Братцева Екатерина Валериевна ПРОТЕОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ ГРИБОВИДНОГО МИКОЗА
advertisement
На правах рукописи Братцева Екатерина Валериевна ПРОТЕОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ ГРИБОВИДНОГО МИКОЗА 14.01.10 – кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2010 г. 2 Работа выполнена Федерального в отделении Государственного клинической учреждения дерматологии «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» и отделе протеомики Института биомедицинской химии им.В.М. Ореховича РАМН Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Анна Алексеевна Кубанова кандидат биологических наук Сергей Александрович Мошковский Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ирина Борисовна Трофимова кандидат биологических наук Мария Владимировна Савватеева Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов, г. Москва Защита диссертации состоится «________» ___________2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д208.115.01 при Федеральном Государственном учреждении «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» по адресу: 107076, г. Москва, ул.Короленко, д.3, стр.6. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий». Автореферат разослан «______» ______________2010 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Грибовидный микоз (ГМ) является наиболее распространенным видом первичных Т-клеточных лимфом кожи (R. Willemze и соавт., 2005). Диагностика грибовидного микоза, особенно на ранних стадиях (I-II), является одной из наиболее сложных проблем в практике дерматовенеролога. В настоящее время не существует единого диагностического алгоритма грибовидного микоза. Однако большинство авторов считает, что диагностика грибовидного микоза основывается на клинической картине заболевания, иммунофенотипического перестройки гена вспомогательным данных исследований. Т-клеточного методом Определение рецептора диагностики гистологического методом клональной ПЦР (Клинические и является рекомендации. Дерматовенерология, 2008, P. Lenane и соавт., 2007, N. Pimpinelli и соавт., 2005, S.J. Whittaker и соавт., 2003). Трудности диагностики грибовидного микоза заключаются в разнообразии его клинических проявлений, а также их сходстве с проявлениями хронических воспалительных дерматозов (А.А. Каламкарян, 1983, И.Б. Трофимова, 1997, H.S. Zackheim и соавт., 2002). Более того, некоторые дерматозы иммунопатологические имеют сходные механизмы, с например грибовидным псориаз, микозом как Th1- опосредованное заболевание (E.W.Cowen и соавт., 2007, K. Ghoreschi и соавт., 2007). Точность клинического диагноза ГМ, подтвержденного гистологическим методом, составляет от 50 до 75% (А.Н. Родионов, 1997, S.J. Whittaker и соавт., 2003). По данным G. Burg и соавт., точность иммунофенотипического исследования на поздних стадиях ГМ достигает 80% (G. Burg и соавт., 2005), однако на ранних стадиях заболевания точность диагностики оказывается ниже. Кроме того, все перечисленные методы диагностики требуют проведения биопсии кожи. 4 Для своевременной диагностики наиболее перспективным в настоящее время является поиск сывороточных биомаркеров (M.A. Tainsky, 2009). С этой целью успешно применяются протеомные технологии, которые представлены широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия MALDI-TOF, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков (В.М. Говорун и соавт., 2002, T.C. Poon, 2007). Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода. Для изучения белков, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем находится порог чувствительности масс-спектрометрических методов, возможно применение технологии xMAP. Данный метод дает возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно. В качестве целевых белков в настоящем исследовании были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе грибовидного микоза. В этом случае продукция цитокинов осуществляется как атипичными лимфоцитами, так и различными иммунными клетками микроокружения. В отечественной литературе отсутствуют работы, выполненные с применением протеомных технологий при изучении различных аспектов грибовидного микоза, а количество работ иностранных исследователей весьма ограничено, что определило актуальность данного исследования. Цель исследования: Установить молекулярные маркеры грибовидного микоза на основании результатов изучения протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови с целью разработки алгоритма диагностики заболевания. 