Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение
«Федеральный центр охраны здоровья животных»
(ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
Перевод №___7123___
Авторы:
Frank M. Hetrick, Martin D. Knittel, and J.L.Fryer
Название: Increased Susceptibility of Rainbow Trout to Infectious
Hematopoietic Necrosis Virus After Exposure to Copper
Повышение восприимчивости радужной форели к вирусу
инфекционного гемопоэтического некроза после обработки
медью
Источник: Applied and Environmental Microbiology. – 1979. – Vol. 37. №2. –
P.198 – 201.
Переводчик: Доронин М.И.
Редактор: Фраймович Л.К.
Дата: октябрь 2014г.
Владимир
2014
Прикладная и экологическая микробиология, февраль 1979, с. 198-201
Повышение восприимчивости радужной форели к вирусу
инфекционного гемопоэтического некроза после воздействия медью
Воздействие на радужную форель сублетальными дозами меди в воде
повышало их восприимчивость к вирусу инфекционного гемопоэтического
некроза. В большинстве случаев процент смертности был вдвое выше в
группах, подвергнутых стрессу, по сравнению с группами, которых не
подвергали
стрессу, но обрабатывали такой же вирусной дозой. Хотя
уровень меди в воде влиял на показатель смертности, продолжительность
воздействия, по-видимому, не была решающей, так как подобные результаты
были получены через 1, 3, 5, 7 или 9 дней после воздействия. При
использовании различных доз индикаторного вируса, процент смертности
был снова выше у рыб, подвергнутых стрессу при всех использованных
вирусных дозах, а при одной дозе смертность наблюдалась в группе,
подвергнутой стрессу, но не в группе, которую не обрабатывали.
Введение
Часто драматическое повышение заболеваемости, которое мы называем
эпизоотией,
является результатом воздействия ряда факторов, включая
восприимчивость популяции хозяина, вирулентность возбудителя и факторы
стресса, которым подвергается популяция. В случае с болезнями рыб
воздействие окружающей среды, например, пищевой режим хозяина,
температура и соленость воды или присутствие химических загрязняющих
агентов, могут быть решающими факторами в возникновении вспышек
болезни. В ранних сообщениях говорилось о том, что различные
экологические стрессы способствуют снижению резистентности рыбы к
инфекционной болезни (2,4,11).
Хотя давно известно, что тяжелые металлы находятся в списках самых
токсичных соединений для множества видов рыб, почти нет информации о
действии
обработки
низкими
дозами
этих
контаминантов
на
предрасположенность рыбы к болезнетворным агентам. В этом сообщении
мы приводим данные о том, что радужная форель, подвергнутая воздействию
сублетальных доз меди, более восприимчива к вирусу инфекционного
гемопоэтического некроза (ИГН), главному возбудителю инфекции у
лососевых рыб (1, 12).
Материалы и методы
Клеточные культуры. Для наработки вируса использовали клеточную
линию, первоначально полученную из зародышевых клеток чавычи (CHSE214). Клетки обычно культивировали при 160 С в среде Игла с минимально
необходимым набором компонентов с добавлением солей Эрла и 10%
фетальной сыворотки теленка. Поддерживающая питательная среда для
клеток, которую использовали в анализах бляшкообразования и в опытах по
выделению вируса, состояла из среды Игла с добавлением солей Эрла и 2%
фетальной сыворотки теленка.
Вирус.
Вирус
инфекционного
гемопоэтического
некроза,
используемый в этом исследовании, был первоначально выделен из нерки,
выловленной из реки Метолиус в Оригоне, и прошел два пассажа в
зародышевых клетках чавычи (CHSE-214). Перед использованием в этой
работе вирус однократно вводили молодой радужной форели. Вирус,
выделенный от этих рыб, использовали для приготовления запасов вируса в
зародышевых клетках чавычи (CHSE-214).
Анализ бляшкообразования проводили в монослоях зародышевых
клеток чавычи (CHSE-214), выращенных в культуральных флаконах
площадью 25 см2 фирмы Корнинг. Вирусные разведения (0,2 мл)
адсорбировали на монослоях в течение 60 минут, после чего добавляли 5 мл
поддерживающей питательной среды с 1%-ной метилцеллюлозой. После 10
дней инкубации монослои фиксировали в формалине в течение 5 минут,
несколько раз промывали дистиллированной водой, а затем перед подсчетом
бляшек окрашивали раствором метиленового синего в течение 2 минут.
