Перевод № 7120
advertisement
-2ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ ЖИВОТНЫХ» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Перевод № 7120 Автор(ы): Carolina Cubillosa, Silvia Gómez-Sebastianb, Noelia Moreno и др. Заглавие: African swine fever virus serodiagnosis: A general review with a focus on the analyses of African serum samples Перевод заглавия: Обзор по серодиагностике вируса африканской чумы свиней, в частности анализ образцов сыворотки из Африки. Источник: Статья из журнала: Virus Research. – April 2013. – Vol. 173, Issue 1, P. 159–167. Электронный ресурс: URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016817021200 4108 Переводчик: Якупов М.Р. Редактор: Фраймович Л.К. ВЛАДИМИР 2014 -3- РЕЗЮМЕ Африканская чума свиней (АЧС) – инфекционная болезнь, которая вызывает высокую смертность у домашних свиней. В настоящее время нет вакцины против АЧС, и мероприятия по ликвидации этого заболевания в стране, где оно протекает эндемически, основаны только на компетентных программах диагностики и уничтожения инфицированных животных. Из-за наличия естественно аттенуированных штаммов условия течения инфекции могут привести к снижению смертности. В таких ситуациях заболевание можно диагностировать по наличию специфических антител. Использование классических и признанных диагностических методов, таких, как иммуноферментный анализ (ИФА), непрямой иммунофлюоресцентный анализ или иммуноблоттинг, позволило ликвидировать АЧС на Пиренейском полуострове в 1990-х годах. Однако при условии, что традиционные тесты включают использование антигенов, полученных из клеток, инфицированных вирусом АЧС, эти антигены имеют несколько недостатков, например трудность в достижении стандартизации, а также риски, связанные с манипуляцией живым вирусом. Такие недостатки привели к разработке альтернативных и более надежных систем производства антигенов для обнаружения антител к вирусу АЧС. В настоящем обзоре авторы приводят новые сведения об антигенах для серодиагностики АЧС, о значительных успехах, достигнутых в получении рекомбинантного антигена и об усовершенствовании методов серодиагностики АЧС. Более того, они описывают точность метода ИФА, разработанного для серодиагностики АЧС в Африке. Этот анализ основан на новом рекомбинантном белке p30r, полученном из восточноафриканского изолята вируса (штамм MORARA), который при секвенировании показал 100% сходство по аминокислотам с вирусным изолятом Georgia. В этой работе исследовали 587 полевых сывороток, отобранных от домашних свиней и бородавочников в Сенегале (Западная Африка), Демократической Республике Конго (Центральная Африка), Мозамбике (Юго-Восточная Африка) и в Южной Африке. Результаты показали, что ИФА на основе нового рекомбинантного белка р30r позволяет точно выявлять антитела против вируса АЧС, независимо от географического происхождения сывороток. -4- 1. Введение Классифицируемая Международным эпизоотическим бюро (МЭБ) как болезнь, подлежащая обязательной регистрации, африканская чума свиней (АЧС) – это высококонтагиозное заболевание домашних и диких свиней, причиняющее большой экономический ущерб свиноводству в неблагополучных странах. Кроме того, в Африке, где болезнь протекает эндемически, в большинстве стран, южнее Сахары, АЧС также создает серьезную угрозу безопасности продуктов питания, ограничивая доступность важного источника белка для населения (Costard et al., 2009). Поскольку нет вакцины против АЧС, обнаружение специфических антител против вируса является показателем истории инфекции или текущей инфекции только в том случае, если наличие антител совпадает с наличием жизнеспособного вируса. Следовательно, быстрые методы серодиагностики могут способствовать полной ликвидации болезни в некоторых неблагополучных районах. Например, стратегия ликвидации АЧС на Пиренейском полуострове была основана на обнаружении и поголовном убое серопозитивных свиней. Эту стратегию нельзя рекомендовать для Африки, где страны не в состоянии компенсировать отбракованных свиней. Однако в этих районах ценные высокочувствительные и высокоспецифические серологические тесты должны улучшить понимание этой болезни, что позволит идентифицировать районы высокого риска, а также разработать соответствующие рекомендации по предупреждению болезни. Вирус АЧС вызывает скрытые персистентные инфекции у естественных хозяев, а именно: у бородавочников (Phacochoerus africanus), кистеухих свиней (Potamochoerus porcus, P. larvatus) и мягких клещей (Ornithodoros moubata) (Anderson et al., 1998; Kleiboeker et al., 1999). У домашних свиней АЧС была первоначально описана как инфекция, вызывающая острую геморрагическую лихорадку, приводящую к гибели всех инфицированных животных. Однако слабовирулентные изоляты появились во время циркуляции вируса у домашних свиней, поэтому увеличилось превалирование подострых и скрытых инфекций (De Kock et al., 1940; Mebus and Dardiri, 1980; BechNielsen et al., 1995; Penrith et al., 2004). Обычно у переболевших свиней развиваются антитела против вируса АЧС на 7-10 дни после инфекции, которые сохраняются в течение длительного времени. Следовательно, обнаружение специфических антител -5- против вируса АЧС следует выполнять для диагностики подострой и скрытой форм болезни. В связи с этим в настоящем обзоре придается особое значение современным сведениям о серологических тестах на АЧС и иммунодетерминантным антигенам, используемым в борьбе с заболеванием. Успехи, достигнутые в этих областях, могут существенно повлиять на разработку более надежных и точных серологических методов диагностики АЧС. Более того, авторы описывают точность ИФА, основанного на новом рекомбинантном белке р30r, полученном из вирусного изолята Восточной Африки (Мадагаскар) для серодиагностики АЧС в Африке и, возможно, в Европе. Образцы сыворотки от домашних и диких свиней, отобранные в Сенегале (Западная Африка), Демократической Республике Конго (Центральная Африка), Мозамбике (Юго-Восточная Африка) и в Южной Африке, были успешно проанализированы с помощью этого ИФА. Метод, основанный на новом рекомбинантном белке р30r, позволил точно определить антитела против вируса АЧС, независимо от географического происхождения сывороток. Это имеет особую значимость, если принять во внимание, что изоляты вируса АЧС из Европы и Западной Африки близкородственны друг другу (I генотип), в то время как изоляты из Южной и Восточной Африки более разнообразны (21 различный генотип). 