МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРИ ПОНИЖЕННОМ
advertisement
На правах рукописи РЫЛОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРИ ПОНИЖЕННОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА 03.03.01 - физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медикобиологических проблем Российской академии наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией «Протеомики» отдела «Молекулярно-клеточной биомедицины» ГНЦ РФ – ИМБП РАН Ларина Ирина Михайловна доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Института, зав. лабораторией «Энергетики биологических систем» Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН Ведущая организация: Маевский Евгений Ильич Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН» Защита диссертации состоится «___» _________ 2013 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН Автореферат разослан «___» __________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были открыты почти 40 лет назад в лаборатории А.Я. Фриденштейна (Фриденштейн, Лурия, 1980) при анализе клеточных популяций костного мозга по способности формировать колонии фибробластоподобных клеток и по аналогии с гемопоэтическими стволовыми были названы КОЕ-ф (колониеобразующие единицы фибробластов). В настоящее время ученые многих стран обнаружили высокую пластичность этих предшественников, заключающуюся в способности дифференцироваться в клетки разных типов тканей взрослого организма, а также выяснили, что они присутствуют не только в костном мозге. Близкие по свойствам к ММСК клетки выделены из целого ряда тканей и органов, таких как жировая ткань, синовиальная жидкость, скелетные мышцы, легкие, Вартоновский студень пупочного канатика, периодонтальные связки, пульпа зуба и др. (Caplan, 1991; Crisan et al., 2008; Da Silva Meirelles et al., 2006; Fraser et al., 2006; Griffiths et al., 2005; Beltrami et. al., 2003; Josse et al., 2010), что свидетельствует о широком распространении их в организме как тканеспецифичного резерва малодифференцированных мезенхимальных клеток, которые способствуют поддержанию и регенерации этих тканей. Хорошо известны такие свойства ММСК in vitro, как, например, дифференцировка в клетки различных тканей мезенхимального происхождения, (Clarke et al., 2000; Zuk et. al., 2002; Gimble et al., 2008), однако существует мало информации относительно естественного распределения и биологии этих клеток в организме, а также возможных изменений их свойств в процессе экспансии in vitro. Внедрение клеточных технологий, основанных на использовании уникальных свойств ММСК, в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины и требует проведения многочисленных исследований. При этом быстро развивающиеся технологии предоставляют широкие возможности для контролируемого изменения параметров культивирования различных типов клеток. Однако чаще всего эти изменения касаются химических компонентов ростовой среды (содержание питательных веществ, факторов роста, солей и аминокислот). Газовый состав традиционно остается наиболее консервативным параметром при культивировании, при этом уровень СО 2 приближается к тканевому, тогда как содержание кислорода в обычных СО2–инкубаторах соответствует содержанию кислорода в воздухе (около 20%). Вопрос о том, какая концентрация кислорода является физиологической для клеток in vitro, активно обсуждается в научной литературе. В связи с этим предпринимаются попытки изучения состояния культивируемых клеток при различном содержании 4 кислорода (Cooper et. al., 1999; Das et. al., 2001; Bosch et.al., 2006; Grayson et. al., 2006; Буравкова, Анохина, 2007; Буравкова и др., 2009). Однако нет единого мнения о том, какую концентрацию кислорода надо использовать, какое время клетки должны подвергаться воздействию измененного содержания кислорода, как при этом следует учитывать такие факторы, как состав среды, плотность субкультивирования клеток и др. Высказываются предположения, что физиологическое содержание кислорода (около 4%7%) будет оптимальным для культивируемых клеток (Буравкова и др., 2009; Fehrer et. al., 2007), а более низкий уровень приведет к гипоксическому состоянию. Особый интерес исследователей к ММСК, как наиболее перспективному клеточному элементу для тканевой инженерии и восстановительной медицины, диктует необходимость проведения исследований, посвященных оценке функционального состояния ММСК в процессе их экспансии ex vivo, а также оптимизации процесса культивирования с целью приближения к условиям физиологического микроокружения этих клеток. Цель и задачи исследования Целью данной работы является оценка влияния различного процентного содержания кислорода на морфофункциональное состояние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: Задачи исследования: 1. Сравнить эффект, оказанный различным содержанием кислорода (20%, 5%, 3%, 1% О2), на