическим раствором в геометрической прогрессии – 1:2, 1:4, 1:8 и т. д. Реакцию методом иммунодиффузии в геле (или агглютинации в капле) ставят с антигеном (инфекционный сок из больного растения или препарат вируса) в разведении 1:16. После проверки специфичности с помощью антигенов из здорового растения (например, свежевыжатый сок из листьев) делают рабочее разведение сыворотки (1:16 - 1:32). Сыворотка хранится в заморозке (при – 20 - 25ºС) с добавлением консервантов (глицерин – до 50%, 0,5% - 1% борная кислота, азид Na, тимол и др.) до 1 года или в лиофилизированном состоянии в ампулах под вакуумом. Тема 7. Фракционирование и разделение смешанных инфекций Материалы и оборудование. Ультрацентрифуга с бакет – ротором, спектрофотометр, центрифужные весы, стеклянная хроматографическая колонка (1,5400 мм), пробирки, сефадекс марки G 100 или G 200, фосфатный буфер (рН 7,2-7,5), 0,1М ацетатный буфер (рН 5,0), сахароза, очищенные препараты ВТМ и ВМК. При поражениях растений несколькими возбудителями часто возникает необходимость их разделения и очистки. Для этих используются методы центрифугирования в градиенте плотности нейтральных и сравнительно инертных веществ (сахароза, полисахариды, соли тяжелых металлов и др.), электрофореза в различных средах (ПАГ, сефадексы, полисахариды, агар и др.), гельфильтрации и др. 1 3 5 Задание 11. Провести фракционирование вирусной суспензии на колонках с сефадексом. Некоторые параметры (размер, форма и структура вирионов, их молекулярная масса, последовательность нуклеотидов и др.), учитываемые при идентификации вирусов, определяются в результате исследования их очищенных препаратов. Для этих целей при отсутствии ультрацентрифуг можно привлекать методы фракционирования в органических гелях с разной скважностью, для приготовления которых используются сефадексы (G 50, G 75, G 100, G 200), полисахариды (агароза, сефароза), гранулированный агар, полиакриламид и др. соединения. С их помощью удается удалять из суспензий низкомолекулярные примеси, разделять на фракции возбудителей в смеси, различающихся по размерам, форме и молекулярной массе. Ход работы. Закрепить на штативе стеклянную хроматографическую колонку (1,5400 мм), поместить на ее дно фильтр (поролон, стекловолокно и др.). Верхний конец закрывают резиновой пробкой с отверстием, в которое вставляют воронку. Колонку заполняют суспензией гранулированного сефадекса, разведенного в фосфатном буфере с рН 7,2-7,5. После появления осадка (около 3 см) нижний кран у колонки открывают с тем, чтобы жидкость вытекала по каплям, при постоянном добавлении суспензии сефадекса в воронку. Гранулы, оседая, заполняют колонку до края пробки. Сверху (после того как жидкость стекла до поверхности геля) наслаивают смесь возбудителей (10 мл с концентрацией 2,0-2,5 мг/мл), приготовленную на том же буфере. После того как суспензия полностью войдет в гель, колонку, включая и воронку, заполняют буферным раствором и начинают элюирование (0,5 мл/мин). Фракции (по 2 мл) собирают в пробирки и на спектрофотометре (при оптической плотности 240-290 нм), определяют содержание в них вирусных нуклеопротеидов. По результатам измерений составляют диаграмму. Одновременно фракции контролируют с помощью антисывороток, определяя, какой вирус присутствует в пробе. Делается заключение о скорости элюирования вирионов с разной формой и молекулярной массой. Задание 12. Провести фракционирование смеси вирусов в градиенте плотности сахарозы. Ход работы. Приготовить 5%,10% и 20% раствор