Вопросы к экзамену по дисциплине «Основы генетической инженерии» инженерии.
advertisement
Вопросы к экзамену по дисциплине «Основы генетической инженерии» 1.Рекомбинантные ДНК и определение генной инженерии. 2.Основные виды мутаций ДНК in vitro. 3.Общая схема клонирования рекомбинантных ДНК. 4.Роль генной инженерии в молекулярнобиологических и генетических исследованиях. 5.Различные способы получения замен нуклеотидов (дезаминирование цитозина, включение аналогов нуклеотидов и др.). 6.Роль генной инженерии в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. 7.Мутагенез ДНК In vitro с помощью олигонуклеотидов заданной последовательности. Химический синтез олигонуклеотидов. 8.Характеристика репрессоров как элементов, контролирующих синтез индуцибельных ферментов. 9.Оперонная организация бактериальных генов. Модель Ф. Жакоба и Ж. Моно на примере лактозного (lac) оперона. 10.Процессинг первичных транскриптов эукариотических генов. Альтернативный сплайсинг. 11.Клетки растений в культуре: каллусы, суспензии клеток, протопласты. Создание гибридных растений путем слияния протопластов. 12.Участки прокариотических генов, важные для регуляции транскрипции и трансляции (промоторы, последовательность ШайнаДальгарно и др.). 13.Корончатые галлы – опухоли, индуцируемые некоторыми почвенными бактериями. Плазмиды, индуцирующие опухоли. 14.Характеристика Ti-плазмид. Интеграция ТДНК с хромосомой растений. 15.Использование ДНК Ti-плазмиды в качестве вектора. Менделевское наследование Т-ДНК. 16.Повторяющиеся последовательности эукариотических ДНК. 17.Характеристика ферментов рестрикции, их классификация. Изошизомеры. 18.Инсерционные последовательности (IS) и транспозоны (Tn) бактерий (на примере Tn3). 19.Методы трансформации растительных протопластов, клеток и тканей. 20.Механизм аттенуации транскрипции на примере триптофанового оперона. 21.Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты. Принцип метода гибридизации нуклеиновых кислот. 22.Основные системы «вектор-хозяин» у прокариот. Основные свойства векторов. 23.Использование Т-ДНК для выделения генов растений. Практическое применение генной инженерии растений с использованием Tiплазмид. 24.Основные методы секвенирования ДНК. Каковы принципы каждого из этих методов? 25.Каулимовирусы и вирус мозаики цветной капусты (CaMV) как наиболее перспективные вирусные векторы для введения генов в растения. 26.Прием встраивания вирусной ДНК в геном растения с помощью Т-ДНК агробактерии – «агроинфекция». 27.Использование рестриктаз для получения «библиотек» рекомбинантных ДНК. Клонирование фрагментов ДНК «методом дробовика». 28.Использование вирусных регуляторных последовательностей (промоторы, энхансеры) для экспрессии генов, вводимых в растения. 29.Клонирование рекомбинантных ДНК с помощью векторов на основе бактериофага l. 30.Преимущества дрожжей для генетических исследований и для изучения регуляции экспрессии эукариотических генов. 31.Плазмиды дрожжей. Повышение эффективности трансформации с помощью дополнительных точек начала репликации (элементов автономной репликации, ЭАР). 32.Клонирование ДНК в фаге М13; основное его преимущество. 33.Использование плазмидных генов устойчивости к антибиотикам для селекции клонированных рекомбинантных ДНК. 34.Использование радиоактивных зондов для обнаружения клонированных генов. Основные методы получения радиоактивных нуклеиновых кислот (ник-трансляция, мечение 5’- и (или) 3’концов). 35.Общая характеристика ДНК-содержащих онкогенных вирусов на примере вирусов SV40 и полиомы. 36.Направленное встраивание клонированной ДНК в хромосомы дрожжей. 37.Синтез и клонирование комплементарных ДНК (кДНК). Характеристика фермента обратной транскриптазы. 38.Особенности экспрессии ранних (T- и tбелки), а также поздних (VP1-, VP2-, и VP3белки) генов вируса SV40. 39.Организация РНК-содержащих онкогенных вирусов (ретровирусов). Провирусная ДНК, длинные концевые повторы (LTR). 40.Особенности трансляции эукариотических мРНК. Процессинг новосинтезированных белков. 1.Рекомбинантные ДНК и определение генной инженерии. Генная инженерия – это ряд специальных методов, связанных с манипулированием генами (ДНК) и созданием генно-инженерных конструкций. С помощью генно-инженерных методов создаются рекомбинантные молекулы ДНК, сконструированные in vitro в соответствии с определенными научными целями. Отбор и клонирование рекомбинантных ДНК является основой биотехнологических процессов, картирования хромосом, секвенирования геномов, манипулирования генами и коррекции генома с целью лечения наследственных болезней человека. Генная инженерия зародилась в начале 70-х годов и добилась больших успехов. В 1978 г. впервые был получен инсулин генноинженерным методом, а в 1980 г. была разработана технология получения соматротропина. Принципы генетической инженерии - Конструирование рекомбинантных молекул ДНК. - Перенос рекомбинантной ДНК в клетки или вирусные частицы. Клонирование и амплификация рекомбинантной ДНК в клетках. Рекомбинантная ДНК - ДНК, полученная в результате объединения молекулы векторной ДНК, способной к репликации в определенной клетке-хозяине, с ДНК, кодирующей продукт, синтез которого желательно осуществить в этой клетке-хозяине. Векторы для получения рекомбинантных ДНК могут быть плазмидами, вирусами или искусственными хромосомами на основе дрожжевых или животных хромосомных элементов. Существует большой набор различных систем, позволяющих осуществлять экспрессию гетерологичных генов в бактериях, дрожжах и других организмах, включая клетки человека. Часто эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме: -из организма - донора нужных генов экстрагируют нашивную (чужеродную, клонируемую) ДНК; подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования) с образованием новой рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор встроенная ДНК»); -эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией; -идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки); -получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками - хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. 2. Основные виды мутаций ДНК in vitro. Генные мутации выражаются в изменении структуры отдельных участков ДНК. По своим последствиям генные мутации делятся на две группы: мутации без сдвига рамки считывания и мутации со сдвигом рамки считывания. Мутации без рамки считывания происходят в результате замены нуклеотидных пар, при этом общая длина ДНК не изменяется. Точковые мутацииизменение последовательности нуклеотидов в пределах одного гена. Их можно разделить на несколько типов: 1. Транзиции. При транзиции один пиримидин замещается другим пиримидином или один пурин замещается другим пурином: нр, пара А-Т становится парой Г-Ц, или наоборот. Азотистая кислота- это мутаген, который вызывает транзиции. Она конвертирует цитозин а урацил. Цитозин обычно дает пару с гуанином, но урацил- с аденином. В результате пара Ц-Г становится парой Т-А, когда А спаривается с Т в следующей репликации. Азотистая кислота оказывает такой же эффект на аденин, превращая пару А-Т в пару Ц-Г. 2. Трансверзии. Пурин замещается пиримидином или наоборот, н-р, пара А-Т становится парой Т-А или Ц-Г. 3. Мутация сдвига рамки считывания — тип мутации в последовательности ДНК, для которого характерна вставка или делеция нуклеотидов, в количестве не кратном трем. В результате происходит сдвиг рамки считывания при транскрипции мРНК. Хромосомные мутации: 1. Инверсиихромосомные перестройки, связанные с поворотом отдельных участков хромосомы на 180◦. Происходит изменение порядка расположения генов на хромосоме, при этом может быть утрата одних функций и приобретение новых. 2 Транслокациихромосомные перестройки, в результате которых часть хромосомы переносится в друге место той же хромосомы или в другую хромосому, но общее число генов не изменяется. Внутрихромосомные танслокации возникают в результате образования трех разрывов и перенесения хромосомного сегмента в другой район той же хромосомы. Межхромосомные реципрокные транслокации возникают в результате образования двух разрывов и обмена участками негомологичных хромосом. 3.Делеции- выпадение участков хромосомы или нескольких генов. 4. Дупликации- удвоение генов; дополнительный наследственный материал, идентичный тому, который уже есть в геноме. Геномные мутации: 1. Анеуплоидияизменение кариотипа, при котором число хромосом в клетках не кратно гаплоидному набору (n). Отсутствие в хромосомном наборе диплоидного организма одной хромосомы называется моносомией (2n1); отсутствие двух гомологичных хромосом — нуллисомией (2n-2); наличие дополнительной хромосомы называется трисомией (2n+1). Анеуплоидия возникает в результате нарушения сегрегации хромосом в митозе или мейозе. 2. Полиплоидия- изменение числа хромосом, когда в клетке присутствует более двух гаплоидных наборов. 3.Общая схема клонирования рекомбинантных ДНК. 1. Из организма донора извлекают нужную ДНК, подвергают ее ферментативному гидролизу и извлекают нужный ген. 2. У бактерий или других клеточных структур извлекают вектор (плазмиду) и его разрезают. 3. Вставляют в вектор фрагмент ДНК. 4. Полученную конструкцию вводят в клетку хозяина, где она передается потомкам. 5. Получают специфический белковый продукт, синтезируемый клетками хозяина. 4.Роль генной инженерии в молекулярнобиологических и генетических исследованиях. Возникновение ген-ой инженерии связано с развитием молекулярной биологии. Исследования позволили перейти от описания структуры и функции клеток на уровне органелл к установлению молекулярных механизмов протекающих в них процессов. Ученые 60-х годов считали, что репликации, транскрипции, трансляции и системы их регуляции разгаданы. Схема, показывающая однонаправленный поток ген-ой инф-ии, ДНК-РНК-белок, была названа основной догмой молекулярной биологии. Кодирование белков – важная, но не единственная функция ДНК, нужно было узнать, какова общая организация последовательностей ДНК, и каким образом отдельные гены взаимодействуют друг сдругом в геноме организма. Изучение биохим-их св-в клетки не давало надежды на установление деталей ген-ой организации. Для этого нужно было научиться "разрезать" ДНК в определенных местах. Ещё проблема – невозможность определения последтей нуклеотидов в ДНК. Знание ген-ого кода нельзя было применить, т.к. не было прочитано ни одного реально существенного ген-ого текста. Также нельзя было выделить ген, ни расшифровать его структуру и структуру последовательностей нуклеотидов, которые к нему примыкают и обеспечивают его экспрессию. Причина – простейшие организмы содержат очень длинные молекулы ДНК (геном кишечной палочки составляет несколько миллионов н.п.), а геном млекопитающих и человека около 3 млрд пар оснований. Но в течении последующих лет развивались хим-ие и энзимологические матоды, которые привели к созданию рекомбинантных ДНК и положат начало ген-ой инженерии Г.и. - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми комбинациями наследственных св-в. В основе г.и. лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям отнесят установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же а/к в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Т.о., изменение наследственных св-в организма с помощью г.и. сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования. 5. Различные способы получения замен нуклеотидов (дезаминорование цитозина, включение аналогов нуклеотидов и др.) Аналоги оснований по молекулярной структуре очень похожи на основания, нормально входящие в цепи ДНК. Эти соединения приводят к мутациям потому, что они могут существовать в альтернативных (таутамерных) состояниях. В каждом из двух состояний аналоги спариваются с разными нормальными основаниями, в результате чего может произойти их замена. Например, 5-бромурацил в нормальном состоянии спаривается с аденином, в более редком таутамерном состоянии- с гуанином. В связи с этим 5-бромурацил индуцирует транзицию, когда включается в ДНК в одном состоянии, затем в следующем раунде репликации ДНК превращается в более редкую таутамерную форму. Другим широко известным аналогом оснований является 2-аминопурин. Ряд химических агентов действуют как мутагены, непосредственно модифицируя химическую структуру и свойства оснований. К ним относятся дезаминирущие, гидроксилирующие и алкилирующие агенты. Азотистая кислота (HNO2) осуществляет окислительное дезаминирование, т.е. удаляет аминогруппы (NH2) из таких оснований, как гуанин, цитозин и аденин. В результате дезаминирования гуанина азотистой кислотой образуется ксантин, но, так как это пуриновое основание имеет тот же тип спаривания, мутация не проявляется. Однако когда модифицируется цитозин, получается урацил (который спаривается с аденином). В итоге происходит транзиция от C-G К Т-А в ходе акта репликации. Аналогичным образом азотистая кислота модифицирует аденин в гипоксантин- основание, спаривающееся с цитозином, а не с тимином, что продуцирует транзицию А-Т в G-C. Другим мутагеном, модифицирующим основания, является гидроксиламин (NH2OH), который специфически реагирует с цитозином, добавляя гидроксильную группу (-OH), в результате чего он спаривается уже с аденином, а не с гуанином. Таким образом, обработка гидроксиламином индуцирует транзиции C-G в Т-А. Метилметансульфонат алкилирует гуанин, т.е. добавляет группы –CH3 или –CH2CH3 к кислороду в 6-й позиции, в результате чего образуется О6-алкилгуанин или О6-мтилгуанин. Метилированный гуанин будет спариваться с тимином, а не с цитозином, давая транзицию GC в А-Т. 6. Роль генной инженерии в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. Промышленная микробиология - развитая отрасль промышленности, во многом определяющая сегодняшнее лицо биотехнологии. И производство практически любого препарата, сырья или вещества в этой отрасли сейчас так или иначе связано с генетической инженерией. Дело в том, что генетическая инженерия позволяет создавать микроорганизмы - сверхпродуценты того или иного продукта. Имея микроорганизм сверхпродуцент, можно получить больше продукции на том же оборудовании без расширения производства, без дополнительных капитальных вложений. К тому же микроорганизмы растут в тысячу раз быстрее, чем растения или животные. Н-р, с помощью генетической инженерии можно получить микроорганизм, синтезирующий витамин В2 (рибофлавин), используемый в качестве кормовой добавки в рационах животных. Его производство данным способом эквивалентно строительству 4-5 новых заводов по получению препарата обычным химическим синтезом. Особо широкие возможности появляются у генетической инженерии при производстве ферментов-белков - прямых продуктов работы гена. Увеличить производство фермента клеткой можно, либо введя в нее несколько генов этого фермента, либо улучшив их работу путем установки перед ними более сильного промотора. Так, продукция фермента в-амилазы в клетке была увеличена в 200 раз, а лигазы - в 500 раз. С генетической инженерией связаны надежды на расширение ассортимента микробиологических удобрений и средств защиты растений, увеличение производства метана из бытовых и сельскохозяйственных отходов. Путем выведения микроорганизмов, более эффективно разлагающих различные вредные вещества в воде и почве, можно существенно повысить эффективность борьбы с загрязнением окружающей среды. Большие надежды возлагаются на генетическую инженерию растений. Только с ее помощью можно радикальным образом расширить границы изменчивости растения в сторону каких-либо полезных свойств, передав ему гены от других (возможно, неродственных) растений и даже гены животного или бактерии. С помощью генетической инженерии можно определять присутствие вирусов в сельскохозяйственных растениях, предсказывать урожайность, получать растения, способные противостоять различным неблагоприятным факторам внешней среды. Сюда относят устойчивость к гербицидам (средствам борьбы против сорняков), инсектицидам (средствам борьбы против насекомых-вредителей), устойчивость растений к засухе, к засолению почв, фиксации растениями атмосферного азота и т. п. В довольно длинном перечне свойств, которыми люди хотели бы наделить сельскохозяйственные культуры, не последнее место занимает устойчивость к веществам, применяемым против сорняков и вредных насекомых. Благодаря генетической инженерии неожиданно переплетаются интересы животноводства и медицины. В случае пересадки корове гена интерферона (лекарственного препарата, очень эффективного в борьбе с гриппом и рядом других заболеваний), из 1 мл сыворотки можно выделить 10 млн. ед. интерферона. Аналогичным способом можно получить целый ряд биологически активных соединений. С помощью генетической инженерии можно осуществлять и мутационный биосинтез антибиотиков. Суть его сводится к тому, что в результате целенаправленных изменений в гене антибиотика получается не законченный продукт, а некий полуфабрикат. Подставляя к нему те или иные физиологически активные компоненты, можно получить целый набор новых антибиотиков. Уже производятся, проходят клинические испытания или активно разрабатываются следующие препараты: инсулин, гормон роста, интерферон, фактор VIII, целый ряд противовирусных вакцин, ферменты для борьбы с тромбами (урокиназа и тканевой активатор плазминогена), белки крови и иммунной системы организма. Изучаются молекулярно-генетические механизмы возникновения раковых заболеваний. Кроме того, разрабатываются методы диагностики наследственных заболеваний и пути их лечения, так называемая генотерапия. 