5 Задачи исследования: 1 Провести анализ анамнестических данных больных грибовидным микозом для оценки своевременности диагностики данного заболевания 2 Исследовать протеомные профили сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови методом массспектрометрии MALDI-TOF 3 Изучить уровень цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с помощью технологии xMAP на различных стадиях заболевания 4 Провести сравнительное изучение протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров с целью выявления молекулярных маркеров грибовидного микоза 5 Разработать алгоритм диагностики грибовидного микоза на основании данных, полученных в результате исследования профилей белков и цитокинов сыворотки крови. Научная новизна - впервые в России изучен протеомный профиль сыворотки крови больных грибовидным микозом с применением метода MALDI-TOF массспектрометрии. При сравнении протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, больных псориазом и здоровых людей – доноров крови выявлены пики белков, которые достоверно отличаются у обследованных лиц. - впервые изучен широкий профиль из 27 цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии xMAP. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и IL10, а также обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что подтверждает патогенетическую значимость данных цитокинов. 6 - впервые в сыворотке крови больных грибовидным микозом установлено достоверное увеличение концентрации цитокина IP-10 по сравнению с концентрацией этого цитокина у больных псориазом, а также увеличение концентрации цитокинов IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF по сравнению с их концентрацией в сыворотке крови здоровых доноров. На основании проведенных исследований установлено, что цитокин IP-10 может использоваться в качестве диагностического маркера грибовидного микоза. - впервые разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, обладающий высокой точностью и основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокина IP-10. При дифференциальной диагностике грибовидного микоза последовательном и псориаза определении алгоритм концентрации в основывается сыворотке на крови концентрации цитокинов IP-10 и IL-6 и имеет вид «древа принятия решений». Практическая значимость: В сыворотке крови обследованных больных выявлены молекулярные маркеры грибовидного микоза. С применением данных маркеров разработан алгоритм, позволяющий диагностировать грибовидный микоз и, в необходимых случаях, провести его дифференциальную диагностику с псориазом. Применение алгоритма диагностики грибовидного микоза позволит своевременно выявить больных «группы риска» по развитию данного заболевания для диспансерного наблюдения. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания у пациентов до постановки диагноза «грибовидный микоз» составляет от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом у 23,1% больных грибовидный микоз диагностируется на третьей стадии заболевания. 7 2. Выявлены масс-спектрометрические пики белков, являющиеся молекулярными маркерами грибовидного микоза. Точность диагностики с применением данных маркеров составляет 69-75%, качество диагностики по данным ROC-анализа расценивается как хорошее (AUK>0,7). 3. Выявлены 4 цитокина (IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF), уровень экспрессии которых достоверно отличается у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови (р<0.05). Уровень экспрессии цитокина IP-10 у больных грибовидным микозом достоверно выше, чем у больных псориазом (р<0,001), что позволяет использовать его в дифференциальной диагностике этих заболеваний. 