На правах рукописи КУЛЕМЗИНА АНАСТАСИЯ ИГОРЕВНА
advertisement
На правах рукописи КУЛЕМЗИНА АНАСТАСИЯ ИГОРЕВНА СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЦИТОГЕНЕТИКА ОСНОВНЫХ ТАКСОНОВ В ОТРЯДАХ PERISSODACTYLA И CETARTIODACTYLA (LAURASIATHERIA, MAMMALIA) 03.02.07 генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики животных в Учреждении Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, Графодатский А. С., Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Демаков С. А. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, Жданова Н. С. Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии РАН, г. Москва Защита диссертации состоится «__» ________ 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел. (383)-33312-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «__» __________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение организации и эволюции генома является одной из актуальных задач генетики. Развитие флуоресцентной in situ гибридизации, сортинга хромосом и DOP-ПЦР привело к разработке метода сравнительного хромосомного пэйнтинга, который основан на использовании наборов индивидуальных библиотек сортированных хромосом (пэйнтинг-проб) для гетерологичной флуоресцентной гибридизации. Новый подход в сочетании с методами классической цитогенетики оказался эффективным для быстрого и точного анализа консервативных сегментов в кариотипах практически любых видов позвоночных. К настоящему времени с помощью хромосомного пэйнтинга уже изучены геномы около 150 видов млекопитающих (Графодатский, 2007). Анализ данных сравнительного хромосомного пэйнтинга показал, что существуют консервативные районы хромосом, которые, несмотря на миллионы лет дивергенции, сохраняют высокий уровень гомологии в геномах различных видов. Выявление таких консервативных сегментов в кариотипах как близкородственных, так и отдалённых видов позволяет определять хромосомные перестройки, разделяющие кариотипы изучаемых групп животных. При наличии достаточного числа вовлеченных в исследование видов можно реконструировать предполагаемый кариотип предка и возможный сценарий кариотипической эволюции таксона. На данный момент определены вероятные структуры предковых кариотипов основных групп отрядов класса млекопитающих (например, Afrotheria (Yang et al., 2003, Froenicke et al., 2003), Xenarthra (Yang et al., 2006), Laurasiatheria (Yang et al., 2006, Balmus et al., 2007), Primates (Stanyon et al., 2008). Известно, что филогенетические отношения внутри многих отрядов (например, Rodentia, Perissodactyla, Cetartiodactyla (Cetacea+Artiodactyla)) до сих пор остаются спорными. Было показано, что хромосомные перестройки могут служить надежными филогенетическими маркерами дивергенции млекопитающих (O’Brien et al., 1999), и в настоящее время разработан подход к использованию перестроек хромосом как характеристик определенных таксонов при построении филогенетических деревьев (Dobigny et al., 2004). Настоящая работа посвящена изучению филогенетических взаимоотношений внутри отрядов Perissodactyla (непарнокопытные) и Cetartiodactyla (китопарнокопытные) с помощью метода сравнительного хромосомного пэйнтинга. Отряд непарнокопытных представляет существенный интерес для исследования закономерностей хромосомной эволюции, так как объединяет виды, обладающие значительными вариациями диплоидных чисел хромосом (от 32 у горной зебры до 84 у черного носорога). Постоянное внимание привлекает возможность получения жизнеспособных межвидовых гибридов между некоторыми представителями отряда и высокие темпы преобразования хромосомных наборов лошадиных в ходе эволюции. В то же время информации о формировании кариотипов современных представителей непарнокопытных недостаточно. На данный момент только для 3 семейства лошадиных проведены тщательные исследования гомологии хромосом между несколькими видами и определены сегменты гомологии с хромосомами человека. Для таксона носороговых опубликована одна работа по сравнительному пэйнтингу, где кариотипы белого и чёрного носорога сопоставлены