итоговая Государственный от «02» октября 2009 г. № 02.552.11.7059
advertisement
АННОТАЦИЯ итоговая1 научно-исследовательской работы Государственный контракт с Роснаукой: Шифр контракта: Тема работы: Цель работы: от «02» октября 2009 г. № 02.552.11.7059 «2009-07-5.2-00-08-091» «Проведение поисковых научно-исследовательских работ в области разработки конкурентоспособных и экологически безопасных биотехнологий производства продуктов органического синтеза с высоким рыночным потенциалом для медицинского и промышленного применения в центре коллективного пользования научным оборудованием «Идентификация и оценка биотехнологического потенциала микроорганизмов» Использование научных приборов и оборудования, а также методов научных исследований, разработанных или освоенных центром коллективного пользования научным оборудованием при проведении поисковых научно- исследовательских работ по теме «Разработка конкурентоспособных и экологически безопасных биотехнологий производства продуктов органического синтеза с высоким рыночным потенциалом для медицинского и промышленного применения в центре коллективного пользования научным оборудованием «Идентификация и оценка биотехнологического потенциала микроорганизмов» для последующего дооснащения имеющегося специализированного научного оборудования, развития новых и совершенствования существующих методов выполнения измерений для обеспечения и развития исследований в форме коллективного пользования. Использование природного микробного разнообразия для разработки конкурентоспособных и экологически безопасных биотехнологий производства бутанола, 1.3-пропандиола и акриловых мономеров для медицинского и промышленного применения. Живые системы Приоритетное направление развития науки и техники Критическая техБиокаталитические, биосинтетические и биосенсорные 1 нология Исполнитель: Ключевые слова: технологии; технологии биоинженерии Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов», 117545, г.Москва, 1-й Дорожный пр.,д.1 Микробиологический синтез, биокатализ, бутанол, 1,3пропандиол, акриловые мономеры 1 Актуальность проекта Биотехнологии производства продуктов органического синтеза с высоким рыночным потенциалом основаны на использовании специализированных штаммов-продуцентов клеточных метаболитов или ферментов. Современные методы создания штаммов-продуцентов включают широкий набор генетических и селекционных подходов, в.т.ч. клонирование генов, метаболическую инженерию и др. Применение таких методов для новых видом микроорганизмов часто затруднено отсутствием для этих бактерий генетических систем, векторов, методов введения рекомбинантных ДНК. Настоящий проект направлен на создание научно-технических заделов по технологиям производства важнейших продуктов органического синтеза с высоким рыночным потенциалом, таких как бутанол, 1,3-пропандиол и акриловые мономеры. Для создания конкурентоспособных и экологически безопасных биотехнологий производства таких продуктов требуются новые продуктивные штаммы-продуценты и уникальные ферментные системы. Центр Коллективного Пользования научным оборудованием «Идентификация и оценка биотехнологического потенциала микроорганизмов» в составе Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) предоставляет научно-методологические и экспериментальные возможности по скринингу новых штаммов, генетическому конструированию и быстрой оценке их потенциала. 2. Разрабатываемая продукция 2.1 Номенклатура продукции, разрабатываемой в рамках проекта 1. Штаммы - продуценты бутанола, использующие различные углеродные субстраты и позволяющие при периодической ферментации достигать уровня конверсии глюкозы более 30% при конечной концентрации бутанола более 2% . 2. Штаммы Closrtridium acetobutilicum c выключенными путями синтеза побочных продуктов ацетата и бутирата. 3. Штаммы природных микроорганизмов, устойчивые к 3,5-4 % бутанола. 4. Методы определения основных клеточных метаболитов, субстратов и продуктов биотрансформации акрилонитрила и акриламида. 5. Технологичные штаммы природных микроорганизмов, устойчивые к 100 г/л 1.3 пропандиола. 2 6. Штаммы бактерий, содержащие новые ферменты, катализирующие гидролиз нитрилов и амидов. 7. Методы получения высокоактивных катализаторов на основе клеток с нитрилазной активностью. 8. Метод биокаталитического получения акрилата аммония (не менее 25% растворов с конверсией 99%) 9. Методики синтеза полимеров на основе полученных мономеров. 