4. Установлена прямая корреляция концентрационная связь цитокинов IP-10 и IL-10 и обратная корреляционная связь цитокинов RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании. 5. Показана высокая точность разработанного алгоритма диагностики грибовидного микоза, а также возможность выявления с его помощью больных, относящихся к группам риска по развитию грибовидного микоза. Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ «Протеомные технологии в дерматовенерологии» (Москва, 2007 г.) Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и врачей ординаторов ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий». 8 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, из них 1 - в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Клиническая характеристика больных. Обследование пациентов проводилось в консультативно-диагностическом центре ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», в условиях стационара городской клинической больницы №14, в отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии Гематологического научного центра РАМН. В работу включено 39 больных грибовидным микозом, среди которых было 23 женщины и 16 мужчин (59% и 41% соответственно) в возрасте 28 – 82 лет, средний возраст которых составил 57,4 ± 2,2 лет [M±m]. Из 39 пациентов 18 (46,2%) имели первую стадию грибовидного микоза, вторую стадию имели 13 (33,3%) человек, третью стадию - 8 (20,6%). У всех больных грибовидным микозом была диагностирована классическая форма Алибера-Базена (в соответствии с классификацией WHO-EORTC, 2008). В лабораторное исследование с применением протеомных технологий было включено 23 больных грибовидным микозом, в соответствии со следующими критериями: возраст от 18 лет и старше, информированное согласие на участие в исследовании; стадия грибовидного микоза I-III без генерализации патологического процесса (без вовлечения периферической крови и внутренних органов); диагноз грибовидный микоз, подтвержденный гистологическим и иммунофенотипическим методами; отсутствие терапии грибовидного микоза не менее 2-х недель до участия в исследовании; 9 отсутствие следующих инфекционный процесс, патологических наличие состояний онкологических (тяжелый заболеваний, беременность), а также отсутствие серопозитивности в тестах на ВИЧинфекцию. В группу сравнения вошли 29 больных псориазом: 8 женщин и 21 мужчина (28% и 72% соответственно) в возрасте от 21 до 76 лет (средний возраст 45,9 ± 2,9 лет). У всех больных был диагностирован распространенный псориаз, среднее значение индекса PASI составило 30,4 ± 1,37. Контрольную группу составили 22 здоровых человека – доноров крови: 16 женщин и 6 мужчин (73% и 27% соответственно) в возрасте от 29 до 71 года (средний возраст 50,9 ± 2,4 года). При попарном сравнении групп по возрасту выявлены статистически значимые различия между группами больных грибовидным микозом и псориазом (p<0.05). В работе мы допускаем, что возраст больных не оказывает значимого влияния на результаты исследования (E.W. Cowen и соавт., 2007). При сравнении группы больных грибовидным микозом с группами контроля по полу статистически значимых различий не выявлено. Протокол получения сывороток крови. Взятие венозной крови (8 мл) у пациентов производили путем стандартной флеботомии в пластиковые пробирки без наполнителя. Пробирки находились при комнатной температуре в течение 2 часов до образования сгустка, затем их центрифугировали в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин. Сыворотку крови разделяли на аликвоты по 1 мл, которые замораживали и хранили при температуре – 800C. При транспортировке замороженных сывороток использовали сухой лед. Масс-спектрометрическое исследование. Профилирование проводили на масс-спектрометре Autoflex, «Bruker Daltonics» в линейном режиме в диапозоне масс 2-30 кДа. Для калибровки использовали следующие внешние стандарты: гирудин (6964 Да), убиквитин, цитохром C (12230 Да), 10 карбангидраза (14511,5 Да) миоглобин (16951 Да). Спектры снимали вручную, по крайней мере, в двух повторениях до суммарной интенсивности около 105. В работе использовали нормальнофазовые чипы NP20, в качестве матрицы - насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Ciphergen) в 50% (об./об.) ацетонитриле, содержащем 