В взаимоотношениях опухолевых супрессоров ARF и p53
advertisement
На правах рукописи БУДИНА Анна Павловна Опухолевый супрессор ARF и его роль в селективной и неселективной аутофагии 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена на кафедре биологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ и в «Wistar Institute», Филадельфия, США. Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ, заведующий кафедрой биологии Соловьев Александр Семенович Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, руководитель отдела канцерогенеза и онкогеронтологии Анисимов Владимир Николаевич Доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, руководитель лаборатории гибридомной технологии Климович Владимир Борисович Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии российской академии наук», Санкт-Петербург Защита диссертации состоится «____» ____________ 2014 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт экспериментальной медицины» СевероЗападного отделения Российской Академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научноисследовательский институт экспериментальной медицины» СевероЗападного отделения Российской Академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12.или на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov02.htm Автореферат разослан «____» ___________ 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Дыбан П.А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Несмотря на существенные достижения современной медицины, смертность от злокачественных новообразований имеет тенденцию к постоянному увеличению. Успех в разработке новых методов диагностики и лечения опухолей вряд ли возможен без глубокого изучения молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе их развития. Как известно, одной из главных особенностей современной патофизиологии является привлечение методов молекулярной биологии и генетики в исследование патогенеза различных заболеваний, что дает возможность определить конкретные клеточные и молекулярные мишени для воздействия на определенные патологические процессы. С полным правом это можно отнести и к изучению механизмов опухолевого роста. По современным представлениям опухолевый процесс развивается вследствие либо активации онкогенов, либо утраты функции генов – супрессоров опухолевого роста. В этой связи изучение функционирования опухолевых супрессоров является необходимой предпосылкой в раскрытии механизмов клеточной онкотрансформации. К группе онкосупрессоров относится опухолевый супрессор ARF (p14ARF у человека, p19ARF у мышей) – продукт альтернативной рамки считывания гена INK4a/ARF. Это второй по частоте встречаемости мутаций ген в опухолях человека после гена TP53, кодирующего опухолевый супрессор p53 (Saporita, Maggi et al. 2007). Показано, что потеря функции опухолевого супрессора ARF является необходимым этапом трансформации нормальных клеток в опухолевые (Sherr, Bertwistle et al. 2005, Saporita, Maggi et al. 2007). Несмотря на имеющееся мнение, что ARF подавляет развитие опухоли посредством стабилизации p53, накапливается все больше данных, указывающих на существование p53-независимых супрессорных функций белка ARF (Sherr, Bertwistle et al. 2005). Внимание исследователей привлекло существование трансляционной модификации белка ARF с митохондриальной локализацией, получившей название укороченная форма онкосупрессора ARF (smARF, от англ. short mitochondrial form of ARF) (Reef, Zalckvar et al. 2006). Однако данные литературы о роли smARF в клетках немногочисленны и противоречивы. 