7. Мутагенез ДНК in vitro с помощью олигонуклеотидов заданной последовательности. Химический синтез олигонуклеотидов. В 1978-1979 гг. С. Джиллам и М. Смит с соавторами экспериментально обосновали возможность использования синтетических олигонуклеотидов в качестве мутагенов. Объектом мутагенеза авторы выбрали фаг 0X174, имеющий небольшую одноцепочечную кольцевую ДНК, для которой уже была известна последовательность нуклеотидов. Одноцепочечную кольцевую ДНК гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом, имевшим определенные отличия от соответствующей последовательности фагового генома, например точечную замену одного из нуклеотидов. Данный олигонуклеотид использовали в качестве праймера для достройки второй цепи на ДНК-матрице. Эту реакцию осуществляли с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и ДНК-лигазы. Затем препарат ДНК обрабатывали Нуклеазой S1 для гидролиза частично двухцепочечных молекул фаговой ДНК и трансфицировали им сферопласты Е. coli. В процессе репликации образовывалось смешанное фаговое потомство, состоявшее как из фагов дикого типа, так и из мутантных. Причем мутантная форма составляла около 15 % полученного потомства, хотя теоретически может достигать 50 %. Для увеличения выхода мутантов С. Джиллам и М. Смит использовали оригинальный метод селекции in vitro. Они подобрали условия, при которых синтетический олигонуклеотид-мутаген, имеющий точечную замену в последовательности дикого типа, мог гибридизоваться только с мутантной формой фаговой ДНК, но не с ДНК дикого типа. После полимеразной реакции и обработки Нуклеазой S1 происходило обогащение препарата ДНК мутантными формами. Двух циклов описанной процедуры было достаточно, чтобы выход мутантов повысить практически до 100 %. Анализ условий, необходимых для эффективного связывания с ДНК-матрицей олигонуклеотида, содержащего единичную нуклеотидную замену, и дальнейшего праймирования полимеразной реакции, показал, что в этом случае достаточно двух или трех комплементарных нуклеотидов на З'-конце и шести или семи — на 5'-конце от некомплементарного нуклеотида. Когда вводятся большие изменения, размер олигонуклеотида должен быть увеличен. Разработанный на модельной системе фага 0X174 метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза получил дальнейшее развитие на других типах молекул ДНК, прежде всего на ДНК нитевидных фагов и плазмидах. Химический синтез олигонуклеотидов. Первый нуклеотид последовательности через его 5'фосфатную группу химически закрепляют на твердой подложке, н-р, полистирола. Все потенциально химически активные группы и атомы его нуклеинового основания (аминогруппы, кислород) временно блокируются присоединением инертной «защиты». 3'-ОН группа сахара не блокируется. Все нуклеотиды, подлежащие последовательному присоединению тоже заблаговременно защищаются не только по нуклеиновым основаниям, но и по 3'-ОН группе рибозы или дезоксирибозы. Активность фосфорной кислоты, присоединенной по 5'положению сахара умеряется «навеской» хлорбензола по одному из ее кислородов. Таким образом, для реакции остается свободной только ОН-группа этой кислоты. Теперь в реакционную среду вносят второй по заданному порядку нуклеотид. В реакции между двумя ОНгруппами отщепляется вода и устанавливается ковалентная фосфодиэфирная связь двух нуклеотидов. Затем снимается химическая защита с 3'-ОН группы только что присоединившегося второго нуклеотида и в реакционную среду вносят третий защищенный нуклеотид. И так далее. Разумеется, отщепление воды и образование фосфодиэфирной связи происходит не само собой, а в присутствии сложного химического катализатора реакции. По окончании синтеза заданной цепочки олигонуклеотида все защиты снимаются и олигонуклеотид отделяется от твердой подложки. 8.Характеристика репрессоров как элементов, контролирующих синтез индуцибельных ферментов. Репрессор — регуляторный белок, подавляющий транскрипцию генов регулируемого им оперона в результате связывания с оператором.Репрессоры синтезируется под контролем гена-регулятора в кол-ве от 10 до 20 молекул на клетку в виде активной, т. е. способной непосредственно связываться с оператором, или неактивной форм. Образование активного репрессора характерно для индуцибельных ферментов, синтез к-рых начинается только при попадании в клетку специфических низкомолекулярных веществ — индукторов. Связывание индуктора с репрессором инактивирует репрессор и тем самым открывает синтез соответствующего ферментов (индукция). Для репрессибельных ферментов характерно образование неактивного репессора , активация которого происходит при попадании в клетку низкомолекулярных веществ — корепрессоров. При этом синтез ферментов, кодируемых опероном, прекращается (репрессия). Обычно индукторы и корепрессоры обозначают общим термином — эффекторы. Классическим примером репрессора служит LacI, подавляющий экспрессию лактозного оперона у кишечной палочки. Транскрипция генов lacZYA контролируются белкос-репрессором, кодируемым геном lac I. Гены lacZYA контролируются негативно: они транскрибируются до тех пор, пока не выключаются белком-регулятором. lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. lacY кодирует β-галактозид пермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки. lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу, фермент, переносящий ацетильную группу от ацетил-КoA на - β -галактозиды. Мутаций гена-регулятора обуславливает постоянную транскрипционную активность генов lacZYA. Белок Белок репрессор lac-репрессор связывается с оператором на старет транскрипций кластера lacZYA. Когда репрессор связывается с оператором,он предотвращает движение РНКполимеразы и инициацию транскрипций. Белок-репрессор имеет два сайта связывания: один для индуктора,другой для оператора. Когда индуктор связывается со своим сайтом, это изменяет конформацию молекулы белка, что изменяется связывающая способность другого сайта. Индуктор лактоза поступает в клетки, связывается с репрессором, в результате чего репрессор становится неспособным сдерживать транскрипцию и она начинается. При удалений индуктора репрессор вновь занимает положение на операторе,останавливая транскрипцию. 9.Оперонная организация бактериальных генов. Модель Ф. Жакоба и Ж. Моно на примере лактозного (lac) оперона. Оперон — функциональная единица генома у прокариот. Модель оперона прокариот была предложена Ф.Жакобом и Ж.Моно в 1961 г. для объяснения регуляции генов у E.coli, за что в 1965 году получили Нобелевскую премию. Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов). Лактозный оперон (lac оперон) — полицистронный оперон бактерий, кодирующий гены метаболизма лактозы. Лактозный оперон состоит из трех структурных генов – lacZ, lacY и lacA, продукты которых необходимы для использования лактозы в качестве источника углерода, промотора, с которым связывается РНК-полимераза, операторного участка (оператора), с которым связывается белок-репрессор – продукт гена lacI, Терминатор – это последовательность ДНК, которая распознается РНК- полмеразой как сигнал к прекращению транскрипции. lacZ кодирует фермент β-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. lacY кодирует β-галактозид пермеазу, переносит лактозу внутрь клетки. lacA кодирует β-галактозид трансацетилазу. Существует негативная также позитивная регуляция транскрипций у прокариот. Негативная регуляция: Ген-регулятор лактозного оперона (lacI) кодирует белок-репрессор. В активной форме этот белок-репрессор связывается с оператором и блокирует действие РНК-полимеразы. Такая негативная регуляция транскрипции наблюдается при достаточной концентрации глюкозы в клетке и в отсутствии избытка лактозы. При избытке лактозы её молекулы связываются с субъединицами репрессора с образованием репрессор-индукторного комплекса, в котором индуктор (лактоза) выступает в роли аллостерического регулятора, изменяющего конформацию белка- репрессора, что ведёт к инактивации репрессора. У инактивированного репрессора резко снижается сродство к зоне оператора, в результате чего репрессор отсоединяется от промотора, открывая «вход» для РНК-полимеразы. Позитивная регуляция: Если в клетке концентрация глюкозы достаточная для поддержания метаболизма, активация лактозного оперона не происходит. Глюкоза вызывает катаболитную репрессию, снижая уровень циклического АМФ-сигнал энергетического голода. Если нет глюкозы, то цАМФ соединяется с белком катаболической репрессии (САР) и образуется комплекс САР•цАМФ, активирующий посадку РНК-полимеразы на промотор. Это необходимо для связывания РНКполимеразы с промотором и обеспечения транскрипции. В присутствии лактозы lac-оперон включается и работает. Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный источнок энергии), то нет цАМФ - и активатор не образуется, lac-оперон работает слабо, без дополнительной индукции. 10. Процессинг первичных транскриптов эукариотических генов. Альтернативный сплайсинг. Предшественники рРНК являются более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК. Их созревание сводится к разрезанию прерибосомной РНК на более мелкие формы. У эукариот существуют четыре типа рРНК: 5S, 5,8S, 18S и 28S –рРНК. При этом 5S рРНК синтезируется отдельно, а большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными нуклеазами с образованием 5,8S, 18S и 28S рРНК. Процессинг предшественника тРНК: 1 Модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления. 2.Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга и удаления интрона в средней части пре-тРНК. 3.Формирование на 3̸- конце последовательности ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3̸- конца удаляются лишние нуклеотиды до «обнажения» триплета ЦЦА, у другх идет присоединение этой последовательности. Процессинг предшественника мРНК. При транскрипции участков ДНК, несущих информацию о белках, образуются гетерогенные ядерные РНК, по размеру намног превосходящие мРНК. Из-за мозаичной структуры генов эти гетерогенные РНК включают в себя информативные (экзоны) и неинформативные (интроны) участки. 1. Сплайсинг- особый процесс, в котором при участии мяРНК происходит удаление интронов и соединение экзонов. 2.Кэпирование. Процесс состоит в присоединении к 5̸- трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК 5̸- углерода N7метил- гуанозина. «Кэп» необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5-̸ конца. 3.Полиаденилирование- при помощи полиаденилат- полимеразы с использованием молекул АТФ просходит присоединение к 3-̸ концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент- поли(А)- хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3̸- конца. Альтернативный сплайсинг — процесс, в ходе которого экзоны, вырезаемые из пре-мРНК, объединяются в различных комбинациях, что порождает различные формы зрелой мРНК. Молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК, и соответственно, разных белков одного первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга: 1.Экзон может вырезаться или оставаться в составе мРНК. 2.Один из двух «взаимоисключающих» экзонов вырезается, а другой остаётся. 3. Использование альтернативного донорных сайтов: используются разные 5'-точки разрезания первичного транскрипта (донорные сайты), что изменяет 3'-границу вышележащего (upstream) экзона 4. Использование альтернативных акцепторных сайтов: используются разные 3'точки разрезания транскрипта (акцепторные сайты), так что меняется 5'-границы нижележащего (downstream) экзона. 5. Сохранение интронов в составе мРНК. В этом случае для сохранения функциональности белка интрон должен содержать последовательность нуклеотидов, не вызывающую сдвиг рамки считывания и не содержащую стоп-кодонов. Существуют и другие механизмы альтернативного сплайсинга. 11.Клетки растений в культуре: каллусы, суспензии клеток, протопласты. Создание гибридных растений путем слияния протопластов. Культурой клеток растений называется выращивание отдельных клеток, тканей и органов растений на искусственной питательной среде в асептических условиях. Кусочек простеризованной растительной клетки помещают в чашку Петри или пробирку на агаризованную питательную среду. После этого в ткани начинается интенсивное деление клеток. Клеточная масса быстро разрастается, образуя каллус. Каллус – это особый тип ткани, представляющий собой скопление недифференцированных клеток. Одним из направлений совершенствования метода культуры тканей был поиск возможностей выращивания одиночных клеток, результатом которого явилась разработка метода получения и выращивания клеточных суспензий. Культура клеток, или суспензионная культура, — это выращивание отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание. Протопласт — клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом. При слиянии протопластов сначала происходит их слипание—агглютинация, а затем собственно слияние мембран. Протопласты имеют отрицательный поверхностный заряд, поэтому взаимно отталкиваются. Для индуцированного слияния протопластов используют химический и электрический методы. Химический метод заключается в добавлении к суспензии протопластов веществ, стимулирующих слияние. Благодаря широкому поиску эффективного фюзогена (индуктора слияния) был найден полиэтиленгликоль (ПЭГ) — хорошо растворимый в воде полимер. Предварительная обработка суспензии смешанных протопластов концентрированным раствором ПЭГ (20 - 30%) вызывает их слипание. Через 10 - 15 мин ПЭГ удаляют отмыванием раствором с щелочным рH 9 - 11 и высоким содержанием Са2+ (100 - 300 мМ), и в этом растворе мембраны слепившихся протопластов сливаются. Методика “ПЭГ - высокое рН — высокое содержание Са2+" используется в большинстве лабораторий мира. Применяя эту обработку, удается вовлечь в слияние более 10% и даже до 50% протопластов. В начале 80-х годов был разработан метод электрослияния (частота слияния 20% и более). При этом для агглютинации и слияния протопластов используют электрическое поле, суспендируя их между двумя электродами. Слияние под действием электрического поля происходит с высокой эффективностью без применения каких-либо химических стимуляторов, при комнатной температуре и физиологических значениях рН. Протопласты могут сливаться как попарно, так и в большем количестве. Многоядерные продукты слияния - разрушаются. Первое сообщение о получении соматических гибридов на уровне растений появилось в 1972 году. Слияние протопластов приводит либо к образованию гибрида, либо к образованию цибрида. Соматический гибрид - продукт слияния и цитоплазмы, и ядра обоих протопластов. Цибрид - растение-регенерант, содержащее цитоплазму обоих родителей и ядро одного из них. При слиянии могут образовываться и асимметричные гибриды – продукты слияния, имеющие полный хромосомный набор одного из партнеров и часть хромосом другого партнера. Такие гибриды часто возникают при слиянии клеток организмов, филогенетически удаленных друг от друга. В этом случае вследствие неправильных делений клетки, обусловленных некоординированным поведением двух разнородных наборов хромосом, в ряду поколений теряются частично или полностью хромосомы одного из родителей. Асимметричные гибриды бывают устойчивее, плодовитее и жизнеспособнее, чем симметричные, несущие полные наборы генов родительских клеток. В целях асимметричной гибридизации возможна избирательная обработка клеток одного из родителей для разрушения части его хромосом. Возможен прицельный перенос в клетку нужной хромосомы. Гибриды могут быть получены путем слияния трех и более родительских клеток. Из таких гибридных клеток могут выращены растения – регенеранты. 