Эколого-генетические механизмы изменчивости генома

На правах рукописи
ТЮЛЬКО ЖАННА СЕРГЕЕВНА
ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ ГЕНОМА ХАНТАВИРУСОВ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА МИКРОЭВОЛЮЦИЮ
ОГРАНИЧЕННОЙ ПО ЧИСЛЕННОСТИ ВИРУСНОЙ ПОПУЛЯЦИИ
03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Омск – 2009
Работа выполнена в Омской Государственной Медицинской Академии на базе
ФГУН ОмскНИИПОИ Роспотребнадзора
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Якименко Валерий Викторович
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,
Поползухина Нина Алексеевна
кандидат биологических наук,
Кушнарева Татьяна Валерьевна
Ведущая организация:
ГУ Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии
наук (ИЭГМ УрО РАН) (г. Пермь)
Защита состоится 18 декабря 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.177.05 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Омском государственном педагогическом университете по адресу:
644099, г. Омск, наб. Тухачевского, 14; тел./факс 8 (3812) 24-37-95.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омского государственного педагогического университета по адресу: г.Омск, ул. Набережная Тухачевского, 14 и на официальном сайте Омского государственного педагогического университета: http://www.omgpu.ru/.
Автореферат разослан 17 ноября 2009 г.
Отзыв на автореферат (в 2-х экземплярах‚ заверенных печатью) просим
направлять по адресу: 644099, г. Омск, наб. Тухачевского, 14; тел./факс 8
(3812) 24-37-95; E-mall: kolpakova@omgpu.ru
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук, доцент
2
Т. Ю. Колпакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Одной из актуальных проблем экологии, в
связи с ростом количества заражений хантавирусными инфекциями, является
изучение взаимоотношений вирусов с популяциями их хозяев. Хантавирусы
относятся к семейству буньявирусов, распространены практически по всему
свету, переносятся мышевидными грызунами и способны вызывать у человека
опасные заболевания, иногда с летальным исходом: геморрагическую лихорадку с почечным синдромом и хантавирусный пульмонарный синдром.
Геном хантавирусов представлен сегментированной РНК отрицательной
полярности. Неточность работы РНК-зависимой РНК-полимеразы и отсутствие
системы репарации РНК у вирусов приводит к формированию квазивида –
множеству генетически не идентичных вирусов одного генотипа, с разной приспособленностью, конкурирующих между собой в процессе микроэволюции в
клетках хозяина (Quasispecies structure and persistence of RNA viruses / E.E.
Domingo [et al.] // Emerg. Infect. Dis. 1998. Vol. 4. P. 521-527). Иммунная система
хозяина, организм которого является средой обитания возбудителя, направляет
микроэволюцию вирусов. При изменении среды обитания вирусов - изменении
иммунной реакции организма-хозяина или передаче другому хозяину, один
квазивид сменяется другим, несколько отличающимся от предыдущего. Таким
образом, в группах контактирующих между собой организмов-хозяев, формируются постоянно эволюционирующие и смешивающиеся вирусные популяции, на свойствах которых основана современная классификация вирусов, вводящая для хантавирусов понятие «генотип» аналогичное понятию «вид» у более сложных организмов.
Эволюция хантавирусов тесно связана с эволюцией их хозяев-грызунов,
что отражается в структуре филогенетических деревьев, построенных по генетическим последовательностям тех и других. Эти деревья имеют звездчатое
строение (Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution // J. of General Virology. 1996. Vol. 77. P. 2677-2687), показывающее древнее происхождение хантавирусов, связанное с процессами видообразования у хозяев. Считалось, что генетические расстояния между ветвями
этих деревьев у хантавирусов, в пределах одного и того же генотипа, зависят от
степени географической удаленности отдельных изолятов. Однако, в последнее
время, были обнаружены факты, противоречащие этому мнению, а так же поставлен вопрос об изменении классификационных критериев при выделении
вирусных геновариантов (подвидов), в связи с большей изменчивостью нуклеотидных последовательностей в пределах одного и того же генотипа, чем это допускается нормами международного комитета по таксономии вирусов (Plyusnin
A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy. Brief Review // Arch. Virol.
2002. Vol. 147. P. 665–682). Большинство таких несоответствий наблюдается
при смене вирусом хозяев, что показывает необходимость изучения механизмов изменчивости вирусов, обусловленных особенностями взаимодействия с
организмом хозяина.
3
Вирусы гаплоидны и размножаются бесполым путем. При этом типе размножения внутрипопуляционные генетические связи могут отсутствовать. Однако, при наличии способности к рекомбинации, может реализовываться эпизодический внутрипопуляционный генетический обмен, что приводит к образованию новых рекомбинантных клонов. Основным механизмом изменчивости
генома хантавирусов считается возникновение точечных замен. Для некоторых
хантавирусов, кроме того, предполагается наличие реассортации и обмен
фрагментами гомологичных сегментов генома в результате рекомбинации
(Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with
recombinant S RNA segment / A. Plysnin [et al.] // The EMBO Journal. 2002. Vol.
21. N 6. P. 1479-1503; Sironen T., Vaheri A., Plysnin A. Molecular Evolution of Puumala Hantavirus // J. of virology. 2001. Vol. 75. N 23. P. 11803–11810). К моменту начала исследования, возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов была показана только в пределах S-сегмента для генотипа Тула (Recombination in Tula Hantavirus Evolution: Analysis of Genetic Lineages from Slovakia /
C. Sibold [et al.] // J. of Virology. 1999. Vol. 73. N 1. P. 667-675). Поэтому, было
целесообразным исследовать распространенность механизма гомологичной рекомбинации и у других хантавирусов.
Влияние рекомбинации на внутрипопуляционные процессы может быть
разнообразным и приводить к результатам, зависящим от характеристик самой
популяции вирусов, от возможности смешанной инфекции, от жизнеспособности мутантных клонов, от действия (или отсутствия) отбора и т.д. Анализ влияния гомологичной рекомбинации на эволюцию вирусов уже проводился
(Tajima F. N., Takezaki N. Estimation of Evolutionary Distance for Reconstructing
Molecular Phylogenetic Trees // Mol. Biol. Evol. 1994. Vol. 11, N 2. P. 278-286).