0,5% (об./об.) трифторуксусной кислоты, разведенный в два раза тем же растворителем. Для анализа масс-спектрометрических пиков была использована программа Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems) со следующими настройками: соотношение сигнал/шум (первая ступень) 10, соотношение сигнал/шум (вторая ступень) 5, пороговая интенсивность пика 0%, допустимая ошибка в определении массы 0,2%. Массы пиков и их интенсивности экспортировали в таблицы MS Excel, значения интенсивностей в повторных измерениях усредняли. Исследование с применением метода мультиплексного анализатора. Для анализа на мультиплексном анализаторе Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США), основанном на технологии хМАР, была выбрана панель из 27 цитокинов в составе коммерческой тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-Plex Panel (Bio-Rad, США). В исследуемую панель входили следующие цитокины: PDGF-bb, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1(MCAF), MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-a, VEGF. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя. Для анализа сывороток на приборе Bio-Plex образцы размораживали, центрифугировали 10 мин при 13.2 тыс. об./мин. и 40 С и разводили в 4 раза. Для построения стандартной калибровочной кривой лиофилизованную смесь стандартов растворяли в 500 мкл sample diluent и готовили серию из 8 разведений в standard diluent. Измерения проводили с низким и высоким разрешением. В качестве контролей использовали standard diluent и sample diluent. Все измерения проводили двух повторах. Результаты измерений были представлены с помощью программы Bio- 11 Plex Manager 5.0. При статистической обработке значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за 0 пг/мл. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе. Статистическая обработка. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета Statistica 6.0 и языка программирования R. Для описания групп больных использовались стандартные методы описательной статистики. Статистическая проверка данных на нормальность осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса, проверка гипотез о значимости различий в исследуемых группах по количественному признаку - с помощью дисперсионного анализа (тест Шеффи) и U-критерия Манна Уитни с поправкой Бонферрони, по качественным признакам – с помощью критерия Фишера с поправкой Бонферрони. Выбранный критический уровень значимости р<0,05. Оценка диагностического качества выбранных маркеров оценивалось с помощью ROC-анализа. Качество диагностических маркеров оценивалась по экспертной шкале для значений AUC (J.A. Hanley и соавт., 1982, M.H. Zweig и соавт., 1993). Сравнение диагностического исследования (маркера) с референтным диагнозом. Для выявленных маркеров рассчитывали показатели точности, чувствительности, специфичности и прогностической ценности положительного диагноза (PPV). Расчет производился по формулам, представленным в таблице 1. Таблица 1. Формулы расчета показателей точности, специфичности, чувствительности и PPV изучаемого маркера Референтный диагноз здоровы выявлено заболевание Изучаемый здоровы а b метод выявлено c (количество человек) d заболевание Чувствительность = a/( a + c) (1) Специфичность = d/( b + d) (2) Точность = (a + d)/(a + b + c + d) (3) Прогностическая ценность положительного диагноза (PPV) = a/( a + b) (4) 12 При обработке данных масс-спектрометрического исследования детекцию и выравнивание пиков производили с помощью программы ClinProTools (Bruker Daltonics). Кластерный анализ использовали для выявления групп схожих по масс-спектрометрическим профилям образцов. Для снижения размерности данных использовали двухступенчатый подход: сначала выбирали среди групп коррелирующих пиков пики с наибольшим значением площади под ROC-кривыми, а затем оставшиеся пики ранжировали с использованием метода рекурсивного отбора признаков. На втором этапе для отбора значимых признаков применяли алгоритм рекурсивного исключения признаков (Recursive Feature Elimination algorithm, RFE) (I. Gyuon и соавт., 2002). Для разработки диагностического алгоритма использовали метод опорных векторов (Support Veсtor Mashine, SVM). Из-за небольшого количества образцов точность диагностики определяли с помощью 10-кратной кросс-валидации. Кросс-валидацию повторяли 50 раз и вычисляли 95% доверительные интервалы для точности, чувствительности и специфичности диагностики (M. Pyatnitskiy и соавт., 2010). Результаты исследования и их обсуждение У больных грибовидным микозом (39 человек) тщательно изучались анамнез и клиническая картина заболевания. Основные клинические характеристики представлены в таблице 2. 