12.Участки прокариотических генов, важные для регуляции транскрипции и трансляции (промоторы, последовательность ШайнаДальгарно и др.). Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции. Ген — единица наследственной информации. Участки прокариотических генов, важные для регуляции транскрипции и трансляции: Промотор- это участок ДНК, с которым взаимодействует РНК-полимераза,т.е. это участок с которого начинается инициация транскрипций. Оператор- тот участок ДНК, с которым специфически связывается белок-репрессор или белок-активатор. Терминатор– последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, находятся на 3'-конце гена. Последовательность Шайна — Дальгарно — пуринбогатая последовательность из шести нуклеотидов AGGAGG ,служит сайтом связывания рибосом на молекуле мРНК прокариот, обычно на расстоянии около 10 нуклеотидов до стартового кодона AUG. Комплементарная последовательность CCUCCU, называемая последовательностью анти-Шайна — Дальгарно, располагается на 3'конце молекулы 16S рибосомной РНК. Наиболее консервативными являются -10 (TATAAT) и -35 (TTGACA) элементы, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами сигма-субъединицы, соответственно. Расстояние между -10 и -35 элементами у большинства промоторов составляет 17-18 нуклеотидов. ТАТА бокс – это богатая тимином и аденином последовательность из 6 или 7 пар оснований и расположен на расстоянии примерно 10 нуклеотидов до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция . ЦААТ(СААТ)-бокс-консерватиный регуляторный элемент(последовательность ГГССААТСТ), расположен на расстоянии примерно 35 нуклеотидов до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция . Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, который расположен на один нуклеотид левее 10 элемента и узнается районом 2.5 сигмасубъединицы . Еще одним элементом, который влияет на эффективность узнавания некоторых промоторов, является участок ДНК между -10 элементом и стартовой точкой транскрипции, который получил название дискриминатора . Наличие G/C-богатого дискриминатора уменьшает стабильность промоторных комплексов и эффективность инициации транскрипции РНК E. coli . Точная роль дискриминатора в узнавании промоторов до последнего времени оставалась неизвестной. 13.Корончатые галлы – опухоли, индуцируемые некоторыми почвенными бактериями. Плазмиды, индуцирующие опухоли. В группе почвенных бактерий Agrobacteria есть несколько видов,которые могут заражать растения и вызывать образование корончатых галлов, то есть наростов-опухолевой ткани,растущей в месте заражения.К этим бактериям чувствительны почти все двудольные растения, а злаки и однодольныенечувствительны.Клетки корончатых галлов имеют способность к неограниченному росту. В культуре они растут в отсутствие гормонов. Особо сильнейшим индуктором опухолей является Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия,попадая в растение через ранки,вводит чужеродные гены и заставляют его синтезировать соответствующие белки. В результате растительные клетки размножаются и образуют галл, то есть опухоль, обычно в области корневой шейки. Агентом, вызывающим опухоль,является плазмида этой бактерий, которая называется Tiплазмиды(с перевода от английского означает «вызывающий опухоль»). Эти плазмиды представляют собой кольцевую молекулу ДНК. Они размножаются в бактериальных клетках как независимо реплецирующие генетические элементы. В 1977 году американские генетики доказали,что опухоли корончатого галла возникают в результате включения в растения ДНК определенного фрагмента Ti-плазмид агробактерий, названного Т-ДНК. В опухолевых клетках были обнаружены химические соединения нового класса- опины, которых нет в здоровых клетках того же растения. Опины-производные аминокислоты аргинина. К настоящему времени изучены два типа опинов: октопин ,состоящий из аргинина и пировиноградной кислоты, и нопалинсоединение аргинина с кетоглутаровой кислотой. Опухолевые клетки синтезируют либо октопин, либо нопалин, это зависит от щтамма бактерий, индуцировавшей опухоль. Бактерий используют опинов в качестве источника углерода и азота, клетки растений не способны утилизировать их. Ti-плазмиды классифицируют по типу индуцируемого опина. Каждая клетка А. tumefaciens содержит один тип плазмиды:либо октопиновую, либо нопалиновую. После заражения часть Ti-плазмиды встречается в хромосомах клеток растения-хозяина. Следовательно, A. Tumefaciens встраивает часть своего генома в ДНК растительной клетки.Участок Ti-плазмиды,встречающийся в хромасомах растит=х клеток, называется Тобластью в бактерий и Т-ДНК в клетках растений.Т-область содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов.Все гены,ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом-в vir-области. Т-ДНК в Ti-плазмиде с обеих сторон ограничена идентичными повторами длиной в 25 пар нуклеотидов, которые играют роль в переносе т-ДНК в растение. Недостаток этих плазмид состоит в том,что некоторые гены, находящиеся в ТДНК,заставляют расти клетки растений независимо от гормонов,вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки.И поэтому трудно регенировать норм растение из клеток,содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостатокбольшие размеры Ti-плазмиды, из-за которой затруднены какие-либо манипуляций с ней. 14.Характеристика Ti-плазмид. Интеграция Т-ДНК с хромосомой растений. Некоторые виды агробактерий могут поражать клетки двудольных растений,что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный рост растения. Одним из самых сильных индукторов опухолей служит почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens. Способность этой бактерий к образованию опухоли связана с плазмидой, получившей название Ti-плазмида-естественные векторы, обладающие всеми функциями, необходимые для переноса ген.информаций в растениях. Эти плазмиды различаются по типу кодируемых опинов-белков,которые используются бактериями в качестве источников азота и углерода. Плазмиды кодируют 2 типа опинов: либо октопин, либо нопалин. Каждая клетка А. tumefaciens содержит один тип плазмиды:либо октопиновую, либо нопалиновую.Плазмида содержит Т-ДНК, которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Участок Ti-плазмиды,встречающийся в хромасомах растит-х клеток, называется Тобластью в бактерий и Т-ДНК в клетках растений.Т-область содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, синтез опинов Кроме ТДНК в плазмидах имеются область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir)..Все гены,ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а рядом-в vir-области. Недостаток этих плазмид состоит в том,что некоторые гены, находящиеся в ТДНК,заставляют расти клетки растений независимо от гормонов,вносимых в питательную среду, на которой культивируются данные клетки.И поэтому трудно регенировать норм растение из клеток,содержащих полную последовательность Т-ДНК. Другой недостатокбольшие размеры Ti-плазмиды, из-за которой затруднены какие-либо манипуляций с ней. Интеграция Т-ДНК с хромосомой растений. Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК.Индукция трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции ТДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение.В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНКполимеразой II растения-хозяина. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода. 15.Использование ДНК Ti-плазмиды в качестве вектора. Менделевское наследование Т-ДНК. Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, что и позволяет использовать их в качестве векторов для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения ТДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы, под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. Tumefaciens. В первую очередь необходимо встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность используют другие стандартные плазмиды.Т -ДНК вырезают из Tiплазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают , то есть клонируют в кишечной палочке. Затем конъюгации вводят в клетки агробактерии, несущие полную Tiплазмиду. Между Т-сегментами Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Тсегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.Но широко используют бинарные векторы, которые упрощают этот весь процесс. Бинарные векторы представляют собой бактерий, содержащие две разные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Вторая Ti-плазмида содержит область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Идеальная векторная система на основе Tiплазмиды должна: 1) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях, маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. 16. Повторяющиеся последовательности эукариотичеких ДНК В современной классификации повторов принято различать высокоповторяющиеся последовательности, число которых превышает 105 на гаплоидный геном, и умеренно повторяющиеся, представленные 10-104 копиями. Высокоповторяющиеся последовательности включают функционально и структурно обособленную часть генома, представленную сателлитными ДНК. Сателлитные ДНК состоят из коротких тандемных повторов длиной 1-20 н.п., организованных в длинные блоки. Свое название эти ДНК получили на основании того, что при анализе суммарной эукариотической ДНК центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия они сопровождали основной пик оптической плотности в виде плеча (спутника, сателлита). Для сателлитов характерен ряд свойств: а) быстрая и точная реассоциация в процессе ренатурации ДНК; б) множество копий; в) простая первичная структура; г) гомогенный состав (протяженные кластеры одних и тех же повторяющихся блоков последоватеьностей); д) пурин-пиримидиновая ассиметрия в распределении нуклеотидов по цепям ДНК; е) концентрирование в прицентромерном гетерохроматине; ж) ограниченная репликация при политенизации хромосомя; з) нахождение в составе хромосом в виде тандемно (друг за другом) расположенных кластеров. Содержание сателлитной ДНК в геноме эукариот может достигать 5-50% от суммарного количества ДНК. В составе одного генома можно обнаружить несколько разных сателлитных ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей сателлитных ДНК показано наличие в их составе тандемных повторов из нескольких нуклеотидов. К умеренно повторяющимся последовательностям относятся последовательности, представленные в геноме десятками или несколькими сотнями копий. Среди них можно выделить структурно и функционально различающиеся геномные фракции. Существуют семейства генов, построенные из сгруппированных тандемно повторяющихся копий. Они участвуют в осуществлении жизненно важных общеклеточных функций. Это гены гистонов, тРНК и рРНК. Большую разнородную группу составляют подвижные (мобильные) генетические элементы. На их долю приходится значительная часть генома (10-20%). Подвижные элементы рассеяны по геному. В геноме обнаруживаются также рассеянные или находящиеся в кластерах гены, кодирующие гомологичные белки со сходными функциями. Это гены разных видов актина, тубулина, глобина, иммуноглобулина, гены теплового шока и др. Они выполняют как общеклеточные, так и специализированные функции. 17.Характеристика ферментов рестрикции, их классификация. Изошизомеры. В основе метода, позволяющего приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов – рестрикционные эндонуклеазы. В 70-е годы были открыты специфический модифицирующий фермент, метилирующий ДНК, и рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК. Но этот фермент не был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности ДНК. Так появилась первая рестриктаза, которая расщепляла строго опред-ую послед-ть ДНК. Т.к. бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные послед-ти. Были выделены рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции. Выделяют три типа ферментов рестрикции: 1.Рестриктазы первого типа (например, ЕсоК из Escherichia coli К12) узнают опред-ую послед-ть нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК не далеко от этой послед-ти в произвольной точке и само место разреза строго не специально. 2.Рестриктазы второго типа (например, EcoRI) узнают опред-ую послед-ть и разрезают двойную спираль ДНК в опред-ой фиксированной точке внутри этой послед-ти. Рестриктазы этого типа узнают палиндромальные послед-ти, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. 3.Рестриктазы третьего промежуточного типа (например, EcoPI) узнают нужную послед-ть и разрезают двухцепочную молекулу ДНК, отступив опредое число н.п. от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными (тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или 3'-концами. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. В клетках разных видов бактерий могут содержаться рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Такие рестриктазы называют изошизомерами. Изошизомеры некоторых рестриктаз используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме. Рестриктазы HpaI и HpaII расщепляют неметилированные последовательности GCGC и CCGG соответственно и утрачивают способность к расщеплению, если хотя бы один из остатков цитозина в этих сайтах метилирован. Фермент MspI (изошизомер HpaII) расщепляет последовательность CCGG независимо от того, метилированы или неметилированы остатки цитозина в таком сайте. N-Метилирование остатков аденозина в ДНК можно обнаружить с помощью изошизомеров Sau3A(расщепляет как метилированные, так и неметилированные последовательности GATC), DpnI(расщепляет только метилированные последовательности GMeATC) и MboI (расщепляет только неметилированные последовательности). 18.Инсерционные последовательности (IS) и транспозоны (Tn) бактерий (на примере Tn3). IS-элементы-это сегменты ДНК,способные как целое перемещаться из одного участка локализаций в другой. IS-элементы содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения-транспозиций. Кроме того, IS-элементы имеют особую последовательность на концахинвертированные повторы. При встраивании в новую последовательность ДНК IS-элементы вызывают небольшую дупликацию: дуплицированный участок с двух сторон фланкирует встроившийся IS-элемент. У E.сoli имеются несколько типичных IS-элементов: IS1(768 н.п.-обычно находится в хромосоме E.сoli), IS2(1327 н.п.- в хромосоме E.сoli), IS4(в хромосоме E.сoli,1-2 копий),IS10(местонахождение: R-плазмиды) Т.о. инсерционные последовательности обладают двумя важными характеристиками — они мало похожи на другие мобильные элементы и кодируют лишь белки, вовлеченные в процесс транспозиции (в отличие от транспозонов, кодирующих еще и некоторые вспомогательные гены, например, гены резистентности к антибиотикам). Эти белки обычно представлены транспозазой, которая катализирует ферментативную реакцию, позволяющую IS элементу перемещаться, а также регуляторный белок, который стимулирует или ингибирует активность транспозиции. IS-элементы могут быть частью сложных транспозонов. Транспозонами (Tn-элементами) называют сегменты ДНк, обладающие теми же свойствами,что и IS-элементы, но содержащие гены, не имеющие непосредственно отношения к транспозиций(гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов).Два IS элемента,оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе,т.е. они могут образовать транспозон. Некоторые IS-элементы и транспозоны вызывают генетическую нестабильность поблизости от места своей локализаций: повышается частота делеций и инверсий, также они способны вызывать транслокаций. Транспозон Tn3 представляет семейство мобильных элементов с короткими инвертированными повторами. (35-50 п.