морфологию ММСК жировой ткани человека in vitro; 2. Провести сравнительный анализ жизнеспособности ММСК, культивируемых при пониженной до 5%, 3% и 1% концентрации кислорода; 3. Изучить влияние газовой среды с измененным уровнем содержания кислорода на число КОЕ-ф и пролиферативную активность ММСК; 4. Исследовать экспрессию маркерных поверхностных антигенов ММСК, культивируемых при различном содержании кислорода; 5. Сравнить остеогенный и адипогенный дифференцировочный потенциал ММСК в стандартных условиях и при пониженном до 5% и 1% уровне содержания кислорода; 6. Оценить влияние пониженного содержания кислорода (5%, 3%, 1% О2) на метаболизм глюкозы в процессе гликолиза; 5 7. Исследовать обратимость эффектов пониженного содержания кислорода на ММСК жировой ткани; 8. Исследовать влияние газовой среды с различным содержанием кислорода (20% и 5% О2) на уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК. Научная новизна Впервые содержания проанализировано кислорода (20%, влияние 5%, 3%, постоянного 1%) на воздействия метаболизм различного глюкозы и морфофункциональное состояние ММСК, а также проведен сравнительный анализ дифференциальной экспрессии генов при различном содержании кислорода в среде культивирования. Впервые установлено, что снижение гетерогенности популяции ММСК и увеличение в ней доли веретенообразных клеток при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1% О2) сопровождается изменением экспрессии генов таких структурных и регуляторных белков цитоскелета как, β-тубулин, супервиллин, анкерин, тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки RhoГТФазы, трансгелин и саркогликан-γ. Получены новые данные, свидетельствующие о стимулирующем эффекте пониженного содержания кислорода в среде (5% О2) на пролиферацию ММСК, что соотносится с изменением экспрессии регуляторов клеточного цикла (белки семейства Fos, формирующие транскрипционный фактор AP1, ядерный антиген пролиферирующих клеток, циклин D2, регуляторная единица циклин-зависимой киназы и ингибитор циклинзависимой киназы). Впервые показано, что культивирование ММСК при пониженной концентрации кислорода приводит к уменьшению потребления глюкозы клетками и увеличению молярного соотношения продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы, что сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий и увеличением экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического расщепления глюкозы. Впервые продемонстрирована обратимость изменений, вызванных пониженной концентрацией кислорода в среде, заключающаяся в восстановлении остеогенного дифференцировочного потенциала, уменьшении пролиферативной активности ММСК и способности к формированию КОЕ-ф. Теоретическая и практическая значимость работы Проведенное исследование позволило продемонстрировать, что содержание кислорода в среде культивирования может быть использовано как фактор, модулирующий 6 свойства ММСК, что имеет большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований в области физиологии прогениторных клеток. Представленные результаты вносят существенный вклад в изучение основных механизмов вовлечения ММСК в процессы репарации с учетом специфики их локального микроокружения. Полученные в настоящей работе данные показали, что использование низкого парциального давления в среде культивирования позволяет в 2-3 раза увеличить прирост клеточной массы по сравнению с условиями стандартного содержания кислорода в среде культивирования (20% О2). Получен патент на изобретение № 2418066 от 26.04.2010. Данные настоящего исследования демонстрируют возможность поддержания недифференцированного статуса активно пролиферирующей популяции ММСК в условиях пониженного содержания кислорода, что может иметь большое значение для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Положения, выносимые на защиту 1. Снижение концентрации кислорода (до 5%-1%) в среде культивирования оказывает протективное действие на ММСК жировой ткани человека, что выражается в увеличении жизнеспособности клеток, а также снижает гетерогенность популяции, активирует пролиферацию и смещает метаболизм глюкозы ММСК в сторону гликолитической составляющей. 2. Концентрация кислорода в среде культивирования около 5% является наиболее оптимальной для постоянной экспансии in vitro и моделирования физиологической ниши прогениторных клеток жировой ткани, тогда как более низкое содержание кислорода (≤ 1% О2) может быть использовано для сокращения времени экспансии и получения большего количества клеток для нужд регенеративной медицины. 