с кариотипом бурчелловой зебры; семейство тапировых до настоящего времени вообще не было изучено. Отряд парнокопытных включает виды, удивительно разнообразные по морфологическим признакам (от самого большого млекопитающего планеты – голубого кита до крошечного оленька, живущего в тропическом подлеске). Диплоидные числа хромосом в кариотипах варьируют от 6 у мунтжака до 74 у верблюдов. Основной акцент в исследовании отряда был сделан на построении сравнительных цитогенетических карт высокого уровня разрешения и секвенировании геномов таких важных представителей этого таксона, как корова и свинья. Несмотря на то, что отряд парнокопытных всегда был объектом интереса многих групп ученых, часть ключевых семейств (например, Hippopotamidae, Cetacea, Giraffidae) слабо или совсем не исследованы с помощью методов молекулярной цитогенетики. В работе Балмуса с соавт. (Balmus et al., 2007) приведен возможный предковый кариотип парнокопытных, который нуждается в дальнейшем подтверждении или корректировке, поскольку был реконструирован по результатам исследования только части семейств этого отряда. Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является выявление закономерностей и особенностей эволюции кариотипов млекопитающих из отрядов Perissodactyla (непарнокопытные) и Cetartiodactyla (китопарнокопытные). Для составления картины кариотипических эволюционных изменений в отрядах были поставлены следующие задачи: 1. Охарактеризовать кариотипы представителей отряда непарнокопытных с помощью пэйнтинг-проб человека, чепрачного тапира и зебры Грэви. 2. Охарактеризовать кариотипы представителей отряда китопарнокопытных с помощью пэйнтинг-проб человека и одногорбого верблюда. 3. Проанализировать данные сравнительного хромосомного пэйнтинга, реконструировать предковые кариотипы непарнокопытных и китопарнокопытных. 4. Проследить возможный ход перестроек, приведших к формированию кариотипов видов из отрядов непарнокопытных и китопарнокопытных. Оценить темпы преобразований кариотипов в различных таксонах этих отрядов. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в эксперименты по сравнительному хромосомному пэйнтингу вовлечены следующие виды: чепрачный тапир (Tapirus indicus), зебра Грэви (Equus grevyi), онагр (Equus hemionus onager), обыкновенная гринда (Globicephala melas), обыкновенный бегемот (Hippopotamus amphibius), окапи (Okapia johnstoni), саола (Pseudoryx nghetinhensis) и сибирская кабарга (Moschus moschiferus). Впервые охарактеризованы и использованы для определения сегментов гомологии между кариотипами представителей отряда непарнокопытных 4 хромосомоспецифичные библиотеки чепрачного тапира и зебры Грэви. Для исследования кариотипической эволюции в отряде китопарнокопытных были использованы в качестве зондов хромосомы одногорбого верблюда. В качестве внешней группы для всех изученных видов животных был выбран консервативный кариотип человека (Homo sapiens), что позволило провести детальный анализ кариотипических преобразований, свойственных представителям таксонов непарнокопытных и китопарнокопытных. Обработка данных сравнительного хромосомного пэйнтинга с помощью пакета программ PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) позволила получить первое филогенетическое древо непарнокопытных, построенное на основе перестроек хромосом. Тщательный анализ результатов помог уточнить структуры предковых кариотипов непарнокопытных и китопарнокопытных, а также реконструировать предковые кариотипы всех групп внутри этих отрядов. В целом по результатам проделанной работы удалось проследить изменения хромосом, сопровождавшие эволюцию отрядов, оценить скорости кариотипических преобразований в различных ветвях филогенетического древа непарнокопытных и китопарнокопытных. Впервые показана огромная вариабельность скоростей эволюции кариотипов внутри таксона непарнокопытных. Использование хромосомного набора человека, как вида, геном которого детально картирован, придает особую практическую ценность данной работе: создает базу для картирования геномов видов