3 В последние годы активно изучается участие онкосупрессоров в регуляции аутофагии (Kung, Budina et al. 2011). Аутофагия – механизм лизосомальной деградации собственных компонентов клетки, который направлен на обновление клеточных структур. В то же время аутофагия – это компенсаторный механизм, обеспечивающий питание и снабжение клеток энергией в условиях метаболического голода (Pimkina, Humbey et al. 2009). Повышенный интерес к изучению аутофагии связан с тем, что она вовлечена во многие патологические процессы, в том числе и канцерогенез (White 2012). Показано, что эффективная работа некоторых супрессоров зависит от их способности активировать аутофагию, которая, в свою очередь, обладает различными механизмами противоопухолевой защиты (Kung, Budina et al. 2011). На сегодняшний день роль аутофагии в канцерогенезе рассматривается в зависимости от стадии развития опухоли. На этапе инициации опухолевого процесса аутофагия может подавлять канцерогенез, а на этапе прогрессирования опухоли аутофагия позволяет опухолевым клеткам выжить в условиях метаболического стресса (Wei, Pattingre et al. 2008). Аутофагия представляет собой сложный многоступенчатый процесс с большим числом сигнальных путей, которые участвуют в ее регуляции (Yang and Klionsky 2009). Несмотря на большое количество публикаций по данной проблеме, до настоящего времени нет ясного понимания как регулируется данный процесс и какую роль в нем играют онкосупрессоры, в частности, опухолевый супрессор ARF. Необходимость раскрытия этих механизмов регуляции и определила актуальность данного исследования. Цель работы. Изучить роль опухолевого супрессора ARF и его укороченной митохондриальной формы в процессах селективной и неселективной аутофагии. Задачи исследования: 1. Определить участки опухолевого супрессора p19ARF, ответственные за его митохондриальную локализацию и активацию аутофагии. 2. Изучить роль укороченной формы белка ARF - smARF в процессе неселективной и селективной аутофагии в клетках человека. 4 3. Исследовать роль С – концевого участка опухолевого супрессора p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека. 4. Изучить влияние точечных мутаций гена INK4a/ARF, встречающихся в опухолевых клетках человека, на ARF – опосредованную аутофагию. 5. Оценить взаимное влияние экспрессии ARF и p53 на регулируемую ими аутофагию. Научная новизна исследования. Впервые в работе раскрыт механизм селективной деградации митохондрий (митофагии) с участием укороченной формы ARF – smARF. В результате исследований впервые определены участки белка p19ARF, ответственные за его митохондриальную локализацию и активацию аутофагии. В работе впервые определена физиологическая значимость консервативного Сконцевого участка опухолевого супрессора ARF мыши и человека. Приоритетными являются данные по изучению влияния точечных мутаций гена INK4a/ARF на способность опухолевого супрессора ARF активировать аутофагию в опухолевых клетках человека. Определена роль ARF как посредника в p53-зависимой аутофагии. Практическая значимость работы. Комплекс проведенных исследований позволил определить конкретные, ранее не известные молекулярные механизмы процесса аутофагии, как одного из составляющих патогенеза опухолевого роста. Идентифицированные молекулы, участвующие в реализации этого процесса, могут являться потенциальными мишенями для разработки новых фармакологических методов лечения онкологических заболеваний. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Последовательность аминокислот в опухолевом супрессоре p19ARF с 45 по 100 отвечает за его митохондриальную локализацию; активацию неселективной аутофагии контролирует гомологичный консервативный С-концевой участок белков p14ARF и p19ARF. 2. Укороченная форма опухолевого супрессора ARF, расположенная в митохондриях, активирует процесс селективной деградации митохондрий – митофагию. 5 3. Опухоль-ассоциированные точечные мутации гена INK4a/ARF, нарушающие структуру C-концевого участка молекулы, блокируют ARF – опосредованную аутофагию. 4. Опухолевый супрессор ARF выполняет роль посредника в p53зависимой аутофагии. Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе, а также в лекционном курсе и на практических занятиях на кафедрах патологической физиологии, патологической анатомии и онкологии Смоленской государственной медицинской академии. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях проблемной комиссии «Иммунология, иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской государственной медицинской академии (2011-2014) и на международных конференциях: «16 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference» (Филадельфия, США, 2011), «Wistar Institute Cancer Center Retreat» (Филадельфия, США, 2012), «Tumor metabolism Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology» (Keystone, США, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 странице машинописного текста и включает 28 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, а также заключения и выводов. Библиографический указатель содержит 235 источника литературы (9 работ отечественных и 226 зарубежных авторов). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование клеток. В работе были использованы клеточные линии U2OS-ARF, H1299, Capan2 и PC3. Культивирование перечисленных клеточных линий проводили в среде DMEM (U2OS6 ARF, H1299), RPMI 1640 (PC3) и McCoy 5a (Capan2) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10000 ед/мл стрептомицина в атмосфере 5% CO2 при 37°C. Для клеточной линии U2OS-ARF в среду добавляли 50 мкг/мл зеоцина. Конструирование плазмид. Для получения рекомбинантных плазмид, содержащих делеции в гене ARF мыши и человека, была проведена амплификация фрагментов гена ARF с помощью полимеразной цепной реакции и синтезированных нами специфичных праймеров. В качестве белок-кодирующей части кДНК p19ARF мы использовали плазмидную конструкцию pcDNA 4/TO-ARF (Pimkina, Humbey et al. 2009). Для получения мутантных p14ARF мы использовали кДНК, полученную из РНК, выделенной из клеток опухоли поджедудочной железы человека. Иммуноблоттинг. Экспрессию исследуемых белков в клеточных лизатах оценивали путем переноса разделенных белков с полиакриламидного геля на поливинилиденфторидную мембрану (PVDF) с последующим применением поли- и моноклональных антител к изучаемым белкам. Выделение митохондрий. Выделение митохондриальной фракции из эукариотических клеток производилось при помощи набора Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (Abcam, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Метод сайт-направленного мутагенеза. Введение в ген ARF сайт-специфических мутаций, встречающихся в опухолях человека, осуществляли с использованием коммерческого набора QuickChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США) в соответствии с протоколом производителя. В качестве исходной матрицы была использована плазмида pcDNA 4/TO с геном ARF дикого типа. Иммуноцитофлюоресцентный анализ. Для оценки уровня аутофагии клетки трансфецировали плазмидой GFP-LC3, кодирующей маркер аутофагосом – белок LC3 и зеленый флуоресцентный белок GFP. Формирование аутофагосом анализировали через 48 часов после суперэкспрессии ARF с помощью конфокальной микроскопии. Общее количество митохондрий оценивали по интенсивности флюоресценции 7 митотракера зеленого и белка митохондрий Tom20, меченного красителем FITC. Инфицирование клеток ретровирусами. Для инфицирования мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) ретровирусами shARF 157 и shE, описанными ранее (Pimkina, Humbey et al. 2009), использовали линию пакующих клеток эмбриональной почки Феникс (Phoenix, Stanford University, США). Трансфекцию Феникс клеток векторами осуществляли с использованием реагента Fugene 6.0 по стандартной методике. Сбор вируса с клеток - упаковщиков и инфицирование фибробластов проводили трижды (через 24, 36 и 48 часов) с добавлением 8мг/мл полибрена. Селекцию инфицированных клеток проводили в среде, содержащей 1,5 мкг/мл пуромицина. Статистическая обработка результатов исследования. Статистическую достоверность различий измеряемых параметров оценивали путем расчета t-критерия Стьюдента в программе SigmaPlot V.10. Различия считали достоверными при p < 0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение участка митохондриальной локализации опухолевого супрессора p19ARF. Данные литературы свидетельствуют, что опухолевый супрессор p19ARF, расположенный на наружной мембране митохондрий, отвечает за активацию неселективной аутофагии (Pimkina, Humbey et al. 2009). В то же время специфические последовательности аминокислот, которые обеспечивают транспорт молекулы в митохондрии, а также ответственные за активацию аутофагии до настоящего времени не были установлены. Для определения участка митохондриальной локализации p19ARF была создана серия делеционных форм белка с удаленными С-концевыми участками различной длины, а также укороченная форма супрессора – smARF. Таким образом, были