3. Вызванное низким парциальным давлением кислорода в среде культивирования увеличение пролиферативной, клоногенной активности и сохранение менее коммитированного состояния ММСК является обратимым. Апробация работы Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 8-й – 10-й конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2009 - 2011); 6-й Всероссийской конференции с международным участием “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция” (Москва, 2011); 7-й Международной конференции “Молекулярная генетика соматических клеток” (Звенигород, 2009); Всероссийской научной школе по биомедицинской инженерии «БМИ 7 – 2010» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, «Стволовые клетки и 2009); 4-й Всероссийской регенеративная научной медицина» (Москва, школе-конференции 2011); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 2nd International Conference on Medical Physiology «Recent researches in modern medicine» (Cambridge, UK, 2011); World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany, 2011). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ. Работа выполнена при поддержке программы поддержке программы ОБН РАН и гранта Минобрнауки РФ № 11.G34.31.0006. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 24.10.2012 г. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 39 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 371 источника, из них 34 на русском и 337 на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Получение и культивирование ММСК. Для получения первичной культуры использовали метод ферментативной обработки стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани человека (Zuk et al., 2001, Буравкова и др., 2009). Культивирование клеток осуществляли в среде α-MEM (MP Biomedicals, США) с добавлением 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США). Плотность посадки клеток составляла 3 х 103 клеток/см2. Стандартное культивирование проводили при 37оС в атмосфере 5% СО2 с использованием СО2-инкубатора (Sanyo, Япония). Для создания пониженного содержания кислорода в среде использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония) (5% О2) и герметичную камеру (Stem Cell Technologies, США), модифицированную датчиками давления и концентрации О2, которую продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления 1% и 3% концентрации кислорода. В работе использовали клетки 1-8 пассажа. Каждый эксперимент воспроизводился 3-6 раз с дублированием аналитических измерений. 8 Характеристика ММСК. Оценку морфологии ММСК и подсчет клеток для определения их прироста проводили с помощью программы Sigma ScanPro 5 при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL, оснащенного системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия). Число удвоений популяций (PD) подсчитывали по формуле PD = log2N/No, где No и N – начальное и конечное количество клеток (Wolfrom С., Raynaud N., Maigne J., 1994). Время удвоения популяции (TD) определяли по формуле TD = (log22) * t/[log2(N/N0)], где t – время прироста популяции, N – количество клеток через время t, N0 – исходное количество клеток (Романов, 2011). Способность ММСК формировать колонии в процессе культивирования на разных пассажах оценивали методом, описанным в работе А.И. Фриденштейна и сотрудников (1987). В чашки Петри (Ø 60 мм) высевали по 50 клеток и культивировали в ростовой среде. Через 14-15 дней культуры окрашивали 0,5% раствором кристаллвиолета в метаноле в течение 5 мин. (Фриденштейн и др., 1967). Иммунофенотип клеток оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (Immunotec, Франция), меченых FITC (HLA-ABC, CD9, CD90, CD106, CD54, CD31, CD117) и PE (CD34, CD54, CD73, CD105, CD62L, CD62P, CD62E), на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали неиммунные меченые FITC и PE моноклональные антитела (Immunotec, Франция) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера. Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя. Индукцию дифференцировки осуществляли с помощью остеогенных (10 -8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-Lаскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 μМ дексаметазона (Sigma, США), 10 μг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания), 200 μМ индометацина (Sigma, США)) дифференцировочных стимулов. Выявление щелочной фосфатазы проводили с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Выявление минерализованных компонентов матрикса проводили, окрашивая культуры клеток ализариновым красным (Sigma, США). Коммитирование ММСК в адипогенном направлении оценивали по появлению клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США). Концентрацию лактата и глюкозы в среде определяли ферментативным колориметрическим методом, согласно инструкции производителя наборов (Biocon, Германия) на спектрофотометре Eppendorf (Германия) и затем пересчитывали на 1 клетку по формуле: qMet = [ΔMet] Xv где [ΔMet] величина, на которую изменилась концентрация глюкозы/лактата в среде за 24 часа и Xv среднее количество клеток в данный момент времени. Молярное соотношение продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы (YLa/Glu) рассчитывали как соотношение qLa /qGlu. Выявление и оценку функционального состояния митохондрий в ММСК проводили с помощью флуоресцентного красителя MitoTracker Red 580 (Invitrogen, США). Исследование дифференциальной экспрессии генов проводили в ММСК подвергавшихся 96 часовой экспозиции, а также при постоянном культивировании в условиях 20% и 5% содержания О2. Результаты уровня экспрессии генов ММСК, 9 полученные с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США) сотрудниками фирмы ООО «Геноаналитика» анализировали с помощью базы данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” и “Statistica 7.0” для WinXP. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости p < 0,05. Результаты исследования и их обсуждение Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека Культивируемые ММСК, выделенные из СВФ жировой ткани, представляли собой морфологически гетерогенную популяцию адгезивных клеток, в которой можно выделить треугольные или звездчатые клетки (40-60 мкм), веретеновидные клетки (60-100 мкм) и очень крупные (до 200 мкм) клетки с большим количеством отростков (рис. 1). При субкультивировании ММСК происходила постепенная смена одного типа клеток другим: преобладающие на 1-2 пассаже клетки 1-го и 2-го типа постепенно заменялись клетками 3-го типа, что сопровождалось торможением пролиферации. К 6-му пассажу снова наблюдалось появление клеток 2-го типа и изменение морфологической картины культур ММСК, что вероятно объясняется субселекцией определенной клеточной популяции на данном этапе культивирования. Однако доминирования этого типа клеток не происходило и в последующем в культурах 8-го пассажа снова начинали преобладать крупные распластанные клетки 3-го типа. Пролиферативный потенциал ММСК характеризовался сходной динамикой показателей пролиферативной активности (число удвоения и время удвоения популяции) вне зависимости от количества ядросодержащих клеток после выделения. Сравнительный анализ числа удвоений и времени удвоения популяции позволил выявить общую тенденцию, которая заключалась в поддержании более высокой скорости пролиферации в течение первых 3-х пассажей и ее значительном снижении, как правило, к 4-му пассажу (табл. 1). Более длительное культивирование сопровождалось сокращением числа удвоений и увеличением доли крупных распластанных клеток 3-го типа и клеток, в которых была выявлена активность β-галактозидазы, свидетельствующей об их старении. Пассаж Число удвоений 1 2,2 ± 0,45 Изучаемые 2 поверхностных 3 клетки антигенов, экспрессировали 1,5 ± 0,11 которые ТаблицаВремя 1. Показатели, удвоения, часы ряд регулируют 1,9 ± 0,42 такие процессы как адгезия, миграция, рецепция, ко4 0,8 ± 0,10* 10 характеризующие 78 ± 9 пролиферативную активность ММСК на начальных 96 ± 8этапах культивирования. Данные 87 M ± 18 представлены как ± m, n=5, * - достоверное186 отличие ± 21* от значений на 1 пассаже, p < 0,05. рецепция и межклеточные иммунофенотипический взаимодействия профиль резидентных и формируют ММСК характерный жировой ткани. Иммуноцитохимическое исследование клеток показало стабильную экспрессию ряда поверхностных антигенов, которые в настоящее время широко используются для идентификации ММСК (Gronthos, et al., 2001; Zuk et. al., 2002; Буравкова и др., 2009; Mafi et al., 2011), а именно: HLA-ABC (антиген лимфоцитов человека - A, -B, -C), CD105 (эндоглин, рецептор TGF-β), CD73 (5’-нуклеотидаза), CD90 (рецепторная тирозинкиназа1), а также CD54 (ICAM-1, молекула межклеточной адгезии 1 типа), CD106 (VICAM-1, молекула адгезии клеток сосудов 1 типа) и CD9 (тетраспанин), при этом клетки не экспрессировали маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток, такие как CD45, СD31, СD34, CD62L, СD62Е, СD62P, CD117(c-kit), HLA-DR (рис. 2). При оценке дифференцировочного потенциала ММСК была подтверждена их способность коммитироваться в остеогенном и адипогенном направлении в ответ на присутствие соответствующих стимулов в среде культивирования. Наблюдаемый на 1-ом пассаже достаточно высокой уровень активности щелочной фосфатазы (маркера ранней остеодифференцировки) в клетках, не подвергавшихся индукционным стимулам, значительно снижался к 3-му пассажу. При этом клетки в отсутствии стимулов не формировали минерализованного матрикса, тогда как добавление остеогенных индукторов сопровождалось активной кальцификацией соединительно-тканных структур матрикса (рис. 7, а). ММСК также не дифференцировались спонтанно в адипогенном направлении. В ходе индуцированного адипогенеза клетки приобретали близкую к сферической форму, группировались в кластеры клеток, накапливающих в цитоплазме липидные включения различного размера (рис. 7, б). Таким образом, клетки-предшественники, выделенные из СВФ жировой ткани, характеризовались комплексом морфофункциональных свойств, отражающих их фенотипическую принадлежность к мезенхимальным стромальным клеткам: обладали свойственными этим клеткам морфологическими особенностями и потенциалом к экспансии in vitro, экспрессировали характерные поверхностные маркеры и были способны подвергаться направленной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлении. 