13 Таблица 2. Основные клинические характеристики больных грибовидным микозом Клинические характеристики Возраст, диапазон лет (среднее ± ст.ош. ср) Пол Мужчины Женщины Возраст дебюта заболевания, диапазон лет (M ± m) Длительность заболевания, диапазон лет (M ± m) Стадия ГМ I II III Классическая форма (Алибера Базена) У всех больных была Число больных ГМ от 28 до 82 лет (57,4 ± 2,2) 16 (41%) 23 (59%) от 26 до 71 года (46,1 ± 2,26 лет) от 2 до 36 лет (10,3 ± 1,23 лет) 18 (46,2%) 13 (33,3%) 8 (20,5%) 39 (100%) диагностирована классическая форма грибовидного микоза (Алибера-Базена). Однако патологический кожный процесс отличался большим разнообразием проявлений, особенно на первой стадии заболевания. В этом случае высыпания были представлены различными по окраске и размерам эритематозными пятнами с шелушением на поверхности: псориазо- и парапсориазоподобными элементами, имели вид пигментно-пурпурозного дерматоза. У одного пациента имелся единственный очаг грибовиного микоза. У пациентов со II стадией ГМ на ряду с пятнистыми элементами имелись бляшки с различной степенью инфильтрации, разных размеров, окраска которых варьировала от розового до желтовато-красного и бурого цветов. На поверхности очагов поражения наблюдались множественные чешуйки. У некоторых больных на отдельных участках тела наблюдалась пойкилодермия. У пациентов с III стадией ГМ наряду с пятнистыми и бляшечными элементами имелись опухоли, формирующиеся как в области бляшек, так и на непораженной ранее коже. У части больных процесс носил генерализованный характер и имелось состояние близкое к эритродермии. Отмечалась разлитая эритема и инфильтрация всего кожного покрова, кожа была покрыта крупными и мелкими чешуйками. Эритродермическое состояние у некоторых больных сопровождалось появлением эктропиона, выпадением волос, изменением 14 ногтевых пластин. У некоторых больных отмечались повышение температуры тела, озноб, недомогание. Пациенты предъявляли жалобы на зуд (53,8%) или жжение (15,4%) в области высыпаний, у 30,8% больных субъективных ощущений не было. При анализе данных анамнеза больных грибовидным микозом было выявлено, что длительность заболевания (от момента появления первых симптомов) до постановки диагноза грибовидный микоз составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 ± 0,84 года). У 43,6% пациентов грибовидный микоз был диагностирован на первой стадии, у 33,3% пациентов – на второй стадии и у 23,1% пациентов на третьей стадии (рис. 1). Рисунок 1. Распределение больных грибовидным микозом по стадиям на момент постановки диагноза. Наиболее часто грибовидный микоз у пациентов первоначально диагностировался как дерматит (аллергический или контактный) – у 46,2%, псориаз, атопический дерматит (нейродермит), экзема - по 10,3% на каждый диагноз. У отдельных пациентов первоначально диагностировались парапсориаз (у 2 человек), васкулит (у 3 человек), генерализованный микоз (2 человека), В-клеточная лимфома кожи, болезнь Дарье, чесотка, болезнь 15 Девержи, туберкулез кожи, саркоидоз, отрубевидный лишай, гранулематозный панникулит. Только у 18% пациентов грибовидный микоз был первым диагнозом (рис. 2). Необходимо отметить, что у 15,4% пациентов устанавливали более 2 различных диагнозов, сменявших друг друга. Более 25% пациентов получали системную терапию по поводу неверно установленного диагноза такими препаратами, как метотрексат, неотигазон, циклоспорин. препараты ГКС (преднизолон, метипред, дипроспан), плаквенил. Рисунок 2. Первоначальные диагнозы больных грибовидным микозом Результаты исследования с применением метода масс- спектрометрии MALDI-TOF. Образцы