Министерство образования и науки России ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
advertisement
Министерство образования и науки России ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И КАЧЕСТВА ___________АКАДЕМИЯ ЭКОЛОГИИ, МОРСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ____________ УДК 338.2 МАТЕРИАЛЫ ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНОЙ ШКОЛЫ ДЛЯ МОЛОДЕЖИ «ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ИННОВАЦИЙ В БИОЛОГИИ» Под общей редакцией Н.В. Воеводиной Л.С. Бузолевой Н.Н. Ханчук Владивосток 2010 СОДЕРЖАНИЕ ПРЕДИСЛОВИЕ ……………………………………………………………………………5 Раздел I НАУКА БИОЛОГИЯ КАК ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫЙ РЕСУРС……………………..9 Глава 1. Л.С. Бузолева. Влияние экзометаболитов микрофлоры обсеменяющей пищевые продукты, на пролиферативные свойства ассоциированной с ними L. monocytogenes …………………………………………………………………….......9 Глава 2. Т.А. Кузнецова. Бифидосодержащие продукты функционального питания…………………………………………………………………………….....18 Глава 3. Н.Л. Белькова, Е.В. Суханова, Н.Н. Деникина, О.Т. Русинек, Е.В. Дзюба. Молекулярно-генетические методы в изучении кишечной микрофлоры лососевидных рыб озера Байкал: проблемы и решения…………...26 Глава 4. А.Г. Гербст. Подходы к компьютерному моделированию углеводбелковых взаимодействий…………………………………………………………..40 Глава 5. С.В. Охотина. Бактериальные биопленки и ремедиация среды……...43 Глава 6. Н.Л. Белькова, Е.Б. Матюгина, С.О. Воронова, Н.В. Долгих. Современные методы идентификации и детекции физиологического статуса водных микроорганизмов…………………………………………………………...46 Глава 7. И.А. Теркина, Г.А. Федорова, О.П. Глызина, В.В. Парфенова. Поиск и исследование новых антимикробных метаболитов, продуцируемых бактериями озера Байкал……………………………………………………………48 Глава 8. Н.Б.Цветкова. Изменчивость биологических свойств Listeria monocytogenes под действием абиотических факторов при культивировании на пищевых продуктах…………………………………………………………………57 Глава 9. И. А. Теркина. Актиномицеты озера Байкал, как перспективные источники биологически-активных соединений……………………………….....60 Глава 10. Л.С. Бузолева. Влияние холодового обогащения на синтез биологически активных веществ у возбудителей сапрозоонозов………………..61 Глава 11. А.В. Гринченко, В.В. Кумейко. Активность агглютинирующих факторов гуморальногоиммунитета двустворчатых моллюсков Modiolus kurilensis и Anadara broughtoni из некоторых акваторий Японского моря……...62 Глава 12. Ю.Н. Сокольникова, В.В. Кумейко. Показатели фагоцитоза гемоцитов двустворчатых моллюсков Modiolus kurilensis из некоторых 2 акваторий Японского моря с незначительной антропогенной нагрузкой…….....65 Глава 13. А.А. Анисимова. Использование метода проточной цитофотометрии для оценки пролиферативной активности гемоцитов и диагностики гемоцитарной неоплазии у двустворчатых моллюсков…………………………..67 Глава 14. А.В. Мартынова, А.П. Прушинский, Е.С. Носач, О.А. Чулакова. Разработка метода идентификации и генотипирования микроорганизмоввозбудителей инфекций респираторного тракта…………………………………..70 Раздел II БИОТЕХНОЛОГИИ КАК ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕСУРС ………….................73 Глава 1. Е.А. Бородин. Инновационные технологии в производстве пищевых продуктов из сои. Использование соевых продуктов в медицине…………….....73 Глава 2. М.В. Антонюк, Б.И. Челнокова, Т.А. Гвозденко, О.Н. Фотина. Лечебные грязи Приморского края и перспективы их использования…………..83 Глава 3. Н.Е. Спиченкова. Морская экспериментальная станция ТИБОХ ДВО РАН (МЭС) – база для образовательных, научных и прикладных программ.......93 Глава 4. Е.А. Богатыренко. Пробиотики как перспективное направление в биотехнологии……………………………………………………………………….94 Глава 5. А.А. Коротких, И.Э. Памирский, М.А. Штарберг, Е.А. Бородин. Создание фармацевтического препарата на основе соевого ингибитора трипсина…………………………………………………………………………......99 Глава 6. М.Л. Сидоренко. Оценка возможности использования лиственничной губки в качестве источника биологически активных веществ……………….....103 Глава 7. Е.А. Остапенко. Характеристика микрофлоры обрастания причальных сооружений бухты Парис………………………………………………………….106 Раздел III УПРАВЛЕНИЕ ПРОДВИЖЕНИЕМ БИОТЕХНОЛОГИЙ ………………………..109 Глава 1. Н.В.Воеводина. Инновации: от науки к интеллектуальному ресурсу……………………………………………………………………………...109 Глава 2. Н.Н. Ханчук. Некоторые вопросы сущностных категорий в теории инноваций………………………………………………………………………… 111 Глава 3. Т.А. Жукова. Эффективная презентация как инструмент управления инновациями………………………………………………………………………..122 Глава 4. И.В. Глущук. Управление инновационным проектом на примере продвижения разработки «Пробиотики»…………………………………………125 Глава 5. П.Ю. Долгих. Внедрение результатов научного исследования……...129 3 Глава 6. Т.Е. Лопатина. Синергический эффект развития инновационного предпринимательства в сфере высоких технологий……………………………..131 Раздел IV РАЗВИТИЕ НАУКОЕМКОГО ПРОИЗВОДСТВА ………………………………......135 Глава 1. А.П. Мирошниченко. Интересы бизнеса в инновационной деятельности………………………………………………………………………..135 Глава 2. В.Д. Даровских. Мобильный микроманипулятор (наноробот) для сервиса биологических и технических систем…………………………………...137 НАШИ АВТОРЫ……………………………………………………………….................150 4 ПРЕДИСЛОВИЕ Инновационная деятельность характерна развитием системных связей между наукой, образованием, хозяйствующими субъектами, государственными мероприятиями и финансовыми учреждениями. Развитие системных связей является сегодня процессом крайне нестабильным, реагирующим на множество факторов риска. Системность связей формируется этапами и рассматривается как экономические отношения. Таким образом, инновация выражает экономические отношения, возникающие по поводу трансформации знания в фактор производства. Функции инновации: 1. Междисциплинарная организация проектирования. 2. Систематизация научного знания и научного опыта. 3. Создание интеллектуального ресурса. Регулирование инноваций в РФ реализуется Стратегией инновационного развития, Политикой инновационного развития, Федеральными целевыми программами и финансовой политикой РФ. Инновации являются частью бюджетной системы РФ, так как инновационная деятельность и развитие инновационной инфраструктуры финансируется из федерального и местного бюджетов. Инновации также являются частью финансовой системы, так как НИОКР координируется Межведомственной комиссией по научно-инновационной политике. Эффективность НИОКР в вузах или на предприятии вливается в процесс денежно-кредитного регулирования. Цель Стратегии инновационного развития РФ сформулирована следующим образом: конкурентоспособность технологичной продукции и восприимчивость инноваций бизнесом. Ожидаемые результаты сформулированы как: - внебюджетное финансирование инновационной деятельности довести до - рост числа технологичных малых предприятий. При этом показатели 70%; инновационного развития запланированы в следующем содержании и интервалах значений. 5 Таблица 1 - Целевые показатели Стратегии 2004 2007 2010 2015 инерционная динамика 1,6 1,9 1,94 1,99 с учетом реализации Стратегии 1,6 2,0 4,0 5,5 инерционная динамика 2,0 2,3 2,6 3,1 с учетом реализации Стратегии 2,0 2,9 4,6 8,1 инерционная динамика 0,7 1,5 3,5 8,5 с учетом реализации Стратегии 0,7 7,0 15,0 30,0 1. Коэффициент изобретательской активности (число патентных заявок на изобретения, поданных российскими заявителями в стране, в расчете на 10 тыс. населения) 2. Число зарегистрированных договоров об уступке патента и лицензионных договоров (тыс. ед.) 3. Удельный вес нематериальных активов в общей сумме активов организаций сектора исследований и разработок (%) Для достижения поставленных ориентиров выбраны такие инструменты регулирования инновационной деятельности, как: 1. Развитие производственно-технологической инфраструктуры (технопарки, инновационно-технологические центры, бизнес-инкубаторы, центры трансфера технологий, инжиниринговые центры и т.п.); 2. «диффузии» Содействие развитию связей в рамках инновационной деятельности и знаний, поддержка совместных исследований на стадии экспериментальных исследований и опытных производств. Сдерживание инновационной активности возникает по двум причинам: 1. Недофинансирование процессов по причине размытости критических направлений, информационной непрозрачности результатов научно-технической деятельности, отсутствия технологической и индустриальной оценки, неэффективного использования средств местных бюджетов; 2. Высокая стоимость нововведений: отсутствие института государственных гарантий, отсутствие связей между вузом и предприятиями «прикладные исследования – опытно-конструкторские разработки – производство». 6 Стратегия инновационного развития экономики РФ послужила фундаментом для формулировки политики инновационного развития РФ, цель которой - формирование экономических условий для вывода на рынок конкурентоспособной инновационной продукции в интересах реализации стратегических национальных приоритетов Российской Федерации. При этом Политика провозглашает следующие механизмы ее реализации установление порядка закрепления и передачи прав на результаты интеллектуальной деятельности гражданского и двойного назначения, созданные за счет средств федерального бюджета, с целью их введения в хозяйственный оборот. Механизм реализации направлен на содействие развитию торговли ценными бумагами предприятий высокотехнологичных отраслей. Политика инновационного развития реализуется через Федеральную Целевую Программу «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России», которая выполняется в рамках следующих приоритетных тематических направлений: - информационно-телекоммуникационные системы; - индустрия наносистем; - стратегические и перспективные материалы; - технологии живых систем; - рациональное природопользование; - энергетика и энергосбережение; - безопасность и противодействие терроризму. Второй этап ФЦП (2010-2012гг.) ставит задачи: - технологической модернизации экономики и повышение ее конкурентоспособности; - обеспечения активного развития инновационной деятельности предприятий. Развитие инноваций как части финансовой системы должно учитывать тенденции развития финансового рынка РФ. Основные направления единой государственной денежно-кредитной политики ЦБ РФ на 2010г. и период 2011 и 2012гг. ставит следующие ориентиры развития: - ставка рефинансирования – 10%; - снижение инфляции до 9-10% в 2010г. и 5-7% в 2012г.; - переход к плавающему валютному курсу. Таким образом, перспективы развития инноваций в биологии базируется на следующих инструментах государственного регулирования инноваций: 7 1. Усиление контроля за эффективностью НИР - оптимизация затрат на первичную экспертизу экономической содержательности НИР; 2. Кредитование технико-внедренческой деятельности малых предприятий – будет консервативным; 3. Совместное сосуществование инвестора, хозяйства и ученого – по принципу минимизации затрат; 4. Основной источник финансирования НИОКР – бюджетные средства; 5. Развитие инвестиций в инновации - зависит от уровня подготовки кадров. Из этого следует, что основными функциями инновацтй должны быть: 1.Подготовка специалистов; 2. Управление стоимостью внедрения; 3. Управление трудоемкостью работ; 4. Управление финансами инновационных хозяйств; 5. Управление естествознанием. Н.В.Воеводина 8 ___________________________________________________________________________ Раздел I НАУКА БИОЛОГИЯ КАК ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫЙ РЕСУРС ___________________________________________________________________________ Л.С. Бузолева Глава 1. ВЛИЯНИЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВ МИКРОФЛОРЫ, ОБСЕМЕНЯЮЩЕЙ ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ, НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ СВОЙСТВА АССОЦИИРОВАННОЙ С НИМИ L. MONOCYTOGENES. Введение Данные зарубежных и отечественных исследований за последние годы свидетельствуют об исключительно широких адаптивных способностях листерий, позволяющих им размножаться в сапрофитической фазе в различных природных субстратах (растительных, почвенных, водных). Листерии способны к размножению в широком диапазоне температуры, влажности и рН среды, а их высокая метаболическая пластичность обусловливает возможность перехода от сапрофитической фазы к паразитической и наоборот, что, наряду с традиционными представлениями о связи листерий с теплокровными организмами, позволяет рассматривать листерии как типичный сапрозооноз. Особенности экологии листерий проявляются и при контаминации ими продуктов питания животного и растительного происхождения. Если в работах 10-20 летней давности листериозную инфекцию прежде всего связывали с употреблением в пищу сырых продуктов животного происхождения или непосредственным контактом с животными, особенно с грызунами, то в последние годы многочисленные эпидемические вспышки листериоза в высокоразвитых странах мира (США, Великобритания, Канада, Франция) были связаны с употреблением готовых продуктов пищевой индустрии, прошедших соответствующую обработку и контроль (сыры, особенно мягкие, различные мясные полуфабрикаты для приготовления «fast food», салаты и др.). Причем в США листериоз по числу 9 смертельных исходов лидирует среди других пищевых инфекций (до 30%). У чувствительных людей листериоз могут вызвать всего 100 клеток L. monocytogenes, поэтому даже непродолжительный период хранения пищевого продукта с листериями при температуре бытового холодильника в течение 1,5-3 дней может сделать продукт опасным для здоровья. Таким образом, в настоящее время листериоз следует рассматривать, прежде всего, как пищевую инфекцию с четко обусловленным путем преимущественного распространения, что диктует необходимость разработки системы индикации листерий в продуктах питания (Douglas A., 1992). На сегодняшний день экология и эпидемиология листериоза еще полностью не раскрыта. До сих пор остается неясным, что влияет на вирулентные свойства и размножение L. monocytogenes при культивировании на продуктах питания. 1. Экономический ущерб По данным профессора H. Seeliger (1989) листерии выявлены в 30 различных видах продукции Европейского происхождения. В настоящее время проблема пищевого листериоза помимо медицинского, приобретает и существенное социальноэкономическое значение. Изъятие зараженных продуктов из торговли, ограничение ввоза и вывоза, остановка производства приносят ущерб в сотни миллионов долларов США и европейским странам – экспортеров сыра и мясных продуктов (Carvajal A., Fredericsen W., 1988; Карликанова Н., 1999; Костенко Ю., 1997). Так, в марте 1999 года в порционных упаковках сливочного масла от 5 до 10 граммов финской компании «Милка» были обнаружены патогенные листерии. Из 18 заболевших трое скончались. Завод был закрыт, проведено тщательное расследование. Листериями было заражено оборудование. А спустя некоторое время листерии обнаружились во Франции, в сырах, произведенным небольшим фермерским заводом, в сортах «Эпуаз» и Сумэтрен» (www.mega.kemerovo.su). Во Франции в 2000 году компании Nestle пришлось изъять из продажи 114 тысяч коробок с мороженым, зараженных листериями (Агенство News, 2000г.). Около 30 млн. фунтов мяса, а так же мясных полуфабрикатов пришлось изъять из розничной продажи американской компании Wample Foods после того, как анализы выявили их заражение патогенными листериями. Это крупнейшее изъятие мяса кур и индеек за всю историю Минсельхоза США (до сих пор самым крупным оставался отзыв из розничной торговли около 11 тонн фарша для гамбургеров, проведенный в 10 1997 году). Все продукты из мяса домашней птицы были уничтожены (Агенство ФгроФакт, 2002г.). В апреле 2005 года в Алтайский край была завезена очередная партия (101 тонна мяса птицы) окорочков цыплят в декоративной обсыпке гриль. Краевой ветеринарной инспекцией в образцах мяса были обнаружены листерии (Агенство АМИТЕЛ, 2005г.). В Российскую Федерацию был поставлен мягкий сыр «Fermier Calvet feuille x 12» (Cavet Picodons Sarl, Франция), произведенный из сырого молока, инфицированный листериями. Канадская инспекция пищевых продуктов отозвала из продажи несколько видов сэндвичей и ростбифов, зараженных листериями, которые продавались в Онтарио. Жителям советовали не употреблять в пищу готовые ростбифы и сэндвичи торговой марки «Mainline Market Best Picks». Также были отозваны сэндвичи и ростбифы из магазинов в Ривервью (Нью-Брансуик), Сиднее и Дартмаусе, что в Новой Шотландии. В пятницу инспекция отозвала 10 видов сэндвичей, проданных компанией «William Davids Foods Ltd» в Онтарио. Ростбифы, отозванные из продажи, произведены квебекской компанией «Les Salaisons Desco Inc.», располагающейся северо-восточнее Монреаля. Ранее продукция этой компании отзывалась уже дважды. 21 октября в Квебеке были отозваны сэндвичи под торговой маркой «Plaisirs Gastronomiques», а 23 октября – сэндвичи «Savco», проданные в Сарнии, Онтарио. Недавние вспышки листериоза в Торонто и Квебеке (Канада, 2009г.) подтвердили причастность к ним именно сыров и мясных продуктов питания. Число жертв заражения пищевыми продуктами с листериями в Канаде достигло 19 человек. Источник заражения мясоперерабатывающий завод компании "Мейпл лиф" в окрестностях Торонто. Следы опасной бактерии были обнаружены на двух разделочных машинах. Завод с 20 августа был закрыт на глубокую санитарную обработку, а из торговли были отозваны продукты около 200 наименований на общую сумму около 20 млн. долларов. Еще одна вспышка листериоза зарегистрирована в Квебеке: там источником бактериального заражения стали сыры и по решению органа санитарного контроля провинции 11 видов продукции местной сыроваренной промышленности были изъяты из продажи. В 2008 году Россельхознадзор ввел временные ограничения на поставки продукции с ряда европейских и одного азиатского предприятия. Как сообщили ИТАРТАСС в этом ведомстве, при мониторинге на безопасность поступающей в Россию пищевой продукции было обнаружено около 60 тонн опасных для здоровья человека товаров. Так, задержана 1 тонна французского куриного мяса и 32 тонны исландской икры мойвы, в которых были обнаружены листерии. Это послужило поводом к 11 введению временных ограничений на ввоз в РФ продукции с предприятийпоставщиков. В конце прошлого года - начале этого поступила партия мясопродуктов (сосиски и готовый продукт "Мясо для завтрака") в количестве 40 тонн из штата Арканзас. Мясопродукты были распределены в торговой сети Москвы, Санкт-Петербурга и Мурманска. Обнаружив в продуктах бактерии листерии, Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия России уведомил об этом Минсельхоз США, изъял продукты из продажи и через посольство США решает вопрос о возвращении опасных продуктов изготовителю. Таблица 2 – Случаи заболеваемости пищевым листериозом (на основании данных литературы за последние 10 лет) Страна США Швейцария Продукт Причина заражения Случаи заболеваний Фарш для гамбургеров, Контаминация 1999 год оборудования Нет Сыр, 2002 год Добавление сырого 142 заболевания, молока 47 летальных исходов Горячие сосиски Контаминация 79 заболеваний, (hot dog), 2002год оборудования 20 летальных исходов Мясо кур, 2002 год Контаминированное 120 заболеваний, сырье 20 летальных исходов Свиные и говяжьи сосиски, Контаминация на Нет 2006 год производстве Молоко из супермаркета, Контаминация 6 заболеваний, 2008 год оборудования 3 летальных исхода Сыр 2007 год Контаминация на 122 заболевания производстве Паштет, 2006 год Контаминация на Свыше 300 заболеваний производстве Англия Сэндвичи, 2007 год Контаминация на Нет производстве Языковая колбаса, 1997 год Сыр, 1999 год Контаминация 279 заболеваний, оборудования 63 летальных исхода Контаминация Нет оборудования Франция Шотландский атлантический Контаминация на копченый лосось, 2000 год производстве Мороженое, 2000 год Контаминированное Нет 10 заболеваний молоко 12 Италия Студень из языка, Контаминация 24 заболевания, 2000 год оборудования 7 летальных исходов Колбаса, 2001 год Контаминация в 1300 заболеваний хранилище Финляндия Канада Сливочное масло, 1999 год Мясные продукты, 2008 год Сыр, 2008 год Бразилия Говядина, 2007 год Контаминация 18 заболеваний, оборудования 3 летальных исхода Контаминация 26 заболеваний, оборудования 12 летальных исходов Контаминация на 18 заболеваний, производстве 1 летальный исход Котаминированное Нет сырье Эстония Филе сельди в растительном Контаминация на масле, 2006 год производстве Окорочка цыплят, 2004 год Контаминация на Россия Нет Нет складах Камбала дальневосточная, Контаминация на 2005 год складах Нет 2. Меры контроля на производстве Происшедшие вспышки листериоза показали, что в самой технологии приготовления ряда продуктов содержится опасность контаминации листериями и их размножения до высоких концентраций. Возбудитель листериоза предприятия с сырьем, пищевыми L. monocytogenes попадает на ингредиентами (чаще растительного происхождения), с необеззараженной водой, с частицами почвы, уличной пыли, с упаковочным материалом. Источником листерий могут быть работники предприятия, занятые на начальных этапах переработки сырья, плохо вымытые и необеззараженные руки персонала, контактирующего с сырьем, полуфабрикатом или готовой продукцией. Местами размножения листерий могут быть любые недостаточно очищенные и продезинфицированные технологические поверхности, которые имеют выемки, полости, трещины, царапины и которые постоянно или регулярно увлажняются во время работы. Листерии сохраняют жизнеспособность на холодных поверхностях оборудования и способны на них размножаться. На поверхности технологического оборудования, в микротрещинах и царапинах, листерии образуют микроколонии, покрытые дополнительной оболочкой, так называемые «биопленки», которые не удаляются обычными моющими средствами. 13 Частично проблема поступления патогенных листерий на производство может быть решена введением в практику процедуры санации сырья и вспомогательных материалов. Тем не менее эта процедура не исключает попадания листерий на предприятие другими путями. То есть вероятность попадания листерий на любое производство постоянно остается высокой, а пути распространения листерий не всегда легко выявляются. Для гарантированного снижения численности L. monocytogenes в готовой продукции ниже норматива следует создать систему защиты предприятия от патогенных листерий и наладить постоянный мониторинг их распределения. Контроль за распространением листерий не будет успешным, если на производстве нарушаются правила GMP («Правильной производственной деятельности») или не соблюдаются санитарные требования по организации технологического процесса (СанПин 2.3.4.050-96). На начальном этапе создания контроля за листериями следует заново оценить, насколько целесообразно распределены стадии технологического процесса по помещениям, нет ли резерва в организации производства для снижения вероятности как вторичного заражения листериями сырья, полуфабрикатов, готовой продукции, так и их размножения, образования на оборудовании зон постоянной локализации. Для организации и проведения контроля за распространением L. monocytogenes назначается ответственное лицо, которое разрабатывает план контрольных мероприятий и, что особенно важно, постоянно корректирует его в зависимости от результатов проверки эффективности процедур мойки и дезинфекции. (Дмитириева, Мухина, 2008). При проведении бактериологического контроля продуктов питания на наличие листериозной инфекции необходимы: быстрота исследования, так как пищевые продукты не могут долго храниться, высокая достоверность результатов, не только качественный, но и количественный анализ, т. е., определение величины контаминации (Бакулов, Васильев, 1999). Для достижения этих целей необходимо совершенствовать лабораторную диагностику листериоза в том числе методы экспресс-контроля листерий в продуктах питания и других потенциально опасных для человека объектах. На сегодняшний день бактериологический метод является основным для обнаружения и идентификации эффективным в силу листерий. Однако часто он является слабо обнаруженной у листерий способности переходить в некультивируемое состояние. Перспективнее всего применение ПЦР с использованием праймеров на основе последовательностей гена листериолизина О (hly) или фосфолипазы (plcA). Данный подход позволяет в 3 раза сократить число культур, 14 изначально идентифицированных как L. monocytogenes, а так же обнаружить в продуктах листерии, находящиеся в некультивируемом состоянии (Ефимочкина, 2005). Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет выявить возбудитель в течение нескольких часов, однако он является довольно дорогостоящим, что ограничивает его применение в большинстве современных лабораториях. На современном этапе разработки методов исследования необходимо обратить внимание на биотические факторы (факторы стимуляции роста и размножения), способные дать толчок для разработки простых, не дорогих и эффективных методов выделения и идентификации листерий в пищевых продуктах. 3. Влияние метаболитов на процессы размножения L. monocytogеnеs при разных температурах культивирования На продуктах питания листерии обитают в сообществе с сапрофитной микрофлорой, вступая в определенные связи и взаимоотношения с ней. Так, итальянские ученые смоделировали взаимодействие бактерий в мясопродуктах, при котором сроки хранения сосисок и салями увеличиваются (New Scientist, 2008). Отличительной особенностью модели итальянских ученых является не только влияние простых факторов: наличие пищи, влажность, температура и уровень кислотности среды, но и учет конкуренции за ресурсы, которая возникает между различными видами бактерий внутри одного продукта. При помощи новой модели исследователи изучали развитие микроорганизмов внутри салями во время процесса ее приготовления. В качестве конкурента Listeria monocytogenes выступали молочнокислые бактерии. Это еще раз, хотя и косвенно доказало, что одним из механизмов, оказывающих влияние на рост листерий, может быть действие метаболитов, стимулирующих размножение бактерий (Николаев, 1996; Ильинская 2002). В связи с этим целью нашей работы являлось изучение влияния метаболитов штаммов сопутствующей флоры пищевых продуктов на рост и размножение Listeria monocytogenes на продуктах питания. Для решения данной проблемы методом прямого смыва с поверхности продуктов (сыр «Российский», сосиски свиные, креветка) были получены 67 штаммов сопутствующих сапрофитных микроорганизмов. Для выяснения способности метаболитов данных культур стимулировать рост и размножение листерий применяли метод прямого культивирования (скрининг-метод) (сапрофит сеяли ковриком на 15 чашку, фильтровальные диски, пропитанные культурой испытуемых листерий 109 укладывали на поверхность среды другой чашки, скрепляли чашки друг напротив друга скотчем) при температурах 22˚С и 6˚С. В результате оценки взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые летучие метаболиты были отобраны два штамма смытых с поверхности сыра (№7 и №8), стимулирующих рост листерий при 6˚С и 22˚С соответственно. Методом фильтрации были получены метаболиты изолированных штаммов в стадии активного роста периодического культивирования и применены в ходе дальнейших исследований. 4. Не культивируемые формы листерий При переходе во внешнюю среду из организма человека или животного или при резком изменении условий существования в этой среде патогенные бактерии с помощью различных сенсорных и регуляторных механизмов перестраивают работу своего генетического аппарата, что позволяет им сохранять свою жизнеспособность. В настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о способности не спорообразующих бактерий к длительному существованию во внешней среде в виде клеток со значительно сниженной метаболической активностью, не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования на питательных средах. Таким образом, не культивируемыми (НФ) называют такие формы микроорганизмов, которые в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшении условий культивирования возобновляют пролиферацию. В настоящее время способность к переходу в не культивируемое состояние обнаружена у широкого круга микроорганизмов, в том числе и у листерий. Необходимо отметить, что на продуктах питания возможно существование листерий в не культивируемом состоянии, что подтверждается низким процентом высеваемости при использовании стандартных бактериологических методов и сред. Есть данные, что присутствие не культивируемых форм листерий на продуктах питания подтверждалось методом ПЦР. Так, исследование нами 50 проб продуктов дало нулевой процент высеваемости листерий, однако при проведении генетического исследования было обнаружено 8 образцов, контаминированных некультивируемыми формами листерий, что составило 16% от общего количества образцов. 16 Ранее предполагалось, что температура является основным фактором, индуцирующим образование НФ. Однако переход в НС зависит не только от температуры культивирования, но и от вида микроорганизма, его физиологического состояния, сопутствующих факторов. Даже незначительные вариации химического состава среды при оптимальной температуре могут индуцировать переход в НС. Долгое время биологические индукторы НС оставались неизвестны. Но появились немногочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о важной роли биотических факторов в образовании НФ. Так, Listeria monocytogenes в ассоциации с зелеными водорослями или в присутствии их экзометаболитов значительно быстрее переходили в НС, чем в контроле (Пушкарева В. И., Емельяненко Е. Н., Диденко Л. В.). Мы осмелились предположить, что в процессе жизнедеятельности некоторые сапрофитные бактерии, обитающие на продуктах питания, могут выделять вещества не только усиливающие рост и размножение симбионтов, изменяющие экспрессию их биологических свойств, но так же и индуцирующие реверсию штаммов Listeria monocytogenes в культивируемое состояние. Восстановительным культивированием (по Мукомоловой) с метаболитами ранее полученных культур сапрофитов переводили не культивируемый штамм Listeria monocytogenes NCTC 4b в культивируемое состояние и проверяли изменение морфологических, биологических и вирулентных свойств. В результате только один штамм №7 (холодовой!!!) индуцировал реверсию не культивируемого штамма. Достоверность результата подтверждена генетически. Важно отметить, что колонии листерий приобрели нехарактерную (по сравнению с контролем) морфологию. Они стали значительно крупнее в диаметре (до 0,5-0,8 мкм), имели ровный край, выпуклый центр, слизистую консистенцию, кремовато-белую окраску. Отсутствовал специфический запах, характерный для листерий, что косвенно свидетельствовало об изменении продуктов метаболизма. Анализ измененных ферментировать L(+) свойств листерий показал утрату способности рамнозу, D(+) ксилозу, маннозу, манит в течение 7 суток, отсутствие подвижности при 22˚С, замедленную способность индуцировать лецитиназу как в присутствии угля, так и без него (на 4-е сутки), значительное снижение вирулентности (LD50 - 6,8х107). Однако в отличие от исходного штамма наблюдалось ярко выраженное увеличение зоны гемолиза (почти a-гемолиз), что свидетельствует об усилении гемолитической активности восстановленного штамма. 17 Для восстановления первоначальных свойств листерий провели пассирование в триптиказо-соевом бульоне с дальнейшим высевом на чашки с агаром КД для листерий. После 3 пассажа наблюдали постепенное изменение морфологии колоний и появление способности разлагать рамнозу и маннозу. Полное восстановление свойств, характерных для исходного штамма Listeria monocytogenes NCTC 4b наблюдали после 5 пассажа на питательных средах. Проводится идентификация выделенных штаммов сапрофитных микроорганизмов. Заключение Таким образом, на уровне тест – микроорганизмов мы нашли вещество, способное стимулировать рост и переход бактерий Listeria monocytogenes в культивируемое состояние. Следующим этапом исследований должно быть получение данного фактора стимуляции роста, которое можно будет использовать в диагностике, посредством добавления его в среды накопления для листерий. Дальнейшая разработка диагностических систем с использованием данного фактора роста позволит ускорить этап выделения и идентификации бактерий Listeria monocytogenes, в том числе и на продуктах питания, что с успехом можно применять в санитарно – медицинской практике и на производстве. Т.А. Кузнецова Глава 2. БИФИДОСОДЕРЖАЩИЕ ПРОДУКТЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПИТАНИЯ 1. Функциональное питание и продукты функционального питания В последние десятилетия ввиду роста числа хронических заболеваний и установления их причинной связи с несбалансированным питанием, к пищевым продуктам стали относиться как к эффективному средству поддержания физического и психического здоровья и снижения риска возникновения ряда заболеваний. Одним из пионеров, предложивших продукты питания и отдельных их компоненты в качестве 18 фармацевтических препаратов, являлся дважды лауреат Нобелевской премии Лайнус Полинг, обосновавший в 60-80 гг. прошлого века теорию и практику «Ортомолекулярной медицины», согласно которой физическая болезнь и психическое заболевание могут быть излечены не с помощью лекарственных средств, а путем тщательного отбора и применения оптимальных количеств определенных макро- и микронутриентов (например, витамины) или веществ эндогенного происхождения (например, инсулин). В нашей стране в эти же годы активным пропагандистом фармакологических эффектов пищевых продуктов являлся директор Института питания академик А.А. Покровский. Авторитетное мнение Л. Полинга, других ведущих исследователей, нутрициологов и клиницистов стимулировало во всем мире поиск и идентификацию тех пищевых продуктов и специфических нутриентов, которые оказывают благоприятные эффекты на организм человека. В современном терминологическом плане концепция «Функционального питания» как самостоятельного научно-прикладного направления в области здорового питания сложилась в начале 90-х годов. С современных позиций под термином «функциональные пищевые продукты» понимают такие продукты питания, которые предназначены для систематического употребления в составе пищевых рационов всеми возрастными группами здорового населения с целью снижения риска развития заболеваний, связанных с питанием, сохранения и улучшения здоровья за счет наличия в их составе физиологически функциональных пищевых ингредиентов [ГОСТ 52349-2005]. Согласно «Научной концепции Функционального питания в Европе» (Scientific Concepts of Functional Food in Europe), разработанной в 1995-1998гг [20; 29], продукты питания лишь в том случае могут быть отнесены к функциональным, если имеется возможность продемонстрировать их позитивный эффект на ту или иную ключевую функцию (функции) человека (помимо традиционных питательных эффектов) и получить веские объективные доказательства, подтверждающие эти взаимоотношения. Рекомендуется по возможности идентифицировать конкретные маркеры этих функций, чувствительные к модулирующему эффекту пищевых функциональных ингредиентов, если позитивные эффекты на эти функции проявляются при употреблении пищи (или ее действующего начала) в количествах, которые безопасны для организма. 19 2. Пробиотики, пребиотики, синбиотики Мы останавливаем внимание на функциональных пищевых продуктах, в состав которых входят про- и пребиотики. С современных совокупность позиций множества микрофлору человека микробиоценозов, рассматривают занимающих как многочисленные экологические ниши на коже и слизистых всех открытых внешней среде полостей макроорганизма, Наиболее сложный по составу микробиоценоз в толстом кишечнике. Условия жизни человека в современном городе, сопровождаемые воздействием целого ряда негативных факторов (неблагоприятная экология, антибиотики, стрессы и пр.) породили «синдром мегаполиса», который проявляется в нарушении обмена веществ, ослаблении иммунитета, нарушении микробной экологии пищеварительного тракта. Одна из его составляющих - снижение уровня бифидо- и лактофлоры и возрастание условно-патогенных микроорганизмов у человека, т.е. дисбактериоз (дисбиоз). Важнейшей составляющей лечебного комплекса дисбактериозов являются пробиотики - живые культуры микроорганизмов, относящихся к нормальным обитателям различных экологических ниш макроорганизма. Они свободны от побочного действия химических соединений. Их использование является наиболее физиологичным по регулирующему влиянию на микрофлору. В настоящее время все больше внимания уделяется разработкам пробиотиков, в состав которых входят несколько микроорганизмов, принадлежащих к различным родам и видам. При этом, прежде всего учитывают взаимодействия микробов в естественной среде обитания, и в первую очередь, симбиоз бифидобактерий с лактобациллами, так как именно они доминируют в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта. Так, бифидобактерии создают деятельности лактобацилл, а лактобациллы условия для способствуют метаболической размножению би- фидобактерий. Последние колонизируют в основном в толстом кишечнике, а лактобактерии - и в остальных отделах пищеварительного тракта. В настоящее время общепризнанна роль, которую играют бифидобактерии в поддержании здоровья человека. Бифидобактерии составляют основу микрофлоры кишечника (до 90% у взрослых и до 95% у детей). Основные функции бифидобактерий в организме - подавление активности гнилостных и патогенных бактерий и обеспечение защиты от кишечной инфекции; торможение роста клеток опухоли в 20 кишечнике; активизация кишечных функций и участие в синтезе и усвоении питательных веществ, витаминов и микроэлементов; усиление иммунной защиты. Помимо пробиотиков для необходимы также макроорганизме поддержания нормальной пребиотики. микрофлоры Пребиотики – в соединения различного немикробного происхождения, способные стимулировать симбиотную флору кишечника (или способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активизацию метаболической функции нормальной микрофлоры). Наиболее верная тактика лечения дисбактериоза заключается в применении комбинированных пребиотиков, например сочетание энтеросорбента (для нейтрализации патогенных микроорганизмов) и пребиотика (для стимуляции роста нормальной микрофлоры). Пребиотики обеспечивают функциональное питание облигатных бактерий кишечника, являются источником энергии для них, снижают потенциал роста условно патогенной и метаболические патогенной реакции кишечной полезных флоры, стимулируют представителей и активизируют микрофлоры, усиливают энергообеспечение и регенерацию эпителия толстой кишки, активируют иммунитет, не подвергаются гидролизу пищеварительными ферментами человека, не абсорбируются в верхних отделах пищеварительного тракта, лишены побочных эффектов при длительном использовании. Исследования показали, что высокий уровень нормальной микрофлоры не служит показателем того, что она в полной мере проявляет свои полезные свойства. Под влиянием неблагоприятных факторов может изменяться не только видовой состав бифидо- и лактобактерий, но и их ферментативная активность. Поэтому становится целесообразным одновременное использование про- и пребиотиков. Такие комбинированные биопрепараты получили название синбиотики (полученные в результате рациональной комбинации про- и пребиотиков препараты). Один из механизмов пробиотического действия следующий: обитающие в кишечнике бифидобактерии вырабатывают ферменты типа гидролаз, эти ферменты расщепляют пребиотики, и полученная таким образом энергия, используется бифидобактериями для роста и размножения. Кроме того, в этом процессе образуются органические кислоты. Именно они понижают кислотность среды и тем самым препятствуют развитию патогенных микроорганизмов, которые не обладают ферментами для переработки пребиотиков. 