2. Серодиагностика АЧС на основе белков Знание белкового состава вирионных структур вируса АЧС играет важную роль, потому что некоторые белки имеют иммунологическую значимость. Кроме того, определение наиболее антигенных вирусных белков очень важно для усовершенствования серологических методов диагностики. Вирус АЧС является ДНК – содержащим единственным арбовирусом и единственным членом семейства Asfarviridae (Dixon et al., 2011). Вирус АЧС - это крупный вирус, который показывает тропизм к макрофагам и моноцитам, где он индуцирует около 100 полипептидов (Alcaraz et al., 1992). Около 40 таких молекул, как сообщают, включены в вирусную частицу (Carrascosa et al., 1985). Вирусная ДНК кодирует ряд новых генов, не присутствующих в других вирусных семействах. Способность вируса АЧС персистировать в организме переболевших естественных хозяев и домашних свиней, и возможность животных носить низковирулентные изоляты показывает, что вирус имеет -6- эффективные механизмы ускользания от иммунных защитных систем (Dixon et al., 2004). Ядро вириона состоит из нуклеоида, заключенного в белковый слой (оболочку ядра), который содержит несколько вирусных белков (Andrés et al., 1997, 2002). Вокруг ядра находятся два липидных двойных слоя, называемых внутренней мембраной и наружной мембраной – капсидом. Дополнительно полная или разрушенная мембрана, полученная в результате бадинга вируса, может быть обнаружена в вирусной частице. Основным компонентом вирусного капсида является белок р72, один из первых вирусных белков, идентифицированный как ответственный за индукцию антител после естественной инфекции (Tabarés et al., 1980). Разработка процесса полуочистки этого белка от вирусных частиц впервые привела к использованию ИФА для скрининга антител, тем самым снизилось количество ложных положительных результатов, полученных с ранее разработанными антигенами (Tabares et al., 1981). Кроме того, эти два структурных белка р30 (также номинированный как р32) и р54 были точно идентифицированы как высокоантигенные во время инфекции (Pastor et al., 1989; Afonso et al., 1992; Alcaraz et al., 1990, 1995; Oviedo et al., 1997; Kollnberger et al., 2002; Gallardo et al., 2006). Более того, антитела против этих трех белков участвуют в нейтрализации вируса, препятствуют прикреплению (р72 и р54) и поглощению вируса клетками (р30) (Borca et al., 1994; Gómez-Puertas et al., 1996, 1998). Однако, несмотря на потенциал р72, р54 и р30 для серодиагностических целей, этих белков вируса АЧС недостаточно для опосредованной защиты антителами против различных штаммов вируса (Gómez-Puertas et al., 1998; Neilan et al., 2004). Распознавание белков р54 и р30 вируса АЧС полевыми свиными сыворотками, собранными в Испании, сравнили с таковым полипротеина рр62 (продуцируемого геном СР530R) (Gallardo et al., 2006). Сыворотки от инфицированных свиней распознавали все три рекомбинантных белка (р54 r, р30r, рр62r) в иммуноблоттинге (ИБ). Антигенная реакционная способность этих трех белков была обнаружена, когда их использовали как антигены ИФА. Для достижения оптимальных сигналов в этой реакции необходимо растворить р54 в 7М мочевине. Это наблюдение свидетельствует, что антитела, индуцируемые против этого белка во время инфекции, распознают главным образом линейные эпитопы. Полипротеин рр62r – это белок-предшественник зрелых продуктов р35 и р15, то есть структурных белков, локализованных в оболочке -7- ядра (Andrés et al., 2002). Неопубликованные данные из лаборатории авторов этой статьи идентифицируют р15 как зрелый белок, ответственный за антигенность рр62r. Интересно с точки зрения серодиагностики АЧС распознавание рр62 сыворотками от свиней, инфицированных вирусом АЧС, продолжалось даже в плохо сохранившихся образцах, в то время как меньшая реактивность наблюдалась против р30 и р54 (Gallardo et al., 2006). Эти результаты, возможно, означают, что антитела против рр62 более стабильны или показывают более высокое родство, чем другие. Чтобы подтвердить эту гипотезу, необходимо поставить больше опытов с полевыми сыворотками. Это свойство рр62, возможно, очень полезно для того, чтобы преодолеть один из недостатков использования препаратов, не очищенных от инфицированных клеток, в качестве антигенов ИФА, а именно, отсутствие аналитической надежности для плохо сохранившихся образцов (Arias et al., 1993). Обнаружение других новых серологических иммунодетерминант вируса АЧС было достигнуто путем скрининга вирусной библиотеки экспрессирующих последовательностей кДНК изолята вируса АЧС Ва71V при использовании иммунных антисывороток от инфицированных домашних свиней и от кустарниковых свиней (Kollnberger et al., 2002). В этом исследовании идентифицировали 14 вирусных открытых рамок считывания, кодирующих антигенные эпитопы вируса. Пять из них соответствуют следующим предварительно идентифицированным структурным белкам: р30 (CP204L), р54 (E183L) и р72 (B646L), бактериальному гистоноподобному белку (A104 R) и р10 (K78R). Кроме того, три неструктурных (F334L, K196R and NP419L) и четыре неустановленных белка (B602L, C44L, Cp312R and K205R) также показали значительную реактивность с иммунными антисыворотками. Выраженная реакция конвалесцентной свиной сыворотки была описана против белка, полученного путем трансляции открытой рамки считывания гена В602L in vitro (Irusta et al., 1996). В продольном анализе ответа антител против 12 упомянутых выше рекомбинантных белков при использовании сывороток от экспериментально зараженных свиней высокие и устойчивые титры антител были подтверждены против 4 из них: р54, K205R, A104R и B602L (Reis et al., 2007). Впоследствии антигенность этих рекомбинантных белков была также подтверждена при тестировании сыворотки от свиней, естественно инфицированных вирусом АЧС (Gallardo et al., 2009). -8- 3. Традиционные процедуры производства антигена вируса АЧС и виды серологических анализов Одним из самых первых серологических анализов, используемых для лабораторной диагностики АЧС, был иммуноэлектроосмофорез (ИЭОФ) (Pan et al., 1972). Этот анализ был гораздо более чувствительным, чем тест двойной диффузной преципитации на агаровом геле, и даже более чувствительным, чем реакция связывания комплемента (Ferris et al., 1980), вскоре он был принят в качестве скринингового теста. Обычный (традиционный) антиген, используемый в ИЭОФ, получали из экстрактов Vero клеток, инфицированных вирусом АЧС (Pan et al., 1974). Тем не менее, при инфекционных заболеваниях, где диагностика основана на определении антител для подтверждения положительных реакций, обычно требуются подтверждающие тесты, особенно при использовании неочищенных антигенов. В связи с этим в прошлом в стратегии серодиагностики АЧС использовали ИЭОФ как скрининг-тест, а метод непрямой иммунофлюоресценции - для подтверждения положительных реакций (Botija, 1970; Pan et al., 1974). Этот подтверждающий тест проводят на культурах клеток, в которых только 10-20% клеток инфицированы вирусом. Следовательно, типичные положительные реакции можно рассматривать как флюоресцирующие внутриклеточные тельца, которые соответствуют наличию вируса. Положительные и ложные положительные реакции можно легко различить при анализе свиной сыворотки на инфицированных и не инфицированных клеточных культурах. Хотя эти методы сыграли решающую роль в серодиагностике и искоренении АЧС (Pan et al., 1974), они были трудоемки, и их было трудно применять при массовых исследованиях. Поэтому ИЭОФ был вскоре заменен иммунным ферментным анализом (ИФА), считавшимся тогда самым чувствительным и подходящим методом для исследования большого количества сывороток. Это самый широко распространенный метод для диагностики подострой формы инфекции и скрытых вирусоносителей (Wardley et al., 1979; Tabares et al., 1981; Pastor et al., 1990). ИФА обладает более высокой чувствительностью, чем ИЭОФ, хотя в обоих тестах качество антигенного препарата -9- влияет на конечную чувствительность и специфичность метода. Действительно, использование неочищенных антигенов в ИФА, например описанных для ИЭОФ, не обеспечивало достаточную специфичность, что не позволило считать его традиционным методом диагностики АЧС. Итак, Tabares и др. (1981) описали приготовление полуочищенного основного капсидного белка VP73 (р72) вируса АЧС, который значительно повышал надежность ИФА при использовании его в качестве