11 Рис. 1 Морфологическая гетерогенность ММСК. Представлены клетки первого типа (а), второго типа (б) и третьего типа (в) в культуре 4 пассажа, фазовый контраст, ув. х100 а в б Рис. 2. Иммунофенотип ММСК, выделенных из жировой ткани человека. Представлены репрезентативные данные для клеток 4-го пассажа. б а г в Рис. 3. Морфология ММСК 2-го пассажа при экспозиции в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержания кислорода в среде культивирования, фазовый контраст, ув. х 100. а б в г Рис. 5. Формирование колоний ММСК 2-го пассажа в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) концентрации кислорода. Окраска кристаллвиолетом, ув. х 0,6. 12 Влияние пониженного содержания кислорода на морфофункциональные характеристики ММСК При снижении содержания кислорода популяция крупных клеток 3-го типа уменьшалась, и уже на 2-ом пассаже преобладали клетки 1-го и 2-го типа (рис. 3). Более длительное культивирование в течение 4-х пассажей не вызывало дальнейших морфологических изменений ММСК в условиях 5% О2, тогда как экспансия в условиях 1% и 3% О2 приводила к появлению распластанных клеток с большим количеством отростков. Клетки с морфологией, отличной от наблюдаемой в стандартных условиях культивирования, имели отличия в уровне экспрессии ряда генов. Было отмечено, что в ММСК при 5% О2 уровень экспрессии генов TUBB3, SVIL и ANK2, продукты которых (βтубулин, супервиллин, анкерин) участвуют в примембранной перестройке и стабилизации цитоскелета был выше, а генов TPM2, ACTN1, CNN3, CDC42EP3, CDC42EP1, TAGLN, SGCG, продукты которых (тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки RhoГТФазы, трансгелин и саркогликан-γ) участвуют в формировании адгезионных контактов, взаимодействии с ВКМ и формировании псевдоподий, был ниже, чем в стандартных условиях культивирования (20% О2) (табл. 2). Допуская, что появление клеток 3-го типа связано с их повреждением в процессе культивирования, можно предположить, что приближение концентрации кислорода в среде к тканевому уровню обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества таких клеток, о чем свидетельствует увеличение гомогенности культур ММСК в условиях 5% и 3% О2. Оценка пролиферативного потенциала культивируемых клеток показала, что уменьшение концентрации кислорода (до 5%-1%) способствовало активации пролиферации (на 2-ом пассаже максимальное количество удвоений в 2 раза превышало значение при 20% О2). При этом более выраженный стабильный прирост клеток наблюдался в условиях 5% О2 (рис. 4, а). Уменьшение концентрации кислорода сокращало время лаг-фазы на кривой пролиферации до нескольких часов, тогда как при 20% О 2 лагфаза длилась не менее двух дней (рис. 4, б). Экспансия клеток в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась увеличением числа КОЕ-ф, в то время как при 20% О2 формирования колоний не происходило. Перенос клеток в условия пониженного содержания кислорода (5%-1%) активировал эту способность, максимально выраженную на втором пассаже (рис. 5). Механизм влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный потенциал ММСК остается не совсем понятным. Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток может быть уменьшение окислительного повреждения клеток в результате окислительного стресса (Бурнаевский и др., 2010). 13 Таблица 2. Соотношение уровня дифференциальное экспрессии генов ММСК 2-го пассажа при 5% и 20% О2 . * - достоверное отличие от значений в условиях стандартного содержания кислорода. Апоптоз Метаболизм глюкозы Пролиферация Морфлогия клеток Символ TUBB3 SVIL ANK2 TPM2 ACTN1 CNN3 CDC42EP3 CDC42EP1 TAGLN SGCG FOSB FOSL1 PCNA CCND2 CKS2 CDKN2C HK1 HK2 PFKL PFKP PFKFB3 PFKFB4 ALDOC PKM2 LDHA PDK1 BIRC5 PSEN2 STAMBPL1 BCL2L1 TIMP3 IGFBP3 BNIP3 Интенсивности сигнала 5% / 20% O2 2,2* 2,3* 3,6* 0,5* 0,5* 0,4* 0,3* 0,3* 0,3* 0,2* Продукт β-тубулин, 3 супервиллин анкерин 2 тропомиозин 2 актинин 1 кальпонин 1 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 3 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 1 трансгелин саркогликан-γ белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор AP1 белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор AP1 ядерный антиген пролиферирующих клеток G1/S-специфичный циклин D2 регуляторная единица циклин-зависимой киназы ингибитор циклин-зависимой киназы гексокиназа, изоформа 1 Гексокиназа, изоформа 2 Фосфофруктокиназа, изоформа L Фосфофруктокиназа, изоформа P 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-бисфосфатаза, изоформа 3 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-бисфосфатаза, изоформа 4 альдолаза С пируваткиназа, изоформа M2 лактатдегидрогеназы А киназу пируватдегидрогеназы1 антиапоптотические белок белок IAP пресенилин 2 металлопротеаза, взаимодействующая с FADD антиапоптотический белок Bcl2 ингибитор металлопептидазы 3 белок, связывающий IGF белок, взаимодействующий с Bcl2 4,2* 3,2* 2,1* 2,0* 2,0* 0,4* 1,1 1,1 1,6 1,9 2,1* 1,6 2,1* 1,5 1,5 0,9 3,5* 3,2* 2,4* 2,2* 0,4* 0,3* 0,3* * а б Рис. 4. Пролиферативная активность ММСК в условиях различного содержания кислорода. Представлены средние значения числа удвоения популяций (а) и кривые пролиферации ММСК 2-го пассажа (б), культивируемых в условиях 20%, 5%, 3% и 1% О2. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 6. 14 Рис. 7. Влияние пониженного содержания кислорода на эффективность остеогенеза и адипогенеза ММСК. Гистохимическое выявление компонентов минерализованного матрикса (ализариновый красный) (а) и липидных включений (масляный красный) (б) в культурах ММСК 2-го пассажа и полуколичественный анализ, * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. Рис. 8. Потребление глюкозы (белые столбики) и продукция лактата (черные столбики) (а), молярное cоотношение YLa/Glu (б), средняя интенсивность флуоресценции потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red (в) в ММСК 2-го пассажа в предмонослойной культуре, в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. а б в г Рис. 9. Выявление митохондрий ММСК 2-го пассажа, культивируемых при 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержании кислорода, с помощью потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red. 20% O2 20% → 5% O2 5% O2 5% → 20% O2 а б в г Рис. 10. Выявление колоний, формируемых при 20% (а,г) и 5% (б,в) содержании кислорода клетками: а - постоянно культивируемыми при 20% О2, б – предкультивируемыми при 20% О2, в – постоянно культивируемыми при 5% О2, г - предкультивируемыми при 5% О2. Окраска кристаллвиолетом, ув. х. 0,6. 15 Активация пролиферации ММСК в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась более выраженной экспрессией генов семейства Fos (FOSB, FOSL1), продукты которых формируют транскрипционный фактор AP-1, генов PCNA, CCND2, кодирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток и циклин D2, а также гена CKS2, кодирующего регуляторную единицу циклин-зависимой киназы при значительном подавлении экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) (табл. 2). Можно предположить, что увеличение пролиферативной активности ММСК обусловлено активирующимся в этих условиях JNK сигнальным путем, с последующим образованием транскрипционного фактора AP-1, о чем косвенно свидетельствует увеличение экспрессии генов семейства Fos и гена CCND2, кодирующего циклин D2, экспрессия которого происходит под воздействием этого транскипционного фактора. Активация SAPK/JNK и p38 киназных путей при гипоксии была продемонстрирована во многих типах клеток, в том числе ММСК (Scott et al., 1998; Kunz et al., 2003, Lee et al., 2011). Экспозиция при 5% - 1% О2 на 1-ом пассаже сопровождалась снижением доли клеток, экспрессирующих CD73 и CD54, пропорционально уменьшению концентрации кислорода в среде (рис. 6, а, б), не вызывая изменения количества клеток, экспрессирующих CD105 и CD90. Дальнейшая экспозиция ММСК в условиях пониженного содержания кислорода в течение 3-х пассажей не оказывала влияния на долю CD105+- и CD90+-клеток и способствовала восстановлению количества CD73+- и CD54+-клеток до исходного уровня. Однако, при длительном культивировании в условиях 20% О2 происходило практически двукратное снижение доли CD54+-клеток (рис. 6, в, г). Рис. 6. Количество CD73+- и СD54+-клеток через 6 суток (а,б) и при длительной экспозиции (в,г) в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. 16 Известно, что 5’-нуклеотидаза (CD73) осуществляет гидролиз АМФ до аденозина и фосфата, а ICAM-1 (CD54) выступает в качестве ко-рецептора β2-интегрина. Для выраженной экспрессии этих двух мембранных белков необходима активация клеток такими цитокинами как, IFN-γ, IL-1β (Pober et al., 1986; Muro et al., 1989; Murray, 1988; Stefanovic, 1989). В ряде работ было отмечено, что экспрессия CD73, зависит от уровня содержания кислорода, а гипоксическое состояние провоцирует увеличение концентрации аденозина (Synnestvedt et. al., 2002; Ledoux et. al., 2003). Молекулярные механизмы, приводящие к увеличению аденозина в условиях пониженного содержания кислорода, в настоящий момент активно изучаются. Показано, что увеличение и уменьшение уровня экспрессии CD73 в условиях пониженного содержания кислорода может быть вызвано регуляторными факторами, среди которых активируемый гипоксией транскрипционный фактор HIF-1 и эритроидные транскрипционные факторы -1 и -2 (GATA1 и GATA2) (Synnestvedt et. al., 2002). При исследовании дифференцировочный влияния потенциал пониженного ММСК содержания обнаружено кислорода