Первичная роль функциональной ишемии, количественные данные...
advertisement
Первичная роль функциональной ишемии, количественные данные для двух механизмов развития и терапии ингибиторами фосфодиэстеразы 5 мышинной модели мышечной дистрофии. Введение Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД ) обусловлена отсутствием продукта гена дистрофина, и затрагивает приблизительно одного из 3500 новорожденных мальчиков. В скелетных мышцах МДД пациентов проходит медленное прогрессивное повреждение, которое приводит к возникновению заболевания. Точная патофизиологии не известна, кроме широко принятой теории, что основную роль играет мембранная уязвимость. Предшествующие исследования показали, что отсутствие дистрофина и связанных с ним молекул вызывает дефекты в потое крови в мышечные ткани. В ответ на сократительную нагрузку нормальные мышцы стремятся к увеличению притока крови для удовлетворения метаболических потребностей. Однако, когда этот ответ ослабляется, мышцы имеют риск ишемии из-за отсутствия достаточного количества кислорода и питательных веществ или достаточного выведения накопленных метаболитов, патологическое состояние "функциональной ишемии ». Ишемия определяется как снижение кровотока из-за структурных обструкций сосудов или вазоконстрикции. Состояние функциональной ишемии- когда приток крови не может сравниться с метаболическим спросом тканей даже при отсутствии обструкции сосудов. Баланс между спросом и предложением кровотока нарушается в обоих случаях. Оксид азота (NO) , также известный как эндотелийрасслабляющий фактор ( ЭФР ) , производимый в скелетных мышцах контролирует местный кровоток в мышцах [8] , [9] наряду с различными другими вазорегуляторными молекулами. У пациентов с МДД, а также мышей MDX ( мышиный эквивалент ), экспрессия сарколеммой нейрональной синтазы оксида азота ( нОАС ) в скелетных мышцах значительно снижается с сопутствующими нарушениями в регулировании кровотока. Различные исследования показали, что имеют место сосудистая патология, изменения сосудорасширяющего ответа и нарушенная сосудорасширяющая сигнализация нОАС. Не было оценено в деталях, однако, является ли нарушение регуляции кровотока в связи с отсутствием экспрессии ННО основной причиной или вторичным дефектом мышечной дистрофии. У мышей с отсутствием ННО схожие аномалии кровотока не проявляются фенотипом мышечной дистрофии, было высказано предположение, что функциональная ишемия или отсутствие ННО может быть вспомогательным мероприятием, но не является прямой причиной заболевания. Отсутствие фенотипа дистрофии у мышей с отсутствием фермента, однако, означает не более, чем отсутствие ННО или недостаточность кровотока, чтобы вызвать мышечную дистрофию. Было бы неправильно сделать вывод, что отсутствие ННО или нарушение кровообращения не является существенной причиной заболевания. В дополнение к сказанному, ткани продуцируют другие типы сосудорасширяющего факторов, включая эндотелиальный фактор гиперполяризации ( EDHF ). Хотя структура EDHF остается неясной, предыдущие доклады показали, что супероксиддисмутаза (СОД ) производит перекись водорода (H2O2) , которая оказывает EDHF -подобные функции. Кроме того, было предложено, что одного фактора недостаточно для объяснения патогенеза МДД и предположили, что, по крайней мере, два фактора, необходимы для побуждения повреждения мышечных волокон. В этом исследовании мы оценили регулирование потока крови в патогенезе мышечной дистрофии с использованием естественных микроскопических анализов : мы исследовали, как кровоток реагирует на сокращение мышцы у MDX и контрольных мышей , с NO/H2O2 производством в мышцах , ослабляется ли у MDX мышей , и является ли увеличение окиси азота фактором, который может предотвратить функциональную ишемию и повреждение мышечных волокон у MDX мышей. Степень функциональной ишемии и количество повреждений миофибрилл сравнивались у MDX и контрольных мышей. Результаты Контрольные мыши показывают увеличение потока крови в мышцах при сокращении, чего нет у MDX мышей. Различные параметры существуют для анализа местного кровотока , в том числе поток эритроцитов, скорость потока плазмы , диаметр кровеносного сосуда и функциональная плотность капилляров. Среди них потокэритроцитов отражает местную подачу кислорода и является хорошо организованным стандартным методом для оценки локального кровотока . В этом исследовании мы измерили периферийный поток эритроцитов в внутримышечных артериолах в естественных условиях ( номенклатура кровеносных сосудов, см. дополнительную информацию , S1 рисунок) . Наблюдаемые люминесцентные эритроциты, помечены различными красителями включая PKH26GL, что является общепринятым методом анализа микроциркуляции. Чтобы оценить возможное влияние флуоресцентных меченных эритроцитов PKH26GL на динамику потока эритроцитов , альтернативный способ окрашивания ( FITC) был использован по той же схеме кинетики (данные не показаны). Базальный уровень абсолютного потока ( окрашенные и не окрашенные эритроциты комбинированный) был 8043,2 ± 1372,5 и 10403,2 ± 1876,0 для контроля и MDX мышей ( потока значение в минуту ± SE, N ( количество животных ) = 18 и 17 , статистически не отличались , р = 0,31 при т -тест) . Справедливость нашего метода маркировки , таким образом, обеспечивает согласованность с предыдущими исследованиями потока эритроцитов для венулы ( 12-39 мкм в диаметре ) прибл 100000 в минуту у мышей [ 25], опираясь на капиллярный поток 1800 или 1200-2000 в минуту у крыс [26] или хомяков [27] (заметим, что одна первичная артериола питает несколько капилляров и множество капилляров впадают во вторичные венулы). Как показано на рисунке 1а , у контрольных мышей произошло увеличение потока , что продолжается более 8 - 10 минут в связи с сокращением в