непарнокопытных и китопарнокопытных. Апробация работы. Результаты исследования были доложены на Международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», Новосибирск, 2005 г.; ХV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 2005 г., конференции «Биоразнообразие и динамика генофондов», Москва, ФИАН, 2007 г.; V конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А. Лаврентьеву, Новосибирск, 2007 г., конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009г. Публикации. По результатам работы опубликовано три статьи. Вклад автора. Автором выполнены работы по культивированию используемых в исследовании первичных линий фибробластов и получению суспензий хромосом большей части животных, вовлеченных в исследование. Проведено дифференциальное окрашивание кариотипов всех исследованных видов, все эксперименты по гибридизации in situ, анализ результатов локализации пэйнтинг-проб и идентификация хромосом. Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 219 ссылок, и 1 приложения. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 35 рисунков. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Список видов, вовлеченных в исследование. Таблица 1. Список культур клеток животных, использованных в работе. Латинское название Русское название Аббреви 2n Пол Кем предоставлена культура атура клеток и/или суспензия метафазных хромосом Отряд Perrisodactyla (Непарнокопытные) Семейство Equdae (лошадинные) Equus hemionus онагр EHE 56 m ETH, Цюрих onager Equus grevyi зебра Грэви EGR 46 f Кориэльский банк клеток Equus burchelli бурчеллова зебра EBU 44 f Университет Стелленбох Семейство Tapiridae (тапировые) Tapirus indicus чепрачный тапир TIN 52 m Зоопарк Сан Диего, Семейство Rhinocerotidae (носороговые) Ceratotherium simum белый носорог CSI 82 f Университет Стелленбох Diceros bicornis черный носорог DBI 84 f Университет Стелленбох Отряд Cetartiodactyla (Китопарнокопытные) Семейство Suidae (свиные) Sus scrofa свинья SSC 38 m ИЦиГ, СО РАН Семейство Delphinidae (дельфиновые) Globicephala melas гринда GME 44 f Океанографический обыкновенная исследовательский институт Семейство Hipopotamidae (бегемотовые) Hippopotamus бегемот HAM 36 m Зоопарк Сан Диего amphibius обыкновенный Семейство Giraffidae (жирафовые) Giraffa жираф GCA 30 f 1. Зоопарк Сан Диего camelopardalis 2. Национальный парк Закума Okapia johnstoni окапи OJO 44 m Брукфилдский зоопарк Семейство Moschidae (кабарговые) Moschus moschiferus сибирская MMO 58 m ИЦиГ, СО РАН кабарга Семейство Bovidae (полорогие) Bos taurus корова BTA 60 f ИЦиГ, СО РАН Pseudoryx саола PNG 50 f ETH, Цюрих nghetinhensis Культуры клеток и суспензии хромосом. Большинство суспензий получены в лаборатории цитогенетики животных при непосредственном участии автора или полностью самостоятельно. Культивирование клеток, получение суспензий хромосом и приготовление препаратов проводили по стандартным методикам (Графодатский, Раджабли, 1988; Henegariu et al., 2001). Дифференциальные окраски хромосом. GTG-бэндинг проводили по методике Сибрайт (Seabright, 1971), модифицированной Графодатским и 6 Раджабли (1988). С-окрашивание проводили по методике Самнер (Sumner, 1972), модифицированной Графодатским и Раджабли (1988). Наборы сортированных хромосом зебры Грэви и чепрачного тапира предоставлены центром сравнительной молекулярной цитогенетики Национального института рака (Фредерик, США). ДНК-пробы человека и одногорбого верблюда предоставлены Центром сравнительной геномики Кембриджского университета (Великобритания). Хромосомный пэйнтинг проводили на дифференциально окрашенных метафазных хромосомах по методу, описанному Yang et al., 1995, с некоторыми модификациями. Филогенетический анализ проведен согласно Dobigny et al., 2004. В соответствии с принципами кладистического анализа каждое структурное изменение хромосом было рассмотрено как характеристика (признак). Матрица хромосомных признаков проанализирована Г. Добиньи в лаборатории при Национальном музее истории природы, происхождения, структуры и эволюции биоразнообразия (Париж, Франция) методом максимальной экономии (Maximum Parsimony, MP) с использованием программного обеспечения PAUP 4.01b (Swofford, 1998). РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Многонаправленный хромосомный пэйнтинг для видов отряда Perrisodactyla В отряде непарнокопытных выделяют три сохранившихся семейства: носороговые, тапировые и лошадиные. Наше исследование затрагивает все три семейства отряда непарнокопытных, что позволяет определить хромосомные перестройки, произошедшие в ходе эволюции (рис.1А). Для выявления сегментов гомологии использованы пэйнтинг-пробы человека, чепрачного тапира, зебры Грэви и несколько хромосомоспецифичных проб белого носорога. 2. Хромосомный пэйнтинг для видов отряда Cetartiodactyla Отряд Cetartiodactyla включает 11 семейств. В нашей работе мы провели исследование шести видов из пяти семейств: Cetaceae, Hippopotamidae, Giraffidae, Moschidae и Bovidae (рис.1Б). Для выявления сегментов гомологии были использованы пэйнтинг-пробы человека и одногорбого верблюда. Поскольку кариотип верблюда состоит из большого числа хромосом (2n=74) и имеются результаты по реципрокному пэйнтингу между человеком и верблюдом, комбинирование этих двух наборов пэйнтинг-проб позволяет получить подробные карты сегментов гомологии между хромосомами видов отряда Cetartiodactyla. 7 Рисунок 1. Схема исследования кариотипов представителей (А) непарнокопытных и (Б) китопарнокопытных. Стрелками отмечены направления экспериментов по сравнительному хромосомному пэйнтингу, проведенных в данной работе. ОБСУЖДЕНИЕ 1. Кариотипическая эволюция отряда непарнокопытных Информации, полученной из результатов этой работы и данных литературы, оказалось достаточно для построения филогенетического древа с помощью PAUP (рис. 2). Топология древа согласуется с другими, полученными ранее (Oakenfull, Clegg 1998; Oakenfull et al., 2000; Norman, Ashley 2000; Pitra, Veits 2000; Tougard et al., 2001). 1.1. Определение предкового кариотипа непарнокопытных После построения филогенетического древа, стало возможным определить предковый статус каждой хромосомной характеристики и предложить предковый кариотип непарнокопытных (ПКН) с 2n=74−78 (рис. 3). Варьирование диплоидного числа может быть обусловлено или полиморфным статусом двух пар хромосом ПКН или неоднократным использованием одной и той же точки разрыва, что приводит к конвергенции и появлению гомоплазий. Большинство элементов ПКН целиком сохранились в геноме домашней лошади и носороговых. В ПКН присутствуют синтении, характерные для большинства плацентарных млекопитающих. Формирование ПКН из предкового кариотипа плацентарных млекопитающих шло за счёт разрывов. 1.2. Кариотипические преобразования в отряде непарнокопытных Кариотипы видов Ceratomorpha (носороговые и тапировые) имеют наиболее высокие диплоидные числа среди Laurasiatheria и представлены акроцентрическими хромосомами, большинство из которых, по-видимому, не отличаются от ПКН и образовались путем нескольких разрывов (рис. 2). Виды Hippomorpha (лошадинные) имеют кариотипы, преимущественно состоящие из мета- и субметацентрических хромосом, которые сформировались за счет множественных центрических и тандемных слияний предковых хромосом (рис. 2). Ранее была обнаружена неслучайная сегрегация хромосом во время мейоза у самок, кариотип которых содержал робертсоновскую транслокацию по одной из пар хромосом (Manuel de Villena, Sapienza, 2001). В яйцеклетку у видов с кариотипами, содержащими в основном метацентрические хромосомы (например, человек), преимущественно попадала метацентрическая хромосома, а не два акроцентрика. И, наоборот, у самок видов с кариотипами, состоящими из акроцентрицеских хромосом (например, мышь), в ходе мейоза чаще 8 9 10 формировались яйцеклетки с акроцентрическими хромосомами. Вероятно, причина различия формирования кариотипов непарнокопытных заключается в неслучайной сегрегации хромосом: при появлении робертсоновского полиморфизма у Hippomorpha фиксировался слитый вариант предковых элементов, а у Ceratomorpha, наоборот, кариотипы оставались похожими на ПКН с высоким диплоидным числом. 