Однако недостаточная изученность механизмов изменчивости у большинства
хантавирусов ограничивала область исследования. Поэтому, возникла необходимость более углубленного изучения проблемы, и построения, по возможности, более точной модели этих процессов.
Изучение микроэволюции большинства РНК-вирусов в настоящее время
проводится с использованием математических и имитационных моделей (Wilke
C.O. Quasispecies theory in the context of population genetics [Электронный ресурс] // BMC Evolutionary Biology. 2005. Vol. 5. N 44. URL:
www.biomedcentral.com/1471-2148/5/44 (дата обращения: 04.10.09)), в которых
представлена микроэволюция нуклеотидных последовательностей вирусов,
формирующих квазивид. К началу нашего исследования, моделирование микроэволюционных процессов у хантавирусов не проводилось, поэтому построение модели было необходимо, так как позволяло оценить роль различных механизмов изменчивости и понять направленность процессов формообразования в
данной группе вирусов, а также эволюционные ограничения, накладываемые на
вирусную популяцию взаимодействием с организмом хозяина.
Соответствие темы диссертации требованиям Паспорта специальностей ВАК Министерства образования и науки РФ. Диссертационное исследование выполнено в рамках специальности 03.00.16 экология и соответствует
4
п.2 «Популяционная экология» Паспорта специальностей ВАК Министерства
образования и науки РФ.
Цель исследования – Выявить эколого-генетические механизмы изменчивости геномов хантавирусов и исследовать их влияние на процессы микроэволюции в популяциях хантавирусов, ограниченных по численности.
Задачи исследования:
1.
Проанализировать изменчивость генома хантавирусов в пределах
отдельного генотипа в связи с особенностями географического распространения и взаимодействия с видом хозяина.
2.
Выявить структурные особенности генетических последовательностей, влияющие на изменчивость генома, возникающую в процессе приспособления к организму хозяина, у наиболее распространенных хантавирусов Старого Света.
3.
Применить имитационную модель микроэволюции ограниченной
по численности популяции хантавирусов для оценки направленности эволюционного процесса, связанной с действием выявленных механизмов изменчивости
генома хантавирусов и структурными особенностями генома.
Научная новизна. Впервые выполнен сравнительный статистический
анализ консервативности первичной структуры S и M сегментов генома хантавирусов генотипов Старого Света. Впервые показана возможность гомологичной рекомбинации у хантавирусов Пуумала и Хантаан. Показано существование коррелированных нуклеотидных замен в S - сегментах генотипов Тула, Пуумала, Хантаан, Добрава/Белград. Разработан алгоритм поиска гомологичных
рекомбинаций в массиве выровненных нуклеотидных последовательностей с
применением метода вычисления значений взаимной информации. Впервые
проведено имитационное моделирование микроэволюции хантавирусных последовательностей, учитывающее возможность осуществления гомологичной
рекомбинации и существование связанных нуклеотидных замен в S - сегменте,
позволившее охарактеризовать влияние этих механизмов изменчивости на микроэволюцию ограниченной по численности популяции хантавирусов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные, раскрывают действие некоторых эколого-генетических механизмов микроэволюции хантавирусов Старого Света, влияющих на изменение приспособленности вирусов к организму хозяев-грызунов, расширяют и углубляют представления о процессах, происходящих в вирусных популяциях. Результаты исследования могут быть использованы при уточнении классификационных критериев хантавирусов, создании вакцин, в медицинской практике, в дальнейшей
научно – исследовательской работе.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном отборе и обработке данных о хантавирусах Старого Света и их генетических последовательностях, разработке и тестировании методов анализа нуклеотидных последовательностей хантавирусов (методы поиска случаев гомологичной рекомбинации и наличия коррелированных замен нуклеотидов), создании имитационной модели микроэволюционных процессов в пределах вирусного квазивида, написании компьютерных программ, реализующих эти методы, формировании научных положений и выводов.
5
Обоснованность выводов и достоверность результатов работы обеспечены значительным объемом анализируемого материала, применением современных методов исследований и подтверждением их методами математической статистики.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
1.
Современное распределение геновариантов хантавирусов сформировалось в результате совокупности процессов расселения хозяев (исторический аспект) и распространения хантавирусов в их популяциях (экологический
аспект) с учетом возможности переключения вируса на нового хозяина.
2.
Приспособительные механизмы изменчивости у хантавирусов
включают в себя не только накопление точечных замен нуклеотидов, но и возможность гомологичной рекомбинации.
3.
Наличие гомологичных рекомбинаций в процессе микроэволюции
хантавирусов приводит к ускоренному накоплению приспособительных изменений, что повышает вероятность выживания ограниченной по численности
вирусной популяции.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции
«Актуальные аспекты природноочаговых болезней» (г. Омск: 2001); конференции, посвященной 70-летию изучения хантавирусов на Дальнем Востоке (г.
Владивосток, 2003); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы сохранения здоровья населения Сибири.» (г. Омск, 2008);
конференции, посвященной 70-летию медико-профилактического факультета
ОГМА (г. Омск, 2008); республиканской конференции, посвященной 70-летию
учения Е. Н. Павловского о природной очаговости болезней (г. Омск, 2009).
Организация исследований. Работа выполнялась в период с 2001 по
2007 гг. в Омской Государственной Медицинской Академии и ФГУН Омск
НИИПОИ Роспотребнадзора.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (235-источников, из них 206 - зарубежных). Материалы изложены на 135 листах компьютерного текста. Работа иллюстрирована
25 рисунками и 11 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы
В главе приведен обзор литературных данных относящихся к свойствам
генетических последовательностей хантавирусов Старого и Нового Света, скорости их эволюции и зависимости генетических расстояний между нуклеотидными последовательностями одного генотипа от степени географической и
экологической изоляции. Рассмотрены основные статистические подходы к
6
анализу свойств генетических последовательностей и математические модели
эволюции популяций генетических последовательностей, использующие понятие квазивид.