ответ на 50 Гц стимуляцию. Там не было никаких существенных различий в структуре изменения потока между NMJ и не NMJ районах либо штаммами мышей , за исключением небольшой разницы во времени увеличения потока у контрольных мышей . Таким образом, все измерения проводились в не- NMJ областей, если не указано иное. В предыдущих экспериментах , высокие частоты стимуляции при 20 Гц на мышцы задней конечности крыс привело к увеличению скорости кровотока продолжительностью до 14 минут после прекращения стимуляции [28]. Прямая стимуляция на одной стороне грудино-сосцевидной мышцы не вызывала сокращение на другой стороне, а поток в контралатеральной стороне остался на базальном уровене (рис. 1а). Это наблюдение позволяет предположить, что в условиях в этом исследовании, стимуляция грудино-сосцевидной мышцы не изменяет сердечный выброс, и увеличение кровотока в соответствии с местной стимуляцией мышц. Эксперименты показали, у MDX мыши полное отсутствие увеличения потока после стимуляции как в NMJ, так и в не NMJ областях (рис. 1b ), несмотря на тот факт, что тетанические стимулы дали такой же степени сокращения мышц у контрольных мышей (рис. S2 , вспомогательная информация ). Изучение вопроса отсутствия реакции у MDX мышей было связано с дефектом кровеносных сосудов или дефектом в передаче сигнала между мышцами и кровеносными сосудами, мы применили SNAP (S -нитрозо- N- ацетилпенициламин, NO донор) на местном уровне. Когда SNAP был применен в покое на мышцы MDX мышей , поток был увеличен до максимума 212,4 % от базального потока (рис. 1b). Это увеличение было сопоставимо с изменениями у контрольных мышей, которым вводили такую же дозу SNAP (данные не показаны , максимальное увеличение до 236,2 %, N ( количество животных ) = 10, существенно не отличались от MDX мышей в любой момент времени между 0 и 8 минут). Этот результат позволяет предположить , что сосудорасширяющие механизмы в кровеносных сосудах были функциональны у MDX мышей, но сигналы между скелетной мышцей и кровеносными сосудами были скомпрометированы. Дальнейшее подтверждение этого вывода наблюдалось, когда мембранпроницаемый цГМФ аналог , 8-( 4- Хлорфенилтио ) - гуанозин-3 ', 5'- циклического монофосфат (8- СРТ цГМФ) был локально применен. Этот препарат вызвал медленное увеличение потока у мышей MDX , достигнув такой же степени реакции, которая наблюдалось в группе SNAP через 7 минут после введения. Учитывая, что сосудорасширяющий эффект NO через цГМФ -зависимые пути [ 29] - [ 31] , различие в кинетике увеличения потока между группами с SNAP и с 8 -CPT цГМФ произошло , вероятно, из-за разницы в скорости достижения препаратами своих клеток-мишеней. Влияние на увеличение потока эритроцитов 8 -CPT цГМФ неспецифически необратимо сосудосуживающее действие, но , скорее всего, определенно физиологическим регулированием, потому что этот ответ полностью противодействует дальнейшему добавлению физиологической концентрации вазоконстриктора ангиотензина -II ( ATII ) . Поскольку β2 - агонисты имеют различный механизм вазодилатации , мы рассмотрели кленбутерол, как препарат, который вызывает расширение кровеносных сосудов у MDX мышей. Когда кленбутерол был локально введен вместо SNAP, MDX мыши показали увеличение потока , хотя и в меньшей степени ( максимум до 172% , рис 1b). В результате этот эксперимент подтверждает , что механизм вазодилатации гладких мышц сосудов является функциональным у MDX мышей. Оксида азота и производство перекиси водорода в ответ на сокращение мышц ослабляется у MDX мышей. В естественных условиях производство сосудорасширяющих молекул (т.е. нет и H2O2 ) измерялось в грудинососцевидной мышце MDX и контрольных мышей для исследования механизмов функциональной ишемии у мышей MDX. Прямая тетаническая стимуляция грудино-сосцевидной мышцы индуцировала заметное повышение уровня азота в мышечных волокнах (рис. 2- б). Когда L -NAME ( нОм -нитро -L- аргинина, метиловый эфир ) ,неспецифический ингибитор NOS , был применен, производство NO в мышечных волокнах было снижено примерно на 67,6% из чистого прироста. Тот факт, что экзогенный L-NAME не может подавить все внутриклеточное NO производство, согласуются с предыдущими исследованиями [33]. Последствия сокращения мышц между контролем и MDX мышами (рис. 2и B). Базальный уровень NO в покоящейся мышце MDX мышей был выше, чем у контрольных мышей , но увеличение NO производства после сокращения мышц было полностью прекращено у MDX мышей. Производство NO от не мышечными клетками было отмечено ( черно-белая стрела на рисунке 2а). Хотя EDHF не полностью идентифицировали, предыдущие исследования продемонстрировали производство перекиси водорода (H2O2) при помощи флуоресценции карбокси- H2- DCFDA (2 ' ,7 -дихлордигидрофлюоресцеина диацетата ), как EDHF функция [22]. В этом исследовании H2O2 производство в грудинососцевидной мышце сравнивали между контролем и MDX мышами с помощью карбокси- H2- DCFDA . Прямая тетаническая стимуляция мышцу индуцировала производство H2O2 в миоцитах у контрольных мышей (фиг. 2а и в). Хорошо известно, что фармакологические препараты , включая комбинации апамина и карибдотоксина [34] , ингибируют EDHF путем противодействия активированным кальциево- калиевым каналам эндотелиальных клеток сосудов в естественных условиях [34] , [35] . Производство Н2О2 мышечными волокнами ингибировалось комбинированным применения апамина и карибдотоксина (рис. 2а права третьих панели , 2с 3-я колонка ) . Увеличение количества Н2О2 обнаруженое после тетанической стимуляции уменьшалось у MDX мышей (рис. 2а правой нижней панели , 2с крайней правой колонке ) . Эти эксперименты показывают, что в грудино-сосцевидной мышце контрольных мышей , как NO, так и Н2О2 увеличиваются после тетанических стимулов , в то время как у мышей MDX