Заражение рыб. Группы мальков форели весом 0,2 – 0,7 г помещали в
цистерны емкостью примерно 3,8л для заражения. Для групп из 25 рыб
использовали 1л воды, а для групп из 50 рыб – 2 л. Нужное количество
бляшкообразующих единиц (БОЕ) добавляли в воду, и рыбу заражали
вирусом в течение 24 часов, при этом емкости частично погружали в
проточную воду при 120 С. После воздействия вирусом рыбу переносили в
резервуары с водой объемом 20 галлонов, в которых поддерживали
температуру 120 С ± 0,280 С с помощью Бристольского пропорционального
регулятора-самописца и комплекта клапанов для смешивания. Аэрированную
воду поставляли к каждому аквариуму со скоростью 3,8 л/мин. Смертность
регистрировали ежедневно в течение 21 дня, и рыбу сохраняли при – 200 С до
момента выделения вируса.
Выделение вируса от инфицированной рыбы. Каждую рыбу
измельчали в ступке до 20%-ной суспензии, используя
растворителя
среду Игла
с
в качестве
минимальным набором компонентов
с
добавлением солей Эрла. Полученную суспензию затем центрифугировали
при 2000 g 15 минут при 40 С; 0,5 мл супернатанта добавляли к 2 мл раствора
антибиотика, содержащего на 1 мл 100 МЕ пенициллина, 100 мкг
стрептомицина, 100 МЕ микостатина и 50 мкг гентамицина. После 4-часовой
инкубации при комнатной температуре или инкубации в течение ночи при
40 С 1,0 мл суспензии наносили на монослой зародышевых клеток чавычи
(CHSE-214) в культуральном флаконе площадью 25 см2. После адсорбции в
течение 1 часа добавляли 5 мл поддерживающей питательной среды. Затем
ежедневно наблюдали за развитием характерной цитопатологии во флаконах,
вызванной вирусом ИГН. Несколько изолятов из каждого эксперимента
идентифицировали
как
вирус
специфическими антисыворотками.
ИГН
в
реакциях
нейтрализации
со
Обработка рыбы медью. Рыбу непрерывно обрабатывали медью в
пропорциональном проточном разбавителе, разработанном Гартоном (R.
Garton). Двойные образцы воды (10мл каждый) ежедневно отбирали из
каждого
аквариума
для
определения
концентрации
меди.
Образцы
подкисляли 0,01мл концентрированной азотной кислоты, концентрацию
меди определяли с помощью атомарного поглощающего спектрофотометра
Перкина-Элмера
(Perkin-Elmer)
невоспламеняющимся
нагревающим
(модель
графит
305
B),
распылителем
оснащенного
HGA-2000.
Используемые дозы меди составляли 2,1 – 10 нг/л в зависимости от плана
эксперимента. Все уровни находятся в сублетальном диапазоне для радужной
форели.
Статистические методы. Данные обрабатывали с помощью линейной
регрессии и метода Мэнтела-Хэнсзела (Mentel-Haenszel test) (7).
Результаты
Влияние концентрации меди.
В первом эксперименте исследовали влияние доз меди в воде на форель
до заражения вирусом. Результаты (таблица 1) показывают, что процент
смертности был выше во всех группах рыб, обработанных медью, по
сравнению с группой рыб, подвергнутых воздействию только вируса. Это
было статистически значимо при α = 0,1 по методу Мэнтела-Хэнсзела. Ни у
одной из восьми павших контрольных рыб, обработанных медью, не
обнаружили вирус, в то время как вирус был выделен от 84 из 85
экспериментальных рыб.
Таблица 1. Влияние обработки медью на заражение радужной форели
вирусом ИГНа.
Обработкаб
Доля
%
Количество рыб, у
смертности
смертности
которых выделили
вирус,/количество
исследованных рыб
Высокий уровень
4/25
16
0/4
25/25
100
21/21
2/25
8
0/2
23/25
92
23/23
1/25
4
0/1
22/25
88
21/22
1/25
4
0/1
19/25
76
19/19
меди
Вирус+высокий
уровень медив
Средний уровень
меди
Вирус+средний
уровень меди
Низкий
уровень
меди
Вирус+низкий
уровень меди
Контроль
(без
обработки)г
Только вирус
а
б
Средний вес рыбы составлял 0,2 г.
Группы из 50 рыб обрабатывали водой, содержавшей 9,6 мкг (высокий
уровень), 5,8 мкг (средний), 4,0 мкг (низкий) меди на литр воды в течение 1
недели. Затем половину рыб каждой группы заражали вирусом, другую
половину – только медью, она служила в качестве контроля.