2. Материалы и методы
Объектами исследования являлись нуклеотидные последовательности
малого и среднего сегментов генома хантавирусов генотипов Тула (31- изолят,
97 последовательностей), Пуумала (52,516), Хантаан (44,125), Сеул (48, 204),
Добрава/Белград (38, 171), хантавирусов Нового Света (26 генотипов, 326 последовательностей), и некоторых неклассифицированных хантавирусов (11 генотипов, 16 последовательностей), полученные из банков данных (GenBank и
EMBL) в режиме свободного доступа и в исследованиях, проведенных ФГУН
Омск НИИПОИ Роспотребнадзора (г. Омск) совместно с ГУ ИПВЭ РАМН им.
акад. М.П.Чумакова (г. Москва).
Методы анализа генетических последовательностей. При сравнении
нуклеотидных последовательностей в качестве меры подобия использовалось
значение взаимной информации - MJ (Кульбак С. Теория информации и статистика. М.: Наука, 1967. 220 с.; Чалей М.Б., Коротков Е.В. Информационный
подход к выявлению сходства генов тРНК и их глобальная классификация //
Изв. АН СССР. Сер. биол. 1991. N 6. С. 915-927). Удвоенное значение MJ распределено как случайная величина 2, что позволяет оценить вероятность случайной взаимосвязи двух последовательностей в одном испытании и выбрать
значение минимального уровня взаимной информации MJ min, обеспечивающее
обнаружение статистически значимой взаимосвязи последовательностей с заданной вероятностью ошибки.
Построение филогенетических деревьев по нуклеотидным последовательностям проводилось с использованием методов максимального правдоподобия и связывания ближайших соседей (Вейр Б. Анализ генетических данных.
–М.: Мир, 1995. 400 c). Для подтверждения обнаруженных случаев гомологичной рекомбинации в сегментах строились дендрограммы, в которых объединение в кластеры осуществлялось в соответствии со значениями MJ, рассчитанными при сравнении каждой нуклеотидной последовательности с другими,
аналогично алгоритму идентификации сообщений, передаваемых по каналам с
помехами (Клюев Н.И. Информационные основы предачи сообщений. - М.:
«Советское радио», 1966. 360 c.). В этом случае, кластер можно считать однородным с заранее заданной доверительной вероятностью, а последовательности, входящие в него, одинаково дивергировавшими друг от друга, если отношение максимального значения MJ, из рассчитанных для всех возможных пар
последовательностей этого кластера, к сумме этих значений меньше квантиля
распределения Кокрена.
7
Анализ консервативности вирусных нуклеотидных последовательностей проводился путем построения филогенетических профилей (Weiller G.F.
Phylogenetic Profiles: A Graphical Method for Detecting Genetic Recombinations in
Homologous Sequences // Mol. Biol. Evol. 1998. Vol. 15. N 3. P. 326-335), где по
оси абсцисс откладывались координаты правой границы скользящего окна (номер нуклеотида в сегменте, далее н.), а по оси ординат - значения MJ, рассчитанные при сравнении фрагментов выровненных гомологичных последовательностей, попадающих в «скользящее окно» шириной 100 и 150 н., двигающееся
вдоль пары сравниваемых последовательностей. Пики, присутствующие на
этих графиках в одном и том же месте, показывают наличие и положение консервативного участка в данном массиве последовательностей, а общие для всех
кривых спады графиков соответствуют положению вариабельных участков.
MJ 200
3
130
4
5
1
2
60
1
Korhumaki
301
601
Sotkamo
901
Evo\12Cg\93
1201
1501
н.
Opina916-Eidsvoll
Рис. 1 Результат сравнения по уровню MJ последовательностей S - сегмента вирусов генотипа Пуумала (изолят Gomselga сравнивается с изолятами
Korhumaki, Sotkamo, Evo/12Cg/93, а изолят Opina916 с изолятом Eidsvoll). Серым прямоугольником вдоль горизонтальной оси показано положение кодирующей части сегмента, цифрами в рамках обозначены номера консервативных
участков.
Случаи гомологичной рекомбинации выявляли после попарного сравнения всех последовательностей одного генотипа по уровню MJ. Наличие разных по составу групп с высоким уровнем подобия внутри группы, обнаруженных для соседних участков последовательности длиной более 150 символов,
свидетельствует о наличии гомологичной рекомбинации. На дендрограммах,
это проявляется в перемещении последовательности из одного кластера в другой. Для оценки значимости обнаруженных случаев гомологичной рекомбинации задавался уровень отсечки MJL = 130 – 140. Он обеспечивает достаточно
малую вероятность ошибки (< 3%) при выделении возможных единиц рекомбинации в составе последовательностей.
Поиск корреляций при возникновении нуклеотидных замен: в массивах выровненных нуклеотидных последовательностей S - сегмента каждого вирусного генотипа столбцы с разными координатами (отсчитываемыми от пер8
вого нуклеотида в кодирующей части последовательности) сравнивались между
собой по уровню взаимной информации. В результате, для всех возможных пар
столбцов в массиве выровненных последовательностей был получен набор значений MJ, по которым оценивали связь между заменами нуклеотидов в этих
столбах. Для каждого генотипа был рассчитан минимально значимый уровень
MJ (заданная величина ошибки (  5%): Тула - 20, Пуумала - 21, Добрава/Белград - 18; Хантаан и Сеул - 17. Тестирование рассчитанных значений
провели в эксперименте со случайным образом сгенерированными текстами.
С
G
Т
С
G
А
T
G
Выровненные
нуклеотидные
последовательности
G
T
сравниваемые столбцы
Рис. 2 – Схема поиска корреляций в столбцах выровненных нуклеотидных последовательностей при анализе замен нуклеотидов.
Методы моделирования. В имитационной модели эволюции нуклеотидной последовательности S - сегмента был реализован стандартный алгоритм
эволюционного моделирования (Каширина И.Л. Введение в эволюционное моделирование. Воронеж: Воронежский государственный университет, 2007. 40 с;
Редько В.Г. Оценка скорости эволюции в моделях Эйгена и Куна // Биофизика.
1986. Т. 31. N 3. С. 511-516), в котором были учтены следующие условия: для
моделирования использовалась кодирующая часть сегмента; численность моделируемых популяций ограничена действием иммунной системы хозяев до значений ≈106-108 (Temporal and Spatial Analysis of Sin Nombre Virus Quasispecies
in Naturally Infected Rodents / R. Feuer [et al.] // J. of virology. 1999. Vol. 73. N 11.