антигена. Впоследствии производство антигена для ИФА было усовершенствовано, чтобы сделать этот метод экономически приемлемым для крупномасштабных исследований. В настоящее время цитоплазматически растворимый антиген, используемый в этом тесте (Escribano et al., 1989), получают из MS клеток (клеточная линия почки обезьяны), выращенных в присутствии свиной сыворотки, инфицированной изолятом вируса АЧС, прошедшим 48 пассажей на клетках MS. Использование сывороток свиней в клеточных культурах вместо сывороток КРС предотвратило контаминацию антигена альбумином сыворотки КРС, что было главным фактором, ответственным за ложные положительные реакции в ИФА до тех пор (Escribano et al., 1989). Растворимую белковую фракцию инфицированных клеток готовят путем разрушения клеток, элиминации ядер и седиментации клеточных осколков на 20% - ной (вес\вес) сахарной подушке. Супернатант над слоем сахарозы используют в ИФА в качестве антигена. Этот неочищенный антиген в настоящее время рекомендуют в качестве обнаруживающего реактива для скрининга в международной торговле (OIE, 2012). Несмотря на чувствительность ИФА, одним из недостатков продолжает оставаться число ложных положительных реакций на полевых сыворотках и стандартизация метода в лабораториях. Вследствие этих недостатков положительные образцы сыворотки требуется подтверждать вторым серологическим тестом. Хотя реакцию непрямой иммунофлюоресценции можно использовать для этой цели, ее заменили иммунноблоттингом (ИБ), который обладает повышенной специфичностью и чувствительностью, аналогичной чувствительности ИФА. Кроме того, было показано, что сыворотки теряли реактивность в ИФА раньше, чем в ИБ (распознавание линейных эпитопов вместо конформационных), что позволило усовершенствовать обнаружение антител в плохо сохранившихся сыворотках (Arias et al., 1993). Более того, ИБ - 10 - представляет простую и объективную интерпретацию результатов (Pastor et al., 1989; Alcaraz et al., 1990; OIE, 2012). Эту реакцию ставят с таким же антигеном, как и в ИФА, и с антигеном, описанным выше. Антигенные белки растворяют в 17% - ном акриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. Полоски, длиной примерно 4 см, содержащие белки 23 - 35 кДа, представляют собой антигенные полоски, используемые для отдельных образцов сыворотки. Этот тест имеет дополнительное преимущество в том, что фильтровальные полоски показывают стабильность на протяжении всего периода хранения и транспортировки при комнатной температуре в сухой атмосфере. Не наблюдается потери реактивности у перенесенных белков в течение 6 месяцев (Pastor et al., 1989). Другим подтверждающим тестом – альтернативой непрямой иммунофлюоресценции и ИБ является непрямой иммуно – пероксидазный метод окрашивания по бляшкам (IIPS) (Pan et al., 1982). Чувствительность и специфичность этого метода сравнима с таковой метода напрямой иммунофлюоресценции, но он более пригоден для крупномасштабных анализов. Несмотря на удовлетворительное исполнение классических реакций, описанных здесь (на основе использования индуцируемых вирусом белков в инфицированных клетках в качестве антигенного реактива), у них есть несколько недостаков, например стандартизация методов и необходимость манипулировать инфекционным возбудителем; при этом обязательно строгое соблюдение правил биобезопасности для патогенов 3 и 4 группы (OIE, 2012). 4. Серологические тесты с использованием рекомбинантных белков для диагностики АЧС Достижения молекулярной биологии позволили значительно улучшить возможности селекции и производства иммунореагентов и их применения для разработки новых методов. В этом отношении в последние годы научные исследования были направлены на разработку рекомбинантных антигенов, предназначенных для серологических диагностических исследований АЧС. Использование рекомбинантных белков как реагентов имеет много преимуществ по сравнению с антигенами, приготовленными на основе инфицированных вирусом клеток. В случае с вирусом АЧС использование рекомбинантных белков исключает необходимость манипулировать потенциально опасным живым вирусом и позволяет - 11 - стандартизировать и повысить производство белков. Кроме того, эти антигены улучшают однородность результатов, получаемых в лабораториях, и могут повысить чувствительность и специфичность, снизить таким образом ложные положительные реакции, продуцируемые веществами клеточной культуры, которые контаминируют антигены (Escribano et al., 1989). В некоторых случаях, например в ИБ, рекомбинантные антигены также облегчают интерпретацию результатов диагностики (Alcaraz et al., 1995). Рисунок 1. Анализ последовательностей рекомбинантного белка р30 изолятов Morara/Georgia и E70 вируса АЧС. (А) Выравнивание последовательностей р30, полученных из двух изолятов вируса АЧС. Остатки, в которых они отличались, указаны стрелкой. Количество остатков также указывается в скобках. (В) Корреляция между антигенностью, структурой и изменчивостью в белках р30 двух изолятов вируса АЧС. Графики показывают изменения антигенного индекса в зависимости от положения аминокислоты для испанского Е75 и африканского изолятов MALAGASY. Горизонтальные черные полосы указывают регионы прогнозируемого внутреннего расхождения. Было описано много потенциально полезных вирусных белков (кандидатов для диагностики), однако лишь небольшое число было проверено и утверждено для различных методик. Одним из первых рекомбинантных анализов, описанных для вируса АЧС, был вестерн-блоттинг, подтверждающий положительные результаты, полученные при обнаружении антител к вирусу АЧС в ИФА (Alcaraz et al., 1995). Этот подтверждающий тест был основан на использовании белка р54, экспрессированного в Escherichia coli и соединенного с N концом MS2 полимеразы. Рекомбинантный вариант - 12 - вестерн-блоттинга был высоко специфичен и в равной степени чувствителен для обнаружения свиней с антителами к вирусу АЧС, как и традиционный вестерн-блоттинг с использованием неочищенных антигенов, полученных из описанных выше инфицированных клеток. Такая прокариотная экспрессия Е. coli была использована Reis и др. 2007 для получения 12 вирусных белков, ранее идентифицированных как серологические мишени (Kollnberger et al., 2002). Образцы сывороток от свиней, экспериментально инфицированных слабопатогенным изолятом вируса АЧС, взятые в различные дни после инфицирования, были проанализированы в ИФА с использованием этих 12 рекомбинантных белков отдельно. Напряженный иммунный ответ был установлен на 4 из них (p54, гистоноподобный, pK205R и pB602L). Все они показали 100% чувствительность на 21-й день после инфицирования. Интересно заметить, в этом исследовании установили, что рекомбинантный белок р73, экспрессированный в бактериях, не является адекватной серологической мишенью для серодиагностики вируса АЧС, так как он не смог выявить серологически положительных свиней со скрытыми симптомами. Пригодность этих 4 белков, кандидатов для диагностики, была в дальнейшем оценена на европейских и африканских полевых сыворотках свиней (Gallardo et al., 2009). ИФА на основе очищенных рекомбинантных белков, полученных из Е. coli, оказался эффективным для анализа свиных сывороток из Европы при использовании р54 и pB602L в качестве антигенов, чувствительность и специфичность составляли 95 и 98% соответственно. Следовательно, эти ИФА на основе рекомбинантных белков ставили так же, как и диагностический метод, одобренный