На правах рукописи 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ
advertisement
На правах рукописи ЖУКОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА СИМБИОТИЧЕСКАЯ АССОЦИАЦИЯ WOLBACHIA–DROSOPHILA MELANOGASTER: УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2011 Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Учреждения Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: кандидат биологических наук Киселева Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Высоцкая Л.В. Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск доктор биологических наук, профессор Бугров А.Г. Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Защита диссертации состоится «__» ___________ 2011 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр-т Ак. Лаврентьева, д. 10, тел/факс (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «__» __________ 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Хлебодарова Т.М. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние десятилетия существенное внимание уделяется исследованию механизмов симбиоза, в частности анализу взаимодействия эндосимбионтов и их хозяев, так как на основе полученных знаний становится возможным использовать влияние эндосимбионтов на различные функции хозяина. Эффективность симбиоза зависит от генотипа организмов и условий их обитания (Thomas, Blanford, 2003). В естественной среде обитания все организмы подвержены влиянию различных неблагоприятных факторов, и изучение особенностей поведения симбионтов в условиях стресса обеспечивает получение новой информации о процессах, происходящих в симбиотических ассоциациях в природе. Хозяин и симбионт, каждый в отдельности, могут специфически реагировать на изменения условий окружающей среды, а ответ симбиотической ассоциации в целом будет зависеть от взаимодействия партнеров в новых условиях. Можно предположить, что под влиянием экспериментально созданных неблагоприятных факторов среды будет происходить либо активация, либо ингибирование процессов взаимодействия симбионтов, и исследование их организации и динамики в таких условиях позволит выявить дополнительные особенности отношений в системе эндосимбионт-хозяин. До настоящего времени влияние изменений факторов среды на морфологию и взаимоотношения симбионтов, особенно на ультраструктурном уровне, мало изучены и являются активно развивающейся и актуальной областью исследований. Эндосимбиотические бактерии рода Wolbachia широко распространены среди членистоногих и вызывают у них изменения репродуктивных функций, такие как цитоплазматическая несовместимость, партеногенез, феминизация и андроцид (Werren et al., 2008). Исследование особенностей строения и функциональной роли Wolbachia позволяет выявить механизмы симбиоза на клеточном и организменном уровнях, и найти возможные пути влияния бактерий на численность популяций насекомых-вредителей сельского хозяйства, а также на виды организмов, патогенных для животных и человека. Одним из удобных модельных объектов для исследования процессов взаимодействия Wolbachia-хозяин является Drosophila melanogaster, цитологические и генетические особенности которой достаточно подробно изучены. В настоящей работе мы использовали этот объект, а в качестве стрессовых факторов среды для симбиотических организмов было выбрано влияние на них повышенной температуры и голодания хозяина. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - провести исследование влияния повышенной температуры и голодания на морфологию клеток яичников и ранних эмбрионов D. melanogaster, симбиотических бактерий Wolbachia в этих клетках, а также на взаимодействие бактерий и хозяина на клеточном и субклеточном уровнях. Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать и сравнить ультраструктуру клеток яичников и синцитиальных эмбрионов D. melanogaster, неинфицированных и инфицированных бактериями Wolbachia, в стандартных лабораторных условиях и после 1 воздействия повышенной температуры и голодания. 2. Провести сравнительный анализ распределения и морфологии бактерий в клетках яичников и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster в стандартных лабораторных условиях и после стрессовых воздействий. 3. Провести сравнительный анализ структурно-функциональных взаимодействий между бактериями и внутриклеточными органеллами хозяина в стандартных лабораторных условиях и после воздействия на D. melanogaster повышенной температуры и голодания. Научная новизна С использованием методов световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также методов молекулярной биологии, в работе впервые проведен подробный комплексный анализ тонкой структурной организации и взаимодействия симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) – D. melanogaster (линия w1118) в экспериментальных стрессовых условиях. Установлено, что тепловое воздействие и голодание хозяина вызывают различные изменения морфологии Wolbachia штамм wMelPop в цитоплазме синцитиальных эмбрионов и клеток яичников, однако не влияют на их распределение у мух линии w1118. Впервые в клетках яичников D. melanogaster w1118 описаны Wolbachia, контактирующие с электронно-плотными тельцами, которые предположительно являются покоящейся формой бактерий. Их количество увеличивается при голодании мух. На ультраструктурном уровне продемонстрировано, что, несмотря на изменение морфологии каждого из симбионтов в ответ на стресс, тесные структурно-функциональные контакты бактерий с цитоплазматическими органеллами хозяина сохраняются. Впервые показано, что присутствие Wolbachia штамм wMelPop увеличивает частоту апоптоза в гермариях