P. 9544–9554; Wilke C.O., Novella I.S. Phenotypic mixing and hiding may contribute to memory in viral quasispecies [Электронный ресурс] // BMC Microbiology
2003. Vol. 3, N 11. URL: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/3/11 (дата обращения: 04.10.09)); допускается существование одной или нескольких оптимальных последовательностей, обладающих достаточной приспособленностью
для закрепления в популяции; каждая из последовательностей обладает приспособленностью, которая тем больше, чем выше уровень подобия между рассматриваемой и наиболее близкой к ней оптимальной последовательностью;
предварительно, по имеющимся подборкам выровненных последовательностей, для каждого генотипа хантавирусов находится вероятность нахождения
каждого типа нуклеотида в каждой позиции последовательности, что позволяет
определить вероятность существования последовательности и ее приспособленность; наименее приспособленные последовательности и последовательности с нонсенс-мутациями элиминируются, что сохраняет постоянную во времени численность популяции; мутации типа делеций и инсерций не рассматрива9
ются, допускаются гомологичные рекомбинации внутри сегмента; возникновение мутаций, осуществляется случайным образом в соответствии с имеющимися оценками скорости возникновения замен (10-3-10-5 замен на нуклеотид на одну генерацию - шаг моделирования); для моделирования эволюции последовательностей с учетом корреляции при возникновении мутаций, подсчитываются
вероятности P(j1,j2, i1,i2) нахождения каждого нуклеотида типа i1, в каждой позиции j1, в зависимости от каждого типа нуклеотида типа i2 в позиции j2, где i1 ,
i2 = 1, 2, 3, 4 (A, T, C, G), где j1, , j2 меняются от 1 до L, где L-длина кодирующей части S - сегмента. Это позволяет построить матрицу Р каждого генотипа
хантавирусов размерностью (L,L,4,4), используемую при моделировании и с ее
помощью учесть наличие возможной корреляции при возникновении замен в
сегменте.
Программное обеспечение. При написании компьютерных программ,
подсчитывающих MJ для анализа последовательностей, использовался язык
фортран. Для выравнивания последовательностей и построения филогений
применялись программы: Clustal X (1.8); Phylip3.5; Njplot и TreeViev 1.6.6;
BioEdit 5.0.9. Построение графиков и расчет вероятностей при использовании
свойств стандартных статистических распределений проводились с помощью
Microsoft Excel.
3. Результаты и обсуждение
Анализ филогений вирусов. Исследование показало, что предположение о соответствии генетических расстояний географическим расстояниям
между изолятами не всегда подтверждается для хантавирусов Старого Света.
Это видно на примере геновариантов хантавирусов Тула и Пуумала из природных очагов в Омской области (рис. 3): геноварианты хантавируса Тула, географически наиболее близкие, но изолированные от разных хозяев (MG22/Omsk,
MG23/Omsk - от узкочерепной полевки; LL2\Omsk, LL58\Omsk - от степные
пеструшки), показывают большее подобие с геновариантами из европейской
части России и Восточной Европы соответственно, чем друг с другом (см. рис.
3а); геноварианты хантавируса Пуумала обнаруживают большее подобие с карельскими и финскими геновариантами, чем с поволжскими, более близкими к
ним географически (см. рис. 3б).
В пределах генотипов Хантаан и Добрава/Белград также выявляется высокий уровень сходства первичной структуры генома географически удаленных
изолятов: изоляты вируса Хантаан из китайской провинции Гуйчжоу оказываются наиболее подобны последовательностям географически удаленных от них
изолятов Хабаровского края и Кореи. Как показывают позднее опубликованные
работы китайских авторов генетическое разнообразие нуклеотидных последовательностей в этой провинции Китая наибольшее, и предполагается, что именно здесь находился центр, из которого происходила адаптивная радиация хантаан-подобных вирусов (Molecular diversity and phylogeny of Hantaan virus in
Guizhou, China: evidence for Guizhou as a radiation center of the present Hantaan
virus/ Yang Zou [et. al] // J. of General Virology. 2008. Vol. 89. P. 1987-1997).
10
84Fli
G20-S
C109-S
757
K58
KOZIK/5276
Зап. Словакия,
86-99%
KOZIK/5247
Чехия, Австрия
MOR/5302
M. arvalis
MO/5302/MA
MOR/5294
MOR/52866
MOR/5293
Сербия Pitymys
991
CACAK
subterraneus
88-97%
KOSICE144
вост. Словакия M. arvalis
KOSICE667
TULA/76MA
1000
TULA/175MA
TULA/53MA
Россия,
789
TULA/23MA
европейская часть 85-99%
Sam/6836
M. arvalis
Sam/6661
Sam/6677
Sam/6801-M
1000
MG22/Omsk
Россия (Омская об.)
MG23/Omsk
M.gregalis
441
81-98%
Taldykorgan/Ma343
б)
Казахстан
Karatal/Ma340
M
.
arvalis
obscurus
Karatal/Ma322
1000
LL2/Omsk
Россия (Омская область) 95%
LL58/Omsk
Lagurus Lagurus
D63-98
D17-98
Германия, Польша
D5-98
89-99%
988
М. arvalis
Lodz-1
Lodz-2
1000
Mu 46/04
Mu 137/05
Mu 137/04
999
Sen05/139
Германия
87-97%
Sen05/222
М. arvalis
995
Sen05/175
M. agrestis
Sen05/174
Sen05/205
918 Sen05/121
Sen05/204
а)
0.1
1000
K habarovsk M icrotus fortis
L e m m us sibiricus
Topograf ov
Fuson g843-06
97-99% К и тай
Fuson g/200-05
M yod es
Fuson g-C r-247
Tobetsu
я
и
он
п
Я
97%
rufo canus
iiso
am
K
1000
C G /B askiria
C G 1820
K 27
M yod es
88-99%
Fuson g48
TK / Ufa-97
D
1000
П оволж ье glareolus
P 360/R U S
P uu/K azan
Ud m urt/894C g
976
F-s808
C G 142
B altic/205
B altic/49
C G 144/O m sk
712
C R F366/O m sk 94-99% M yod es
C G 168/O m sk
C R F161/O m sk О мская glareolus,
C R F308/O m sk
M .rufocanus
обл.