сахарозы в 0,1м ацетатном буфере (рН 5,0). Центрифужную пробирку медленно через капиллярную пипетку заполняют сначала 20% и затем, по убывающей, 10 и 5% сахарозой и оставляют на 12 ч. Затем на 1 3 6 поверхность градиента наслаивают Пастеровской пипеткой с оттянутым концом смесь очищенных препаратов 2 вирусов - ВТМ и ВМК (около 0,5 мл). Пробирки уравновешивают, помещают в бакет – ротор и центрифугируют при 25000 об/мин и температуре 2-4º в течение 2,5 ч. После окончания центрифугирования визуально видимые в проходящем свете вирусные зоны отбирают шприцом с загнутой под 90º иглой (или путем прокалывания дна центрифужной пробирки). Концентрацию вирусов в исследуемых фракциях определяют на спектрофотометре в УФ – свете и длине волны 260 нм. Тема 8. Пути и способы распространения инфекции Материалы и оборудование. Растения гороха, фасоли или ячменя в фазе 1-го настоящего листа. Больные исходные растения-бобы, инфицированные ВЖМФ или ячменя и заселенные соответственно тлями - бобовой (Aphis fabae) и злаковой (Shizaphis graminis). Беличьи кисточки. Микроизоляторы. В естественных условиях распространение инфекции (вирусы, вироиды и фитоплазмы) происходит следующими основными способами: при контактах, вегетативном и половом (через семена и пыльцу) размножении, а также с помощью переносчиков. Многие вирусы и вироиды, например, ВТМ, ВМК, Х-вирус картофеля, вироид веретеновидности картофеля, достаточно стабильны и передаются от растения к растению при их соприкосновении. Во время междурядных обработок, сильных ветрах при контакте листьев, ветвей, корней больного и здорового растений образуются микротрамвы, через которые и происходит заражение. Активно инфекция распространяется и при вегетативном размножении - с клубнями, отводками, черенками и глазками при прививках, взятых от больных растений. Передача через семена и пыльцу характерна только для отдельных групп вирусов, в частности, NEPO и ILAR. В природных условиях наиболее интенсивно циркуляция возбудителей осуществляется с помощью переносчиков (насекомых, клещей и нематод), а также грибов и растений-паразитов, таких как повелики. Задание 12 . Определить вирофорность тлей. На восприимчивые к вирусам растения-индикаторы кисточкой переносят тлей (по 1-5 особей) на 0,5-1 ч. Растения накрывают изоляторами любой конструкции (стеклянными, капроновыми, 1 3 7 целлулоидными и др.) для предотвращения миграции с них тлей. Через 5-7 дней по наличию (или отсутствию) на индикаторах признаков заболевания делают заключение о вирофорности вида и устанавливается способность его к распространению возбудителя. Для определения же степени вирофорности популяции (в %) проводится анализ каждой особи, подсаживаемой на индивидуальное растение. Обычно при оценке полевой вирофорности испытывается от 10 и более особей одного вида в трех повторностях. Исследование переносчиков из других таксономических групп, например цикадок, распространяющих преимущественно микоплазменные инфекции, имеет ряд специфических особенностей. В частности, подкормка на исходном зараженном растении продолжается от 1 до 3 дней. После питания инкубационный период возбудителя в теле самого переносчика длится от 23 до 60 дней. Поэтому подсадку насекомых на индикаторные растения проводят только после его окончания. Кроме того, при оптимальных условиях их выращивания (температура 20-25С, относительная влажность 8085% и освещенность 1500-2000 лк/м2) признаки заболевания проявляются в среднем через 30 дней. Некоторые инфекции имеют и более