тетаническая стимуляция не увеличивает производство обеих молекул, что может быть потенциальной причиной нарушенной регуляции потока. Фармакологические изменение функциональной ишемии предотвращает повреждение при физической нагрузке мышечных волокон у MDX мышей. Эксперименты были разработаны, чтобы определить, происходит ли улучшение микроциркуляции путем пополнения NO у мышей MDX (рис. 1б), что может предотвратить сокращение-индуцированную гибель клеток. Использовав DiOC6 ,мембранный потенциал-зависимых красителей , которые включены в митохондриях и эндоплазматической сети (М / ER) только в живых клетках ( рис. 3а) , мы следовали хронологические изменения в морфологии мышечных волокон в естественных условиях и подсчитывали количество поврежденных мышечных волокон. Преимуществом этого метода является то , что волокна уже погибшие до лечения не окрашенны (рис. 3б ), а волокна повреждены после окрашивания могут быть обнаружены (рис. 3в). Таким образом, стало возможным оценить специфический эффект сокращения мышц и / или фармакологического вмешательства . Интактные мышечные волокона показали зеленый флуоресцентный сигнал кластеров M / ER (рис. 3а). Для количественной оценки повреждения мышечных волокон, мы рассчитывали количество поврежденных локусов (локусе), а не количество поврежденных волокон, потому что существуют различные типы повреждений наблюдаемые по всей длине мышечных волокон (см. методы подробно). Смерть локусов мышечных волокон и у мышей показали нарушенный внутриклеточный характер распределения зеленой флуоресценции. Гибель клеток была подтверждена исключением окрашивания красителем (конечная точка синего цвета на фиг.3) и аннексина Vокрашивание (рис. S3, вспомогательную информацию). Это результат в естественных условиях исследования подтверждает ранее проведенный морфологический анализ митохондриальной аномалии в скелетных мышцах при токсин-индуцированной гибели клеток [36], [37] и мышечной дистрофии [38]. Мышечное волокно с признаками повреждения (гранулированный, рябь, и избыточное окрашивание DiOC6) не вернулось к нормальной поперечнополосатой окраске после длительного покадрового наблюдения до 12 часов. Морфологические изменения указанные выше считаются необратимыми и мышечное волокно, проявляющее эти характеристики, действительно умирает. Процедура окрашивания не влияет на жизнеспособность мышц и сохранность миофибрилл, миофибриллы сохранили свою нормальную поперечно-полосатую модель M / ER во время наблюдения (рис. 3а). Тетаническая стимуляция (6 раз повторяю, продолжительностью 5 секунд при 50 Гц), индуцировала прогрессивное повреждение мышечных волокон у мышей MDX (рис. 4, открытый круг и черную линию, "MDX"), в соответствии с предыдущими докладами о механической слабости мышечных волокон у субъектов с мышечной дистрофией [39]. Через 6 часов после тетанической стимуляции, 67,67 ± 6,57 (± Количество SE) мышечных волокон были повреждены из всей области наблюдения. Общее количество локусов была от 350 до 400 (от 70 до 80 миофибрилл сканирования 5 раз). Мы оценили, может ли изменение функциональной ишемии ослаблять это сокращением индуцированное повреждение мышечных волокон. Как показано на рисунке 1b ,доноры NO , SNAP могут улучшить кровоток в мышцах MDX мышей. Когда SNAP была локально применена у MDX мышей во время мышечной смерти, гибель клеток была полностью отменена (рис. 4, открытые площади и красные пунктирные линии ", MDX + NO »). Микроскопические изображения этих экспериментов приведены на рисунке S5a (с поддержкой информации).Эти наблюдения из оснастки экспериментов подтверждают гипотезу о том , что функциональные ишемия необходима и играет главную роль в сокращении повреждений мышечных волокон у MDX мышей и может быть предотвращена путем увеличения NO. Для дальнейшего исследования этого цитопротекторного эффекта цГМФ зависимого пути, эффект 8 -CPT цГМФ был рассмотрен в том же эксперименте гибели клеток, поскольку данный препарат повышает потока эритрацитов у мышей MDX (рис. 1b). Сокращение индуцированного работой повреждения мышечных волокон было успешно предотвращено (рис. 4). Защитный эффект 8 -CPT цГМФ вероятно, опосредован его вазорегуляторным потенциалом. Тормозящее действие ATII на цГМФ опосредованную цитопротекцию, скорее всего, через сосудистую регуляцию, но не его прямые катаболические функции на мышечные волокна, потому ATII сами по себе не имеют цитотоксического действия на мышечные волокна (рис. 4 ) . Когда β2 -адренергический агонист, кленбутерол, был локально введен вместо этого, до и во время стимуляции, индуцированное сокращением повреждение ослабляется (рис. 4), хотя β2 - агонисты , как известно, имеют различные механизмы сосудорасширяющего действия от NO / EDHF [32]. Предыдущие исследования сообщали о повышенной активности PDE5 в скелетных мышцах образцов у мышей MDX [40] и снижение цГМФ производства [10], мы предположили, что введение ингибитора PDE5 увеличит количество цГМФ , и , следовательно, предотвратить повреждение мышечных волокон, как предсказано на основе данных с 8 - CPTcGMP . Тадалафил (4 мг / kgBW ) вводили MDX мышам через желудочный зонд за 60 минут до начала тетанической стимуляции. Лечение тадалафилом снизило объем повреждений мышечных волокон (рис. 4). Плацебо не помешало повреждению мышечных волокон (данные не показаны). Функциональной ишемии достаточно, чтобы вызвать индуцированное сокращением повреждения мышечных волокон. Эксперименты были разработаны, чтобы оценить, насколько на скелетных мышечных клетках, подобных наблюдаемым у мышей MDX, можно имитировать искусственную функциональную ишемиею у животных дикого типа. Только тогда, когда введены L-NAME (ингибирование NO производства), плюс апамин карибдотоксин (ингибирование EDHF ) и сосудистый спазм, учитывая