в
Используемая доза вируса составляла 105 БОЕ/мл, а время экспозиции – 24
часа.
г
Поставляемая для резервуаров вода содержала 0,9 мкг меди в литре.
Поскольку доза вируса, применявшаяся в описанном выше эксперименте,
приводила к гибели 76% рыбы, обработанной только вирусом, эксперимент
решили
повторить
с
использованием
половины
дозы
контрольного
заражения, чтобы определить, будет ли действие меди более выраженным,
при пониженной дозе вируса. Результаты этого эксперимента (таблица 2)
показывают еще нагляднее действие меди как стрессового фактора,
поскольку в группах с высоким, средним и низким уровнем меди смертность
была примерно вдвое выше, чем в контрольной группе, обработанной
вирусом (значимо при α = 0,05).
Таблица 2. Влияние обработки медью на заражение радужной форели
вирусом ИГНа
Обработкаб
Доля
%
Количество рыб, у
смертности
смертности
которых выделили
вирус,/количество
исследованных рыб
Высокий уровень
1/50
2
0/1
41/50
82
40/41
0/50
0
36/50
72
0/50
0
38/50
76
меди
Вирус+высокий
уровень медив
Средний уровень
меди
Вирус+средний
36/36
уровень меди
Умеренно низкий
уровень меди
Вирус+умеренно
низкий
уровень
34/38
меди
Низкий
уровень
0/50
0
23/50
46
0/50
0
20/50
40
меди
Вирус+низкий
20/23
уровень меди
Контроль
(без
обработки)г
Только вирус
а
б
18/20
Средний вес рыбы составлял 0,25 г.
Группы из 100 рыб обрабатывали 9,5 мкг (высокий уровень), 5,1 мкг
(средний уровень), 3,9 (умеренно низкий уровень), 2,1 мкг (низкий уровень)
меди на литр воды в течение 1 недели. Затем половину каждой группы
заражали вирусом, а другая половина служила контролем для обработки
медью.
в
Используемая доза вируса составляла 104,7 БОЕ/мл, а время экспозиции – 24
часа.
г
Поставляемая для резервуаров вода содержала 1,6 мкг меди в литре.
Не наблюдалось статистически значимых различий между группой,
обработанной низким уровнем меди и вирусом, и контрольной группой,
подвергнутой воздействию вируса. Это, вероятно, отражает тот факт, что
почти не было различий между уровнями меди в воде (2,1 против 1,6 мкг/л).
Влияние продолжительности обработки медью. В описанных выше
экспериментах продолжительность обработки рыбы медью была выбрана
произвольно – 7 дней. Чтобы определить, влияла ли продолжительность
экспозиции на реакцию, группы рыб обрабатывали 10 мкг меди на литр в
течение 1, 3, 5, 7 и 9 дней до заражения вирусом. Результаты этого
эксперимента (таблица 3) снова показывают действие меди как стрессового
фактора, так как смертность была выше во всех группах, подвергавшихся
стрессу, по сравнению с вирусным контролем.
Таблица 3. Влияние продолжительности обработки медью на заражение
радужной форели вирусом ИГН
Продолжительность
обработки медью
Доля
%
смертности смертности
(дни)а
Количество рыб, у
которых выделили
вирус,/количество
исследованных рыб
Только медь
1
0/50
0
3
1/50
2
0/1
5
1/50
2
0/1
7
0/50
0
9
0/50
0
1
47/50
94
46/46
3
43/50
86
32/34
5
40/50
80
28/29
7
42/50
84
22/22
9
32/50
64
23/23
Только вирус
20/50
40
20/20
Без обработки
1/50
2
0/1
Медь+вирусб
Контроль
а
Рыбу обрабатывали 10 мкг меди на литр воды; средний вес рыбы составлял
0,2 г.
б
Доза вирус составляла 104,7 БОЕ/мл, а время воздействия – 24 часа.
Интересно, что почти не было различия в показателях смертности в группах,
обработанных медью в течение 1, 3, 5 и 7 дней до заражения вирусом.
Фактически наиболее высокая смертность наблюдалась у тех рыб, которых
обрабатывали только в течение 1 дня, а процент смертности снижался на
протяжении 3, 5 и 7 дней. Регрессионный анализ данных показывает, что это
уменьшение статистически значимо при α = 0,01. Это снижение может быть
результатом акклимации рыбы к меди с течением времени; однако даже при
акклимации рыба, обработанная в течение 9 дней, была более восприимчивой
к вирусу, чем контрольная необработанная рыба.