C G 215/O m sk
994
V irrat
K arhum aki
G om se lga
93,4-91,8 % M yod es
K olodo zero
P allasjarvi
E vo/12
Ф инляндия glareolus
E vo/15
Sotkam o
Карелия
P uu/1324C g
M ellanse l49
U m ea/hu
B ussjo 98-1
1000
V indeln
P albole 98-3
93-98,8 % M yod es
G um boda 98-2
Skaran 98-1
Северная glareolus
P albole 98-4
N orum 98-5
Скандинавия
H undberget
P albole 98-1
D jaknebole 98-1
Vran ica
663
Tavelsjo
Fyn47
Fyn131 98 % Д ания
So lleftea3
E idsvoll1124 93-98,8 % Н орвегия
B alkan-1
K lippit ztoerl 95-99 % А встрия
E rnstbrunn
O pina916
M yod es
M ignov illard
H eidelber g/hu
glareolus
93-99%
C G 13891
932
C g-E rft
Б ельги я
C G 14445
1000
M ontbliart
Ф ран ц и я
Thuin
0.1
M om ignies-55
Герм ан и я
б)
C ouvin
Рис.3. Филогенетические деревья, построенные с использованием метода связывания ближайших соседей для гомологичных фрагментов S - сегмента хантавирусов Тула (а, 409 н.) и Пуумала (б, 905 н.) Величина бутстрэп – выборок –
1000. Рядом с каждым кластером указан уровень гомологии его нуклеотидных последовательностей (в %). В качестве
внешних групп для укоренения деревьев использованы последовательности генотипа Хантаан (84Fli), Khabarovsk и
Topografov.
Для геновариантов хантавируса Добрава/Белград наибольшее влияние
оказывает принадлежность разным хозяевам: Apodemus flavicolis или A.
agrarius: так нуклеотидные последовательности из Словакии и России обнаруженные у A. agrarius более схожи, чем последовательности из одного и того же
района Словакии от вирусов, принадлежавших разным хозяевам.
Следовательно, предположение о строгой зависимости генетических расстояний от географических в пределах генотипа, нельзя считать справедливым
во всех случаях. В тех местах, где возникает несоответствие данному предположению, наблюдается перекрывание ареалов обитания разных видов, которые
являются хозяевами для одного и того же вирусного генотипа: у хантавирусов
Тула - Microtus arvalis, M. gregalis, Lagurus lagurus, ареалы обитания, которых
перекрываются на юге Западной Сибири; у Пуумала - Myodes rufocanus и M.
glareolus, ареалы обитания, которых перекрываются от юга Западной Сибири,
далее - через Урал, по северу европейской России до Карелии; у Хантаан – перекрытие ареалов обитания полевых мышей и крыс; у Добрава/Белград – A.
flavicolis и A. agrarius, ареалы которых перекрываются на территории Европы.
Вероятнее всего, генетические расстояния между отдельными геновариантами
формируются в ходе двух процессов: миграции хозяев и распространения хантавирусов в их популяциях, которое может происходить с переключением вируса с одного хозяина на другого. Грызуны – хозяева хантавирусов, в течение
своей жизни обычно не совершают больших миграций, и площадь их обитания
часто ограничена несколькими квадратными километрами. Однако, в прошлом,
в связи с природными процессами, приводящими к изменению климатических
условий и ландшафтов (чередование оледенений и межледниковых периодов,
имевших место в северном полушарии или горообразование) происходило периодическое расселение всех видов грызунов из неких рефугиумов на территории современного обитания. И вместе с ними расселялись их паразиты, в т.ч. хантавирусы. В Китае и Корее эти два процесса имеют место и в настоящее
время из-за высокой мобильности крыс – основных хозяев вирусов генотипа
Хантаан.
Анализ консервативности нуклеотидных последовательностей S - и
М - сегментов хантавирусов. При анализе полученных филогенетических
профилей, построенных для S - сегментов разных генотипов, обнаруживается
похожая картина (табл. 1): в кодирующей части сегмента выделяются четыре
наиболее консервативных участка последовательности со схожими координатами, превышающими критические значения MJ = 135 – 140. Ширина участков
у разных генотипов может отличаться. Наиболее консервативными оказываются участки 1 и 4; внутренние участки с номерами 2 и 3, расположенные в центре
кодирующей части (≈300 - 790 н., ≈680 - 1030 н.), менее выражены, и при сравнении некоторых геновариантов одного генотипа могут отсутствовать. Кроме
концевых (3’- и 5’-) консервативных участков в не кодирующей части типичных для всех буньявирусов (The 5’ Ends of Hantaan Virus (Bunyaviridae) RNAs
Suggest a Prime-and-Realign Mechanism for the Initiation of RNA Synthesis/ D.
Garcin [et al.]. J. of virology. -1995. -Vol. 69, № 9. -P. 5754-5762), иногда обнару13
живается дополнительный консервативный фрагмент в некодирующей части на
3’- конце (участок 5, см. табл. 1)
Таблица 1
Результат анализа консервативности S - сегмента
Генотип
Тула
Пуумала
Хантаан
Добрава/Белград
Сеул
1
40 – 350
40-280
40-250
120-450
Координаты консервативных участков S - сегмента
(количество нуклеотидов от начала сегмента)
2
3
4
5
350-790
800-1030
1064-1358
*
300-600
700-980
1000-1300
*
300-560
680-950
1000-1300
―
500-750
840-1100
1150-1320
1340-1650
152-320
780-965
1100-1330
―
Таблица 2
Результат анализа консервативности М-сегмента
Генотип
Пуумала
Хантаан
Добрава/
Белград
Сеул
Координаты консервативных участков М-сегмента (количество нуклеотидов от начала сегмента)
гликопротеин G1
гликопротеин G2
360 – 660, 1130 – 1320, 1500 – 1880 1980-2300, 2480-2800, 3100-3250
40-200, 220-450, 640-950, 1000-1250, 2140-2360, 2500-2800
1500-1780
*
*
*
2000-2250, 2340-2670,
2750-3000, 3150-3370
Примечание: «―» отсутствие консервативного участка; «*» – невозможность точно определить координаты участка;  консервативный участок выделяется только при сравнении сильно дистанцированных геновариантов.