2.2 Характеристика разрабатываемой продукции Результатом поисковых научно-исследовательских работ является создание научного задела по технологиям биосинтеза бутанола, пропандиола и акриловых мономеров и оценка эффективности разрабатываемых процессов биосинтеза клеточных метаболитов и мономеров на основе возобновляемого сырья и биокатализа. Разрабатываемые штаммы-продуценты клеточных метаболитов (бутанола и 1.3 пропандиола), биокатализаторы получения акриловых мономеров, а также процессы биосинтеза клеточных метаболитов и получения акриловых мономеров с помощью биокатализа обеспечат: - Рентабельность процесса получения бутанола на основе Clostridium из доступного сахаросодержащего сырья с себестоимостью бутанола не более 30 рублей/кг. - - создание новых процессов синтеза 1.3 пропандиола с уровнем накопления продукта не менее 100 г\л . - Получение концентрированных растворов акриловых мономеров (25% ) высокого качества, позволяющих синтезировать высокомолекулярные полимеры для широкого применения 2.3 Форма коммерциализации результатов проекта Созданные в ходе выполнения проекта штаммы-продуценты клеточных метаболитов и ферментов, а также основанные на их использовании процессы биосинтеза будут являться объектами патентования и лицензирования 3 Области и масштабы использования полученных результатов Полученные в ходе выполнения проекта результаты будут использованы для разработки опытно-промышленных технологий производства мономеров (бутанол, пропандиол и акриловые мономеры) на основе возобновляемого сырья и биокатализа с целью создания новых полимеров с улучшенными потребительскими свойствами. Основные области применения – промышленная биотехнология и полимерная химия. Разрабатываемые технологии получения солей акриловой кислоты и 1,3 пропандиола, основанные на использовании микробных клеток в качестве катализаторов, позволят получать мономеры полимерного сорта, при этом снизить энергозатраты, отказаться от дополнительных стадий очистки, повысить конверсию, уменьшить отходы, использовать в качестве сырья возоб3 новляемые источники и сделать процесс экологически безопасным. 4 Ход выполнения проекта C использованием потенциала ЦКП ГосНИИгенетика разработаны методики скрининга новых штаммов, перспективных для создания на их основе биотехнологий получения продуктов органического синтеза с помощью ферментации возобновляемого сырья и биокатализа. Впервые для скрининга штаммов, устойчивых к высоким концентрациям бутанола и пропандиола, а также штаммов, содержащих ферменты утилизации нитрилов, использована робототехника. Проведены исследования по выявлению штаммов с повышенной устойчивостью к бутанолу. Обнаружено 24 штамма бактерий, способных расти на средах с 3% бутанола. Среди них выявлены и идентифицированы 10 штаммов, способных расти при 3% (объем/объем) бутанола и утилизировать глюкозу в присутствии бутанола в концентрациях > 3,5% . Получена большая коллекция штаммов, свыше 200, способных утилизировать нитрильные соединения. Детальный анализ коллекции на наличие в штаммах ферментов нитрильного метаболизма выявил уникальную группу амидаз, способных гидролизовать N-замещенные амиды. На основе масштабного сравнительного анализа более 80 штаммов клостридий из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов на способность продуцировать бутанол, используя в качестве сырья различные углеродные субстраты (мука, крахмал, гидролизаты целлюлозы), осуществлен выбор 20 наиболее перспективных штаммов, способных продуцировать более 75% бутанола (от суммарных растворителей) или (и) обеспечивать в ходе ферментации накопление растворителей более 19 г/л. Полученные в ходе скрининга новые штаммы обладают уникальными свойствами, что позволяет рассматривать их в качестве базовых для разработки биотехнологий получения продуктов органического синтеза на основе ферментации возобновляемого сырья и биокатализа. Разработана система инактивации генов в клетках Clostridium acetobutylicum, обладающая высокой эффективностью, специфичностью и частотой интеграции селекционного маркера. Разработанная система успешно опробована на примере инактивации генов pta и buk, контролирующих биосинтез ацетата и бутирата в клетках Clostridium acetobutylicum. Таким образом, созданы предпосылки для повышения продуктивности штаммов Clostridium acetobutylicum с помощью методов метаболической инженерии. Клонированы гены, кодирующие ферменты метаболизма нитрильных соединений из трех природных штаммов - Acinetobacter radioresistens М6, Alcaligenes denitrificans С-32 и Rhodococcus erythropolis ТА37 и осуществлена их экспрессия в клетках E.coli. Экспрессия клонированного гена нитрилазы из штамма С-32 в E.coli обеспечила накопление белка нитрилазы в клетках в количестве не менее 30% от всех растворимых белков. При этом специфическая нитрилазная активность рекомбинантных клеток E.coli составила не менее 20 ед\мг клеток, что почти в 4 раза превышает уровень активности 4 родительского штамма A. denitrificans С-32. В штамме R. erythropolis ТА37 обнаружена ациламидаза, отличающаяся от всех известных амидаз по аминокислотной последовательности и субстратной специфичности. Обнаруженная ациламидаза обладала уникальной способностью гидролизовать замещенные амиды. С учетом полученных данных сделан вывод о том, что обнаруженная ациламидаза является представителем новой группы ферментов в семействе