н.), перемещающимися с помощью репликативной транспозиции и образующими дуплицированными прямыми повторами из 5 п.н. У самого Tn3 центральная часть содержит гены транспозазы, резолвазы и бета-лактамазы bla (обеспечивает устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда). Ген транспозазы tnA кодирует большой белок из примерно 1000 аминокисл.остатков., ген резолвазы tnR кодирует белок из 185 аминокисл.ост. Гены транспозазы и резолвазы транскрибируются в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенном пространстве . В межгенном пространстве находится и сайт res, по которому происходит разрешение коинтегратов. К семейству Tn3 относятся Tn1, Tn1000 и др. Общая схема транспозонов. Существуют 2 типа транспозиций из одного генома в другой. В ходе первого типакоинтеграционного, донорный геном,который несет транспозон сливается с реципиентной ДНК. Затем репликация приводит к удвоению мобильного элемента.Образуется коинтеграт с дупликацией транспозонов.Чтобы произошло разделение коинтеграта на репликоны,необходимо дейтсвие револвазы,которая разрезает на исходные репликаторы. Второй тип транспозиций называют встраиванием. Транспозон перемещается в новый геномный локус, при этом никаких перестроек не происходит. 19.Методы трансформации растительных протопластов, клеток и тканей. Методы трансформаций: 1) Трансформация растительных протопластов осуществляется благодаря слияния протопластов. Существует 2 метода слияния протопластов: химический и физический. Химический метод заключается в добавлений к суспензий протопластов веществфюзогенов,стимулирующих слияние. В качестве фюзогенов используют полиэтиленгликоль. Обработка суспензий протопластов раствором полиэтиленгликоля вызывает их слипание. Второй физический метод-метод электрослияния. При этом методе для слияния протопластов используют электрическое поле,суспендируя их между двумя электродами. При подаче переменного тока протопласты выстраиваются в ряд,примыкая своими полярными поверхностями один к другому. 2) Культуру протопластов на начальной стадии её роста заражают агробактериями, которые используют в качестве векторов. Технология совместного культивирования предусматривает инкубацию протопластов в присутствии агробактерий в соответствующей жидкой питательной среде. Методика кокультивации рассматривается как индукция опухолей в искусственных условиях: вирулентные агробактерии временно совместно культивируются с протопластами. После периода кокультивации , в течение которого наступает агрегация протопластов с бактериями, свободные бактерии удаляются повторным отмыванием. Далее растительные клетки культивируются на среде с добавлением гормонов, а через 3—4 недели небольшие колонии высеваются на безгормональную среду. На этой среде выживают только колонии трансформированных клеток. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать и двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты).Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК. Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. 3) Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Трансформация не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение. 4) Электропорация. Метод основан на повышении проницаемости биомембран за счет действия импульсов высокого напряжения. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране. 5) Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нуклеазами растительной клетки. Липосомы – сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами. 6) Метод биологической баллистики. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. Исходный материал для трансформации – суспензионная культура, каллусная ткань . Метод основан на напылении ДНК-вектора на мельчайшие частички вольфрама, которыми затем бомбардируют клетки. Бомбардировка осуществляется с помощью биолистической пушки за счет перепада давления. Часть клеток гибнет, а выжившие клетки трансформируются, затем их культивируют и используют для регенерации растений. Также для трасформаций растит-х клеток и тканей можно использовать и другие векторы, в том числе Ri-плазмиды,вызывающей раковую болезнь. 20.Механизм аттенуации транскрипции на примере триптофанового оперона. Триптофановый оперон содержит 5 генов, кодирующих ферменты синтеза триптофана. Триптофановый оперон является репрессируемым опероном с отрицательной регуляцией. Р – промотор; О – оператор; trpE, D, C, B, A гены, кодирующие ферменты синтеза триптофана; T – терминатор; trpR - ген, кодирующий белок-репрессор; L-a - лидераттенюатор ; Регуляция триптофанового оперона осуществляется с помощью белка-репрессора, кодируемого геном trp R. Белок-репрессор триптофанового оперона в отличие от белкарепрессора лактозного оперона синтезируется в неактивном виде. При низкой концентрации триптофана в клетке белок-репрессор остается неактивным, РНК-полимераза транскрибирует гены триптофанового оперона, на полицистронной мРНК синтезируются белкиферменты синтеза триптофана и осуществляется его синтез. При высокой концентрации триптофана в клетке белок-репрессор соединяется с ним, изменяет свою конфигурацию, становится активным и блокирует область оператора,следовательно не происходит транскрипция. Триптофан синтезируется в клетке из ароматического предшественника - хоризмовой кислоты. Также имеются дополнительные возможности осуществления процесса транскрипций, благодаря наличию в структуре триптофаного оперона аттенюаторной последовательности, расположенная между зоной промотора и областью структурных генов. Эта последовательность входит в состав так называемой лидерной области.Аттенюаторная последовательность способна вызывать преждевременную терминацию транскрипции, влияя на вторичную структуру синтезируемой РНК. Если в клетке триптофан присутствует в достаточном количестве, происходит образование терминаторной шпильки и отделение РНК-полимеразы от ДНК. Т.е. при высокой конц. триптофана образуются шпилечные структуры в мРНК, которые могут останавливать дальнейший ход транскрипции. В результате образуется непригодная для трансляций РНК. Если концентрация триптофана в клетке снижается, терминации в аттенюаторе не происходит. При снижении концентрации триптофана РНК-полимераза преодолевает зону аттенюатора и транскрипция приводит к синтезу полноразмерной мРНК. 21.Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты. Принцип метода гибридизации нуклеиновых кислот. Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой послед-ти, а другие – со сдвигом с образованием "ступеньки". В первом случае образ-ся "тупые" концы, а во втором "липкие", т.е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК. Использование электрофореза для разделения рестрикционных фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты. Рестрикционная карта линейное изображение последовательности ДНК, которое показывает расположение сайтов узнавания специфических рестрикционных ферментов. Рестрикционные карты строят при исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены. Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является строго опред-ой послед-ттью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома. Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их электрофоретической подвижности с фрагментов ДНК известных размеров. Получив информацию о кол-ве сайтов рестрикции в гене, определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных рестриктаз, к 5'- или 3'-концевым частям исследуемой послед-ти нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах. 22.Основные системы «вектор-хозяин» у прокариот. Основные свойства векторов. Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий. Синтез белков происходит в клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, но применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки. Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Сущест-ет много типов векторов. 1.плазмиды. Они имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, ионам тяжелых металлов (Rплазмиды), а также гены, контролирующие катаболизм некоторых орган. соединений (плазмиды биодеградации, или D-плазмиды). Т.к. эти гены находятся в плазмидах, они представлены гораздо большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого кол-ва ферментов, химически нейтрализующих антибиотики или ксенобиотики, что и обеспечивает устойчивость к последним. 2.вирусы. Есть вирусы, кот-е не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, или вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую. К таким относятся ДНКвирусы SV-40 и вирус полиомы. Вирусы вектора для введения чужеродной ДНК. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильных вирусных промоторов, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования. 3.космиды. плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу. 4.фазмиды. Гибрид между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды. 5. Транспозоны. сегменты ДНК, которые контролируют собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. 23.Использование Т-ДНК для выделения генов растений. Практическое применение генной инженерии растений с использованием Ti-плазмид. Раньше использовали конститутивные промоторы ДНК-содержащего вируса мозаики цветной капусты или промоторы опиновых синтетаз в экспериментах по экспрессии трансгенов в растениях. Сейчас агробактериальная трансформация растений приводит к интеграции Т-ДНК или гибридов на ее основе в различные участки разных хромосом. Каждое трансгенное растение индивидуально по месту встройки и числу встроенных копий Т-ДНК. Некоторые особи могут содержать единичную встройку гибридной Т-ДНК, в то время как другие — низкокопийные тандемные повторы Т-ДНК. Уровень экспрессии трансгена может меняться у разных трансгенных растений, полученных в одном эксперименте, при этом он часто не коррелирует с копийностью, а зависит от положения трансгена в растительном геноме. При изучении трансгенных растений обнаружили эффект сайленсинга трансгена в последующих поколениях, т.е. у ряда индивидуальных трансгенных растений может происходить снижение уровня или полное прекращение синтеза целевого белка, кодируемого встроенным трансгеном. Механизмы замолкания гена могут быть разными. Например, встройка двойной копии трансгена в ориентации "голова к голове" приведет к нестабильности конструкции и выщеплению трансгена. Это рекомбинационный сайленсинг. Метилирование промотора трансгена, обусловленное встройкой Т-ДНК в активно метилируемые районы генома растения, приведет к транскрипционному сайленсингу. Специфичное расщепление мРНК, в которое вовлекаются низкомолекулярные двухцепочечные молекулы РНК, вызывает посттранскрипционный сайлесинг трансгена. Поскольку плазмиды Ti имеют очень большой размер, районы Т-ДНК обычно не содержат уникальных участков гидролиза рестриктазами. Поэтому прямая встройка целевого гена в ТДНК на плазмиде Ti практически невозможна. Исходя из этого, учеными были разработаны разные стратегии введения чужеродных генов в состав Т-ДНК. Одна из них состоит в введении целевого гена в Т-ДНК в составе плазмиды Ti. ТДНК успешно переносится в клетки растений даже при очень большом размере встройки. В 1992 г. А. Миранда с соавторами первыми показали, что при изменении ориентации участка RB Т-ДНК в растения может переноситься полная копия плазмиды Ti. В 1996 г. К. Гамильтон с соавторами, используя бинарную векторную систему, осуществили перенос из Agrobacteium в растительные клетки фрагментов хромосомной ДНК человека размером до 150 тпн. 24.Основные методы секвенирования ДНК. Каковы принципы каждого из этих методов? Секвенирование - расшифровка нуклеотидной послед-ти н.к. Высокоэффективные методы секвенирования ДНК возникли в результате объединения ряда методических достижений. Решающую роль при этом сыграла разработка методов электрофореза, позволяющих с высокой точностью разделить олигомеры, отличающиеся друг от друга по длине только на 1 нуклеотид. 1. Плюс-минус метод. Первый метод секвенирования ДНК, предложенный Сэнгером основан на ферментативных реакциях. Подход предполагает выделение одноцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент используют затем в реакции полимеразного копирования в качестве матрицы, а в качестве праймера — синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. 2.Существенным недостатком ≪плюс-минус≫метода является то, что получить строго статистический набор продуктов ограниченного копирования на первой стадии очень трудно. В 1977 г. был разработан метод - дидезокси-метод Сэнгера. Как и в ≪плюс-минус≫-методе, в его основу положено ферментативное копирование при помощи Poll исходного одноцепочечного сегмента ДНК с точки, задаваемой положением 3'-конца праймера. Специфическая терминация синтеза новых цепей ДНК обеспечивается добавлением в реакционную смесь кроме четырех типов dNTP синтетического аналога нуклеотида — 2',3'дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). Poll способна включать этот аналог в растущую цепь ДНК, но, как только включение ddNTP произошло, дальнейшее наращивание цепи прекращается ввиду отсутствия в ddNTP З'-ОНгруппы. 3.Наряду с ферментативным дидезоксиметодом распространение получил метод секвенирования ДНК, разработанный А. Максамом и В. Гилбертом в 1976 г. Метод применим к одно- или двухцепочечным фрагментам ДНК. Изучаемый полинуклеотид подвергают специфической химической фрагментации. Для того чтобы иметь точку отсчета, фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом 32Р по 5'- или 3'-концу. Чаще всего метку включают в 5'-концы с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, которая в реакции обмена переносит радиоактивный фосфат с [у-32Р] АТР на ДНК. У двухцепочечного фрагмента ДНК в такой реакции метятся обе антипараллельные цепи. Субстраты, меченные только по одному концу, при этом могут быть получены или после денатурации и разделения цепей фрагмента, или после гидролиза фрагмента какой-либо другой рестриктазой и последующего разделения субфрагментов электрофорезом. 4. Под автоматическим секвенированием ДНК понимается в первую очередь электрофоретическое разделение меченых продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов — автоматических секвенаторов ДНК. Автоматизации с помощью лабораторных биороботов подвергаются процесс наработки матриц для их последующего ферментативного секвенирования и проведение секвенирующих реакций. Для мечения вновь синтезируемых цепей ДНК в условиях терминации при автоматическом секвенировании используют молекулу какоголибо флуоресцирующего соединения. Принцип заключается в электрофоретическом разделении флуоресцентно меченных продуктов специфически терминированных секвенирующих реакций и их детекции в режиме реального времени. Детекция осуществляется в нижней части геля, где в момент прохождения фрагментов ДНК происходит возбуждение молекул красителя лазерным лучом. 25.