21 Пробиотики и пребиотики широко применяют в производстве молочных продуктов ежедневного рациона человека. Такая продукция полезна как детям, так и взрослым и способствует профилактике различных заболеваний. 3. Кисломолочный бифидумбактерин и новые пробиотические продукты категории продуктов функционального питания - бифидумбактерин на молочной и белково-растительной основе, обогащенный БАВ из морских гидробионтов. При НИИЭМ СО РАМН уже 17 лет существует производство кисломолочного бифидумбактерина, осуществляемое медицинской фирмой «Дисбактериоз». Кисломолочный бифидумбактерин представляет собой стерильное молоко, сквашенное бифидобактериями, и имеет приятный вкус ряженки. Основные технологические этапы производства осуществляются в соответствии с ТУ 9222-001-01898115-94 и ТИ 1-27033654-94 на производство бифидумбактерина кисломолочного и инструкции МЗ СССР по применению кисломолочного бифидумбактерина № 5/33-101-2; М.:1988, с соблюдением санитарных норм и правил для предприятий молочной промышленности и включают следующие операции: подготовка сырья и материалов (приготовление молока из сухого молока или детских смесей) и расфасовка в стеклянную тару с пробками из алюминиевой фольги; стерилизация молока (в автоклавах); приготовление закваски (в стерильных условиях из лиофильно-высушенной производственных штаммов бифидобактерий В.Iongum B379M или B.bifidum 791 готовят рабочий раствор закваски с концентрацией не менее 109 КОЕ/см3); приготовление продукта кисломолочного (внесение закваски, сквашивание в термостатах при 37 - 40С в течение 24 часов); охлаждение (до температуры 4 ± 2С в холодильных камерах); маркировка (этикетка); хранение; реализация. Хранят и реализуют продукт кисломолочный при температуре от 2°С до 6°С в течение 5 суток с момента окончания технологического процесса, в том числе на предприятии-изготовителе не более 18 часов. На всех стадиях производства продукта кисломолочного производят контроль за соблюдением технологических параметров. Технохимический, 22 микробиологический контроль и контроль качества готовой продукции по показателям безопасности осуществляют в соответствии со стандартами на методы, указанными в ТУ на данный продукт. В целях расширения ассортимента присутствующих на рынке бифидопродуктов, нами разработана технология и получены пробные партии новых пробиотических продуктов, относящихся к категории продуктов функционального питания, а именно бифидумбактерина на молочной и белково-растительной основе, обогащенного БАВ из морских гидробионтов (тинростима, ДНК, моллюскама, фукоидана, каррагинана и сочетания 2-х последних). Перспективными в этом плане являются маристим (уникальный комплекс биологически-активных веществ из икры морских ежей с широким спектром активности), кумазид (БАВ из кукумарии) и другие БАВ. Преимущества новых продуктов. А) Высокая эффективность в нормализации микрофлоры кишечника Одно из главных условий эффективности - высокая концентрация живых бифидобактерий (не менее 109-10 на 1 мл). Установлено, что введение в рацион пробиотиков, кисло-молочных продуктов, биологически активных добавок, содержащих штаммы микроорганизмов в обычных низких (106-7) дозах или в виде сухих препаратов, не способно эффективно подавить рост патогенных видов микроорганизмов в толстой кишке. Попадая в желудочнокишечный тракт, бифидо- и лактобактерии подвергаются действию соляной кислоты в желудке, а затем оставшиеся жизнеспособные штаммы преодолевают иммунную защиту тонкой кишки и антагонистическое влияние ее собственной микрофлоры, и к месту назначения попадает только малая доля необходимых микроорганизмов. Следующим важным условием эффективности новых продуктов является высокая физиологическая активность бифидобактерий. В отличие от сухих, в жидких пробиотиках, к которым относятся полученные нами новые продукты, бактерии находятся в активном состоянии. Свое благотворное воздействие они оказывают незамедлительно после приема препарата. Что касается сухих препаратов, то большинство штаммов бифидобактерий при сушке значительно теряют свою активность и восстанавливают её только после попадания в благоприятную для размножения среду и проделав цикл делений. Им требуется 8-10 часов для перехода к активному физиологическому состоянию, однако к этому времени большая их часть уже может быть естественным образом элиминирована из кишечника. Таким образом, при комплексной терапии дисбактериоза на порядок должны быть увеличены дозы назначаемых пробиотиков и их активность. 23 Полученные нами новые продукты содержат штаммы бифидобактерий (bifidum, longum), обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной флоре (сальмонеллам, стафилококку, протею, патогенной кишечной палочке), а также задерживает размножение хеликобактера (одного из главных факторов, провоцирующих заболевания язвой желудка и двенадцатиперстной кишки). Кроме живых бактерий полученные нами напитки содержат продукты жизнедеятельности бифидобактерий, в частности такие биологически активные вещества, как незаменимые аминокислоты, органические кислоты, витамины, интерфероностимулирующие и иммуномодулирующие вещества. Употребление новых продуктов способствуют росту и развитию других представителей нормальной флоры кишечника (в частности, лактобактерий). Б) Возможность использования разными категориями потребителей, в том числе при лактазной недостаточности (в зависимости от основы продукта (молочная, растительная). Как известно, натуральное коровье молоко содержит в значительном количестве молочный сахар лактозу. Лактоза не усваивается в кишечнике в натуральном виде; для ее усвоения необходимо расщепление на простые сахара - глюкозу и галактозу при помощи фермента бета-D-галоктозидазы, более известного как лактаза. По оценкам специалистов до 70% людей страдают недостаточностью фермента лактазы и плохо переносят употребление молочных продуктов. Кроме того, коровье молоко сильный аллерген, а использование его для питания грудных детей и детей, страдающих желудочно-кишечными заболеваниями, затруднено, вследствие повышенного содержания в нем ионов кальция, что приводит к образованию в желудке ребенка плотного, трудно перевариваемого коагулята белка. Перспективным субстратом для бифидумбактерина является молоко на основе соевых бобов и фруктово-овощные соки. Соевое молоко эквивалентно коровьему по биологической ценности, но не содержит ряда белков-аллергенов и лактозы, холестерина. Главными достоинствами соков являются их пищевая и биологическая ценность, обусловленная присутствием углеводов, витаминов, минеральных солей, клетчатки, пектиновых веществ. Кроме того, перечисленные продукты отличаются низкой калорийностью, что позволяет рекомендовать их для функционального питания. Тыквенный сок и соевое молоко оказались прекрасным субстратом для роста и активизации бифидобактерий, содержание которых при добавлении н-ДНК увеличивалось с 109 до 1010 КОЕ/г. 24 Нами (совместно с ТИБОХ ДВО РАН, ТГЭУ и ТИНРО-центром) разработаны технологические режимы приготовления бифидумбактерина на основе соевого молока и тыквенного сока с добавлением н-ДНК (утверждены ТУ и ТИ на продукт на молочнорастительной основе «Бифидум Дальневосточный» (кисломолочный или на основе сои или тыквенного сока с н-ДНК)). Новые продукты на белково-растительной основе (соевое молоко, тыквенный сок) рекомендованы для лиц с лактазной недостаточностью. Органолептические, физико-химические и другие показатели готовых продуктов не отличались от общепринятых. При переносимости коровьего молока применимы разработанные нами продукт кисломолочный с фукоиданом - «Бифидофукус», каррагинаном - «Бифидокрасный», и с их сочетанием – «Бифидокомплекс». Разработана технология производства (ТУ и ТИ) на эти продукты и подана заявка на патент «Кисломолочный напиток». Новые кисломолочные продукты, характеризуются, прежде всего, хорошей усвояемостью. Эти продукты оказывают стимулирующее действие на секреторную активность пищеварительных желез; способствуют нормализации перистальтики кишечника за счет молочной кислоты; способствуют улучшению всасывания микроэлементов (P, Ca, Fe); оказывают гипохолестеринемический эффект; способствуют сорбции и выведению тяжелых металлов. В) Иммуномодулирующий эффект, обусловленный самим пробиотиком, как природным иммуномодулятором, а также полезные эффекты, обусловленные биологической активностью того или иного БАВ. Помимо того, что восстановление нормальной микрофлоры кишечника приводит к реализации последней (ею) иммуномодулирующего действия, БАВ оказывают свои полезные, в том числе иммуномодулирующие эффекты. Г) Показания (рекомендации) к применению новых продуктов Полученные новые бифидопродукты рекомендованы для систематического применения и могут быть отнесены к категории продуктов функционального питания у взрослых. Спектр показаний к их применению довольно широк: дисбактериозы кишечника, кишечные инфекции, колиты, интоксикации различного происхождения, длительное применение антибиотиков, радиационное облучение, стрессы. Показано применение новых продуктов с профилактической целью при нервно-эмоциональном напряжении, повышенных физических и интеллектуальных нагрузках. Новые продукты перспективны для эффективной профилактики многих заболеваний (ОРЗ, гриппа, кишечных инфекций и др.), для детоксикации организма, 25 для восстановления после стрессовых ситуаций, во время и после курса антибактериальной, гормональной, лучевой терапии. Н.Л. Белькова, Е.В. Суханова, Н.Н. Деникина, О.Т. Русинек, Е.В. Дзюба Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИЗУЧЕНИИ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЛОСОСЕВИДНЫХ РЫБ ОЗЕРА БАЙКАЛ: ПРОБЛЕМЫ И РЕШЕНИЯ Введение В настоящее время технология разведения рыб в аквакультуре во многих странах превратилась в одну из наиболее быстропрогрессирующих отраслей производства продовольствия. Российская Федерация по наличию водоемов, отвечающих требованиям культивирования гидробионтов, занимает первое место в мире (Богерук, 2005). Современное развитие аквакультуры, как и всего агропромышленного комплекса, во многом определяется применением в производстве инноваций, базирующихся на использовании научно-технических разработок (Богерук, 2005). Решение острых проблем, выведение рыбной отрасли из многолетнего системного кризиса и достижение поставленной цели возможно только на основе инновационного пути развития экономики рыбохозяйственного комплекса. В настоящее время в нашей стране в разных секторах аквакультуры появляются эффективно работающие рыбоводные хозяйства, в основе деятельности которых лежат инновационные решения, базирующиеся на применении прогрессивных биотехнологий. При разведении рыб, как в естественных, так и в искусственных водоемах, одной из серьезных проблем является изменение трофности водной среды и образование токсичных соединений, вызванных увеличением продуктов животного метаболизма. В этих условиях преимущество для роста и развития получают сапрофитные микроорганизмы, происходит распространение бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, что ведет к повышенной смертности объектов культивирования. В рыбоводных хозяйствах широко распространены бактериальные заболевания, объединенные термином "краснуха" карпов: аэромоноз, псевдомоноз, бактериальная 26 геморрагическая септицемия, смешанные бактериальные инфекции (Грищенко и др., 1999; Buller, 2004). Исследования микрофлоры рыб необходимы для контроля и коррекции их питания, для научного обеспечения контроля показателей качества и безопасности сырья и готовой продукции, а также для изучения патогенных бактерий и факторов, способствующих профилактике инфекционных заболеваний (Абрамова, 2004; Извекова и др., 2007; Кириченко и др., 2004; Кузьмина, 2005; Austin, 2002; Buller, 2004). Использование новых, современных технологий в профилактике и терапии заболеваний рыб позволит существенно снизить экономические потери, вызванные массовой гибелью их от инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы становятся надежным и удобным инструментом для решения многих прикладных задач в данной области. Методы диагностики бактериальных инфекций на основе видоспецифичной амплификации (ПЦР-диагностика) – современные наукоемкие технологии – показали свое преимущество перед классическими микробиологическими методами детекции и идентификации бактериальных заболеваний рыб: они требуют меньше времени для получения результата и эффективны для детекции заболеваний, особенно на ранних стадиях. ПЦР-диагностика бактериальных инфекций позволяет корректно идентифицировать возбудителей тех болезней, культивирование и определение которых по классическим биохимическим тестам затруднительно. Этот метод активно используется в странах с развитой аквакультурой (Норвегия, Канада и др.), постоянно совершенствуется и развивается (Buller, 2004; Haygood et al., 1992; Haygood, 1993; Van der Maarel et al., 1999; Spanggaard et al., 2000). В настоящее время подобраны специфичные праймеры на патогенные микроорганизмы таких родов, как Aeromonas, Lactococcus, Flavobacterium и др. (Buller, 2004). Известно, что бактериальные клетки имеют различный физиологический статус: живые; жизнеспособные, но некультивируемые; резистентные – споры; мертвые. Определение жизнеспособности клеток имеет принципиальное значение в таких областях использования ПЦР-методологии, как пищевая микробиология (учет активных бактериальных клеток в продуктах питания), медицинская и ветеринарная микробиология. Для детекции живых клеток применяют ОТ-ПЦР и мРНК (Novak, Juneja, 2001; Bentsink et al., 2002), однако возникают определенные трудности, как с воспроизводимостью результатов такого анализа, так и с корректной дифференцировкой живых и мертвых клеток при использовании мРНК в качестве маркерных молекул (McKillip et al., 1998; Sheridan et al., 1998). Другое направление 27 исследований связано с применением методов микроскопии и проточной цитометрии с красителями, позволяющими различать живые и мертвые клетки, такие как Syto 9 или BacLight (Michel et al., 1999; Burnett, Beuchat, 2002; Rudi et al., 2005). Однако в данном случае чувствительность метода существенно ниже, чем ПЦР или подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) (Rudi et al., 2005). Поэтому разработка методологии, позволяющей использовать ПЦР для дифференциации ДНК из живых и мертвых бактериальных клеток, позволит полностью использовать потенциал ПЦРметодологии в микробной диагностике (Lee, Levin, 2009). В настоящее время в мировой научной литературе обсуждаются результаты лабораторных экспериментов по селективному различению ДНК из живых и мертвых бактериальных клеток с помощью производных этидиумбромида (Flekna et al., 2007; Lee, Levin, 2007, 2009; Nocker et al., 2009). Мы сочли, что использование производных этидиумбромида для ингибирования ДНК из мертвых клеток перед проведением ПЦР является наиболее перспективным методом. Цель работы – разработка эффективной методики, позволяющей быстро и корректно детектировать бактериальные инфекции рыб в условиях искусственного содержания с учетом селективной детекции живых и жизнеспособных бактериальных клеток на основе специфичного ингибирования внеклеточной ДНК. Материалы и методы Пробы биологического материала отбирали в карантинном и экспозиционном аквариумах Байкальского музея ИНЦ СО РАН. Исследования выполнены на следующих видах байкальских рыб: а) черный байкальский хариус (Thymallus baicalensis): три здоровых особи и рыба со слизистыми обрастаниями на внешних покровах, анализировали образцы соскобов около головы, спинного плавника и по боковой линии; б) ленок (Brachymystax lenok): две особи с язвами на внешних покровах, анализировали ежедневные образцы соскобов слизи в месте язвенных кровотечений в течение 7 дней; в) байкальский сиг (Coregonus lavaretus baicalensis): две особи с язвами на внешних покровах, анализировали ежедневные образцы соскобов слизи в месте язвенных кровотечений в течение 7 дней; г) байкальский омуль (Coregonus migratorius): пять внешне здоровых особей, анализировали образцы переднего, среднего и заднего отделов кишечника, соскобов около головы, спинного плавника, по боковой линии. 28 Все образцы отбирали в двух повторностях и подвергали первичной обработке: либо добавление трис-солевого буфера (ТСБ) и использование сразу же для выделения тотальной ДНК, либо суспендирование биологического материала в ТСБ и обработка моноазидом этидиумбромида. Отбор биологического материала и первичная обработка проб. Образцы тканей рыб собирали стерильным скальпелем в пробирки эппендорф и добавляли от 100 мкл до 1 мл трис-солевого буфера в зависимости от объема биологического материала (ТСБ: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5; 0,1 M NaCl; 2 мМ ЭДТА). Проводили серию экспериментов по определению оптимальных условий первичной обработки бактериального материала: 1) суспензию биологического материала использовали без фиксации для выделения тотальной ДНК и фиксировали этанолом до конечной концентрации 70%; 2) лизис биологического материала с добавлением понижающих концентраций анавидина (табл. 3) и 3) обработка биологического материала моноазидом этидиум бромида (ЕМА) для удаления внеклеточной ДНК. Для этого к 100 мкл суспензии добавляли 2 мкл ЕМА (50 мг/мл), инкубировали во льду 1 мин при освещении 650 вт. Выдерживали в темноте 20 мин и использовали для выделения тотальной ДНК. Эксперименты выполнены в трех повторностях. Таблица 3 - Схема эксперимента по возможности использования раствора анавидина в качестве последующего лизирующего выделения агента для суммарных разрушения нуклеиновых бактериальных кислот, клеток пригодных и для амплификации Концентрация анавидина Дополнительный Результаты лизирующий агент амплификации 0,01% Ана 1* – – 0,02% Ана 1 – – 0,05% Ана 1 – – 0,1% Ана 1 – – 0,01% Ана 1 1% SDS ++ 0,02% Ана 1 1% SDS ++ 0,05% Ана 1 1% SDS + 0,1% Ана 1 1% SDS – 0,01% Ана 2** – + 0,02% Ана 2 – – 0,05% Ана 2 – – 0,1% Ана 2 – – 29 0,01% Ана 2 1% SDS ++ 0,02% Ана 2 1% SDS ++ 0,05% Ана 2 1% SDS ++ 0,1% Ана 2 1% SDS – – 1% SDS – – Ферментативный лизис ++ Примечания: * - Анавидин товарный продукт (бочка) ** - Анавидин с запахом лесных трав (№ партии 16-07 МК-6) Интерпретация результатов амплификации: – ПЦР-продукт не был получен ++ получено два ПЦР-продукта как специфический бактериальный, так и неспецифический с ДНК рыбы + получен только неспецифический ПЦР-продукт с ДНК рыбы Выделение ДНК методом ферментативного лизиса проводили с пробами без предварительной обработки, фиксированными 70% этанолом и после обработки ЕМА. Для выделения тотальной ДНК к 100 мкл пробы с биологическим материалом добавляли 300 мкл ТСБ с лизоцимом (10 мкг/мл), лизис проводили в течение 60 мин при 37°С (Белькова и др., 2008). Затем добавляли 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл), инкубировали 30 мин при 60°С. Для денатурации белков добавляли 40 мкл 10% SDS и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Проводили три стадии замораживания-оттаивания. Белки и остатки клеточных стенок удаляли фенолхлороформной экстракцией. К водной фазе добавляли 1/10 объема 3M ацетата натрия (pH 5,0) и 2 объема абсолютного этанола. ДНК осаждали в течение ночи при –20С, собирали центрифугированием на настольной центрифуге на максимальных оборотах 30 мин (12000 об/мин). Для удаления солей осадок промывали 400 мкл 70% холодного этанола, затем его подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (ТЕ: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5; 1 мМ ЭДТА). Выделение ДНК из проб после эксперимента с анавидином проводили с помощью сорбента. Обработку лизирующими растворами проводили, как описано в таблице 3. Пробы прогревали 10 мин при 60С, центрифугировали 15 мин на настольной центрифуге (12000 об/мин), надосадочную жидкость переносили в новую пробирку. К прозрачному лизату добавляли 25 мкл сорбента. Суспензию тщательно суспендировали на вортексе, выдерживали при комнатной температуре 5 мин, 30 периодически перемешивая. Центрифугировали 30 сек при 12000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок промывали 400 мкл 70% этанола и подсушивали 30 мин при 60°С. Нуклеиновые кислоты элюировали в 25 мкл ТЕ буфера. Для этого осадок тщательно суспендировали, прогревали в термостате 5 мин при 60°С и центрифугировали 5 мин на настольной центрифуге на максимальных оборотах (12000 об/мин). Надосадочную жидкость тщательно, без сорбента отбирали в новую пробирку и использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция. Выделенную суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР и подбирали режим, обеспечивающий высокое качество ПЦРпродукта ожидаемой длины на праймерах, комплементарных участкам гена 16S рРНК бактерий с разным уровнем специфичности (табл. 4). Амплификацию вели в разных условиях, в том числе проверяли температуру отжига в градиенте температур от 44 до 72°С в амплификаторе DNA Engine DYADTM. Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле. Таблица 4 - Структуры праймеров, использованных в работе (Белькова, Андреева, 2009) Название праймера Детектируемая Структура 5’–3’ филогенетическая группа Консервативные праймеры 21L TTCCGGTTGATCCYGCCGGA Архебактерии 109L ACKGCTCAGTAACACGT Архебактерии 333L TCCAGGCCCTACGGG Архебактерии 344L ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA Архебактерии 915R GTGCTCCCCCGCCAATTCCT Архебактерии 958R YCCGGCGTTGAMTCCAATT Архебактерии 1492R GGCTACCTTGTTACGACTT Архебактерии 500L CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA Эубактерии 1350R GACGGGCGGTGTGTACAAG Эубактерии 338L ACTCCTACGGGAGGCAGCAG Эубактерии 500R TTACCGCGGCTGCTGGFACG Эубактерии NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA Эукариоты Групп-специфичные праймеры 35L CTGGCTCAGAYCGAACG Альфа-протеобактерии 681L AGTGTAGAGGTGAAATT Альфа-протеобактерии 663L GAATTCCATCCCCCTCT Бета-протеобактерии 680L CRCGTGTAGCAGTGA Бета-протеобактерии 31 319L GTACTGAGACACGGACCA Цитофаги-Флавобактерии 342L CAGCAGTAGGGAATCTTC Бациллы 31L GATCCTGGCTCAGAATC Ацидобактерии 235L CGCGGCCTATCAGCTTGTTG Актинобактерии 930R CTCCACCGCTTGTGTGA Планктомицеты NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC Saprolegniaceae Видо-специфичные праймеры АН-F GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA Aeromonas hydrophila AH-R CGTGCTGGCAACAAAGGCCAG Aeromonas hydrophila PAF GACCTCGCGCCATTA Pseudomonas anguilliseptica PAR CTCAGCAGTTTTGAAAG Pseudomonas anguilliseptica BF1 TCACCAAGGCRACGATGCG Bacillus licheniformis BR2 CGTATTCACCGCGGCATG Bacillus licheniformis 650L TAGAGTATGGGAGAGGAT Acinetobacter calcoaceticus Амплификацию с лизатами клонов после клонирования проводили на плазмидных праймерах, рекомендованных фирмой производителем и поставляемых в наборе для клонирования (GeneJETTM PCR Cloning Kit, Fermentas). В амплификацию брали 1 мкл лизата. Режим реакции: 94С – 5 мин (1 цикл), 92С – 45 сек, 55С – 45 сек, 72С – 45 сек (30 циклов). После амплификации ПЦР-продукты анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле в ТА буфере (2 мМ трис-ацетат, рН 7,6). Полосы нужной длины вырезали из геля. ПЦР-продукты элюировали замораживанием-оттаиванием и использовали для секвенирования. Лигирование ПЦР-продукта и трансформация клеток Escherichia coli. Для лигирования использовали набор GeneJETTM PCR Cloning Kit (Fermentas). Реакцию проводили по рекомендации фирмы-производителя. Компетентные клетки E. coli (штамм XL-1) для трансформации получали, используя методику трансформации CaCl2-зависимых клеток (Sambrook et al., 1989). Анализировали все выросшие колонии. Для быстрого скрининга большого числа колоний использовали метод «кипячения» клеток. Лизат клеток после центрифугирования (15 мин, 12000 об/мин) использовали в качестве матрицы в ПЦР на плазмидных праймерах. Сравнительный анализ. Анализ полученных последовательностей проводили путем их сравнения с последовательностями, зарегистрированными в международной базе данных с помощью пакета программ FASTA (http://www.ebi.ac.uk/fasta33). Наличие химерных структур определяли анализом последовательностей с имеющейся 32 базой данных с помощью пакета программ CHECK CHIMERA (http://rdp8.cme.msu.edu/html/analyses.html). Результаты и обсуждение Для разработки эффективной методики, позволяющей быстро и корректно детектировать бактериальные инфекции рыб, необходимо оценить разные подходы для фиксации бактериального материала и выделения тотальной ДНК. Нами для фиксации и лизиса бактериальных клеток были использованы как классические процедуры: фиксация этанолом и выделение ДНК методом ферментативного лизиса, так и апробирована возможность использования новых химических реагентов, лизирующих клеточные стенки бактерий и денатурирующих внутриклеточные белки. Разработка эффективной методики предполагает поиск оптимальных реагентов и условий лизиса в максимально сжатые сроки. Для этой цели нами впервые эффективный антисептик – анавидин, разработанный на основе производных гуанидина в Иркутском институте химии СО РАН (патент РФ N2144024), был использован в качестве реагента, лизирующего клеточные стенки бактерий. Качество полученной ДНК проверяли ПЦР на консервативных бактериальных праймерах (табл. 4). Положительным считали наличие хотя бы одного ПЦР-продукта. Установлено, что оптимальной для лизиса клеток является концентрация анавидина 0,01% и добавление додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1% (рис. 1). Таким образом, нами показано, что при низких концентрациях анавидин является эффективным лизирующим реагентом и на его основе возможно создание нового набора для выделения тотальной ДНК. 1400 п.н. 1000 п.н. 500 п.н. Рисунок 1 - Электрофоретический анализ результатов амплификации тотальной ДНК из соскоба слизи больного сига. М – маркер молекулярного веса, Р – положительный контроль – ДНК выделена методом ферментативного лизиса, в остальных случаях указаны концентрации анавидина 1 и 2 (%, об/об) 33 Нами ранее показано, что в результате ПЦР на консервативных праймерах получено два продукта длиной 900 и 1050 пар нуклеотидов (п.н.) (Белькова и др., 2008). Более длинный ПЦР-продукт соответствует фрагменту гена 18S рРНК исследуемого вида рыб. К сожалению, загрязнение ДНК организма-хозяина при проведении видоспецифичной амплификации на бактериальных праймерах приводит к ложно отрицательному результату. Нами использованы праймеры с разным уровнем специфичности для дальнейшей разработки методики (табл. 4). В серии экспериментов показано, что с разных матричных ДНК получается разный спектр целевых ампликонов, неспецифичные полосы могут синтезироваться с ДНК организма-хозяина (рис. 2). На следующем этапе была предпринята попытка селективной амплификации бактериальной ДНК. М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М 1400 п.н. 1000 п.н. 500 п.н. Рисунок 2 - Электрофоретический анализ результатов амплификации тотальной ДНК, выделенной из соскоба слизи сига на парах праймеров: 1 – 500L-1350R, 2 – 21L-1492R, 3 – 109L-915R, 4 – 333L-958R, 5 – 344L-958R, 6 – 35L-500R, 7 – 681L1350R, 8 – 663L-1350R, 9 – 680L-1350R, 10 – 319L-1350R, 11 – 338L-930R, 12 – 235L-1350R, 13 – 31L-1350R, 14 – BF1-BR2, 15 – 342L-1350R, 16 – NS8-NS1, 17 – 650L-1350R, 18 – безматричный контроль на паре 500L-1350R, М – маркер молекулярного веса Известно, что этидиумбромид встраивается в двойную цепь ДНК, что способствует ее разрушению при облучении УФ-светом. Установлено, что обработка клеток производным этидиумбромида – моноазидом (ЕМА) с последующим кратковременным освещением светом высокой мощности приводит к селективной инактивации как внеклеточной ДНК, так и ДНК, находящейся в мертвых или частично разрушенных клетках (Nocker, Camper, 2006; Wagner et al., 2008). Механизм этого процесса основан на неспособности этого химического реагента проникать через клеточную стенку жизнеспособных и активных клеток. При мониторинге бактериальных заболеваний существует необходимость получения достоверной информации: из живых или мертвых бактериальных клеток 34 получен ампликон. Актуальность проведения данной диагностики вызвана следующими особенностями: 1) в пробах, взятых с внешних покровов рыб, особенно с травмированных участков тела, присутствуют как бактериальные, так и мертвые (лизированные) клетки эпителия организма-хозяина; 2) специфика профилактики и лечения бактериальных инфекций, заключается в регулярной обработке аквариумов дезинфицирующими средствами, разрушающими клетки микроорганизмов. Мы использовали моноазид этидиумбромида для селективной инактивации внеклеточной ДНК, ДНК отмерших эпителиальных клеток организма-хозяина, а также мертвых бактериальных клеток. Следует отметить, что вся процедура дополнительной обработки занимает несколько минут (обработка светом идет в течение 90 сек). В экспериментах использовали как соскобы с внешних покровов рыб, так и фрагменты кишечника (рис. 3). ПЦР-продукты на некоторых специфичных праймерах, в частности на специфичных праймерах на бактерии рода Bacillus, удалось получить только с тех препаратов ДНК, которые были получены после дополнительной обработки ЕМА. Очевидно, что соотношение ДНК:ЕМА при первичной обработке биологического материала является принципиально важным и должно быть оптимизировано для полного ингибирования ДНК в мертвых клетках. Были проведены предварительные эксперименты по поиску оптимальных концентраций бактериальных клеток для ингибирования ДНК после их разрушения или фиксации на примере культуры грамотрицательных бактерий Escherichia coli. Результаты показали, что фиксация или разрушение клеточной суспензии, титр клеток в которой меньше 1–2×105 кл./мл, и последующая обработка ЕМА приводят к полному ингибированию тотальной ДНК, т.к. не удается получить ПЦР-продукты на праймерах с разным уровнем специфичности. При титре клеток выше 1×106 кл./мл обработка суспензии клеток ЕМА после их лизиса не влияет на получение ПЦР-продукта. 35 1400 п.н. 1000 п.н. 500 п.н. Рисунок 3 - Электрофоретический анализ результатов амплификации тотальной ДНК, выделенной из проб ЖКТ байкальского омуля М3-5 без обработки ЕМА, М6-28 после обработки на парах праймеров: ADF-1350R, BET-1350R. М – маркер молекулярного веса, б/м – безматричный контроль. . По-видимому, соотношение ДНК:ЕМА в последнем случае не является оптимальным для полного ингибирования ДНК в мертвых клетках. Это соотношение необходимо учитывать при оценке оптимального количества биомассы материала, которое необходимо отбирать при проведении диагностического молекулярногенетического анализа. Для этого необходимо провести дополнительные эксперименты по определению оптимальных концентрацией ЕМА при обработке микроорганизмов с разным типом клеточной стенки. Однако несомненно, что данный подход является перспективным для дальнейшего исследования и практических рекомендаций. На следующем этапе была проведена диагностика бактериальных инфекций лососевидных рыб, вызываемых Aeromonas hydrophila и Pseudomonas anguilliseptica, в условиях аквариумной экспозиции Байкальского музея ИНЦ СО РАН на основе видоспецифичной амплификации. Эти микроорганизмы широко распространенны в естественных водоемах. В благоприятных условиях рыбы обладают устойчивостью к этим видам и вырабатывают вещества, предупреждающие развитие инфекций. 36 Апробацию метода и подбор условий видо-специфичной амплификации проводили для анализа соскобов с кожных покровов рыб. Положительные ПЦР-продукты были получены только с препаратов ДНК, полученных с внешних покровов рыб с явными проявлениями язвенных заболеваний. Таким образом, разработана эффективная методика, позволяющая корректно детектировать бактериальные инфекции рыб в условиях искусственного содержания с учетом селективной детекции живых и жизнеспособных бактериальных клеток на основе специфичного ингибирования внеклеточной ДНК. Работа поддержана инновационным проектом «Тест-системы для диагностики бактериальных инфекций рыб» 2008 г. ИНЦ СО РАН и выполнена в рамках программы РАН №23, подпрограммы 1, проект 23.13 (2009-2010 гг., рук. Е.В. Дзюба). Библиографический список 1. Абрамова Л. С. Основные направления технологических исследований ВНИРО // Прикладная биохимия и технология гидробионтов : труды ВНИРО. - М. : Изд-во ВНИРО, 2004. - Т. 143. - С. 9–16. 2. Белькова Н. Л., Андреева А. М. Введение в молекулярную экологию микроорганизмов : учебно-методическое пособие. – Ярославль : Изд-во ООО «Принтхаус», 2009. – 91 с. 3. методов Белькова Н. Л., Дзюба Е. В., Суханова Е. В., Ханаева Т. А. Адаптация молекулярно-генетического анализа для изучения микроорганизмов, ассоциированных с рыбами // Биология внутренних вод. - 2008. - № 2. - С. 91–94. 4. Богерук А. К. Аквакультура в России: история и современность // Рыбное хозяйство. - 2005. - № 4. - С. 14–18. 5. Грищенко Л. И., Акбаев М. Ш., Васильков Г. В. Болезни рыб и основы рыбоводства. – М. : Колос, 1999. – 456 с. 6. Извекова Г. И., Извеков Е. И., Плотников А. О. Симбионтная микрофлора рыб различных экологических групп // Известия РАН. Серия биологическая. - 2007. - № 6. - С. 728–737. 7. Кириченко С. Г., Курлапова Л. Д., Хромых Н. Н., Рубцова Т. Е., Бакштанский Э. Л., Митешова Т. С., Волкова А. Б., Платонова Н. А., Катышкова Т. И., Полуяктов В. Ф., Копыленко Л. Р. Экспертиза продуктов из гидробионтов // Прикладная биохимия и технология гидробионтов : труды ВНИРО. - М. : Изд-во ВНИРО, 2004. - Т. 143. - С. 42–44. 37 8. Кузьмина В. В. Физиолого-биохимические основы экзотрофии рыб. - М. : Наука, 2005. – 300 с. 9. Austin B. The bacterial microflora of fish // TheScientificWorldJOURNAL. - 2002. - Vol. 2. - P. 558–572. 10. Bentsink L., Leone G. O., van Beckhoven J. R., van Schijndel H. B., van Gemen B., van der Wolf J. M. Amplification of RNA by NASBA allows direct detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in potato // J. Appl. Microbiol. - 2002. - Vol. 93. - P. 647–655. 11. Buller N. B. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual. – Oxfordshire : CABI publishing, 2004. – 361 p. 12. Burnett S. L., Beuchat L. R. Comparison of methods for fluorescent detection of viable, dead, and total Escherichia coli O157:H7 cells in suspensions and on apples using confocal scanning laser microscopy following treatment with sanitizers // Int. J. Food Microbiol. - 2002. - Vol. 74. - P. 37–45. 13. Flekna G., Stefanic P., Wagner M., Smulders F. J. M., Mozina S. S., Hein I. Insufficient differentiation of live and dead Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes cells by ethidium monoazide (EMA) compromises EMA/real-time PCR // Res. Microbiol. 2007. - Vol. 158. - P. 405–412. 14. Haygood M. G. Light organ symbioses in fishes // Crit. Rev. Microbiol. - 1993. - Vol. 19. - P. 191–216. 15. Haygood M. G., Distel D. L., Herring P. J. Polymerase chain-reaction and 16S- ribosomal-RNA gene-sequences from the luminous bacterial symbionts of 2 deep-sea anglerfishes // J. Mar. Biol. Assoc. U.K. - 1992. - Vol. 72. - P. 149–159. 16. Lee J.-L., Levin R. E. Quantification of total viable bacteria on fish fillets by using ethidium bromide monoazide real-time polymerase chain reaction // Int. J. Food Microbiol. - 2007. - Vol. 118. - P. 312–317. 17. Lee J.-L., Levin R. E. A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets // J. Microbiol. Methods. - 2009. - Vol. 76. - P. 93–96. 18. McKillip J. L., Jaykus L. A., Drake M. rRNA stability in heat killed and UV- irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7 // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 4264–4268. 19. Michel C., Antonio D., Hedrick R. P. Production of viable cultures of Flavobacterium psychrophilum: approach and control // Res. Microbiol. - 1999. - Vol. 150. P. 351–358. 38 20. Nocker A., Camper A. K. Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. Vol. 72. - P. 1997–2004. 21. Nocker A., Mazza A., Masson L., Camper A. K., Brousseau R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology // J. Microbiol. Methods. - 2009. - Vol. 76. - P. 253–261. 22. Novak J. S., Juneja V. K. Detection of heat injury in Listeria monocytogenes Scott A. // J. Food Prot. - 2001. - Vol. 64. - P. 1739–1743. 23. Rudi K., Moen B., Dromtorp S. M., Holck A. L. Use of Ethidium Monoazide and PCR in Combination for Quantification of Viable and Dead Cells in Complex Samples // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, - № 2. - P. 1018–1024. 24. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Coning. A laboratory Manual. - Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - Vol. 2. - 345 p. 25. Sheridan G. E., Masters C. I., Shallcross J. A., MacKey B. M. Detection of mRNA by reverse transcription-PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 1313–1318. 26. Spanggaard B., Huber I., Nielsen J., Nielsen T., Appel K. F., Gram L. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification // Aquaculture. - 2000. - Vol. 182. - P. 1–15. 27. Van der Maarel M.J.E.C., Sprenger W., Haanstra R., Forney L.J. Detection of methanogenic archaea in seawater particles and the digestive tract of a marine fish species // FEMS Microbiol. Lett. - 1999. - Vol. 173. - P. 189–194. 28. Wagner A.O., Malin C., Knapp B.A., Illmer P. Removal of free extracellular DNA from environmental samples by ethidium monoazide and propidium monoazide // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol. 74, № 8. - P. 2537–2539. 39 А.Г. Гербст Глава 4. ПОДХОДЫ К КОМПЬЮТЕРНОМУ МОДЕЛИРОВАНИЮ УГЛЕВОДБЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ Углеводы играют очень важную роль в процессах межклеточного распознавания, проникновения в клетку вирусов, лекарcтвенных веществ и т.