сыворотки крови от 23 больных грибовидным микозом, 29 больных псориазом и 22 здоровых доноров крови были проанализированы методом масс-спектрометрии. Для обработки данных были использованы значения площадей масс-спектрометрических пиков во всех образцах. Сравнение групп проводили по 182 пикам. На первом этапе статистической обработки данных проводилась проверка отдельных масс-спектрометрических пиков на возможность использования в 16 качестве биомаркеров, на втором этапе – разработка диагностического алгоритма с применением панели пиков. При сравнении масс-спектрометрических пиков в группах больных грибовидным микозом и псориазом достоверные различия были обнаружены по 2 белковым пикам с m/z 4326 Да и 7674 Да (р<0,05). При сравнении данных в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови статистически значимые различия (р<0,05) были обнаружены по 3 белковым пикам: m/z 14689 Да, 7848 Да и 4184 Да. Для оценки диагностического качества данных маркеров проводили расчет чувствительности, специфичности, точности и PPV, которые представлены в таблице 3. Методом ROC-анализа определяли диагностическое качество данных белковых пиков, в соответствии с экспертной шкалой AUC оно расценивается как хорошее (AUC>0,7). Результаты проведенного исследования доказывают, что использование масс-спектрометрической технологии MALDI-TOF позволяет с достаточно высокой точностью проводить диагностику грибовидного микоза с использованием отдельных белковых пиков. Необходимо отметить, что точность диагностического алгоритма, основанного на использовании панели пиков, не превышала 77%. Таким образом, показано, что наиболее перспективной является разработка метода диагностики грибовидного микоза, основанная на отдельных белках-биомаркерах, спектрометрические пики которых представлены в таблице 3. масс- 17 Таблица 3. Пики белков, имеющие достоверные отличия между исследуемыми группами m/z AUС Точность, % Чувствительность, % Специфичность, % PPV,% Порог пиков, Да отсечения Пики белков, имеющие достоверные различия в группах больных грибовидным микозом и псориазом 4326 0,78 75 65,2 82,7 75 71* 7674 0,76 69 60,9 75,9 70,9 14* Пики белков, имеющие достоверные различия в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров 4184 0,73 71,1 56,5 86,3 81,3 25,2** 7848 0,75 75,5 69,5 81,8 72 9,9** 14689 0,73 77,7 78,2 77,2 77,2 14,23* * достоверные различия между группами при р<0,005; ** достоверные различия между группами при р<0,001 Таблица 4. Цитокины, концентрация которых в сыворотке крови достоверно отличается между группами Название цитокина AUC IL-1Ra 0,85 Точность, % Чувствитель ность, % Специфичность, % Порог отсечения концентрации цитокина, пг/мл Цитокины, концентрация которых достоверно отличается в сыворотке крови больных ГМ и здоровых доноров PPV,% 82,2 91,3 72,7 88 58,77** IL-4 0,77 75,5 91,3 59 86 4,53* G-CSF 0,82 80 78,2 81,8 78 17,33** IP-10 0,92 88,8 82,6 95,4 84 3233,9** Цитокины, концентрация которых достоверно отличается в сыворотке крови больных ГМ и псориазом IP-10 0,8 76,9 65,2 86,2 75 5264,84** * достоверные различия между группами при р<0,005; ** достоверные различия между группами при р<0,001 18 Результаты изучения уровня цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии xMAP. С целью обнаружения молекулярных маркеров, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем это возможно определить методами масс-спектрометрии, нами был проведен анализ ряда целевых белков, в качестве которых были выбраны цитокины, с применением технологии xMAP. На приборе BioPlex-200 (BioRad), в сыворотках крови больных ГМ, псориазом и здоровых людей было проанализировано содержание 27 цитокинов: PDGF-bb, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GMCSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1(MCAF), MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-a, VEGF. При сравнении полученных данных в группах больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови достоверные различия были обнаружены в концентрациях 4 цитокинов: IL-1ra, G-CSF, IP-10 (p<0,001) и IL-4 (р<0,05). Все перечисленные цитокины были значительно повышены