продолжительный инкубационный период (до года). Задание 13. Провести анализ зараженности почвы грибамипереносчиками и с их помощью инфицирование растений. В настоящее время выявлено около 15 вирусов, в распространении которых участвуют грибы, в частности, из родов Olpidium и Polymyxa. Так, вирус Х-картофеля переносится Synchytrium endobioticum, вирус мозаики озимой пшеницы Polymyxa graminis и вирус некроза табака и вирус некроза огурца Olpidium brassicae. Показано, что вирусы с грибами проникают в клетки растений обычно на стадии спорангиального плазмодия. Перенос возбудителей от растения к растению происходит с помощью подвижных зооспор, имеющих жгутики, с током воды. Они легко проникают в первичные корешки молодых растений. При влажности почвы выше 40% О. brassicae образует несколько генераций зооспорангиев. Ход работы. Для выявления зараженности почвы грибамипереносчиками и, в частности Olpidium brassicae, на участке в 10-15 местах с глубины 10-15 см буром берутся ее пробы. Затем они смешиваются и по 200-300 г (средний образец) после просеивания через сито (диаметр пор 2 мм) помещаются в пластмассовые вазоны (4,5 х 4,5 х 4 см) с поддоном, в который наливается вода. В анализируемую почву высаживаются промытые в стерильной воде 1 3 8 семена или проростки (3-5-дневные) “растений-приманок”. Восприимчивыми к O. brassicae таковыми являются Nicotiana tabacum, Cucumis sativum и Beta vulgaris. Уже через 7 дней в клетках эпидермиса их корней под световым микроскопом (при увел. х 200-400) без дополнительной окраски обнаруживаются плазмодии, а на 13-16-е сутки - покоящиеся споры с характерной звездчатой оболочкой. Задание 14. Провести искусственное инфицирование с помощью грибов. Ход работы. Искусственное заражение 2-3-недельных растений огурца или табака осуществляют погружением их корней в суспензию зооспор либо простым поливом ею стерильной почвы или песка в вазонах, в которых они выращиваются. В качестве инокулюма можно использовать и порошок из сухих молотых корней от больных растений, содержащих споры Olpidium. Они сохраняют свою инфекционность около года. Суспензию зооспор получают, погружая корни от зараженных вирусом некроза табака растений, содержащих зооспорангии, на 2030 мин в кипяченую холодную воду. Концентрацию зооспор в суспензии рассчитывают с помощью камеры Горячева. 100процентное заражение растений происходит при численности 2·104 зооспор/мл. Факт передачи инфекции устанавливается с помощью иммуноферментного анализа через 5-6 дней или визуально по внешним признакам поражения через месяц. Тема 9. Классификация вирусов, вироидов и фитомикоплазм Первые попытки упорядочить информацию о возбудителях вирусных, фитомикоплазменных и вироидных заболеваний связаны с особенностями их проявления на поражаемых растениях. Однако варьирование симптомов при инфицировании различными штаммами одного и того же патогена и их комбинаций не давали основы для объективного диагноза и группирования по этим показателям. Поэтому в настоящее время принципы таксономии указанных возбудителей базируются на комплексе их признаков и свойств. Задание 15. Ознакомиться с принципами классификации и определить таксономическое положение конкретных возбудителей. Ход работы. По раздаточному материалу, в котором дается описание отдельных свойств набора возбудителей (не менее 5), 1 3 9 используя в качестве справочного материала приложения 1 и 2, провести их систематику по соответствующим таксонам. 1 4 0 Рекомендуемая литература Основная литература: 1. Богоутдинов Д.