одновременно двенадцатикратное повторение тетанических стимулов производят 56,2 ± 13,69 (число ± SE) поврежденых локусов мышечных волокон через 6 часов после стимуляции (на рисунке 5). Сопоставимые повреждения мышечных волокон не наблюдались в отсутствие одного из следующих реактивов / вмешательства : L-NAME (рис. 5), апамин плюс карибдотоксин, сосудистые угнетение или тетаническую стимуляцию. Тетаническая стимуляция и угнетение сосудистого тонуса сами по себе не вызывает повреждения мышечных волокон. Повторение шести тетанических стимулов вызывает меньшее количество повреждений мышечных волокон через 6 часов. Подробные микроскопические изображения каждой группы представлены в S5b. Наши фармакологические вмешательства не возвращали аномальную фрагментированную морфологию NMJs у мышей MDX (рис. S5a , красное окрашивание) к нормальной форме (см. рис S5b ) , или наоборот, у контрольных мышей , в течение 6 часов наблюдения. Количество функциональной ишемии достигнутое путем различных обработок было количественно измерено путем интеграции общего изменения потока эритроцитов в течение 10 минут после тетанической стимуляции (расчеты показаны во вспомогательной информации, рисунок S6), и того чтобы оценить функциональную ишемию было достаточно. Функциональная ишемия определяется как патологическое состояние, когда есть отсутствие нормальной реакции кровотока в пост-сокращении мышц: в нашем эксперименте MDX мыши не показывают увеличение потока в ответ на тетаническую стимуляцию (рис. 6). Лечение контрольных мышей LNAME, апамин плюс карибдотоксином, или сосудистое угнетение индивидуальная функциональная ишемия в одинаковой степени наблюдается у MDX мышей, но вызывало большее снижение потока, когда все они были объединены (рис. 6). В некоторых случаях сочетание лечения вызвало значительное падение потока, например патологическое состояние, которое вписывается в определение "тяжелой ишемии", а не функциональной ишемии. Теоретически, полная обструкция артериол под наблюдением приведет к отрицательным значениям. В наших экспериментах мы наблюдали ишемию с отрицательными значениями (рис. 6, все комбинации препаратов, 2-я колонка справа) и по-прежнему поддерживали определенный уровень кровотока. Эти эксперименты показывают, что функциональная ишемия сама по себе не достаточна, чтобы вызвать повреждения мышечных волокон. Сосудистая терапия тадалафилом , ингибитором фосфодиэстеразы -5. Для проверки гипотезы , что (I) предотвращение дегенерации миофибрилл может мешать уменьшать развитие мышечной дистрофии , и (II) агенты направлены на NO- цГМФ путь могут быть использованы в качестве терапевтических кандидатов, MDX мышам давали перорально тадалафил , ингибитор фосфодиэстеразы 5 ( PDE5I ). Этот препарат повышает внутриклеточный уровень цГМФ в гладкомышечных клетках сосудов , вызывает расширение кровеносных сосудов и увеличивает приток крови к органу-мишени. Без лечения MDX мыши показали повышенное количество поврежденных мышечных волокон в задних конечностях и диафрагме, как показал их синий цвет после инъекции красителя Эванса синего (рис. 7а, верхней панели 6 и 7б , верхняя 3 панели). Когда MDX мышей обрабатывали тадалафилом , количество умирающих волокон снижалась (фиг. 7а нижней панели 6 и 7б , нижняя панель 3 ) . Когда срезы мышц задних конечностей и диафрагмы мышей MDX оцениваются флуоресцентной микроскопией, MDX мыши без лечения показали повышенние красного флуоресцентного окрашивания то время как воздействие тадалафила снизило травму икроножной , ягодичной мышцы , четырехглавой мышцы и мышц диафрагмы ( рис. 7 и 7D) . Для дальнейшего подтверждения этого вывода использовалась обычная гистология с трехцветной окраской и гематоксилин-эозином (H & E) (рис. 8а). Обширные повреждения мышечных волокон и фиброз (рис. 8а , синий депозит в интерстициальной области в трехцветного окрашивания , желтые стрелки) занимает видное место у необработанных мышей MDX. Степень фиброза была снижена при лечении (рис. 8b , р <0,05) . Количество мышечных волокон с центральными ядрами сократилось при лечении (рис. 8в). Изменение размера волокон заметно у необработанных мышей MDX , было уменьшено при лечении тадалофилом (рис. 8d , р <0,05) . Эти данные предполагают, что защитный эффект на миофибриллы тадалафила может замедлить развитие болезни. Обсуждение Функциональная ишемия может стать существенной причиной мышечной дистрофии. До сих пор нет единой точки зрения по поводу роли регулирования кровотока при МДД, изучения которой были начаты еще в середине 19-го века. Самый важный вопрос - играют ли оставшиеся нарушения кровообращения в скелетных мышцах основную роль в патогенезе МДД. С помощью вновь созданных анализов мы исследовали в естественных условиях гибель мышечных волокон, в сочетании с анализом микроциркуляции, мы зафиксировали доказательства того, что поддерживает важнейшую роль регуляции сосудистого тонуса в патофизиологии скелетных мышц у MDX мышей и показали, что лекарственные средства направленные на регуляцию сосудов эффективны для уменьшения повреждений мышечных волокон у этих мышей. Этот вывод согласуется с предыдущими сообщениями, что избыточная экспрессия трансгенов нОАС у мышей MDX [ 41 ], [42 ] или дистрофина в гладкомышечных клетках сосудов [43] уменьшают повреждения мышц. Исследования экспрессии нОАС у мышей MDX с использованием специфического промотора скелетных мышц [41], [42], и послужили основой для утверждения, что NО защищает мышечные волокна. Таким образом, предыдущие исследования не исключают возможность того, что NO производится из мышечных волокон, чтобы защитить мышечные волокна, действуя на сосудистую регуляцию. Прошлые отчеты подтвердили, что нОАС выражение в миофибриллах контролирует расширение кровеносных сосудов в скелетных мышцах [8]. Теория «Функциональной ишемии» мышечной дистрофии показала, что под напряжением сосудосуживающих механизмов мышц пациентов не в состоянии увеличить приток крови в норму даже после сокращения мышц [ 4], [ 5]. До сих пор одним из технических ограничений исследований гибели клеток было тог, что гибель клеток миофибрилл всегда увеличена в мышцах при мышечной дистрофии (см. фиг.7 алфавит и г). В обычных анализах существует значительное количество клеток даже перед фармакологическим/молекулярным вмешательством, маскирующих эффект вмешательства, даже если они вызывают дальнейшее повреждение клетки. Наш новый метод клеточной гибели мышечных волокон устраняет уже мертвые клетки с помощью мембранного потенциал -зависимого красителя, DiOC6 , который проникает только в живые клетки в начале эксперимента. Этот новый подход позволил количественно определить специфическое действие фармакологических вмешательств. С помощью непосредственного наблюдения за живыми животными нами было зафиксировано полное отсутствие стимулирования производства двух молекул сосудорасширяющих веществ, NO и H2O2 , в ответ на сокращение мышц: возможной причиной функциональной ишемии. Подробные наблюдения обнаружили слегка повышенный базальный уровень NO производства у MDX мышей, и его освобождение от не- мышечных типов клеток (рис. 2). Поскольку известно, что экспрессия сарколеммой нОАС теряется у MDX мышей [46] , и активность [47] и уровень экспрессии остается неизменным в сердечной и скелетных мышцах MDX мышей или у пациентов с МДД , высокий базальный уровень NO , вероятно, активируется индуцируемой NOS ( иСОА ) [48]. Дальнейшие эксперименты должны подтвердить это понятие. Путем дополнения NO мышечных волокон MDX мышей, приток крови к мышце был усовершенствован и повреждения мышечных волокон индуцированные сокращением были предотвращены (рис. 4). Те же результаты были подтверждены путем применения кленбутерола или 8 -CPT цГМФ. Защита миофибрилл 8 -CPT цГМФ , скорее всего, происходит через сосудистый контроль, так как его преимущества были полностью отменены дополнительным добавлением ATII. Это тормозящее действие ATII , определяется, скорее всего, через сосудистую регуляцию, но не является его прямой катаболической функцией на мышечные волокна, потому ATII сам по себе не вызывает повреждение мышечных волокон. Эти эксперименты предложили главную роль в функциональной ишемии мышечных волокон у MDX мышей. Возможно участие другого вазодилататора, EDHF. Предыдущие исследования EDHF преимущественно осуществляются на сосудистой системе и в меньшей степени на скелетных миоцитах. Там было много мнений, как к личности EDHF , так и его генерации, его действия, его существовании в качестве ( а) секретируемых молекул. Эти исследования приводят к пониманию, что EDHF является гетерогенным субъектом сосудорасширяющим молекул / факторов , поведение которых варьируется в зависимости от ткани исследовании. Действие апамина и карибдотоксина, двумя хорошо зарекомендовавшими фармакологическими ингибиторами EDHF, также не было спорным до недавнего времени. Ранее, как считалось, они работали на функции EDHF путем ингибирования гиперполяризации клеток гладких мышц сосудов. В естественных условиях сосудистого эксперимента, однако, все больше доказательств [34] , [35] предполагает, что апамин и карибдотоксин влияют на эндотелиальные клетки, а не на клетки гладких мышц сосудов. Наши данные показывают, что скелетные миоциты могут быть другой точкой действия этих ингибиторов. EDHF , во взаимодействии с NO , может работать , чтобы передать сигналы для мышечно -сосудистой связи, хотя действие обнаруженного Н2О2EDHF должно быть подтверждено. Причина известного производства флуоресцентных сигналов от не- миоцитов (без волокон, как, точечное окрашивание) только в анализах на NO ( 2а , первый и второй столбцы , стрелки ), но не для Н2О2 ( третий и четвертого столбцов ) может быть отчасти потому, что проникают клетки такие, как макрофаги. Количественные доказательства "два хита" механизмов обеспечиваются сравнением двух моделей животных: функциональной модели ишемии у мышей MDX против тяжелой модели ишемии у контрольных мышей. Количественное сравнение контроля и MDX мышах показали, что ингибирование NO / EDHF у одних наблюдалось их функциональная ишемия сравнима с мышами MDX (рис. 6), но не вызывало гибели мышечных клеток в той же степени, как было замечено у MDX мышей. Для стимулирования сокращений для повреждений мышечных волокон у контрольных мышей в сопоставимых масштабах более тяжелой ишемии и более напряженные тетанические стимулы были необходимы (рис. 5 и 6). Эти результаты позволяют предположить , что независимо от ненормального ответа кровотока, мышечные волокна у MDX мышей уже уязвимы к механическим воздействиям. Наши эксперименты показали существование, по крайней мере, двух причин, приводящих к уменьшению повреждений мышечных волокон у мышей MDX: (I) фармакологически поддается лечению фактор ( поток ), который опосредован NO / EDHF и, возможно, другими молекулами , и (II) элементы, зависимые от NO / EDHF или регулирования кровотока ( вспомогательная информация Рисунок S8a -D). Эти два фактора можно объяснить как ранее предложили "два удара " механизма при этом заболевании [23]. Один из этих двух факторов только вызывает повреждение мышц, что наблюдается у MDX мышей. Возможно, млекопитающие развивались так, что есть избыточные факторы, которые предусмотрены для сокращения мышц - индуцированного увеличения потока крови и защиты от сокращения индуцированной стрессом. Таким образом, даже если EDHF синтез / функция завершается ошибкой, еще одним фактором, например, не может заменить в его отсутствие, и наоборот. Пополнение NO, может само по себе, нормализуют кровоток и предотвратить ишемию, несмотря