МЭБ (традиционный ИФА + подтверждение вестерн-блоттингом). Серологическая дифференциация полевых изолятов вируса АЧС невозможна из-за отсутствия различных серотипов. Однако вариабельность последовательностей, наблюдавшаяся среди вирусных изолятов различного географического происхождения, может повлиять на распознавание специфических антигенов в серологических тестах. Точный отбор антигенов вируса АЧС с низким уровнем антигенной вариабельности среди вирусных изолятов есть предпосылка для использования их в серологических реакциях. Несмотря на то, что ограниченное число положительных сывороток из - 13 - Западной Африки было исследовано, 9 положительных образцов, идентифицированных рекомендуемыми МЭБ тестами в этом опыте, были подтверждены в ИФА на основе рекомбинантных белков р54 и pB602L. При условии их выполнения, эти методы на основе рекомбинантных белков можно также применять для тестирования образцов сывороток из Западной Африки. Что касается сывороток из Восточной Африки, поскольку очень мало АЧС-положительных образцов было проанализировано в этих ИФА на основе рекомбинантных белков, чувствительность данного теста не подсчитывали (Gallardo et al., 2009). Однако частота обнаружения положительных сывороток в этих реакциях была ниже, чем в рекомендуемых МЭБ тестах. Этот вывод, возможно, говорит о том, что эти ИФА на основе рекомбинантных белков показывают неприемлемую чувствительность при диагностике образцов из Восточной Африки. В дополнение к анализам образцов сыворотки свиней, исследование сывороток, отобранных от диких животных, например бородавочников (Phacochoerus africanus), представляет особый интерес для Восточной и Южной Африки, где дикие животные являются резервуаром вируса АЧС. Следовательно, борьба с этим заболеванием у бородавочников весьма релевантна для контроля за спорадическими вспышками у домашних свиней, побывавших в контакте с этими дикими животными, и для определения статуса заражения бородавочников вирусом АЧС, где лесной цикл играет решающею роль в эпидемиологии болезни (Lubisi et al., 2005; Jori and Bastos, 2009). Небольшое количество образцов от бородавочников, собранных в Уганде, было исследовано в ИФА на основе рекомбинантных белков с использованием белков, экспрессированных в Е. coli. Всего 23 из 26 положительных сывороток, идентифицированных в рекомендуемых МЭБ тестах, были также положительными в ИФА на основе рекомбинантных белков В602L и р54 (Gallardo et al., 2006). Эти результаты противоречат низкой чувствительности, установленной при тестировании сывороток от домашних свиней из Восточной Африки. Это расхождение, возможно, связано с отдельными генотипами вируса АЧС, ответственными за выработку антител. Изоляты вируса АЧС, относящиеся к IX генотипу, были зарегистрированы в Уганде (Gallardo et al., 2009), тогда как главным образом II генотип зарегистрирован в Мозамбике во время вспышек 1998 - 2005 гг. (Bastos et al., 2004; Lubisi et al., 2005). - 14 - Следовательно, если бы эту гипотезу подтвердили, то результаты ИФА на основе рекомбинантных белков говорили бы о том, что антигенность белков В602 L и р54 консервативна в изолятах вируса АЧС с IX генотипом, но не в изолятах с генотипом II. Эукариотные системы, например рекомбинантная система бакуловируса и клеток насекомых, обеспечивает альтернативную систему для производства рекомбинантных антигенов. Преимущество этой системы экспрессии по сравнению с Е. coli состоит в том, что белки, вероятно, должны продуцироваться в нативной конформации, так как они могут после трансляции модифицировать белки, которые экспрессируются эффективно. Белки вируса АЧС р30, р54 (Oviedo et al., 1997; Gallardo et al., 2006) и полипротеин рр62 (Gallardo et al., 2006) были получены как рекомбинантные антигены, экспрессированные в клетках насекомых (Sf9 или Hi5 клетки) с использованием системы экспрессии бакуловируса. Эти рекомбинантные белки были использованы в ИФА и вестерн-блоттинге для обнаружения антител к вирусу АЧС в сыворотках от экспериментально зараженных свиней и в полевых сыворотках от европейских серологически положительных животных со скрытой инфекцией. Эти анализы показали, что ИФА на основе рекомбинантных белков р30, р54 и рр62 с использованием белков, экспрессированных в системе бакуловирусов, были высоко эффективны для серодиагностики АЧС, чувствительность и специфичность составляли 96-99%. Более того, в соответствии с результатами, полученными с использованием белков р54 и рВ602L, экспрессированных в Е. coli (Gallardo et al., 2009), ИФА с использованием рекомбинантных белков р30, р54 и рр62, экспрессированных системой бакуловируса, показали более высокую чувствительность по сравнению с традиционной рекомендуемой МЭБ ИФА (на основе клеточных экстрактов инфицированных клеток) для анализа плохо сохранившихся образцов (Gallardo et al., 2006). Следовательно, использование этих экспрессированных в системе бакуловируса белков в качестве реагентов в ИФА снижает количество ложных положительных реакций, что обеспечивает более точную диагностику. Использование насекомых в качестве живых биофабрик – рентабельная альтернатива производству белка в клетках насекомых в системе бакуловируса (Barderas et al., 2000; Pérez-Filgueira et al., 2007). Это весьма релевантно для развивающихся стран. Производство гетерологичных белков с помощью комбинаций - 15 - систем рекомбинантного бакуловируса и личинок насекомых Trichoplusia ni (T. ni) было признано усовершенствованной технологией системы экспрессии бакуловирусов (IBES®technology), что является одной из лучших производственных альтернатив на основе векторов бакуловируса. Эту недорогую платформу использовали для эффективного получения нескольких рекомбинантных антигенов в качестве диагностических реагентов для других заболеваний (Gomez-Sebastian et al., 2008; PérezMartín et al., 2008; Encinas et al., 2011; Todolí et al., 2009). Более того, рекомбинантный белок р30 для АЧС очень высокого качества был получен по технологии IBES®technology (Barderas et al., 2000; Pérez-Filgueira et al., 2006). Методы ИФА и иммуноблоттинг были утверждены с использованием экстрактов насекомых, содержащих рекомбинантный белок р30 без дальнейшей очистки. Рекомбинантный белок р30, полученный с помощью насекомых, показал очень низкий уровень фоновой реактивности при использовании в качестве реактива в ИФА, что позволяет провести точные различия между положительными и отрицательными сыворотками и снизить количество ложных положительных реакций (Pérez-Filgueira et al., 2006). Эти результаты контрастируют с результатами, полученными при использовании рекомбинантного белка р30, экспрессированного в E. сoli, который создавал очень высокую фоновую реактивность даже при использовании белка высокой степени очистки (Reis et al., 2007). Процессы очистки значительно повышают стоимость производства любого белка и приводят к большой потере выхода рекомбинантного белка. От одной инфицированной личинки насекомого можно получить достаточное количество реагента рекомбинантного белка р30 для выполнения более 40 000 исследований в ИФА и 2 000 подтверждений в иммуноблоттинге (Pérez-Filgueira et al., 2006). ИФА на основе рекомбинантного белка р30, полученного в личинках трихоплюсии, была утверждена тестированием полевых сывороток от больных АЧС свиней из Испании. Этот анализ показал чувствительность 98.2 %; эта величина аналогична таковой традиционного