яичника D. melanogaster w1118 по сравнению с неинфицированными мухами. Практическая значимость работы Штамм wMelPop в настоящее время считается наиболее патогенным штаммом бактерий Wolbachia, снижающим продолжительность жизни у D. melanogaster и комаров. Результаты нашего исследования, демонстрирующие особенности поведения партнеров симбиотической ассоциации Wolbachia (штамм wMelPop) – D. melanogaster (линия w1118) в стрессовых условиях, могут быть использованы при построении моделей для поиска путей воздействия с помощью Wolbachia на численность популяций насекомых, являющихся переносчиками заболеваний человека и животных, а также вредителей сельского хозяйства. Положения, выносимые на защиту: 1. Симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop вызывают увеличение апоптоза клеток в контрольной точке гермария яичника D. melanogaster. 2. Присутствие Wolbachia в организме D. melanogaster не влияет на изменение морфологии клеток яичников, происходящие под действием повышенной температуры и голодания. 3. При действии повышенной температуры и голодания характер распределения 2 Wolbachia штамм wMelPop в синцитиальных эмбрионах и клетках яичников D. melanogaster сохраняется, однако происходят различные изменения морфологии бактерий, обусловленные как их дегенерацией, так и адаптацией к стрессу. 4. В условиях теплового стресса и голодания мух бактерии Wolbachia продолжают тесно контактировать с эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями в клетках яичников D. melanogaster. Апробация работы. Результаты работы были представлены на: XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине» (Новосибирск, 2007); V Международной конференции, посвященной биологии Wolbachia (Колимбари, Крит, Греция, 2008); IV съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, Узбекистан, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009); XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010); 14-й Международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010); Научной школе-конференции «Успехи в исследовании симбиоза» (Реховот, Израиль, 2010); Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010); на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (2009). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых отечественных журналах. Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по тепловому воздействию на симбионтов проведены совместно с Д.А. Ворониным. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы (157 ссылок). Работа изложена на 161 страницах, содержит 58 рисунков и 5 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали линию Drosophila melanogaster w1118, полученную от проф. С. О’Нейлла (Университет Квинсланда, Австралия), инфицированную бактериями Wolbachia, штамм wMelPop. Мух содержали при температуре 25ºC на стандартном дрожжевом или на обогащенном корме. При содержании мух на обогащенном корме стандартный корм покрывали слоем дрожжевой пасты и ежедневно меняли на свежий. Для получения неинфицированной линии w1118Т мух содержали в течение двух поколений на корме с добавлением тетрациклина (0,03 %), а три последующих поколения – на стандартном корме. Зараженность D. melanogaster бактериями проверяли с помощью ПЦР, с использованием ДНК, выделенной из яичников мух, и праймеров к фрагменту гена поверхностного белка Wolbachia wsp 81F/wsp 691R (Braig et al., 1998). 3 Для теплового воздействия мух помещали в водный термостат в предварительно нагретые до 36ºС пробирки с кормом на 75 мин. Яичники и эмбрионы D. melanogaster фиксировали через 3,5-4 ч после воздействия. Голодание мух проводили в термостате при температуре 25С. 5-дневных мух переносили со стандартного корма в пустые пробирки, которые закрывали влажной ватой. Яичники фиксировали сразу после 24 ч голодания. Для определения продолжительности жизни D. melanogaster в условиях голодания, 5-дневных мух наркотизировали и разделяли на самцов и самок. 30 особей помещали в пустые пробирки, закрытые влажной ватой, и ставили в термостат с температурой 25С. Учет погибших мух вели через 24, 40, 48, 58 и 72 ч. Эксперимент проводили в четырех повторностях, в каждом из экспериментов учитывали продолжительность жизни 120-150 особей каждой группы мух. Обработку результатов проводили с помощью стандартных статистических методов (Васильева, 2000). При определении выживаемости потомства линий D. melanogaster 100-200 мух в возрасте 2-6 дней помещали в стеклянную бутылку со съемным дном, содержащим корм, в термостат с температурой 22-24С на 1 ч. Затем мух из бутылки удаляли, подсчитывали отложенные на корм яйца и помещали в термостат при 22-24С на время, пока из них не разовьются все имаго. Определение выживаемости мух производили путём подсчёта отношения числа развившихся мух к числу отложенных яиц, принимаемому за 100%. Оценку уровня апоптоза в яичниках D. melanogaster проводили с помощью окраски клеток яичников акридиновым оранжевым (Abrams et al., 1993; Foley, Cooley, 1998). Яичники 5-дневных мух выделяли в растворе Эфрусси-Бидла Рингера, окрашивали 3 мин. в растворе акридинового оранжевого (5 мкг/мл) на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) при комнатной температуре. Затем яичники переносили на предметное стекло в каплю галокарбонового масла, покрывали покровным стеклом и анализировали в флуоресцентном микроскопе (Axioscop 2 plus, Zeiss, Германия). Процент гермариев с апоптозом подсчитывали как отношение количества гермариев с апоптозом к общему числу проанализированных гермариев. Фиксацию яичников и синцитиальных эмбрионов D. melanogaster для электронно-микроскопического анализа проводили согласно ранее описанному методу (Terasaki et al., 2001; Дудкина и др., 2004). Затем образцы обезвоживали в спирте, ацетоне и заключали в смолу Agar 100 Resin. Ультратонкие срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали в электронном микроскопе JEM 100 SX (JEOL, Япония). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Морфология клеток яичника неинфицированной и инфицированной Wolbachia D. melanogaster, линии w1118Т и w1118, на разных стадиях оогенеза В яйцевых трубках видов рода Drosophila выделяют два отдела: гермарий и вителлярий (King et al., 1956; Dansereau et al., 2005). Наши данные показали, что в яйцевых трубках яичников мух линий w1118 и w1118Т клетки гермария сходны по морфологии и имеют округлую или уплощенную форму, небольшие 4 размеры (около 5 мкм), достаточно крупные ядра и небольшое количество цитоплазмы. Основываясь на морфологических особенностях строения, в оогенезе D. melanogaster выделяют 14 стадий развития яйцевых камер (King et al., 1956). С использованием световой и электронной микроскопии нами была проанализирована морфология клеток вителлярия, включающих ооциты, питающие и фолликулярные клетки, на стадиях оогенеза 1-10. Следует отметить, что на стадиях оогенеза 11-14, когда ооцит занимает практически весь объем яйцевой камеры, его исследование в электронном микроскопе было затруднено из-за вителлиновой оболочки, синтезируемой фолликулярными клетками вокруг ооцита и препятствующей его нормальной фиксации. Сравнительное исследование срезов яичников в световом и электронном микроскопе не выявило каких-либо различий в организации яйцевых камер вителлярия неинфицированных и инфицированных Wolbachia мух. Таким образом, присутствие бактерий не изменяет организацию яйцевых камер яичника D. melanogaster и тонкую морфологию клеток гермария и вителлярия. Ультраструктура бактерий Wolbachia штамм wMelPop и их распределение в клетках яичника и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 Электронно-микроскопическое исследование показало, что в цитоплазме всех типов клеток яичника и в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 бактерии Wolbachia имеют кокковидную или палочковидную форму, варьируют в размере от 0,5 до 1,4 мкм и окружены трехслойной оболочкой (Рис. 1 а). В бактериальном матриксе выявляется большое количество рибосом, а также расправленные нити ДНК и компактный хроматин. Во всех типах клеток вителлярия яичников впервые обнаружены Wolbachia, тесно контактирующие с округлыми электронно-плотными тельцами, расположенными под наружной оболочкой бактерий (Рис. 1 б, в). Такие тельца диаметром 0,2-0,5 мкм имеют Рис. 1. Бактерии Wolbachia в цитоплазме клеток яичников. а – бактерия с типичной морфологией. На вставке сверху – тройная оболочка бактерии; б, в – Wolbachia, контактирующие с электронно-плотными тельцами (стрелки) в питающей (б) и фолликулярной клетке вителлярия. Масштаб: 0,5 мкм. более плотный, чем у бактерий, гомогенный матрикс и покрыты двойной оболочкой. Доля бактерий, контактирующих с тельцами, составляет 0,8% в питающих клетках на стадиях оогенеза 1-6, и 0,2% в питающих клетках на стадиях оогенеза 7-8. Зарегистрированное нами появление Wolbachia, контактирующих с электронно-плотными тельцами, по-видимому, связано с изменением функционального состояния бактерий. Основываясь на 5 литературных данных, полученных на разных видах бактерий (Wiebe et al., 1972; Miyashita, Matsumoto, 2004; Kozek, 2005), можно предположить, что эти структуры представляют покоящуюся форму Wolbachia. Установлено, что бактерии присутствуют во всех типах клеток яичника. В клетках цист гермария, в питающих и фолликулярных клетках вителлярия бактерии Wolbachia распределены по всей цитоплазме равномерно. Следует отметить, что фолликулярные клетки содержат наименьшее количество бактерий по сравнению с другими типами клеток яичника мух. Наибольшая плотность бактерий выявлена в ооцитах на 1-7 стадиях развития яйцевых камер. На 1-3 стадиях оогенеза Wolbachia занимают всю свободную от внутриклеточных органелл цитоплазму ооцита, а на 4-6 стадиях оогенеза они локализуются в его апикальной части. В синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 бактерии штамма wMelPop локализуются вблизи ядер на разных стадиях клеточного цикла. В интерфазе бактерии распределены случайным образом вокруг ядер, а на всех стадиях митоза они концентрируются вблизи полюсов веретена деления. Эти наблюдения согласуются с литературными данными о локализации Wolbachia других штаммов в эмбрионах мух и обусловлены взаимодействием эндосимбионтов с микротрубочками в клетках хозяина (Callaini et al., 1994). Сравнительный анализ количества гермариев с апоптозом у неинфицированных и инфицированных Wolbachia штамм wMelPop D. melanogaster В гермарии видов рода Drosophila выделяют четыре района: 1, 2а, 2б, 3 (Dansereau et al., 2005). В районе 2а/2б, где расположена контрольная точка (checkpoint) и может происходить апоптоз, располагаются 16-клеточные цисты, соматические стволовые клетки (ССК), контактирующие с клетками ниши, и фолликулярные клетки. Проведенный нами анализ с использованием флуоресцентной микроскопии окрашенных акридиновым оранжевым яйцевых трубок показал, что у инфицированных и неинфицированных мух подвергшиеся апоптозу клетки располагаются в районе 2а/2б гермария в виде крупных скоплений желтого или оранжевого цвета (Рис. 2 а, в). Клетки имели гомогенную зеленую окраску в яйцевых трубках, в которых апоптоз отсутствовал (Рис. 2 б, г). Количественный анализ яйцевых трубок показал, что при содержании неинфицированных Wolbachia мух на стандартном