Каулимовирусы и вирус мозаики цветной капусты (CaMV) как наиболее перспективные вирусные векторы для введения генов в растения. Среди растительных вирусов группа каулимовирусов – изометрических вирусов мозаики цветной капусты CaMV (Caulimoflower mosaic virus) рассматриваются наиболее часто как потенциальный вектор для введения чужеродной ДНК в растение. Это связано с тем, что CaMV являются вирусами растений, содержащими двунитевую ДНК, с которой легче всего манипулировать при использовании технологии рекомбинантных ДНК для их потенциального применения в качестве векторов. Геном CaMV имеет длину 8 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) и ДНК обнаруживается в линейной, кольцевой, закрученной или завязанной в узел форме. Она обладает уникальными (один раз встречающимися в данной молекуле) сайтами для гидролиза эндонуклеазами SalGI и XhoI. Эти сайты могут быть использованы для превращения ДНК CaMV в линейную молекулу с последующим лигированием с подходящим плазмидным ветктором E. Coli, в результате чего образуется гибридная плазмида, которая может быть клонирована в E. сoli. Транскрипция генома CaMV ассиметрична – только α-нить продуцирует стабильные РНК-транскрипты. Перед С5' концом транскриптов найдены типичные эукариотические промоторные сигналы. Очевидно, синтез вирусной РНК осуществляется полимеразой хозяина. На интеграцию вирусной ДНК с геномом хозяина данных нет. CaMV инфекция не передается через семена и нет оснований думать, что происходит интеграция геномов вируса и растения. Нуклеотидные последовательности CaMV указывают на то, что обширные области генома кодирует белок. Чтобы встроить новую ДНК необходимо идентифицировать области, куда можно было бы внедрить нужные гены так, чтобы это не отражалось на интересующих исследователей областях. Есть сообщение об успешном внедрении экзогенных ДНК, в частности γ-ДНК в вирус и ее размножении в растениях. Принципиальный интерес к CaMV как вектору основан на томчто его ДНК может быть введена непосредственно в растение просто путем втирания в листья и вирус распространяется по всему растению. Это дает основание рассматривать возможности введения чужеродной ДНК врастение, а не в клеточную культуру. Введение вирусной ДНК эффективно – нужно всего лишь 1-5 мкг клонированной ДНК на растение и почти 100% растений становятся инфицированными. 26.Прием встраивания вирусной ДНК в геном растения с помощью Т-ДНК агробактерии – «агроинфекция». Агробактериальная трансформация, агробактериальный перенос генов (agrobacterial transformation, agrobacterium-mediated gene transfer) [греч. agros — поле и bacterion — палочка; лат. transformatio — превращение] — перенос чужеродных генов (ДНК) в реципиентный геном растений с помощью Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes и их Tiили Ri-плазмид соответственно. Первоначально целевой ген клонируют в подходящем векторе, который содержит нуклеотидные последовательности Т-ДНК из Tiплазмиды. Такая конструкция трансформируется в подходящий штамм E. coli, размножается и переносится в клетки агробактерий, содержащие Ti-плазмиду дикого типа или бинарную векторную плазмиду с генами вирулентности (vir-генами). С помощью рекомбинации целевой ген из векторной плазмиды переносится на Tiплазмиду дикого типа или бинарную векторную плазмиду. При инкубации генетически модифицированных агробактерий с протопластами, листовыми дисками или другими частями растения vir-область Ti(Ri)плазмиды активируется веществами, выделяемыми поврежденными клетками растения (напр., ацетосирингоном). В результате T-район, содержащий целевой ген, вырезается из рекомбинантной плазмиды и внедряется в геном растительной клетки. А.т. является одним из способов получения трансгенных двудольных растений. Агроинфекция (agroinfection) [греч. agros — поле и лат. infectio — заражение] — метод, позволяющий вводить инфекционную вирусную ДНК или кДНК вирусной РНК в растения. Вирусная ДНК включается в Т-район Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, после чего рекомбинантная плазмида переносится в клетки агробактерий, которые затем наносят на раневую поверхность растения. С помощью механизма агробактериальной трансформации вирусная ДНК переносится в растительные клетки, где она может реплицироваться и продуцировать вирус, который затем распространяется по всему растению. А. значительно эффективнее, чем простая инокуляция растения вирусной нуклеиновой кислотой 27.Исп-ние рестриктаз для получения «библиотек» рекомбинантных ДНК. Клонирование фрагментов ДНК «методом дробовика». Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК). Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома высока. Такой способ называется «метод дробовика», т.к. геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, т.к. они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома. Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Т.о., получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном кол-ве. Разрезание геномной ДНК опред-ся случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, потом с помощью ДНКполимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК). Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная послед-ть гена ничем не прерывается. Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК. 28.Исп-ние вирусных регуляторных последовательностей (промоторы, энхансеры) для экспрессии генов, вводимых в растения. Генетическая конструкция, вводимая в раст. клетку обычно включает: белок-кодирующую структурную последовательность, сигнальные элементы трансляции и транскрипции, а также маркерные гены. Наиболее важными из регуляторных посл-тей яв-ся проксимальный участок промотора, связывающий РНКполимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на 3'-конце мРНК. Для лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно приблизить набор кодонов к типичному для растения. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют «редкие» кодоны на синонимичные «частые», что не сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена может быть усилена до 300 раз. Иногда в структурной части генов прокариотического происхождения могут присутствовать какие-либо нежелательные сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами сплайсинга или деградации, либо ферментами модификации на уровне белка. Наличие таких скрытыхсигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в растении, поэтому их обычно удаляют также путем точечных замен оснований. Минимальный промотор, связывающий РНК-полимеразу недостаточен для обеспечения заметного уровня транскрипции. Для усиления экспрессии встроенного гена и придания ей заданных характеристик используют полноразмерные промоторы, включающие энхансеры (усилители) . Набор известных промоторов достаточно разнообразен и постоянно пополняется. Конститутивные промоторы применяются для наработки существенных количеств продукта гена во всем растении. Для двудольных растений такими эффективными промоторами являются, например, 35Sпромотор вируса мозаичности цветной капусты (CaMV) и nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий; для однодольных - промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act). Помимо конститутивных, известно большое число специфических промоторов, которые активны лишь в отдельных органах, тканях или клетках, либо на отдельных стадиях онтогенеза растения. Примером может служить промотор гена пататина картофеля, работающий практически только в клубнях. Имеются также промоторы, активность которых проявляется в листьях, корнях, меристемах и других местах специфической локализации. Интенсивно изучаются и используются также индуцибельные промоторы, которые активируются лишь при определенных условиях: температуры, освещения, концентрации фитогормонов и т.д. Использование таких промоторов, соединенного с целевым геном, дает возможность выращивать трансгенные раст. как обычные вплоть до стадии уборки урожая, а далее срезка растений индуцирует экспрессию целевого гена, продукт которого накапливается в собранной биомассе. 29.Клонирование рекомбинантных ДНК с помощью векторов на основе бактериофага l. В основе конструирования фаговых векторов лежит несколько принципов. В середине молекулы лямбда-ДНК длиной 45 т.п.о. расположен участок хромосомы (около 15 т.п.о.), который не яв-ся необходимым для литического развития бактериофага. Поэтому его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осущ-ть клонирование фрагмента путем размножения рекомбинантного бактериофага. Механизм упаковки хромосомной ДНК в фаговые частицы основан на включении ДНК строго определенного размера, поэтому рекомбинантные ДНК, содержащие фрагменты клонируемой ДНК, не соответствующие оптимальному размеру, не упаковываются и не клонируются. Это позволяет легко освобождаться от фаговых частиц, не содержащих вставки клонируемой ДНК, и оптимизировать процесс клонирования путем снижения в упаковочных экстрактах доли нежизнеспособных фаговых частиц. Процесс упаковки фаговой ДНК в зрелые фаговые частицы осущ-ся в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов E. coli, лизогенных по дефектным бактериофагам лямбда. В одном штамме амбер-мутацией инактивирован один из белков фагового капсида (продукт гена E), а в другом - ген A, продукт которого необходим для включения фаговой ДНК в головку бактериофага. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Т.о., в объединенных экстрактах имеются все компоненты, необходимые для сборки зрелых инфекционных фаговых частиц, в них происходит упаковка рекомбинантной ДНК с эффективностью образования 104-105 фаговых частиц на 1 мкг упаковываемой ДНК. В хромосоме профага имеется мутация, инактивирующая ген S, кодирующий лизоцим, что препятствует преждевременному лизису бактериальных клеток после индукции профага и позволяет сконцентрировать бактериальные клетки перед получением упаковочных экстрактов. Бактериальные лизогенные клетки содержат мутацию recA , которая предотвращает гомологичную рекомбинацию между ДНК профага и рекомбинантными ДНК, упаковываемыми в фаговые частицы. 30. Преимущества дрожжей для генетических исследований и для изучения регуляции экспрессии эукариотических генов. Дрожжи-сахаромицеты (Saccharomyces cerevisiae) входят в число излюбленных объектов экспериментальной биологии. Данный низший эукариотический организм удобен в работе, имеет относительно небольшой геном и прекрасно изучен генетически и биохимически. Дрожжи обладают многими свойствами, характерными для клеток высших эукариот, и поэтому рассматриваются как экономически наиболее выгодная эукариотическая система для продукции белков человека и животных. Кроме того, благодаря относительной простоте своей организации дрожжи являются замечательной лабораторной моделью, позволяющей изучать на молекулярном уровне такие фундаментальные биологические процессы, как митоз, мейоз, секреция и посттрансляционная модификация белков и др. Важное направление исследований открывает также возможность введения мутаций в клонированные дрожжевые гены с последующей встройкой таких генов в нормальные положения генома для изучения влияния мутаций на функции генов. Такая «обратная генетика» имеет большое значение для тонкого молекулярно-генетического познания S. cerevisiae, а также изучения организации и функционирования генетических элементов эукариот в целом. Пекарские дрожжи S. cerevisiae являются наиболее изученными в биохимическом и генетическом плане эукариотическими организмами. Это обусловлено тем, что для них применимо большинство методов, разработанных для манипуляций с бактериальными культурами. Дрожжи можно выращивать на простых питательных средах, в том числе агаризованных, в обычной бактериологической посуде. Кроме простоты культивирования дрожжи характеризуются высокой скоростью размножения и наличием небольшого числа стадий в цикле развития, смена которых легко контролируется в эксперименте. Будучи типичными эукариотами, дрожжевые клетки представляют собой удобную модель для изучения молекулярных основ наследственности и изменчивости высших организмов. Большое внимание дрожжи привлекли к себе как объекты генно-инженерных экспериментов, направленных на создание высокоэффективных технологий биосинтеза различных белков высших эукариот. У дрожжей-сахаромицетов подробно изучен клеточный цикл. Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы — простота и надежность ее генетического анализа. Дрожжевые штаммы могут существовать как стабильные гаплоиды, что значительно упрощает, по сравнению с большинством диплоидных эукариотических систем, получение мутантов. Так как диплоидные штаммы также генетически стабильны, легко выяснить, является ли определенная мутация доминантной или рецессивной, и классифицировать мутанты со схожим фенотипом по группам комплементации. Размер хромосом у дрожжейсахаромицетов значительно меньше, чем у высших эукариот, и находится в интервале от 250 до 2200 тпн. Это позволяет разделить дрожжевые хромосомы методом пульсэлектрофореза. Относительно небольшой размер генома у дрожжей объясняется низким содержанием в их ДНК повторяющихся последовательностей. 31. Плазмиды дрожжей. Повышение эффективности трансформации с помощью дополнительных точек начала репликации (элементов автономной репликации, ЭАР) У дрожжей известны три вида плазмид, которые можно использовать в качестве векторов. Это 2 и 3 (длина соответственно 2 и 3 мкм), а также митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК. В 1967 г. Дж. Синклэйр с соавторами опубликовали статью, в которой сообщили, что при электронно-микроскопическом анализе препарата общей дрожжевой ДНК выявляется кольцевая двухцепочечная ДНК с контурной длиной около 2 мкм. Дальнейшие исследования в разных лабораториях показали, что большинство (около 75 %) лабораторных штаммов S. сerevisiae содержат этот класс внехромосомных молекул ДНК. Обнаруженная кольцевая ДНК была названа двухмикронной плазмидой, а в дальнейшем — Scpl. На гаплоидную клетку приходится в зависимости от штамма от 30 до 200 копий Scpl. Плавучая плотность Scpl в градиенте концентрации хлорида цезия такая же, как и у хромосомной ДНК. Данная плазмида является криптической и обнаруживается лишь физико-химически, т. е. выделением плазмидной ДНК. Плазмида Scpl является прекрасной модельной системой для изучения контроля экспрессии эукариотических генов и репликации хромосом. Зная молекулярно-биологическую организацию данной плазмиды, можно эффективно использовать ее для создания молекулярных векторов, последующего конструирования гибридных ДНК и введения их в клетки дрожжей. Дж. Мейеринк с соавторами в 1979 г. обнаружили, что в ядре клеток дрожжейсахаромицетов находится небольшое число молекул кольцевой двухцепочечной ДНК с контурной длиной около 3 мкм. Как выяснилось, данная плазмида представляет собой автономно реплицирующуюся полную копию одного хромосомного набора генов рибосомной РНК. В зависимости от штамма S. Cerevisiae плазмида Iμ присутствует в ядре в количестве от 1 до 19 копий. Полагают, что внехромосомные гены рибосомной РНК в виде автономной кольцевой ДНК могут быть промежуточной формой при амплификации генов рРНК дрожжей. Такая внехромосомная форма генов рРНК выявлена также у целого ряда других низших эукариот. Обнаружение внехромосомных плазмид и подробное исследование их структурнофункциональной организации дало мощный толчок работам по созданию молекулярных векторов и использованию S. cerevisiae для клонирования генов. Данная эукариотическая система предоставляет экспериментаторам принципиально новые возможности по сравнению с бактериальными клетками. Генноинженерные манипуляции на S. Cerevisiae стали реальны лишь после того, как экспериментально была доказана возможность генетической трансформации дрожжевых клеток. Трансформирующая ДНК может сохраняться в дрожжевых клетках либо путем интеграции с хромосомой, либо путем автономной репликации в виде эписомы. Судьба введенной в клетки ДНК определяется присутствием или отсутствием в ней элементов автономной репликации (ЭАР). Высокоэффективная эписомная трансформация достигается включением в кольцевую плазмиду сегмента ДНК, содержащего точку начала репликации, что обусловливает независимую репликацию эписомы в дрожжевых клетках. Включение в плазмиду ЭАР во многих случаях позволяет довести эффективность трансформации популяции сферопластов дрожжей до 1%. Последовательности ЭАР были выделены из эндогенной дрожжевой плазмиды (2µ-кольца) и из клонированных сегментов дрожжевой хромосомы. Они состоят, по крайней мере, из 60 нуклеотидных пар, обогащены АТ парами и содержат каноническую последовательность АААС/ТАТААА. Интересно, что в качестве ЭАР в дрожжевых плазмидах функционируют также определенные клонированные сегменты ДНК кукурузы, дрозофилы и других организмов. Во всех случаях последовательности служат сигналом для экстрахромосомной репликации ДНК, введенной в дрожжевые клетки, однако пока нет четких доказательств того, что они инициируют репликацию хромосомной ДНК у дрожжей или других организмов. 32.Клонирование ДНК в фаге М13; основное его преимущество. Фаг М13 – один из наиболее просто устроенных фагов, состоящий из одноцепочечной молекулы ДНК размером – 7000 н., окруженный белковой оболочкой из 2700 субъединиц, которые упакованы по спирали. Оболочка вируса называется капсид. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. ДНК М13 содержит несущественную часть, которую можно заменить нужным фрагментом ДНК; инфекционность рекомбинантных вирусных частиц сохраняется. Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в который могут быть произведены изменения (делеции, вставки) без нарушения жизнеспособности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков распознавания многих рестртктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров уникальных участков расщепления определенными рестриктазами. М13 – система имеет следующие преимущества: выделенная двухцепочечная репликативная форма может функционировать как плазмида, а одноцепочечная фаговая ДНК – используется в качестве матрицы для секвенирования ДНК. Все это позволяет использовать фаг М13 как комбинированную систему для клонирования и секвенирования ДНК. 33.Использование плазмидных генов устойчивости к антибиотикам для селекции клонированных рекомбинантных ДНК. Плазмидный вектор pBR322. Длина плазмиды pBR322 – 4361 п.н. Она несет два гена устойчивости к антибиотикам, ампициллину(Ampr) и тетрациклину(Tetr), а также сайты для BamHI, HindIII и SalI в гене r r Tet , один PstI-сайт в гене Amp , один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в E.coli. Плазмида реплицируется с образованием большого числа копий, в другие бактериальные клетки переносится с трудом. Если очищенную плазмиду pBR322 обработать рестриктазой, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащий нужный ген и предварительно обработанный такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНКлигазой фага Т4 в присутствии АТР, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК. Чтобы уменьшить количество последних, образовывают рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей от линеазированной молекулы 5′фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК. Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина. Плазмида pUC19 длиной 2686 п.н. содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ′) лактозного оперона E.coli; ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ′; полилинкер – которую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, KpnI, XmaI, SmaI, BamHI, XbalI, SalI, HineII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плазмиды pBR322. Для клонирования в pUC19 донорную ДНК расщепляют одной из рестриктаз, чей сайт находится в полилинкере; плазмидную ДНК гидролизуют такой же рестриктазой, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой. Обе ДНК смешивают в присутствии ДНК-лигазы Т4 и используют образовавшийся продукт для трансформации клеток, которые могут синтезировать ту часть β-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ′ с образованием активного фермента. Обработанные клетки высеивают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для β-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки несущие, интактную плазмиду, образуют на среду с ампициллином колонии синего цвета. Клеткихозяева, несущие гибридную плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии, поскольку обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК последовательности ДНК. 34.Использование радиоактивных зондов для обнаружения клонированных генов. Основные методы получения радиоактивных нуклеиновых кислот (ник-трансляция, мечение 5’- и (или) 3’-концов). До разработки ПЦР методами обнаружения и выделения специфических фрагментов ДНК были гибридизация с ДНК-зондами и клонирование. ДНК-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных послед-тей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДНК. ДНКзонды можно синтезировать искусственно либо выделить из генома. Затем эти послед-ти клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном кол-ве. В любой клонированный фрагмент можно ввести метку (радиоактивный изотоп и др.) и использовать его как специфический молекулярный зонд. Радиоактивные зонды выявляют с помощью радиоавтографии. Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНКзондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек. Никтрансляция. Этот метод применяется для выявления ДНК, поскольку соответствующие зонды легко получать и с ними удобно работать. Метод включает внесение в двухцепочечную ДНК случайных разрывов, в результате чего образуются меченые фрагменты разной длины с разным соотношением между векторной ДНК и вставкой. Такие фрагменты при отжиге соединяются друг с другом по перекрывающимся послед-тям, образуя сеть, что приводит к усилению сигнала в месте локализации послед-ти-мишени и повышению чувствительности метода. Мечение 3'-концов двуцепочечного фрагмента ДНК проводят с помощью фрагмента ДНК-полимеразы I E. coli или ДНК-полимеразы фага Т4 и соответствующего меченного по α-положению дНТФ. Мечение З'-концов как одно-, так и двуцепочечного фрагмента ДНК осущ-ют с использованием терминальной трансферазы и меченного по ос-положению подходящего нуклеотидного предшественника. В случае с фрагментом ДНК-полимеразы I для эффективного мечения необходимо наличие фрагментов ДНК с выступающими 5'-концами, образованными при расщеплении ДНК определенными рестрикционными эндонуклеазами. Для этого необходимо добавление в реакционную смесь конкретного дНТФ, комплементарного первому нуклеотиду в выступающем участке молекулы. Т.к. фрагмент ДНК-полимеразы I имеет низкую 3' → 5'экзонуклеазную активность, то возможное мечение тупых и 3'-выступающих концов не принимают во внимание. Но добавление в реакционную смесь всех четырех дНТФ (один из которых меченый) позволяет полностью исключить эту вероятность, кроме случаев, когда для обоих концов будут требоваться одинаковые меченые дНТФ. Более высокая эффективность мечения может быть достигнута, если в результате расщепления фрагмента ДНК какой-либо рестрикционной эндонуклеазой образуются 5'-выступающие концы с одинаковыми нуклеотидами. Например, рестрикционная эндонуклеаза ЕсоRI генерирует выступающие концы со следующей последовательностью: 5'-ААТТ-3'. Таким образом, в результате мечения могут образоваться более высоко меченные фрагменты ДНК с двумя нуклеотидами, несущими метку. 35.Общая характеристика ДНК-содержащих онкогенных вирусов на примере вирусов SV40 и полиомы. Вирус SV40 относится к роду Polyomavirus семейства Polyomaviridae и является мелким вирусом, двухцепочечная кольцевая ДНК которого реплицируется в ядре хозяйской клетки. Подобно умеренным фагам ДНК вируса SV40 может размножаться вегетативно (в пермиссивных для литического развития клетках) или в интегрированном в хромосомы состоянии (в непермиссивных клетках). Хотя вирус SV40 выделен из первичной культуры клеток почки макака резус, наиболее эффективно он размножается на первичных или перевиваемых линиях клеток почки африканской зеленой мартышки, таких как Vero, CV-1, BSC-1 и некоторых других. При инфекции пермиссивных клеток происходит лизис клеток с выходом в среду вирусного потомства. В непермиссивных клетках ДНК вируса интегрируется в геном, обусловливая онкогенную трансформацию клеток. Вирус SV40 имеет икосаэдрический вирион, содержащий геномную ДНК длиной около 5000 пар оснований. Вирион прикрепляется к рецепторам MHC класса 1 на поверхности клетки при помощи гликопротеина VP1. Внутри ядра клетки клеточная РНК полимераза II экспрессирует ранние гены. Транскрибированная мРНК подвергается разрезанию на два фрагмента, кодирующие большой и малый Т-антигены. Около 5 % большого Т антигена поступает в плазматическую мембрану клетки, а около 95 % поступает в ядро. В большой Т антиген связывается с тремя сайтами в вирусной ДНК, связывание с сайтом I и II регулирует синтез ранних РНК, связывание со вторым сайтом происходит в каждом клеточном цикле II. Связывание с сайтом I вызывает репликацию ДНК в месте ориджина репликации. Сборка вирионов осуществляется в ядре клетки. Вирус полиомы – малый ДНК-содержащий вирус, найденный у мышей. Его аналоги найдены у макаки резус (вирус SV40) и человека (вирусы BK и JC). В пермиссионных клетках естественных хозяев они не вызывают трансформации. Например, вирусы ВК и JC онкогенны для грызунов, но не человека. Геном вирусов разделен на две части – раннюю и позднюю в соответствии со временем ее активной экспрессии в жизненном цикле вируса. В ранней области закодированы два белка – большой и малый Т-антиген (Tumor), транскрибируемые с одного гена в результате альтернативного сплайсинга. В пермиссионных клетках они инициируют репликацию вирусной ДНК и стимулируют синтез ДНК и экспрессию генов хозяина, в том числе и контролирующих пролиферацию. В непермиссионных клетках, где репликация вируса подавлена, повышенная пролиферация может приводить к трансформации. 36. Направленное встраивание клонированной ДНК в хромосомы дрожжей. Среди дрожжей наиболее полно изучен вид S. сerevisiae. У этого вида в гаплодных клетках содержится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp1 S.cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а также имеют короткое время генерации (несколько часов) вследствие малого размера генома. В дрожжевых плазмидах селективные маркеры не обнаружены, поэтому в качестве векторов их стали применять лишь после включения в них определенных хромосомных генов дрожжей. Наиболее подходящими для таких целей оказались гены, функционально активные и в клетках E.coli, т.е. исправляющие соответствующие бактериальные дефекты. Известны 5 типов дрожжевых векторов. Векторы типа YIp (Yeast Integrating plasmid) являются фактически бактериальными векторами, так как дрожжевая ДНК в них представлена только одним из указанных в табл. 1 генов. Они не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформацию путем интеграции в хромосому через рекомбинацию дрожжевого гена с гомологичным участком и путем замены хромосомного гена на векторный с помощью двойного кроссинговера. Векторы типа YEp (Yeast Episomal plasmid) сконструированы на базе 2-микронной ДНК. Эти челночные векторы позволяют клонировать чужеродные гены в клетках E.coli и затем исследовать их экспрессию в дрожжевых клетках. Частота трансформации дрожжей векторами YEp на три порядка выше по сравнению с таковой векторами первого типа, но получаемые при этом трансформанты нестабильны. Векторы типа YRp (Yeast Replicating plasmid) имеют хромосомные репликаторные последовательности ars (autonomously replicating sequence), которые были найдены около генов trp1(ars1) и arg4 (ars2), а также в других участках дрожжевых хромосом. Однако они слабо обеспечивают самостоятельную репликацию векторов, поэтому полученные с их помощью трансформанты дрожжей нестабильны. Наиболее перспективны для клонирования генов векторы типа YCp, содержащие, кроме хромосомных репликаторов ars1 и ars2, центромеры дрожжевых хромосом. В настоящее время для конструирования таких векторов применяют центромеры 3-й (CEN3) и 11-й (CEN11) хромосом. Поскольку центромера обеспечивает физическую связь хромосомы с нитями веретена, векторы YCp проявляют стабильность при митозе и мейозе. Векторы типа YLp являются линейными минихромосомами. Их получают путем введения в кольцевые плазмиды YCp теломер (специфические нуклеотидные последовательности) и последующей линеаризации плазмид. Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно проста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, полуая так называемые сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии CaCl2 и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток- хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компонент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попадании в клетку- хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. 37.Синтез и клонирование комплементарных ДНК (кДНК). Характеристика фермента обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клеткихозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК.Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа). Обратная транскриптаза обладает тремя ферментативными активностями: 1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК; 2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК; 3) ДНК-эндонуклеазной активностью. Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК. Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, — химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I . По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечную кДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований. 38.Особенности экспрессии ранних (T- и tбелки), а также поздних (VP1-, VP2-, и VP3белки) генов вируса SV40. SV40-это ДНК-содержащий онкогенный вирус. Его геном представлен одной замкнутой двуцепочечной молекулой ДНК. ДНК в составе этого вируса находится в комплексе с четырьмя гистонами и образуют кольцевую,содержащую нуклеосомы минихромосому, окруженная белковой оболочкой(капсидом). Нуклеотидная последовательность этого вируса составляет 5243 н.п., также в структуре этого вируса выделяют участки,кодирующие пять вирусных белков: малый и большой Т-антигены, VP1-, VP2-, и VP3-белки.Вирус SV40, проникнув в клетку,направляется к ядру.Здесь происходит как бы распаковка вируса, затем –экспрессия генов.Первыми траскрибируются гены двух белков-малого и большого Т-антигенов в направлений против часовой стрелки. Этот участок в геноме называется «ранней областью». При синтезе мРНК для Т-антигенов происходит вырезание вставочной последовательности из первичного транскрипта с использованием аппарата сплайсинга. Ранние белки не входят в состав зрелых вирусных частиц, но большой Тантиген играет важнейшую роль в репликаций вирусной ДНК, выполняя функцию хеликазы.Репликация начинается в точке ori, идет в обоих направлениях и заканчивается в месте встречи репликативных вилок; затем происходит сшивание дочерних двухчепочечных молекул ДНк с образованием кольцевых структур. После инициаций репликаций ДНк замедляется синтез «ранних» белков и активизируется транскрипция «поздних» генов,протекает по часовой стрелке. Три мРНК образуются в результате различных реакций сплайсинга и транслируются в соответ-ие белки VP1-, VP2-, и VP3. Накопление дочерних молекул ДНК, белков, завершается сборкой вирусных частиц,их высвобождением из клетки. Новосинтезированная ДНК связывается с гистонами клетки-хозяина и образует спирализованный комплекс,который затем упаковывается в капсулу с помощью белков VP1-, VP2-, и VP3. 39.Организация РНК-содержащих онкогенных вирусов (ретровирусов). Провирусная ДНК, длинные концевые повторы (LTR). К РНК-содержащим вирусам относятся многие вирусы растений, возбудители заболеваний человека и животных: вирус полиомиелита, вирусы гриппа А, В и С, вирусы паротита (свинки), кори, чумы плотоядных животных (чумки), бешенства, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Многие РНК-содержащие вирусы вызывают ОРВИ (например, коронавирусы), желудочно-кишечные заболевания (реовирусы птиц, млекопитающих и человека).Вирионы РНК-содержащих вирусов содержат РНК. После проникновения в клетку вирусная РНК становится матрицей для синтеза ДНК и РНК. Вирионы ретровирусов представляют собой округлые частицы, обладающиетрехслойной структурой. Центральная часть вириона представлена нуклеопротеиновым комплексом, который включает молекул ревертазы . Эта структура окружена капсидом-белковой оболочкой.Геном ретровирусов уникален в следующих отношениях: 1) является единственным диплоидным; 2) вирусная РНК синтезируется и изменяется с помощью механизма, изменяющего клеточную мРНК; 3) это единственный геном, связанный со специфическим переносом функции РНК целиком к первичной репликации; 4) это единственный геном, кодирующий обратную транскриптазу, которая сама по себе уникальна. В сердцевине содержатся две идентичные молекулы одноцепочечной РНК (то есть геном ретровирусов диплоидный) длиной 8000-10000 нуклеотидов каждая, тРНК , а также некоторые белки, например обратная транскриптаза и интеграза . Концы вирусной РНК модифицированы как у мРНК : на 5'-конце находится 7-метилгуанозин, необходимый для инициации трансляции , на З'-конце полиадениловая последовательность, которая определяет стабильность мРНК (чем короче полиадениловая последовательность, тем быстрее происходит распад матрицы). Ретровирусная РНК участвует не в синтезе белка, а транскрибируется с образованием ДНК. ДНКформу ретровирусного генома называют провирусом. После проникновения в клетку вирусу, чтобы жить и развиваться, необходимо свою генетическуюинформацию, записанную в форме полимерной молекулы РНК, превратить в ДНКовую форму . Для этого клетка синтезирует белок-фермент, закодированный в вирусном геноме, под названием обратная транскриптаза . Этот фермент осуществляет образование на РНК однонитевой ДНК-копии. Затем с помощью того же фермента достраивается вторая нить ДНК. Новосинтезированная двунитевая ДНК-копия вируса получило название провируса. ДНК провируса имеет размер около 10 тыс. пар нуклеотидов и окружена с обеих сторон одинаковыми последовательностями нуклеотидов, называемыми длинными концевыми повторами- LTR, размером по 600700 п.