ИФА, рекомендованного МЭБ (Escribano et al., 1989). Однако специфичность такого рекомбинантного белка была значительно лучше по сравнению с традиционным ИФА (97,4 % против 87,8 %). - 16 - 5. Точность ИФА на основе р30r штамма Morara/Georgia для серодиагностики африканских сывороток различного географического происхождения ИФА на основе рекомбинантного белка р30, полученного в личинках, также ставили с образцами сывороток из Африки. Рекомбинантные белки р54 и pB602L (Gallardo et al., 2009) и рекомбинантный белок р30, полученный в личинках, происходили из испанского изолята. Рекомбинантный белок р30, полученный в личинках, был точным с ограниченным числом сывороток из Западной Африки, но работал с меньшей эффективностью с образцами из Восточной Африки (Pérez-Filgueira et al., 2006). Сравнение последовательностей р30 испанских изолятов и изолятов из Западной, Южной и Восточной Африки показало, что данные идентичности снижались с Запада на Восток, а изоляты из Южной Африки находились между этими двумя показателями (Pérez-Filgueira et al., 2006). Эти результаты, возможно, указывают на то, что антигенные расхождения в отношении р30 ответственны за отчетливое исполнение ИФА на основе рекомбинантного белка р30 для африканских сывороток различного географического происхождения. На основе этих результатов авторы получили дополнительную версию рекомбинантного белка р30 из изолята вируса АЧС, более отдаленного от I генотипа (европейские, южноамериканские, карибские и западноафриканские изоляты), и использовали его как антиген в ИФА. Авторы отобрали ген CP204L, кодирующий белок р30 вируса АЧС штаммов Morara и Georgia (Morara/Georgia). Последовательности ДНК генов CP204L изолятов Morara/Georgia и испанского (Е70) вируса АЧС были транслированы, а выравнивание и подсчёт идентичности проводили с помощью программы Clustal-W program (European Bioinformatics Institute). Профили антигенной последовательности были определены с использованием алгоритма, описанного Hopp and Wood (1981), тогда как характер гидропатичности был проанализирован с помощью ProtScale tool по шкале Kyte and Doolittle scale (Kyte and Doolittle, 1982). Последовательность аминокислот этих двух белков р30 (Morara/Georgia and E70) показала высокую степень идентичности (97%). Однако белок р30 Morara/Georgia имел 3 аминокислотные замены по сравнению с белком испанского изолята. Эти изменения - 17 - были обнаружены в позициях 67 (Histidine на Arginine), 131 (Glutamic на Valine) и 172 (Histidine на Tyrosine) (Рис. 1A), и они вызывали изменения в характере гидропатичности рекомбинантного белка р30 африканского изолята (Рис. 1B). Ген CP204L изолята Morara/Georgia, который кодирует белок р30, был амплифицирован из плазмиды, любезно предоставленной Drs. E. Albina и V. Michaud (CIRAD, Montpellier, France). Этот ген был клонирован в системе pFastBac1TM (Invitrogen) под контролем промотора полиэдрина для высокой экспрессии белка, а рекомбинантный бакуловирус был получен по системе Bac to BacTM (Invitrogen). Полученный в результате бакуловирус, содержащий ген, кодирующий белок р30 штамма Morara/Georgia, был использован для экспрессии рекомбинантного белка по системе IBES®technology. Рекомбинантный белок p30r штамма Morara/Georgia был эффективно экспрессирован в личинках трихоплюсии и накоплен в зависимости от дозы и времени в инокулированных насекомых (данные не представлены), как было описано ранее для рекомбинантного белка р30 испанского изолята Е70 (Pérez-Filgueira et al., 2006). Суммарные экстракты рекомбинантного белка р30, полученные из личинок, инфицированных бакуловирусом, экспрессирующим белок р30, выделенные из вирусных штаммов Е70 и Morara/Georgia, были проанализированы с помощью электрофореза в SDS-PAGE. Оба рекомбинантных белка были четко идентифицированы в виде одной полосы в гелях, окрашенных голубым кумасси, с незначительной разницей электрофоретических половин, но обе половины были ожидаемого размера 30 кДа (Рис. 2A). Эту четкую электрофоретическую подвижность рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia можно было отнести к его высокой гидропатичности. Оба белка р30 реагировали с пулом сывороток от свиней, серологически положительных к вирусу АЧС, при применении их в качестве зонда в вестерн-блоттинге (Рис. 2B). Суммарные экстракты растворенного белка в личинках насекомых были получены в основном, как описано Pérez-Filgueira et al. (2006) (подробности в приложении), и исследованы с целью показать усовершенствование серодиагностики АЧС в африканских странах, которые адаптировали имеющиеся в настоящее время методы выявления этой болезни. Исходную панель из 92 образцов сывороток свиней из Мозамбика тестировали методами, рекомендованными МЭБ (ИФА и ИБ) как золотой стандарт, и в ИФА на - 18 - рекомбинантном белке р30 как штамма Morara/Georgia, так и Е70 для сравнения производительности двух последних. Двадцать один образец из 92 был классифицирован как положительный на АЧС в рекомендованных МЭБ тестах. Сыворотки свиней из Мозамбика не показали значительной фоновой реактивности против экстрактов белка контрольных (неинфицированных) личинок (ОП > 2), как это также было обнаружено для образцов сывороток из Испании. Поэтому результаты были выражены как соотношение между средней ОП, полученной для каждого образца, против положительного антигена (белок р30) и отрицательного антигена (экстракты из личинок) (подробности о процедурах ИФА даны в приложении). При соотношении ОП 2,5 в качестве предельного уровня, 21 из 92 сывороток от свиней была серологически положительной в ИФА с рекомбинантным белком р30 штамма Morara/Georgia, тогда как только 19 сывороток были серопозитивными в ИФА с р30 штамма Е70 (данные не представлены). Более того, 2сероположительных образца из 19, обнаруженные в ИФА с рекомбинантным белком р30 штамма Е70, находились в предельном интервале. Все положительные результаты в ИФА были подтверждены в вестерн-блоттинге на основе р30 (данные не представлены). Результаты сравнительных исследований ИФА на основе рекомбинантных белков р30 и рекомендованных МЭБ тестов показали, что специфичность этих рекомбинантных белков (штаммы Morara/Georgia и Е70) для анализа сыворотки от свиней из Мозамбика была эквивалентна. Однако были установлены различия между рекомбинантными белками штаммов Morara/Georgia и Е70 относительно чувствительности, которая была немного ниже в ИФА с р30 штамма Е70 (серопозитивные результаты - 90,4%), чем в ИФА с р30 штамма Morara/Georgia (выявлено 100% серопозитивных результатов). Результаты, полученные в ИФА с р30 штамма Morara/Georgia на отрицательных сыворотках из Мозамбика, были выражены как соотношение ОП и показаны на рис. 3. - 19 - Рисунок 2. Производство рекомбинантного белка р30 Morara/Georgia в личинках трихоплюсии. Экстракты суммарного белка из личинок, инфицированных бакуловирусом Васр30, в которых экспрессируются белки р30 штаммов Morara/Georgia и Е70, были проанализированы с помощью (А) окраски кумасси бриллиантовым синим в геле SDS-PAGE и (В) в вестерн-блоттинге с использованием положительного контроля свиной сыворотки в качестве зонда. Красные стрелки указывают на положение рекомбинантного белка р30. Рисунок 3. Обнаружение АЧС-специфических антител в пробах сыворотки от свиней из Мозамбика в ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia. Соотношение распределения ОП МЭБ АЧС-положительной (красный квадрат