п. В последнее время все больше внимания уделяется изучению пространственных механизмов биологического взаимодействия углеводов с природными рецепторами. Понимание механизмов физиологического действия углеводов на молекулярном уровне необходимо для направленного дизайна структур с заданной активностью. Такая важная роль углеводов определяется особенностями строения их молекул (Рисунок 4). С одной стороны, они являются конформационно подвижными соединениями засчет наличия гибких мостиков между моносахаридными остатками, которые называются гликозидными связями. С другой стороны, сами моносахаридные кольца имеют, как правило, достаточно жесткую конформацию. Однако, наличие многих вариантов взаимного пространственного расположения заместителей в этих остатках обуславливает большую вариабельность пространственных структур углеводов. Таким образом получается, что молекулы углеводов могут принимать весьма широкий спектр конформаций, в то время как некоторые их фрагменты остаются фиксированными. Это облегчает образование углевод-белкового комплекса и позволяет иногда достичь специфичности определенного углеводного лиганда к определенному белку. O H Малоподвижные кольца Подвижные гликозидные связи O H O O O O H M e O H O O H M e O O N H A c O H O H O O H O O H O O O H O H O H O Разнообразие пространственных конфигураций заместителей Рисунок 4 - Структурные особенности молекул углеводов. 40 На настоящий момент существуют различные методики теоретического молекулрного моделирования структур комплексов углеводов с белками, являющимися их природными мишенями. Задачу такого моделирования можно разделить на две части: 1) поиск оптимальной с энергетической точки зрения конформации самой молекулы углевода 2) количественная оценка энергии взаимодействия молекулы лиганда с рецептором. Методики, позволяющие решать первую часть задачи, известны достаточно давно. Как правило, это методы молекулярной механики, хотя иногда для конформационного анализа применяются и неэмпирические методы квантовой механики. Для решения второй части существуют так называемые “функции ранжировки” (“scoring functions”), развитие и оптимизация которых и представляет особый интерес. Следует отметить, что не всегда обе части докинга выполняются в одной компьютерной программе. Так, существует ряд программ, позволяющих проводить количественную оценку сродства лиганда к белку, в которых конформации лиганда берутся из сторонних источников, например на основании данных молекулрномеханического расчета или экспериментального конформационного анализа с помощью методов ЯМР. В докладе рассматривается программа XScore [1], в которой реализованы сразу несколько функций ранжировки [2]. Наряду с величинами сродства, вычисленными по каждой из этих функций, программа на выходе предоставляет так их усредненную величину и эмпирически вычисленное значение коэффициента распределения LogP, который так же может оказаться полезным при поиске потенциальных лекарственных веществ. Так же рассматривается использование программы LigBuilder [3], которая не рассчитывает степень сродства заданного лиганда к белку, но по эмпирическим функциями на основе структуры связывающего центра в белке может предложить структурные модификации лиганда, потенциально приводящие к увеличению активности. Кроме того, в докладе упоминается возможность самостоятельного построения функции ранжировки с использованием для этого метода молекулярных дескрипторов. Такими дескрипторами могут быть, например, число атомов определенного элемента, молекулярный вес, молекулярный объем и поверхность, дипольный момент, коэффициент распределения и множество других. Смысл данного подхода состоит в 41 том, что строится математическая модель, коррелирующая все эти параметры с некоторой экспериментальной величиной, характеризующей активность лиганда по отношению к белку. Чаще всего в качестве такой величины используется константа 50%-ого ингибирования, IC50. Для построения такой модели могут быть использованы самые разные математические приемы, в том числе, метод искусственных нейронных сетей [4]. В заключение в докладе рассматривается самый современный на сегодняшний день алгоритм докинга, внутримолекулярной реализующий конформационной одновременно энергии как лиганда, расчет так величины и энергии межмолекулярного взаимодействия лиганда с рецептором. В данном случае, следовательно, константа устойчивости получающегося комплекса может быть рассчитана напрямую, а через нее — и величина IC50. Самая распространенная свободно доступная компьютерная программа, использующая данный подход — Autodock [5]. Эта программа имеет следующие преимущества: 1) Точность расчета энергий связывания составляет 2.1 ккал/моль; 2) Можно учитывать эффекты сольватации-десольватации как особый вид взаимодействий; 3) Позволяет учитывать подвижность рецептора. Так же в докладе отмечено, что с помощью программы Autodock можно проводить анализ вкладов отдельных атомов или других фрагментов молекулы в энергию связывания. Это позволяет предположить исходя из компьютерных расчетов, какие именно из частей лиганда являются существенными для проявления активности. Таким образом, на сегодняшний день существует ряд функций ранжировки («scoring functions»), позволяющих провести количественную оценку стабильности углевод-белковых комплексов. Эти функции могут быть реализованы в программах, осуществляющих только расчет сродства лиганда к рецептору, в этом случае на выходе получаются эмпирические величины, которые могут быть прокоррелированы с величинами IC50. В случае если программа проводит конформационный анализ лиганда и всего комплекса в целом, на выходе получаются величины изменения свободной энергии образования комплекса, из которых его константы устойчивости и величины IC50 могут быть рассчитаны в явном виде. Анализируя вклады различных частей молекулы в связывание, можно делать предположения о возможном упрощении структуры лиганда с синтетической точки зрения, в том числе, с перспективой создания на его основе неуглеводного потенциального лекарственного вещества. 42 Библиографический список 1. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://sw16.im.med.umich.edu/software/xtool/manual/index.html 2. Wang R., Lu Y., Wang S. Comparative Evaluation of 11 Scoring Functions for Molecular Docking. // J. Med. Chem. – 2003. - Vol. 46. – P. 2287-2303. 3. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://mdl.ipc.pku.edu.cn/drug_design/work/ligbuilder.html 4. Fabry-Asztalos L., Andonie R., Collar C. J., Abdul-Wahid S., Salim N. A. Genetic Algorithm Optimized Fuzzy Neural Network Analysis of the Affinity of Inhibitors for HIV-1 Protease. // Bioorg. Med. Chem. – 2008. – Vol. 16. – P. 2903-2911. 5. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://autodock.scripps.edu С.В. Охотина Глава 5. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЕНКИ И РЕМЕДИАЦИЯ СРЕДЫ Известно, что микроорганизмы являются наиболее древней формой жизни на Земле. Они же являются и основными преобразователями среды. Если на планете произойдет какая-нибудь глобальная катастрофа, то микроорганизмы – бактерии и вирусы, несомненно, выживут и на основе их генетического материала начнут образовываться новые формы жизни. То, что бактерии способны к самоорганизации и образуют сообщества, было известно еще с середины минувшего столетия. Но активное изучение этой особенности началось в 90-х годах XX-го столетия, а первые публикации, касающиеся такой формы организации, как биопленка, датируются 2002-2003гг. Способность бактерий образовывать биоплёнки интересна ввиду того, что микроорганизмы проявляют устойчивость к действию антимикробных веществ при их росте в биоплёнках. Биоплёнки - высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в прикреплённом состоянии. Биоплёнки могут состоять из одного или нескольких видов бактерий. Их пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма. В одной биоплёнке можно наблюдать различные 43 образцы генной экспрессии, что говорит о том, что индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности», которые, комбинируясь с другими, усиливают жизнеспособность всего консорциума. Микроколонии в зрелой биоплёнке расположены во внеклеточном полисахаридном матриксе. Итак, биопленка – это взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов, сгруппированных в микроколонии, окруженные защитным матриксом. Основные свойства бактериальной биопленки: • взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов; • микроорганизмы собраны в микроколонии; • микроколонии окружены защитным матриксом; • внутри микроколоний – различная среда; • микроорганизмы имеют примитивную систему связи; • микроорганизмы в биопленке устойчивы к воздействию антибиотиков, антимикробных средств и к реакции организма хозяина. Бактерии способны образовывать биопленки на любом субстрате – это и поверхности внутренних органов, протезы, зубная эмаль, стенки катетеров и контактных линз. Известно, что именно биопленки являются причиной внутрибольничных инфекций и хронических инфекционных заболеваний. Тем не менее, активно ведутся исследования по использованию способности бактерий к самоорганизации в «мирных» целях. Одним из направлений, где активно ведется исследование по применению бактериальных биопленок, является биоремедиация среды. Биоремедиация – это ряд мероприятий, направленных на оздоровление окружающей среды, путем утилизации поллютантов, осуществляемое с участием живых микроорганизмов. На сегодняшний день существуют различные сооружения для очистки промышленных и бытовых сточных вод, в которых осуществляется биодеградация и трансформация органических и минеральных веществ, содержащихся в стоках, в аэробных или анаэробных условиях. По способу контакта очищаемой сточной воды и колоний микроорганизмов различают сооружения очистки сточных вод с иммобилизованной (прикрепленной) микрофлорой и свободноплавающей (табл.5). В настоящее время известно много модификаций, совмещающих в одном сооружении очистки стоков оба механизма. Базовыми вариантами современных сооружений очистки сточных вод являются классические биофильтры, аэротенки и анаэробные биореакторы. Очистные реакторы на основе биопленок, в основном, используются для 44 больших акваторий в местах индустриальных стоков и способны пропускать большие объемы воды. Аэробная биодеструкция органических загрязняющих веществ сточных вод в биофильтрах осуществляется путем фильтрования сточных вод через загрузочный материал, на нем постепенно адсорбируются органические вещества (поллютанты) и микроорганизмы, находящиеся в сточной воде. Образуется так называемый биоорганоминеральный комплекс - биопленка, используемая в технологии биологической очистки промышленных и бытовых сточных вод. Иммобилизованные (прикрепленные) микроорганизмы адсорбируют субстрат (питательные вещества) из сточной воды, омывающей загрузочный материал. В процессе обмена веществ они с помощью экзоферментов ускоряют процесс гидролиза сложных веществ, содержащихся в сточных водах, до более простых, молекулы которых имеют размеры меньшие, чем размеры бактерий. Продукты гидролиза диффундируют в клетку, где под действием эндоферментов происходит их дальнейшее окисление с целью получения энергии и более простых соединений, используемых в качестве строительных блоков клеточного вещества. Состав продуктов окисления зависят от состава субстрата и видового разнообразия бактерий, образующих биопленку, обязательно присутствуют углекислый газ и вода, в различном количестве могут присутствовать сульфаты, фосфаты, азот аммонийный и нитратный, а также продукты неполного разложения - различные органические кислоты. Биопленка, используемая для участия в биоремедиации должна обладать способностью к биосорбции, биоаккумуляции и биоминерализации загрязняющих веществ, а также сродством бактериальных клеток в составе биопленки к определенному виду поллютанта. Высокая плотность микробных клеток и уникальная архитектура биопленки способствуют поддержанию оптимального pH среды, веществ в среде и концентрации питательных окислительно-восстановительного потенциала в межклеточном пространстве Современные возможности генной инженерии при помощи сочетания нескольких генов или активации одного гена позволяют запустить развитие полезных свойств, имеющихся у бактериальных штаммов. Например, создание штаммов с металлосвязующими способностями возможно путем экспрессии генов металлоспецифичных протеинов и пептидов, что усовершенствует процесс утилизации тяжелых металлов природными штаммами. 45 Таблица 5 Типы биореакторов/ экспериментальные Методы ремедиации условия Утилизируемые тяжелые металлы Анаэробные / аэробные процессы в биопленке Биосорбция Zn, Cd, Ni Биопленка, растущая на подвижной песчаной Биосорбция и осаждение Cu, Zn, Ni, Co Иммобилизация Co Биопленка на подложке из гранулированного угля Адсорбция Cd, Cu, Zn, Ni Антибактериальный коплексный мембранный Осаждение Cd, Zn, Cu, Pb, Y, Co, подложке Вращающийся биореактор для утилизации водорослей биореактор Ni, Pd, Ge Таким образом, сочетание методов генной инженерии микроорганизмов, с оптимальными физико–химическими параметрами и концентрацией субстрата в биореакторах является основным условием развития стратегий биремедиации. Н.Л. Белькова, Е.Б. Матюгина, С.О. Воронова, Н.В. Долгих Глава 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА ВОДНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Изучение функционирования пресноводных экосистем в современных условиях является одной из приоритетных научных проблем, так как в настоящее время более половины населения Земного шара вынуждены употреблять для питьевых целей воду, не соответствующую нормам и стандартам. Микробные сообщества – одни из наиболее существенных компонентов живого населения водоемов. Они играют важную роль в процессах круговорота веществ и энергии и в трофической цепи организмов пелагиали. В природной микробной популяции бактериальные клетки находятся в разном физиологическом статусе: живые клетки могут быть метаболически активными и неактивными – покоящимися (резистентными) или спорами, а какую-то часть биомассы составляют мертвые клетки. Способности этих бактерий к культивированию различны, и их доля от общей численности может варьировать от 0.25% (культивирование из пресноводных источников) до 2% (из морской воды) (Amann et al., 1995; Bernard et al., 2000, Белькова, 2004). Сложные органические субстраты успешно применяются для выращивания большого разнообразия бактериальных штаммов и для 46 выделения численно доминирующих, способных к культивированию бактериальных клеток из различных водных экосистем (Pinhassi et al., 1997). Оптимизация методов культивирования гетеротрофных бактерий позволяет проводить культивирование микроорганизмов, находящихся в природной среде в некультивируемом состоянии (Bussmann et al., 2001, Hahn et al., 2004). Успехи молекулярной систематики позволяют микробиологам пользоваться принципиально новыми возможностями решения таксономических проблем. В настоящее время описание и регистрация нового штамма микроорганизма не возможны без определения нуклеотидной последовательности гена малой субъединицы рибосомной РНК (гена 16S рРНК) и установления по этой структуре филогенетических взаимоотношений этого штамма с его ближайшими родственниками. Таким образом, селективная детекция микроорганизмов разного физиологического статуса разными методами: с помощью культивирования и молекулярно-генетическим становится актуальной научной задачей. Основными целями исследования стали: (1) молекулярно-генетический анализ природных микробных происхождения; (2) сообществ поиск новых ультраолиготрофных подходов для экосистем анализа разного некультивируемых микроорганизмов. Мы использовали новый метод фильтрации-акклиматизации для культивирования микроорганизмов, находящихся в природных условиях в некультивируемом состоянии. Обработку водных проб из пресноводных озер Восточной Сибири проводили по следующей схеме: (1) культивирование гетеротрофных микроорганизмов и подсчет их численности; (2) эксперимент по фильтрации-акклиматизации; (3) молекулярно-генетическая идентификация штаммов; (4) концентрирование бактериального материала на бактериальных фильтрах и его молекулярно-генетический микроорганизмов анализ. определены Среди представители культивируемых следующих гетеротрофных родов: Aeromonas, Arthrobacter, Escherichia, Dietzia, Flavobacterium, Microbacterium, Rhodococcus и Serratia. Метод фильтрации-акклиматизации был адаптирован для проведения полевых экспериментальных работ по культивированию микроорганизмов из природных микробных эксперимента сообществ, по находящихся фильтрации в некультивируемом акклиматизации состоянии. преимущественно После получены неспорообразующие бактерии Pseudomonas и Acinetobacter. Молекулярно-генетический анализ природных проб выявил новые кластеры некультивируемых микроорганизмов. Работа выполнена при финансовой поддержке грантом РФФИ №09-04-00977 и в рамках интеграционного проекта №122 (рук. Н.Л. Белькова). 47 И.А. Теркина, Г.А. Федорова, О.П. Глызина, В.В. Парфенова Глава 7. ПОИСК И ИССЛЕДОВАНИЕ НОВЫХ АНТИМИКРОБНЫХ МЕТАБОЛИТОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ ОЗЕРА БАЙКАЛ В настоящее время широкое использование антибиотиков в медицинских и немедицинских (ветеринария, животноводство, растениеводство, пищевая и бродильная промышленность, научные исследования) целях привело к возникновению в окружающей среде антибиотикорезистентных штаммов бактерий. Это бактерии группы кишечной палочки [Srinivasan et al., 2007], энтерококки [Johnston & Jaykus, 2004], некоторые виды рода Bacillus, коринеформные бактерии, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes [Gravenitz, 2001] и другие. В последние годы наиболее ярким примером антибиотикорезистентности является возникновение устойчивости к ванкомицину у 12% штаммов Enteroccocus faecalis (с 1988 г.) и некоторых штаммов S. aureus (с 2002 г.) [Appelbaum & Jacobs, 2005]. Одним из основных путей преодоления антибиотикорезистентности является поиск и изучение антибактериальных метаболитов микроорганизмов, обитающих в окружающей среде. Решением этой проблемы в настоящее время занимаются объединенные группы ученых биологов и биохимиков разных стран мира, таких как Япония, Германия, Франция, Россия, Америка, Австралия, Индия, Китай и т.д. Водная среда в течение последних 20 лет является богатой лабораторией для выделения таких продуцентов. Установлено, что антимикробная активность продуктов метаболизма водных штаммов бактерий не уступает активности почвенных штаммов [Sponga et al., 1999]. Большой интерес представляет исследование микробного сообщества озера Байкал - уникального древнего пресноводного водоема, в котором обнаружено большое количество редких и специфичных для озера микроорганизмов [Белькова и др., 2003; Шубенкова и др., 2005]. Особые экологические условия в оз. Байкал, в первую очередь низкое содержание растворенного органического вещества и биогенных элементов, а также постоянные низкие температуры, оказывают значительное влияние на жизнедеятельность микроорганизмов, создают антагонистические взаимоотношения между бактериями, которые могут продуцировать уникальные по своей структуре и свойствам антимикробные метаболиты. 48 Поэтому целью этой работы было выделить и исследовать антибактериальные вторичные метаболиты, продуцируемые бактериями озера Байкал в процессе своей жизнедеятельности. 1. Материалы и методы Выделение микроорганизмов из озера Байкал. Источником выделения бактерий были байкальские губки трех видов - Lubomirskaia baicalensis, Baicalospongia bacillifera и Baicalospongia intermedia и байкальская вода. Образцы губок отбирали при помощи водолазной техники в районе п. Листвянка (Lubomirskia baicalensis) с глубины 6 м и в районе пос. Большие коты с глубины 13 метров (Lubomirskia baicalensis) и 3,6м (Вaicalospongia bacilifera). Пробы воды отбирали асептически с корабля при помощи батометра в Южном Байкале. Методы выделения бактерий были опубликованы ранее (Парфенова и др., 2008). Антимикробную активность чистых культур бактерий определяли двумя способами: методом перпендикулярных штрихов и методом одновременного культивирования продуцента и тест-культуры (Теркина и др., 2006). В качестве тесткультур использовали условно-патогенные штаммы бактерий Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium и Candida albicans. Ферментативную активность бактерий определяли по качественной реакции (Парфенова и др., 2008). Идентификацию антимикробной выделенных активностью штаммов проводили на бактерий основании с высокой морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков с помощью определителя бактерий Берги (Определитель бактерий Берджи, 1997). Для получения культуральной жидкости бактерии культивировали в колбах Эрленмейера обьемом 250 см3 со 100 мл среды приведенного состава на установке для выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 (скорость качания 110 об/мин). Время культивирования 5 суток, при комнатной температуре. Культивирование проводили в течение 5 суток при комнатной температуре на следующих средах: среда I - рыбопептонный бульон (2 г/л) и среда (II): глицерин – 3 г, рыбо-пептонный бульон – 0.5 г, пептон – 0.5 г, NaCl – 0.45 г, CaCO3 – 0.35 г, H2O - 1л, pH= 7.2. Культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом и концентрировали в вакууме для получения сухого остатка. Для определения активности экстрактов готовили этилацетатные и 49 водно-спиртовые (не более 10 % спирта в воде) растворы. Антимикробную активность культуральной жидкости, а затем микробных экстрактов оценивали методом диффузии в агар (Медицинская микробиология, 1999). В качестве тест-культур были использованы штаммы E. coli, S. aureus, E. faecium и C. albicans. Хроматографическое исследование микробных исследования микробного экстракта использовали метод жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой экстрактов. Для высокоэффективной детекцией (ВЭЖХ-УФ). Хроматографические исследования были выполнены на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с колонкой 2х75 мм, упакованной сорбентом Silasorb SPH C 18 с одновременной многоволновой ультрафиолетовой детекцией. Упаренный досуха бактериальный экстракт перерастворяли в 60% водном метаноле (10 мг/мл). Для общей характеристики бактериального экстракта записывали обзорную хроматограмму в градиенте от 2 до 100% метанола в воде. Для идентификации соединений, обладающих антимикробной активностью, бактериальный экстракт был разделен на 12 фракций. Каждая из фракций была выделена в полупрепаративном режиме и исследована на антимикробную активность в отношении E. faecium. Результат учитывали по величине диаметра зоны подавления роста вокруг лунки, измеренной в миллиметрах. Масс-спектрометрический анализ соединения 11,5 мин проводили на приборе МХ 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионизации с ортогональным вводом ионов и времяпролетным масс-анализатором (TOF) (ESI-oTOF), разработанном в лаборатории экологической и биомедицинской массспектрометрии ИАнП РАН. Спектр получали в режиме съемки положительных ионов. При проведении хромато-масс-спектрометрического анализа в качестве подвижных фаз использовали: А - 0.5% НСООН в воде (pH 2.5), В - 0.5% НСООН в ацетонитриле. Скорость потока 150 мкл/мин. Градиент: линейный, от 2 до 75% Б за 2000 мкл, 75% Б 1000 мкл. 2. Результаты и обсуждение В результате проведенной научно-исследовательской работы из воды озера выделено 98 штаммов бактерий, а из байкальских губок 122 штамма бактерий. Обнаружено, что антимикробной активностью по отношению к условно-патогенным тест-культурам обладали 47% штаммов бактерий, выделенных из губок, и около 70% штаммов, выделенных из воды озера. Практически все бактерии, выделенные из воды, подавляли рост S. aureus и E. faecium. (рис. 5). 50 % активных штаммов 100 98 95 вода 80 губки 60 40 18,8 20 12 13,9 9,8 0 4,1 0 4,9 8 2,5 C. albicans E. coli P. aeruginosa E. faecium B. subtilis S. aureus 0 Рисунок 5 - Антимикробная активность бактерий, выделенных из оз. Байкал Ферментативная активность бактерий является одним из показателей их участия в разложении органических веществ (белков, жиров и углеводов). По результатам тестирования установлено, что бактерии, выделенные из воды и губок озера Байкал, обладают высокой гидролитической активностью. Выявлено 63.1% культур, способных пептонизировать молоко, более 60% обладают лецитиназной и липазной активностями, фосфатазную активностью проявляют 55.2% исследованных культур, 53.9% штаммов бактерий способны гидролизовать крахмал, 26.3% разжижают желатину. Больше половины исследованных культур проявляют сразу несколько активностей: липаза амилаза лецитиназа коллагеназа протеаза 70 60 50 40 30 20 10 0 фосфатаза % активных штаммов фосфатазную, протеазную, лецитиназную и липазную (рис. 6). 51 Рисунок 6 - Ферментативная активность бактерий, выделенных из озера Байкал По результатам тестирования для дальнейшей идентификации были выбраны 18 штаммов, обладающих высокой антимикробной и ферментативной активностями. Установлено, что 11 штаммов относятся к роду Pseudomonas, 3 штамма принадлежат к роду Flavobacterium, 2 штамма – к роду Acinetobacter и по 1 штамму к родам Aeromonas и Proteus. Чтобы оценить антимикробную активность бактерий при разных условиях культивирования, были выбраны четыре штамма Pseudomonas sp. 1Lb-06, Pseudomonas sp. 7Lb-06, Flavobacterium sp. 15Bb-06 и Flavobacterium sp.28Bb-06. Штамм Pseudomonas sp.1Lb-06 угнетал рост S. aureus (диаметр зоны подавления роста () составлял 7мм), B. subtilis ( 13мм), C. albicans ( 6мм) и E. faecium ( 14мм), и проявлял протеазную активность (диаметр зоны лизиса () составлял 15мм), лецитиназную ( 10мм) и липазную ( 6мм) активности. Штамм Pseudomonas sp.7Lb-06 был активен в отношении S. aureus ( 18мм), B. Subtilis ( 10мм), и также проявлял протеиназную (15мм), лецитиназную ( 5мм) и липазную ( 12мм) активности. Штамм Flavobacterium sp.15Lb-06 угнетал рост S. aureus ( 15мм), B. subtilis ( 28мм), C. albicans ( 14мм), E. faecium ( 22мм) и P. aeruginosa ( 35мм), обладал протеазной (18мм), коллагеназной ( 2мм), лецитиназной ( 19мм) и липазной ( 12мм) активностями. Штамм Flavobacterium sp.28Bb-06 ингибировал рост S. aureus ( 30 мм), B. subtilis ( 15мм) и E. faecium ( 7мм), и проявлял протеазную (16мм), лецитиназную ( 8мм) и липазную ( 11мм) активности. Тестирование культуральной жидкости, полученной на среде I и среде II, показало, что спектр антимикробного действия этих бактерий зависит от времени культивирования и от состава среды культивирования. Обнаружено, что объем культуральной жидкости, используемой для тестирования, не влиял на антимикробную активность. Штаммы Pseudomonas sp. 1Lb-06, Pseudomonas sp. 7Lb-06, Flavobacterium sp. 15Bb-06 при культивировании на рыбо-пептонном бульоне (среда I) проявляли активность по отношению к E. faecium, S. aureus и C. albicans уже на 3 и 5 сутки, а на среде II выделяли антимикробное вещество только на 7 сутки. В таблице приведены результаты тестирования культуральной жидкости штамма Flavobacterium sp.28Bb-06. Этот штамм был выбран как самый активный для выделения 52 и исследования активного вещества. На среде I эта культура подавляла рост S. aureus и E. faecium (среда I) на третьи сутки культивирования и рост C. albicans – на 7 сутки. На среде II штамм Flavobacterium sp.28Bb-06 уже на 3 сутки культивирования показал активность в отношении S. aureus, B. subtilis и на 7 сутки – к E. faecium. Кроме того, этот штамм обладал протеазной, лецитиназной и липазной ферментативной активностями. Таблица 6 - Антимикробная активность штамма Flavobacterium sp.28Bb- 06 при разных условиях культивирования, (мм) 1 Среда II Среда I Штамм Время культивирования 3 сутки 5 сутки 7 сутки Тест- 0.1 0.3 0.5 0.1 0.3 0.5 0.1 0.3 0.5 культура мл мл мл мл мл мл мл мл мл E. faecium 7 8 8 0 8 8 +/- 6 6 B. subtilis 0 0 0 0 0 0 0 0 6 St. аureus 8 10 8 0 +/- 8 +/- +/- 9 aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E.coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. albicans 0 0 0 0 0 0 13 13 13 E. faecium 0 0 0 0 0 0 11 11 12 B. subtilis +/- +/- 14 0 0 0 18 19 19 St. аureus 19 19 20 21 22 22 19 20 24 aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E.coli 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. albicans 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ps. Ps. Полученный из культуральной жидкости микробный экстракт протестировали на антимикробную активность по отношению к S. aureus, B. subtilis и E. faecium. Результаты показали, что в микробном экстракте Flavobacterium sp.28 Bb-06 содержится активное вещество, которое подавляло рост этих тест-культур (рис. 7). 1 +/- — зона подавления, до 5 мм. 53 Экстракт Контроль Экстракт Экстракт Контроль Контроль Рисунок 7 - Антимикробная активность суммарного микробного экстракта Flavobacterium sp. 28 Bb-06 (контроль – 10% метанол в воде) Для общей характеристики бактериального экстракта была записана обзорная хроматограмма в градиенте ацетонитрила в воде. Для выявления соединений, обладающих антимикробной активностью, хроматограмма бактериального экстракта была условно разделена на 12 зон различной длительности, каждая из которых была собрана в отдельную пробирку. Фракции были исследованы хроматографически в тех же условиях для оценки качественного и количественного состава и протестированы на антимикробную активность в отношении E. faecium. Обнаружено, что фракция 11,012,0 мин практически полностью состоит из соединения со временем удерживания 11,5 мин и обладает значительной антимикробной активностью. Анализ результатов рехроматографии фракций 10,0-11,0 мин; 12,0-13,0 мин и 13,0-14,5 мин показал, что каждая из них содержит в себе соединение со временем удерживания 11,5 мин и их антимикробная активность может быть связана с присутствием этого соединения. По результатам антимикробной активности фракций и повторной хроматографии (рехроматографии) обнаружено 2 зоны, которые обладают высокой антимикробной активностью (рис. 8). 54 5 Поглощение, 196 нм 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 Время, мин 14 16 18 20 Фракции, обладающие антибиотической активностью Фракции, не обладающие антибиотической активностью Рисунок 8 - Антибиотическая активность фракций этилацетатного экстракта Flavobacterium sp.28 Bb-06, перерастворенного в 60% растворе МеОН-Н2О Тестируемая культура – E. faecium. По форме и ширине пика можно предполагать, что зона 4,5 - 6 мин состоит из нескольких соединений, а зона 11-12 мин представляет собой гомогенное химическое соединение. Для характеристики соединения 11,5 мин (зона 11,0-12,0 мин) был записан его УФ-спектр в интервале длин волн от 190 до 360 нм с шагом 2 нм методом остановленного потока (рис. 9). Из рисунка 9 видно, что один из максимумов поглощения исследуемого вещества, соответствующий максимальной экстинкции в исследуемом интервале длин волн, равен 270 нм. Это может быть связано с присутствием ароматической системы в этом соединении. 55 1.2 Ах/А270 0.8 0.4 0 200 220 240 260 280 300 Длина волны, нм 320 340 360 Рисунок 9 - Нормированный УФ-спектр для соединения (11,5 мин), полученного из штамма Flavobacterium sp.28 Bb-06. Растворитель МеCN-Н2О=35:65 Методом масс-спектрометрии была определена масса этого соединения, которая составила 594.179, предложена брутто формула: C30H39N3O3Cl3. Таким образом, среди бактерий, выделенных из озера Байкал, обнаружен штамм Flavobacterium sp.28 Bb-06, обладающий антибактериальной активностью, которая связана с наличием, по меньшей мере, двух соединений. Одно из них выделено в индивидуальном виде и охарактеризовано. Установление структуры этого соединения будет являться предметом наших дальнейших исследований. Работа выполнена при поддержке грантом РФФИ - Байкал № 05-05-97271 и междисциплинарного проекта СО РАН № 96. Библиографический список 1. Белькова Н. Л., Парфенова В. В., Косторнова Т. Я., Денисова Л. Я., Зайчиков Е. Ф. Характеристика биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал // Микробиология. – 2003. - Т. 72, № 2. - С. 239-249. 2. Медицинская микробиология / под ред. В. И. Покровского, О. К. Поздеева. - М. : ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 1200 с. 56 Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта и др. - М. : Мир, 3. 1997. - Т. 1, Т. 2. - 368 с. Парфенова В. В., Теркина И. А., Косторнова Т. Я., Никулина И. Г., 4. Черных В. И., Максимова Э. А. Микробное сообщество пресноводных губок озера Байкал // Известия РАН. Серия Биологическая. – 2008. - № 4. - С. 435-441. Теркина И. А., Парфенова В. В., Ан Т. С. Антагонистическая активность 5. актиномицетов озера Байкал // Прикладная биохимия и микробиология. – 2006. - Т. 42, № 2. - С. 195-199. Шубенкова О. В., Земская Т. И., Черницына С. М., Хлыстов О. М., 6. Трибой Т.И. Первые результаты исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов осадков Южного Байкала в районе приповерхностного залегания гидратов метана // Микробиология. – 2005. - Т. 74, № 3. - С. 370-377. 7. Appelbaum P. C., Jacobs M. R. Recently approved and investigational antibiotics for treatment of severe infections caused by Gram-positive bacteria // Curr. Opin. Microb. – 2005. - Vol. 8. - Р. 510-517. 8. Gravenitz A. Antimicrobial therapy of infections with aerobic Gram-positive rods // Clin. Microbiol. Infect. – 2001. - Vol. 7. - Р. 41-46. 9. Johnston L. M., Jaykus L.-A., Antimicrobial resistance of Enterococcus species isolated from produce // Appl. Env. Microb. – 2004. - Vol. 70, № 5. - Р. 3133-3137. 10. Sponga F., Cavaletti L., Lazzarini A. et al. Biodiversity and potentials of marine-derived microorganisms // J. of Biotechnology. – 1999. - Vol. 70. - Р. 65-69. 11. Srinivasan V., Nam H-M., Sawant A. A., Headrick S. I., Nguyen L. T., Oliver S. P. Distribution of tetracycline and streptomycin resistance genes and class 1 integrons in Enterobacteriaceae isolated from dairy and nondairy farm soils // Microbial Ecol. - 2007. Н.Б. Цветкова Глава 8. ИЗМЕНЧИВОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ LISTERIA MONOCYTOGENES ПОД ДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ НА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Среди пищевых инфекций серьезную озабоченность в настоящее время вызывает листериоз. Известно, что Listeria monocytogenes – обладает психрофильными 57 свойствами, что позволяет микроорганизму накапливаться в пищевых продуктах в условиях низкотемпературного хранения, сохраняя и даже повышая вирулентность (Бузолева, 2004). В литературе отсутствуют данные по изучению сочетанного действия вакуума, температуры и вида продукта на изменение биологических свойств листерий. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение влияния абиотических (температура, вакуум, вид продукта-субстрата) факторов на размножение и биологические свойства L. monocytogenes при культивировании на пищевых продуктах. Для эксперимента были взяты продукты, приобретенные в торговой сети г. Владивостока, наиболее эпидемически значимые при листериозе (Тартаковский, 2002): сосиски свиные и сыр «Камамбер», упакованные под вакуум на производстве, креветки вареные. Для лабораторных исследований использовали музейные штаммы L. moпocytogeпes типичные по своим культурально - морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам сероварианта 4b: 132 , 152 , 148. Под парафин стерильным шприцем в асептических условиях вводили по 0,5 мл суспензии листерий в концентрации 109 КОЕ/мл. Срок экспозиции составлял 30 дней, температура культивирования - 6˚С (холодовой вариант) и 22˚С (тепловой вариант). Биологические свойства листерий определяли в соответствии с МУ 4.2.1122-02. В результате экспериментальных исследований установлено, что действие абиотических факторов приводит к изменению биологических и вирулентных свойств листерий. Так, тепловые варианты, включая те, которые выращивали в вакууме, независимо от штамма и субстрата, утратили подвижность при 22˚С, в отличие от холодовых вариантов, что подтверждают данные литературы (Сомов, Бузолева, 2004). Из всех холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, был неподвижен при 22˚С. Возможно, что на подвижность листерий кроме температуры так же влияет и вид продукта, которые они контаминируют. Все тепловые штаммы утратили гемолитическую и лецитиназную активность. Из холодовых, лишь штаммы, культивируемые на креветке и сыре, не лизировали эритроциты и не продуцировали лецитин. Показано, что выращивание в вакууме не зависимо от температуры культивирования, усиливало адгезию листерий к эритроцитам. Из холодовых вариантов лишь штамм, культивируемый на креветке, незначительно повысил адгезивность. По данным Е. А. Зайцевой (2006), в холодных условиях адгезивные свойства у большинства штаммов листерий снижаются. В наших экспериментах в результате 58 сочетанного действия вакуума и низкой температуры на листерии наблюдали повышение их адгезивных свойств. Каталазная, оксидазная, гиалуронидазная активность, а также тинкториальные свойства и цитопатогенное действие листерий в эксперименте не изменялись. При изучении сочетанного действия условий вакуума и низкой температуры было показано, что вирулентность L. monocytogenes повышается, при этом значения LD50 уменьшались на два порядка по сравнению с контролем. Во всех остальных вариантах происходило снижение вирулентности, при этом значения LD50 увеличивались на один - два порядка. Под действием абиотических факторов изменялись биохимические свойства листерий. Характер изменений в большей степени зависел от субстрата и температуры культивирования штаммов. Так, наибольшие изменения (в сторону усиления ферментативной активности) наблюдали у тепловых вариантов, культивируемых на сыре, наименьшие – у холодовых на сосисках. При культивировании на сыре при 22˚С отмечено усиление способности ферментировать сахарозу, мелезидозу, раффинозу, инулин, сорбозу. Изменчивость антигенных свойств листерий определяли по изменению их антибиотикочувствительности. культивирования у всех антибиотикочувствительности, цефалоспоринам monocytogenes Так, независимо от штаммов вплоть до наблюдалось приобретения и фторхинолонам III поколения. способны образовывать субстрата капсулу и условий снижение устойчивости к Известно, что штаммы L. в условиях экстремального существования (длительное обитание в морской воде, почве) (Сомов, Бузолева, 2004). Возможно, что хранение контаминированных листериями продуктов в вакуумных упаковках способствует формированию капсулы у возбудителя. Углубленное изучение биологических свойств возбудителя листериоза на современном этапе является весьма актуальным, так как открывает дополнительные возможности для разработки новых методов профилактики и предупреждения заболевания. Библиографический список 1. Бузолёва Л. С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды : автореферат дис. д-ра биол. наук.- Владивосток, 2001. - С. 48. 59 2. Зайцева Е. А., Сомов Г. П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 2006. - № 3. - С. 20– 23. 3. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocetogenes в пищевых продуктах : МУ 4.2.1122-02 : [утв. Главным санитарным врачем РФ 22.04.2002.] Сомов Г. П., Бузолёва Л. С. Адаптация патогенных бактерий к 4. абиотическим факторам окружающей среды. – Владивосток : ОАО Примполиграфкомбинат, 2004. – 167 с. 5. Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. - М. : Медицина для всех, 2002. – 200 с. И. А. Теркина Глава 9. АКТИНОМИЦЕТЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ, КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ИСТОЧНИКИ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Из донных осадков и воды озера Байкал было выделено 154 изолятов актинобактерий. Показано, что 34 штамма актинобактерий продуцируют соединения, обладающие антимикробной активностью. Для 14 штаммов определены оптимальные условия синтеза антибиотиков. Большинство из полученных соединений исследованных актинобактерий проявляли специфическую активность только по отношению к грамположительным тест-культурам: Bacillus subtilus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faеcalis, Listeria zeeligery. Только один штамм ингибировал рост Candida albicans. Наибольшая антикандидозная активность отмечена для актинобактерий, культивируемых на синтетических средах. Показано, что выделенные штаммы синтезируют соединения с высокой ингибиторной активностью по отношению к патогенным бактериям: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovi и Staphylococcus aureus. В то же время эти соединения не подавляли рост Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pseudotuberculosis , Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa. Установлено, что исследуемые штаммы не продуцировали соединения с цитотоксической активностью по отношению к мышиным эритроцитам. Среди тестируемых микроорганизмов 60 выявлены продуценты ингибиторов ферментов 13--D-глюканазы LVI из кристаллического стебелька Spisula sachalinensis и арилсульфатазы из брюхоногого моллюска Littorina kurila. Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-49528 и 02-04-49517; грантом Президента Российской Федерации № 1237.2003.4; грантом № 04-1-0-05-005 Президиума Российской Академии Наук “Молекулярная и клеточная биология”; грантом ДВО РАН № 04-2-0-00-023 и Интеграционным грантом ДВО РАН и СО РАН, № 58. Л.С. Бузолева Глава 10. ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОГО ОБОГАЩЕНИЯ НА СИНТЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ У ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПРОЗООНОЗОВ Известно, что для успешного выделения возбудителей сапрозоонозов листерий и иерсиний, как из бактериологической исследуемого внешней практике материала. Как среды, так широко правило, и от теплокровного используется высеваемость холодовое этих организма, в обогащение микроорганизмов значительно повышается после 30 суточного выдерживания инокулята в среде Петерсона Кука при низкой температуре (6-80С). В связи с этим, целью исследования являлось выявление факторов, способствующих ускорению размножения листерий и иерсиний в условиях низкой температуры в среде обогащения. Для экспериментальных исследований использовали фильтраты культуральной жидкости от Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis, выращенных при температуре 370С и 6-80С в среде Петерсона Кука, взятых на разных стадиях периодического роста. Биологическую активность веществ «холодовых» и «тепловых» вариантов культуральной жидкости проверяли на тест культурах: Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus, E.coli, Pseudomonas aeruginosa , которые выращивали при 370С и 6-80С. В результате проведенных исследований было установлено, что метаболиты листерий, выращенных при 370С, не оказывали стимулирующего действия на размножение самих листерий, а также сальмонелл, псевдомонад и иерсиний ни при 61 370С ни при 60С, но усиливали скорость размножения E.coli в 3 раза, а Staphylococcus aureus в 6 раз при 370С. Тепловые метаболиты иерсиний стимулировали размножение самих себя при температуре 370С в 2 раза, сальмонелл, кишечной палочки, псевдомонад, стафилококка в 3 раза, а листерий в 5 раз. При 60С усиления роста тест микроорганизмов на тепловых метаболитах иерсиний не наблюдали. При этом следует отметить, что стимулирующим действием обладали метаболиты исследуемых бактерий, взятых в логарифмической стадии роста при 370С, для метаболитов стационарной фазы не было установлено такого факта. «Холодовые» метаболиты листерий, взятые на 30-40 сутки роста культуры, стимулировали рост сальмонелл, стафилококка и самих листерий при 6 0С в 2-3 раза, и не усиливали рост таких тест микроорганизмов как иерсинии и псевдомонады. «Холодовые » метаболиты иерсиний, взятые на 30-40 сутки роста культуры, стимулировали рост только иерсиний при 60С и не стимулировали рост остальных тест микроорганизмов. Таким образом, «тепловые» и «холодовые» метаболиты иерсиний и листерий отличаются по их воздействию на рост тест микроорганизмов. У «тепловых» стимулирующий фактор выделяется в культуральную среду в логарифмической стадии роста, у «холодовых» - в стационарной. А.В. Гринченко, В.В. Кумейко Глава 11. АКТИВНОСТЬ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS KURILENSIS И ANADARA BROUGHTONI ИЗ НЕКОТОРЫХ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ Иммунология – одна из наиболее интенсивно продвигающихся областей биологии и медицины, с развитием которой связано много перспектив. В частности, исследования в этой области могут способствовать развитию марикультуры, а также разработке удобных методов экологического мониторинга, поскольку иммунный статус является показателем состояния животных, в том числе и морских гидробионтов. Modiolus kurilensis и Anadara broughtoni – двустворчатые моллюски, у которых почти не исследована иммунная система. В то же время, данные виды имеют важное 62 промысловое значение. Двустворчатые моллюски является источником многих биологически активных веществ, а также ценным пищевым продуктом, имеющим спрос на ближайших рынках сбыта – Китае и Японии. Кроме того, в нашем регионе есть все условия для культивирования этих видов. В данной работе проводилось определение интервала естественной вариации титра агглютининов гемолимфы M. kurilensis и A. broughtoni как основного показателя гуморального звена иммунитета моллюсков. Гемолимфа M. kurilensis была собрана в мае-июне 2006 года и в тот же период 2007 года во время экспедиций в бухте Троица, заливе Восток и бухте Киевка. Все указанные акватории слабо подвержены антропогенному влиянию, и целью работы являлось сравнение иммунного статуса животных из различных фоновых акваторий для выявления границ нормы. Гемолимфа A. broughtoni была собрана 20 марта и 4 мая 2009. Животных собирали на акватории Амурского залива с целью оценки сезонной динамики нормальной активности гуморального иммунитета. Для исследования гуморального иммунитета моллюсков была проведена реакция прямой гемагглютинации. Необходимо отметить, что методики постановки реакции в разные годы несколько отличались: в 2006 г. использовали нативную плазму и фиксированные глютаровым альдегидом трипсинизированные и не трипсинизированные эритроциты (Эр) групп крови человека О, А, В, АВ и Эр барана; в 2007 г. плазму подвергали заморозке в жидком азоте, а агглютинируемыми частицами были нативные Эр четырех групп крови человека. В 2009 году в работе с A. broughtoni также использовали замороженную плазму, а Эр использовали как нативные, так и обработанные описанным выше способом. Большинство работ по изучению гуморального иммунитета моллюсков рассматривает либо химическую структуру и специфичность растворимых агентов гемолимфы, либо изменение их концентраций в ответ на искусственное введение антигенов (АГ). Встречаются работы, в которых производится сравнение иммунных реакций между разными видами, но по изучению естественной вариабельности иммунного статуса внутри популяций и, тем более, по сравниванию между разными популяциями работ практически нет. В ходе 2006 г. была апробирована и отработана сама методика постановки реакции. Было отмечено присутствие у некоторых животных микрофитобионтных инвазий: у шести представителей M. kurilensis со станции «Троица» в органах (гонада, пищеварительная железа (ПВЖ), мантия) и/или гемолимфе были обнаружены микроводоросли. Определить выраженную корреляцию между активностью 63 гуморальных реакций иммунитета и наличием микрофитобионта в организмах моллюсков не удалось. Однако это лишь указывает на необходимость более глубокого исследования данного явления. Наибольший интерес представляют собой результаты, полученные при сравнении суммарных показателей гемагглютинации с исследованиями по выявлению у модиолусов различных гистопатологий (результаты любезно предоставлены Сясиной И.Г., ИБМ ДВО РАН). В ходе сравнительного анализа было выявлено, что наличие патологических изменений органов, в виде аномальной вакуолизации клеток ПВЖ и деструкции клеток почечных канальцев, сопровождается заниженным титром гемагглютинации. Для доказательства непосредственной связи этих двух фактов был рассчитан коэффициент корреляции, который составил –0,578. Данное значение подтверждает наличие корреляции. По результатам работ с M. kurilensis в 2007 г. можно с уверенностью сказать, что наиболее активно реакция прямой гемагглютинации проходила с Эр групп О и А для представителей со всех станций. Кроме того, данные говорят о схожести иммунного статуса животных из различных акваторий, собранных в один и тот же период. В работе 2009 г. на A. broughtoni было установлено, что наибольшая активность агглютинирующих факторов проявляется в отношении Эр группы крови АВ, а наименьшая – к Эр группе О. Кроме того, сезонные сравнения показали изменение активности агглютинирующих факторов: титры реакции с плазмой животных, взятых в низкотемпературный период, ниже, чем таковые у животных в период активации метаболизма, вызванных повышением температуры до устойчивых положительных значений (+5 – +7оC). Этот факт необходимо учитывать при оценке иммунного статуса этих животных. Все полученные данные могут позволить разработать метод диагностики состояния здоровья M. kurilensis и A. broughtoni в естественных и культивируемых популяциях. Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292. 64 Ю.Н. Сокольникова, В.В. Кумейко Глава 12. ПОКАЗАТЕЛИ ФАГОЦИТОЗА ГЕМОЦИТОВ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ MODIOLUS KURILENSIS ИЗ НЕКОТОРЫХ АКВАТОРИЙ ЯПОНСКОГО МОРЯ С НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЙ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКОЙ Двустворчатые моллюски обладают гемальной системой циркуляции внутренней среды, которая сообщается с интерстициальными компартментами и формирует единую транспортно-защитную ткань, называемую гемолимфой, реагирующую на любые изменения, происходящие в окружающей среде. Важную роль в адаптивных и защитных реакциях животных играет фагоцитоз: как фактор клеточного иммунитета он отвечает за поглощение и удаление чужеродных агентов из организма. Ввиду активного развития аквакультуры и промысла ценных пищевых объектов, изучение защитных и адаптационных механизмов морских животных, в т.ч. моллюсков, актуально и необходимо. Modiolus kurilensis в силу его широкого распространения в Японском море также может являться удобным модельным объектом для мониторинговых исследований морских экосистем. Данное исследование выполнено с целью оценки показателей фагоцитоза гемоцитов моллюсков из акваторий Японского моря как метода исследования активности клеточного иммунитета этих животных, а также оценки физиологического состояния двустворчатых моллюсков M. kurilensis при средне-нормальном фоне естественных патогенов. Для исследования фагоцитоза определяли два показателя: фагоцитарную активность (ФА) – количество фагоцитирующих клеток и фагоцитарный индекс (ФИ) – среднее количество бактерий, поглощенных клеткой. Для достижения этой цели клеточные суспензии гемолимфы инкубировали с заранее термически убитыми и мечеными флуоресцирующим красителем FITC бактериями: Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens, Staphilococcus aureus. Затем препараты заключали в гидрофильную среду Mowiol 4.88 и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axioimager. Раннее полученные нами данные по исследованию фагоцитарных свойств гемоцитов у M.kurilensis, собранных в бухте Троицы за 2006 год, показывают, что фагоцитарный индекс и фагоцитарная активность в отношении трех бактерий Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens и Staphylococcus aureus незначительно варьируют. В связи чем, для сравнения показателей фагоцитоза у модиолусов, взятых с 65 трех станций (б. Троицы, б. Киевка и зал. Восток), нами было принято решение использовать в качестве чужеродного агента при подсчете данных лишь одну бактерию – Staphylococcus aureus. Известно, что фагоцитарной активностью обладают не все типы гемоцитов моллюсков. По нашим данным у животных, собранных с трех станций, от 46 до 59 % гемоцитов M. kurilensis проявляют фагоцитарную активность. При вскрытии моллюсков и дальнейшем исследовании у шести особей моллюсков, собранных в бухте Троицы, была обнаружена инвазивность тканей микроводорослями. У модиолусов с интенсивной тканевой инвазивностью микроводорослями (заражением охвачены гонада, мантия, ПВЖ) фагоцитарные показатели максимальны или приближаются к таковым. Моллюски, у которых микроводоросли выявлялись только в гемолимфе, имели средние фагоцитарные значения. Данная вариабельность, вероятно, связана с различным иммунологическим состоянием животного (активированное или угнетенное). У ряда моллюсков из бухты Киевка и залива Восток инвазии микроводорослей были выявлены лишь в гемолимфе, и ввиду этого, фагоцитарные показатели имеют различные значения. Особи, имеющие инвазии, равномерно располагаются по всей длине ранжированного ряда. Выраженной корреляции между показателями фагоцитоза и обнаруженной микрофитобионтной инвазией не выявлено, что, вероятно, может быть связано с необходимостью регистрировать степень выраженности и время развития инвазии. Сравнение результатов по гистопатологическим изменениям в пищеварительной железе и почках, любезно предоставленных И.Г. Сясиной (ИБМ ДВО РАН), с полученными нами фагоцитарными показателями показало, что животные с гистопатологиями имеют невысокие показатели ФА и ФИ. Выявлена обратная коррелятивная связь между наличием патологий и показателями фагоцитоза, которая характеризуется для выборки из залива Восток как значительная и составляет – 0,51. Средние значения фагоцитарной активности и фагоцитарного индекса незначительно дифференцируют три исследованные выборки и составляют 51,3±6,77 и 2,24±0,64, соответственно. Результаты работы являются шагом к разработке метода диагностики физиологического состояния двустворчатых моллюсков в природе и аквакультуре, а кроме того, позволяют оценить естественную вариативность показателей иммунитета этих животных и установить в дальнейшем границы нормы и патологии для исследованных морфофункциональных изменений. 66 Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292. А.А. Анисимова Глава 13. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕМОЦИТОВ И ДИАГНОСТИКИ ГЕМОЦИТАРНОЙ НЕОПЛАЗИИ У ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ Двустворчатые моллюски – объект, который часто используется в различных исследованиях, в т. ч. в целях биоиндикации и оценки качества среды. Это связано с тем, что двустворчатые моллюски являются фильтраторами морской воды и накапливают в своих тканях всевозможные мутагенные токсины, содержащиеся в среде их обитания. В результате генотоксического эффекта среды у животных развиваются различные патологические состояния, которые могут свидетельствовать о неблагоприятной экологической обстановке в данной акватории. Учитывая, что моллюски выступают как ценный объект промысла и аквакультуры во многих странах мира, оценка физиологического состояния этих гидробионтов, включая диагностику различных заболеваний, стала актуальной задачей для всех приморских регионов, экономика которых так или иначе связана с культивированием морских организмов. Одним из наиболее чувствительных критериев, отражающих физиологическое состояние моллюсков, является изменение пролиферативной активности клеток гемолимфы, связанное с нарушениями клеточного (митотического) цикла гемоцитов и приводящее к опасному заболеванию – гемоцитарной неоплазии, сходной по своим проявлениям с лейкемией позвоночных животных. Ее распространение среди коммерчески значимых видов достаточно велико. Поражение и смертность в культивируемых популяциях моллюсков (до 95 %) наносит значительный экономический ущерб марикультурным хозяйствам. Во многих странах имеются лаборатории, занимающиеся проблемой гемоцитарной неоплазии двустворчатых моллюсков. На Дальнем Востоке России, несмотря на широкий охват огромной акватории Северной Пацифики, такие исследования единичны. Сотрудниками Института биологии моря ДВО РАН выявлены опухоли у некоторых видов двустворчатых моллюсков (модиолус, мидия, гребешок), обитающих в южной части 67 Приморья (Usheva, Odintsova, 1997; Usheva, Frolova, 2000). Среди них зарегистрированы и случаи гемоцитарной неоплазии. Механизмы возникновения и прогрессии опухолевого роста до сих пор до конца не поняты. Согласно господствующей теории, в нормальной клетке имеются эндогенные протоонкогены (гены инициации и прогрессии клеточного цикла), которые под действием мутаций превращаются в онкогены, что приводит к перерождению нормальных клеток в опухолевые. Мутации могут происходить как спонтанно, так и под воздействием мутагенных факторов – радиации, природных токсинов, тяжелых металлов, антропогенной органики и т.д. В качестве онкогенов могут выступать и экзогенные вирусы при внедрении их в геном эукариотической клетки. Трансформированные (неопластические) клетки характеризуются бесконтрольным ростом, способностью проникать (метастазировать) в здоровые ткани, увеличением содержания ДНК в результате полиплоидизации клеток или, наоборот, его уменьшением в ходе апоптоза. Диагностировать гемоцитарную неоплазию можно несколькими способами. Один из методов, применяемых в диагностических лабораториях, – гистологический анализ тканей. На препаратах мазков гемолимфы раковые клетки моллюсков выглядят более крупными и имеют увеличенное ядро (из-за избыточности генетического материала). В клетках также могут регистрироваться митозы и апоптотические явления (Usheva, Odintsova, 1997; Galimany, Sunila, 2008). Отмечено, что на ранних стадиях развития гемоцитарной неоплазии процент апоптотических клеток выше, чем на более продвинутых стадиях, где в большей степени регистрируются полиплоидные клетки (Galimany, Sunila, дополняется (анеуплоидии) 2008). методом или Гистологический хромосомного целых метод анализа. хромосомных выявления Выявление наборов опухолей часто лишних хромосом (полиплоидии) позволяет предположить наличие неоплазии. Цитогенетический метод, как и гистологический, достаточно трудоемок и требует много времени для анализа. Более удобным способом выявления клеток с измененным хромосомным набором (как с увеличенным в ходе полиплоидизации, так и с уменьшенным в ходе апоптоза) является метод проточной цитофотометрии. Этот метод позволяет произвести очень быстрый и точный анализ содержания ДНК в большом количестве образцов гемолимфы или других тканей. Проточная цитофотометрия опирается на измерения свойств клеток в «проточной системе», состоящей из специальным образом создаваемого потока жидкости, в который вводят клетки. В момент, когда клетки проходят через луч лазера, они рассеивают свет во всех направлениях и испускают 68 небольшое количество света за счет флуоресценции. Для выявления анеуплоидных или полиплоидных клеток используют количественные флуоресцентные окраски на ДНК (DAPI, PI, ЕВ Хёхст и др.). Поскольку содержание ДНК в клетках меняется по ходу клеточного цикла (перед делением клетки оно удваивается), метод позволяет также выявить долю клеток на разных стадиях цикла, а также суммарный процент клеток, участвующих в данный момент в пролиферации. Если на однопараметрической гистограмме выявляется нетипично большой пик тетраплоидных клеток (больше ожидаемого числа нормальных предмитотических (G2) и митотических (М) клеток) или регистрируются клетки других классов плоидности, подозревают наличие в исследуемой ткани опухолевой трансформации (Bihari et al., 2003; da Silva et al., 2005). Если образцы одновременно окрашены на ДНК и на какие-либо специфические антигены (маркеры) клеточной пролиферации, то двумерные гистограммы позволяют анализировать динамику клеточного цикла и оценивать различные его параметры – такие как скорость деления клеток, время удвоения популяции опухолевых клеток, границы между фазами цикла и т.д. Так, для устрицы Crassostrea virginica при одновременном анализе содержания ДНК методом проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимическом определении экспрессии PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) на препаратах было показано, что клетки ротовой лопасти обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с клетками других органов – мантии, жабер, глотки и пищеварительной железы (Jenkins et al., 2006). Подобные исследования позволяют отбирать определенные клеточные линии для использования показателя пролиферативной активности в качестве биомаркера при изучении воздействий стрессовых факторов на морские организмы. Работа поддержана Государственным контрактом с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.740.11.0292. Библиографический список 1. Bihari N., Micic M., Batel R., Zahn R. K. Flow cytometric detection of DNA cell cycle alterations in hemocytes of mussels (Mytilus galloprovincialis) off the Adriatic coast, Croatia // Aquatic Toxicology. - 2003. - Vol. 64. - P. 121-129. 2. Da Silva P. M., Soudant P., Carballal M. J., Lambert C., Villalba A. Flow cytometric DNA content analysis of neoplastic cells in haemolymph of the cockle Ceratoderma edule // Diseases of Aquatic Organisms. - 2005. - Vol. 67. - P. 133-139. 69 3. Galimany E., Sunila I. Several cases of disseminated neoplasia in mussels Mytilus edulis (L.) in Western Long Island Sound // Journal of Shellfish Research. - 2008. Vol. 27, № 5. - Р. 1201-1207. 4. Jenkins J. A., LaPeyre J. F. Cell proliferation detected with flow cytometric cell cycle analysis and immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) from somatic tissues of eastern oysters, Crassostrea virginica // Environmental Bioindicators. -2006. - Vol. 1, № 3. - Р. 177-190. 5. Usheva L. N., Odintsova N. A. Mesenchymal tumor in the mantle of the mussel Modiolus difficilis from Amursky Bay in the Sea of Japan // Diseases of Aquatic Organsms. - 1997. - Vol. 29. - P. 121-126. 6. Usheva L. N., Frolova L. T. Neoplasia in the connective tissue of the mussel Mytilus trossulus from polluted areas of Nakhodka Bay, Sea of Japan // Russian Journal of Developmental Biology. - 2000. - Vol. 31, № 1. - Р. 53-60. А.В. Мартынова, А.П. Прушинский, Е.С. Носач, О.А. Чулакова Глава 14. Разработка МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ РЕСПИРАТОРНОГО ТРАКТА Несмотря на достигнутые успехи, диагностика инфекций респираторного тракта до сих пор остается одной из наиболее значимых проблем здравоохранения. Во многом это связано как с отсутствием адекватных методов диагностики и идентификации возбудителей, так и с объективными причинами, такими как многообразие видового состава и принадлежность рассматриваемых микроорганизмов к группе прихотливых возбудителей. Целью нашей работы являлось на примере Streptococcus pneumoniae, наиболее часто встречающегося патогена респираторного тракта, обосновать новый метод идентификации и генотипирования микроорганизмов- возбудителей инфекций респираторного тракта. Методы: В качестве перспективного диагностического и молекулярно- эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). 70 Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов. Результаты: несмотря на значимость пневмококковых инфекций эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S. pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики, а также проводить мониторинг пневмококковых инфекций. Для решения данной задачи был применен метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент геномной ДНК S. pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве. Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S. pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видоспецифический фактор вирулентности пневмококка- пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP1922 (гипотетический протеин) и SP1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 bp) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома. В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была изменена схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации и были проведены согласно общепринятым правилам. В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептокококков, а также была отрицательна со штаммами, 71 неродственными S. pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов. Кроме того, чувствительность NCR фрагмента S. pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268 ± 6,57 пар оснований [1254,997-1281,603]. Выводы: в качестве перспективного диагностического и молекулярно- эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов. 72 ___________________________________________________________________________ Раздел II БИОТЕХНОЛОГИИ КАК ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ РЕСУРС ___________________________________________________________________________ Е.А. Бородин Глава 1. ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ СОИ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОЕВЫХ ПРОДУКТОВ В МЕДИЦИНЕ Для населения стран Азии продукты из сои – традиционный продукт питания, с употреблением которого распространения ряда восточные болезней. народы Традиционные связывают низкую восточные соевые частоту продукты малоприемлемы для европейцев вследствие наличия специфических вкуса и запаха. С целью улучшения вкусовых качеств продуктов из сои на Западе были разработаны новые инновационные технологии производства текстуратов и изолятов соевого белка, вакуумная дезодорация соевого масла и других соевых продуктов. Сегодня в США и странах Европы на прилавках магазинах широко представлены соевые молоко, напитки, мороженое йогурты, причем на рынке эти продукты позиционируются как продукты здоровья. В 90-е годы в России отмечался всплеск интереса к продуктам из сои. На Дальнем Востоке и других регионах была освоено производства ряда соевомолочных продуктов. Однако, к настоящему времени интерес населения к этим продуктам снизился, а их производство постепенно сходит на нет. В значительной мере это связано с использованием производителями достаточно примитивных технологий. Лишь единичные предприятия, например Комсомольский городской молочный завод (ДАКГОМЗ), имеют высокотехнологичные линии, позволяющие производить дезодорированные продукты. За рубежом проводятся исследования, направленные на выяснение возможности профилактики и лечения ряда болезней с помощью употребления в пищу соевых продуктов. Несмотря на очевидную практическую пользу от широко внедрения продуктов из сои в рацион питания населения, в нашей стране выполняются лишь единичные подобные исследования. Решение проблемы соевого 73 питания в России возможно только лишь на основе внедрения новых инновационных технологий производства этих продуктов, широкой пропаганды среди населения соевых продуктов как продуктов здоровья, проведения научных исследований, показывающих пользу соевого питания для россиян. Еще одна область, в которой благодаря использованию инновационных технологий (нанотехнологий), достигнут определенный успех это производство лекарств из компонентов сои. В 80-ые годы я участвовал в разработке лекарственного препарата для лечения заболеваний кровеносных сосудов на основе фосфолипидов сои. Исследования проводились в Московском медицинском университете. Нами было установлено, что наиболее эффективной формой фосфолипидного препарата для удаления избыточного холестерина из плазматических мембран клеток являются мелкие положительно заряженные мицеллы. Однако, предложенный препарат был нестабилен при хранении и поэтому не мог быть внедрен в производство. Лишь несколько лет спустя в Институте биологической и медицинской химии РАМН был зарегистрирован препарат «Фосфоглив», представляющий лиофилизированные нанолипосомы. Еще один лекарственный препарат, над разработкой которого мы сейчас работаем, может быть создан на основе соевого ингибитора трипсина, причем этот препарат может найти применение не только в медицине, но и как консервант, позволяющий предохранять белки от разрушения протеолитическими ферментами. Таким образом, проблема использования потенциала сои подразумевает широкое внедрение инновационных технологий производства соевых пищевых продуктов и создания лекарственных средств на основе компонентов сои. Без сомнения, инновационный характер имело бы приобщение россиян к соевым продуктам. Ниже речь пойдет о имеющемся у нас опыте использования соевых продуктов в медицинских целях. Соя богата полноценным растительным белком и полиненасыщенными липидами, многими витаминами и особенно витамином Е - важнейшим природным антиоксидантом. Углеводы сои – сахара стахиоза и рафиноза, обладают способностью стимулировать рост чрезвычайно полезной бифидофлоры в кишечнике. Соя представляет источник ряда минеральных веществ и микроэлементов. В сое в значительных количествах присутствует легко усваиваемое железо [1]. В последнее десятилетие ученые во всем мире уделяют исключительное внимание изофлавоноидам соевых бобов – генистеину и диадзеину. Предполагается, что именно фитоэстрогены сои обеспечивают большинство положительных для здоровья человека эффектов, связанных с регулярным употреблением в пищу продуктов из сои [2]. Данные эпидемиологических, экспериментальных и клинических исследований ясно указывают 74 на существование отрицательной корреляции между систематическим потреблением в пищу продуктов из сои и низкой частотой рака груди, толстого кишечника и простаты, уровнем холестерина крови и частой заболеваний сердца и сосудов, менопаузальными симптомами и постменопаузальным остепорозом [3]. За рубежом созданы многочисленные пищевые добавки на основе изофлавоноидов сои. Роль продуктов из сои в решении проблемы улучшения качества питания россиян зафиксирована в федеральном документе «Концепция государственной политики в области здорового питания», утвержденном правительством РФ в 1998г. Еще в 1989г. по инициативе кафедры биохимии БГМИ в г. Благовещенске под эгидой научного совета «Биомембраны» АН СССР был проведен Всесоюзный научный симпозиум «Реконструкция, стабилизация и репарация поврежденных биологических мембран». Участники симпозиума – ведущие специалисты в своей области знаний, отмечали, что в Амурской области имеются самые благоприятные условия для производства лекарственных препаратов на основе компонентов сои. С 1997г. каф. биохимии ГОУ ВПО АГМА активно включилась в исследование БАВ сои, выяснение возможности использования соевых продуктов в лечении и профилактике ряда заболеваний. В 2001-02 гг. в Амурской области реализована разработанная проф. Е.А. Бородиным областная целевая программа «Пищевые продукты из сои как средства профилактики и лечения сердечно-сосудистых, онкологических и других заболеваний». В реализации программы активно участвовали клинические кафедры АГМА. На основании результатов реализации программы изданы методические рекомендации: «Применение соевых напитков в качестве средств диетотерапии при лечении и профилактике ишемической болезни сердца» (Е.А. Бородин, И.Г. Меньшикова, Н.В.Лесик, Л.В. Матыцина, Г.П. Синицкая, М.А. Штарберг и Т.В. Аксенова).Благовещенск. 2002, «Применение питательных соевых коктейлей в питании детей» (Е.А. Бородин, А.Ф.Бабцева, Н.В. Лесик, М.А. Штарберг и С.М. Поддубная). – Благовещенск. 2002, защищены кандидатские диссертации: Т.В. Аксенова «Антиокислительные свойства соевых продуктов. Использование соевого молока для коррекции окислительного стресса и гиперлипидемий» (2006), О.П. Дуянова «Гестоз. Профилактика тяжелых форм» (2004), О.А. Шаршова «Ранняя диагностика и профилактика эндометритов у родильниц с гестозом» (2004), Л.Д.Стрижева «Использование соевых продуктов при лечении больных с хроническим гломерулонефритом» (2003), получены патенты: Аксенова Т.В., Бородин Е.А., Меньшикова И.Г., Синицкая Г.П., Ивченко А.Е. Способ лечения дислипопротеидемий. Патент на изобретение № 2195949, от 10.01.2003г. по заявке № 2001103769 от 75 08.02.2001г., Дуянова О.П., Быстрицкая Т. Способ профилактики гестоза у беременных. Патент на изобретение № 2228760. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 мая 2004 г., Бородин Е.А. Методы лечения ИБС, нефротического синдрома, осложнений беременности с использованием соевых продуктов внедрены в отделениях АОКБ, 1-ой ГКБ г. Благовещенска. Методы профилактики ряда заболеваний с использованием соевых продуктов внедряются в различных формах: продажа соевых продуктов в розничной сети; пропаганда пользы для здоровья продуктов из сои в средствах массовой информации. Предложенные в ходе осуществления Программы научно-технические разработки внедрены в производство на ОАО «Молочный комбинат Благовещенский», ЗАО «Флибустьеры», ОАО «ДАКГОМЗ» г. Комсомольск-на Амуре, ЗАО «Сибирская Соевая Компания» г. Новосибирск, ЗАО «Алев» г. Димитровград, Ульяновская область. По итогам конкурса Дальневосточной межрегиональной выставки-ярмарки “АГРОПРОД-2002” на лучшую научно-техническую разработку авторы награждены Золотой медалью и Дипломом за разработку и внедрение указанной областной целевой программы. За прошедшие годы установлены деловые контакты со многими отечественными и зарубежными производителями соевых продуктов: ОАО «Молочный комбинат Благовещенский» (разработка технологии производства соевых напитков «Здоровье», исследование их эффективности в лечении ИБС), ЗАО «Флибустьеры», г. Благовещенск (исследование химического состава соевой муки, соевого молока и соевого творога, выступления в СМИ), ЗАО «АНК АГРО», г. Благовещенск (исследование химического состава соевой муки), ЗАО «Орбита-АГРО», г. Благовещенск (исследование химического состава соевого шрота и жмыха), ООО «Амурагроцентр», г. Благовещенск (исследование химического состава растительных масел, рекомендации по улучшению технологии производства масла «Злато», помощь в устранении технологических проблем), компания АМЕТИС, г. Благовещенск. Начало сотрудничества по производству изофлавоноидов из отходов переработки сои, ЗАО «Сибирская Соевая Компания», г. Новосибирск (исследование химического состава соевой муки, соевой крупки, вопросы маркетинга), ОАО «ДАКГОМЗ», г. Комсомольскна Амуре (исследование химического состава выпускаемых комбинатом соевых продуктов, исследование оздоровительных эффектов приема коктейлей «Dr. Сойер», выступления в СМИ), ЗАО «Алев», г. Димитровград (научно-практические конференции для представителей СМИ, отделов здравоохранения и социального обеспечения Ульяновской и Самарской областей. Ульяновск, Димитровград, Самара, 76 Москва (2004, 2005 годы), содействие установлению сотрудничества с фирмой Fuji Oil Co (Япония). В 2000г. во время проведения в Благовещенске российско-японского симпозиума медицинского обмена профессор Е.А.Бородин познакомился с японским специалистом в области исследования соевых продуктов профессором Ш.Ямамото. В 2003г. во время визита с делегацией студентов АГМА в г. Осака в побратимский университет профессор Е.А.Бородин посетил университет г. Токушима, в котором работал профессор Ш.Ямамото. В 2005г. состоялся визит профессора Ш.Ямамото и представителей фирмы Fuji Oil Co в Россию (гг.Москва, Самара, Димитровград, Ульяновск) для налаживания сотрудничества с ЗАО «АЛЕВ» и в этом же году профессор Е.А.Бородин был принят на фирме Fuji Oil Co. Была достигнута договоренность о проведении совместного исследования способности изолята соевого белка снижать содержание холестерина в крови русских людей. Проект реализован в 2006-2007 годах. Высокие антиокислительные свойства соевых продуктов мы связываем с высоким содержанием в соевых бобах витамина Е (по нашим данным 300-400 мкг/г сырого веса) и фосфолипидов (1,5-2,0% от сырого веса) [4,5]. С учетом наличия у токоферолов и фосфолипидов антиокислительных и мембраностабилизирующих свойств указанное обстоятельство представляется важным диетическим преимуществом соевых продуктов. По сравнению с коровьим соевое молоко более устойчиво к действию активных форм кислорода, содержит меньше продуктов пероксидации, медленней окисляется и проявляет большую антиокислительную активность [4,6]. При анализе жирнокислотного состава липидов соевого и коровьего молока, установлено, что коровье и соевое молоко характеризуются выраженными различиями в жирнокислотном составе, которые могут иметь весьма существенное значение для их диетических свойств. В коровьем молоке преобладают насыщенные жирные кислоты – пальмитиновая и стеариновая и мононенасыщенная олеиновая кислота, а в соевом – полиненасыщенная линолевая кислота. Содержание полиненасыщенных жирных кислот омега-3 серии, которым приписывается благоприятное действие в плане профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, в соевом молоке в 4 раза выше чем в коровьем [4]. В последующих экспериментах in vivo мы нашли дальнейшее подтверждение высоким антиокислительным свойствам соевых продуктов [4,5,7]. 77 В первом эксперименте группа здоровых молодых людей в возрасте 17-19 лет (8 девушек и 5 юношей) в течение 2-х недель ежедневно принимали по стакану соевых питательных коктейлей. Перед началом и по окончании эксперимента натощак брали образцы крови. В последующем в образцах сыворотки определяли показатели, отражающие состояние ПОЛ, протеолиза, а также содержание общего белка и глюкозы. К окончанию эксперимента отмечено достоверное увеличение содержания витамина Е на 30% с 7.84 0.41 до 10,60.41 мкг/мл (p<0.005). Из 13 участников, принимавших соевые коктейли, увеличение содержания витамина Е было выявлено у 11 человек, у 1 участника содержание витамина Е к окончанию эксперимента снизилось, а еще у 1 – не изменилось. При анализе содержания в крови участников эксперимента продуктов перекисного окисления липидов установлено, что содержание гидроперекисей липидов к окончанию эксперимента снизилось в 2 раза с 7.47 1.51 до 3.730.80 мкмоль/л (p<0.05). В группе принимавших соевые коктейли выявлена тенденция к уменьшению содержания в сыворотке крови диеновых конъюгатов, но это изменение не имело статистической достоверности. Таким образом, прием соевых коктейлей здоровыми молодыми людьми сопровождался антиоксидантным эффектом. Нам представляются весьма интересными результаты исследования влияния соевых коктейлей на состояние протеолиза, которому принадлежит исключительно важная роль в регуляции поведения клеток в условиях, как физиологии, так и патологии. Как известно, в соевых бобах присутствует в значительных количествах ингибитор трипсина, во многих отношениях схожий с альфа1-антитрипсином сыворотки крови человека. Большая часть ингибитора в соевых пищевых продуктах разрушается в процессе термической обработки, но 20% от общего содержания ингибитора остаются активными и попадают с соевыми продуктами в желудочнокишечный тракт человека, откуда согласно результатам ряда исследований могут всасываться. В группе студентов, принимавших соевые коктейли, произошло статистически достоверное снижение общей протеолитической активности сыворотки крови с 0.2870.022 до 0.2260.019 Е/л (p<0.05), т.