н. каждый . В этих длинных концевых повторах содержатся все необходимые для регуляции работы генов элементы, которые управляют работой вирусных генов в новом для них месте. 40.Особенности трансляции эукариотических мРНК. Процессинг новосинтезированных белков. В клетках эукариот этапы биосинтеза белка представляют собой более тонко организованный процесс, связанный с особенностью организации их мРНК и иным набором белковых факторов трансляции. Зрелые мРНК эукариот содержат на 5/-конце- кэп, который необходим для связывания мРНК с малой (40S) субчастицей рибосомы.У большинства моноцистроновых мРНК эукариот в качестве стартового используется ближайший к 5/-концу триплет AUG, и ни один из других триплетов AUG, расположенных в кодирующей области мРНК, не может быть использован в качестве инициирующего.Инициация трансляции с кодона AUG происходит только тогда, когда он находится в составе соответствующего нуклеотидного окружения: за два нуклеотида от него должен располагаться пуриновый нуклеотид (A или G), а сразу после него- G:...NNN A(G)NN AUG GNNN…, где Nпиримидиновый нуклеотид. Перед началом трансляции у эукариот последовательность мРНК сканируется начиная с 5/-конца (кэпа) для поиска AUG, расположенного в оптимальном нуклеотидном окружении. Инициация трансляции у эукариот связана с функционированием большого числа белковых факторов инициации, которые называются eIFфакторами (eukaryotic Initiation Factors). К собственно факторам инициации относят белки eIF1-eIF5.Эти факторы условно подразделяют на две группы. К первой группе относят факторы, которые взаимодействуют с субчастицами рибосомы и тем самым облегчают присоединение инициаторной тРНКMet и мРНК. К этой группе принадлежат eIF-1, eIF -2, eIF-3, а также eIF-2B и eIF- S. Вторая группа факторов специфична для эукариот и включает мРНКсвязывающие и мРНК-расплетающие белки. Важнейшими из них являются факторы из группы eIF-4. После связывания кэпа для инициации трансляции необходимо расплетание вторичной структуры мРНК в 5 /нетранслируемой области. Этот ATP- зависимый процесс у эукариот осуществляется за счет РНКхеликазной активности белковых факторов eIF4A и eIF-4B. В элонгации трансляции участвуют два фактора (eIF-1 и eIF -2). Фактор eIF-1 образует комплекс с аминоацил- тРНК и GTP. Этот комплекс присоединяется к А-центру рибосомы. После предварительного узнавания (кодоноантикодонового взаимодействия) фактор элонгации расщепляет GTP и отходит от рибосомы вместе с GDP, освобождая тем самым акцептирующий конец пептидил-тРНК и открывая возможность для удлинения пептида в последующей реакции транспептидирования. Факторы элонгации эукариот в отличие от соответствующих факторов прокариот обладают выраженной РНК- связывающей способностью. В терминации трансляции эукариот участвует один белковый фактор- R, функция которого аналогична белковым факторам терминации бактерий. Процессинг новосинтезированных белков. К основным реакциям процессинга относятся: 1.Удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопетидазами. 2.Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина. 3.Частичный протеолизудаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином. 4.Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи. 5.Включение простетической группы. 6. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, н-р, гемоглобин, коллаген, лактатдегидрогеназа. Задача 1. А. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза катализирует синтез РНКкопий на цепи ДНК в ходе процесса, называемого транскрипцией. Б. Синтез РНК начинается на участке ДНК, называемом промотором и заканчивается на особом участке ДНК, называемом терминатором. В. В молекуле тРНК участок, называемый антикодон построен таким образом, что его основания образуют пары с комплементарной последовательностью из трех нуклеотидов, называемой кодоном, в молекуле мРНК. Задача 2. Г. Ферменты, называемые аминоацил-тРНК-синтетазами, присоединяют каждую аминокислоту к соответствующей молекуле тРНК, образуя молекулу аминоацилтРНК . Д. Генетический код называют вырожденным, потому что большинство аминокислот представлено более чем одним кодоном. Е. В рибосоме имеются три участка связывания молекул тРНК: аминоацильный, или А-участок, предназначенный для удерживания новой молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; пептидильный, или Р-участок, удерживающий молекулу тРНК, присоединенную к растущему концу полипептидной цепи; exit-участок, или Е-участок, предназначенный для удерживания деацилированной молекулы тРНК. Задача 3. Ж. Образование пептидной связи катализируется пептидилтрансферазой субчастицей рибосомы, каталитическая активность которой, осуществляется крупной молекулой 28S рРНК, входящей в состав большой субъединицы рибосомы. З. Белки, называемые факторами терминации, связываются со стоп-кодонами в А-участке рибосомы, в результате чего пептидилтрансфераза гидролизует связь, которая соединяет растущий пептид с молекулой тРНК. И. Во всех клетках первую аминокислоту, с которой начинается любая белковая цепь, доставляет молекула особой инициаторной РНК, узнающей кодон AUG и несущей аминокислоту метионин. Задача 4. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему. А. Направление движения РНКполимеразы зависит от связывания с промотором, а выбор матричной цепи – от дополнительных белковых факторов. Ответ: Неверно. Для транскрипции существенна ориентация промотора; именно она определяет ту цепь ДНК, которая служит матрицей для синтеза РНК. Цепь РНК, синтезируюшая направление от 5 к 3- концу должна быть антипараллельна матричной цепи. Б. В любом месте двойной спирали ДНК только одна цепь ДНК обычно используется как матрица. Ответ: верно В. В клетках бактерий транскрипцию РНК всех классов осуществляет РНК-полимераза одного типа, тогда как в клетках эукариот используются три разных типа РНК-полимераз. Ответ: верно Задача 5. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Г. Модифицированные нуклеотиды, особенно часто встречающиеся в молекулах тРНК, образуются в результате ковалентной модификации стандартных нуклеотидов перед их включением в РНКтранскрипты. Ответ: Неверно. Модифицированные нуклеотиды образуются после синтеза РНК. Д. Если в антикодоне тРНК Tyr заменить одно основание, так чтобы он узнавал сериновый кодон, а затем добавить его в бесклеточную систему, то синтезированный белок должен содержать тирозин во всех положениях, обычно занимаемых серином. Ответ: Неверно. Замена одного основания приведет к тому, что тРНКtyrстанет узнавать два сериновых кодона UCUили UCC. В бесклеточной системе вследствие конкуренции модифицированной тРНКtyrи тРНКser будет синтезироваться белок, содержащий как серин, так и тирозин, но в положениях определяемых четырьмя другими сериновыми кодонами будет находиться только серин. Е. Каждый комплекс аминокислоты с тРНК активирован не для собственно его синтеза, а для присоединения очередной аминокислоты к растущей полипептидной цепи. Ответ: верно Задача 6 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Ж. Согласно гипотезе неоднозначного соответствия, спаривание оснований происходит путем образования связи между основанием в первом положении кодона и основанием в третьем положений антикодона. Ответ: Неверно. Связь образуется между основанием в третьем положении кодона и в первом положении антикодона. З. Главная функция малой субчастицы рибосомы – связывание мРНК и различных тРНК; большая субчастица рибосомы катализирует образование пептидной связи. Ответ: верно И. На синтез белков, при котором для присоединения одной аминокислоты требуются четыре макроэргические фосфатные связи (4 на кодон), идет в целом меньше энергии, чем на транскрипцию ДНК с образованием РНК, при которой на один добавляемый к полинуклеотидной последовательности нуклеотид тратится свободная энергия двух макроэргических фосфатных связей (6 на кодон). Ответ: Неверно. На синтез белка тратится больше энергии, чем на транскрипцию ДНК с образованием РНК, поскольку на одной молекуле мРНК образуется сотни тысяч белков. Задача 7 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие – нет. Если утверждение неверно, объясните почему. К. Поскольку стартовым кодоном для начала синтеза белка является AUG, то метионин обнаруживается только на N-концах полипептидных цепей белков. Ответ: неверно. Метионин может обнаруживаться также в середине цепи мРНК. Л. Некоторая задержка между связыванием нагруженной тРНК с рибосомой и последующим использованием аминокислоты в белковом синтезе повышает точность последнего, давая возможность тРНК с неправильно спаренными основаниями отделиться от рибосомы. Ответ: верно М. Многие антибиотики, используемые в современной медицине, избирательно подавляют синтез белка только у бактерий благодаря структурным и функциональным различиям между рибосомами прокариот и эукариот. Ответ: верно Задача 8. Одна цепь участка ДНК, выделенной из Е. coli, имеет следующую последовательность оснований: 5'GTAGCCTACCCATAGG-3'. А. Допустим, что с этой ДНК транскрибируется мРНК, причем матрицей служит комплементарная цепь. Какова будет последовательность мРНК? мРНК: 5'-GUAGCCUACCCAUAGG-3'. Б. Какой пептид будет синтезироваться, если трансляция начинается точно с 5'-конца этой мРНК? (Предположите, что не требуется никакого стартового кодона, как это и происходит при определенных условиях опытов в пробирке.) Пептид: 5’-Val-Ala-Tyr-Pro-stop-3’ Когда от рибосомы отделяется тРНКAla, какая тРНК связывается следующей? тРНКTyr Когда аминогруппа аланина образует пептидную связь, какие связи разрываются, и разрываются ли вообще, и что происходит с Ala тРНК . При связывании аланина, происходит его отщепление от тРНК, т.е разрушается между ними ковалентная связь, тРНК освобождается и переходит из А-сайта в Рсайт В. Сколько пептидов кодирует эта мРНК? 1 пептид Будут ли синтезироваться такие же пептиды, если матрицей для трансляции будет служить другая цепь ДНК? Нет, так как цепь не представляет собой палиндром, последовательность нуклеотидов разная, следовательно, пептиды тоже будут разными. Г. Предположите, что эта последовательность ДНК транскрибируется, как указано в пункте А, но вам неизвестно, какая рамка считывания используется. Может ли этот участок ДНК относиться к началу гена, к его середине, к его концу? Данный участок может относиться лишь к концу цепи, т.к. содержит стоп-кодон. Задача 9. Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Фермент, ответственный за синтез ДНК как при репликации, так и при репарации, называется ДНК-полимераза. Б. Активный участок хромосомы, участвующий в репликации, представляет собой Y-образную структуру, называемую репликативная вилка . В. У Е. coli новосинтезированная ДНК кратковременно обнаруживается в молекулах длиной 1000-2000 нуклеотидов, называемых фрагменты Оказаки. Задача 10. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Г. Фермент, который сшивает разрывы в ДНК во время синтеза ДНК или ее репарации, называется ДНК-лигаза. Д. Та дочерняя цепь ДНК, которая при репликации синтезируется непрерывно, называется лидирующей, а та цепь, которая синтезируется с перерывами – отстающей. Е. Для ДНК-полимеразы в отличие от РНК-полимеразы совершенно необходим свободный З'-ОН-конец затравочной цепи, спаренной с расплетенной ДНК, чтобы присоединять к нему новые нуклеотиды. Задача 11. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Ж. Если ДНК-полимераза ошибочно присоединит неправильный нуклеотид к З'- концу, ее отдельный каталитически активный домен, обладающий (3' → 5') экзонуклеазной активностью, удалит неподходящее основание. З. Для инициации синтеза ДНК на отстающей цепи нужны короткие праймеры, возникающие благодаря работе фермента ДНКпраймаза, которая в качестве субстратов использует рибонуклеозидтрифосфаты. И. Расплетание двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализируется ДНК-геликазой, использующей для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТР. Задача 12. Заполните пропуски в следующих утверждениях. К. Способствующие расплетанию ДНК белки SSB-белки связываются с одноцепочечной ДНК таким образом, что основания становятся доступными для реакции матричного синтеза. Л. Если ДНК-полимераза ошибается при образовании пары оснований, соединенных друг с другом водородными связями, то ошибка исправляется специальной системой коррекцией неправильного спаривания (репарации повреждений), которая отличает новые цепи от старых по признаку метилирования. М. Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, было показано, что репликационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальные последовательности, называемые точки начала репликации. Н. Белки ДНК-топоизомеразы можно рассматривать как «обратимые нуклеазы», которые создают либо кратковременный одноцепочечный разрыв (тип I), либо кратковременный двухцепочечный разрыв (тип II). Задача 13. Фрагмент ДНК, изображенный на рис. 1-13, является двухцепочечным на концах и одноцепочечным в середине. Для верхней цепи указана полярность. Рис. 1-13. Фрагмент ДНК с одноцепочечным участком, образовавшимся вследствие разрыва в нижней цепи (задача 5-22). А. На каком конце фрагмента, 5' или 3', находится указанный на нижней цепи остаток фосфата (Р)? Указанный фосфат (Р) находится на 5'-конце того фрагмента, к которому он прикреплен. Б. Каким способом, по вашему мнению, будет заполняться с помощью репаративных внутриклеточных процессов разрыв в цепи ДНК? Промежуток будет заполняться путем непрерывного репаративного синтеза ДНК, начинающегося от указанной на нижней цепи ОН-группы и продолжающегося в направлении от 5'- к З'-концу (влево), до фосфатной группы (Р) на соседнем фрагменте. В. Сколько фрагментов будет содержаться в нижней цепи (рис. 1-13), если разрыв в ней заполняется (в условиях реакции в пробирке – in vitro) при наличии в среде только дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ДНКполимеразы? При отсутствии ДНК-лигазы два фрагмента нижней цепи останутся несоединенными даже после того, как заполнится промежуток между ними. Задача 14. Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Вирусы, инфицирующие бактерии, называются бактериофагами. Б. Размножение вирусов летально для клетки-хозяина, если для того, чтобы образовавшиеся вирусные частицы вышли наружу, она должна лизировать. В. Белковая оболочка, окружающая вирусный геном, называется капсид. Г. Самый внешний покров у вирусов, имеющих оболочку – это типичная мембрана, обычно приобретаемая вирусными частицами в процессе отпочковывания от плазматической мембраны. Задача 15. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Д. Поскольку в нормальных клетках нет ферментов, которые непосредственно копировали бы РНК на матрице РНК, то вирусы с РНК-геномом должны кодировать аминокислоты или белки, чтобы реплицироваться. Е. Если вирусная РНК выполняет роль непосредственно мРНК, то вирус называется вирусом с «+» нитью РНК (т.