Механизм образования наноструктурированного биокомплекса

Грязнева Т.Н. – зав. кафедрой микробиологии, доктор биологических наук, профессор,
Смирнова Е.А. – доцент кафедры биотехнологии, кандидат биологических наук
ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и
биотехнологии имени К.И. Скрябина»
МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОГО
БИОКОМПЛЕКСА, ОБУСЛАВЛИВАЮЩЕГО АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ
АКТИВНОСТЬ БАЦИЛЛ-КОМПОНЕНТОВ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ
ДОБАВКИ «ОЛИН»
В статье приводятся экспериментально подтвержденные данные о том, что в процессе
культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 – бактерийкомпонентов пробиотической кормовой добавки «ОЛИН», в смеси с энтеротоксигенными
микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов
и энтеротоксинов, который
адсорбируется на клеточной стенке патогенных
микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных
веществ в клетки, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов
бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
Создание биопрепаратов на основе живых, антагонистически активных бактерий
(пробиотики, синбиотики, симбиотики), как альтернативы антибиотикам, является актуальной задачей и для медицины и для ветеринарии.
Общеизвестен тот факт, что широкое применение антибиотиков способствует появлению антибиотикорезистентных штаммов бактерий и микроскопических грибов, распространению микозов и микотоксикозов, развитию у людей и животных дисбактериозов,
иммунодепрессий и т.д. [1, 2].
На сегодняшний день отказаться от антибиотиков невозможно, но в ряде случаев,
например, при желудочно-кишечных болезнях, вызванных энтеропатогенными бактериями, антибиотики с успехом заменяются пробиотическими препаратами и пробиотическими кормовыми добавками на основе бацилл – B.subtillis и B.licheniformis (КД-5, Биоспорин, Биод-5, ОЛИН, Белолин и др.).
Однако, несмотря на обилие отечественных и зарубежных публикаций о положительных свойствах пробиотиков, механизм их действия изучен недостаточно [3, 4, 5, 6, 7].
Для определения влияния биологически активных веществ, продуцируемых B.subtilis
ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 (компоненты пробиотической кормовой добавки «ОЛИН»), на энтеропатогенные бактерии нами было проведено культивирование
изучаемых бацилл в мясо-пептонном бульоне в смеси с эшерихиями - непатогенной (E.coli
1257) и энтеротоксигенной (E.coli К88).
Для этого в пробирку вносили суточные бульонные культуры B.subtilis ВКПМ 10172 и
B.licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1:1 с концентрацией 108 м.кл./мл. Затем вносили суточную бульонную культуру непатогенной или энтеротоксигенной E.coli в той же
концентрации.
В контрольных пробах выращивали чистые культуры бацилл и эшерихий.
Через 2 часа культивирования при 37°С были приготовлены нативные микропрепараты для изучения в электронном микроскопе высокого класса разрешения «J 100В» [8, 9].
2
Ранее нами было установлено, что B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ
10135 продуцируют ферменты и бактериоцины, губительно действующие на патогенные
энтеробактерии, а E.сoli К88 вырабатывает энтеротоксины (рис. 1).
Рис. 1. Метаболиты, образующиеся в процессе культивирования
B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135 и энтеротоксигенной E.coli К88
Мы предположили, что продукты метаболизма бацилл (ферменты и бактериоцины)
образуют комплексы с энтеротоксинами энтеропатогенной E.сoli (рис. 2).
Рис. 2. Образование комплекса бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов,
вырабатываемых B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135
и энтеротоксигенной E.coli К88, при совместном культивировании
3
Условно данный комплекс мы обозначили как «КФБЭ».
Для исследования химической природы комплекса КФБЭ использовали метод биохимической деградации с помощью таких веществ, как лизоцим, холинэстераза, пептидазы
(трипсин, папаин, протеиназа К).
Для этого из мясо-пептонного бульона, в котором в течение 2 часов культувировали
бациллы и энтеропатогенные эшерихии, удаляли методом центрифугирования биомассу
клеток. Полученную культуральную жидкость, содержащую комплекс КФБЭ, анализировали следующими методами:
1. Метод перйодатного окисления.
2. Лизоцимный метод.
3. Холинэстеразный метод.
4. Пептидазный метод.
В результате проведенной биохимической деградации было установлено, что комплекс КФБЭ имеет сложную химическую структуру и содержит в своем составе углеводы,
липополисахариды, мукополисахариды и белки.