амидаз. Обнаруженный новый фермент –ациламидаза может использоваться в качестве биокатализатора получения N-замещенных акриламидов – важной группы акриловых мономеров. Для обеспечения селекционных и генетических работ разработаны лабораторные методики определения ключевых метаболитов, включая бутанол, этанол, ацетон, уксусную и масляную кислоты, 1,3-пропандиол с помощью газовой хроматографии. Также разработаны методики количественного определения концентраций акрилонитрила и акриловой кислоты, продукта трансформации акрилонитрилы с помощью нитрилазы. На основе рекомбинантных клеток E.coli, содержащих ген нитрилазы из Alcaligenes denitrificans С-32, разработаны высокопродуктивные биокатализаторы для получения акрилата аммония – широко используемого промышленностью акрилового мономера. Активность созданных биокатализаторов превышает 25 ЕД\мг, что в 3-4 раза выше уровня активности используемого в настоящее время биокатализатора на основе клеток A. denitrificans С-32. Проведены испытания биокаталитического способа получения мономера акрилата аммония с помощью биокатализатора с нитрилазной активностью и раствора акрилата аммония, полученного согласно разработанному способу. Испытания показали, что новый биокатализатор для получения акрилата аммония на основе рекомбинантного штамма E.coli E.coli BLR(DE3) pET16bnitC1-10 превосходит промышленный биокатализатор С32 по ряду покозателей, в частности обеспечивает более высокую продуктивность (233 г/г час против 79 для С32) и позволяет получать более высокие концентрации акрилата аммония (25% против 19% для С32). Разработанный процесс получения 25% растворов акрилата аммония с использованием полученного биокатализатора характеризуется следующими показателями: длительность процесса не превышает 2 часов, конверсия достигает более 99%. Полученные растворы акрилата аммония не содержат акрилонитрил (субстрат), ионы меди (менее 105%), при этом содержание акриламида (промежуточный продукт) не превышает 0,5%. Разработанный процесс позволяет получать 25% растворы акрилата аммония, которые по результатам тестирования у производителей отвечают техническим требованиям к мономерам полимерного качества, обладают высокой полимеризационной способностью и позволяют проводить синтез сополимеров акриламида и акриловой кислоты с заданными свойствами, широко востребованные в различных промышленных процессах. Селекционированы штаммы-продуценты бутанола и осуществлен выбор углерод содержащих субстратов, позволяющих превращать сахара в бутанол с конверсией выше 32%, что существенно превосходит уровень кон5 версии, ранее достигнутый в промышленности на основе периодической ферментации. Новые штаммы открывают возможности для разработки рентабельного биотехнологического процесса получения бутанола. Разработан модельный технологический процесс синтеза бутанола. Для оценки эффективности исследуемых продуцентов С.acetobutilicum на базе ЦКП ГосНИИгенетика создана установка, позволяющая проводить биосинтез бутанола в 3 л ферментерах, а также выделение и очистку бутанола и наработку опытной партии продукта. В результате широкого скрининга обнаружен штамм B. licheniformis, который превосходит по своим технологическим свойствам все ранее использованные штаммы для конструирования рекомбинантных продуцентов 1.3 пропандиола. Клонированы ключевые гены биосинтеза 1,3 пропандиола из глицерина и экспрессированы в реципиентном штамме B. licheniformis. Проведены патентные исследования с целью анализа известных биотехнологий получения 1.3 пропандиола с использованием природных и рекомбинантных микробных продуцентов. Разработаны основные этапы управляемого процесса биосинтеза 1.3 пропандиола на основе штамма Clostridium butyricum (diolis) В-10264, включающие этапы ферментации в 3-х литровом ферментере в режиме подпитки глицерином и выделения целевого продукта. В результате проведенных проверок с использованием разработанных методик показано, что скорость накопления , концентрация 1.3 пропандиола в культуральной среде и % конверсии глицерина сравнимы с известными по литературным данным аналогичными технологиями. Полученные результаты позволяют рассматривать эту биотехнологию в качестве базовой для дальнейшей оптимизации, в т.ч. путем селекционного повышения активности продуцента, и оценки ее рентабельности при масштабировании. В случае достижения рентабельности открывается возможность разработки промышленной биотехнологии. Достижение уровней накопления 1.3 ПД выше 70 г/л и использование в качестве сырья наряду с глицерином – глюкозы , возможно только при создании рекомбинантных продуцентов на основе штаммов с качественно более высокой устойчивостью к 1.3 ПД. Полученные в ходе выполнения проекта результаты свидетельствуют о перспективности использования для создания подобных продуцентов штамма B. licheniphormis B-4677. Полученные результаты полностью соответствуют требованиям Технического задания. 6