получены варианты ARF: 1-140, 1-120, 1-100 и 45-169 – smARF (рис. 1 - А). В качестве матрицы при мутагенезе использовался плазмидный вектор pcDNA4/TO, содержащий ген полноразмерного ARF (1-169). Для получения регулируемой экспрессии генов каждого варианта ARF была создана клеточная линия остеосаркомы человека U2OS-ARF. Инкубация U2OS-ARF клеток в 8 присутствии доксициклина приводила к повышению экспрессии гена дикого типа ARF и мутантных генов (рис. 1 - Б). Рис. 1. Данные, полученные при анализе экспрессии ARF дикого типа и мутантов в клетках остеосаркомы человека. A - Схема структуры гена ARF дикого типа и его мутантов. Б - Уровень экспрессии ARF дикого типа и его мутантов в клетках U2OS-ARF при воздействии доксициклина. Для определения участка p19ARF, отвечающего за локализацию белка в митохондриях, мы проверили способность мутантных форм ARF перемещаться в митохондрии. Используя метод Вестерн блоттинга (рис. 2 - А) и электронной микроскопии (рис. 2 - Б) было установлено, что количество 1-140, 1-120, 1-100 ARF в митохондриях соответствовало уровню wt ARF в этой фракции. Результаты данного эксперимента свидетельствуют о том, что делеция С-концевого участка ARF (100-169) не повлияла на нормальный транспорт этих форм в митохондрии. Также было установлено, что белок smARF был доминирующей формой ARF в митохондриях. 9 Рис. 2. Выявление содержания wt ARF и мутантов в митохондриях методом иммуноблоттинга митохондриальной фракции клеток остеосаркомы (А) и методом иммуноэлектронной микроскопии клеток U2OS-ARF (Б, В). Учитывая, что smARF в своей структуре не содержит участок молекулы 1-44 и это не ограничивает его митохондриальную локализацию, можно сделать вывод, что последовательность аминокислот белка p19ARF с 45-100 отвечает за его локализацию в митохондриях. Выявление участка белка p19ARF, отвечающего за активацию неселективной аутофагии Для выявления участка молекулы ARF, отвечающего за активацию неселективной аутофагии, сравнивали уровень аутофагии в клетках остеосаркомы после суперэкспрессии полноразмерного белка ARF с уровнем аутофагии, наблюдаемым после активации делеционных мутантов (1-100, 1-120, 1-140). Методом иммуноблоттинга было выявлено, что повышенная экспрессия 1-140 и 1-120 мутантов ARF сопровождалась деградацией белка p62 и накоплением белка LC3-II, что характерно для активации 10 неселективной аутофагии. В то же время при повышении экспрессии 1100 ARF подобного эффекта не наблюдалось (рис. 3 - А). Поскольку точно идентифицировать функционально значимые сайты белка позволяет индукция мутаций этого участка, мы провели замену аминокислоты валин на аланин в 113 положении белка ARF с помощью метода направленного мутагенеза. Исследование влияния этой мутации на ARF – опосредованную аутофагию методом иммуноблоттинга показало, что точечная мутация полностью нарушила способность супрессора ARF к активации аутофагии (рис. 3 Б). Полученные данные свидетельствуют, что за ARF – опосредованную аутофагию отвечает участок полипептидной цепи белка ARF 100-120. Рис. 3. Участок полипептидной цепи белка ARF 100-120 отвечает за активацию неселективной аутофагии. А - Вестернблоттинг анализ конверсии белка LC3-I в LC3-II и деградации белка p62 после индукции ARF дикого типа (wt ARF) и его мутантов доксициклином в течение указанных промежутков времени. Б – Суперэкспрессия белка V113A ARF не сопровождается образованием LC3-II или деградацией p62, определенных методом Вестернблоттинга. 11 Исследование роли C-концевого участка p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека До настоящего времени исследования роли опухолевого супрессора ARF в аутофагии проводились только на примере мышиного белка p19ARF. В наших экспериментах мы определили способность ARF человека (p14ARF) к выполнению этой функции. ARF человека содержит на своем N-конце два метионина в 1 и 42 положениях (рис. 5 - A). Инициация трансляции может начинаться с любого из них, в результате чего могут синтезироваться полипептдные цепи белка различной длины - 1-173 ARF и 42-173 ARF. До настоящего времени исследований по изучению формы 1-173 ARF не проводилось. С помощью методов конфокальной и электронной микроскопии было