1.3. Скорости хромосомной эволюции в отряде непарнокопытных На основании опубликованных результатов палеонтологических и молекулярных исследований (Prothero , Schoch 1989, Xu et al., 1996, Oakenfull, Clegg, 1998, Tougard et al., 2001, Murphy et al., 2007) мы смогли датировать каждый узел филогенетического древа, полученного с помощью PAUP. Затем была посчитана скорость хромосомных перестроек для каждой ветви. Подотряд Ceratomorpha, как уже было отмечено, в основном характеризуется разрывами предковых элементов и отличается низкими скоростями эволюции кариотипов (0,06-0,1 П/МЛ). Однако заметно быстрее эволюционировали хромосомы двух тапиров, чепрачного и горного, в кариотипах которых происходили робертсоновкие слияния с примерно одинаковой скоростью (0,6−0,8 П/МЛ). Подотряд Hippomorpha отличался очень низкими скоростями кариотипической эволюции (0,04 П/МЛ), но ситуация изменилась в период дивергенции семейства лошадиных (около 2,4 МЛН). Резкий скачок в скорости фиксации перестроек в кариотипах лошадиных произошел почти в одно время с миграцией этого семейства из Северной Америки в Евразию (2,6 МЛН), а затем в Африку (1,9 МЛН) (Lindsay et al., 1980). Особенно быстро эволюционировали кариотипы зебр: за последний миллион лет путем 22 слияний и одного разрыва сформировался кариотип горной зебры. Таким образом, скорость эволюции кариотипа горной зебры в почти 40 раз выше, по сравнению темпами эволюции кариотипа чепрачного тапира, который является самым перестроенным в подотряде Ceratomorpha. Невероятно быстрая эволюция кариотипов семейства Equidae могла быть вызвана рядом причин:1. Лошадиные, по-видимому, являются толерантными к полиморфизму по робертсоновским транслокациям, поскольку в некоторых современных популяциях зебр, онагров, ослов были обнаружены полиморфные пары хромосом (Ryder et al., 1978, Whitehouse et al., 1984, Houck et al., 1998, Myka et al., 2003). В некоторых случаях гибриды между различными видами не только жизнеспособны, но и фертильны (Short et al., 1974, Rong et al., 1988, Yang et al., 2004). 2. Возможно, для кариотипов семейства лошадиных характерен мейотический драйв, который способствует фиксации центрических слияний хромосом (Padro Manuel De Villena, Sapienza, 2001). 3. Быстрая эволюция повторяющейся ДНК в геномах лошадиных также является фактором, который ускоряет эволюцию кариотипов (Wuers et al., 1993, Bradley, Wichman, 1994) 4. Известно, что лошадиные организуют табуны и широко расселяются по огромным территориям. Такая социальная организация ведет к уменьшению эффективного размера популяции, репродуктивной изоляции и к более быстрому накоплению хромосомных перестроек (Bush et al., 1977). 11 Возможно, все эти факторы в разной степени способствовали быстрой эволюции кариотипов семейства Equidae. 2. Кариотипическая эволюция отряда Cetartiodactyla 2.1. Определение предкового кариотипа китопарнокопытных На основании наших результатов в совокупности с ранее опубликованными данными мы реконструировали предковый кариотип китопарнокопытных (ПКК) (рис. 4). Мы предполагаем, что ПКК состоял из 25−26 пар аутосом и пары половых хромосом (2n=52−54). Варьирование числа хромосом, как и в случае с ПКН, связано с неоднозначным статусом ассоциации хромосом, соответствующей CDR1/17(HSA3/21). Возможно, по этой ассоциации в ПКК был полиморфизм, который впоследствии зафиксировался в одних ветвях в виде двух хромосом (например, хромосомы GME 5 и 12q гринды), а в других в слитом состоянии (например, хромосома 13 свиньи). При формировании ПКК из предкового кариотипа всех Boroeutheria (ПКБ) (Froenicke et. al, 2006) произошло всего 4 разрыва и 1 слияние. Разрыв ПКБ6 и слияние ПКБ4/22 характерны для отрядов Cetartiodactyla (Balmus et al., 2007, Huang et al., 2008, наша работа), Perissodactyla (Yang et al., 2003, 2004, Trifonov et al., 2008, наша работа) и Chiroptera (Volleth et al., 2002). Это свидетельствует о том, что эти перестройки возникли до отделения этих трех отрядов от их общего предка. Большинство элементов ПКК сохранились в неизменном виде в кариотипе гринды. 