корме, процент гермариев, в которых присутствуют цисты, подвергшиеся апоптозу, составляет 41,8±4,1%. В яичниках мух, инфицированных Wolbachia штамм wMelPop, этот параметр увеличивается до 70,6±5,3%, (Рис. 2 д). Чтобы исключить возможное влияние недостаточного питания D. melanogaster на полученные результаты, был проведен эксперимент с использованием обогащенного корма, поскольку ранее было показано, что содержание на нем мух уменьшает количество гермариев с апоптозом, по сравнению со стандартным кормом (Drummond-Barbosa, Spradling, 2001; Smith et al., 2002). Обнаружено, что использование обогащенного корма приводит к небольшому снижению относительного количества гермариев с апоптозом в обеих группах, однако различие по этому показателю между инфицированными Wolbachia и неинфицированными мухами 6 Рис. 2. Визуализация клеток гермария после окраски яичников D. melanogaster акридиновым оранжевым. а, в – гермарии с цистами, подвергшимися апоптозу, в районе 2а/2б у неинфицированных (w1118T) и инфицированных Wolbachia (w1118) мух, соответственно; б, г – гермарии тех же линий мух, не содержащие цист, подвергшихся апоптозу. Скобками обозначен район 2а/2б гермария. д – относительное количество гермариев с апоптозом у неинфицированных и инфицированных Wolbachia D. melanogaster. n- общее количество проанализированных гермариев. **P>0,99; *P>0,95. Достоверность различий между средними величинами определяли с помощью критерия Стьюдента. Масштаб: 20 мкм. остается достоверно значимым. Полученные данные свидетельствуют об увеличении числа гермариев с апоптозом у инфицированных Wolbachia штамм wMelPop мух. Исследование ультраструктуры клеток гермария у неинфицированных и инфицированных wMelPop мух подтвердило данные флуоресцентной микроскопии и позволило выявить в районе 2а/2б клетки цист с характерными признаками апоптоза, такими как: конденсация ядра и цитоплазмы (пикноз), потеря контактов с окружающими клетками, распад клеток на фрагменты, или апоптозные тельца. Во многих клетках подвергшихся апоптозу цист у инфицированных Wolbachia мух наблюдались большие скопления тесно расположенных бактерий. Фолликулярные клетки, окружающие цисты в районе 2б гермария, имели нормальную морфологию и содержали лишь небольшое количество бактерий. Можно предположить два пути влияния присутствия эндосимбионта в клетках яичника D. melanogaster на апоптоз в контрольной точке гермария. Вопервых, это может быть непосредственное воздействие бактерий на клетки зародышевого пути. Известно, что именно в районе 2а гермария одна из 16 клеток цисты дифференцируется в ооцит, остальные же становятся питающими клетками. Одновременно происходит транспорт 15 центриолей в ооцит и формирование в нем центра организации микротрубочек (Mahowald, Strassheim, 1970; Megraw, Kaufman, 2000). Ранее было показано, что Wolbachia взаимодействуют с микротрубочками на ранних стадиях оогенеза (Ferree et al., 2005). Возможно, что выявленное нами методом электронной микроскопии присутствие большого количества бактерий Wolbachia в клетках цисты на стадии дифференцировки ооцита в районе 2а приводит к нарушениям на структурном или молекулярном уровне, вследствие чего циста подвергается апоптозу. 7 Во-вторых, увеличение частоты апоптоза в гермариях в присутствии Wolbachia может быть связано с влиянием бактерий на ССК, которые дают начало фолликулярным клеткам в районе гермария 2б. Существует гипотеза, согласно которой апоптоз в районе 2а/2б гермария служит для поддержания правильного количественного соотношения клеток зародышевого пути и соматических фолликулярных клеток (Drummond-Barbosa, Spradling, 2001). Известно, что стволовые клетки окружаются клетками ниши, обеспечивающими необходимые условия для их функционирования (Li, Xie, 2005). Недавно было показано, что Wolbachia имеют высокую плотность в клетках ниши ССК (НССК) гермария (Frydman et al., 2006). Можно предположить, что присутствие бактерий в НССК негативно влияет на их функцию и способствует замедлению деления ССК, что приводит к нарушению соотношения между соматическими клетками и клетками зародышевого пути, и, как следствие, к гибели цист. Согласно нашим данным, фолликулярные клетки в районе 2б гермария у инфицированных Wolbachia мух линии w1118 имеют нормальное строение, что, по-видимому, свидетельствует об отсутствии негативного влияния Wolbachia на эти клетки. Таким образом, проведенные нами исследования показали, что присутствие Wolbachia штамм wMelPop у D. melanogaster w1118 влияет на ранние этапы формирования яйцевых камер в гермарии. Предложены два возможных пути действия бактерий на клетки яичника мух. Следует отметить, что плодовитость инфицированных wMelPop D. melanogaster не снижена по сравнению с неинфицированными мухами (Reynolds et al., 2003; Воронин и др., 2009), что свидетельствует о высоких потенциальных возможностях организма насекомых адаптироваться к действию различных неблагоприятных факторов. Морфология яичников D. melanogaster, инфицированных и неинфицированных Wolbachia, после теплового воздействия Сравнительный электронно-микроскопический анализ ультраструктурной организации клеток гермария не обнаружил существенных различий в строении ядер, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и аппарата Гольджи у инфицированных и неинфицированных Wolbachia штамм wMelPop мух до и после воздействия повышенной температуры. В то же время, тепловое воздействие вызывало появление в цитоплазме всех типов клеток, входящих в состав вителлярия яичников как инфицированных, так и неинфицированных мух, гранул теплового шока, которые, согласно исследованиям авторов, представляют