двукратное на подавление индуцированного остеогенеза как при 5%, так и при 1% О2 (рис. 7, а), тогда как при стимуляции адипогенеза выраженное снижение наблюдалось только при 1% О2 (рис. 7, б). Культивирование ММСК в условиях пониженной концентрации кислорода не вызывало спонтанного коммитирования клеток. Известно, что в условиях низкой концентрации кислорода происходит увеличение фосфорилирования Erk1/2-киназы, которое сопровождается уменьшением экспрессии ключевых транскрипционных факторов Runx2/Cbfa1 и активности ЩФ в клеткахпредшественниках костного мозга (Xiao et al., 2000; Wang et al., 2012). Сохранение экспрессии некоторых адипогенных маркеров ММСК в условиях пониженного содержания кислорода широко обсуждается (Matsumoto et al., 2008; Nobusue et al., 2008). В нашем исследовании сохранение адипогенного дифференцировочного потенциала в условиях 5% содержания кислорода может объясняться более высоким уровнем экспрессии основного адипогенного маркера PPARγ (в 7,5 раза) по сравнению со стандартными условиями культивирования. При оценке метаболизма глюкозы мы обнаружили, что при 20% О2 ММСК потребляли значительно большее количество глюкозы и продуцировали большее количество лактата, чем клетки в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) (рис. 8, а). Для оценки эффективности катаболизма глюкозы в процессе гликолиза использовали молярное соотношение YLa/Glu. Результаты показали, что при приближении культур клеток к состоянию монослоя в условиях 20% О2, несмотря на повышенный 17 уровень продукции лактата в среду, YLa/Glu было ниже, чем при 5%-1% О2 (рис. 8, б). При этом флуоресцентная микроскопия (рис. 9) и цитофлуориметрический анализ окрашенных потенциал-зависимым зондом MitoTraker Red клеток выявили двукратное снижение интенсивности флуоресценции зонда при уменьшении концентрации кислорода (рис. 8, в). Эти данные могут свидетельствовать об увеличении гликолитического вклада в процесс катаболизма глюкозы при уменьшении концентрации кислорода в среде культивирования, что подтверждается увеличенной экспрессией генов, кодирующих ферменты всех стадий расщепления глюкозы в процессе гликолиза. Необходимо отметить, что в условиях 5% О2 экспрессия ряда генов гликолитических ферментов увеличивалась уже через 96 часов экспозиции, среди которых HK1, HK2, кодирующих две изоформы гексокиназы, PFKL, PFKP, кодирующих различные изоформы фосфофруктокиназы, PFKFB3, PFKFB4, гены двух изоформ бифункционального фермента 6-фосфофруктокиназы-2/фруктозо-2,6-дифосфатазы, осуществляющего регуляцию на уровне второго субстратного цикла, ALDOC, гена альдолазы С, PKM2, кодирующего пируваткиназу. При этом отмечается возрастание уровня экспрессии LDHA, гена лактатдегидрогеназы А, и незначительное уменьшение экспрессии гена PDK1, кодирующего киназу пируватдегидрогеназы (табл. 2). Снижение экспрессии PDK1 и увеличение LDHA в ММСК пуповины при уменьшении концентрации кислорода было показано в работе А. Lavrentieva и сотрудников, полагающих, что снижение способности митохондрий к потреблению кислорода в этих условиях происходит в результате фосфорилирования пируватдегидрогеназы киназой пируватдегидрогеназы и подавления поступления пирувата в цикл Кребса (Lavrentieva et al., 2010). Оценка жизнеспособности показала, что длительное культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода не оказывает повреждающего воздействия, более того, наблюдается снижение доли некротических и апоптотических клеток (табл. 3). Таблица 3. Жизнеспособность ММСК 2-го пассажа в условиях различного содержания кислорода. Представлено среднее количество живых (AnnV-/PI-), апоптотических (AnnV+), некротических (PI+) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (AnnV+/PI+). Данные представлены как (М ± m), n =3. условия 20% О2 5% О2 3% О2 1% О2 PI+, % 1,7 ± 0,47 1,4 ± 0,43 1,2 ± 0,23 1,3 ± 0,59 AnnV+/PI+, % 4,6 ± 1,62 4,4 ± 1,44 2,6 ± 0,86 2,2 ± 0,33 AnnV+, % 2,3 ± 0,57 1,8 ± 0,55 1,6 ± 0,64 1,1 ± 0,24 AnnV-/PI-, % 91,4 ± 2,39 92,4 ± 1,74 94,6 ± 1,43 95,5 ± 0,95 Сравнительный анализ уровня экспрессии генов показал, что уменьшение концентрации кислорода сопровождается увеличением экспрессии BIRC5, PSEN2, 18 STAMBPL1, BCL2L1, кодирующих такие антиапоптотические белки как белок IAP, пресенилин 2, металлопротеазу, взаимодействующую с FADD и каспазами 8 и 9 и Bcl2. При этом отмечено уменьшение экспрессии TIMP3, IGFBP3, кодирующих ингибитор металлопептидазы 3, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, экспрессия, которых наблюдается, как правило, на начальных этапах апоптоза (Thomas et. al., 2006; Natsuizaka et al., 2012) и гена BNIP3, продукт которого, взаимодействуя с Bcl2, приводит к выходу цитохрома с из митохондрий (Ray et al., 2000) (табл. 2). В настоящее время механизмы, опосредующие выживание клеток- предшественников в условиях гипоксии активно изучаются. Один