2.2. Кариотипические преобразования в отряде китопарнокопытных В нашей работе мы использовали филогенетическое древо, полученное Прайс с соавт. (Price et al., 2005), поскольку оно было построено с учетом данных по всем 290 современным видам. На основе этого древа мы построили возможный сценарий эволюции кариотипов для изученных видов. Перестройки хромосом, произошедшие в каждом семействе отряда китопарнокопытных, нанесены на филогенетическое древо (рис. 5). 2.3. Сложность установления филогенетических отношений внутри отряда китопарнокопытных на основе результатов хромосомного пэйнтинга Гомоплазии затрудняют реконструкцию филогенетических деревьев на основе перестроек хромосом. Недавно описанное явление гемиплазии, при котором полиморфные предковые хромосомы фиксируются одинаковым образом у неродственных видов (например, синтении HSA3/20 и HSA10q/17 у группы Afrotheria (Robinson et al., 2008), HSA16q/19q, HSA4/8/4 у непарнокопытных), вносит те же неточности, что и гомоплазия. Возможно, часть хромосомных перестроек, обнаруженных в кариотипах китопарнокопытных – например, синтения HSA3/21, присутствующая в кариотипах свиных и окапи в виде CDR1+CDR17, а у остальных – в виде двух отдельных элементов гомологичных CDR1 и CDR17 – могут являться гемиплазиями, а не гомоплазиями. При попытке построения филогенетического древа китопарнокопытных на основе перестроек хромосом с использованием принципа парсимонии семейство Cetacea оказывается базальным по отношению к Hippopotamidae+Pecora из-за 12 Рисунок 4. Схема реконструированного кариотипа предка китопарнокопытных. Соответствие блоков ПКК элементам кариотипов человека (HSA) и верблюда (CDR) указаны слева и справа, соответственно. 13 инверсий (на хромосомах CDR4/31, CDR21/13) и трех разрывов хромосом (CDR2, 21, 22, 23), присутствующих как в кариотипах бегемота, так и у группы Pecora, но не у гринды. Однако такая топология филогенетического древа противоречит многим экспериментальным данным (Montgelard et al., 1997; Arnason et al., 2000; Gatesy, 1997; Shimamura et al., 1997, Nikado et al., 1999, Lum et al., 2000). Согласно модели неравномерного распределения точек разрывов, в геномах млекопитающих есть районы с высокой и низкой частотой хромосомных перестроек (Pevzner , Tesler 2003, Bailey et al., 2004, Beck et al., 2006). Наличие «горячих точек», где разрывы и инверсии хромосом происходили более часто, чем в остальных районах хромосом, увеличивает вероятность возникновения одного и того же разрыва (или очень похожего) или инверсии в разных линиях . Что, по-видимому и наблюдается в кариотипах бегемота и группы Pecora. Мы обнаружили слияние CDR4+31(=HSA8/9), характерное для кариотипов всех видов китопарнокопытных, за исключением верблюжьих. С одной стороны, это может свидетельствовать в пользу базального положения верблюжьих, однако, с другой стороны, так же вероятно, что ассоциация CDR4+31 присутствовала в ПКК, но не сохранилась в кариотипах Camelidae. Согласно палеонтологическим и молекулярным датировкам, основные семейства китопарнокопытных отделились от общего ствола в течение 9−24 млн лет. Быстрая дивергенция основных групп китопарнокопытных с последующим накоплением перестроек в каждой линии, по-видимому, привела к отсутствию маркерных перестроек, которые бы позволили определить филогенетические отношения между семействами. Аналогичная ситуация с группой семейств Pecora. 