е. на 30%. Содержание альфа1-антитрипсина в сыворотке крови по окончанию эксперимента, хотя и несколько выше исходного, но 78 не имеет с ним статистически значимых различий [7]. Исходя из полученных данных, мы не можем объяснить снижение протеолитической активности сыворотки крови после приема соевого молока всасыванием ингибитора в желудочно-кишечном тракте. Точно такие же результаты были получены нами в независимом исследовании при выяснении влияния соевого молока на показатели протеолиза у женщин с мастопатией – снижение общей протеолитической активности без статистически достоверного увеличения содержания ингибитора трипсина в крови. Таким образом, полученные результаты очевидно указывают на принципиальную возможность влияния на процессы протеолиза в организме с помощью приема пищевых продуктов из сои. В опытах in vitro нами установлено однозначное влияние протеазы трипсина и его соевого ингибитора на процессы свертывания крови [8]. Показатели, отражающие время свертывания крови – протромбиновое время, тромбиновое время и активированное время реакции, при добавлении к нативной плазме крови раствора трипсина в конечной концентрации 0,1% уменьшались в 1,5-2 раза, отражая возрастание скорости свертывания крови под влиянием экзогенного трипсина. При добавлении к нативной плазме крови соевого ингибитора трипсина в конечной концентрации 1% эти показатели, напротив, возрастали в 1,5-3 раза, свидетельствуя о замедлении свертывания крови под влиянием экзогенной антипротеазы. Аналогичное противоположное влияние трипсин и его ингибитор из бобов сои оказали на скорость растворения тромба, как это следует из результатов проведения фибринолиз-теста. Время растворения тромба уменьшалось в 2 раза в присутствии раствора трипсина и возрастало в 2,5 раза в присутствии ингибитора трипсина. Полученные нами результаты являются новыми и представляют несомненный интерес как в теоретическом, так и в практическом плане: оказывается регуляция гемостаза неспецифическими протеолитическими ферментами и их ингибиторами. С помощью приема соевых продуктов, в принципе, можно влиять на течение реакций гемостаза. Для поиска других потенциальных мишеней соевого ингибитора протеаз в организме человека мы предпринимаем попытку воспользоваться возможностями биоинформатики [9]. Используя базы данных белков (Protein Data Bank, NCBI) и программы поиска гомологичных белков (BLAST и PSI-BLAST), мы нашли гомологичные соевому ингибитору трипсина природные ингибиторы протеаз. Максимально близок ингибитору трипсина соевых бобов панкреатический ингибитор протеиназ. По системе 79 CATH SSAP степень гомологичности этих белков составляет 88,22 балла по 100 бальной шкале и объединяет эти два ингибитора в одну гомологичную семью (Sequence Family) и гомологичную суперсемью (Homologues Superfamily). Соевый ингибитор трипсина в отличие от панкреатического ингибитора протеаз является двуглавым, то есть связывает трипсин по реактивному центру Lys16-Ser17, а по второму центру – Leu43-Ser44 - химотрипсин и эластазу плазмы крови. В меньшей степени определяется гомология ингибитора трипсина соевых бобов с сывороточным альфа-1- антитрипсином. Степень гомологичности данных белков составляет 65 баллов, что также указывает на довольно высокое сродство, позволяя предполагать высокую степень идентичности их функциональной активности. С учетом того, что α 1антитрипсин по системе SSAP на 89,33 балла гомологичен антитромбину плазмы крови можно прогнозировать, что ингибитор трипсина соевых бобов подобно α1антитрипсину, обеспечивающему 90% антитриптической активности плазмы, обладает антиплазминовой активностью. Таким образом, использование биоинформационных методов способствует получению информации о возможных гомологах ингибитора трипсина соевых бобов и выяснению потенциальных субстратов и функций данного белка. Ингибитор трипсина соевых бобов действует не только на панкреатический трипсин, но и на химотрипсин, тромбин, эластазу, катепсины, что открывает перспективы для его исследования в качестве потенциального используемый сегодня терапевтического лекарственный средства. препарат По сути, апротинин, единственный представляющий полипептид из легких крупного рогатого скота, успешно применяется в лечении острого панкреатита и расстройств гемостаза. По прогнозам к 2010 году ежегодные объемы мировых продаж тразилола достигнут 500 млн долларов. Препарат обладает побочными эффектами: высокая аллергенность, возможность внесения инфекционного начала. Преодолеть недостатки можно путем разработки препарата на основе растительного белка – ингибитора трипсина из бобов сои, или создания с помощью методов протеомики и биоинформатики рекомбинатнтного белка или пептитда. Аспирантом кафедры И.Э. Памирским выполнена работа «Сравнительное исследование влияния ингибитора трипсина соевых бобов и апротинина на состояние процессов протеолиза». Ассистент кафедры Т.В. Аксенова исследовала эффективность применения соевого молока в комплексном лечении больных ишемической болезнью сердца [4,6]. 80 Обследованные были разделены на три 3 группы. В первую группу вошли практически здоровые люди. Во вторую (контрольную) и третью (экспериментальную) - больные с инфарктом миокарда и прогрессирующей стенокардией, получающие стандартное лечение. Больные экспериментальной группы дополнительно получали соевое молоко по 0,5 литра ежедневно. В контрольной группе больных клиническое выздоровление на момент выписки из стационара не биохимических сопровождалось показателей, хотя достоверными средние изменениями величины общего определяемых холестерина и триглицеридов были ниже, чем при поступлении в стационар. В отличие от этого в экспериментальной группе больных, получавших наряду с фармакотерапией соевое молоко, установлено достоверное уменьшение содержания в сыворотке крови общего холестерина на 28% с 7,600,49 до 5,970,35 ммоль/л (p<0.02) и увеличение содержания фосфолипидов 2,820,22 до 3,640,24 моль/л (p<0.05). Изменения содержания холестерина липопротеидов высокой плотности и уменьшение индекса атерогенности не были статистически достоверными. Включение в диету больных соевого молока сопровождалось достоверными изменениями некоторых показателей, отражающих интенсивность процесса перекисного окисления липидов. Так, содержание в сыворотке крови диеновых конъюгатов и гидроперекисей липидов к окончанию эксперимента достоверно снизилось в 1,6 и 1,8 раза, соответственно, при одновременном уменьшении окисляемости липидов сыворотки крови. Возможная причина антиоксидантного эффекта соевого молока может состоять в увеличении содержания в сыворотке крови витамина Е у больных, получавших соевое молоко. Содержание витамина Е к моменту окончания лечения возрастало почти в 2 раза с 29,15,8 до 51,08,0 мкг/мл (p<0.05). Мы считаем, что увеличение содержания витамина Е в крови после приема соевых продуктов, сопровождающееся антиоксидантным эффектом, представляет весьма существенный механизм в реализации благотворных для здоровья эффектов соевых продуктов. Аналогичный эффект мы наблюдали в экспериментах с животными, получавшими соевое молоко. В целом, полученные результаты позволяют рассматривать продукты из сои как полезные для здоровья продукты. На основе БАВ сои возможно создание новых лекарственных средств. 81 Библиографический список 1. Бородин Е. А., Аксенова Т. В., Анищенко Н. И. Пищевые продукты из сои. Новая роль. - Вестник ДВО РАН, 2000. - № 5. - С. 72-85. 2. Setchell K. D. Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones. // Am.J.Clin.Nutr. - 1998. - Vol. 68, № 6. – Р. 13331346. 3. Messina M., Gardner C., Barnes S. Gaining insight into the health effects of soy but a long way still to go: commentary on the fourth International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease // Journal of Nutrition. - 2002. - V. 132, № 3. – P. 547-551. 4. Бородин Е. А., Доровских В. А., Аксенова Т. В., Штарберг М. А. Липидный состав и антиокислительные свойства соевого молока в условиях in vitro и in vivo // Дальневосточный медицинский журнал. - 2001. - № 4. - С. 26-30. 5. Borodin E. A., Dorovskikh V. A., Aksyonova T. V. et al. Soy milk is more effective in enhancing the blood vitamine E content and suppressing lipid peroxidation than the dietary vitamine E. In: Ninth Internatinal Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange. Program Abstract (II) Supplement. - Kanazawa, 2001. - P. 208. 6. Aksyonova T. V., Borodin E. A. The lipid composition and the antioxidant properties of soy and cow milk. In: YIII Russia-Japan International Medical Symposium. Blagoveshchensk, September 21-22, 2000. – Р. 401-402. 7. Бородин Е.А., Бородина Г.П., Штарберг М.А. и соавт. Исследования влияния питательные соевых коктейлей и витамина Е на состояние перекисного окисления липидов, протеолиза, липидный профиль, содержание глюкозы и активность некоторых органо-специфичных ферментов в сыворотке крови молодых людей // Дальневосточный медицинский журнал. - 2003. - № 1. - С. 14-17. 8. Borodin E., Pamirski I., Shtarberg M., Gorin A., Anikin S., Beloglazova I. Proteolysis, protease inhibitors and soya. In: “Medical-bilogical bases of drug therapy in traditional east and up-to-date medicine”. IV Russia and China Medical Forum. Blagoveshchensk, 2007. – Р. 31-35. 9. Borodin E. A., Shtarberg M. A., Beloglazova I. G., Anikin S Protease inhibitors from soy beans – antinutritious factors or respective drug? In: Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange. - Niigata, Japan : JRME NIIGATA, August 10-11, 2004. – Р. 92. 82 М.В. Антонюк, Б.И. Челнокова, Т.А. Гвозденко, О.Н. Фотина Глава 2. ЛЕЧЕБНЫЕ ГРЯЗИ ПРИМОРСКОГО КРАЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ С лечебной целью грязи (пелоиды) применяли еще в Древнем Египте, Древнем Риме, Индии. С конца XVIII–начала XIX века лечение грязями стало проводиться во многих странах Западной Европы (Швеция, Франция, Германия, Австрия). В России лечебные грязи использовались уже в XIV–XVI вв. (Крым, Саки, Астраханская губерния), но только с начала XIX в. грязелечение стало проводиться под контролем медицинского персонала. Центрами изучения проблем пелоидотерапии в XX в. стали Бальнеологический институт (Пятигорск), Центральный НИИ курортологии и физиотерапии (Москва), Украинский институт курортологии (Одесса). В настоящее время доказано, что пелоидотерапия влияет на многие патогенетические звенья, лежащие в основе различных заболеваний. Это определяет широкие возможности применения грязелечения как метода патогенетической терапии при заболеваниях опорно-двигательного аппарата, нервной системы, желудочнокишечного тракта, в гинекологии. Лечебное действие морских иловых лечебных грязей обеспечивается сложным составом илов и комплексом физико-химического воздействия на местном уровне и на весь организм, ионно-солевым составом, наличием газов, специфических компонентов и органических веществ. Условно выделяют физическое тепловое, химическое, сорбционное, механическое действие. При этом каждая грязь имеет специфические свойства и первичные аспекты действия, во многом обуславливающие особенности физиологических реакций и лечебный эффект [1, 3, 4]. В Приморском крае имеются почти все известные типы лечебных грязей: морские иловые (Ясненские, Садгородские, Находкинские, и др.), сапропелевые (Лазовские, Ольгинские, Кировские, Ласточка и др.). Наиболее распространены морские иловые сульфидные грязи. Морские иловые сульфидные грязи формируются в заливах и бухтах Японского моря (залив Угловой, бухты Экспедиция и Тихая Лагуна, лагуны Лебединая, Духовская и др.) при интенсивном водообмене с морем в условиях, благоприятных для накопления пелитового материала и органических веществ. Илы состоят из жидкой и твердой фаз. Жидкая фаза представлена водой и растворенными солями, твердая – кристаллами 83 солей, гидрофильным коллоидным комплексом, силикатными частицами, обломками ракушек, остатками растений. Детально изучено, разведано и широко используется в санаторно-курортной практике только Садгородское месторождение грязей – залив Угловой. Илы данного месторождения относятся к среднеминерализованным слабосульфидным лечебным грязям, характерными особенностями которых являются высокое содержание силикатного материала в твердой фазе, небольшое содержание сульфидов (FeS 0,05– 0,15 %), повышенная засоренность растительными остатками (до 5–10 %), раковинами моллюсков. Иловые грязи залегают на дне залива и представляют собой тонкодисперсную мазеподобную пластичную породу темно-серого или серого цвета. Сульфиды придают грязям темную серо-черную окраску. На базе месторождения в течение более чем 75 лет функционировал курорт. Широкое распространение получило внекурортное (пакетированное) использование Садгородской грязи. К сожалению, экологическая ситуация акватории залива Углового не позволяет в настоящее время продолжать полноценное использование грязи в лечебно-профилактических целях. Аналогом Садгородских являются иловые грязи месторождений Ясное (Хасанский район). В отличие от Садгородского, месторождение Ясное удалено от источников загрязнения и находится в достаточно благоприятных санитарных условиях. Однако сдерживающим условием использования месторождения является отсутствие научного обоснования применения, экспериментальных и клинических исследований грязей. В долине реки Киевка обнаружены сапропелевые илы (озера Шелюшино, Безымяное). По данным физико-химических исследований илы отвечают требованиям, предъявляемым к лечебным грязям, и являются близким аналогом пресноводных илов курорта Талая (Магаданская область). В конце ХХ в. открыто новое месторождение сульфидных иловых грязей месторождение бухты Мелководная, общая эксплуатационнозначимая площадь которого составляет 717992 м3 высококачественной лечебной грязи. В настоящее время месторождение включено Госрегистрации 25-06-7 в реестр от природных 03.05.06). На лечебных ресурсов месторождение РФ (№ оформлено первооткрывательство (Свидетельство об установлении факта открытия полезных ископаемых № ВЛВ 08ПРЧ10074 от 28.04.08). Исследованием химических и физических свойств грязей бухты Мелководная (Воевода) занимались Росгеолфонд, ООО «Дальстам», Приморгеолфонд, НИИ медицинской климатологии и восстановительного лечения СО РАМН (г. Владивосток), 84 Тихоокеанский институт географии ДВО РАН (г. Владивосток), Томский НИИ курортологии и физиотерапии. По классификации Мелководненская грязь относятся к лечебным иловым слабосульфидным среднеминерализованным грязям Садгородского типа. Мелководненское месторождение лечебных грязей расположено в бухте Мелководной (Воевода) острова Русский. Бухта Воевода глубоко врезана в северную часть суши острова, где переходит в бухту Мелководная и бухту Круглая. На основании «Лицензии на право пользования недрами» и «Лицензии на право пользования водным объектом» ООО «ДальСТАМ» провело поисково-разведочные работы в акватории бухты Мелководная. Изученность донных отложений, растительных и животных сообществ бухты Мелководная отсутствовала, в связи с чем были проведены работы по подводному ландшафтному картографированию под руководством доктора геолого-минералогических наук Б.В. Преображенского. Ландшафтная характеристика бухты Мелководная подтверждена бурением скважин в зимнее и летнее время на глубину от 0,3 до 2,5 метров. Протоколом Территориальной комиссии Приморского края по запасам утверждены балансовые запасы Мелководненского месторождения грязей, по состоянию на начало 2008 года они составляли 717,99 тыс. м3 или 947,7тыс. тонн. По категории С1 – 234,52 тыс. м3 и категории С2 – 483,472 тыс. м3. Прогнозные запасы по категории Р1-391,3 тыс. м3. Месторождение и запасы относятся к оцененным, что позволяет вести его опытно-промышленную эксплуатацию. Бальнеологическое заключение, составленное по результатам физико- химических, бактериологических, радиологических, микробиологических показателей, определило кондиции лечебных грязей «Мелководненские»: влажность 45,9-64,67 % и объемный вес 1,40-1,41 г/см3 характерны для верхнего горизонта морских илов. Сопротивление сдвигу изменяется от 2282-9699 дин/см2, повышенные показатели относятся к глубинам от 1,0 до 2,5 метров, что свидетельствует о некоторой переуплотненности ила и требует его разбавления морской водой в процессе подготовки к процедурам. Теплоемкость 0,47-0,86 кал/гград. обусловлена влагоемкостью в отдельно взятой пробе ила. В кристаллическом скелете грязей преобладают глинистые минералы на сухое вещество (каолинит, гидрослюды, монтмориллонит), присутствуют карбонаты – 4,686,59 %, гипс – 0,53-4,36 %. Реакция среды слабощелочная, рН-6,99-7,8, то есть илы условно нейтральные, окислительно-восстановительный потенциал отрицательный (от + 9,6 до -109), что 85 свидетельствует о восстановительных условиях в илах и способствует образованию сероводорода и накоплению сульфидов железа. Содержание сульфидов (одного из важнейших, с бальнеологической точки зрения, компонентов в грязях) составляет 0,053-0,155 %, что соответствует слабосульфидным илам. Минерализация грязевого раствора 33,1-36,6 г/дм3 близка солености океанической воды (35 г/дм3), то есть илы являются среднеминерализованными. Грязевой раствор содержит бальнеологически ценные компоненты и соли – бром (45-60 мг/дм3), бор (3,93-12,24 мг/дм3). Исследование радионуклидов показало, что удельная эффективная активность (Аэфф.), определяемая по содержанию природных изотопов: радий-226, торий-232, калий-40, составляет -214,43 Бк/кг (предельно допустимые содержания - 370 Бк/кг). Загрязнений по техногенным радионуклидам (цезий-137 и стронций-90) также не отмечается. Проведенные микробиологические исследования показали, что отложения представлены микрофлорой, преобразующей аммонифицирующие, нитрифицирующие, денитрифицирующие микобатериями сапрофитовых железобактериями. форм, Сульфатредуцирующие донные соединения азота: бактерии, а также сульфатредуцирующие, микроорганизмы тионовыми, способствуют образованию сероводорода и сульфида железа в донных отложениях. Также присутствуют гнилостные, маслянокислые, целлюлозоразрушающие бактерии. Санитарно-бактериологическое состояние грязей удовлетворительное. Лечебная грязь месторождения Мелководненское по физико-химическим свойствам отличается от других сульфидных иловых грязей Дальневосточного региона (табл. 7). Важными отличительными особенностями данной грязи является высокая влажность, липкость, большое сопротивление сдвигу из всех известных лечебных грязей. Это обеспечивает хороший контакт пелоида с кожей пациента и максимальное проявление термического, химического, сорбционного и механического действия пелоидотерапии [3]. Значительное количество водорослей и моллюсков, выращивание гребешка в западной части бухты указывает на антимикробные свойства сульфидной грязи и интенсивно протекающие процессы ее самоочищения. В процессе опытно-промышленной добычи осуществляется отработка техники и технологии добычи грязей, разработка мероприятий по охране окружающей среды. В настоящее время добыча грязи производится в районе точки № 31, где сульфидные грязи залегают в 150-200-х метрах от берега на глубине 2,5-3,0 метра. Добыча проводится с плавучей платформы без нарушения окружающей среды, при помощи 86 модефицированного бура «Геолог». После подъема бура скважина затягивается, не оставляя значительных повреждений иловых отложений. Таким образом, состав пелоида Мелководненского месторождения предполагает наличие специфического лечебного действия, которое до настоящего времени не изучалось. Следует отметить, что каждый пелоид по своему физико-химическому составу и лечебным свойствам является уникальным. В связи с этим ряд авторов считают неправомерным отождествлять все лечебные свойства хорошо известных и мало изученных пелоидов. В экспериментально-клинических исследованиях доказано, что на фоне общего неспецифического действия лечебных грязей имеют место специфические особенности их влияния [2, 4]. Это положение обуславливает необходимость изучения физиологичности действия Мелководненской грязи, научных исследований для уточнения медицинских показаний и методики применения конкретно каждого пелоида. Впервые на стадии экспериментально-клинические поисково-разведочных исследования работ действия были проведены грязи нового Мелководненского месторождения [5]. В эксперименте на крысах-самцах линии Вистар изучено физиологическое действие Мелководненской грязи при курсовом применении общих процедур пелоидотерапии. В качестве экспериментальных животных использовали 20 крыссамцов линии Вистар средней массой 180,510,6 г. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977 год). Все животные находились на стандартном виварном рационе и были разбиты на группы: контрольная группа – интактные крысы-самцы, содержащиеся на обычном рационе и свободном доступе к питьевой воде (10 крыс); опытная группа – интактные крысы, содержавшиеся на обычном рационе при свободном доступе к воде и получавшие общие грязевые процедуры. Мелководненскую грязь температурой 28-30оС накладывали ежедневно на 15 мин., на курс - 15 процедур. Физиологическое действие Мелководненской грязи оценивали на основании поведенческих реакций животных, биометрических показателей, лабораторных показателей, характеризующих иммунологический статус, обменные процессы, функциональное состояние гепатобилиарной и мочевыделительной систем. Материалом экспериментального исследования явились кровь, моча. Определяли показатели белкового, ферментов печени водно-электролитного, (биохимический азотистого анализатор FP-901 обменов, фирмы активность «Labsistems», 87 Финляндия). Электролиты в сыворотке крови и моче определяли на ионометре EF-HK “Fresenins” (Германия). Иммунологическое исследование крови животных включало определение фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН); фагоцитарного резерва (ФР); поглотительной активности (ФЧ) и ее резерва (ФЧР), динамики фагоцитарного процесса (суммарный процент завершающих стадий), его завершенности. Количественные и качественные параметры окислительного метаболизма – тест нитросинего тетразолия (НСТ) и его резерв (НСТР), индекс активации нейтрофилов (ИАН) и его резерв (ИАНР). В процессе курсового применения грязи поведенческие реакции животных опытной группы, также как и контрольной, характеризовались достаточной активностью. На фоне общих грязевых процедур шерсть животных по сравнению с контролем была более блестящей и гладкой, с выраженным подшерстком, плотно прилегала к телу. Масса тела всех животных увеличивалась равномерно, ежедневный прирост составлял в среднем 2,2 г. За весь период эксперимента прирост массы тела у крыс опытной группы увеличился в пределах нормальных значений и незначительно превышал данный показатель у животных контрольной группы. После курса пелоидотерапии Мелководненской грязи у животных опытной группы содержание общего белка в сыворотке крови было на 8,7% ниже по сравнению с аналогичным показателем у животных контрольной группы. Отмечено повышение активности трансаминаз у животных опытной группы: активность АЛТ в опытной группе превышала контрольные значения на 24,2%, а АСТ – на 19,7% (p<0,05). Курсовое использование Мелководненской грязи в условиях физиологического состояния организма повышает белковосинтетическую функцию печени и оказывает стимулирующее действие на её ферментативную систему. Концентрация натрия, калия и магния в сыворотке животных в обеих группах достоверно значимого различия не имела. Отмечено повышение концентрации катионов кальция в сыворотке крови, сопряженное с увеличением концентрации данных катионов в моче в 2,1 раза (p<0,02). Увеличение концентрации креатинина в сыворотке крови и моче у животных после курса пелоидотерапии характеризовалась повышением его почечного клиренса при снижении канальцевой реабсорбции и суточной экскреции, адекватных значениям контрольной группы. Представленные данные свидетельствуют о физиологическом течение процессов гломерулярной фильтрации и канальцевой реабсорбции на фоне курсового приема процедур Мелководненской грязи. Состояние фагоцитарного звена иммунитета в опытной группе крыс не претерпевало достоверных изменений в сравнении с животными контрольной 88 группы. При этом выявлено изменение показателей окислительного метаболизма. У животных опытной группы более чем в 2 раза по сравнению с интактными крысами возрасла интенсивность количество клеток, протекания внутриклеточного восстанавливающих диформазан. процесса, увеличилось Значительное усиление спонтанного уровня бактерицидности сопровождается снижением функциональных резервов фагоцитов при интенсивной пелоидотерапии, проводимой животным. Экспериментальное исследование выявило модулирующее действие грязи на состояние обмена кальция, частичное восстановление функционирования фагоцитарного звена иммунной системы, повышение резервных возможностей окислительного метаболизма компенсаторных возможностей нейтрофильных организма, что гранулоцитов, активацию сопровождается повышением противовоспалительной активности, уменьшением спазмов гладкомышечных структур, увеличением эластичности соединительнотканных структур, ускорением обменных процессов, иммунотропным эффектом. Результаты действия экспериментального Мелководненской грязи исследования и определили доказали физиологичность направления ее лечебно- профилактического использования. В клинических Мелководненской грязи исследованиях при изучали заболеваниях возможность применения опорно-двигательного аппарата, гепатобилиарной, периферической нервной систем. На основе добровольного информированного согласия в клинических исследованиях участвовало 84 больных в возрасте 28-65 лет. Группу наблюдения составили 28 больных остеоартрозом I-II стадии с преимущественным поражением крупных суставов, 25 пациентов с неврологическими проявлениями остеохондроза позвоночника (хроническая люмбалгия, цервикалгия, торакалгия, компрессионный синдром), 7 человек с травматическим повреждением периферических нервов конечностей, 24 пациента с хронический некалькулезный холециститом, дискинезией желчевыводящих путей. Грязевые аппликации проводили пациентам соответственно локализации патологического процесса температурой 36–40С, экспозиция 15–20 мин, через день, на курс 8–15 процедур. По динамике клинико-лабораторных показателей больных, получивших курс пелоидотерапии, установлена высокая клиническая эффективность. У больных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата пелоидотерапия способствовала уменьшению скованности, тугоподвижности и болей в пораженных конечностях, позвоночнике, снижению воспалительного отека и интенсивности болевого синдрома. У пациентов с заболеваниями билиарного тракта уменьшились 89 диспетические явления, болевой, астенический синдромы. Отмечены позитивные эффекты со стороны сердечнососудистой системы. Патологической бальнеореакции при использовании Мелководненской грязи не наблюдалось. Результаты гидрогеологического и экспериментально-клинического исследования сульфидной иловой грязи бухты Мелководная показали перспективность данного месторождения. Общие оцененные и утвержденные запасы Мелководненского месторождения намного превышают текущую и перспективную потребность действующего в настоящее время лечебно-оздоровительного Лебедь». По физико-химическим свойствам лечебная комплекса «Белый грязь месторождения Мелководненское выгодно отличается от других сульфидных иловых грязей Дальнего Востока, что предполагает ее высокую лечебно-профилактическую эффективность. Доказана эффективность применения Мелководненской грязи при заболеваниях опорно-двигательного аппарата, гепатобилиарной, периферической нервной систем. Особенности физико-химического состава грязи требуют дальнейших исследований по разработке частных методик пелоидотерапии при различных заболеваниях. Данная задача в настоящее время реализуется в рамках инновационного проекта «Разработка новых медицинских технологий на основе лечебной грязи месторождения бухты Мелководная острова Русский», поддержанного Фондом содействия развития малых предприятий в рамках Программы «Старт». Таблица 7 - Сравнительный физико-химический состав сульфидных иловых грязей Приморского края Общие свойства грязи Внешние признаки Влажность, %; Бухта Залив «Бухта Мелководная Угловой Экспедиции» Грязь иловая, Грязь иловая, Грязь иловая, т-серая, слегка серая, однородная, т-серая, окисленная, мягкопластичная, слегка однородная, очень слабый однородная, пластичная, сильный запах пластичная, запах сероводорода сероводорода запах сероводорода местами окисленная, до 64,67 59,95 54,39 Объемный вес, г/см3 1,25-1,75 1,42 1,41 Сопротивление сдвигу, 2282-9699 9710 4100 0,47-0,86 0,675 0,613 слабый норма - 25-75% дин/см ; норма - 1500-4000 2 Теплоемкость, кал/гград. 90 рН грязи; норма - 6-9 6,99-7,8 6,73 7,17-7,37 Еh грязи, mV +9,6 -109 -100 -109 45,9-64,67 59,95 54,66 0,09 2,08 0,22 4,59 0,53-4,36% 0,67 3,02% Карбонат кальция (CaCO3) 1,5-2,4% 0,32 2,22% Карбонат магния (MgCO3) 3,18-4,19% 0,73 3,48% 0,02-2,84 0,08 0,3 0,25-0,1 мм 0,0-5,8 0,38 3,4 0,1-0,05 мм 0,0 -37,5 0,78 0 0,05-0,01 мм 16,6-38,3 8,35 0 0,01-0,005 мм 16,0-37,0 5,55 0 0,005-0,001 мм 3,9-12,5 3,40 0,05 0,053-0,155 0,09 < 0,002 Жидкая фаза: на сырую грязь на сухое вещество вода, % растворенные соли, % Твердая фаза: А. Кристаллический скелет, в том числе: Гипс (CaSO4 x 2H2O) Глинистый остов, в т.ч. силикатных частиц диаметром: < 0,25 мм Сульфид железа (FeS), в том числе H2S 0,04 закисное железо Fe2+, % 0,1429-0,2251 / на сырую/сухую грязь 0,2493-0,7788 окисное железо Fe3+, % 0,0044-0,0118 / на сырую/сухую грязь 0,0086-0,0417 нет сведений нет сведений нет сведений нет сведений Продукты разрушения НCl, том числе SiO2 0,26-0,38 0,35 0,44 окись железа Fe2O3 0,26-1,48 1,76 1,82 окись алюминия Al2O3 0,38-0,76 2,43 1,24 Орган. в-во (потери при 8,87-13,73% 0,73 1,83 9887-14650 8910 10057,95 390-752 694 300,6 1301-1727 1083 1185,60 < 0,05 0,0051 < 0,05 < 0,05 0,0054 < 0,05 прокал.) Состав грязевого отжима: Катионы: мг/дм3 натрий+ калий (Na+ + +K+) кальций Ca 2+ магний Mg2+ закисное железо Fe 2+ окисное железо Fe3+ 91 Анионы : мг/дм3 хлор Clбром Br йод J - - сульфат SO42_ гидрокарбонат HCO3 - карбонат CO3рН Борная кислота Н2ВО3 16350-24850 15435 18460,0 40-60 53,2 55,00 < 0,05 Сл. < 0,05 2434-5965 3,51 1250,0 24-268 0,146 756,4 < 6,0 - < 6,0 7,0-7,4 6,9 7,2 3,93-12,24 45,3 20,93 30786-48,272 29890 32010 Cl 87-92 SO4 8-11 Cl 86 SO4 14 Cl 93 SO4 5 HCO3 2 ----------------------- --------------------- ------------------------ Na +K 73-75 Na +K 76 Mg17 Na +K 79 Mg 18 Mg 20-21 Ca 5-6 Са 7 Ca 3 (мг/дм ) 3 Минерализация (мг/дм3) Формула ионного состава Микрокомпоненты (мг/кг): 1.Медь 8-15,5 6,2 % 10,74 2. Цинк 46,7-87,6 25 73,04 3.Свинец 17,1-30,0 29 19,82 4.Кадмий 0,56-1,06 0,1 0,01 5.Кобальт 4,0-5,5 2,0035 4,66 6. Ртуть 0,042 нет сведений 0,042 7. марганец 36-61 100 139,85 1. Радий (Ra -226) 45,6 <7,0 8,9 2. Торий (Th -232) 18,1 12 13,43 не опр. 260 192,1-214,43 7,7 нет сведений Нет сведений 5. Стронций (Sr ) Менее 1,2 нет сведений 57,4 6. Суммарная Менее 0,67 нет сведений 111,7 Содержание радионуклидов Бк/кг 3. Калий (К-40) 4. Уран (U-238) 90 бета-активность альфа-активность Библиографический список 1. Иванов Е. М. Актуальные вопросы восстановительной медицины. – Владивосток : Изд-во ДВГАЭУ, 2001. - 204 с. 92 2. Иванов Е. М., Антонюк М. В. Механизмы физиологического и лечебного действия бальнеофакторов Физиотерапия и курортология / под ред. В.М. Боголюбова. Книга 1. - М. : БИНОМ, 2008. - С.60-69. 3. Природные лечебные факторы. Основы курортологии: Руководство / под ред. Е. М. Иванова, М. В. Антонюк. – Владивосток : Изд-во Дальневост. ун-та, 2007. – 316 с. 4. Шустов Л. П. Экстракты иловой сульфидной грязи и их лечебное применение. - Томск, 1996. - 182 с. 5. Ivanov E. M., Antonyuk M. V., Gvozdenko T. A., Chelnokova B. I., Slusarenko S. Yu. Perspective significance of treatment-and-prophylactic use of Melcovodnaya sulfide silt mud // Family health in the XXI century: material of XII International Scientific Conference. - Elat, Israil, 2008. - P. 300-3001. Н.Е. Спиченкова Глава 3. МОРСКАЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ СТАНЦИЯ ТИБОХ ДВО РАН (МЭС) – БАЗА ДЛЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ, НАУЧНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ПРОГРАММ. В начале 1964 года президент Академии наук СССР академик М. В. Келдыш подписал постановление о создании во Владивостоке Института биологически активных веществ ДВФ СО АН СССР (ИнБАВ), который в 1972 году был переименован в Тихоокеанский институт биоорганической химии (ТИБОХ). Расширение работ в Институте по заготовке и изучению морских организмов заставило ученых задуматься о создании экспериментальной станции на берегу моря. В декабре 1967г. академиком Михаил Алексеевич Лаврентьевым было подписано постановление о включении Морской экспериментальной станции, расположенной в бухте Троица Хасанского района, в состав Института биологически активных веществ. Станция явилась первой на Тихоокеанском побережье нашей страны базой для химико-биологических исследований. На станции впервые на Дальнем Востоке была создана академическая водолазная служба. В первые же годы на станции были выполнены работы по изучению липидного состава морских беспозвоночных, работы по изучению морской 93 травы Zostera marina привели к созданию препарата «Зостерин» - компонента целой серии лечебно-профилактических пищевых добавок. На технологическом участке МЭС из гепантопанкреаса камчатского краба выделен комплекс протеаз, на основе которых в ТИБОХ создано новое лекарственное средство – коллагеназа КК. На станции были начаты работы по исследованию хиноидных пигментов морских ежей. Дальнейшее изучение этих пигментов привело к созданию медицинских препаратов серии «Гистохром», которая используется при лечении заболеваний в области офтальмологии и кардиологии. Из мидии иммуностимулятор – Crenomytilus grayanus на станции был выделен митилан, обладающий также противовоспалительным и влагоудерживающим средством. Большую роль играет МЭС в воспитании и подготовке научных кадров. Ежегодно на станции проходит биологический и технологический практикум для студентов факультета Отделения биоорганической Дальневосточного химии и государственного биотехнологии университета; химического учебно-научные экспедиции; Всероссийская школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии; Английский лагерь по углубленному изучению языка для студентов, аспирантов и молодых ученых ДВГУ и ДВО РАН. Таким образом, МЭС сыграла важную роль в становлении и развитии Института, в обеспечении исследований морским биологическим сырьем. МЭС – первая в стране морская станция, где выполнялись довольно сложные эксперименты с применением химических, биохимических и физико-химических методов. За многие годы на МЭС был получен огромный объем экспериментального материала, лежащего в основе сотен публикаций и патентов ТИБОХ. Е.