показано, что индукция 1-173 ARF и 42-173 ARF приводила к формированию GFP-LC3 вакуолей и аутофагосом. В то же время экспрессия делеционной формы 1-140 ARF не сопровождалась подобными изменениями (рис. 4). Рис. 4. Измерение аутофагии в клетках U2OS-ARF в результате индукции p14ARF и мутантов доксициклином с помощью конфокальной (А, Б) и электронной микроскопии (В). Таким образом, была подтверждена консервативность функции аутофагии у человека. Оказалось, что делеция консервативного C12 конца участка у обоих белков (p14ARF и p19ARF) нарушает ARF – опосредованную аутофагию в клетках мыши и человека. Влияние точечных мутаций гена Ink4a/ARF, индуцируемых в опухолевых клетках человека, на ARF – опосредованную аутофагию Несмотря на то, что аминокислотные последовательности мыши и человека перекрываются только на 50%, участок 100-120 является одним из двух наиболее гомологичных участков p14ARF и p19ARF, функциональная значимость которого ранее была не известна (рис. 5 А). Кроме того, эта последовательность располагается в экзоне 2 локуса INK4a/ARF, где встречается наибольшая частота мутаций в опухолях человека (Saporita, Maggi et al. 2007). Мы экспериментально показали, что индукция подобных мутаций полностью блокирует способность опухолевого супрессора ARF к активации аутофагии в опухолевых клетках человека (рис. 5 – Б, В). Рис. 5. Изучение влияния аминокислотных замен P94L, R98L, L104I и R155G в p14ARF на ARF – зависимую аутофагию путем определения накопления GFP-LC3 вакуолей (Б) и аутофагосом (В). 13 Изучение роли укороченной формы белка ARF – smARF в процессе митофагии В последнее время в литературе накапливаются данные о связи между нарушениями процесса митофагии и развитием новообразований (Zhou, Yazdi et al. 2011, Lu, Li et al. 2013). В этой связи изучение молекулярных механизмов митофагии представляет особый интерес. Для доказательства роли укороченной формы ARF в индукции селективной аутофагии – митофагии мы использовали несколько подходов. Электронно-микроскопическое исследование клеток U2OS-ARF выявило грубые нарушения структуры митохондрий – «набухание» органелл после суперэкспрессии smARF (рис. 6 - А). По данным литературы такие повреждения митохондрий являются стимулом к селективной деградации митохондрий. Индукция smARF действительно сопровождалась фрагментацией и кластеризацией митохондрий в околоядерном пространстве клетки и снижением общей массы митохондрий (рис. 6 – Б, В). Таким образом, полученные результаты, при всех используемых методических подходах, позволяют сделать вывод, что укороченная форма ARF (smARF) активирует селективную аутофагию – митофагию. Рис. 6. Индукция smARF в клетках U2OS-smARF вызывает «набухание» митохондрий (А), кластеризацию митохондрий в околоядерном пространстве (В) и снижает их общую массу в клетке (Б). 14 Оценка взаимного влияния экспрессии ARF и p53 на регулируемую ими аутофагию в клетке Пока остаются малоизученными p53-независимые функции ARF, хотя работа в этом направлении ведется активно в последние годы. Нами предпринята попытка рассмотреть некоторые механизмы взаимного влияния ARF и p53 в активации неселективной аутофагии. Во-первых, мы проверили влияние присутствия p53 в клетке на ARF – опосредованную аутофагию. Опыты показали, что экспрессия гена ARF в клетках карциномы легких H1299, в которых отсутствует p53, стимулировала накопление GFP в цитоплазматических вакуолях, что характерно для аутофагии (рис. 7 - А). При электронной микроскопии этих клеток наблюдалось увеличение числа аутофагосом в цитоплазме (рис. 7 - Б). Эти результаты свидетельствуют, что активация неселективной аутофагии опухолевым супрессором ARF не зависит от экспрессии p53 в клетке. Рис. 7. Определение уровня аутофагии в клетках H1299 до и после индукции 1-173 и 42-173 ARF доксициклином. См. Пояснения в тексте. В взаимоотношениях опухолевых супрессоров ARF и p53 нерешенным, в частности, оставался вопрос: влияет ли активность опухолевого супрессора ARF на способность p53 активировать/подавлять ауофагию. Известно, что ингибирование p53 приводит к активации аутофагии и увеличению уровня ARF (Pimkina, Humbey et al. 2009). В этой связи представлялось важным