собой агрегаты потерявших нативную конформацию белков (Nover et al., 1989; Lin, Rye, 2006). Кроме того, в цитоплазме клеток вителлярия были обнаружены дегенерирующие митохондрии. Полученные данные свидетельствуют о том, что после действия повышенных температур на инфицированных и неинфицированных Wolbachia мух наибольшие изменения происходят в клетках вителлярия яичника. Ультраструктурная организация и распределение Wolbachia штамм wMelPop в клетках яичников D. melanogaster w1118 после теплового воздействия Электронно-микроскопическое исследование показало, что после теплового воздействия на мух Wolbachia присутствуют во всех типах клеток и равномерно распределены по цитоплазме. Фолликулярные клетки содержат лишь небольшое 8 количество бактерий. Эти данные свидетельствуют о том, что характер распределения Wolbachia в цитоплазме клеток яичников мух линии w1118 после теплового воздействия и при содержании в стандартных условиях не различается. В то же время, морфология Wolbachia штамм wMelPop после воздействия на мух повышенной температуры существенно изменяется. Появляются бактерии с нарушением строения мембран бактериальной оболочки, формирующей инвагинации или выпячивания, что может свидетельствовать о начальных этапах дегенерации симбионта. Эти изменения затрагивают либо плазматическую мембрану бактерий (Рис. 3 а. б), либо все мембраны, окружающие бактерию (Рис. 3 в, г). Регистрируются также дегенерирующие Wolbachia с существенными нарушениями строения клеточной стенки и матрикса (Рис. 3 д, е). В цитоплазме всех клеток яичника мух после воздействия повышенной температуры выявляется также значительное количество эндосимбионтов, имеющих нормальную морфологию, но содержащих пузырьки, располагающиеся между клеточной стенкой и наружной мембраной бактерий (Рис. 3 ж, з), что редко наблюдается в контроле. Рис. 3. Изменение морфологии Wolbachia штамм wMelPop в цитоплазме клеток яичников D. melanogaster w1118 после воздействия на мух повышенной температуры. а, б – бактерии с инвагинацией плазматической мембраны (указано стрелками) в клетках гермария; в, г – бактерии с инвагинациями клеточной оболочки (стрелки) в фолликулярной (в) и питающей (г) клетках; д, е – дегенерирующие бактерии в питающих клетках; ж, з – бактерии с отделяющимися пузырьками (стрелки) в питающих клетках; и – Wolbachia с электронно-плотным бактериальным матриксом (стрелка) в питающей клетке. Масштаб – 0,5 мкм 9 Недавние исследования Escherichia coli и Salmonella enterica показали, что активация процесса отделения пузырьков у бактерий происходит при помещении их в различные стрессовые условия, включая повышенные температуры (McBroom, Kuehn, 2007). Авторы установили, что действие неблагоприятных факторов приводит к нарушению нативной конформации белков в составе мембран клеточной стенки бактерий, и отделение пузырьков является механизмом, способствующим удалению поврежденных компонентов клеточной стенки. Можно предположить, что пузырьки, отделяемые Wolbachia в клетках яичника D. melanogaster w1118, связаны с процессом удаления поврежденных компонентов клеточной стенки бактерий по сходному механизму, и это может быть свидетельством адаптации бактерий к повышенной температуре. После действия повышенной температуры у некоторых Wolbachia отмечается также увеличение плотности матрикса (Рис. 3 и), что не характерно для бактерий в клетках яичников мух, содержащихся в стандартных условиях. Ранее было высказано предположение о существовании хламидиеподобного типа размножения Wolbachia в цитоплазме клеток паразитических нематод Dirofilaria immitis, при котором происходит компактизация матрикса бактерий с образованием электронно-плотных телец (Kozek, 2005). Эти тельца, представляющие неактивную форму бактерий, могут затем декомпактизоваться и давать начало новым бактериям с типичной морфологией. Присутствующие в цитоплазме клеток Wolbachia с темным матриксом могут представлять неактивную форму бактерий, появляющуюся под действием повышенной температуры. Таким образом, тепловое воздействие на мух вызывает ряд изменений структурной организации бактерий Wolbachia в клетках яичника D. melanogaster w1118, отражающих процесс их дегенерации либо адаптации к стрессовым условиям. Морфология синцитиальных эмбрионов и выживаемость потомства у мух, подвергавшихся стрессовому тепловому воздействию Электронно-микроскопический анализ ранних эмбрионов D. melanogaster w1118 после теплового воздействия на мух показал, что часть из них имела существенные морфологические нарушения в цитоплазме, обычно не регистрируемые в контроле. Они включали множественные скопления митохондрий вокруг крупных вакуолей, увеличение количества мембранных структур в цитоплазме и полное отсутствие ядерных оболочек. Мы предположили, что такие эмбрионы впоследствии погибают, и поэтому провели эксперимент по анализу выживаемости потомства у мух, подвергавшихся воздействию повышенной температуры. Сравнительный подсчет выживаемости потомства у инфицированных мух показал, что если в контрольной группе мух (содержание при 25ºC) этот параметр составлял 78,8 ± 6,6 %, то после стрессового воздействия (температура 36ºC) в течение 75 мин. выживаемость уменьшалась до 35,6 ± 3,6 %. Распределение и ультраструктура бактерий в синцитиальных эмбрионах мух после теплового воздействия Для электронно-микроскопического анализа морфологии Wolbachia в ранних эмбрионах мух линии w1118 выбирались эмбрионы, по периферии которых на 10 полутонких срезах четко детерминировались интерфазные или делящиеся ядра (стадии 9-14 синцитиального дробления), что свидетельствовало о нормальном развитии