в группе больных ГМ. Результаты представлены в таблице 4. Установлено достоверное увеличение концентрации IP-10 (р<0,001) у больных ГМ при сравнении с больными псориазом. Таким образом, наиболее значимое увеличение концентрации в сыворотке крови у больных грибовидным микозом выявлено для цитокина IP-10. В группе больных ГМ этот показатель составил 13,5± 2,8 нг/мл [M±m], тогда как у больных псориазом – 3,3±0,5 нг/мл, у здоровых доноров крови – 1,8±0,2 нг/мл (рис.3). Таким образом, IP-10 является наиболее перспективным цитокином для использования в качестве молекулярного маркера грибовидного микоза. IP-10 (interferon-γ inducible protein-10, СХСL10) – индуцированный интерфероном-γ белок, является хемокином. Он принадлежит к семейству CXC хемокинов и играет важную роль в процессе воспаления, привлекая Т-лимфоциты в очаг воспаления путем модуляции их адгезии к эндотелиальным клеткам и трансмиграции в ткани. В коже продукция хемокинов осуществляется кератиноцитами в ответ 19 22000 Концентрация IP-10 в сыворотке крови, пг/мл 20000 18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 Mean ±0,95 Conf . Interv al 0 Больные ГМ Больные псориазом Здоров ые доноры кров и Рисунок 3. Концентрация IP-10 в сыворотке крови больных ГМ, псориазом и здоровых доноров на различные стимулы, например, на синтез IFN-γ активированными Тлимфоцитами или TNF-α – макрофагами (D.M. Boorsma и соавт., 1994, X.S. Wu и соавт., 2009, D.M. Boorsma и соавт., 1998). Рецептором IP-10 является CXCR3, который экспрессируется на Т-лимфоцитах (преимущественно Th1типа), и, в меньшей степени, на эозинофилах, моноцитах и NK-клетках (R. Bonecchi и соавт., 1998, D.D. Taub и соавт., 2001, T. Jinquan и соавт., 2000). Гипотеза патогенеза Т-клеточных лимфом кожи с участием IP-10 была предложена A.H. Sarris с соавторами (A.H. Sarris и соавт., 1995). Первый этап заключается в хоуминге в кожу активированных или атипичных Тлимфоцитов, путем связывания лимфоцит-ассоциированного антигена (CLA) с Е-селектином, который экспрессируется в коже при реакциях гиперчувствительности замедленного типа или хроническом воспалении, часто предшествующих развитию ТКЛК. Эти лимфоциты продуцируют IFNγ, в ответ на который кератиноциты эксперссируют IP-10. Это второй этап, заключающийся в эпидермотропизме активированных Т-лимфоцитов. На третьем этапе кератиноциты связываются с лимфоцитами посредством межклеточных молекул адгезии (ICAM), что, вероятно, приводит к формированию микроабсцессов Потрие (A.H. Sarris и соавт., 1995). Результаты наших исследований также согласуются с этой гипотезой, так как 20 концентрация IP-10 не только повышена в сыворотке крови больных грибовидным микозом, но и увеличивается при прогрессировании заболевания (см. далее), то есть при усилении инфильтрации кожи Тлимфоцитами. Разработан диагностический алгоритм грибовидного микоза с применением цитокина IP-10 в качестве молекулярного маркера. Для дифференцировки сыворотки крови больных грибовидным микозом от сывороток крови здоровых доноров и больных псориазом методом xMAP установлен пороговый уровень концентрации IP-10 – 5,3 нг/мл, который может использоваться для диагностики грибовидного микоза. Чувствительность метода в данном случае составляет 65,2%, специфичность – 86,2%, прогностическая ценность положительного диагноза – 75%. Качество диагностики по данным ROC-анализа расценивается как очень хорошее (AUC>0,8). Распространенным подходом к увеличению точности диагностики является совместное использование нескольких маркеров. С целью поиска оптимальной диагностической панели цитокинов мы использовали различные методы многомерной статистики. Наибольшая точность алгоритма диагностики ГМ была достигнута при последовательном определении в сыворотке крови концентрации двух цитокинов: IP-10 и IL-6 (рис. 4). При концентрации цитокина IP-10 в сыворотке крови выше 7,3 нг/мл пациенту ставится диагноз грибовидный микоз с точностью до 90%. Если концентрация IP-10 ниже 7,3 нг/мл, то переходят к оценке концентрации IL-6 в сыворотке крови. Если она выше 13 пг/мл, то при наличии у пациента характерных клинических проявлений диагностируется псориаз. В том случае если концентрация IL-6 в сыворотке крови ниже 13 пг/мл, у пациента нельзя исключить наличие грибовидного микоза. Данная категория пациентов является «группой риска», их необходимо направлять на дополнительные методы обследования и они должны оставаться на диспансерном учете. 