е. с РНК, имеющей положительную полярность); если в роли мРНК выступает РНК, комплементарная вирусной, то вирус называется вирусом с «-» нитью РНК. Ж. Бактерии называются лизогенные, если они несут в своих геномах «дремлющий», но потенциально активный вирусный геном: интегрированный вирусный геном называют провирусом; этот термин используется также при описании аналогичных вирусных геномов в клетках млекопитающих. З. Вирусы, которые могут встраивать свою ДНК в бактериальные хромосомы, называются лизированными бактериофагами. Задача 16. Заполните пропуски в следующих утверждениях. И. Животные клетки, в которых не развивается литическая инфекция, вызванная ДНК-содержащими вирусами, называются непермессивные. К. О животных клетках, которые вследствие вирусной инфекции из нормальных стали раковыми, говорят, что они подверглись неопластической трансформации, вызванной вирусом. Л. Стабильные генетические изменения, вызываемые ретровирусами, объясняются активностью фермента обратной транскриптазы, который транскрибирует цепи РНК с образованием комплементарных молекул ДНК. М. Транспозирующие (подвижные) элементы генома перемещаются с места на место в геноме хозяина, используя свои собственные ферменты сайт-специфической рекомбинации, называемые транспозазы. Задача 17. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Н. Элемент Ty1 в геноме дрожжей служит примером ретротранспозона, для перемещения которого требуется синтез полного РНК-транскрипта; последний копируется с образованием двуспиральной ДНК и только затем встраивается в новый локус хромосомы. О. Независимо реплицирующиеся элементы, называемые плазмидами, могут реплицироваться произвольно вне хромосомы клетки-хозяина. П. Вироиды, являющиеся возбудителями болезней растений, представляют собой мелкие одноцепочечные кольцевые молекулы РНК, которые не кодируют какой-либо белок. Р. Вирусы захватывают иногда последовательности ДНК в одной клеткехозяине и переносят их в другую клетку в процессе трансдукции ДНК. (Этот процесс не следует путать с трансфекцией ДНК, при которой в клетку вводится свободная ДНК.) Задача 18. Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Ферменты рестрицирующие нуклеазы разрезают двухцепочечную спираль ДНК по специфическим последовательностям, состоящим из четырех – восьми нуклеотидов (палиндромы), разделяя ее на фрагменты строго определенных размеров, которые называются рестрикты. Б. С целью размножения (амплифицирования) и получения в чистом виде тех или иных генов фрагменты эукариотической ДНК могут быть встроены в специально подготовленные бактериальные вирусы или в плазмиды, называемые векторами клонирования. В. Колония клеток, происходящая от одной клетки, называется клоном клеток. Задача 19. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Г. Отдельная колония бактерий, которые содержат плазмиду с включенным в нее фрагментом ДНК человека, называется клоном геномной ДНК; набор таких бактерий, представляющий весь геном человека, составит библиотеку геномной ДНК. Д. Двухцепочечные ДНК-копии эукариотических мРНК, полученные с помощью обратной транскриптазы, могут быть встроены в векторы клонирования для создания библиотеки кДНК, которая может использоваться для выявления отдельных клонов, соответствующих определенным мРНК. Е. Если от одного организма имеются клетки двух близких между собой типов и при этом интересующий исследователя белок или белки производят клетки только одного типа, то перед клонированием кДНК можно прибегнуть к методу субтрактивная гибридизация, позволяющему обогатить смесь определенными нуклеотидными последовательностями. Задача 20. Заполните пропуски в следующих утверждениях. Ж. Использование перекрывающихся клонов для продвижения от известного гена к ближайшему гену называется методом «прогулка по хромосоме». З. Чтобы установить, содержит ли данный клон ДНК, кодирующую ранее охарактеризованный белок, часто проводят гибридизационную селекцию, т. е. клонированную ДНК используют для того, чтобы отобрать соответствующую мРНК, продукт трансляции которой можно затем сравнить с известным белком. И. Плазмиды или вирусы с сильными промоторами, размещенными так, что продукт клонируемого гена может производиться в большом количестве, называются экспрессирующими векторами. Задача 21. Заполните пропуски в следующих утверждениях. К. Новый гибридный ген, который кодирует комбинированный белок, может быть образован путем соединения частей кодирующих последовательностей двух разных генов. Л. В клетках зародышевой линии у трансгенных мышей присутствуют хромосомы со стабильными изменениями, которые произошли в результате интеграции клонированной ДНК. М. Очищенные ДНК-полимеразы и синтетические олигонуклеотиды ДНК можно использовать для амплификации отдельных областей генома с помощью метода ПЦР. Задача 22. Рестриктазы BamHI и PstI разрезают узнаваемые ими последовательности, как показано на рис. 122. Рис. 1-22. Расщепление рестриктазами BamHI и PstI узнаваемых ими последовательностей. Показаны только те нуклеотиды, которые образуют сайты узнавания. А. Укажите, где находятся 5'- и З'концы разрезаемых молекул ДНК. 5'- и З'-концы разрезанных молекул показаны на рис. 5-58. Последовательности ДНК обычно представляют таким образом, что 5'-конец верхней цепи находится слева. Б. Как будут модифицироваться эти концы, если инкубировать разрезанные молекулы ДНК с ДНК-полимеразой в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов? Как показано на рис. 5-58, концы, образующиеся при обработке BamHI, могут быть достроены ДНК-полимеразой, а концы, образующиеся при обработке PstI-нет. Это различие объясняется известным свойством ДНК-полимеразы: для ее работы необходимы праймер с З'-ОН-концом, к которому могут присоединяться дезоксинуклеозидтрифосфаты, и матричная цепь, определяющая, какой нуклеотид должен присоединиться. Эти требования выполняются в случае BamHI-концов. но не в случае концов, образуемых рестриктазой PstI, которая разрезает дальше от 5'-конца, в результате чего фрагменты не достраиваются ДНК-полимеразой, так как 5'-конец не может служить затравкой. Примечание: обычно в методе рекомбинантной ДНК используется ДНКполимераза фага Т4, чтобы «затупить» концы обоих типов. Концы BamHl будут «затупляться» в результате пришивания к ним соответствующих нуклеотидов, как показано на рис. 5-58. Однако PstI-концы также будут затупляться благодаря ассоциированной У -* 5'-экзонуклсазной активности, которая удаляет участок у З'конца, оставляя тупой конец. В. Могут ли концы, появившиеся в результате разрезания ферментом BamHI, соединиться вновь при инкубации с ДНКлигазой фага Т4 после того, как была проведена реакция, о которой шла речь в пункте Б? Можно ли соединить вместе концы ДНК, образовавшиеся при обработке PstI? (Лигаза ДНК фага Т4 соединяет вместе «тупые» концы так же, как и «липкие».) Как видно на рис. 5-58, затупленные концы в случае BamHI и немодифицированные концы в случае PstI могут соединяться ДНК-лигазой фага Т4. Г. Будет ли регенерировать узнаваемый BamHI сайт, о котором шла речь в пункте В, при соединении концов? Будет ли регенерировать сайт, узнаваемый PstI? Соединение обработанных концов приводит к восстановлению PstI-сайта, но не BamHIсайта. За счет соединения достроенных концов в случае BamHI образуются два новых рестрикционных сайта, как указано на рис. 558. Расщепление, достраивание на концах и соединение концов заново часто приводят к появлению новых рестрикционных сайтов, которые иногда полезны для дальнейших манипуляций с ДНК. Задача 23. Фермент рестрикции Sau3A узнает последовательность — /GATC— и расщепляет цепь ДНК на 5'-стороне (слева) от G (поскольку верхняя и нижняя цепи большинства сайтов рестрикции читаются одинаково в направлении от 5'- к З'-концу, только одна цепь этого сайта может быть показана для иллюстрации). Одноцепочечные концы, возникающие при расщеплении рестриктазой Sau3A, идентичны концам, возникающим при расщеплении рестриктазой BamHI (-G/GАТСС-), что позволяет им соединяться при инкубации с ДНК-лигазой. (Полезно нарисовать структуру продукта, образующегося в результате такого сшивания, чтобы убедиться в том, что она правильна.) А. Какая доля сайтов, узнаваемых BamHI, может быть разрезана рестриктазой Sau3A? Какая доля сайтов, узнаваемых Sau3A, может быть разрезана рестриктазой BamHI? Четыре центральных нуклеотида в сайте, узнаваемом BamHI, образуют сайт, узнаваемый Sau3A. Поскольку Sau3A узнает только чти четыре нуклеотида, все BamHIсайты будут разрешаться ферментом Sau.lA. Обратного, однако, не может быть, потому что BamHI узнает сайт, состоящий из шести нуклеотидов. Таким образом, BamHI будет разрезать только часть сайтов, узнаваемых Sau3A. у которых есть соответствующие соседние нуклеотиды (т.е. 5'G н З'С). Поскольку в среднем один из четырех соседних нуклеотидов на каждой стороне окажется правильным, то лишь одно из 16 возможных расположений двух пограничных нуклеотидов будет подходящим для того, чтобы сайт расщеплялся BamHI. Таким образом, только 1 из 16 сайтов, узнаваемых Sau3A. будет разрезаться BamHI. Б. Если два конца, образовавшиеся при расщеплении BamHI, сшиваются вместе, то образующийся сайт может быть снова расщеплен BamHI. Тo же самое справедливо для двух концов, образующихся при расщеплении Sau3A. Предположите, однако, что вы сшиваете конец, образовавшийся при обработке Sau3A, с концом, образовавшимся при обработке BamHI. Может ли гибридный сайт разрезаться рестриктазой Sau3A, рестриктазой BamHI? Поскольку для Sau3A, как уже было отмечено, не имеют значения iini раничные нуклеотиды. все гибридные сайты Sau3A BamHI могут разрезаться с помощью Sau3A. Однако с помощью BamHI будет разрезаться в среднем только один из четырех гибридных сайтов. В гибридном сайте пять из шести нуклеотидов будут соответствовать BamHIсайту; шестой нуклеотид окажется правильным примерно в одном из четырех гибридных сайтов. В. Каков будет средний размер фрагментов ДНК, образующихся при обработке хромосомной ДНК рестриктазой Sau3A, рестриктазой BamHI? Вероятность того, что любая четырехнуклеотидная последовательность окажется Sau3A-caйтом. равна (1/4)4. или 1 из 256. п выбранной случайным образом последовательности ДНК, где все четыре нуклеотида встречаются с одинаковой частотой. Таким образом, сайт, узнаваемый Sau3A. будет встречаться в среднем один раз на 256 п. и. в цепи ДНК. Сайт, узнаваемый BamHI и состоящий из шести нуклеотидных пар, будет встречаться один раз на 4096 п. н. ((1/4)6 = 4096) в случайной последовательности ДНК. Задача 24. Гемоглобин крови человека содержит 0, 34% железа. Вычислите минимальную молекулярную массу гемоглобина. Необходимые пояснения: средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка принимается за 120; вычисление молекулярной массы белков: Мmin = а : б * 100%; где Мmin минимальная молекулярная масса белка; а – атомная или молекулярная масса компонента (железо Fe – 56); б – процентное содержание компонента. Дано: ω Fе в гемоглобине = 0,34% Найти: Mmin (гемоглобина) - ? Анализ: M (1-го а/к остатка) = 120 Мmin = а : б * 100%, где а – молекулярная масса компонента, б – процентное содержание компонента. M(Fe) = 56 Решение: Мmin = 56 : 0,34% * 100% = 16470,58 Ответ: Мmin = 16470,58 Задача 25. Альбумин сыворотки крови человека имеет молекулярную массу 68400. Определите количество аминокислотных остатков в молекуле этого белка. Необходимые пояснения: средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка принимается за 120. Дано: М (альбумина) = 68400 Найти: n а/к остатков - ? Анализ: M (1-го а/к остатка) = 120 Решение: х = 68400/120 = 570 Ответ: n а/к остатков = 570 Задача 26. Белок содержит 0,5% глицина. Чему равна минимальная молекулярная масса этого белка, если М глицина = 75,1? Сколько аминокислотных остатков в этом белке? Необходимые пояснения: средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка принимается за 120; вычисление молекулярной массы белков: Мmin = а : б * 100%; где Мmin минимальная молекулярная масса белка; а – атомная или молекулярная масса компонента; б – процентное содержание компонента. Дано: ω глицина в белке = 0,5% Найти: Mmin (белка) - ? n а/к остатков - ? Анализ: M (глицина) = 75,1 M (1-го а/к остатка) = 120 Мmin = а : б * 100%, где а – молекулярная масса компонента, б – процентное содержание компонента. M(Fe) = 56 Решение: Мmin = 75,1 : 0,5% * 100%= 15020 n а/к остатков = 15020 : 120 = 125 Ответ: Мmin = 15020; n а/к остатков = 125 Задача 27. Во фрагменте ДНК в одной цепи нуклеотиды расположены в следующей последовательности: –5’–A-A-G-T-C-T-A-C-G-T-A-T–3’– Определите процентное содержание всех нуклеотидов в двухцепочечной ДНК этого фрагмента и его длину. Необходимые пояснения: Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) составляет 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C). Найти: ω (%) A, T, G, C в двухцепочечной ДНК этого фрагмента - ? l фрагмента - ? Анализ: Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) = 0,34 нм Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C) Решение: 12 нуклеотидов – 100% содерж. А = 4 – х % х = 100 * 4 / 12 = 33,3% соответственно: A=T = 33,3%; G=C = 16,7% l фрагмента: 0,34 * 12 = 4,08нм Ответ: A=T = 33,3%; G=C = 16,7% l фрагмента = 4,08нм Задача 28. В молекуле ДНК на долю цитидиловых нуклеотидов приходится 18%. Определите процентное содержание других нуклеотидов в этой ДНК. Необходимые пояснения: Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C). Дано: Доля C = 18% Найти: ω (%) A, T, G, C в этой ДНК Анализ: Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C) Решение: G=C = 18% , => A=T = 32%; Ответ: A=T = 32%; G=C = 18% Задача 29. В молекуле ДНК обнаружено 880 гуаниловых нуклеотидов, которые составляют 22% от общего числа нуклеотидов в этой ДНК. Определите: 1) сколько других нуклеотидов в этой ДНК? 2) какова длина этого фрагмента? Необходимые пояснения: Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) составляет 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C). Дано: G = 880 нк = 22% Найти: ω (%) A, T, G, C в этой ДНК l фрагмента - ? Анализ: Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) = 0,34 нм Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C) Решение: G=C = 22% ,=> A=T = 28%; n нк A и T = 880 * 28 / 22 = 1120 G=C = 880 A=T = 1120; l фрагмента: (880 + 880 + 1120 + 1120) / 2 * 0,34 = 680 нм Ответ: A=T = 22%; G=C = 28% l фрагмента = 680 нм Задача 30. Дана молекула ДНК с относительной молекулярной массой 69000, из них 8625 приходится на долю адениловых нуклеотидов. Найдите количество всех нуклеотидов в этой ДНК. Определите длину этого фрагмента. Необходимые пояснения: Относительная молекулярная масса одного нуклеотида принимается за 345; Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) составляет 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C). Дано: Mr (ДНК) = 69000 Mr (А) = 8625 Найти: n A, G, C, T в этой ДНК l фрагмента - ? Анализ: Mr (1-го нуклеотида) = 345 S м/у нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= l одного нуклеотида) = 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C) Решение: n нуклеотидов = 69000 / 345 = 200 n А = 8625 / 345 = 25 (=> Т = 25, G=C = 75) l фрагмента = (25 + 75) * 0,34 = 34нм Ответ: A=T = 25нк; G=C = 75нк Длина фрагмента = 34нм Задача 31. Что тяжелее: белок или его ген? Необходимые пояснения: Средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка принимается за 120; Средняя молекулярная масса одного нуклеотида принимается за 345. Одна аминокислота кодируется тремя нуклеотидами. Масса одной аминокислоты равна 120, масса нуклеотидов, ее кодирующих равна 1035 (345*3). Очевидно, что ген тяжелее белка. Задача 32. Дана молекула ДНК с относительной молекулярной массой 345000, из них 43125 приходится на долю гуаниловых нуклеотидов. Найдите количество всех нуклеотидов в этой ДНК. Определите длину этого фрагмента. Необходимые пояснения: Относительная молекулярная масса одного нуклеотида принимается за 345; Расстояние между нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) составляет 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C). Дано: Mr (ДНК) = 345000 Mr (G) = 43125 Найти: n A, G, C, T в этой ДНК l фрагмента - ? Анализ: Mr (1-го нуклеотида) = 345 S м/у нуклеотидами в цепи молекулы ДНК (= длина одного нуклеотида) = 0,34 нм; Правила Чаргаффа: 1) ∑(А) = ∑(Т); 2) ∑(G) = ∑(C); 3) ∑(А+G) = ∑(Т+C) Решение: n нуклеотидов = 345000 / 345 = 1000 n G = 43125/ 345 = 125 (=> C = 125, A=T = 375) l фрагмента = (125 + 375) * 0,34 = 170нм Ответ: A=T = 375нк; G=C = 125нк l фрагмента = 170нм