З. Фитоплазмозы картофеля и методы их изучения.-Самара, 2000.- С.34. 2. Бойко А.Л. Экология вирусов растений.- Киев: “Выща школа”, 1990.- С.165. 3. Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология.- М.:Колос, 1982.- С.239. 4. Дьяков Ю.Т. Фитопатогенные вирусы.- М.: 1984. 5. Гибсс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений.- М.: Мир, 1978. 6. Гнутова Р.В. Вирусология с основами иммунохимии.Владивосток.:Дальнаука, 1999. 7. Журавлев Ю.Н. Вирусы в клетке и целом растении.- М.: 1979. 8. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Вирусные болезни древесных растений.- М.: Наука, 1985. 9. Метьюз Р. Вирусы растений.- М.: 1998. Дополнительная литература: 1. Кеглер Х. и др. Борьба с вирусными болезнями.- М.:: 1986. 2. Крылов А.В. Вирусы Дальнего Востока.- М.: 1992. 3. Нагорная Г.Б. и др. Цикадки-переносчики вирусных и микоплазменных заболеваний с/х культур.- М.: ГБС АН, 1988.С.50. 4. Тряпицын С. и др. Трипсы-переносчики вирусных заболеваний.- М.: ВАСХНИЛ, 1990.- С.30. 5. Помазков Ю.И., Келдыш М.А. Методические указания по выявлению и идентификации вирусов и микоплазм.- М.: 1980.С.26. 6. Лебедева Е.Г., Дьяконов К.П., Немилостева Н.И. Насекомые – переносчики вирусов растений на Дальнем Востоке.- Владивосток, 1982.- С.193. 1 4 1 1 4 2 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1 Классификация вирусов Переносчики Пыльца Семена КМ Тип НК Размер, нм Род Форма частиц Таксономические показатели* Строение Способ вирионов передачи Carlavirus П 620-690 РНК + А Сlosterovirus + А Hordeivirus П 600РНК 2000 110-160 РНК Furovirus Н 100-300 РНК Potexvirus Potyvirus Tobamovirus П 480-580 РНК Н 730-800 РНК П 300 РНК + + + А Tobravirus C 80-210 РНК + Н Bromovirus C 25 РНК + Н Carmovirus C 25-30 РНК + А Caulimovirus C 50 ДНК + А Comovirus С 25-30 РНК + Ж Cucumovirus С 30 РНК + А Diantovirus С 31-34 РНК + 1 4 3 + + + Г Типичный представитель (вид) Сarnation latent virus Beet yellow virus Barley stripe mosaic virus Wheat mosaic virus (soil borne) Potato virus X Potato virus Y Tobacco mosaic virus Tobacco rattle virus Brome mosaic virus Carnation mottle virus Caulflower mosaic virus Cowpea mosaic virus Cucumber mosaic virus Carnation ringspot virus Продолжение п р и л о ж е н и я 1 Ilarvirus C 20-35 РНК + + Luteovirus C 25 РНК А Nepovirus C 30 РНК + Necrovirus C 26 РНК + Reovirus C 70 РНК Sobemovirus С 30 РНК + Pea enation С mosaic virus Tomato C spotted virus Tombusvirus С 28 РНК + А 80 РНК + А 30 РНК + ? + + Ц + Ж Tymovirus C 25-30 РНК Geminivirus П / П Б 15-25 41-52 ДНК 58х 18 РНК + A Б 50-130 РНК + А Ц Alfalfa mosaic virus Rhabdovirus * Ал Prunus ringspot virus Barley yellow dwarf virus Tobacco ring spot virus Tobacco necrosis virus Wound tumor clover virus Southern bean mosaic virus Pea enation mosaic virus Tomato spotted virus Tomato bushy stunt virus Turnip yellow mosaic virus Maize streak virus Alfalfa mosaic virus - Условные обозначения: С - изометрические (сферические), П - палочковидные, Н - нитевидные, Б - бацилловидные, П/П – парнопочкующиеся, КМ - контактно-механически, А - тли, К - клещи, Н - нематоды, Ц - цикадки, Г - почвенные грибы, Ж - жуки, Пс - псиллиды. 