А. Богатыренко Глава 4. ПРОБИОТИКИ КАК ПЕРСПЕКТИВНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ Значительное сокращение морских биоресурсов за счёт активного промысла, браконьерства, а также ухудшения состояния естественных экосистем вследствие антропогенной деятельности привело в последнее время восстановления и сохранения природных богатств к необходимости посредством создания ферм и 94 заводов по искусственному выращиванию промысловых видов гидробионтов. Однако, как показывает опыт, при искусственном культивировании нередко приходится сталкиваться с проблемой снижения иммунитета у животных и их подверженности различным заболеваниям из-за качественных и количественных изменений в бактериальных популяциях организма, что связано с постоянно действующими факторами стресса (высокими нагрузками биомассы на единицу объёма, органическим загрязнением воды, перепадами концентрации кислорода). Применение антибиотиков не всегда является эффективным при лечении и может привести к формированию у гидробионтов дефицита целого ряда полезных микроорганизмов и значительному снижению естественных защитных систем организма. В настоящее время наиболее перспективным способом решения этих проблем является применение препаратов на основе пробиотиков, которые представляют собой живые организмы и (или) вещества микробного или иного происхождения, оказывающие благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма хозяина через оптимизацию его микробного статуса. Пробиотики нашли широкое применение как в медицинской практике для лечения и профилактики различных инфекционных заболеваний человека, так и в ветеринарии (Fuller, 1987). Использование же пробиотиков в марикультуре является сравнительно новым направлением в биотехнологии. Пробиотики могут использоваться в качестве основного (vanDuffel et al., 1998) и дополнительного питания для гидробионтов (Robertson et al., 2000), а также добавляться в воду для улучшения её качества (Moriarty, 1999; Ringo, Birkbeck, 1999). Пробиотики, применяемые при искусственном разведении промысловых видов, оказывают довольно разнообразное положительное воздействие на организм. Чаще всего это влияние проявляется в снижении смертности и увеличении скорости роста животных. Механизмы положительного воздействия пробиотиков до конца не изучены, но, согласно последним научным публикациям, пробиотики способны: - ингибировать рост потенциально вредных микроорганизмов в результате продукции антимикробных субстанций, конкуренции с ними за рецепторы адгезии и питательные вещества, а также активации иммунно-компетентных клеток и стимуляции иммунитета; - стимулировать рост представителей индигенной флоры в результате продукции витаминов и других ростостимулирующих факторов; - разрушать и перерабатывать органические вещества и токсичные соединения, улучшая тем самым качество воды; 95 - обеспечивать макроорганизм ферментами, позволяющими улучшать пищеварение животных (Verschuere et al., 2000). Во многих зарубежных странах в аквакультурных хозяйствах успешно используется широкий спектр пробиотических биопрепаратов. В России особую популярность приобрел препарат «Субалин», основу которого составляет штамм Bacillus subtilis 2335. Продукт успешно используется в прудовом рыбоводстве при выращивании карпа и растительноядных рыб, лососевых и осетровых видов рыб при индустриальном выращивании в садках, бассейновых и УЗВ хозяйствах (установках замкнутого цикла водообеспечения). Применение «Субалина» обеспечивает в товарном рыбоводстве не только высокие экономические показатели, но и качественную рыбоводную продукцию, способствуя быстрому увеличению массы тела рыб и снижению кормового коэффициента. В основном пробиотики предназначены для пресноводных и морских промысловых видов рыб, моллюсков и ракообразных. Целью нашей работы стал поиск потенциальных пробиотиков дальневосточного трепанга Apostychopus japonicus, который относится к важным объектам промысла в морях Дальнего Востока, издавна являясь традиционным экспортным пищевым продуктом. Поскольку одним из возможных способов положительного воздействия пробиотиков является синтез пищеварительных ферментов, то основной задачей проведенных нами исследований стало выявление среди микрофлоры трепангов, обитающих в естественных условиях, штаммов, способных к синтезу амилазы, хитиназы, хондроитинсульфатазы и альгинатлиазы. Указанные ферменты участвуют в переваривании таких трудноусваиваемых природных полимеров как крахмал, хитин, хондроитинсульфат и альгинат соответственно, которые в большом количестве поступают в пищеварительный тракт трепангов вместе с грунтом и останками различных морских животных и водорослей. Для проведения исследований по изучению свойств микрофлоры трепанга из прибрежной зоны острова Попова и из бухты Киевка Японского моря были отобраны взрослые особи голотурий, из кишечников которых выделили в общей сложности 67 штамма бактерий. Из них амилолитической активностью обладали 12% штаммов, альгинатлиазной – 7%, хондроитинсульфатазной и хитинолитической – по 6%. Из полученной коллекции штаммов только один Pseudomonas stutzeri проявил высокую активность в отношении всех четырех изученных ферментов. Также следует отметить высокую активность штамма Bacillus pumilus в расщеплении хондроитинсульфата и хитина, а штаммов Bacillus coagulans и Bacillus megaterium K13 96 - в отношении гидролиза крахмала и альгината натрия. Указанные штаммы являются наиболее предпочтительными при выборе потенциальных пробиотиков для искусственного выращивания голотурий. Таким образом, на данный момент нами получен ряд штаммов бактерий, способных к синтезу определённых пищеварительных ферментов, а именно ферментов, гидролизующих различные полисахариды. В дальнейшем предполагается проведение исследований по выявлению среди выделенной микрофлоры штаммов, продуцирующих липазу и протеазу. Следующими этапами работы по подбору пробиотиков для трепанга станут: 1. Изучение микроорганизмов, способности вызывающих полученных заболевания бактерий трепангов ингибировать и других рост морских беспозвоночных, за счёт продукции антибиотиков или конкуренции с ними за питательные вещества. 2. Определение с помощью лабораторных моделей способности потенциальных пробиотиков к колонизации в кишечнике трепанга. 3. Проведение испытаний на молоди трепанга со штаммами, обладающими высокой ферментативной активностью, а также способными ингибировать рост патогенных бактерий и колонизировать кишечник голотурии, для подтверждения лабораторных данных и выявления штаммов, обладающих пробиотическим in vivo эффектом. На основе результатов предстоящих исследований можно будет сделать вывод о том, какие из выделенных штаммов или какое их сочетание оказывают пробиотический эффект на организм трепанга, а также как именно применение данных микроорганизмов влияет на снижение смертности, активацию защитных функций и увеличение скорости роста голотурий. В настоящее время выделяют следующие категории пробиотиков: Монопробиотики - субстанции, содержащие представителей только одного вида микроорганизмов. Полипробиотики (ассоциированные пробиотики) - субстанции, представляющие собой ассоциацию штаммов нескольких видов микроорганизмов (от 2 до 30). Метаболические пробиотики – на основе компонентов микробной клетки и/или метаболитов. Синбиотики - комплексные препараты на основе живых микроорганизмов и пребиотиков - соединений различного состава и происхождения, поддерживающих рост индигенных микроорганизмов. 97 В зависимости от назначения пробиотиков их также различают: Гетеропробиотики - назначаются вне зависимости от видовой принадлежности хозяина, от которого первоначально были выделены штаммы пробиотических бактерий. Гомопробиотики - назначаются только представителям того вида организмов, из биоматериала которых были выделены соответствующие штаммы. Настоящая работа требует проведения определённого количества дополнительных исследований перед внедрением биопрепаратов в производство и использованием их в марикультуре, но, тем не менее, данное направление в биотехнологии имеет ряд преимуществ и является весьма перспективным. В настоящее время нами ведётся сотрудничество c Тренинг-инкубационным центром Дальневосточного института инновационных технологий и качества ДВГУ по привлечению инвесторов для реализации данной разработки. Проект «Пробиотики» был представлен на «ХII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии», которая проходила на Морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН. Кроме того, планируется участие в организованных компанией «Иннотех-Экспо» Международной выставке новых технологий и достижений "Инновации и технологии" и конкурсе «Идея года», основными задачами которых являются демонстрация наиболее перспективных инновационных решений, обеспечение государственной поддержкой и финансирование наиболее перспективных инновационных проектов. Помимо этого, ведутся переговоры со специалистами ФГУП «ТИНРО-центр» и Института биологии моря ДВО РАН по проведению совместных испытаний биопрепаратов на живых объектах. Стоит отметить, что исследования по созданию препаратов на основе пробиотиков для разведения дальневосточного трепанга проводится в нашей стране впервые, поэтому получение положительных результатов могло бы значительно поспособствовать развитию марикультуры в Приморском крае. Библиографический список 1. vanDuffel H., Dhert P., Swings J., Sorgeloos P. Use of potential probiotic Lactococcus lactis AR21 strain for the enhancement of growth in the rotifer Branchionus plicatilis // Aquaculture research. − 1998. − Vol. 29. − P. 411-417. 98 2. Fuller R. A review, probiotics in man and animals // J. of Applied Bacteriology. − 1987. − Vol. 66. − P. 365-378. 3. Moriarty D. J. W. Diseases control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. In: Microbial Biosystems: New Frontiers. Proceedings of the 8th International symposium on microbial ecology. - Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Halifax, Canada, 1999. 4. Ringo E., Birkbeck T. H. Intestinal microflora of fish larvae and fry // Aquaculture research. − 1999. − Vol. 30. − P. 73-93. 5. Robertson P., O’Dowd C., Burrels C., Williams P., Austin B. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon Salmo salar L. and rainbow trout Oncorhynchys mykiss Walbaum // Aquaculture. − 2000. − Vol. 185. − P. 235-243. 6. Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture // Microbiology and Molecular Biology Reviews. − 2000. − Vol. 64 (4). − P. 655-671. А.А. Коротких, И.Э. Памирский, М.А. Штарберг, Е.А. Бородин Глава 5. СОЗДАНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА В статье представлены завершенные, текущие задачи научного проекта по исследованию соевого ингибитора трипсина. Результаты, полученные на сегодняшний день, указывают на перспективность использования в клинике данного белка в качестве регулятора протеолиза. Организм человека содержит более пятисот протеаз (Puente et al., 2004). Типичными представителями протеаз являются трипсин, калликреин, тромбин, плазмин, урокиназа, пепсин. С участием протеаз осуществляется гидролиз пептидных связей белковых субстратов – протеолиз. Регуляция действия протеаз происходит под действием белков-ингибиторов. К таким ингибиторам в организме человека относятся α1-антитрипсин, α2-макроглобулин, С1-ингибитор. Протеазы и их ингибиторы образуют протеазно-ингибиторные системы, лежащие в основе функционирования важнейших физиологических процессов (свертывание крови, фибринолиз, активация системы комплемента, ангиогенез, пищеварение и др.). При патологии протеазно-ингибиторный 99 баланс значительно смещается в сторону протеаз. Чрезмерная активация протеолиза представляет один из наиболее общих молекулярных механизмов повреждения тканей в условиях патологии, в частности, является важнейшим биохимическим механизмом развития фундаментального патологического процесса – воспаления (Lindstedt et al., 2004). Воспаление, протекающее с массовым выделением протеаз, сопутствует таким многим заболеваниям, таким как язвы, альвеолиты, эмфизема, аневризмы, артриты и другим (Lancaster et al., 2005; Akbasheva, 2007; Santos et al., 2007; Nichols et al., 2008). С помощью протеолиза патогенные простейшие разрушают клетки, в которых паразитируют (Rementeria et al., 2005). Сегодня протеазы рассматривают как один из факторов канцерогенеза (Bashir T. et al., 2003; Doherty F.J. et al., 2003; Søreide, 2008). Поэтому регулирование протеолиза в условиях патологии является актуальной проблемой в медицины. В клинике среди фармацевтических препаратов – ингибиторов протеолитических ферментов наиболее востребован апротинин – поливалентный ингибитор протеаз, получаемый из органов крупного рогатого скота (легкие, поджелудочная железа). Апротинин является полипептидом, состоящим из 58 остатков аминокислотных остатков. Препараты апротинина выпускаются рядом зарубежных фирм под различными торговыми названиями («Контрикал», «Трасилол», «Гордокс») и используются в клинике при профилактике и лечении острого панкреатита, панкреонекроза, кровотечений, сопряженных с гиперфибринолизом, шока и жировой эмболии. Как фармацевтический препарат апротинин обладает рядом существенных недостатков: возможность анафилактического шока; развития вероятность аллергических осложнений одновременного внесения вплоть в до организм инфекционного начала, характерная для всех белковых препаратов, выделяемых из тканей животных; высокая цена, обусловленная технологией его производства. Поэтому представляет интерес разработка аналогов апротинина, лишенных указанных недостатков. Один из подходов к решению этой задачи состоит в исследовании возможности использования для регуляции протеолиза ингибиторов протеаз растительного происхождения, в частности, ингибиторов трипсина из бобов сои. В последних в большом количестве (до 10% от всех белков) содержатся ингибиторы трипсина двух типов – Кюнитца и Боумана-Бирка (Моссе и соавт., 1986; Csáky et al., 2004). В настоящее время интенсивно исследуются антиканцерогенные свойства соевого ингибитора трипсина типа Боумана-Бирка и рассматривают этот белок в качестве универсального антиканцерогенного средства. В США проводятся его клинические испытания в качестве противоракового лекарственного препарата 100 (Kennedy, 1998, Losso, 2008). В свете вышеизложенного представляется актуальным выявление возможности использования соевого ингибитора трипсина типа Кюнитца (далее СИТ) в качестве фармацевтического регулятора протеолиза. Нами запланирован научный проект, целью которого является исследовать возможность использования СИТ как фармацевтического регулятора протеолиза в организме человека. На данном этапе достигнуты следующие задачи: 1. Определена трипсин-ингибиторная активность апротинина и соевого ингибитора трипсина in vitro. 2. Изучено влияние апротинина и СИТ на свертывание крови (протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время и тромбиновое время) in vitro. 3. Определено влияние апротинина и СИТ на фибринолиз (время фибринолиза) in vitro. 4. Определено влияние апротинина и СИТ на агрегацию тромбоцитов (скорость и степень агрегации) in vitro. 5. Проведен первый этап исследования влияние апротинина и СИТ на функциональное состояние системы комплемента (гемолитическая активность комплемента) in vitro. 6. Изучено влияние приема изолята соевого белка, содержащего СИТ, на общую протеолитическую и трипсин-ингибиторную активности в сыворотке крови людей. 7. Методами биоинформатики установлена степень структурной гомологии апротинина и СИТ. 8. Предпринята попытка выявления спектра биологической активности апротинина и СИТ, а также поиска потенциальных молекул-мишеней данных ингибиторов из числа протеаз организма человека поиска компьютерными методами. Библиографический список 1. Puente X. S., Lopez-Otin C. A. Genomic Analysis of Rat Proteases and Protease Inhibitors // Genome Res. - 2004. - Vol. 14. - P. 609-622. 2. Lindstedt K. A., Leskinen M. J., Kovanen P. T. Proteolysis of the Pericellular Matrix. A Novel Element Determining Cell Survival and Death in the Pathogenesis of Plaque Erosion and Rupture // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. - 2004. - Vol. 24. - P. 1350-1358. 101 3. Lancaster L. H., Christman J. W., Blackwell T. R., Koay M. A., Blackwell T. S. Suppression of lung inflammation in rats by prevention of NF-kappaB activation in the liver // Inflammation. - 2001. - Vol. 25, № 1. - P. 25-31. 4. Akbasheva O. E., Parameters of plasma blood proteolysis and phenotypes of alpha1-proteinase inhibitor in children with duodenal ulcer // Biomed. Khim. - 2007. - V. 53, № 3. - P. 338-344. 5. Santos M. M., Moreira R. Michael acceptors as cysteine protease inhibitors // Mini Rev. Med. Chem. - 2007. - V. 7, № 10. - P. 1040-1050. 6. Nichols L., Lagana S., Parwani A. Coronary artery aneurysm: a review and hypothesis regarding etiology // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2008. - Vol. 132, № 5. - P. 823828. 7. Rementeria A., López-Molina N., Ludwig A., Vivanco A. B., Bikandi J., Pontón J., Garaizar J. Genes and molecules involved in Aspergillus fumigatus virulence // Rev. Iberoam. Micol. - 2005. - Vol. 22, № 1. - Р. 1-23. 8. Bashir T., Pagano M. Aberrant ubiquitin-mediated proteolysis of cell cycle regulatory proteins and oncogenesis // Adv. Cancer. Res. - 2003. - Vol. 88. - P. 101-144. 9. Doherty F. J., Dawson S., Mayer R. J. The ubiquitin-proteasome pathway of intracellular proteolysis // J. Essays Biochem. - 2003. - Vol. 38. - P. 51-63. 10. Søreide K. Proteinase-activated receptor 2 (PAR-2) in gastrointestinal and pancreatic pathophysiology, inflammation and neoplasia // Scand. J. Gastroenterol. - 2008. Vol. 43, № 8. -P. 902-909. 11. Моссе Д., Пернолле Д. Химия и биохимия бобовых. – Москва : Агропромиздат, 1986. - 248 с. 12. Csáky I., Fekete S. Soybean: feed quality and safety. Part 1: biologically active components. A review // Acta. Vet. Hung. - 2004. – Vol. 52, № 3. - P. 299-313. 13. Kennedy A. R. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as anticarcinogenic agent // Am. J. Clin. Nutr. - 1998. - Vol. 68, № 6. - P. 1406-1412. 14. Losso J.N. The biochemical and functional food properties of the bowman-birk inhibitor // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2008. - Vol. 48, № 1. - P. 94-118. 102 М.Л. Сидоренко Глава 6. ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЛИСТВЕННИЧНОЙ ГУБКИ В КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В настоящее время в отечественной и мировой науке наблюдается повышенный интерес к изучению грибов. Это связано, прежде всего, с кардинальным пересмотром значимости и уникальности экологических функций, контролируемых грибами в природных экосистемах. Во-вторых, грибы были и остаются одним из основных и перспективных объектов биотехнологии. Особое внимание привлекает ксилотрофный базидиомицет Fomitopsis officinalis (Vill.: Fr.) Bond. et Sing., известный как трутовик лекарственный или лиственничная губка. Этот вид характеризуется многими интересными с научной точки зрения особенностями, изучение которых очень важно для понимания эволюции микобиоты Евразии в третичном и четвертичном периодах. Лиственничная губка на протяжении нескольких тысячелетий является объектом заготовок в качестве лекарственного сырья в народной и официальной медицине. В настоящее время естественные ресурсы этого вида истощены и как редкий исчезающий вид он внесен во многие региональные Красные книги. Это единственный вид трутовых грибов, который планируется включить и в Красную книгу России. Поэтому данная работа направлена на решение не только одной из приоритетных задач, стоящих перед отечественной наукой “Химический и биологический синтез лекарственных средств и пищевых продуктов” (Постановление Правительства РФ N 2727/п-П8 от 21 июля 1996 г.), - но и на решение фундаментальных вопросов сохранения биологического разнообразия путем разработки ресурсосберегающих технологий. Лиственничная губка паразитирует, вызывая бурую гниль древесины, на стволах лиственниц, реже на кедрах, пихтах и соснах. Ареал ее совпадает с таковым лиственниц, то есть занимает всю лесную зону Сибири и доходит через Урал до Онежского озера. Используются плодовые тела гриба, собираемые весной и в первой половине лета. Плодовое тело гриба содержит агарициновую и эбуриколовую кислоты, d-глюкозамин; фумаровую, рициноловую, лимонную и яблочную, органические кислоты; 30% смол (с возрастом содержание смол увеличивается); жирное масло, фитостерин, глюкозу и маннит. В медицинской практике препараты из лиственничной губки применяются как слабительное и кровоостанавливающее средство и для 103 уменьшения изнурительного потоотделения у туберкулезных больных. Агарицин в небольших дозах при приеме внутрь вызывает снотворное и успокаивающее действие. Клинические испытания трутовика, проведенные в Японии, позволили выделить полисахарид "ланофил", который заставляет "ленивую" печень выделять нужные ферменты для расщепления глюкозы и жиров в организме, то есть, другими словами, восстанавливать нарушенный обмен веществ. Помимо этого лиственничная губка содержит смолистые вещества, которые губят патогенную микрофлору бронхолегочных путей. Трутовиком в России лечили туберкулез, пневмонии, бронхиты, рак легких и бронхов в любой стадии. В основном о целебных свойствах трутовика известно из прописей Диоскорида, древнегреческого врача. В России он тоже был известен и вплоть до прошлого века считался традиционным лекарством против туберкулеза и даже служил для России прибыльным товаром. Только в 1870 году Россия экспортировала в Европу 8 тонн сушеного трутовика. Трутовик, по описаниям русских знахарей и врачевателей Востока, применяют при следующих заболеваниях: инфекционные (грипп, вирусные заболевания, туберкулез), опухолевые (доброкачественные и злокачественные опухоли), заболевания почек и поджелудочной железы, желудочно-кишечные заболевания. Применяется как присыпка при гнойных ранах и язвах. В последнее время этот гриб начали изучать в качестве продуцента биологически активных веществ. Из плодового тела F. officinalis выделены каратиноиды, стерины, ненасыщенные жирные кислоты агарициновая кислота, биофлаваноиды, витамины группы В, Р, Е, А. Установлена антибиотическая активность плодового тела и мицелиальной культуры гриба в отношении некоторых патогенных бактерий. Наряду с этим лиственничная губка остается пока еще недостаточно изученным и новым для биологии и медицины видом. Скорость роста исследованного нами мицелия лиственничной губки на различных натуральных, комплексных и синтетических агаризованных средах относительно не велика (средняя суточная скорость линейного роста составляет 2 - 4 мм), поэтому для получения иннокулюма требуется 12-14 дней, а посевного мицелия на зерне ячменя около 20 дней. Однако эта величина не является сама по себе постоянной. Она изменяется и при этом не равномерно, в зависимости от возраста культуры и состава среды. Мицелий гриба характеризуется увеличением среднесуточной скорости роста в течение первой недели и далее. С использованием подобранных нами условий получения жидкого иннокулюма (состава и рН сред, температура инкубации, аэрация, 104 освещение, скорость перемешивания) сроки получения посевного мицелия первой генерации могут быть сокращены до 10-12 суток. Для получения целостной картины культурально-морфологических особенностей исследуемого штамма в зависимости от источников питания на плотных средах была изучена морфология колоний. Обнаружено, что колонии лиственничной губки на разных агаризованных средах были морфологически различны. Так, при культивировании на сусло-агаре образуется ватная колония, воздушный мицелий высокий. Цвет белый, центр и края прижаты, колония округлая, внешняя линия ровная. При описании мицелия под световым микроскопом наблюдали длинные, спутанные мицелиальные гифы. Отдельные гифы переплетены во всех направлениях. На 35 – 40 сутки колония приобретает желтоватый оттенок. При культивировании на глюкозопептонной среде края колонии прижаты, центр приподнят. Гифы длинные, спутанные, от центра отходят радиально, покрыты пушком. Колония просвечивается Также, нами были проведены исследования глубинного культивирования в колбах на качалках, в результате которых установлено, что на богатых натуральных средах, содержащих соевую, пшеничную или кукурузную муку, молочную сыворотку мицелиальный рост гриба очень слабый или не наблюдается вообще. В тоже время на синтетических средах с добавкой пивного сусла урожай биомассы достигает 7,1 г/л за 14 суток, что является своеобразным рекордом для лиственничной губки. Одним из наиболее важных компонентов плодовых тел трутовика лекарственного является агарициновая кислота. Последние исследования зарубежных авторов доказывают, что агарициновая кислота является соединением, которое индуцирует проницаемость ионов кальция в митохондрии путем связывания с адениннуклеотидтранслоказой, т.е. может использоваться при раковых новообразованиях. Проведенный сравнительный анализ ИК-спектроскопии образца мицелия лиственничной губки и стандартного образца агарициновой кислоты показал идентичность спекров опытного и стандартного образцов. Следовательно, мицелий ЛГ может быть использован для получения биологически активного соединения агарициновой кислоты. В настоящее время очень остро стоит вопрос поиска новых природных антибиотиков. Одним из направлений такого поиска новых является изучение видов, ранее не рассматривавшихся как возможные продуценты антибиотиков. Различные экологические и систематические группы высших Basidiomycetes отличаются характером антибиотического спектра. Образование антибиотиков более присуще дереворазрушающим базидиомицетам. Среди них свойство образовывать антибиотики 105 в большей мере характерно для возбудителей бурой гнили древесины, к которым и относится лиственничная губка. В результате исследований была установлена антибактериальная активность поверхностного мицелия в отношении Yersinia pseudotuberculosis. Во всех вариантах наблюдаются зоны лизиса, в пределах 12 – 24 см. Полученные результаты сравнимы с действием общепринятых противомикробных препаратов, а в некоторых случаях превышают действие таковых. Таким образом, культивирование лиственничной губки возможно и необходимо развивать. Важными аргументами в пользу дальнейшей оптимизации технологии культивирования лиственничной губки и включения его в число новых перспективных объектов отечественного грибоводства является не только убедительные данные, касающиеся его лекарственных свойств, но и возможное исчезновение его в природе. Е.А. Остапенко Глава 7. ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ ОБРАСТАНИЯ ПРИЧАЛЬНЫХ СООРУЖЕНИЙ БУХТЫ ПАРИС В Приморском крае начал реализацию проект строительства океанариума на острове Русском. Согласно этому проекту, забор воды будет вестись в бухте Парис. С целью оценки экологических особенностей акватории, Институт биологии моря ДВО РАН проводит крупномасштабный мониторинг состояния бухты для оценки качества воды. Одним из важнейших звеньев мониторинговых исследований является оценка состояния микробных сообществ и их характеристика. Информативным звеном в оценке состояния микрофлоры бухты может являться анализ микробоценозов обрастания причальных сооружений. Готовили смывы с поверхностей микроорганизмов – обрастателей в стерильном 0,85% растворе NaCl; пользовались методом предельных разведений – посев осуществляли из серии десятикратных разведений в трёх повторностях; также пользовались чашечным методом Коха – принцип состоит в получении чистой культуры из отдельной колонии. На поверхность среды вносят каплю разведения и стерильным шпателем распределяют по поверхности агара. Для учёта численности микроорганизмов использовали следующие среды: Для определения численности гетеротрофных бактерий 106 Для определения численности олиготрофов Среда для учета бактерий – липолитиков Среда для учета бактерий – протеолитиков Среда для учета бактерий – амилолитиков Среды для учета бактерий, устойчивых к нефтеуглеводородам или способных к их трансформации дифференциально-диагностическая среда Эндо энтерококкагар Среда для оценки металлоустойчивости В северной части бухты Парис отмечена самая высокая численность гетеротрофных сапрофитных бактерий, обладающих гидролитическими свойствами, а так же эта часть акватории характеризуется высоким свежим фекальным загрязнением и загрязнением нефтеуглеводородами. Численность культивируемых гетеротрофов в сообществах бактерий, ассоциированных с организмами - обрастателями причальных сооружений в бухте Парис, варьировала в диапазоне 2,8·103-1,1·105 КОЕ на 1 см2. Отмечено, что наибольшее количество гетеротрофных бактерий на всех станциях обнаруживалось именно в приповерхностном слое обрастаний причальных сооружений, что соответствовало 104-105 КОЕ на 1 см2. Этот факт может быть обусловлен тем, что концентрация растворенных и взвешенных веществ в поверхностном слое воды обычно может быть в несколько раз выше, чем в нижележащих горизонтах водной толщи, что, и определяет более интенсивное развитие гетеротрофной микрофлоры. В целом можно отметить, что не было резких колебаний численности гетеротрофных бактерий по станциям проведения мониторинга. Количество их в микробных ассоциациях с обрастателями соответствовало уровню, характерному для мезотрофных вод. В южной части наблюдается хроническое фекальное загрязнение. Наибольшая численность бактерий группы кишечной палочки обнаружена в южной части бухты, где она изменялась по глубине в диапазоне 3·10 36·103 КОЕ БГКП/см2, что может указывать на более интенсивное поступление стоков в этой части. Кроме того, здесь, а также в восточной части выявлено присутствие фекальных стрептококков (энтерококков), являющихся индикаторами поступления свежего фекального загрязнения. Их количество установлено на уровне 10 КОЕ/см2 обрастаний. По сравнению с другими частями бухты, западная часть оказалась наиболее чистой. Несмотря на достаточно высокую численность КОЕ БГКП в западной части бухты, фекальные стрептококки в образцах в этой части не обнаруживались, что указывает на отсутствие поступления свежего загрязнения в этом районе, а 107 соответственно, на отсутствие антропогенной нагрузки. В коллекцию выделено 147 штаммов микроорганизмов с выраженными ферментативными свойствами. В сообществах эколого-трофических групп микроорганизмов преобладают псевдомонады и микроорганизмы с выраженными амилолитическими свойствами. Для выявления псевдомонад и энтеробактерий провели тест на оксидазу и каталазу. Большую часть коллекции составляют псевдомонады. Таблица 8 Оксидаза + Оксидаза – Каталаза + Каталаза + Доля штаммов 31% 16% В коллекции большую долю составляют микроорганизмы, обладающие выраженными амилолитическими свойствами. Рассматривая коллекционные штаммы по гидролитическим свойствам, можно сказать о том, что среди них большую часть составляют бактерии амилолитики, т.е. они синтезируют и выделяют в среду фермент – амилазу, который гидролизует крахмал. Таблица 9 № Ферменты % штаммов 1 Лецитиназа 35,4 2 Амилаза 54,4 3 Казеиназа 53,1 108 ___________________________________________________________________________ Раздел III УПРАВЛЕНИЕ ПРОДВИЖЕНИЕМ БИОТЕХНОЛОГИЙ ___________________________________________________________________________ Н.В. Воеводина Глава 1. ИННОВАЦИИ: ОТ НАУКИ К ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОМУ РЕСУРСУ Правительство Российской Федерации, начиная с 2004 года, достаточно активно занимается созданием институтов инновационного развития. Сейчас, по прошествии нескольких лет, принято считать, что «нулевая точка», с которой Россия может осуществить инновационный рывок, обозначена чётко. Однако экономике РФ сегодня свойственная фрагментарность инновационной активности и низкая мотивация к технологичному предпринимательству. Инновационная деятельность концентрируется вокруг формирования и использования интеллектуального ресурса. Интеллектуальный ресурс как форма движения капитала, обращается под воздействием определенных факторов, исследование которых – наша цель. Основной признак инновации – она должна быть внедрена. Основные признаки, по которым экономический субъект относят к инновационному типу - расходы на НИОКР, эффективность затрат на НИОКР, доля инновационной продукции в общем выпуске, доля научно-технического персонала. В свою очередь, сферу высоких технологий характеризуют - соотношение приобретаемых и продаваемых технологий, а также коэффициент коммерциализации интеллектуальной собственности. Начальным этапом инновационной деятельности является трансформация знания в интеллектуальную собственность. Трансформация знания в интеллектуальную собственность происходит в инкубаторах и технопарках. В инкубаторах развиваются финансы инновационных проектов, в технопарках развиваются финансы технологичных предприятий. На этих этапах интеллектуальная собственность формируется в процессе инвентаризации результатов научно-технической деятельности (РНТД) и идентификация субъектов прав на РНТД. 109 На начальных этапах инновационной деятельности закладываются основы стабильности и непрерывности внедрения изобретений, а именно, адаптация друг к другу бизнеса и науки, интересов бизнеса и науки в производстве. Для выявления причин, способствующих развитию инноваций, необходимо две составляющие научная деятельность и промышленное производство. Таким образом, функциями инноваций являются внедрение и технологичность. К функциям государственных инноваций можно отнести планирование. В ходе планирования определяются приоритетные направления приоритетных направлений науки. Логично предположить, что определение позволяют прогнозировать появление инновационной активности. Таким образом, государство создает условия для развития инновационной активности во всех видах хозяйственной деятельности. Однако технологичный бизнес формирует финансы, дающие краткосрочный результат. Краткосрочность инвестиционных проектов не создает условий для развития высокотехнологичного производства. В этой среде малый бизнес весьма ограничен ресурсами, и становится технологичным только при государственной поддержке или совместной деятельности с вузом. Тогда, развитие инноваций должно иметь в потенциале малое предпринимательство. Однако для этого государственные финансы РФ должны стимулировать долгосрочные инвестиции. Бюджетная политика 2008-2009гг. впервые содержала выводы о том, что распределение и контроль государственных финансов на уровне субъектов федерации крайне не эффективен, что затрудняет достижение показателей инновационной активности. Таким образом, непрерывность этапов факторами инноваций технико-внедренческих являются преемственность мероприятий. и Инструментами инноваций становятся: • Методичность продвижения; • Соответствие товаров и процессов техническому стандарту; • Идентификация субъектов прав на РНТД; • Зарплата. Все вышеописанное больше относится к абстрактному знанию. В действительности, инновационная активность в РФ фрагментарна и экономически немотивированна. Выставочно-конкурсная деятельность, прижившаяся в России за последнее десятилетие, не только смешает технико-внедренческую деятельность в сферу рекламы, но и начинает претендовать на своеобразный инвестиционный институт. Однако управление финансами, механизмы инвестирования и обращение 110 интеллектуальной собственности не сопрягаются с планами организаторов инновационных выставок. Если это так, то инвестор не имеет информации о существе процессов инвестирования, которые формируют отношения между наукой и бизнесом. Другими словами, представленный выше инструментарий инноваций не имеет отношения к популяризации изобретений посредством выставочно-конкурсной деятельности. Н.Н. Ханчук Глава 2. НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ СУЩНОСТНЫХ КАТЕГОРИЙ В ТЕОРИИ ИННОВАЦИЙ В ХХI веке стали все более очевидными тенденции смены ценностных приоритетов, обеспечивающих общественное развитие. Цивилизационный сдвиг, совпавший с переходом человечества в ХХI век, вызвал к жизни не только изменение условий и соответствующих им способов организации человеческой деятельности, но и понимание того, за счет каких источников возможно создание национального богатства и достижение национального благополучия. “Национальное процветание не наследуется – оно создается. Национальное процветание не вырастает просто из природных ресурсов, имеющейся рабочей силы, процентных ставок или покупательной силы национальной валюты… Конкурентоспособность конкретной нации зависит от способности ее промышленности вводить новшества и модернизироваться”2. На современном этапе одним из важнейших системных факторов экономического роста, повышения конкурентоспособности отечественной продукции, обеспечения экономической безопасности государства становится инновационная деятельность. Только на основе использования достижений научно-технического прогресса, разработки и внедрения высоких технологий возможно преодоление топливно-сырьевой направленности экономики России. Масштаб инновационной деятельности определяет уровень национального экономического развития, влияет на конкурентоспособность национального бизнеса на мировой арене. Научная литература оперирует разнообразными определениями таких сущностных категорий как: инновация, новшество, инновационная деятельность, 2 Портер М.Э. Конкуренция/М.Э. Портер: Пер. с англ. - М. : Издательский дом «Вильямс», 2002. - С. 162. 111 инновационный процесс, инновационная политика и т.д. Несмотря на определенное сходство в трактовке определений, единое понимание отсутствует, что в ряде случаев приводит к снижению результативности развития как отдельных хозяйствующих субъектов, так и всей макроэкономической системы. Даже беглый контент - анализ работ по инновационной проблематике показывает, что наиболее распространенным понятием является понятие “инновации”. Его определению посвящено огромное количество работ отечественных и зарубежных ученых, которые представляют собой достаточно пеструю исследовательскую палитру. Но, тем не менее, как справедливо отметил на II окружной инновационной конференции в Екатеринбурге в 2002 г. А.И. Татаркин, “… вопрос о том, что же такое инновация, по-прежнему нуждается в теоретико-методологической проработке”3. Как отмечают некоторые исследователи, первоначально (в сравнении с другими терминами - “новшество”, “нововведение”) появился термин “инновация”, который достаточно плотно вошел в “разговорное пространство” еще в XIII веке, обозначая при этом “придумывание чего-нибудь нового, опережающего свое время”4. В научной литературе отмечается, что впервые термин “инновация” был зафиксирован во французском языке в 1297 г. Французское innovation восходит к латинскому innovation (обновление, перемена). В английском языке - в 1553 г. как определение нового в языке и праве, т.е. в чисто социально-культурных сферах деятельности5. Интересны наблюдения профессора МГУ им. М.В. Ломоносова И. Милославского6. Он отмечает, что еще в 80-е годы прошлого века абстрактного слова инновация не было в словарях русского литературного языка. В “Толковом словаре иноязычных слов” Л. Крысина (2006г.) инновация толкуется как нововведение, новшество. Под словом нововведение словарь Ожегова-Шведовой понимает “новое правило, вновь установленный порядок”, а под новшеством – “новое явление, новый обычай, новый метод, изобретение”. Итак, английское innovation уже имеет три значения – инновация, нововведение, новшество. Два последних имеют существенное смысловое различие, Татаркин А.И. Теоретические основы и приоритеты формирования государственной инновационной политики [Электронный ресурс] / А.И. Татаркин. – Электрон. дан. – Режим доступа: //http://www.invur.ru/index.php?page=inconf&cat=inconf2&scat=plenar&doc=osn_gosinn С.1. - Дата обращения 09.09.2003. 4 Карпова Ю.А. Инновации, интеллект, образование / Ю.А. Карпова. – М. : 1998. - С. 15. 5 Николаев А.И., Лисин Б.К. Инновационная культура как культура перемен / А.И. Николаев, Б.К. Лисин. //Инновации.- 2002. - № 2-3. - С. 85-87. 6 Милославский И. Новизна с последствиями / И. Милославский // Известия. - 2009. - № 99. - С. 4. 3 112 поскольку новшество (новация) является результатом нововведения. Получается, что под одним термином можно понимать и динамический процесс создания новшеств, и конечный результат этого процесса – само новшество в виде определенного продукта7. Не станем вдаваться вслед за профессором И.Милославским в поиск ответа на вопрос: не является ли инновация одним из ненужных заимствований, дублирующих уже имеющиеся в русском языке собственные слова? Важным представляется сделанный им вывод о том, что слово инновация обозначает такое новшество и/или нововведение, которое, во-первых, делает систему существенно более эффективной, и, во-вторых, как следствие, имеет положительную оценку. Поэтому, считает И.Милославский, встречая в текстах слово инновация, следует понимать, что за ним стоит весьма радикальное улучшение чего-либо. Отмечая те или иные новшества и/или нововведения, следует считать только тогда, когда они серьезно повысили производительность труда, значительно облегчили или ускорили процесс обучения, многим вернули здоровье и работоспособность и т.