2.4. Скорости хромосомной эволюции в отряде китопарнокопытных С начала формирования кариотипов древних верблюжьих (63 МЛН) до дивергенции современных видов (11 МЛН) (Stanley et al., 1994) произошло 14 перестроек, что соответствует 0.28П/МЛ. Кариотипы верблюдов и лам после отделения друг от друга не претерпели больше никаких межхромосомных перестроек и остаются консервативными последние 11 млн лет (Balmus et al., 2007), что схоже с темпами хромосомной эволюции кариотипов носорогов и тапиров Нового света. Период видимой остановки эволюции кариотипов внутри группы Pecora длится от образования предкового кариотипа этой группы до отделения Giraffidae, а затем проявляется у коровы после образования предкового кариотипа Bovidae. Скорости эволюции кариотипов группы Suina значительно выше. Для Cetartiodactyla наиболее быстрые темпы преобразования наблюдаются при формировании предкового кариотипа Suina (1.76П/МЛ). После дивергенции этой группы скорость фиксации перестроек у свиньи упала в семь раз, а у пекари в три раза. Предковый кариотип Pecora сформировался за относительно короткое время и также претерпел множественные перестройки (1.18П/МЛ). Затем, так же как и у Suina, после дивергенции скорость сильно понизилась (кроме Giraffidae). 14 15 Минимальные скорости перестроек для отряда Cetartiodactyla как раз наблюдаются в этот период у семейства Moschidae (0.07 П/МЛ, что близко к темпам эволюции Cetacea). Таким образом, можно заключить, что кариотипическоя эволюция в отряде китопарнокопытных характеризуется периодами быстрой и медленной фиксации перестроек. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Непарнокопытные (Perissodactyla) и китопарнокопытные (Cetartiodactyla) входят в состав группы плацентарных млекопитающих Laurasiatheria, филогенетические отношения внутри которой до сих пор точно не установлены. Степень родства между отрядами непарнокопытных и китопарокотыных также не выяснена. Дополнительное вовлечение представителей этих таксонов в филогенетические исследования позволит прояснить взаимоотношения не только внутри изучаемых отрядов, но и облегчит разрешение вопросов таксономии между отрядами внутри группы Laurasiatheria. Метод сравнительного хромосомного пэйнтинга является простым и в то же время мощным инструментом для сравнения кариотипов как близкородственных видов, так и отдаленных. Как и многие другие работы, наше исследование показало, что сочетание нескольких хромосомоспецифичных библиотек дает больше информации, особенно когда используются пэйнтинг-пробы мелких хромосом из кариотипов с высоким диплоидным числом. Использование пэйнтинг-проб человека, как внешнего вида, позволило нам не только связать наши результаты с данными других авторов в единую картину, но и проследить эволюцию кариотипов для практически всех ныне живущих видов отряда непарнокопытных и большей части семейств отряда китопарнокопытных, а также предложить предковые кариотипы для этих двух отрядов. С помощью сравнительного хромосомного пэйнтинга мы выявили сегменты гомологии между хромосомами как представителей семейства лошадиных (онагра, зебры Грэви, бурчелловой зебры), так и видов семейств тапировых (чепрачного тапира) и носороговых (чёрного и белого носорогов). Впервые для выявления консервативных сегментов хромосом непарнокопытных были использованы наборы пэйнтинг-проб чепрачного тапира и зебры Грэви. Наши данные, совместно с результатами, полученными Янгом с соавторами по семейству лошадиных (Yang et al., 2003, 2004), Трифоновым с соавторами по семейству носороговых (Trifonov et al., 2003) и тапировых (Trifonov et al., 2008), позволили впервые реконструировать возможный ПКН (предковый кариотип непарнокопытных), для которого характерны следующие ассоциации сегментов хромосом человека: HSA3/21, HSA12 /22(а), HSA12 /22(b), HSAl4 /15, HSA7 /16p, HSA8p/4, HSA1/10q, HSA5/19p. Эти же ассоциации (кроме двух последних, которые есть у китопарнокопытных) присутствуют и в кариотипах представителей группы отрядов Boroeutheria, а формирование ПКН шло за счет множественных разрывов. Варьирование диплоидного числа ПКН 2n=74-78 обусловлено возможным полиморфным статусом двух пар хромосом. 