слева) и отрицательной (синий квадрат справа) сывороток приведены в разных квадратах. Каждая точка соответствует среднему показателю дубликатов анализа индивидуального образца. Пограничное значение показано в виде пунктирной линии. Центральный блок представляет значения от низшего к верхнему квартилю (25 – 75 процентиль). Средняя линия показывает медиану, а вертикальная линия проходит от минимального до максимального значения. Среди серопозитивных сывороток, обнаруженных в утвержденных МЭБ тестах, наивысшее значение составляло 9,8. - 20 - Характеристики ИФА с рекомбинантным белком р30 штамма Morara/Georgia для серологической диагностики АЧС в образцах из Мозамбика были подсчитаны по результатам этого теста с помощью таблицы 2х2 диагностического теста при использовании рекомендованных МЭБ тестов (ИФА и ИБ) в качестве референтных. Чувствительность теста достигала 100% (при доверительном интервале (ДИ) 95%, от 83,89% до 100%), а специфичность 97,18% (при ДИ 95%, от 90,19% до 99,66%). При условии удовлетворительной работы ИФА с рекомбинантным белком р30 Morara/Georgia при анализе образцов сывороток от свиней из Мозамбика авторы расширили исследования и проверили этот метод на обнаружение антител к вирусу АЧС в сыворотках из других географических районов Африки. С этой целью авторы использовали ИФА с рекомбинантным белком р30 штамма Morara/Georgia и рекомендуемые МЭБ тесты для исследования образцов сыворотки от домашних свиней из Демократической Республики Конго (ДРК) (303 сыворотки) и из Сенегала (109 сывороток). Величины соотношения, полученные для сывороток из этих двух стран, показаны на рис. 4 и 5 соответственно. Рисунок 4. Обнаружение АЧС-специфических антител в пробах сыворотки от свиней из ДРК в ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia. Результаты выражены, как описано на рисунке 4. Среди серопозитивных сывороток, обнаруженных в утвержденных МЭБ тестах, наивысшее значение составляло 34,2. - 21 - Рисунок 5. Обнаружение АЧС-специфических антител в пробах сыворотки от свиней из Сенегала в ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia. Результаты выражены, как описано на рисунке 4. Среди серопозитивных сывороток, обнаруженных в утвержденных МЭБ тестах, наивысшее значение составляло 12,9. Сто тридцать четыре образца сыворотки из 135 серологически положительных образцов из ДРК, тестированных в рекомендованных МЭБ тестах, были правильно диагностированы в ИФА с р30 штамма Morara/Georgia. Относительно реактивности МЭБ-отрицательных сывороток в ИФА на основе р30 штамма Morara/Georgia, 166 из 168 образцов сыворотки из ДРК были правильно проанализированы. Что касается образцов из Сенегала, 20 из 22 МЭБ серопозитивных образцов были правильно выявлены в ИФА на основе р30 штамма Morara/Georgia, в то время как все исследованные образцы из этой страны оказались отрицательными в рекомендованных МЭБ тестах и были также отрицательными в ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia. Поэтому чувствительность ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia для образцов сывороток из ДРК и Сенегала составила 97,78% (95% ДИ, от 93,64% до 99,54%) и 90,91% (95% ДИ, от 70,84% до 98,88%) соответственно. Что касается специфичности этого теста, она составила 98,81% (95% ДИ, от 95,77% до 99,86%) и 97,75% (95% ДИ, от 92,12% до 93,73%) для образцов из ДРК и Сенегала соответственно. Таким образом, эти результаты, полученные при тестировании сывороток от свиней из Африки, показывают, что ИФА на основе рекомбинантного белка р30 имеет около 98% специфичности, независимо от происхождения сывороток (Восточная, Центральная или Западная Африка), в то время как чувствительность варьировала от 100% (Восточная Африка) до 90% (Западная Африка). Эти изменения, вероятно, - 22 - объясняются наличием высокой генетической вариабельности изолятов вируса АЧС, выделенных в этих районах. Однако эти изменения в чувствительности были несомненно ниже таковых, описанных ранее для ИФА с рекомбинантным белком р30 штамма Е70, где чувствительность составляла 70% и 100% для образцов, полученных из Восточной и Западной Африки соответственно (Pérez-Filgueira et al., 2006). Следовательно, авторы приходят к выводу, что ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia обеспечивает приемлемую специфичность (97-98%) и чувствительность (90-100%) для серодиагностики АЧС в образцах сывороток от домашних свиней из стран Юго-Восточной (Мозамбик) Центральной (ДРК) и Западной (Сенегал) Африки. Комбинация рекомбинантных белков р30 штаммов Е70 и Morara/Georgia, возможно, даст универсальный ИФА для диагностики АЧС. Диагностика АЧС у диких видов особенно важна в Африке, где эти животные являются резервуаром вируса. Итак, в этом исследовании авторы использовали ИФА на основе рекомбинантных белков и рекомендованные МЭБ тесты для анализа образцов сывороток от бородавочников, отобранных в Сенегале (73 сыворотки), в Национальном парке Gorongosa (Мозамбик) (5) и в Национальном парке Крюгера (Восточная Африка) (1), а также сывороток из Мозамбика, взятых после контрольного заражения классической чумой свиней (4). Шесть из 83 исследованных образцов от бородавочников были положительными в рекомендованных МЭБ тестах, а также в ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia, в то время как остальные образцы показали отрицательный результат в обоих анализах (рис. 6) (не представлен). К сожалению, вследствие ограниченного количества положительных на АЧС образцов сывороток, включенных в эту панель, было невозможно определить характеристики рекомбинантного метода для диагностики АЧС у бородавочников. Однако, поскольку все 6 положительных на АЧС образцов были выявлены в данном ИФА, авторы полагают, что этот метод способен с приемлемой чувствительностью диагностировать АЧС у бородавочников. Итак, в этом сообщении описан подходящий и недорогой серологический тест, позволяющий точно выявлять антитела против вируса АЧС, независимо от географического происхождения сывороток. Следует подчеркнуть, насколько это известно авторам, это первая оценка ИФА на основе рекомбинантных белков с таким - 23 - большим количеством положительных на АЧС образцов сыворотки из трех основных районов Африки (Юго-Восточного, Центрального и Западного) исходя из вариабельности вируса. 6. Выводы АЧС – это опустошающее заболевание, вызываемое крупным и сложным вирусом. Принимая во внимание его чрезвычайно высокий потенциал к трансграничному распространению, проникновение из Африки в Азию (Грузия, Армения) и в Европу (Россия, Украина), этот вирус представляет угрозу ещё не пораженным африканским странам и другим континентам. Вследствие отсутствия вакцины в борьбе с АЧС полагаются на быструю диагностику, осуществление ветеринарно-санитарных мероприятий и ограничение перемещения домашних свиней. Однако диагностика АЧС осложняется разными формами патогенеза и эпидемиологическими сценариями, а также сходством этого заболевания с другими геморрагическими болезнями, например с классической чумой свиней. Обнаружение специфических антител к вирусу АЧС указывает на предшествующую инфекцию, и, так как антитела вырабатываются с 1 недели инфекции и персистируют в течение длительного периода времени, они являются соответствующими маркерами для диагностики болезни. Классические методы, такие, как ИФА и ИБ, основанные на использовании неочищенных экстрактов инфицированных вирусом АЧС клеток, хорошо