д. Иными словами, в результате существенно улучшили качество жизни человека. Понятие “инновация” постоянно эволюционирует и имеет привязку ко времени возникновения. Первоисточники определяют понятие “инновация” прежде всего как экономическую, социальную, личностную, инструментально-технологическую категории. Рассмотрение “инновации” как экономической категории впервые было предложено великим австрийским экономистом Йозефом Шумпетером, и является наиболее полным и точно отражающим его смысл 8. Он определил инновацию как “претворение в жизнь новой комбинации производственных факторов, которая позволяет удовлетворить новые потребности”. Инновация, по Шумпетеру, является одним из главных двигателей, генераторов прибыли: “прибыль, по существу, является результатом выполнения новых комбинаций”, “без развития нет прибыли, без прибыли нет развития”9. Концепция Й. Шумпетера включает пять основных вариантов инноваций: - создание нового товара, с которым потребители ещё не знакомы, или нового качества товара; Бендиков М.А., Фролов И.Э. Высокотехнологичный сектор промышленности России: состояние, тенденции, механизмы инновационного развития / М.А. Бендиков, И.Э. Фролов; Центр. экон.-мат. ин-т РАН. – М. : Наука, 2007. - С.96. 8 Шумпетер Й. Теория экономического развития / Й. Шумпетер. - М. : Прогресс, 1983. - С. 6. 9 Шумпетер Й. Теория экономического развития / Й. Шумпетер. - М. : Прогресс, 1983. - С. 125. 7 113 - внедрение нового, ранее не испытанного в данной отрасли промышленности, метода производства, который совершенно не обязательно основан на новом научном открытии и может состоять в новой форме коммерческого обращения товара; - открытие нового рынка сбыта, т.е. рынка, на котором данная отрасль промышленности этой страны ещё не представлены, независимо от того, существовал ли этот рынок ранее или нет; - получение нового источника сырья или полуфабрикатов, независимо от того, существовал ли этот ранее или его пришлось создать заново; - создание новой организации отрасли, например, достижение монополии или ликвидация монопольной позиции. Эти положения, сформулированные Й.Шумпетером еще в начале XX в., до настоящего времени считаются наиболее полной классификацией инноваций, т.к. все существующие варианты представляют собой лишь частные случаи шумпетерианской теории. В настоящее время в соответствии с Международными стандартами науки, техники и инноваций, установленных Руководством Осло, “инновация” - конечный результат инновационной деятельности, получивший воплощения в виде нового или усовершенствованного технологического процесса, используемого в практической деятельности, либо в новом подходе к социальным услугам10. В российской практике (см. “Концепция инновационной политики Российской Федерации на 2002-2005 годы”) “инновация – это конечный результат инновационной деятельности, получивший реализацию в виде нового или усовершенствованного продукта, реализуемого на рынке, нового или усовершенствованного процесса, используемого в практической деятельности”11. Таким образом, инновации рассматриваются и как событие, возникшее в мире бизнеса чего-то нового, и как процесс, при котором одно новшество вызывает другое. Изменение в технологии приводит к появлению нового продукта, который при эффективном использовании, требует изменения в организации бизнес-процессов. В конечном счете, новые продукты могут привести к формированию новых отраслей и рынков и их развитию. Представляет интерес проблема генезиса инноваций. Анализ и систематизация теоретических подходов к причинам возникновения инноваций позволяют объединить 10 OSLO Manual: Proposed Guidelines For Collecting And Interpreting Technological Innovation Data. P. : OECD, 2002. - Р. 2. 11 Концепция государственной инновационной политики Российской Федерации на 2002-2005 годы // Инновации. – 2002. - № 4. - С. 3-10. 114 всю их совокупность в четыре группы: 1) развитие науки и изобретательство; 2) колебания экономического цикла; 3) растущие потребности рынка; 4) конкуренция. Совокупность классификационных признаков инноваций (направленность результата и сфера приложения, характер удовлетворяемых потребностей, причины возникновения инноваций, новизна для рынка, по месту на предприятии – на входе, выходе, системные, уровень разработки, степень значимости в экономическом развитии, функциональное назначение и область применения, частота применения, ресурсосбережение) является многообразной в силу многообразия инновационных процессов. Следовательно, формы их организации, масштабы и способы воздействия на инновационную деятельность также отличаются многообразием. Иными словами, классификация инноваций позволяет: осуществлять “привязку” к тому или иному типу инноваций с целью их реализации в ходе практической инновационной деятельности; разрабатывать эффективную рыночную стратегию, направленную на реализацию нововведений; создавать экономические механизмы и организационные формы управления инновациями и инновационной деятельностью в зависимости от типа инноваций; определять методы, формы и способы реализации и продвижения инновационного продукта и инновационных технологий в зависимости от различных типов инноваций; оптимизировать организационные формы инновационной деятельности и инновационной инфраструктуры, экономические отношения в инновационной сфере и управление активизацией инновационными процессами в регионе и отраслях. Обзор экономической литературы по инновационной проблематике показывает отсутствие единства взглядов ученых на сущность понятия “инновация”, что неизбежно сказывается на разработке инновационной теории. За общим термином скрывается целый спектр нововведений, различающихся источниками, масштабностью, природой результата и другими характеристиками, но при этом, главной целью инноваций всегда выступает социально - экономический эффект, достигаемый в результате инновационной деятельности. Значимость инновационной деятельности для общества отмечается многими учеными. Так, ещё в конце XIX века английский ученый Адам Смит (1723-1790) считал, что “производительная сила одного и того же количества рабочих может быть увеличена только за счет увеличения или модернизации машин и орудий, облегчающих и сокращающих труд…”12. Смит А. Исследование о природе и причинах богатства народов: в 2-х кн. / А. Смит. - М. : Соцэкгиз, 1962. - С. 253. 12 115 В литературе содержание инновационной деятельности исследуется многими зарубежными и отечественными авторами. В период до перестройки инновационная деятельность изучалась в отечественной литературе на основе методологии диалектического материализма, предусматривавшей “раздвоение единого и познание противоречивых частей его”13. Отличительной чертой такого подхода является представление о том, что разрешение противоречий осуществляется в ходе борьбы (антагонизма) взаимоисключающих противоположностей предполагало сторон (тенденций). обнаружение у Само вычленение различных сторон взаимоисключающих параметров. Противоречие источник всякого движения и жизненности. “Лишь поскольку нечто имеет в себе самом противоречие, оно живет, движется, обладает побуждением и деятельностью”14. Следовательно, противоречие принцип всякого самодвижения, развития; само движение есть противоречие, поскольку восходит от “абстрактного к конкретному”, ко все более полному, многообразно расчлененному внутри, “истинному и результату”. Признавая методологическую значимость принципа противоречия в познании любой, в том числе и экономической, действительности, следует отметить, что основной способ разрешения противоречий экономических процессов через сочетание интересов государства, хозяйствующего субъекта, индивида имманентно присущ для стран на индустриальной и постиндустриальных стадиях развития, когда отрицание устаревших форм и методов хозяйственной практики, появление и закрепление их новых видов возникает как следствие эволюционного процесса в результате не столько разрушительной, сколько созидательной активности субъектов социально- экономических отношений. Разрешение экономических противоречий посредством отрицания устаревших форм и методов хозяйствования, формирования и утверждения новых – одно из проявлений инновационной деятельности общества (нации). Вполне можно согласиться с точкой зрения на инновационную деятельность (выделено нами – Н.Х.) как момент жизнедеятельности общества, включающий естественные и искусственные, социально-политические, экономические и другие факторы общественного развития (широкий смысл слова)15. Ленин. В.И. Полн. собр. соч. Т. 29. М. : Наука, 1970. - С. 307. Гегель Г.В. Наука логики. Т. 1, кн. 11. – М., 1970. - С. 42. 15 Кокурин Д.И. Инновационная деятельность / Д.И. Кокурин. – М. : Экзамен, 2001. - С. 34. 13 14 116 В узком (“специфически экономическом”) смысле слова инновационная деятельность (выделено нами - Н.Х.) направлена на обеспечение нового уровня взаимодействия факторов производства вследствие использования новых научнотехнических знаний. Любые изменения в способе взаимодействия социального субъекта с природной и общественной средой возникают в результате его практической, в том числе духовной, деятельности16. И здесь вполне уместно отметить еще одно определение инновационной деятельности. “Инновационная деятельность, - подчеркивает Питер Ф. Друкер, - это особый инструмент, позволяющий предпринимателю использовать перемены и превращать их в новые возможности для, например, открытия нового бизнеса или оказания новой услуги… Предприниматель должен находиться в целенаправленном поиске источников инноваций, перемен и признаков, указывающих на возможности успешной инновационной деятельности. И он должен знать и применять на практике принципы успешной инновационной деятельности”17. О собственно деятельность инновационной деятельности социально-экономического субъекта можно имеет вести речь, когда целенаправленный, осознанный характер, то есть предполагает, что новое качество возникает в процессе целевого преобразования природно-общественной среды, в том числе и экономической. Так, непосредственно на микроэкономическом уровне это проявляется в субъективной осознанной деятельности экономического микроагента, реализующую новую комбинацию факторов производства. Объективной основой этой деятельности выступает способность искусственных, экономических и социально-культурных ресурсов национальной экономики к совершенствованию, поскольку они есть проявление творческой способности самого человека. Переход данных ресурсов на новые уровни сложности, операционности, продуктивности, то есть их способность к прогрессу, является их внутренним ресурсом, который позволяет осуществиться как технико-технологическим, так и социально экономическим преобразования, научнотехнической революции. Поэтому вполне справедлива оценка: “Обладание потенциалом прогресса – важнейшее ресурсное достояние хозяйствующего общества (нации), дающее ему колоссальные преимущества в экономическом соревновании с другими обществами”18. Кокурин Д.И. Инновационная деятельность / Д.И. Кокурин. – М. : Экзамен, 2001. - С. 34. Друкер, Питер, Ф. Бизнес и инновации / Ф.Питер Друкер.: Пер. с англ. – М. : ООО “И.Д. Вильямс”, 2007. – С. 39. 18 Осипов Ю.М. Теория хозяйства / Ю.М. Осипов. Учебник в 3-х томах. Т. 2. – М., 1997. - С. 232. 16 17 117 Инновационная деятельность перестала быть для России терра инкогнита, еще недавно неизвестной отечественной практике и прошедшей мимо “массового” теоретического сознания”. За прошедшие 15-18 лет отечественная наука в известной степени восполнила пробел в исследовании инновационной деятельности, прежде всего в определении самого понятия. В литературе сложилось различное толкование инновационной деятельности. Большинство исследователей сходятся в том, что под инновационной деятельностью следует понимать деятельность, связанную с трансформацией научных исследований и разработок либо иных научно-технических достижений в новый или усовершенствованный продукт (товар, работа, услуга, технология), потенциально востребованный рынком, как деятельность, направленную на использование и коммерциализацию результатов научных исследований и разработок для расширения и обновления номенклатуры и улучшения качества выпускаемой продукции (товара, услуги), совершенствование технологии их изготовления и последующим обязательным внедрением и эффективной реализацией как на внутреннем, так и на внешних зарубежных рынках. Согласно определению, принятому в статистике, инновационная деятельность это “вид деятельности, связанный с трансформацией идей (обычно результатов научных исследований и разработок либо иных научно-технических достижений) в технологически новые или усовершенствованные продукты или услуги, внедренные на рынке, в новые или усовершенствованные технологические процессы или способы производства (передачи) услуг, использованные в практической деятельности”19. Инновационная деятельность предполагает целый комплекс научных, технологических, организационных, финансовых и коммерческих мероприятий, и именно в своей совокупности они приводят к инновациям. Следует согласиться, что инновационная деятельность в современных условиях выступает как “вид профессиональной деятельности, направленный на практическое освоение результатов интеллектуального труда, реализуемых в форме внедренных в различные области жизнедеятельности нововведений, а также все связанные с этими процессами дополнительные трудовые затраты. Инновационная деятельность является совокупностью усилий, прилагаемых для осуществления инновационного процесса. В свою очередь, инновационный процесс представляет собой логически связанную цепь последовательных переходов от одного события к другому (от идеи возможного 19 Индикаторы инновационной деятельности: 2009 - Статистический сборник. – М., 2009. - С. 483. 118 нововведения до его практической реализации), конечным результатом чего является инновация”20. Инновационную деятельность можно определить и как системный вид деятельности людей, направленный на реализацию в общественной практике инноваций на базе использования и внедрения новых научных знаний, идей, открытий и изобретений, а также существующих и проверенных наукоёмких технологий, систем и оборудования21. Безусловно, инновационная деятельность имеет системный характер, воплощая в себе единство технологических, организационных, социально-экономических новшеств, в ходе реализации которых формируется новая модель развития, преобразования и использования общественных, природных и экономических ресурсов, где конечной целью является ускорение повышения благосостояния населения региона и страны. Инновационная деятельность, согласно некоторым определениям, выступает базой инновационного процесса. Некоторые авторы не разграничивают эти понятия, трактуя их абсолютно одинаково22. Во всяком случае, инновационная деятельность – практическая часть инновационного процесса, процесс получения и коммерциализации изобретения новых технологий, видов продукции и услуг, решений организационно-технического, экономического, социального или иного характера и других результатов интеллектуальной деятельности23. Представляется, что инновационная деятельность – это сознательная целенаправленная деятельность индивидов и их сообществ по созданию, освоению в производстве и/или практическому применению нового экономического блага: новой или усовершенствованной продукции, нового или усовершенствованного технологического процесса. Переход экономического блага (вещи) в новое состояние или новое качество реализуется в виде нововведений. Изначально они оформляются в сознании как проблема, связанная с наличием противоречия между действительностью и возможным состоянием, представленным как сущностное противоречие. Уланова Ж.Ю. Развитие инновационной инфраструктуры как фактора экономического роста. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. экон. наук. – Самара, 2006. - С. 7. 21 Гамидов Г.С. Основы инноватики и инновационной деятельности / Г.С. Гамидов. - СПб. : Политехника, 2000. – С. 8. 22 Ермасов С.В. Финансовое стимулирование инновационной деятельности / С.В. Ермасов. - Саратов: Издательский центр Саратовской государственной экономической академии, 1997. - 75 с. 23 Морозов Ю.П. Инновационный менеджмент: учебно-методический комплекс / Ю.П. Морозов. – М. : ЮНИТИ, 2002. – С. 9. 20 119 Субъективное содержание последнего предполагает целенаправленную инновационную деятельность (выделено нами – Н.Х.) социальных субъектов, в ходе которой и разрешается данное противоречие. Инновационная деятельность позволяет разрешить противоречия, связанные с тем, что каждое экономическое благо (вещь, явление и т.п.) содержит объективные тенденции развития (потенции). Их реализация осуществляется благодаря целенаправленной инновационной деятельности социальных и экономических субъектов24. Сама инновационная деятельность также является внутренне противоречивой, поскольку расхождение целей и результатов инноваций является неизбежным, поскольку оно связано с рассмотрением объективного и субъективного в самих нововведениях. Инновация проявляется в конечном счете как результат различия интересов участвующих в инновационном процессе субъектов и предполагает реализацию общей функции – разрешение возникающих или имеющихся противоречий посредством целенаправленной деятельности, предотвращающей противоречия или сглаживающей остроту их проявления. Инновационная деятельность, являясь сложным процессом, осуществляется на разных уровнях организации экономических систем. Можно выделить семь таких уровней, инновационная деятельность на каждом из уровней имеет свои особенности (таблица 1025). Таблица 10 – Характеристика уровней инновационной деятельности Уровень инновационной Основные характеристики деятельности Инновационная деятельность на уровне конкретного человека. Здесь происходит основной этап получения знаний, 1 Индивидуальный а также инвестирования в наукоёмкую сферу путем приобретения товаров и услуг, необходимых для обеспечения жизнедеятельности и удовлетворения собственных потребностей Микро- Инновационной деятельностью занято одно Д.И. Инновационная деятельность / Д.И. Кокурин. – М. : Экзамен, 2001. - С. 10-11. Иванов В.В. Инновационная политика при переходе к экономике знаний / В.В. Иванов // ЭНСР. – 2006. - № 1 (32). – С. 47-58. 24 25 120 предприятие, осуществляющее разработку и выпуск наукоемкой продукции, а также оказывающее услуги по 2 обеспечению инновационного процесса (образование, финансы, юридическое сопровождение, информация и т.д.) Инновационная деятельность осуществляется группой 3 предприятий Локальный на уровне одного или нескольких муниципальных образований Инновационная деятельность осуществляется группой 4 предприятий на уровне сетевых или корпоративных структур Мезо- в пределах государственно-региональных образований (штат, регион, область, земля и т.д.) Инновационная деятельность осуществляется группой 5 предприятий на уровне сетевых или корпоративных структур Макро- в пределах государственно-региональных образований (штат, регион, область, земля и т.д.) Инновационная деятельность осуществляется: 6 - объединенными национальными инновационными Гипер- системами (США, ЕС, Россия, КНР); - транснациональными корпорациями Получение и распространение новых знаний на уровне глобальных формализованных и неформализованных сетей. 7 Глобальный Примерами таких сетей является фундаментальная наука (неформализованная сеть) и информационная сеть Internet (формализованная сеть) Осуществление инновационной деятельности предполагает наличие соответствующего механизма реализации ее целей и задач. Базовым элементом создания этого механизма, позволяющим оценить принципиальную возможность осуществления инновационной деятельности, является инновационный потенциал, который представляет собой совокупность элементов, необходимых для решения конкретных производственных задач и отражающих готовность предприятия к их решению. Существующие в экономической литературе определения этого понятия в основном не имеют каких-либо принципиальных различий. Наиболее полным, определением, отражающим его суть, является поддерживаемая большинством исследователей следующая трактовка: инновационный 121 потенциал – это совокупность кадровых, материально-технических, информационных и финансовых ресурсов, необходимых для реализации нововведений и обслуживаемых соответствующей инфраструктурой. Достаточно распространено мнение, что инновационный потенциал, инновационные возможности, инновационная восприимчивость это тождественные понятия. Разделяем точку зрения о том, что это не так, поскольку потенциал, действительно определяющий возможности инноваций, вовсе не гарантирует соответствующей ему (потенциалу) восприимчивости к нововведениям (из-за чрезвычайной инертности руководства предприятия высокие потенциальные возможности к инновациям могут быть слабо или совсем нереализуемыми)26. Инновационный потенциал как совокупность элементов, необходимых для осуществления инновационной деятельности, выступает одной из основных характеристик инновационной восприимчивости хозяйствующих субъектов, которая отражает способность любой системы к быстрому и эффективному освоению новшества. Т.А. Жукова Глава 3. ЭФФЕКТИВНАЯ ПРЕЗЕНТАЦИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ УПРАВЛЕНИЯ ИННОВАЦИЯМИ Реклама и PR являются оптимальными инструментами эффективной презентации в сфере управления инновациями. Воронов Н.А. Исследование терминологически-классификационного аспекта инновационной деятельности / Н.А. Воронов // Вестник ННГУ. Выпуск 1 (7). - 2005. – Серия Экономика и финансы. – С. 289-290. 26 122 1. Дифференциация: в условиях конкуренции выделиться среди других проектов, которые оцениваются как равные. 2. Идентификация: представить проект как объект, равный по статусу тем, которые уже достигли какого-либо успеха и, возможно, даже является законодателем некоей социальной нормы. 3. Создание имиджа: продемонстрировать проект в наиболее выгодном свете, создать достойный образ, понравиться целевой аудитории. Стратегии саморекламы инновационного проекта как оптимальный способ позиционирования 1. Проекция. Эта стратегия является прямым проявлением социальной мотивации субъектов, которая очень часто преобладает над их рефлексивными способностями. 2. Эмпатия. Это способность «встать на точку зрения» партнера, почувствовать его эмоциональное взаимопроникающую состояние, умение коммуникацию и т.д. сопереживать Эмпатия в и выстраивать некотором смысле противоположна проекции, поэтому она характерна для установления рекламной коммуникации второго типа. С точки зрения системного подхода, такая характеристика, как психологическая проекция, отражает неспособность человека войти внутрь некоей социальной системы и распознать системные свойства ее элементов; эмпатия, наоборот, отражает способность субъекта быстро проникать в социальные системы и раскрывать их свойства изнутри, становиться частью этих систем. Для формирования презентации инновационного проекта целесообразно использовать следующие модели PR-коммуникации: 1. «Двухступенчатая модель коммуникации» Элихью Каца и Пацея Лазарсфельда. Из традиционной одноступенчатой модели коммуникации (СМИ – получатели сообщения) возникла двухступенчатая (СМИ – лидеры мнений – получатели сообщения). На первом этапе основной момент двухступенчатой модели коммуникации – передача информации, на втором – передача влияния. 123 2. Модель «Спираль молчания», которую предложила немецкая исследовательница коммуникаций Элизабет Ноэль-Нойман. Модель «спираль молчания» рассматривает ситуацию, когда СМИ, манипулируя общественным мнением, предоставляют слово не большинству, а меньшинству. Более того, данное меньшинство выступает от имени большинства. 3. Модель «инновационной диффузии» Эверетта Роджерса. Отражает заключительный этап коммуникативного процесса – момент адаптации (восприятия) или отторжения информационных сообщений обществом. При этом «двухшаговый поток» восприятия информации человеком и ее передачи окружающим трансформируется в «многошаговый поток». Коммуникацию ограничивают следующие пять факторов. ♦ Традиция: как традиционно оценивалась и разрешалась конкретная ситуация? ♦ Общественное мнение: что в настоящее время считается приемлемым с точки зрения большинства? ♦ Закон: что разрешается и что запрещается законом? ♦ Мораль: ограничения, связанные с духовными и религиозными верованиями и убеждениями, относящиеся к области морали. ♦ Этика: стандарты, накладываемые профессией, или организацией, или личностью и основанные на совести и общественном сознании с точки зрения того, что хорошо и справедливо по отношению к другим и самому себе. Во время презентации необходимо последовательно вызвать у слушателей четыре состояния: Внимание, Интерес, Решимость, Действие. Существует два типа внимания – произвольное, вызываемое волевым усилием, и непроизвольное, вызываемое изменением в окружении. Модель «AIDA» – рациональный подход, не учитывающий эмоциональной составляющей. 124 И.В. Глущук Глава 4. УПРАВЛЕНИЕ ИННОВАЦИОННЫМ ПРОЕКТОМ НА ПРИМЕРЕ ПРОДВИЖЕНИЯ РАЗРАБОТКИ «ПРОБИОТИКИ» Введение На сегодняшний день инновационная деятельтность играет ключевую роль в развитии бизнеса. Это обусловлено научно-техническим прогрессом и постоянно растущей борьбой за рынки сбыта продукции; если конкуренция играет роль в формировании спроса на инновационнные проекты, то научно-технический прогресс формирует предложение. Поэтому задачей инновационного проектирования является не только подготовка проекта к «выпуску» на рынок, но и оценка того, насколько проект нужен рынку. Цель работы: Описать особенности инновационного проектирования разработки «Пробиотики». Задачи: 1) описать суть разработки «Пробиотики»; 2) описать порядок работ, проводимых в рамках инновационного проектирования разработки «Пробиотики»; 3) описать потенциальных потребителей, конкурентов и рынки сбыта пробиотиков для трепанга. Суть разработки 1 Назначение пробиотиков в аквакультуре Произведенные на основе пробиотиков биопрепараты успешно используются в аквакультурных хозяйствах с целью контроля заболеваемости гидробионтов, повышения защитных функций организма, обеспечения организма животных питательными веществами и пищеварительными ферментами, улучшения качества воды в водоёмах. 2 Научно-техническая новизна полученных результатов исследований Работа по изучению ферментативной активности микроорганизмов проводилась путём посева выделенных штаммов на плотные и жидкие среды с 125 хитином, крахмалом, хондроитинсульфатом и альгинатом натрия. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате. Качественную оценку ферментативной активности проводили по зонам гидролиза вокруг колоний на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота хитин, крахмал, хондроитинсульфат и альгинат натрия соответственно. Количественная оценка амилазной и хондроитинсульфатазной активности бактерий проводилась по методу Шомодьи, хитиназной активности - колориметрическим методом оценки количества N-ацетиламиносахаров, альгинатлиазной - визкозиметрическим методом по степени падения вязкости 0.3%-ого раствора альгината натрия, приготовленного на трис-HCLбуфере с добавлением 1.9% NaCl 3 Преимущества от применения Выведенный штамм бактерий обладает свойствами, необходимыми для развития здоровых особей дальневосточного трепанга. Изучена способность этих штаммов к синтезу пищеварительных ферментов (амилаза, хитиназа, хондроитинсульфатаза, альгинатлиаза), позволяющих трепангу лучше усваивать поступающую в организм пищу. Инновационное проектирование разработки «Пробиотики» 1 Методика осуществления технико-внедренческой деятельности Технико-внедренческая деятельность в Тренинг-инкубационном центре (инновационном инкубаторе) ДВИИТК ДВГУ осуществляется в проектных группах. Проектная группа состоит из студентов – менеджеров по инновациям и менеджеров по качеству, каждый из которых имеет определенную направленность в работе, например: юридическая, технологическая, маркетинговая, финансовая, научная, презентационная, документоведческая и рекламная. Вместе с группой работает научный консультант (автор), связанный с конкретной разработкой. Руководит работой группы директор инновационного инкубатора. 2 Цель онновационного проектирования Целью инновационного проектирования является раскрытие творческого потенциала студента по управлению нововведениями посредством научно- практических мероприятий, организованных в проект. В ходе проектирования студент получает навыки организации НИОКР, знакомится с методиками анализа отраслевой специфики. Процесс разностороннего исследования технического решения или 126 технологии позволяет реализовать интеллектуальный, финансовый и производственный ресурсы. 3 Мероприятия, проводимые в рамках проектирования разработки На сегодняшний день проект «Пробиотики» находится на стадии 2-го года проектирования, и находится в режиме финансирования из сметы ДВИИТК ДВГУ. Мероприятия, проводимые в рамках проектирования, осуществлялись следующим образом. 1) Был проведен поиск аналогичных и похожих разработок по всему миру. В результате было выяснено, что аналогов данной разработке нет, однако существуют похожие технологии, базирующиеся на генной инженерии и использующиеся для разведения трепанга на морских фермах в Приморском крае. 2) Была составлена технологическая карта разработки и план предстоящих научно-исследовательских разработок (НИР). 3) Была подсчитана величина финансовых затрат на НИР, а также составлена смета затрат на предстоящие НИР. Это было сделано для того, чтобы точно оценить стоимость разработки. Был произведен поиск грантов, в которых мы могли бы принять участие, и оформлены документы на некоторые из этих грантов. 4) Было подготовлено юридическое сопровождение разработки, изучено Законодательства РФ в сфере инновационной деятельности, подготовлены проекты юридических документов в тесном сотрудничестве с юристами ДВГУ. Информация, связанная с проектированием разработки, была подведена под действие закона о защите интеллектуальной собственности 5) Были подготовлены презентационные материалы о проекте. 6) Был произведен поиск мероприятий, к темам которых подходит разработка и/или суть проектирования, составлен план пиар-мероприятий для рекламы разработки. Данная разработка участвовала в различных мероприятиях и выставках, например, в Тихоокеанском международном инновационном форуме, Конкурсе инновационных разработок ДВГУ, Конференции ДВГУ «Инновации в предпринимательстве». 7) Было составлено технико-экономическое обоснование. 4 Итог первого года проектирования Итогом 1 года проектирования стало: 1. Формулировка политики продвижения разработки на рынок. 2. Разработка и реализация совместных мероприятий кафедры «Управление инновациями» ДВИИТК и кафедры «Микробиология» АЭМББТ ДВГУ. К 127 реализованным мероприятиям относится Всероссийская научная школа для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии». 3. Правовое сопровождение инновационного проекта. Изучение рынка сбыта пробиотиков для трепанга 1 Сбор информации о рынке Данные о поставщиках, потребителях и потенциальных рынках сбыта пробиотиков собирались из различных источников: информационных агентств, научных журналов, сети Internet (источники: www.krab.ru, www.fishportal.ru, www.arpp.pk.ru, www.seamanfisher.ru). 2 Определение потенциальных потребителей и рынков сбыта Были определены потенциальне потребители пробиотиков для трепанга - это российские компании, производящие марикультуры, в том числе и трепанга. Также был определен потенциальный рынок сбыта трепанга, так как данный рынок косвенно влияет на рынок сбыта пробиотиков. Потенциальный рынок сбыта трепанга – фармацевтические компании и азиатские рестораны. Трепанг сам по себе является очень ценным, редким и дорогостоящим продуктом, он является деликатесом во многих странах, поэтому география сбыта трепанга может быть обширна. 3 Определение конкурентов При анализе существующего рынка пробиотиков было выявлено, что в России компании не занимаются производством пробиотиков для марикультур. Существуют только компании, которые производят пробиотики либо для животных, либо для людей (ЗАО "Партнер", НПФ "Исследовательский центр", ООО "НПФ "Экобиос"). Заключение Нами были описаны особенности проектирования инновационной разработки «Пробиотики». Для этого нами были решены следующие задачи: 1) Была описана суть разработки, преимущества от ее внедрения в производство. 2) Была описана методика осуществления технико-внедренческой деятельности, а также мероприятия, проводимые в рамках проектирования разработки «Пробиотики». 128 3) Был определен потенциальный рынок сбыта пробиотиков для трепанга, потенциальные потребители и конкуренты. В заключение хотелось бы отметить, что производство пробиотиков для трепанга является выращивающих перспективным трепанг, направлением поскольку развитие деятельности предприятий, марикультурных хозяйств поддерживается Национальным проектом «Аквакультура». П.Ю. Долгих Глава 5. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Внедрение инноваций неразрывно связано с экономической проблематикой: ресурсообеспечение, организация, высококвалифицированные кадры и т.д. Таким образом, экономика и инноватика решают одни социальные проблемы и анализируются как единое целое. Необходимо учитывать, что признаком инновационной организации являются результаты научно-технической деятельности (РНТД). В основе технико-внедренческой деятельности лежат процедуры, связанные с прогнозированием экономической эффективности и учетом РНТД. Инвентаризация РНТД регламентирована нормативно-правовой базой РФ и требует от предпринимателя управления внедрением технологии. При этом в отечественной практике находит применение порядок финансирования проектов с выделением госбюджетных средств по этапам с нарастающим итогом. Государство стремится свести к минимуму степень риска и неопределенности, характерных для инновационных процессов. Поэтому на начальном этапе, сумма выделяемых средств, как правило, минимальна, а если по мере реализации проекта или программы будут получены обнадеживающие результаты, сумма ассигнований возрастает. Данные элементы инновационной политики позволяют говорить о процедуре внедрения как о регламентированном процессе: - воспроизводство знаний, в том числе с потенциальным рыночным спросом, путем проведения фундаментальных и поисковых исследований; 129 - проведение прикладных исследований и технологических разработок в государственных научных центрах РФ, внедрение научно-технических результатов в производство; - производство конкурентоспособной инновационной продукции; - развитие инфраструктуры инновационной системы; - подготовка кадров по управлению в сфере инновационной деятельности. Для активного вовлечения РНТД в хозяйственный и гражданско-правовой оборот с целью их правомерного и эффективного использования проводится инвентаризация проекта. Инвентаризация осуществляется организациями с учетом требований законодательства РФ о бухгалтерском учете и отчетности, в том числе положений нормативных правовых актов по инвентаризации имущества и финансовых обязательств и включает следующие мероприятия: осуществление научно-технического, правового и экономического анализа результатов научно-технической деятельности, информация о которых зафиксирована на материальных (информационных) носителях с целью выявления результатов научно-технической деятельности; идентификация субъектов прав на выявленные результаты научно-технической деятельности; разработка рекомендаций по получению правовой охраны на выявленные результаты научно-технической деятельности в качестве объектов исключительных прав или введению в отношении информации о них режима коммерческой тайны, а также рекомендаций по использованию выявленных результатов научно-технической деятельности в гражданском обороте. При проведении инвентаризации РНТД и прав на них рабочая инвентаризационная комиссия анализирует документы. К ним относятся: положения о коммерческой тайне, проекты договоров, исследовательским патентная документация, отчеты по грантам (научномероприятиям), финансовая политика, презентации инновационных проектов и др. Таким образом, регулирование процессов внедрения включает в себя систему мер, указанных в государственной инновационной политике, федеральных целевых программах (ФЦП), постановлениях правительства, указах президента. Рассмотрев все вышеуказанные элементы внедрения научного исследования, мы вплотную подошли к разработке проектной группы «М.И.Р.» Тренинг-инкубационного центра (ТИЦ) Дальневосточного института инновационных технологий и качества (ДВИИТК) Дальневосточного федерального университета (ДВФУ). Уникальность 130 нашей технологии заключается в использовании корма на основе микроорганизмов, которые способны оказать благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические организма, повышая, таким образом, выживаемость марикультуры на ранних стадиях развития. Внедрение включает в себя целенаправленную деятельность по организации и реализации процедур продвижения проекта новшества, которая сопрягается с инновационной политикой государства и финансовой политикой инновационного проекта. Частью инновационной политики являются процессы инвентаризации РНТД. Т.Е. Лопатина Глава 6. СИНЕРГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ РАЗВИТИЯ ИННОВАЦИОННОГО ПРЕДПРИНИМАТЕЛЬСТВА В СФЕРЕ ВЫСОКИХ ТЕХНОЛОГИЙ Аннотация Технологичный бизнес как таковой становится широко распространенным в периоды экономических кризисов и интенсификации научно-технического прогресса. Так, в 80-х годах 20-го века в СССР остро стояла проблема перестройки: условия в стране, необходимые для финансирования инновационного предпринимательства, отсутствовали. Или в 1992 году – радикальная экономическая реформа. Таким образом, кризисы в нашей стране являются периодическими, а значит, также актуально всегда стоит проблема развития механизмов технологичного бизнеса. С 2000 года стали регулярно проводиться инновационные ярмарки, призванные содействовать привлечению инвестиций для финансирования перспективных проектов. Постановка проблемы Как и в любом продвижении, возникли препятствующие факторы: слабое развитие инфраструктуры, отсутствие заметных источников венчурного капитала, низкая ликвидность капиталовложений (из-за большой рискованности), недостаток экономических условий для привлечения капитала к реализации наукоёмких проектов, 131 недостаток квалифицированных менеджеров инновационных проектов, проблемы с регистрацией венчурных фондов и др. Перед нами встаёт вопрос: что же регулирует процесс управления механизмами технологичного бизнеса? Рассматривать это понятие как отдельный компонент социальной системы невозможно, потому что бизнес – это сложная система взаимоотношений. Поэтому имеет место понятие структуры системы, представляющее собой совокупность специфических связей. С точки зрения системного подхода на инновационный бизнес как социальную систему, его можно охарактеризовать как совокупность всех способов взаимодействия и форм объединения людей, в которых выражается их всесторонняя зависимость друг от друга. Целью данной работы является исследование организации и хозяйственных процессов с позиций синергетического эффекта. Анализ Наука о самоорганизации всех систем (в т.