на возможность того, что пораженные мышцы все еще по существу восприимчивы к повреждениям, вызванных сокращениями. Ингибиторы ФДЭ-5 могут быть потенциальным терапевтическим агентом для того чтобы лечить МДД. Дополнительная поддержка, объединяющая данные регуляции сосудов при мышечной дистрофии, продемонстрировала эффективное лечение MDX мышей ингибитором ФДЭ-5 , тадалафилом. Эти данные согласуются с экспериментами в естественных условиях микроскопии, показывающей существенную роль функциональной ишемии в патогенезе мышечной дистрофии, и ожидается, что этот препарат, а также другие вазорегуляторные молекулы могут быть будущей терапевтической мишенью этой болезни. Хотя вазоактивные агенты (NO, 8CPT - цГМФ , и кленбутерол ) почти полностью предотвратили повреждение мышечных волокон в наших краткосрочных экспериментах в естественных условиях от микроскопии (рис. 4), по-прежнему остающееся повреждение мышечных волокон наблюдается у некоторых животных, получавших тадалафил (7а и рис 7б). Это может быть связано с подавлением эффекта препарата после нескольких недель лечения или из-за возможных изменений в объеме движения отдельных животных, которые требуют дальнейших исследований. В этом исследовании мы поставили приоритет биологического вопроса об эффективности тадалафила и начали медикаментозное лечение до рождения и в период лактации и отъема до 4 -недельного возраста, основанное на том, что повреждение мышечного волокна всегда активируется у MDX мышей и пациентов с МДД еще до рождения [53], [54] и , что этот препарат обладает высокой трансплацентарной возможностью распределения [55]. Количество мышечных волокон с центральными ядрами , характерной чертой активной регенерации сократилось после лечения тадалафила. Это наблюдение показывает, что PDE5I может улучшить развитие болезни главным образом через его защитную функцию мышечных волокон, но не через активацию регенерации и, что регенерация мышечных волокон, часто наблюдаемая у мышей MDX, может произойти и вторично активируется дегенерацией мышц. Чтобы полностью установить терапевтический потенциал тадалафила, однако, долгосрочное терапевтическое исследование после отъема мышей MDX не требуется. Наши данные показывают, что защитный эффект цГМФ в острой фазе эксперимента , вероятно, через сосудистую роль, но не исключает возможности того, что NO- цГМФ путь оказывает анаболическое действие через не сосудистые механизмы. Кроме того, наши заключения основной роли сосудистой роли в патогенезе мышечной дистрофии не отрицает или исключает возможности принятые в настоящее время теории « мембраны уязвимости». На самом деле , мембранная уязвимость может быть другим механизмом. Ссылки 1. Hoffman EP, Kunkel LM (1989) Dystrophin abnormalities in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Neuron 2: 1019– 1029. doi: 10.1016/0896-6273(89)90226-2. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 2. Emery AE (1991) Population frequencies of inherited neuromuscular diseases–a world survey. Neuromuscul Disord 1: 19–29. doi: 10.1016/0960-8966(91)90039-U. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 3. Petrof BJ (1998) The molecular basis of activity-induced muscle injury in Duchenne muscular dystrophy. Mol Cell Biochem 179: 111–123. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 4. Sander M, Chavoshan B, Harris SA, Iannaccone ST, Stull JT, et al. (2000) Functional muscle ischemia in neuronal nitric oxide synthase-deficient skeletal muscle of children with Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13818–13823. doi: 10.1073/pnas.250379497. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 5. Thomas GD, Sander M, Lau KS, Huang PL, Stull JT, et al. (1998) Impaired metabolic modulation of alpha-adrenergic vasoconstriction in dystrophin-deficient skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 15090–15095. doi: 10.1073/pnas.95.25.15090. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 6. Corcondilas A, Koroxenidis GT, Shepherd JT (1964) Effect Of A Brief Contraction Of Forearm Muscles On Forearm Blood Flow. J Appl Physiol 19: 142–146. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 7. Mendell JR, Engel WK, Derrer EC (1971) Duchenne muscular dystrophy: functional ischemia reproduces its characteristic lesions. Science 172: 1143–1145. doi: 10.1126/science.172.3988.1143. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 8. Lau KS, Grange RW, Isotani E, Sarelius IH, Kamm KE, et al. (2000) nNOS and eNOS modulate cGMP formation and vascular response in contracting fast-twitch skeletal muscle. Physiol Genomics 2: 21–27. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 9. Stamler JS, Meissner G (2001) Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol Rev 81: 209–237. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 10. Lau KS, Grange RW, Chang WJ, Kamm KE, Sarelius I, et al. (1998) Skeletal muscle contractions stimulate cGMP formation and attenuate vascular smooth muscle myosin phosphorylation via nitric oxide. FEBS Lett 431: 71–74. doi: 10.1016/S0014-5793(98)00728-5. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 11. Burbach JA (1987) Ultrastructure of cardiocyte degeneration and myocardial calcification in the dystrophic hamster. Am J Anat 179: 291–307. doi: 10.1002/aja.1001790311. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 12. Engel WK (1971) Nouvelle hypothese sur la pathogenie de la dystrophie musculaire pseudo-hypertrophique de Duchenne. Revue Neurologique (Paris) 124: 291–298. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 13. Jerusalem F, Engel AG, Gomez MR (1974) Duchenne dystrophy. I. Morphometric study of the muscle microvasculature. Brain 97: 115–122. doi: 10.1016/s0305-4403(03)00014-1. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 14. Kobayashi Y, Suzuki H, Iinuma K, Tada K, Yamamoto TY (1983) Endothelial alterations of skeletal muscle capillaries in childhood myopathies. Tohoku J Exp Med 140: 381–389. doi: 10.1620/tjem.140.381. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 15. Miike T, Sugino S, Ohtani Y, Taku K, Yoshioka K (1987) Vascular endothelial cell injury and platelet embolism in Duchenne muscular dystrophy at the preclinical stage. J Neurol Sci 82: 67–80. doi: 10.1016/0022-510X(87)90007-4. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 16. Musch BC, Papapetropoulos TA, McQueen DA, Hudgson P, Weightman D (1975) A comparison of the structure of small blood vessels in normal, denervated and dystrophic human muscle. J Neurol Sci 26: 221–234. doi: 10.1016/0022510X(75)90034-9. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 17. Hunter EG, Elbrink J (1983) Increased contractility in vascular smooth muscle of dystrophic hamsters. Can J Physiol Pharmacol 61: 182–185. doi: 10.1139/y83-028. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 18. Miyatake M, Miike T, Zhao J, Yoshioka K, Uchino M, et al. (1989) Possible systemic smooth muscle layer dysfunction due to a deficiency of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy. J Neurol Sci 93: 11–17. doi: 10.1016/0022510X(89)90157-3. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 19. Chao DS, Silvagno F, Bredt DS (1998) Muscular dystrophy in mdx mice despite lack of neuronal nitric oxide synthase. J Neurochem 71: 784–789. doi: 10.1046/j.1471-4159.1998.71020784.x. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 20. Crosbie RH, Straub V, Yun HY, Lee JC, Rafael JA, et al. (1998) mdx muscle pathology is independent of nNOS perturbation. Hum Mol Genet 7: 823–829. doi: 10.1093/hmg/7.5.823. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 21. Komori K, Vanhoutte PM (1990) Endothelium-derived hyperpolarizing factor. Blood Vessels 27: 238–245. doi: 10.1159/000158815. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 22. Morikawa K, Shimokawa H, Matoba T, Kubota H, Akaike T, et al. (2003) Pivotal role of Cu,Zn-superoxide dismutase in endothelium-dependent hyperpolarization. J Clin Invest 112: 1871–1879. doi: 10.1172/JCI200319351. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 23. Rando TA (2001) Role of nitric oxide in the pathogenesis of muscular dystrophies: a “two hit” hypothesis of the cause of muscle necrosis. Microsc Res Tech 55: 223–235. doi: 10.1002/jemt.1172. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 24. Tsai AG, Intaglietta M (1989) Local tissue oxygenation during constant red blood cell flux: a discrete source analysis of velocity and hematocrit changes. Microvasc Res 37: 308–322. doi: 10.1016/0026-2862(89)90049-6. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 25. Kim MB, Sarelius IH (2003) Distributions of wall shear stress in venular convergences of mouse cremaster muscle. Microcirculation 10: 167–178. doi: 10.1080/mic.10.2.167.178. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 26. Ferreira LF, Padilla DJ, Musch TI, Poole DC (2006) Temporal profile of rat skeletal muscle capillary haemodynamics during recovery from contractions. J Physiol 573: 787–797. doi: 10.1113/jphysiol.2006.104802. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 27. Berg BR, Sarelius IH (1996) Erythrocyte flux in capillary networks during maturation: implications for oxygen delivery. Am J Physiol 271: H2263–2273. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 28. Mohr T, Akers TK, Wessman HC (1987) Effect of high voltage stimulation on blood flow in the rat hind limb. Phys Ther 67: 526–533. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 29. MacLeod KM, Ng DD, Harris KH, Diamond J (1987) Evidence that cGMP is the mediator of endothelium-dependent inhibition of contractile responses of rat arteries to alpha-adrenoceptor stimulation. Mol Pharmacol 32: 59–64. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 30. Griffith TM, Edwards DH, Lewis MJ, Henderson AH (1985) Evidence that cyclic guanosine monophosphate (cGMP) mediates endothelium-dependent relaxation. Eur J Pharmacol 112: 195–202. doi: 10.1016/0014-2999(85)90496-0. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 31. Ignarro LJ, Byrns RE, Buga GM, Wood KS (1987) Endothelium-derived relaxing factor from pulmonary artery and vein possesses pharmacologic and chemical properties identical to those of nitric oxide radical. Circ Res 61: 866–879. doi: 10.1161/01.RES.61.6.866. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 32. Chiba S, Tsukada M (2001) Vascular responses to beta-adrenoceptor subtype-selective agonists with and without endothelium in rat common carotid arteries. J Auton Pharmacol 21: 7–13. doi: 10.1046/j.1365-2680.2001.00199.x. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 33. Uruno A, Sugawara A, Kanatsuka H, Kagechika H, Saito A, et al. (2005) Upregulation of nitric oxide production in vascular endothelial cells by all-trans retinoic acid through the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway. Circulation 112: 727–736. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.104.500959. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 34. Doughty JM, Plane F, Langton PD (1999) Charybdotoxin and apamin block EDHF in rat mesenteric artery if selectively applied to the endothelium. Am J Physiol 276: H1107–1112. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 35. White R, Hiley CR (1997) Endothelium and cannabinoid receptor involvement in levcromakalim vasorelaxation. Eur J Pharmacol 339: 157–160. doi: 10.1016/S0014-2999(97)01397-6. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 36. Martensson J, Meister A (1989) Mitochondrial damage in muscle occurs after marked depletion of glutathione and is prevented by giving glutathione monoester. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 471–475. doi: 10.1073/pnas.86.2.471. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 37. Lopes-Ferreira M, Nunez J, Rucavado A, Farsky SH, Lomonte B, et al. (2001) Skeletal muscle necrosis and regeneration after injection of Thalassophryne nattereri (niquim) fish venom in mice. Int J Exp Pathol 82: 55–64. doi: 10.1046/j.13652613.2001.00181.x. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 38. Tidball JG, Albrecht DE, Lokensgard BE, Spencer MJ (1995) Apoptosis precedes necrosis of dystrophin-deficient muscle. J Cell Sci 108 (Pt 6): 2197–2204. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 39. Weller B, Karpati G, Carpenter S (1990) Dystrophin-deficient mdx muscle fibers are preferentially vulnerable to necrosis induced by experimental lengthening contractions. J Neurol Sci 100: 9–13. doi: 10.1016/0022-510X(90)90005-8. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 40. Bloom TJ (2002) Cyclic nucleotide phosphodiesterase isozymes expressed in mouse skeletal muscle. Can J Physiol Pharmacol 80: 1132–1135. doi: 10.1139/y02-149. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 41. Wehling M, Spencer MJ, Tidball JG (2001) A nitric oxide synthase transgene ameliorates muscular dystrophy in mdx mice. J Cell Biol 155: 123–131. doi: 10.1083/jcb.200105110. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 42. Tidball JG, Wehling-Henricks M (2004) Expression of a NOS transgene in dystrophin-deficient muscle reduces muscle membrane damage without increasing the expression of membrane-associated cytoskeletal proteins. Mol Genet Metab 82: 312–320. doi: 10.1016/j.ymgme.2004.06.006. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 43. Ito K, Kimura S, Ozasa S, Matsukura M, Ikezawa M, et al. (2006) Smooth muscle-specific dystrophin expression improves aberrant vasoregulation in mdx mice. Hum Mol Genet 15: 2266–2275. doi: 10.1093/hmg/ddl151. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 44. Furchgott RF, WZawadzki JV (1980) The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature 288: 373–376. doi: 10.1038/288373a0. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 45. Toda N, Ayajiki K, Okamura T (2005) Nitric oxide and penile erectile function. Pharmacol Ther 106: 233–266. doi: 10.1016/j.pharmthera.2004.11.011. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 46. Brenman JE, Chao DS, Xia H, Aldape K, Bredt DS (1995) Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from skeletal muscle sarcolemma in Duchenne muscular dystrophy. Cell 82: 743–752. doi: 10.1016/0092-8674(95)904719. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 47. Bia BL, Cassidy PJ, Young ME, Rafael JA, Leighton B, et al. (1999) Decreased myocardial nNOS, increased iNOS and abnormal ECGs in mouse models of Duchenne muscular dystrophy. J Mol Cell Cardiol 31: 1857–1862. doi: 10.1006/jmcc.1999.1018. CrossRef PubMed/NCBI Google Scholar 48. Louboutin JP, Rouger K, Tinsley JM, Halldorson J, Wilson JM (2001) iNOS expression in dystrophinopathies can be reduced by somatic gene transfer of dystrophin or utrophin. Mol Med 7: 355–364. 49. Winston BW, Krein PM, Mowat C, Huang Y (1999) Cytokine-induced macrophage differentiation: a tale of 2 genes. Clin Invest Med 22: 236–255. 50. Auwerx JH, Chait A, Wolfbauer G, Deeb SS (1989) Loss of copper-zinc superoxide dismutase gene expression in differentiated cells of myelo-monocytic origin. Blood 74: 1807–1810. 51. Tomoda T, Nomura I, Kurashige T, Kubonishi I, Miyoshi I, et al. (1991) Changes in Cu,Zn-superoxide dismutase gene during induced erythroid and myeloid differentiation. Acta Haematol 86: 183–188. doi: 10.1159/000204831. 52. Carter AB, Tephly LA, Venkataraman S, Oberley LW, Zhang Y, et al. (2004) High levels of catalase and glutathione peroxidase activity dampen H2O2 signaling in human alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol 31: 43–53. doi: 10.1165/rcmb.2003-0377OC. 53. Edwards RJ, Watts DC, Watts RL, Rodeck CH (1984) Creatine kinase estimation in pure fetal blood samples for the prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. Prenat Diagn 4: 267–277. doi: 10.1002/pd.1970040406. 54. Emery AE (1977) Muscle histology and creatine kinase levels in the foetus in Duchenne muscular dystrophy. Nature 266: 472–473. doi: 10.1038/266472a0. 55. Eli-Lily Rat study shows tadalafil and/or its metabolite crosses placenta and secreted into milk. Eli Lily Company's Drug Information.. 56. Mavrogeni S, Tzelepis GE, Athanasopoulos G, Maounis T, Douskou M, et al. (2005) Cardiac and sternocleidomastoid muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MRI study. Chest 127: 143–148. doi: 10.1378/chest.127.1.143. 57. Lichtman JW, Magrassi L, Purves D (1987) Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci 7: 1215–1222. 58. Strahler AN (1957) Quantitative analysis of watershed geomorphology. Trans Am Geophys Union 38: 913–920. doi: 10.1029/tr038i006p00913. 59. Rich MM, Lichtman JW (1989) In vivo visualization of pre- and postsynaptic changes during synapse elimination in reinnervated mouse muscle. J Neurosci 9: 1781–1805. 60. Matsuda R, Nishikawa A, Tanaka H (1995) Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem (Tokyo) 118: 959–964. doi: 10.1093/jb/118.5.959. 61. Tsai AG, Arfors KE, Intaglietta M (1991) Spatial distribution of red blood cells in individual skeletal muscle capillaries during extreme hemodilution. Int J Microcirc Clin Exp 10: 317–334. Оригинал статьи: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0000806 Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