зарекомендовали себя для диагностики подострой и хронической форм инфекции, но они имеют несколько недостатков, главным образом связанных с биологической безопасностью, сложностью интерпретации результатов диагностики и с проблемами стандартизации. Поэтому определение наличия антител в сыворотке с использованием рекомбинантного белка может быть воспроизводимой и безопасной альтернативой традиционным методам, которая позволит стандартизировать производство антигена и устранить необходимость работы с инфекционным материалом. Несколько исследований, посвященных использованию рекомбинантных белков вируса АЧС для серологической диагностики, показали многообещающие результаты. Более того, эти белки имеют дополнительное преимущество в том, что они упрощают интерпретацию - 24 - результатов, улучшая воспроизводимость методов, и обеспечивают высокую чувствительность реакции для плохо сохранившихся образцов. Использование вновь разработанных тестов для диагностики АЧС требует ратификации. Как следует из опытов, обсуждаемых в этом обзоре, рекомендованные методы показывали различную производительность в зависимости от происхождения образцов. По-видимому, только новый ИФА на основе рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia имеет адекватные характеристики для серодиагностики АЧС в Африке. Более того, последовательность рекомбинантного белка р30 штамма Morara/Georgia (генотип II) соответствует циркулирующим вирусам в Восточной Европе (Georgia 2007/1 isolate; Gene Bank accession number: FR682468.1; Rowlands et al., 2008), что является, таким образом, лучшим диагностическим вариантом для этих районов. Этот белок также работает со всеми положительными сыворотками, собранными ранее в Испании (данные не представлены). Наконец, представленные здесь данные подтверждают, что производство белков вируса АЧС, например р30, в личинках насекомых (IBES®technology) является надежной альтернативой другим методам, особенно с учетом того, что рекомбинантный антиген р30 можно использовать в диагностических тестах без предварительной очистки. Это преимущество свидетельствует о снижении стоимости и потерь антигена при его производстве. Стоит отметить, что 3 компании в настоящее время продают ИФА тесты для серодиагностики АЧС, и 2 из них (SVANOVIR® ASFV-Ab assay from Boehringer Ingelheim Svanova and ID Screen® African Swine Fever Indirect ELISA kit from ID.vet) используют рекомбинантный белок р30 в качестве антигена. References Afonso, C.L., Alcaraz, C., Brun, A., Sussman, M.D., Onisk, D.V., Escribano, J.M., Rock, D.L., 1992. Characterization of p30, a highly antigenic membrane and secreted protein of African swine fever virus. Virology 189 (July (1)), 368–373. Alcaraz, C., De Diego, M., Pastor, M.J., Escribano, J.M., 1990. Comparison of a radioim-munoprecipitation assay to immunoblotting and ELISA for detection of ntibody - 25 - to African swine fever virus. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2 (July (3)), 191–196. Alcaraz, C., Brun, A., Ruiz-Gonzalvo, F., Escribano, J.M., 1992. Cell culture propagation modifies the African swine fever virus replication phenotype in macrophages and generates viral subpopulations differing in protein p54. Virus Research 23, 173–182. Alcaraz, C., Rodriguez, F., Oviedo, J.M., Eiras, A., De Diego, M., Alonso, C., Escribano, J.M., 1995. Highly specific confirmatory western blot test of African swine fever virus antibody detection using the recombinant virus protein p54. Journal of Virological Methods 52, 111–119. Anderson, E.C., Hutchings, G.H., Mukarati, N., Wilkinson, P.J., 1998. African swine fever virus infection of the bushpig (Potamochoerus porcus) and its significance in the epidemiology of the disease. Veterinary Microbiology 62 (April (1)), 1–15. Andrés, G., Alejo, A., Salas, J., Salas, M.L., 2002. African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell. Journal of Virology 76 (December (24)), 12473–12482. Andrés, G., Simón-Mateo, C., Vi˜ nuela, E., 1997. Assembly of African swine fever virus: role of polyprotein pp220. Journal of Virology 71 (March (3)), 2331–2341. Arias, M., Escribano, J.M., Sánchez-Vizcaíno, J.M., 1993. Persistence of African swine fever antibody reactivity on ELISA and immunoblotting assays. Veterinary Record 133 (August (8)), 189–190. Barderas, M.G., Wigdorovitz, A., Merelo, F., Beitia, F., Alonso, C., Borca, M.V., Escrib-ano, J.M., 2000. Serodiagnosis of African swine fever using the recombinant protein p30 expressed in insect larvae. Journal of Virological Methods 89 (September (1–2)), 129–136. Bastos, A.D.S., Penrith, M.L., Macome, F., Pinto, F., Thomson, G.R., 2004. Cocircula-tion of two genetically distinct viruses in an outbreak of African swine fever in Mozambique: no evidence for individual co-infection. Veterinary Microbiology 103, 169–182. Bech-Nielsen, S., Fernandez, J., Martinez-Pereda, F., Espinosa, J., Perez Bonilla, Q., - 26 - Sanchez-Vizcaino, J.M., 1995. A case study of an outbreak of African swine fever in Spain. British Veterinary Journal 151 (March–April (2)), 203–214. Botija, C.S., 1970. Diagnosis of African swine fever by immunofluorescence. Bulletin de l Office International des Epizooties 73 (November–December (11)), 1025– 1044. Borca, M.V., Irusta, P., Carrillo, C., Afonso, C.L., Burrage, T., Rock, D.L., 1994. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope. Virology 201 (June (2)), 413–418. Carrascosa, A.L., del Val, M., Santarén, J.F., Vi˜ nuela, E., 1985. Purification and prop-erties of African swine fever virus. Journal of Virology 54 (May (2)), 337–344. Costard, S., Wieland, B., de Glanville, W., Jori, F., Rowlands, R., Vosloo, W., Roger, F., Pfeiffer, D.U., Dixon, L.K., 2009. African swine fever: how can global spread be prevented? Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B: Biological Sciences 364 (September (1530)), 2683–2696, Review. De Kock, G., Robinson, E.M., Keppel, J.J.G., 1940. Swine fever in South Africa. Onder-stepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry 14, 31–93. Dixon, L.K., Abrams, C.C., Bowick, G., Goatley, L.C., Kay-Jackson, P.C., Chapman, D., Liverani, E., Nix, R., Silk, R., Zhang, F., 2004. African swine fever virus pro-teins involved in evading host defence systems. Veterinary Immunology and Immunopathology 100 (August (3–4)), 117–134. Dixon, L.K., Alonso, C., Escribano, J.M., Martins, C., Revilla, Y., Salas, M.L., Taka-matsu, H., 2011. Asfarviridae. In: Andrew, M.Q., King, Michael, J., Adams, Eric, B., Carstens, Elliot, J., Lefkowitz (Eds.), Virus Taxonomy. Elsevier, Oxford, pp. 153–162. Encinas, P., Gomez-Sebastian, S., Nunez, M.C., Gomez-Casado, E., Escribano, J.M., Estepa, A., Coll, J., 2011. Antibody recognition of the glycoprotein g of viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV) purified in large amounts from insect larvae. BMC Research Notes 21 (4), 210. Escribano, J.M., Pastor, M.J., Sánchez-Vizcaino, J.M., 1989. Antibodies to bovine serum albumin in swine sera: implications for false-positive reactions in the serodiagnosis of African swine fever. American Journal of Veterinary Research 50, - 27 - 1118–1122. Ferris, D.H., Gregg, D.A., Dardiri, A.H., 1980. A simplified method for detection African swine fever antibodies by immunoelectroosmophoresis. Bulletin of the Pan American Health Organization 14 (3), 229–237. Gallardo, C., Blanco, E., Rodríguez, J.M., Carrascosa, A.L., Sanchez-Vizcaino, J.M., 2006. Antigenic properties and diagnostic potential of African swine fever virus pro-tein pp62 expressed in insect cells. Journal of Clinical Microbiology 44 (March (3)), 950– 956. Gallardo, C., Reis, A.L., Kalema-Zikusoka, G., Malta, J., Soler, A., Blanco, E., Park-house, R.M., Leitão, A., 2009a. Recombinant antigen targets for serodiagnosis of African swine fever. Clinical and Vaccine Immunology 16 (July (7)), 1012–1020, http://dx.doi.org/10.1128/CVI.00408-08. Gallardo, C., Dufton, M.M., Macharia, J.M., Arias, M., Taracha, E.A., Soler, A., Okoth, E., Martin, E., Kasiti, J., Bishop, R.P., 2009b. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes 38, 85–95. Gómez-Puertas, P., Rodríguez, F., Oviedo, J.M., Ramiro-Ibᘠnez, F., Ruiz-Gonzalvo, F., Alonso, C., Escribano, J.M., 1996. Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization.Journal of Virology 70 (August (8)), 5689–5694. Gómez-Puertas, P., Rodríguez, F., Oviedo, J.M., Brun, A., Alonso, C., Escribano, J.M., 1998. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response. Virology 243 (April (2)), 461–471. Gomez-Sebastian, S., Perez-Filgueira, D.M., Gomez-Casado, E., Nunez, M.C., Sanchez-Ramos, I., Tabares, E., Escribano, J.M., 2008. DIVA diagnostic of Aujeszky’s disease using an insect-derived virus glycoprotein E. Journal of Virological Methods 153, 29–35. Hopp, T.P., Wood, K.R., 1981. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78, 3824–3828. - 28 - Irusta, P.M., Borca, M.V., Kutish, G.F., Lu, Z., Caler, E., Carrillo, C., Rock, D.L., 1996. Amino acid tandem repeats within a late viral gene define the central variable region of African swine fever virus. Virology 220 (June (1)), 20–27. Jori, F., Bastos, A.D.S., 2009. Role of wild suids in the epidemiology of African swine fever. EcoHealth 6, 296–300. Kleiboeker, S.B., Scoles, G.A., Burrage, T.G., Sur, J., 1999. African swine fever virus replication in the midgut epithelium is required for infection of Ornithodoros ticks. Journal of Virology 73 (October (10)), 8587–8598. Kollnberger, S.D., Gutierrez-Casta˜ neda, B., Foster-Cuevas, M., Corteyn, A., Parkhouse, R.M., 2002. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody. Jour-nal of General Virology 83 (June (Pt 6)), 1331–1342. Kyte, J., Doolittle, R.F., 1982. A simple method for displaying the hydropathic char-acter of a protein. Journal of Molecular Biology 157 (May (1)), 105–132. Lubisi, B.A., Bastos, A.D., Dwarka, R.M., Vosloo, W., 2005. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa. Archives of Virology 150 (12), 2439–2452. Mebus, C.A., Dardiri, A.H., 1980. Western hemisphere isolates of African swine fever virus: asymptomatic carriers and resistance to challenge inoculation. American Journal of Veterinary Research 41, 1867–1869. Neilan, J.G., Zsak, L., Lu, Z., Burrage, T.G., Kutish, G.F., Rock, D.L., 2004. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not suffi-cient for antibody-mediated protection. Virology 319 (February (2)), 337–342. OIE, 2012. African swine fever. In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Ter-restrial Animals. Office International des Epizooties, Paris, France (Chapter 2.8.1, NB: version adopted in May 2012). Oviedo, J.M., Rodríguez, F., Gómez-Puertas, P., Brun, A., Gómez, N., Alonso, C., Escrib-ano, J.M., 1997. High level expression of the major antigenic African swine fever virus proteins p54 and p30 in baculovirus and their potential use as diagnostic reagents. Journal of Virological Methods 64 (February (1)), 27–35. - 29 - Pan, I.C., De Boer, C.J., Hess, W.R., 1972. African swine fever: application of immu-noelectroosmophoresis for the detection of antibody. Canadian Journal of Comparative Medicine 36 (July (3)), 309–316. Pan, I.C., Trautman, R., Hess, W.R., DeBoer, C.J., Tessler, J., Ordas, A., Botija, C.S., Ove-jero, J., Sanchez, M.C., 1974. African swine fever: comparison of four serotests on porcine serums in Spain. American Journal of Veterinary Research 35 (June (6)), 787–790. Pan, I.C., Huang, T.S., Hess, W.R., 1982. New method of antibody detection by indi-rect immunoperoxidase plaque staining for serodiagnosis of African swine fever. Journal of Clinical Microbiology 16 (October (4)), 650–655. Pastor, M.J., Arias, M., Escribano, J.M., 1990. Comparison of two antigens for use in an enzyme-linked immunosorbent assay to detect African swine fever antibody. American Journal of Veterinary Research 51 (October (10)), 1540–1543. Pastor, M.J., Laviada, M.D., Sanchez-Vizcaino, J.M., Escribano, J.M., 1989. Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay. Canadian Journal of Veterinary Research 53 (January (1)), 105–107. Penrith, M.L., Thomson, G.R., Bastos, A.D., Phiri, O.C., Lubisi, B.A., Du Plessis, E.C., Macome, F., Pinto, F., Botha, B., Esterhuysen, J., 2004. An investigation into nat-ural resistance to African swine fever in domestic pigs from an endemic area in southern Africa. Revue Scientifique et Technique 23 (December (3)), 965–977. Pérez-Filgueira, D.M., González-Camacho, F., Gallardo, C., Resino-Talaván, P., Blanco, E., Gómez-Casado, E., Alonso, C., Escribano, J.M., 2006. Optimization and vali-dation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae. Journal of Clinical Microbiology 44 (September (9)), 3114–3121. Pérez-Filgueira, D.M., Resino-Talaván, P., Cubillos, C., Angulo, I., Barderas, M.G., Barcena, J., Escribano, J.M., 2007. Development of a low-cost, insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV. Virology 364 (August (2)), 422–430. Pérez-Martín, E., Grau-Roma, L., Argilaguet, J.M., Nofrarías, M., Escribano, J.M., - 30 - Gómez-Sebastián, S., Segalés, J., Rodríguez, F., 2008. Development of two Trichoplusia ni larvae-derived ELISAs for the detection of antibodies against replicase and capsid proteins of porcine circovirus type 2 in domestic pigs. Journal of Virological Methods 154, 167–174. Reis, A.L., Parkhouse, R.M., Penedos, A.R., Martins, C., Leitão, A., 2007. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus. Journal of General Virology 88 (September (Pt 9)), 2426–2434. Rowlands, R.J., Michaud, V., Heath, L., Hutchings, G., Oura, C., Vosloo, W., Dwarka, R., Onashvili, T., Albina, E., Dixon, L.K., 2008. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007. Emerging Infectious Diseases 14, 1870–1874. Tabares, E., Fernandez, M., Salvador-Temprano, E., Carnero, M.E., Sanchez-Botija, C., 1981. A reliable enzyme linked immunosorbent assay for African swine fever using the major structural protein as antigenic reagent. Archives of Virology 70 (3), 297–300. Tabarés, E., Martinez, J., Ruiz Gonzalvo, F., Sánchez-Botija, C., 1980. Proteins specified by African swine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties. Archives of Virology 66 (2), 119–132. Todolí, F., Pérez-Filgueira, M., Galindo, I., Gómez-Sebastián, S., Escribano, J.M., Rodríguez-Cortés, A., Alberola, J., 2009. Seroreactivity against raw insect-derived recombinant KMPII, TRYP, and LACK Leishmania infantum proteins in infected dogs. Veterinary Parasitology 164, 154–161. Wardley, R.C., Abu Elzein, E.M., Crowther, J.R., Wilkinson, P.J., 1979. A solidphase enzyme linked immunosorbent assay for the detection of African swine fever virus antigen and antibody. Journal of Hygiene (London) 83 (October (2)), 363–369