По нашему мнению, данный комплекс адсорбируется на поверхности энтеротоксигенных бактерий, т.к. обладает сродством к поверхности клеточной стенки патогенных микроорганизмов. Бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ
10135 упаковываются внутрь нано- и липосом, образованных ферментами бацилл и токсинами патогенных эшерихий (рис. 3).
Рис. 3. Взаимодействие комплекса КФБЭ с клеточной стенкой
энтеротоксигенной E.coli К88
После адсорбции наноструктурированного комплекса на поверхности энтеропатогенной E.coli, бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ
10135 проникают внутрь патогенных эшерихий и лизируют их. Кроме того, комплекс
КФБЭ препятствует пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в
патогенные микроорганизмы.
Полученные электронные фотографии подтверждают нашу гипотезу (рис. 4).
4
Рис. 4. Адсорбция комплекса КФБЭ на поверхности энтеротоксигенной E.coli К88
(Х26000)
5
На электронных фотографиях видно, что комплекс КФБЭ представляет собой нанолипосомальные структуры, адсорбирующиеся на поверхности клеточной стенки энтеротоксигенной E.сoli.
В контрольной пробе, в отсутствие бацилл энтеротоксигенные E.сoli К88 размножались и вырабатывали энтеротоксины (рис. 5).
а
б
Рис. 5. Энтеротоксигенные (а) и непатогенные (б) эшерихии
в контрольной пробе (Х26000)
При культивировании непатогенной E.coli 1257 в смешанной культуре с бациллами
комплекс КФБЭ не образовывался, развитие эшерихий не подавлялось, лизиса бактерий
не наблюдалось (рис.6).
Рис. 6. Непатогенные E.coli 1257 и бациллы в опытной пробе (Х26000)
Заключение. Из результатов проведенного опыта можно сделать вывод, что в
процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в смеси с
энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс
6
бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляющий собой смесь
пептидогликанов и липополисахаридов.
Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов,
препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также
способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь
энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
Следовательно, комплекс КФБЭ обуславливает антагонистическую активность бацилл-компонентов пробиотической кормовой добавки «ОЛИН».
Литература
1. Ковалев В.Ф. Некоторые проблемы применения антибиотиков в животноводстве
и ветеринарии /Ковалев В.Ф. //Антибиотики и медбиотехнология.-1999.- № 10.- С. 725729.
2. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной
микрофлоры /Каширская Н.Ю. //Русский медицинский журнал. – 2000. - № 13-14. – С. 3842.
3. Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода
Bacillus и их использование в ветеринарии / Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова
Н.Г. // Биотехнология. – 2001. - № 2. – С. 48-56.
4. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезни животных /Джупина С.И.
//Ветеринария.- 2001.- № 3.- С. 6.
5. Мазанкова Л.Н. Перспективы применения споровых пробиотиков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у детей /Мазанкова Л.Н., Курохтина И.С. // Педиатрия. – 2002. - № 4. – С. 56-61.
6. Жданов П.И. Опыт и перспективы применения нового пробиотика «Споробактерин» в животноводстве и ветеринарной практике /Жданов П.И., Мешков В.М., Лепский
А.И. //Юбилейн. сб.тр.ученых Оренбург.гос.аграр.ун-та.- Оренбург: ОГАУ.- 2000. - С. 4-7.
7. Грязнева Т.Н. Оценка эффективности пробиотика «БИОД-5» при желудочнокишечных болезнях новорожденных телят /Грязнева Т.Н., Тихонов И.В., Васильев П.Г. //
Ветеринарная медицина.- - 2002.- № 2.- С. 22-23.
8. Грязнева Т.Н. Элекронно-микроскопическое исследование колоний патогенных
микроорганизмов и роль лактобактерий в процессе антагонизма /Грязнева Т.Н.
//Достижения ветеринарной науки – производству: Сб. науч. ст. - Чебоксары: Изд. Чувашского СХИ.- 1994.- С. 23-26.
9. Грязнева Т.Н. Электронная микроскопия биологических объектов /Грязнева Т.Н.,
Меньшикова З.Н., Тихонов И.В., Мельницкая Т.И. //Учебно-методическое пособие.- М.:
МГАВМиБ. - 2003.- 109 с.