ч. и социальной) – синергетика, наиболее точно отражает сущность социальных систем, находящихся в состоянии динамического развития и совершенствования своих структур и функций. Причиной самоорганизации является целенаправленная деятельность людей. Если в естественных системах она происходит стихийно, то в обществе самоорганизация и организация проходит через целенаправленную деятельность людей, выражающую их интересы, волю, желания. Этими людьми являются: инноватик, носитель интеллектуального ресурса (учёный) и инвестор. Чтобы понять, как их деятельность взаимосвязывается, рассмотрим два способа появления инновационного предприятия: естественный и искусственный. Последний способ заключается в том, что предприятие создаётся при инкубаторе вуза. В естественном способе предприниматель, обладающий определенными личными качествами, сам организует инновационные процессы. В обоих случаях проявляются свойства самоорганизации: инноватик, инвестор и интеллектуальный ресурс (учёный) организуют совместную деятельность, исходя из своих интересов: экономия времени, энергии, ресурсов. Но здесь возникает вопрос о границах, в которых появляется необходимость дополнения естественно-происходящих процессов самоорганизации внешней организацией. Рассмотрим эту проблему на примере механизмов управления технологичным бизнесом. 132 Венчурное финансирование – это деятельность в инновационной сфере, связанная с высокой степенью риска и заключающаяся в предоставлении необходимых инвестиций отдельным авторам-носителям идеи (интеллектуальному ресурсу), разрабатывающим и производящим наукоёмкую продукцию и услуги с целью их дальнейшей коммерциализации. Поэтому для процесса производства существует своя специфика: заводятся в режим проектирования (либо государством, либо индивидуальным предпринимателем, и др.) самые перспективные разработки. Из всего этого выстраивается следующая картина: в технологичном бизнесе, как в социальной системе, существует самоорганизация. Действительно, на протяжении всей истории развития наукоемкого производства можно проследить скачки наиболее активного финансирования. Причина либо в научно-техническом прогрессе, либо в необходимости восстановления или перестройки экономики. В любом случае, в социально-экономических системах самоорганизация неразрывно связана с организацией. Роль режиссёра берёт на себя государство. Именно государственное регулирование должно иметь место в поддержании устойчивого состояния экономики, должно следить за порядком на уровне макроэкономики, т.е. за характером её основных частей, таких как различные предприятия, фирмы, определяющие совокупный спрос, а также определять возможности темпов роста всей экономической системы. На сегодняшний день государство взяло на себя значительную часть усилий по формированию необходимого для успешного развития наукоемкого (технологичного) бизнеса и его инфраструктуры. Кроме того, оно должно создать благоприятную экономическую среду для привлечения венчурных инвестиций в инновационной сектор экономики, обеспечить ликвидность рисковых капиталовложений, повысить престиж предпринимательской деятельности в области малого и среднего бизнеса. Расширение и совершенствование систем венчурного финансирования во многих странах позволило занять малым предприятиям ведущее место в инновационной сфере, благодаря их более высокой эффективности в проведении НИОКР и скорейшей их реализации по сравнению с крупными компаниями. Заключение Процессы самоорганизации очень сложны. Важно отметить то, что синергетический эффект происходит на этапе обмена информацией, вследствие чего 133 появляется новшество. Рассматривая этот эффект в инновационной деятельности, государство – это организация, а самоорганизация – это действия заинтересованных в развитии рискового наукоёмкого предпринимательства людей (интеллектуальный ресурс, квалифицированные менеджеры, инвесторы). 134 ___________________________________________________________________________ Раздел IV РАЗВИТИЕ НАУКОЕМКОГО ПРОИЗВОДСТВА ___________________________________________________________________________ А.П. Мирошниченко Глава 1. ИНТЕРЕСЫ БИЗНЕСА В ИННОВАЦИОННОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ООО «Компания Гранула Z» создана в июле 2004 года. Целью создания и единственным видом деятельности является сбор и переработка пластиковых отходов (в основном пластиковые бутылки) по городу Владивостоку и Приморскому краю. В целом, это – семейный бизнес. Изначально мы занимались металлоломом, но в конечном итоге этот бизнес стал криминальным и полностью изжил себя. В дальнейшем, имея капитал для вложения и натыкаясь на пластиковые бутылки, проходя по улицам нашего города, было решено вложить денежные средства в переработку полиэтилентерефталата (ПЭТ). Здесь мы столкнулись с множеством проблем, так как наша страна была не готова к поддержке таких компаний как наша, а также к внедрению данного вида переработки, готова только на словах, в умах, но не на практике – еще очень далеко до осуществления экологических программ. К примеру, во многих зарубежных странах этот вид деятельности субсидирован и, как минимум, поддерживаемый государством, в виде уменьшения налоговых ставок, арендной платы, коммунальных платежей. У нас, к сожалению, этого ничего нет, кроме того, данный сектор бизнеса не попадает в категорию льготного налогообложения. При обращении в администрацию города Владивостока, по поводу снижения ставки арендной платы, в ответ слышали только то, что данный вид деятельности в перечень льготных видов не включен. Вопрос о раздельном сборе мусора и льготах рассматривается и на местном, и на Федеральном уровне, но результатов как таковых нет. Обоснованием такого отношения к нашим заявлениям является тот факт, что не принят соответствующий законопроект. Было выполнено 5 проектов по организации предприятия данного типа, только на это было потрачено около 2-х миллионов рублей. Для осуществления деятельности были получены две лицензии и приобретена технологическая линия. Для создания 135 филиалов по сбору по Приморскому краю было закуплено 5 дополнительных комплектов оборудования, прошедших сертификацию в Приморском центре стандартизации (ранее Центр стандартизации и метрологии). Данный вид деятельности малорентабельный. В городах, где население более миллиона, бизнес становится рентабельным. На момент образования нашей компании, мы встречались с руководителями московских компаний переработчиков пластика, встречались с коллегами из Санкт – Петербурга - они сразу говорили, что если население менее миллиона, то бизнес будет убыточным. Но мы выбрали другой путь решения данной проблемы - охватить не только город Владивосток, но и Приморский край. Технологическая линия – это поточная автоматическая линия по переработке пластика во вторичное сырье, мощностью 500 кг/час, поэтому мы можем обслуживать не только город, но и край. Возможны также дополнительные установки для расширения перечня собираемых пластиков. С момента образования данной компании целью было два основных этапа - первый - переработка бутылки во вторичное сырье и второй – получение конечного продукта. По нашему бизнес – плану после получения лицензии, в течение двух лет после закупки технологической линии, она должна была себя полностью окупить. В принципе мы шли полностью по плану окупаемости, запустили мы линию в июне 2008 года. Произошедший кризис сказался на выполнении плана, так как наши продукты являются продуктами нефтепереработки, и при падении мировых цен на нефть – цены на наши продукты снизились, что отдалило сроки окупаемости линии. Цена упала практически в два раза и не повышается. На сегодняшний день цены на нефть растут, но незначительно. С января этого года было полное отсутствие продаж, работали только на склад, но уже в конце лета начались продажи. Продажа производится в Китай, так как в России наши реальные покупатели находятся лишь за Уралом. 95% сырья экспортируется и около 5% продается в России. Но это количество незначительно. Из сырья ПЭТ производят упаковочную ленту, искусственную газонную траву, также используется при изготовлении черепицы, но это не значительный компонент. Поэтому компании, которые производят вышесказанные продукты, в принципе, могут добыть самостоятельно данное сырье. Наша компания при выработке 500 кг/час не заинтересована в потребностях 500 кг в месяц. Поэтому прорабатывался проект по внедрению собственной линии, для получения конечного продукта, но этот процесс затормозился из-за кризиса, финансовой нестабильности, низкой рентабельности нашего производства, что не 136 позволяет создать капитализацию ресурсов для покупки нового оборудования. Тем не менее, перспектива есть - в получении конечного продукта совместно с «инкубаторами» вузов. На данный момент инновационные проекты, которые есть для получения конечного продукта, для нас не совсем подходят. Например, производство упаковочной ленты – на сегодняшний день уже внедрено. В Китае из крошки производят те же пластиковые бутылки, добавляя 5% вторичного сырья в первичное. В нашей стране это запрещено – использование вторичного сырья при изготовлении пластика для пищевых продуктов. Китай в основном закупает для изготовления волокна – полиэстеровой нити, но этот проект очень энергоемкий, и та технология, которая используется в Китае, оставляет желать лучшего. Также и конечный потребитель данной продукции находится в Китае. В Приморье, к сожалению, не развит потребительский спрос на полиэстеровую нить. Выходить с таким продуктом на рынок рискованно, т.к. шансы сбыта очень малы. Инновационный проект «Пиролиз полиэтилентерефталата», который продвигается инновационным инкубатором ДВИИТК ДВГУ. Проект вызвал у нас интерес, так как его реальность в малой энергоемкости, отсутствии выбросов вредных веществ, что немаловажно для нас, как экологической компании. Остается большой вопрос с реализацией продукции, полученной от переработки ПЭТ, с внедрением технологии пиролиза. Но, учитывая что данная деятельность идет с нашими интересами в одном русле, мы решили поучаствовать в данном мероприятии. И проработать возможные варианты применения этого проекта в нашем бизнесе. Наше сотрудничество с кафедрой «Управление инновациями» ДВИИТК ДВГУ выражается заключением договора о совместных проектных работах. И считаем то, что у данного проекта есть перспектива. В.Д. Даровских Глава 2. МОБИЛЬНЫЙ МИКРОМАНИПУЛЯТОР (НАНОРОБОТ) ДЛЯ СЕРВИСА БИОЛОГИЧЕСКИХ И ТЕХНИЧЕСКИХ СИСТЕМ На конкретном примере, для реализации задач здравоохранения и машиностроения, показаны: последовательность структурного развития привода микроманипулятора от 137 технического предложения до модульного схемотехнического решения, планирование его информационной емкости и кинематических способностей. Мобильный и автономный микроманипулятор создается для реализации следующих задач: способность проникновения в ресурсные и энергетические магистрали биологических и технических объектов при минимальной трудоемкости данной операции, а равно вывода из этих магистралей; биологическая и эксплуатационная безопасности; отсутствие в необходимости применения устройств любого вида для извлечения микроманипулятора из объекта; возможность бесступенчатого управления в известных диапазонах режимными характеристиками конструкции; энергетическая автономность; транспортная мобильность; способность к управлению в ручном, супервизорном или автоматическом режимах; способность структурно развиваться через взаимодействие с иными машинами и механизмами; модульность исполнения; рациональность устройства; эффективность эксплуатации. Задачи создания микроманипулятора определяют основные свойства его конструкции: 1. Размер модуля – не более 100 нм. 2. Память – не менее 10 кб. 3. Защитная оболочка – имеется у каждого элемента и связи. 4. Процессор с генерированием управляющей частоты в диапазоне – от 0 до 10 кГц. 5. Температурный режим эксплуатации – от 00 С до 1000 С. 6. Источник энергии – от 10 до 12 кДж. 7. Функции: - создание условий для контроля параметров объектов; - выполнение функций измерения; - частота приемистости – от 0 до 10 кГц; - перемещения - линейное, угловое, смешанное; - диапазоны регулирования скоростей перемещений: а) в линейном радиальном направлении – от 0 до 40 мм/мин.; б) в поперечном (угловом) направлении – от 0 до 650 град./c; - дискретность перемещения: а) радиального линейного – радиус равносторонней шестиугольного рамки модуля конструкции деленный на 3; б) углового поперечного – от 10 до 600 в пропорциональном соотношении с суммарным углом поворота в 3600; 138 - исполнение функций самостоятельное или по программе извне, - функционирование в закрытых полостях и каналах; - движение в жидкостях, - транспортировка и управляемое высвобождение лекарств, - проникновение внутрь биологических клеток; - заполнение сферических емкостей конструкции отработанной биомассой клетки и ее транспортировка; - способность к структурному развитию через кинематическое и функциональное объединение с тождественными нанороботами как модулями, а также выход из модульных структур в автономное исполнение функций; - способность к саморазрушению в биологическом объекте при отсутствии негативных последствий для последнего. Вариант микроманипулятора в данной технической интерпретации показывается без отражения специфики применяемых в его конструкции материалов. Описывается лишь схемотехническая реализация конструкции. С учетом характеристик сопутствующих материалов преимущества микроманипулятора, несомненно, повышаются. При этом, по окончании заданного цикла работы, микроманипулятор сможет разрушиться в объекте и, без последствий для последнего, быть выведен наружу. Принцип структурного развития микроманипулятора представляется таким образом. Его конструкция формируется из идентичных модулей. Модуль основан на рамке, профиль которой тождественен равностороннему шестиугольнику (рис.10). Шестиугольник оснащен связями, проходящими через его вершины таким образом, что образуется многосвязная структура. В ней каждая вершина соединена с каждой из числа имеющихся в структуре, что упрощает процедуры обмена информацией между вершинами. 139 Рисунок 10 - Базовый многосвязный структурный компонент микроманипулятора, выполнен в виде Рисунок 11- Узловые сферические элементы в многосвязной структуре равностороннего шестиугольника микроманипулятора: 1 – рамка шестиугольная; 2 – стержень базирующий; 3 – элемент узловой сферический полый; 4 – элемент полый сферический В центре шестиугольной рамки 1 на базирующем стрежне 2, расположенном вертикально, устанавливается (рис.11) узловой полый сферический элемент 3. На свободных концах стержня 2, выполненного с цилиндрической образующей и полым, также установлены полые сферические элементы 4, причем данные элементы и несут рамку 1 с профилем, тождественным равностороннему шестиугольнику, а связь элементов 4 с рамкой 1 осуществлена через середины параллельных сторон шестиугольников, при этом вершины и середины сторон остальных сторон шестиугольной рамки также оснащены полыми сферическими элементами, связанными с центральным сферическим элементом базирующего стержня посредством самостоятельных полых цилиндрических стержней (рис.12а). Каждый элемент 4 (рис.11) несет один бит информации. Поэтому элементы 4 становятся управляемыми. Узловой элемент 3 (рис.11) предназначен для размещения в нем энергосистемы, блока управления и генератора тактовых импульсов. Во всех элементах, помимо базового, и в связях между ними допускается располагать требуемое количество лекарственных препаратов или информационных указателей. Организуется также исполнение обратной функции: заполнение полых элементов биомассой, отработанной биологической клеткой. 140 Рисунок 12 - Сферические элементы, расположены в вершинах (а) и по периметру (б) модульного многосвязного шестиугольника микроманипулятора Далее каждая сторона шестиугольной рамки дополняется управляемыми полыми сферическими элементами (рис.12б). Количество сферических элементов устанавливается согласно вводимым исходным данным на объем информации в нанороботе, что рассчитывается ниже. а б Рисунок 13 - Способ объединения модулей в микроманипуляторе без узловых сферических опор (а) и с ними (б) 141 Микроманипулятор состоит (рис.13б) из базового стрежня 1, длина которого равна диаметру d вписанной в равносторонний шестиугольник, образующий рамку 2, окружности. Стержень 1 выполнен полым с внутренней и наружной цилиндрическими образующими. На свободных концах опорного стержня 1 имеются полые сферические элементы 3, и 4, а в его центре (d/2) установлена дополнительная полая сферическая опора 5. При этом вершины и середины сторон остальных шестиугольных рамок 2 также оснащены полыми сферическими элементами 6, которые соединены с дополнительной центральной сферической опорой 5 базового стержня 1 конструкции посредством самостоятельных полых цилиндрических стержней 7. В элементах 3 и 4 стрежня 1 смонтированы (рис.14а) радиально расположенные и смещенные друг относительно друга на шаговый угол b шестиугольные рамки 7 как пластины. Сферические элементы 3 и 4 стержня 1 микроманипулятора связаны с центрами (d/4) параллельных сторон 2 каждой шестиугольной рамки 7 посредством центрального сферического элемента 5. Узловые сферические элементы 6 дополняют конструкцию. Количество q рамок 2 (рис.14б) зависит от необходимой дискретности управления, задаваемой шаговым углом а. Так, при α = 10, n = 360, а при α = 600, n = 6 и т.д. Каждая рамка 2 также выполнена полой? имеет внутреннюю и наружную цилиндрические образующие, связана с центральным сферическим элементом 3. б а Рисунок 14 - Конструкция микроманипулятора: виды в плане (а) и профильный (б) Стороны всех рамок 1 и 2 дополнены полыми сферическими элементами 3, которые размещены между центральным 4 и крайним 5 сферическими элементами таким образом, что элементы соседних сторон шестиугольников рамок 1 и 2 смещены в противоположных направлениях относительно центрального элемента 4 на шаг у 142 исходной рамки 1 и на половину шага у соседней с ней рамки 2 (рис.15). При этом дополнительные сферические элементы 3 сообщены друг с другом и с центральным сферической опорой 4 посредством идентичных полых цилиндрических стержней 6. Размещение сферических элементов 3 на соседних сторонах шестиугольных рамок 1 и 2, выполненное со сдвигом шага их относительного расположения и не приводит к их соприкосновению друг с другом. Общее количество сферических элементов N устанавливается согласно вводимым исходным данным на объем информации в конструкции. Для обеспечения требуемой информационной емкости, например в 10 кб задается степень заполнения шестиугольной рамки сферическими элементами. Алгоритм расчета количества необходимых сферических элементов в конструкции следующий: 10 кб → 10240 байта → 81920 бит → N ≈ 228 элементов в одной рамке. Необходимая конструкторская коррекция приводит к результату N = 264. Тогда при наличии шести элементов в вершинах рамки на каждую ее сторону добавляется еще 43 сферических элемента, что в комплексе приводит к 45 элементам на стороне. Далее, в 360 шестиугольных рамках 2, входящих в конструкцию с шаговых углом α = 10, присутствует 95049 сферических элементов и емкость памяти при этом составляет 11,220 кб. 3 6 Шаг 0,5 шага 4 5 1 2 Вершина рамки Сторона рамки 0,5 шага Шаг Вершина Сторона Вершина рамки рамки рамки Рисунок 15 - Способ расположения сферических элементов на сторонах соседних (1 и 2) шестиугольных рамок 143 Процесс работы микроманипулятора протекает следующим образом. Автономный генератор импульсов сферической опоры 5 (рис.13б) формирует серии импульсов в частотном диапазоне от 0 до заданного максимального значения fзад (например, 10 кГц), а блок управления распределяет их по поляризуемым сферическим элементам 3,4,6,8 сторон шестиугольных рамок 2 через полые цилиндрические стержни 1 и 7. Распределение импульсов подачи полярного импульса и его снятие со сферических элементов определено целью исполнения движения микроманипулятора и его направленности. При этом возможны следующие целевые перемещения микроманипулятора в пространстве: 1) прямолинейный ход в любом (прямом или обратном) радиальном направлении с параметром скорости v, задаваемым шаговым углом b и генерируемой частотой импульсов в диапазоне от 0 до fзад. Скорость v данного прямолинейного перемещения равна v = df/2, поскольку за один управляющий импульс микроманипулятор перемещается на шаговый угол b или расстояние d/2. Тогда при d = 100 нм, f = 10 кГц, v = 30 мм/мин. Смена направления прямолинейного движения осуществляется переключением по командам от блока управления подачи импульсов от того же генератора на любую, необходимую для реализации этого направления, рамку 2. Последние смещены радиально друг от друга и относительно оси базового стержня 1 на шаговый угол α, что и устанавливает новый вектор скорости v прямолинейного перемещения конструкции. Возможная скорость vп изменения направления прямолинейного перемещения есть vп = α fзад и при диапазонах изменения шагового угла 10 ≤ α ≤ 600, а также частоты приемистости 0 ≤ fзад ≤ 10 кГц равна, соответственно, 0…10 град./c и 0…600 град./c; 2) криволинейный ход по дуге окружности радиуса d / 3 . Он выполняется в случае исполнения управления каждой стороной шестиугольной рамки, разнесенных на шаговый угол α. Переход на движение по новым сторонам шестиугольных рамок 2 приводит к переносу центра криволинейного хода симметрично относительно точки пересечения двух смежных сторон шестиугольной рамки 2 микроманипулятора. При этом имеют место симметричные траектории криволинейных движений микроманипулятора. Скорость криволинейного хода не отличается от скорости vп изменения направления прямолинейного перемещения. В итоге образована конструкция микроманипулятора, внешний габарит которого приближается к сфере. Подобное исполнение придает конструкции микроманипулятора независимость положения относительно транспортного пути, возможность смены направлений перемещения, развития конструкции в направлениях, 144 определяемых планом его действий, повышение мобильности и быстродействия, упрощение управления и конструктивного исполнения в целом. Модули микроманипулятора информационно и энергетически связаны через единый центр, и их пространственная ориентация задается шаговыми углами α и b (рис.16) при выполнении последовательных угловых смещений текущего модуля относительно предыдущего вокруг оси конструкции в продольном и поперечном направлениях. Схема 2 Схема 1 Рисунок 16 - Схемы расположения шаговых углов α (схема 1) и b (схема 2) микроманипулятора, обеспечивающих его транспортные функции в поперечном и продольном, относительно общей оси симметрии, направлениях Микроманипулятор способен перемещаться в продольном и поперечном направлениях по изучаемому каналу объекта одновременно или раздельно (рис.18). Это определяется схемой (программой) действий микроманипулятора или спецификой непосредственно объекта изучения. Возможная комплексная траектория движения микроманипулятора по внутренней поверхности канала приведена на рис.18. Способ передвижения микроманипулятора задан последовательным переключением с заданной частотой полярности сферических элементов сторон. Это переключение выполняется в направлении от контактирующей с изучаемой поверхностью стороны модуля к следующей за ней. Направления переключений допустимо задавать по ходу или против хода часовой стрелки (рис.19) у каждого модуля. Это объясняется тем, что к каждой стороне шестиугольника модуля прилегает по две стороны и процесс выбора 145 направления движения и, следовательно, управления этим процессом не имеет ограничений. Рисунок 17 - Возможные направления движения микроманипулятора 1 во внутренней полости канала 2 Рисунок 18 - Комплексная траектория движения микроманипулятора во внутренней полости канала Рисунок 19 - Направления переключений полярности сферических элементов Диапазон данной возможности вписывается в максимальный телесный угол сферы, что приближается к идеалу в решении. 146 Обнаруженная взаимосвязь информационного показателя микроманипулятора с параметрами его кинематики и конструкции может быть формализована через соотношения вида N б N / 8 и N Sqk m , где S – количество сторон рамки, шт., ( S 6) ; q 3600 / - количество рамок, шт., ( q 6,60,120,180,300,360) ; – шаговый угол, град., ( 10 ,30 ,600 ) ; k – количество сферических элементов на стороне рамки, шт., (k 10,30,50,70,100) ; - количество центральных сферических элементов, шт., ( 6 при S 6) ; m – количество совмещенных сферических элементов у рамки, шт., (m 6 при S 6) ; N – общее количество сферических элементов, шт., N б - информационная емкость конструкции микроманипулятора, байт; 8 - количество бит информации в одном байте. Итоги расчета, выполненного по данной методике, сведены в таблицу и графически отражены на рис.20. Знаком ▼ на графике (рис.20) отмечены границы предельно допустимых кинематических и конструктивных параметров микроманипулятора, необходимые для задания относительно достаточной информационной емкости конструкции. Следует отметить, что при S 6 у микроманипулятора реализуется гомогенная структура, а при ином количестве сторон рамки, например, при S 8 - гетерогенная. В первом варианте очевидное конструктивное разнообразие решений найдет объективно закономерное распространение. Информационная емкость конструкции микроманипулятора S q k N N+12 ~ Nб 6 60 10 360 372 48 30 1080 1092 136 50 1800 1812 224 70 2520 2532 316 100 3600 3612 451 10 7200 7212 901 30 21600 21612 2701 50 36000 36012 4501 70 50400 50412 6301 100 72000 72012 9000 120 147 360 10 21600 21612 2701 30 84800 84812 10601 50 108000 108012 13501 70 151200 151212 18901 100 216000 216012 27010 Рисунок 20 - Графики зависимости Nб от S , , k Таким образом, реализуется идея перехода от технологий, позволяющих существовать десятилетиями к технологиям, ориентированным на значительно длительное время (на века). Эта идея реализуема посредством гомогенной, модульной индустрии, основанной на принципе ориентации на результат, а не на регулирование. Указанные циклы технологической работы микроманипулятора соответствуют рекомендациям медицины по взаимодействию лекарственных препаратов с биологическими объектами. При этом данная характеристика свойственна и техническим объектам, подлежащим контролю. Управление микроманипулятором допустимо выполнить встроенным, а равно и независимым, что определится задачей исследования. Микроманипулятор данной конструкции является универсальным, мобильным, автономным. Его параметры показаны ниже. 1) габарит конструкции, выраженный в характеристике диаметра d вписанной в равносторонний шестиугольник окружности – 100 нм; 2) информационная емкость – 11,220 кб; 148 3) частота приемистости – 10 кГц; 4) тип системы управления – цикловой; 5) скорости линейных перемещений – от 0 до 30 мм/мин.; 6) скорости криволинейного хода по дуге окружности радиуса d / 3 при диапазонах изменения шагового угла 10 ≤ b ≤ 600 , а также частоты приемистости 0 ≤ fзад ≤ 10 кГц равны, соответственно, 0…10 град./c и 0…600 град./c; 6) энергообеспечение – 1 кДж; 7) защитная оболочка имеется у каждого элемента и каждой связи конструкции. Показанный вариант микроманипулятора приспособлен к взаимодействию с подобными конструкциями по описанному способу (рис.21), с той лишь разницей, что поляризация элементов каждой контактируемой стороны каждого модуля при этом исполняется противоположно. Универсальность свойств микроманипулятора нацеливает исполнителей и исследователей на поиск областей его применения. Уже достигнуты технологические решения в применении модуля для поиска пораженных клеток биологических организмов, терапии глазных заболеваний, контроля работоспособности канатов грузоподъемных двигателей машин, внутреннего сгорания и иных. Рисунок 21 - Схема развития структуры микроманипулятора 149 НАШИ АВТОРЫ Анисимова Анна Алимовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры клеточной биологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: anisan77@mail.ru Антонюк Марина лабораторией Владимировна, доктор восстановительного лечения, Дальневосточного научного центра физиологии Научно-исследовательский восстановительного медицинских институт наук, заведующая Владивостокский филиал и патологии дыхания СО РАМН - медицинской климатологии и лечения (НИИ МКВЛ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: antonyuk@mail.ru Белькова Наталья Леонидовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии, Лимнологический институт (ЛИН) СО РАН. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3, а/я 278. Доцент кафедры физико-химической биологии биолого-почвенного факультета, Иркутский государственный университет (ИГУ). Адрес для переписки: 664000, Россия, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, д. 5. Тел.: 8(3952)425415. Адрес эл. почты: belkova@lin.irk.ru Богатыренко Елена Александровна, аспирант кафедры общей экологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: elena.bogatyrenko@znacom.ru Бородин Евгений Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии, Амурская государственная медицинская академия (АГМА), г. Благовещенск. Адрес эл. почты: borodin@amur.ru Бузолева Любовь Степановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток; 150 заведующая лабораторией экологии патогенных бактерий, Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения (НИИ ЭМ СО) РАМН, г. Владивосток. Тел.: 8(4232)452327. Адрес эл. почты: buzoleva@mail.ru Воеводина Наталия Валентиновна, кандидат экономических наук, доцент кафедры управления инновациями, директор Тренинг-инкубационного центра (инновационного инкубатора), Дальневосточный институт инновационных технологий и качества Дальневосточного государственного университета (ДВИИТК ДВГУ). Тел.: 8(4232)757211. Адрес эл. почты: incubator@dviitq.dvgu.ru Воронова Светлана Олеговна, аспирант биолого-почвенного факультета, Иркутский государственный университет (ИГУ), г. Иркутск Гвозденко Татьяна Александровна, старший научный сотрудник, доктор медицинских наук, врач высшей категории, заместитель директора по научноклинической работе, Владивостокский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения (НИИ МКВЛ), г. Владивосток Гербст Алексей Генрихович, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии гликоконъюгатов, Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского (ИОХ) РАН, г. Москва. Адрес эл. почты: alger@ioc.ac.ru Глущук Иван Васильевич, студент 3-го курса кафедры управления качеством, Дальневосточный институт инновационных технологий и качества Дальневосточного государственного университета (ДВИИТК ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: sluga_gosudarev@mail.ru Глызина Ольга Юрьевна, лаборатория хроматографии, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН, г. Иркутск Гринченко Андрей Викторович, студент 5-го курса кафедры клеточной биологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного 151 государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: grishagrin@mail.ru Даровских Владимир Дмитриевич, кандидат технических наук, доцент кафедры автоматизации и робототехники, Кыргызский университет (КГТУ) им. Раззакова, государственный технический Кыргызстан, г. Бишкек. Адрес эл. почты: vdarovskih@inbox.ru Деникина Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории аналитической биоорганической химии, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3, а/я 278. Тел.: 8(3952)425415. Адрес эл. почты: denikina@lin.irk.ru Дзюба Елена Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биологии рыб и водных млекопитающих, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3, а/я 278. Тел.: 8(3952)422695. Адрес эл. почты: e_dzuba@lin.irk.ru Долгих Надежда Викторовна, аспирант биолого-почвенного факультета, Иркутский государственный университет (ИГУ), г. Иркутск Долгих Павел Юрьевич, студент 3-го курса кафедры управления инновациями, Дальневосточный институт инновационных технологий и качества Дальневосточного государственного университета (ДВИИТК ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: assasin3@mail.ru Жукова Татьяна Алексеевна, кандидат философских наук, доцент, заведующая кафедрой рекламы международных и связей отношений с общественностью, стран АТР Владивостокский Дальневосточного институт государственного университета (ВИМО ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: reklama211@rambler.ru 152 Коваш Наталья Михайловна, генеральный директор, ООО «Дальаналит». Адрес для переписки: 690022, Россия, г. Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, д. 159-а. Сайт: www.dalanalit.ru. Адреса эл. почты: mail@dalanalit.ru, dalanalit@inbox.ru Коротких Александр Владимирович, студент 6-го курса, Амурская Государственная медицинская академия (АГМА), г. Благовещенск Кузнецова Татьяна Алексеевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии, Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии, Сибирское отделение (НИИ ЭМ СО) РАМН, г. Владивосток Кумейко Вадим Владимирович, кандидат биологических наук, доцент кафедры клеточной биологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ Д.ВГУ), г. Владивосток; научный сотрудник лаборатории фармакологии, Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского (ИБМ) ДВО РАН, г. Владивосток. Адрес эл. почты: vkumeiko@yandex.ru Лопатина Татьяна Евгеньевна, студентка 1-го курса кафедры управления инновациями, Дальневосточный институт инновационных технологий и качества Дальневосточного государственного университета (ДВИИТК ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: incubator@dviitq.dvgu.ru Мартынова Алина Викторовна, доктор медицинских наук, доцент кафедры общей экологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ Д.ВГУ), г. Владивосток. Тел.: 8(4232)429632. Адрес эл. почты: anilina@freemail.ru Матюгина Евгения Борисовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории водных экосистем, Институт природных ресурсов, экологии и криологии Сибирского отделения (ИПРЭК СО) РАН, г. Чита Мирошниченко Александра Павловна, исполнительный директор, ООО «Компания Гранула-Zet», г. Владивосток. Тел.: 8(4232)497472. Адрес эл. почты: granulaz@mail.ru 153 Носач Екатерина Сергеевна, аспирант кафедры эпидемиологии, Владивостокский государственный медицинский университет (ВГМУ), г. Владивосток. Тел.: 8(4232)429632. Адрес эл. почты: clinmicro@yandex.ru Остапенко Екатерина Александровна, студентка 5-го курса отделения экологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: angel.8807@bk.ru Охотина Софья Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник УНИР НОЦ «Морская биота», Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: okhotina@list.ru Памирский Игорь Эдуардович, ассистент кафедры биохимии, Амурская Государственная медицинская академия (АГМА), г. Благовещенск. Адрес эл. почты: parimski@mail.ru Парфенова Валентина Владимировна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией водной микробиологии, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН, г. Иркутск. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3, а/я 278. Тел., факс: 8(3952)425415, 8(3952)425405. Адрес эл. почты: parf@lin.irk.ru Прушинский Алексей Петрович, аспирант кафедры эпидемиологии, Владивостокский государственный медицинский университет (ВГМУ), Владивосток. Тел.: 9(4232)429632. Адрес эл. почты: clinmicro@yandex.ru Русинек Ольга Тимофеевна, доктор биологических наук, профессор, географический факультет, Иркутский государственный университет (ИГУ), г. Иркутск; главный специалист Байкальского музея Иркутского научного центра Сибирского отделения Российской академии наук (ИНЦ СО РАН). Адрес для переписки: 664520, Россия, Иркутская область, Иркутский район, поселок Листвянка, ИНЦ СО РАН. Тел.: 8(3952)25055. Адрес эл. почты: rusinek@isc.irk.ru 154 Сидоренко Марина Леонидовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории почвоведения и экологии почв, Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения (БПИ ДВО) РАН, г. Владивосток Сокольникова Юлия Николаевна, студентка 5-го курса кафедры клеточной биологии, Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББТ ДВГУ), г. Владивосток. Адрес эл. почты: iskorka7@yandex.ru Спиченкова Наталья Евгеньевна, аспирант кафедры биоорганической химии и биотехнологии, Институт химии и прикладной экологии Дальневосточного государственного университета (ИХПЭ ДВГУ); научный сотрудник УНИР НОЦ "Морская биота" ДВГУ. Адрес эл. почты: spichenkova_nata@mail.ru Суханова Елена Викторовна, аспирант лаборатории водной микробиологии, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3, а/я 278. Тел.: 8(3952)425415. Адрес эл. почты: sukhanova@lin.irk.ru Теркина Ирина Анатольевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории водной микробиологии, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН, г. Иркутск. Тел.: 8(3952)425415. Адрес эл. почты: iterkina@mail.ru Федорова Галина Афанасьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории гидрохимии и химии атмосферы, Лимнологический институт Сибирского отделения (ЛИН СО) РАН. Адрес для переписки: 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, д. 3. Тел: 8(3952)428220. Адрес эл. почты: fedorova@lin.irk.ru Фотина Ольга Николаевна, аспирант лаборатории восстановительного лечения, Владивостокский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения (НИИ МКВЛ), г. Владивосток 155 Ханчук Надежда Николаевна, кандидат исторических наук, заведующая кафедрой управления инновациями, Дальневосточный институт инновационных технологий и качества Дальневосточного государственного университета (ДВИИТК ДВГУ), г. Владивосток. Тел.: 8(4232)514321. Адрес эл. почты: nadnik48@mail.ru Цветкова Наталья Борисовна, аспирант 3-го года обучения, Научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения (НИИ ЭМ СО) РАМН. Адрес для переписки: 690087, Россия, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1. Тел.: 8(4233)925608. Адрес эл. почты: nat19101976@yandex.ru Челнокова Берта Ивановна, кандидат геолого-минералогических наук, научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории медико-информационных технологий, Владивостокский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения (НИИ МКВЛ), г. Владивосток. Тел. 8(4232)345490 Чулакова Ольга Андреевна, аспирант кафедры эпидемиологии, Владивостокский государственный медицинский университет (ВГМУ), г. Владивосток. Тел. 8(4232)429632. Адрес эл. почты: clinmicro@yandex.ru Штарберг Михаил Анатольевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник кафедры биохимии, Амурская Государственная медицинская академия (АГМА), г. Благовещенск 156