эмбрионов. Электронно-микроскопическое исследование не выявило заметных отличий ультраструктуры внутриклеточных органелл в таких эмбрионах по сравнению с эмбрионами контрольных особей, не подвергавшихся тепловому воздействию. При этом Wolbachia локализовались вокруг интерфазных ядер или вблизи полюсов веретена деления при митозе, что характерно для Wolbachia и свидетельствует о нормальном взаимодействии бактерий с микротрубочками. После воздействия на мух повышенной температуры большинство эндосимбионтов имели нормальную морфологию в цитоплазме выживших ранних эмбрионов D. melanogaster w1118. Вместе с тем, в цитоплазме были выявлены эндосимбионты с расположенными между наружной мембраной и клеточной стенкой пузырьками, подобные тем, что наблюдались в клетках яичников. Таким образом, повышенная температура вызывает изменение морфологии части бактерий, присутствующих в выживших ранних эмбрионах D. melanogaster w1118, однако строение и распределение большинства из них не отличается от контроля. Продолжительность жизни неинфицированных и инфицированных Wolbachia мух при голодании и ультраструктура клеток яичников D. melanogaster Анализ продолжительности жизни (ПЖ) мух в условиях голодания показал, что этот показатель не различается у неинфицированных и инфицированных мух, несмотря на то, что бактерии Wolbachia штамм wMelPop присутствуют во многих тканях D. melanogaster w1118. Период гибели 50 % выборки составил 36,9 и 40,7 ч для неинфицированных и инфицированных самцов; и 51,8 и 49,5 ч для неинфицированных и инфицированных Wolbachia самок D. melanogaster, соответственно. Половой диморфизм по признаку ПЖ при голодании был ранее обнаружен у разных видов рода Drosophila (Service et al., 1985; Sharmila Bharathi et al., 2003; Matzkin et al., 2009). Установлено, что после голодания в течение 24 ч у неинфицированных и инфицированных Wolbachia мух в цитоплазме питающих клеток увеличивается число липидных капель. Морфометрический анализ плотности их распределения на мкм2 цитоплазмы питающих клеток показал, что после голодания количество липидных капель увеличивается в цитоплазме инфицированных Wolbachia мух линии w1118 как на стадиях оогенеза 1-6 (с 0,034±0,001 до 0,065±0,006), так и на стадиях 7-8 (с 0,040±0,005 до 0,075±0,017). Это свидетельствует об изменениях в метаболизме липидов в организме D. melanogaster при голодании, что согласуется с полученными ранее данными (Grönke et al., 2005; Gutierrez et al., 2007). После голодания в питающих клетках яичника как неифицированных, так и инфицированных Wolbachia мух чаще, чем в контроле, выявлялись протяженные цистерны шероховатого ЭПР, лежащие вблизи ядерной оболочки и иногда сливающиеся с наружной мембраной ядра. По сравнению с контрольной группой мух (Рис. 4 а, б), такие участки вблизи ядерной оболочки были более протяженными и могли достигать в длину 4-5 мкм (Рис. 4 в). Как и в контроле, 11 между мембранами шероховатого ЭПР и ядерной оболочкой выявлялись участки электронно-плотного материала с пузырьками гладкого ЭПР, а ядерная оболочка в этих участках отличалась скоплением поровых комплексов. Известно, что в процессе оогенеза D. melanogaster питающие клетки и ооциты в яйцевых камерах увеличиваются в размерах, при этом объем ядер питающих клеток с 1-й по 10-ю стадии оогенеза возрастает приблизительно в 2 тыс. раз (King et al., 1956). Однако при голодании оогенез значительно замедляется (Drummond-Barbosa, Spradling, 2001). Ранее было показано, что увеличение объема ядра и формирование ядерных пор в растущих ооцитах Xenopus laevis происходит за счет слияния с ядерной оболочкой пузырьков Рис. 4. Цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума со скоплениями плотного материала вблизи ядерной оболочки в питающих клетках яичников D. melanogaster в стандартных лабораторных условиях (а, б) и после голодания (в). а – слияние ЭПР (стрелка), контактирующего с компактным материалом, с наружной мембраной ядерной оболочки; б, в – электронно-плотный материал с пузырьками гладкого ЭПР между длинной цистерной шероховатого ЭПР и ядерной оболочкой. Головки стрелок указывают на ядерные поры. Масштаб: 1 мкм. гладкого и шероховатого ЭПР (Морозова, Киселева, 2006; Salpingidou et al., 2008). Обнаруженные нами протяженные участки ЭПР, контактирующие с наружной мембраной ядра, могут быть связаны с процессом замедления слияния ЭПР с ядерной оболочкой в процессе ее формирования. После голодания у инфицированных и неинфицированных Wolbachia D. melanogaster в цитоплазме всех типов клеток яичников обнаружены ранние аутофагосомные пузырьки размером 0,2-0,5 мкм и небольшие аутофагосомы с диаметром 0,7-1,5 мкм, которые редко встречаются в клетках контрольной группы мух. Появление аутофагосом в цитоплазме клеток является типичным ответом различных организмов на условия голодания (Mizushima, 2005). Таким образом, присутствие эндосимбионтов Wolbachia не влияет на ПЖ мух во время голодания. Обнаруженные нами изменения ультраструктуры яичников, связаны с ответом организма на голодание, и не отличаются у неинфицированных и инфицированных Wolbachia мух. 12 Распределение и ультраструктура бактерий Wolbachia штамм wMelPop после голодания Характер распределения Wolbachia в цитоплазме всех типов клеток яичника после голодания не изменялся. Морфометрический анализ показал, что в питающих клетках плотность бактерий на мкм2 цитоплазмы не изменяется по сравнению с контролем как на 1-6 стадиях, так и на 7-8 стадиях оогенеза (Табл.). Голодание мух в течение 24 часов не приводит ни к значительному увеличению плотности бактерий за счет их деления (при замедлении оогенеза), ни