Влияние дозы вируса. Затем авторы исследовали влияние дозы вируса
на необработанную и обработанную медью рыбу. Хотя рыба, использованная
в этом эксперименте, была несколько крупнее, чем в предыдущих
исследованиях, влияние обработки медью снова очевидно (таблица 4).
Таблица 4. Влияние дозы вируса на заражение ИГН нормальной радужной
форели и форели, обработанной медью
Обработка
Доля
%
смертности смертности
Количество рыб, у которых
выделили вирус,/количество
исследованных рыб
Только вируса
105
9/25
36
8/9
104
6/25
24
5/5
103
3/25
12
2/3
102
0/25
0
101
0/25
0
0
1/25
4
0/1
105
17/25
68
14/14
104
13/25
52
11/11
103
12/25
48
10/12
102
4/25
16
3/4
Вирус+медьб
101
0/25
0
0
1/25
4
0/1
а
Значения выражены в БОЕ/мл воды; время экспозиции составляло 24 часа.
б
Форель (средний вес – 0,7 г) обрабатывали водой, содержавшей 6 мкг меди
на литр воды в течение 7 дней до заражения вирусом.
Интерес представляет также тот факт, что наблюдалось 16% смертности у
рыб, подвергнутых стрессу и обработанных вирусом в дозе 100 БОЕ, тогда
как не было ни одного смертельного случая у необработанных рыб при этой
дозе вируса. Анализ этих данных по методу Мэнтела-Хэнсзела показывает,
что рыба, обработанная медью, была более восприимчивой к вирусу, чем
необработанная при α = 0,01.
Обсуждения
Тяжелые металлы широко распространены в водных системах и могут
влиять на популяции рыб, снижая процессы их репродукции, скорость роста
и продолжительность жизни. В этом исследовании мы представили
доказательства того, что обработка радужной форели медью может также
повышать ее восприимчивость к вирусу ИГН. Эксперимент был спланирован
таким образом, чтобы смоделировать природные условия, при которых как
вирус, так и медь вносили в воду, и уровень меди был вполне реальным, если
исходить из того, что она может присутствовать в реках.
Механизм действия меди как стрессового фактора неизвестен.
Гормоны, особенно кортикостероиды, как полагают, являются медиаторами
физиологических реакций, вызываемых большинством стрессовых агентов.
Усиленная обработка нерки медью вызывала выраженное, зависимое от дозы
увеличение кортикоидов в течение 24 часов (3). Обработка молодого кижуча
медью также вызывала повышение уровня кортизола в сыворотках, снижение
уровня хлоридов в сыворотках и снижение выживаемости рыбы в
зависимости от дозы, когда рыбу заражали водой, содержавшей соли (10).
Считают, что вторичные реакции на стресс, такие, как изменения в плазме,
уровней сахара в печени, клеточного профиля крови и иммуносупрессия,
возникают
в
ответ
на
повышение
кортикостероидных
гормонов
и
катехоламинов.
Подавление иммунного ответа, возможно, представляет собой один из
механизмов, обусловливающих повышение восприимчивости у рыб к вирусу.
Сообщали, что медь значительно снижает иммунный ответ у аквариумных
рыб, зараженных вирусом инфекционного панкреатического некроза (8).
Кроме того, вспышка вибриоза у угрей ассоциировалась со снижением у них
резистентности после обработки водой, содержавшей медь (9). Снижение
лейкоцитов и тромбоцитов у лососевых вследствие стресса объясняется
уменьшением числа циркулирующих малых лимфоцитов (5). Полагают, что
эта лимфопения является причиной снижения резистентности к болезни у
рыб, подвергнутых стрессу, поскольку лимфоциты участвуют в иммунном
ответе млекопитающих и других позвоночных (6).
Интересно было бы определить, могут ли другие тяжелые металлы (и
другие химические загрязнители окружающей среды, такие, как пестициды,
сточные воды целлюлозных заводов и т.д.) вызывать у рыб реакцию,
подобную той, о которой сообщили здесь для меди. Поскольку известно, что
внешне здоровая рыба может носить как вирусные, так и бактериальные
патогены, возможно, что спорадический занос химического загрязнителя в
бассейн реки может привести к сильному стрессу у этих носителей, вызвав
репликацию патогена и его высвобождение из хозяина. Такое событие могло
вызвать вспышку болезни, особенно на рыбоводных заводах, где плотность
популяции высокая.