1 4 4 Приложение 2 Классификация вироидов (по Sanger, 1998) Класс/ группа/ подгруппа СDN-viroid/ PST/PST Репликация Цикл Условия РНК- РНКРНК полимеразная зависимость репликации ДНК /CCC Члены группы Potato spindle tuber Citrus exocortis Chrysanthemum stunt Tomato planta macho Tomato apical stunt Mexican papita Columnea latent Iresine viroid Coconut cadang cadang Coconut Tinangaja Hop stunt Hop latent Citrus viroid IV Apple scar skin Длина цепей,nt 356-360 368-375 354,356 360 360,363 361 370,372 370 246,247 256 297-303 256 284 329,330, 334 Australian grapevine 369 Citrus bent leaf 318 Pear blister canker 315 Citrus viroid III 294,297 Apple dimple fruit 306 Grapevine yellow speckle 366-368 viroid 1 Grapevine yellow speckle 363 viroid 2 Coleus blumei viroid 1 248-251 Coleus blumei viroid 2 (= 300-302 chimera 1 2) Coleus blumei viroid 3 361,362, 364 /HS /ASS /GYS /Cb 1 4 5 Продолжение п р и л о ж е н и я 2 HH-viroid РНКРНК “Retroviroids” РНКДНКRNAs satellite РНК /satellites with circular RNA (=virusoids) РибосоAvocado sunblotch моподобный аутокаPeach latent mosaic тализ РНК Chrysanthemum chlorotic mottle в присутствии вируса помощника Satellites with linear RNA (three selected species) 1 4 6 245-251 (rodshape) 336-339 (rodshape) 398,399 (branche d) Саrnation small viroid- 275 like RNA Virusoid of lucerne 324 transient streak virus Virusoid of subterran388 ean clover mottle virus Virusoid of Solanum 377 nodiflorum mottle virus Virusoid of tobacco 366 mottle virus Satellite Bl of cucum- 338 ber mosaic virus Satellite C of turnip 355 crincle virus Satellite S of tobacco 359 ringspot virus Приложение 3 Классификация микоплазм (класс Mollicutes) Порядок Mycoplasmata les Acholeplasmat ales Род Отличительные признаки Mycoplasma 5108Д, Стеринзависимые, плеоморфные Spiroplasma 1109Д, Спиралевидные, подвижные Acholeplasma 1109Д, Стериннезависимые, плеоморфные - размер генома. 1 4 7 Приложение 4 Латинские обозначения вирусов, вироидов и фитоплазм Вирусы Alfalfa mosaic virus - вирус мозаики люцерны, Alium mosaic virus - вирус мозаики лука, Apple mosaic virus - вирус мозаики яблони, Arabis mosaic virus – вирус мозаики резухи, Barley yellow dwarf virus - вирус желтой карликовости ячменя, Bean common mosaic virus - вирус обыкновенной мозаики фасоли, Bean yellow mosaic virus - вирус желтой мозаики фасоли, Brome mosaic virus – вирус мозаики костра, Carnation ring spot virus – вирус кольцевой пятнистости гвоздики, Carnation mottle virus – вирус крапчатости гвоздики, Cauliflower mosaic virus - вирус мозаики цветной капусты, Citrus tristeza virus – вирус тристезы цитрусовых, Cucumber mosaic virus - вирус огуречной мозаики, Fanleaf grapevine – короткоузлие винограда Freеsia mosaic virus – вирус мозаики фрезии, Glycine mosaic virus - вирус мозаики сои, Groundnut mosaic virus - вирус мозаики арахиса, Narcissus mosaic virus – вирус мозаики нарцисса, Plum pox virus - вирус оспы слив, Potato virus Y - вирус У–картофеля, Potato virus S - вирус S–картофеля, Potato virus L - вирус L–картофеля, Potato virus M - вирус М-картофеля, Raspberry leaf mottle virus - крапчатость листьев малины, Raspberry vein chlorosis virus – вирус хлороза жилок малины, Raspberry ring spot virus – вирус кольцевой пятнистости малины, Sugarcane mosaic virus – вирус мозаики сахарного тростника, Tobacco mosaic virus - вирус табачной мозаики, Tobacco necrosis virus – вирус некроза табака, Tobacco rattle virus – вирус погремковости табака, Tomato spotted wilt virus - вирус бронзовости томатов, Tulip mosaic virus - вирус мозаики тюльпанов, Tulip breaking virus - вирус пестролепестности тюльпанов, Wheat winter mosaic virus - вирус мозаики озимой пшеницы, Wheat streak mosaic virus - вирус полосатой мозаики пшеницы, Вироиды Apple dimple fruit viroid – ямчатость плодов, 1 4 8 Chrysanthemum stunt viroid - карликовость хризантем, Citrus exocortis viroid – экзокортис цитрусовых, Citrus bent leaf viroid – поникание листьев цитрусовых, Hop stunt viroid - карликовость хмеля, Potato spindle tuber viroid - веретеновидность клубней картофеля Фитоплазмы Apple proliferation - пролиферация яблони, Greening - грининг цитрусовых Leaf round - круглолистность картофеля, Phyllody clover - филлодия клевера, Reversion ribes - реверсия смородины, Rubbery wood - поникание ветвей, Rubus stunt - израстание малины, Stabborn - стабборн цитрусовых, Stolbur - столбур, Stone fruit - каменистость плодов, Yellow aster - желтуха астр 1 4 9 Приложение 5 Сокращенные обозначения визуальных признаков поражения М – мозаика, ММ – межжилковая мозаика, ПМ – полосчатая мозаика, КП - крапчатая пятнистость, КЛ – крапчатость листьев, ПЖ - посветление жилок, БЖ – побурение крупных жилок, Х – хлороз, КО – кольцевая пятнистость листьев, ЛУ – линейный узор, ШЛ – штриховатость листьев, АО – антоциановая окраска, Н – некрозы, СЛ – скручивание листьев, ПЛ – пожелтение (покраснение) листьев, КЛ – красная пятнистость листьев, ЗЛ – зеленая полосчатость листьев, ДЛ – деформация листьев, НЛ – нитевидность листьев, ИЛ – измельчение листьев, РЛ – изреживание листьев, Э – энации на жилках листа, ПФ – побурение флоэмы, НФ – некроз флоэмы, В – вздутия на листовой пластинке, ЯВ – ямчатость ветвей, ПС – полосчатость стеблей, ПВ – поникание ветвей, ОК – отслаивание коры, Р – розеточность, К – кустистость, И – израстание, ЗР – задержка роста, ВК – веретеновидность клубней, СК – стерильность колоса, СМ – стерильность метелки, ДМ – деформация метелок, ДЦ – деформация цветков, ИЦ – измельчение цветков, ЛП – пестролепестность, РЦ – реверсия цветков, НЦ – несвоевременное цветение, НП – внутренний некроз плодов, БП – бурая пятнистость, БК – бурые кольца, ПП – пятнистость плодов, ИП – измельчение плодов, РП – растрескивание плодов, ЯП – ямчатость плодов, ДП – деформация плодов, ЗП – позеленение плодов. 1 5 0 Приложение 6 (рисунки к тексту) Рис. 1 (к стр. 16). Различные формы вирусных частиц: а палочковидная, б – сферическая, в – нитевидная, г – бацилловидная. Рис. 2 (к стр. 26). Колонии фитоплазмы на твердой питательной среде, выделенные из люцерны, пораженной карликовостью. Рис. 3 (к стр. 38 и 67). Включения в клетках кишечного эпителия цикадки Macropsis fuscula – переносчика микоплазменной карликовости Rubus. Рис. 4 ( к стр. 55). Различные схемы трансмиссирования инфекций: 1 – при использовании в качестве основных и промежуточных кормовых растений их древесных видов, 2 – при взаимодействии переносчиков в инфекционном процессе с древесными и однолетними травянистыми растениями, 3 циркуляция переносчиков с использованием многолетних (основных) и однолетних (промежуточных) травянистых растений, 4 – схема комплексного взаимодействия векторов с кормовыми растениями разного типа. Рис. 5 ( к стр. 61). Некрозы при биологическом титровании Рис. 6 (к стр. 61). Серологическая диагностика: иммунодиффузия в геле, б – иммуноэлектрофорез в геле а – Рис. 7 (к стр. 86). Нитевидность листьев у растений, развивающаяся при попадании на них гербицидов типа 2.4.Д Рис. 8 (к стр. 86). Различные типы неинфекционных мозаик: а, б – виды хлороза, в, г – генетическая пестролистность 1 5 1 1 5 2 Келдыш Марина Александровна, Помазков Юрий Иванович ВИРУСЫ, ВИРОИДЫ И МИКОПЛАЗМЫ РАСТЕНИЙ Учебное пособие (краткий курс) Редактор И.Л.Панкратова Дизайн обложки А.А.Андрианова Технический редактор Ю.В.Чванова Корректор….. 1 5 3