к снижению их плотности в результате аутофагии (см. ниже), что может свидетельствовать о существовании механизмов поддержания определенной плотности распределения эндосимбионтов в клетках хозяина. Таблица. Плотность распределения Wolbachia в цитоплазме питающих клеток яичников D. melanogaster w1118 в стандартных лабораторных условиях и после голодания. D.melanogaster w1118, инфицированы Wolbachia штамм wMelPop Количество бактерий на мкм2 цитоплазмы питающих клеток Стадии оогенеза 1-6 Стадии оогенеза 7-8 контроль 0,112±0,015 0,064±0,008 голодание 0,119±0,014 0,093±0,017 Часть бактерий Wolbachia в клетках яичников сохраняют типичную морфологию после голодания мух. Однако в питающих и фолликулярных клетках яичников обнаружены группы дегенерирующих Wolbachia. Такие группы состоят из 2-3 бактерий, окруженных общей оболочкой, имеющих нарушения в строении клеточной стенки (Рис. 5). Как и в контрольной группе Рис. 5. Бактерии Wolbachia с нарушенной клеточной стенкой, локализующиеся внутри светлых вакуолей, в цитоплазме клеток яичника D. melanogaster w1118 после голодания. Масштаб: 0,5 мкм. мух, в клетках вителлярия выявлены Wolbachia, тесно контактирующие с электронно-плотными тельцами, которые имеют гомогенный матрикс, покрыты двойной оболочкой и окружены общей мембраной с бактериями. Количество таких бактерий увеличивается в цитоплазме питающих клеток с 0,8% в контроле до 1,4% после голодания на стадиях оогенеза 1-6, и не изменяется на 7-8 стадиях оогенеза (0,3%). Таким образом, плотность распределения Wolbachia в питающих клетках яичника мух линии w1118 при голодании не изменяется, однако появляются группы дегенерирующих бактерий и, увеличивается количество покоящихся форм бактерий, что свидетельствует о негативном действии голодания на функциональное состояние симбионта. 13 Взаимодействие Wolbachia с внутриклеточными органеллами в клетках яичника в стандартных лабораторных условиях и после стрессовых воздействий на D. melanogaster w1118 Электронно-микроскопический анализ позволил выявить структурнофункциональные контакты эндосимбиотических бактерий с внутриклеточными органеллами в клетках яичников и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118. Wolbachia взаимодействуют с мембранами ЭПР в цитоплазме яичников и эмбрионов мух (Рис. 6 а), а также с митохондриями в синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 (Рис. 6 б). Известно, что ЭПР принимает участие в процессе трансляции и транспорте синтезированных белков. Можно предположить, что Wolbachia влияет на хозяина через взаимодействие с компонентами ЭПР. Кроме того, при делении бактерий мембраны ЭПР могут использоваться для формирования наружной мембраны вокруг дочерних бактерий. После действия на мух повышенных температур также наблюдается тесный контакт Wolbachia с митохондриями и мембранами ЭПР (Рис. 6 в, г). Рис. 6. Контакты Wolbachia с внутриклеточными органеллами в яичниках и синцитиальных эмбрионах D. melanogaster w1118 в стандартных условиях (а, б), после теплового воздействия (в, г) и после голодания (д, е, ж, з). а, в, д – тесный контакт (стрелки) бактерий с эндоплазматическим ретикулумом в цитоплазме клеток яичника; б, г – контакт бактерий (стрелки) с митохондриями в цитоплазме синцитиальных эмбрионов мух линии w1118; е, ж, з – разные стадии слияния бактерий Wolbachia с аутофагосомами в цитоплазме клеток яичников D. melanogaster w1118. Б – бактерия. Масштаб: 0,5 мкм. Идентичная ситуация была зарегистрирована и после голодания мух. Бактерии продолжали контактировать с мембранами ЭПР в цитоплазме клеток 14 яичника (Рис. 6 д). Однако, в отличие от действия повышенных температур, во всех типах клеток яичника наблюдалась активация аутофагических процессов, в которые были вовлечены бактерии. Установлено, что Wolbachia сливаются с ранними аутофагосомными пузырьками (Рис. 6 е) или с небольшими аутофагосомами (Рис. 6 ж). Выявлены также бактерии, находящиеся внутри небольших аутофагосом (Рис. 6 з). Поскольку аутофагические вакуоли содержат не только бактерии, но и компоненты цитоплазмы клетки хозяина, можно предположить, что Wolbachia сливаются с аутофагическими вакуолями в результате неселективной аутофагии, характерные признаки которой подробно исследовались другими авторами (Kiššová et al., 2007). Таким образом, в результате проведенного исследования впервые продемонстрировано, что бактерии Wolbachia штамм wMelPop влияют на процесс формирования яйцевых камер, что приводит к увеличению частоты апоптоза в контрольной точке гермария яичника D. melanogaster w1118. Впервые показано, что повышенная температура и голодание вызывают различные нарушения структурной организации бактерий в клетках яичника D. melanogaster, однако большинство эндосимбионтов сохраняет типичную морфологию и функциональную активность, продолжая тесно контактировать с органеллами в цитоплазме клеток хозяина. Это дает основание полагать, что в изменяющихся условиях среды характер взаимодействия Wolbachia штамм wMelPop и хозяина будет сохраняться, что делает этих бактерий надежным инструментом для контроля численности насекомых-переносчиков заболеваний человека и вредителей сельского хозяйства. 1. 2. 3. 