16 Феномен катастрофической эволюции, описанный для грызунов подотряда Myomorpha, гиббоновых и собачьих, как оказалось, свойственен кариотипам лошадиных, в особенности, хромосомам зебр. В их кариотипах произошли многочисленные тандемные и робертсоновские слияния предковых элементов, что, по-видимому, объясняется толерантностью к робертсоновскому полиморфизму и наличием мейотического драйва у самок, который способствует накоплению метацентрических хромосом в ходе эволюции. Яркую противоположность быстроизменяющимся кариотипам лошадиных представляют собой хромосомы носорогов и тапиров Нового света, которые практически не изменились со времен дивергенции отряда непарнокопытных. С использованием пэйнтинг-проб человека и верблюда мы исследовали кариотипы представителей пяти семейств китопарнокопытных. Объединив наши результаты с уже известными по еще четырем семействам (Adega et al., 2006, Balmus et al., 2007, Chi et al., 2005a, b, Huang et al., 2005, 2006), мы построили ПКК с 2n=52-54, который отличается от предложенного ранее отсутствием одной ассоциации. Молекулярные и морфологические данные показали, что отряд китопарнокопытных включает в себя китообразных, которые являются семейством, сестринским Hippopotamidae. Хотя нет перестроек, объединяющих кариотипы бегемота и кита, мы выявили ассоциацию HSA 8/9, которая характерна не только для Cetacea, но и для других семейств китопарнокопытных, исключая верблюжьих, что подтверждает объединение китообразных и парнокопытных в один таксон Cetartiodactyla. Кариотип гринды отличается удивительным консерватизмом и практически не изменился за время эволюции, сохранив все предковые ассоциации в неизмененном виде. Темпы кариотипической эволюции у китопарнокопытных ниже, чем обнаружено для семейства лошадиных, но наличие большого количества сложных внутрихромосомных перестроек и гомоплазий затрудняет филогенетический анализ и определение отношений между главными группами семейств этого отряда. ВЫВОДЫ На основании результатов сравнительного анализа кариотипов представителей всех основных таксонов из отрядов Cetartiodactyla и Perissodactyla с помощью методов традиционной и молекулярной (хромосомный пэйнтинг) цитогенетики: 1. Определена возможная структура предкового кариотипа отряда непарнокопытных, включающая 74-78 элементов. 2. Предложен возможный сценарий кариотипической эволюции непарнокопытных. Выявлены характерные перестройки для каждого семейства и вида. Установлены высокие темпы реорганизации геномов лошадиных (Equidae), сопоставимые с таковыми у мышевидных грызунов и собачьих. 3. Реконструирован вероятный предковый кариотип (2n=52-54) для девяти основных семейств Cetartiodactyla. 17 4. Обнаружена ассоциация HSA 8/9, объединяющая все семейства китопарнокопытных за исключением верблюжьих (Camelidae). Это может свидетельствовать в пользу базального положения семейства верблюжьих в отряде китопарнокопытных или означать присутствие этой синтении в предковом кариотипе Cetartiodactyla. 5. Обнаружено, что в кариотипах китообразных (Cetacea) и бегемотовых (Hippopotamidae) не сохранилось общих синапоморфных признаков. Кариотип обыкновенной гринды (Globicephala melas) практически не изменился в течение эволюции и близок к предковому кариотипу Cetartiodactyla. 6. Выявлены характерные перестройки для каждого семейства китопарнокопытных и показано, что темпы хромосомой эволюции группы семейств Suina (свиные и пекариевые) самые высокие в пределах отряда Cetartiodactyla. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Huang L., Nesterenko A., Nie W., Wang J., Su W., Graphodatsky A.S., Yang F. Karyotypic evolution of giraffes (Giraffa camelopardalis) revealed by cross species chromosome painting with Chinese muntjac (Muntiacus reevesi) and human (Homo sapiens) paints. // Cytogenet Genome Res. 2008. V. 122. P. 132-138. 2. Trifonov V.A., Stanyon R., Nesterenko A.I., Fu B., Perelman P.L., O’Brien P.C.M, Stone G, Rubtsova N.V., Houck M.L., Robinson T.J., Ferguson Smith M.A., Dobigny G., Graphodatsky A.S., Yang F. Multidirectional cross species painting illuminates the history of karyotypic evolution in Perissodactyla. // Chromosome Research. 2008. V. 16. P. 89-107. 3. Kulemzina A.I., Trifonov V.A., Perelman P.L., Rubtsova N.V., Volobuev V., Ferguson-Smith M.A., Stanyon R., Yang F., Graphodatsky A.S. Cross-species chromosome painting in Cetartiodactyla: reconstructing the karyotype evolution in key phylogenetic lineages. // Chromosome Research. 2009. V.17. P.419-436. 18