Анализ М-сегмента выявляет большую вариабельность последовательности гена G1 и несколько большую консервативность – гена G2, что согласуется
с литературными данными (Schmalion C.S., Schmalion A.L., Dalryple J. M.
Hantaan Virus M RNA: Coding Strategy, nucleotide Sequence, and Gene Order //
Virologi. 1987. Vol. 157. P. 31-39). Для М-сегмента хантавирусов, также как и
для S-сегмента, характерно сохраняющееся чередование консервативных и вариабельных участков в пределах генотипа (табл.2).
Филогенетические отношения и потенциальные участки рекомбинации. Генетические расстояния при сравнении гомологичных фрагментов нуклеотидных последовательностей S и М - сегментов хантавирусов обычно сохраняются, но в некоторых случаях наблюдается их изменение в зависимости
от того, какие фрагменты сегмента взяты для сравнения. Чтобы определить, что
явилось причиной таких различий – накопление точечных мутаций или возникновение гомологичной рекомбинации - был проведен анализ консервативности
нуклеотидных последовательностей, после чего, случаи резкого изменения
уровня подобия, обнаруженные при сравнении консервативных участков, проверялись для выявления возможной гомологичной рекомбинации. В результате,
14
у хантавирусов генотипов Тула, Пуумала, Хантаан и Добрава/Белград выявлены изоляты, M и S - сегменты которых являются результатом возникновения
гомологичной рекомбинации внутри сегмента:
У генотипа Тула рекомбинантными являются S - сегменты изолятов D598, D17-98 и D63-98 из Германии, имеющие соседствующие участки, гомологичные географически дистанцированным вариантам: участки 1, 3 и фрагмент
на 3’-конце имеют наибольшее подобие с вариантами из Моравии и Восточной
Словакии (Kosice), а участки 4 и 2 - с сибирскими MG23/Omsk и Omsk/LL2.
В S - сегменте хантавируса Добрава/Белград в средней части кодирующей последовательности (участки 2 и 3) выявляется высокий уровень подобия
всех изолятов, полученных от A. flavicolis и A. sylvaticus, независимо от их
географического происхождения (MJ = 150 - 175). В то же время, на краевых
консервативных участках 1 и 4 в кодирующей части последовательностей, может иметь место достаточно высокий уровень подобия с изолятами от A.
agrarius: российским геновариантом Куркино и, в меньшей степени, с эстонским - Сааремаа (MJ = 145 - 165). По-видимому, в эволюционной истории этих
групп имела место гомологичная рекомбинация, в которую вовлекались последовательности вышеупомянутых геновариантов хантавируса Добрава\Белград.
У хантавирусов генотипа Хантаан также выявлены рекомбинантные
формы S - сегмента. При сравнении последовательностей изолятов A16,
TJJ16В между консервативными участками 3 и 4 наблюдается резкое падение
значения MJ от 205 до 140, что можно рассматривать, как следствие гомологичной рекомбинации с участием неизвестной последовательности. Рекомбинантной является последовательность S - сегмента китайского изолята Hu
(провинция Хубэй): на участке 2 наибольшее подобие (MJ = 160 - 170) - с геновариантом Q32 из провинции Гуйчжоу, а на участках 1, 3, 4 - с геновариантами
из провинции Аньхой - Chen4, RG9, E142, 84Fli, hv84Fli (MJ = 158 – 170). Если
рассматривать их географическое расположение, то геновариант Hu (провинция Хубэй) занимает промежуточное положение между геновариантами 84Fli,
hv84Fli и Chen4 (провинция Аньхой) и геновариантом Q32 (Гуйчжоу). Таким
образом, фрагменты последовательности S - сегмента с высоким уровнем подобия могут сохраняться у географически отдаленных друг от друга геновариантов и отсутствовать у более близких.
М-сегмент вируса Хантаан изолята A16 также следует рассматривать как
результат рекомбинации: часть последовательности (1-1870 н.) кодирующая
G1 слева от точки рекомбинации почти идентична (MJ180-205) геноварианту
H8205, а часть справа (1885-1300 н.), приходящаяся на G2 идентична М - сегменту геноварианта 84Fli. Этот случай подтвержден и другими методами исследований (Chare E.R. Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses / E.R. Chare, E.A. Gould, E.C. Holmes //
J. Gen. Virol. 2003. Vol. 84. P. 2691-2703).
Из хантавирусов генотипа Пуумала к рекомбинантным можно отнести
геновариант Ufa97.11, имеющий мозаичную структуру гена G1: на участках с
координатами 201 - 400, 540 – 600 н., характерный для географически близких
последовательностей из одного кластера, наблюдается высокий уровень подо15
бия с башкирскими и удмуртскими вариантами (MJ = 170 – 190) и, одновременно, низкий, характерный для сравнения геновариантов из разных кластеров (MJ  130), на участке с координатами 400 – 540 н. Это может быть следствием включения в М - сегмент фрагмента из другой, не рассматривавшейся в
данном обзоре последовательности. Следствием гомологичной рекомбинации
у предковых по отношению к последовательности М - сегмента геновариантов
Vindeln и Vranica может быть более высокое подобие (MJ = 140 - 150) с геновариантом Sotkamo на участках с координатами 1245-1449 н. (G1) и 2260-2320
н. (G2) н. для Vindeln; и 2590-2650 н. (G2) для Vranica в то время как для
остальных участков их последовательностей этого не наблюдается.
Корреляции замен в нуклеотидных последовательностях S сегментов хантавирусов. В дальнейшем изложении без скобок указывается
номер нуклеотида в последовательности, в скобках указан номер аминокислоты
(а.к.), нуклеотидная замена в триплете которой является связанной с заменами в
других нуклеотидах кодирующей последовательности.
Генотип Тула. Узловыми точками в последовательности, с которыми
связано большинство значимых корреляций, являются нуклеотиды с координатами 817 (258 а.к.), 805 (254 а.к.) и 556 (171 а.к.).