4. ВЫВОДЫ Установлено, что присутствие Wolbachia штамм wMelPop не влияет на морфологию синцитиальных эмбрионов и клеток яичников Drosophila melanogaster w1118, содержащихся в стандартных лабораторных условиях. В клетках яичников D. melanogaster линии w1118 впервые обнаружены симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop, контактирующие с электронно-плотными тельцами диаметром 0,2-0,5 мкм, которые представляют, вероятно, покоящиеся формы симбионта. Впервые показано, что симбиотические бактерии Wolbachia штамм wMelPop нарушают процесс формирования яйцевых камер, что приводит к увеличению частоты апоптоза в гермарии D. melanogaster w1118. Количество гермариев с апоптозом в контрольной точке 2а/2б возрастает до 70,6±5,3% у инфицированных Wolbachia мух по сравнению с 41,8±4,1% у неинфицированных мух. Характерные для теплового шока и голодания изменения выявлены в клетках яичников как неинфицированных, так и инфицированных Wolbachia D. melanogaster. При повышенной температуре в цитоплазме клеток появляются гранулы теплового шока, а голодание активирует процесс аутофагии и накопление липидов в питающих клетках. Впервые показано, что в питающих клетках голодание вызывает увеличение длины цистерн ЭПР, контактирующих с ядерной оболочкой, что свидетельствует о замедлении слияния мембран ЭПР с наружной ядерной мембраной в процессе роста ядра. 15 5. Установлено, что тепловое воздействие и голодание не влияют на распределение Wolbachia штамм wMelPop в синцитиальных эмбрионах и клетках яичников D. melanogaster w1118, однако вызывают изменение их морфологии. Стрессовые воздействия приводят к дегенерации, а также к адаптации Wolbachia к неблагоприятным условиям. При повышенной температуре увеличивается количество бактерий с пузырьками (возможно, для удаления поврежденных компонентов клеточной стенки) и бактерий с темным матриксом (изменение функциональной активности) во всех типах клеток яичника. Голодание вызывает неселективную аутофагию бактерий, наравне с митохондриями и другими цитоплазматическими органеллами хозяина и увеличивает в два раза количество Wolbachia с электронноплотными тельцами (покоящиеся формы) в питающих клетках. 6. Комплексный анализ особенностей ответа симбиотической ассоциации Wolbachia-D. melanogaster на стрессовые условия показал, что, несмотря на изменение морфологии каждого из симбионтов, тесные структурнофункциональные контакты бактерий с эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями хозяина сохраняются. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Захаров И.К., Киселёва Е.В., Илинский Ю.Ю., Воронин Д.А., Ваулин О.В., Жукова М.В., Бочериков А.М., Вайсман Н.Я., Синянский Я.Я., Иванников А.В. Механизмы генетической изменчивости популяций и видов Diptera: Взаимодействия генетических и средовых факторов // Программа фундаментальных исследований РАН. № 11. «Биоразнообразие и динамика генофондов». Подпрограмма 2 «Динамика генофондов». Материалы отчётной конференции, посвящённой памяти академика Ю.П. Алтухова. Москва. 2007. С. 39-40. 2. Захаров И.К., Кикнадзе И.И., Киселева Е.В., Гундерина Л.И., Ваулин О.В., Синянский Я.Я., Илинский Ю.Ю., Воронин Д.А., Жукова М.В., Бочериков А.М., Голыгина В.В., Истомина А.Г., Вайсман Н.Я., Иванников А.В. Механизмы генетической изменчивости популяций и видов Diptera: Разнообразие геномов // Программа фундаментальных исследований РАН. № 11. “Биоразнообразие и динамика генофондов”. Подпрограмма 2. «Динамика генофондов». Сборник материалов. М: ФИАН. 2007. С. 26-28. 3. Жукова М.В. Влияние повышенной температуры на ультраструктуру эндосимбиотических бактерий Wolbachia в клетках яичников Drosophila // Материалы XLV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 2007 г. С. 152-153. 4. Жукова М.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Симбиотическая модельDrosophila/Wolbachia. Влияние повышенных температур на ультраструктурную организацию хозяина и симбионта // Тезисы докладов Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». Саратов, 2007 г. С. 17. 5. Жукова М.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Изменение ультраструктуры симбиотических бактерий Wolbachia в яичниках и ранних эмбрионах Drosophila 16 под влиянием повышенной температуры // Цитология. 2008. Т. 50, №12. С. 10501060. 6. Жукова М.В., Воронин Д.А., Киселева Е.В. Тепловой шок вызывает изменения в строении эндосимбиотических бактерий Wolbachia в организме Drosophila melanogaster // Тезисы докладов IV съезда микробиологов Узбекистана. Ташкент, Узбекистан, 2008. С. 32. 7. Zhukova M.V., Voronin D.A., Zakharov I.K., Kiseleva E.V. Morphology of Wolbachia strain wMelPop in ovaries and early embryos of Drosophila melanogaster affected by high temperature // Book of abstracts of 5th International Wolbachia Conference. Kolymbari, Greece, 2008. P. 67. 8. Жукова М.В., Киселева Е.В. Особенности структурной организации и поведения эндосимбионта Wolbachia в организме Drosophila в нормальных и стрессовых условиях существования // Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина. Москва, 2009. С. 208. 9. Жукова М.В., Захаров И.К., Киселева Е.В. Влияние разных штаммов эндосимбиотических бактерий Wolbachia на уровень апоптоза в гермарии яичников Drosophila melanogaster // Тезисы III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород, 2010. С. 55. 10. Жукова М.В., Киселева Е.В. Апоптоз в клетках яичников Drosophila melanogaster, инфицированных бактериями Wolbachia, штамм wMelPop // Сборник тезисов 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2010. Т 2., С. 225-226. 11. Жукова М.В., Киселева Е.В. Качественный и количественный анализ ультраструктурных изменений эндосимбиотических бактерий Wolbachia в яичниках Drosophila melanogaster при голодании // Сборник материалов XXIII Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, 2010. С. 356. 12. Жукова М.В., Киселева Е.В. Влияние голодания на продолжительность жизни и апоптоз в клетках яичников Drosophila melanogaster // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15, №1. С. 148-155. 17