определить: 15 может ли аутофагия, наблюдаемая при подавлении экспрессии p53, быть опосредована супрессором ARF. Для раскрытия подобной взаимосвязи мы провели опыты на фибробластах мышей в условиях блокирования экспрессии генов p53 и ARF. Установлено, что нокдаун p53 в клетках с нормальным функционированием гена ARF вызывало повышение экспрессии ARF и активацию аутофагии. Однако нокдаун гена p53 в клетках с отсутствием ARF не приводил к индукции аутофагии (рис. 8). Это позволило сделать вывод, что подавление экспрессии p53 активирует аутофагию вследствие индукции ARF. Рис. 8. Результаты исследования взаимного влияния p53 и ARF не регулируемую ими аутофагию методом иммуноблоттинга (А) и электронной микроскопии (Б). 16 ВЫВОДЫ 1. В составе онкосупрессора p19ARF выявлены две функционально значимые аминокислотные последовательности. Последовательность с 45 по 100 определяет митохондриальную локализацию супрессора, а с 100 по 120 активацию неселективной аутофагии. 2. Укороченная митохондриальная форма опухолевого супрессора ARF (smARF) инициирует процесс селективной деградации митохондрий (митофагию). 3. Активация неселективной ARF-опосредованной аутофагии у мышей и человека происходит с участием консервативного Сконцевого участка белков p19ARF и p14ARF, являющегося имманентной составляющей этого процесса. 4. Опухоль-ассоциированные точечные мутации гена INK4a/ARF, нарушающие структуру C-концевого участка молекулы, блокируют ARF – опосредованную аутофагию. 5. Опухолевый супрессор ARF индуцирует неселективную аутофагию независимо от экспрессии гена p53 и является посредником p53-зависимой аутофагии. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ: 1. Kung CP, Budina A, Balaburski G, Bergenstock MK, Murphy M. Autophagy in tumor suppression and cancer therapy // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 21(1). - 2011. – С. 71-100. 2. Anna Budina, Robert D. Hontz, Julia Pimkina and Maureen E. Murphy. A conserved domain in exon 2 of the human and murine ARF tumor suppressor protein is required for autophagy induction // Autophagy 9(10). - 2013. – С. 1553-1565. 3. Gregor M. Balaburski, Anna Budina, and Maureen E. Murphy. Oncogenes and Tumor Suppressor Genes in Autophagy // Autophagy and Cancer by Springer Science+Business Media, LLC. - 2013. – С. 127-143. 4. Будина А.П., Соловьев А.С. Роль опухолевого супрессора ARF в 17 активации селективной аутофагии // Медико-биологические проблемы жизнедеятельности. – 2014. - №2 (12). – С. 48-54. Статьи, опубликованные в других изданиях: 5. Будина А. П., Соловьев А. С. Опухолевый супрессор ARF активирует селективную аутофагию митохондрий – митофагию // Вестник Смоленской государственной Медицинской Академии. – 2013. – Т. 12, №3. – С. 13-17. Тезисы докладов: 1. Anna Budina and Maureen E. Murphy. The ARF tumor suppressor and autophagy // Abstracts of the 16 Annual Postdoctoral & Graduate Student Conference. - Philadelphia, 2011. – С. 7. 2. Anna Budina and Maureen E. Murphy. Identification of the domain(s) necessary for ARF-mediated autophagy // Abstracts of the Wistar Institute Cancer Center Retreat. - Philadelphia, 2012. – С. 7. 3. Будина А.П., Соловьев А.С. Роль опухолевого супрессора ARF в молекулярных механизмах селективной и неселективной аутофагии // VIII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 220-летию со дня рождения академика K.М. Бэра. - Санкт-Петербург, 2012.- С. 43-44. 4. Будина А. П. Опухоли человека содержат мутации в локусе Ink4a/ARF, которые инактивируют ARF-опосредованную аутофагию // Вестник Смоленской государственной Медицинской Академии, специальный выпуск. – Смоленск, 2013. – С. 95-96. 5. Будина А.П. Мутации в локусе Ink4a/ARF инактивируют ARFопосредованную аутофагию в процессе канцерогенеза // XVI Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей с международным участием. – Санкт-Петербург, 2013. – С. 69-70. 6. Anna Budina and Maureen Murphy. Two conserved domains of the human and murine ARF tumor suppressor proteins are required for the induction of autophagy // Abstracts of the Tumor metabolism Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology. - Keystone, Colorado, 2013. – С. 113. 18 19