Генотип Хантаан. Узловой точкой является нуклеотид с координатой
547 (170 а.к.). Число значимых корреляций намного меньше, чем для генотипа
Тула (16 и 46 соответственно), при этом число нуклеотидных замен в расчете
на 100 позиций у этих генотипов отличается незначительно (максимальные
значения - 65 и 67 соответственно), это говорит о меньшей согласованности
возникающих здесь мутаций по сравнению с геномом вирусов Тула.
Генотип Пуумала. Здесь обнаруживается наибольшее количество коррелированных замен нуклеотидов (359). Узловыми точками являются нукледотиды с координатами: 654 (204 а.к.) – с ним связано 25 коррелированных замен,
687 (215 а.к.) – 24, 804 (254 а.к.) – 23, а также нуклеотиды в интервале 590-850,
между которыми наблюдается значительное число корреляций. Видимо мутации, возникающие в S - сегменте вирусов Пуумала, более согласованы между
собой и, возможно, с мутациями в некодирующей части (3’- конец).
Генотип Добрава/Белград. Значимые корреляции отмечаются в 26 аминокислотных позициях. Количество нуклеотидных замен в расчете на сто позиций (≤ 38) было наименьшим среди рассмотренных генотипов, но так же, как и
в случае вирусов Пуумала, сильно возрастало по направлению к 3’- концу последовательности. Наибольшее количество значимых коррелированных нуклеотидных замен зафиксировано для нуклеотида с координатой 208 (56 а.к.).
Генотип Сеул. Значимых корреляций не обнаружено.
Наличие коррелированных замен нуклеотидов в триплетах основной рамки считывания S - сегмента генома хантавирусов различных генотипов позволяет говорить о том, что отбор мутаций идет связанно по нескольким позициям
в последовательности сегмента. Это может быть одним из механизмов, приводящих к дивергенции вирусов. Непосредственные причины существования
корреляций не выявлены, но известно, что особенности вторичной структуры
РНК влияют на замены, происходящие в нуклеотидной последовательности
16
(например, при формировании шпилек РНК и третичных взаимодействиях).
Есть также вероятность того, что обнаруженные корреляции являются результатом существования ограничений для третичной структуры белка нуклеокапсида у хантавирусов. N-протеин, кодируемый S - сегментом, выполняет несколько функций в процессе жизнедеятельности хантавирусов (Characterization
of the Hantaan Nucleocapsid Protein-Ribonucleic Acid Interaction / W. Severson [et
al.] // The Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274. N 47. P. 33732–33739;
The RNA Binding Domain of the Hantaan Virus N Protein Maps to a Central, Conserved Region / X.Xu [et al.] // J. Virol. 2002. Vol. 76. N 7. P. 3301-3308). Он взаимодействует с тремя видами вирусных РНК: геномной РНК, антигеномной РНК
и матричной РНК. Следовательно, можно ожидать наличие связи между изменениями, возникающими в аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида, и изменениями, возникающими в местах связывания (или рядом с
ними) на нуклеотидной последовательности вирусных РНК. В пользу этого говорит обнаружение многочисленных корреляций нуклеотидных замен в S сегменте генотипа Пуумала, для которого предполагается существование множества связывающих сайтов для белка нуклеокапсида (Characterization of the
Hantaan Nucleocapsid Protein-Ribonucleic Acid Interaction / W. Severson [et al.] //
The Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274. N 47. P. 33732–33739), действующих кооперативно, а не 1-2 консервативных участка на 5’ конце, как
предполагается в случае с вирусами Хантаан и Тула.
Таблица 3.
Количество обнаруженных корреляций.
грызуныхозяева
вирусов
количество
корреляций
Пуумала
M. glareolus
M.rufocanus
321
Тула
M. arvalis
M. arvalis obscurus
M.gregalis
M.agrestis
L. lagurus
Pitymys subterraneus
34
Хантаан
M. rufocanus
A. peninsulae
A. agrarius
Niviventer confucianus
Rattus norvegicus
R. nitidus
19
Добрава/ Белград
A.sylvaticus, A.
flavicollis
A.agrarius
26
Как видно (см. табл. 3), наличие большого числа корреляций (как у генотипа Пуумала) возможно ведет к ограничению числа хозяев, в то время как генотип Хантаан, у которого выявлено наименьшее число корреляций, связан с
наибольшим числом хозяев-грызунов. Это можно объяснить тем, что наличие
корреляций препятствует возникновению быстрых изменений в генетических
последовательностях за счет дополнительного направленного отбора мутаций,
которые должны соответствовать схеме корреляций. А при переключении вируса на другого хозяина быстрые изменения генома часто являются условием
выживания вируса в новой среде.
Результаты моделирования микроэволюции хантавирусных популяций. Популяции, полученные в результате моделирования, по своему составу
17
соответствуют понятию “квазивид”, и являются устойчивым состоянием, к которому стремится данная система при наличии постоянных условий. Численный рост популяции наиболее приспособленных последовательностей, получаемый при работе предложенной имитационной модели, может изменяться в соответствии с классическими вариантами (Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных процессов. М.: Изд. МГУ,
1993. 301 С.), наблюдаемыми при решении дискретного аналога уравнения
Ферхюльста: 1) при небольших скоростях роста популяции возрастать по логистическому закону до максимально возможного; 2) при средних скоростях роста популяции меняться периодически; 3) при больших скоростях роста популяции изменяться стохастически.
Проводились следующие варианты моделирования:
- без учета корреляций замен нуклеотидов, наблюдался: а) рост максимального значения приспособленности внутри популяции в случаях монотонного возрастания и (или) наличии периодических колебаний численности
группы наиболее приспособленных последовательностей (при устанавливаемой
скорости возникновения замен 10-4-10-5 замен на нуклеотид на одну генерацию); б) беспорядочные колебания максимального значения приспособленности или его снижение в случае стохастических изменений численности при
большей скорости возникновения замен (≥10-3) замен на нуклеотид на одну генерацию.