21 Рисунок 4. Диагностический алгоритм "древо принятия решений" для дифференциальной диагностики ГМ, псориаза и нормы, основанное на определении концентрации двух цитокинов IP-10 и IL-6 в сыворотке крови 22 При реализации алгоритма диагностики с определением в сыворотке крови концентрации 27 цитокинов методом хМАР с последующей обработкой данных с применением линейного дискриминанта Фишера, его точность составила 80%. Анализ уровня цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом на разных стадиях заболевания. Выявлена прямая корреляция концентрация цитокинов IL-10 и IP-10 в крови больных грибовидным микозом со стадиями грибовидного микоза (rs=0,52 и 0,51 соответственно, при р=0,05). Напротив, концентрация цитокина RANTES достоверно снижается по мере увеличения тяжести заболевания (rs=0,5, при р=0,05). Выводы 1. При анализе данных анамнеза больных грибовидным микозом установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания до постановки диагноза «грибовидный микоз» составила от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом 23,1% пациентов уже имели III стадию заболевания. 2. Изучение протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом и псориазом методом MALDI-TOF показало наличие 2 пиков белков с m/z 4326 Да и 7674 Да (р<0,05), позволяющих их использовать для дифференциальной диагностике этих заболеваний с точностью 69% и 75% соответственно. Качество диагностики с применением этих пиков по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7). Выявлены 3 масс-спектрометрических пика белков с m/z 14689 Да; 7848 Да и 4184 Да, концентрация которых в сыворотке крови достоверно отличается (р<0,05) у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови. Точность диагностики в этом случае составляет 73%, 75% и 73% 23 соответственно, ее качество по результатам ROC-анализа расценивается как хорошее (AUC>0,7). 3. При изучении уровня цитокинов в сыворотке крови с применением технологии xMAP было показано, что у больных грибовидным микозом определяется значительное увеличение концентрации 4 цитокинов: IL-1ra, G-CSF, IP-10 (p<0,001) и IL-4 (р<0,05) по сравнению с результатами здоровых лиц, и цитокина IP-10 (p<0,001) - по сравнению с больными псориазом. 4. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и IL-10 (rs=0,52 и 0,5 при р=0,05) и обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES (rs=0,51 при р=0,05) в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что указывает на патогенетическую значимость этих цитокинов при данном заболевании. 5. Разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, основанный на определении концентрации цитокина IP-10. При уровне IP-10 в сыворотке крови выше 5,3 нг/мл, точность диагноза грибовидный микоз составляет 76,9%. Качество алгоритма по результатам ROC-анализа расценивается как очень хорошее (AUC>0,8). В случае необходимости дифференциальной диагностики грибовидного микоза и псориаза возможно применение алгоритма, основанного на последовательном определении в сыворотке крови концентрации цитокинов IP-10 и IL-6 и имеющего вид «древа принятия решений». Точность данного алгоритма диагностики составляет 90%. 24 Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Братцева Е.В. Протеомные исследования в дерматологии/ Е.В. Братцева// Сб. тез. науч. раб. X Всерос. съезда дерматовенерологов. – М., 2008. – С.17. 2. дерматозов Братцева Е.В. Поиск потенциальных биомаркеров хронических с помощью протеомного анализа/ Е.В. Братцева, С.А. Мошковский, Л.Ф. Знаменская и др.// Вестн. дерматол. венерол. – 2010 – №2. - С.13-20. 3. Братцева Е.В. Оценка возможности диагностики грибовидного микоза с помощью прямого протеомного профилирования сыворотки крови/ Е.В. Братцева, Е.Е. Соколова, М.А. Пятницкий и др.//Сб. тез. науч. раб. «Санкт-Петербургские дерматологические чтения». – СПб., 2010. – С.35-36.