- с учетом корреляции замен нуклеотидов: а) при наличии многочисленных, интенсивных корреляций, выявляемых со значениями MJ > 20, например, как у хантавирусов генотипа Тула, может проявиться режим хаотических
колебаний численности в группе наиболее приспособленных последовательностей (приспособленность при этом остается на одном уровне или падает) даже
при сравнительно низкой скорости возникновения замен (5•10-5); б) при малом
числе корреляций, например, как у генотипа Хантаан или их отсутствии, как у
генотипа Сеул, в процессе моделирования реализуются пути, описанные для
случаев без корреляций. Это может быть объяснено нарушением схемы корреляций нуклеотидных замен и, соответственно, уменьшением значения приспособленности и полной элиминацией мутировавших последовательностей и их
потомков, даже при высоком уровне гомологии внутри группы. Тогда, место
группы наиболее приспособленных последовательностей занимает другая субпопуляция с достаточно большим значением приспособленности у каждой последовательности. Такой режим быстрого восстановления при режиме хаотических колебаний численности группы наиболее приспособленных последовательностей возможен при наличии высокого уровня гомологии (>94%) внутри
всей популяции.
Наличие корреляций в процессе моделирования ведет также к снижению
значения максимальной достигаемой приспособленности в популяции и большему генетическому разнообразию последовательностей, полученных в результате моделирования.
18
приспособленность
- с учетом гомологичной рекомбинации: выявляются все вышеописанные закономерности в поведении моделируемых популяций. Кроме того, в
ограниченных по численности популяциях наличие гомологичной рекомбинации ведет к достижению большего максимального значения приспособленности
и к ускорению темпов микроэволюции (рис. 4). Это происходит за счет ускоренного распространения наиболее приспособленной последовательности, а
также вследствие того, что рекомбинации могут способствовать объединению в
одном генотипе различных благоприятных мутаций, что дает, таким образом,
селективные преимущества (Хедрик Ф. Генетика популяций М.: Техносфера,
2003. 592 С.). Кроме того, популяция не переходит в режим хаотических колебаний численности в случаях, когда скорость роста подгруппы немного выше
критической, дающей такой переход при отсутствии рекомбинаций. Наличие
рекомбинации стабилизирует систему только в определенных пределах скорости роста: при дальнейшем ее увеличении изменения численности становятся
хаотическими, а приспособленность последовательностей уменьшается.
1
0.95
0.9
0.85
0.8
0.75
0.7
0.65
0.6
1
301 601 901 120115011801210124012701
без учета рекомбинаций
шаг
с учетом рекомбинаций
Рис. 4. Изменение приспособленности в ходе микроэволюции моделируемой популяции при наличии гомологичной рекомбинации в S-сегменте и без
нее.
Выводы
1. Генетические расстояния внутри генотипов хантавирусов определяются не только географическим расстоянием и видовой принадлежностью хозяев,
но в большей мере историей расселения хозяев и вирусов включающей переключения на нового хозяина при перекрывании ареалов обитания хозяев.
2. В кодирующих частях последовательностей М и S - сегментов генома
хантавирусов Старого Света имеет место устойчивое чередование консервативных и вариабельных участков, эволюционирующих с различной скоростью, а
также действует механизм гомологичной рекомбинации
3. Наличие в кодирующих частях последовательностей S - сегмента генома хантавирусов Тула, Пуумала, Хантаан и Добрава/Белград корреляций в
19
возникновении нуклеотидных замен является механизмом, лимитирующим генетический дрейф и ограничивающим возможности приспособления хантавирусов к новым хозяевам.
4. Имитационное моделирование демонстрирует, что:
–
наличие корреляций нуклеотидных замен оказывает направляющее
действие на эволюционный процесс, канализируя действие отбора;
–
учет возможности рекомбинаций приводит: к ускорению темпов
эволюции популяции; к большей устойчивости процесса эволюции последовательностей за счет более быстрого распространения благоприятных мутаций в
популяции; к достижению более высокого уровня приспособленности в ограниченной по численности популяции.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1. Тюлько Ж.С. Филогенетические отношения хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации. Вирусы генотипа Тула/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Вопр.
вирусологии. -2006. - №3. - С. 37- 42.
2. Тюлько Ж.С. Изучение филогенетических отношений хантавирусов генотипа Пуумала
с применением метода вычисления взаимной информации/ Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко //
Вопр. вирусологии. -2007. - №2. - С. 20 - 24.
3. Тюлько Ж.С. К вопросу о темпах эволюции хантавирусов генотипа Пуумала/
Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Тихоокеанский медицинский журнал. -2008. - №2. - С. 28 - 32.
4. Тюлько Ж.С. Связанные замены в малом сегменте генома хантавирусов Старого света/
Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко // Вопр. вирусологии. -2008. - №3. - С. 28 - 34.
Научные статьи и материалы:
1. Тюлько Ж.С. Применение метода весовых функций к анализу рапространенности
SINES в генетических последовательностях/ Ж.С.Тюлько, Е.В.Коротков //Новые информационные технологии в медицине и экологии. –Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 1997. –С. 75-76.
2. Тюлько Ж.С. Изучение филогенетических отношений хантавирусов с применением
метода вычисления взаимной информации (на примере Хантаан-подобных вирусов)/
Ж.С.Тюлько, В.В.Якименко //Хантавирусы и хантавирусные инфекции. – Владивосток,
2003.-С. 173-181.
3. Тюлько Ж.С. О существовании зон рекомбинации у хантавирусов/ Ж.С.Тюлько,
В.В.Якименко, А.Е.Деконенко //Актуальные аспекты природноочаговых болезней. – Омск,
2001. –С. 85-86.
4. Якименко В.В. Филогенетические отношения западно-сибирских хантавирусов генотипов Тула и Пуумала/ В.В.Якименко, Ж.С.Тюлько, А.Е.Деконенко //Хантавирусы и хантавирусные инфекции. – Владивосток, 2003.-С. 161-172.
5. Korotkov E.V. Latent sequence periodicity of some oncogenes and DNA-binding protein
genes/ E.V.Korotkov, M.A. Korotkova, J.S.Tulko // CABIOS.-1997. –Vol.13, №1. -P.37-44.
6. Korotkov E.V., MIRs are present in coding regions of human genes/ E.V.Korotkov,
J.S.Tulko, D.A.Phoenix // DNA Sequence. – 1998. –Vol.8, -P.31-38.
7. Tulko J.S. Distribution of MB1 repetitive elements in different genomes and discovery MB1 in
exons/ J.S.Tulko, E.V.Korotkov // Moskow: preprint/MEPhi, 004-97, 1997. –20p.
20