из возможных механизмов может осуществляться за счет активации PI3K/Akt-1 сигнального пути (Greijer et al., 2004; Stubbs et al., 2012). В результате в клетках индуцируется экспрессия ядерного транскрипционного фактора мишенями NF-κB, которого являются антиапоптотические белки IAP2, Bcl-2 и Bcl-xL (Quanungo et al., 2004). Таким образом, культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) способствует поддержанию гомогенности активно пролиферирующей, менее коммитированной популяции мезенхимальных клеток-предшественников, сохраняющих высокий уровень жизнеспособности, что коррелирует с изменением экспрессии генов структурных и регуляторных белков цитоскелета, регуляторов клеточного цикла, а также регуляции экспрессии некоторых про- и антиапоптотических белков. Уменьшение концентрации кислорода приводит к снижению потребления клетками глюкозы, увеличению молярного соотношения потенциала митохондрий, что La/Glu сопровождается и уменьшению увеличением трансмембранного экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического пути катаболизма глюкозы. Обратимость эффектов влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный и дифференцировочный потенциал ММСК Оценив эффекты влияния пониженного содержания кислорода на морфофункциональные свойства прогениторных клеток из жировой ткани, нам было важно определить, являются ли наблюдаемые изменения обратимыми. При изучении обратимости эффектов воздействия пониженного содержания кислорода на клоногенный, пролиферативный и дифференцировочный потенциал мы показали, что предкультивируемые в условиях 20% О2 и переставленные в 5% О2 ММСК формируют количество колоний сходное с клетками, постоянно экспонируемыми в условиях 5% О2. Тогда как клетки, предкультивируемые в условиях 5% О2 и перенесенные 19 для оценки этого параметра в 20% О2, формировали значительно меньшее количество колоний уже через 6 суток экспозиции (рис. 10). Подобные изменения наблюдались при оценке пролиферативного потенциала ММСК, предкультивируемых при 5% О2 и подвергавшихся экспансии при стандартных условиях. Уже через 6 часов экспозиции наблюдалось двукратное уменьшение числа удвоений, по сравнению с клетками, культивируемыми при 5% О 2. В культурах ММСК переставленных из 20% в условия 5% содержания кислорода наблюдалось некоторое увеличение числа удвоений популяции, по сравнению со стандартными условиями культивирования (рис. 11, а). Оценка остеогенного и адипогенного дифференцировочного потенциала ММСК показала, что в культурах клеток, предкультивируемых в условиях 20% О2 и переведенных для дифференцировки в условия 5% О2, площадь минерализованного матрикса снижалась до 30% от общей площади как и при дифференцировке ММСК, постоянно культивируемых в условиях 5% О2. При обратном переносе клеток постоянно культивируемых при 5% О2 и помещенных для дифференцировки в условия 20% О2, отмечалось увеличение площади минерализованного матрикса до контрольных значений ~ 50% от общей площади (рис. 11, б). * 2 3 усл. ед. усл. ед. число удвоений 3 2 * 1 1 * 20% 5% 5%-20% 20%-5% 2 1 0 0 0 3 20% 5% 5-20% 20-5% 20% 5% 5%-20% 20%-5% в б а Рис. 11. Оценка пролиферативного, остеогенного и адипогенного потенциала ММСК, индуцируемого при 20% и 5% содержании кислорода в среде. По оси ординат – число удвоений популяции (а), полуколичественная оценка площади, занятой минерализованным матриксом (б) и доли клеток, содержащих внутриклеточные липидные включения (в). * достоверное отличие от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. При оценке эффектов различного уровня содержания кислорода на способность ММСК подвергаться дифференцировке в адипогенном направлении было обнаружено, что индукция в условиях 5% О2 не сопровождалась выраженным подавлением дифференцировки как постоянно культивируемых в этих условиях клеток, так и предкультивируемых в условиях атмосферного содержания кислорода (рис. 11, в). 20 Аналогичный эффект обратимости воздействия пониженного содержания кислорода ранее был показан для ММСК костного мозга, однако этот эффект наблюдался и в отношении дифференцировки в адипогенном направлении (Fehrer et al., 2007). Таким образом, после помещения ММСК, постоянно культивируемых при 5% О 2, в условия атмосферного содержания кислорода их способность к дифференцировке в остеогенном направлении восстанавливается, тогда как ММСК, подвергающиеся экспансии в условиях 20% О2, при помещении в условия пониженного содержания кислорода приобретают признаки менее дифференцированных предшественников, что коррелирует с увеличением пролиферации и образованием КОЕ-ф при 5% О2. В связи с этим, можно предположить, что низкий уровень содержания кислорода (5% О 2) в среде культивирования является, по-видимому, фактором, замедляющим, но не отменяющим процесс коммитирования ММСК. ВЫВОДЫ 1. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% О2) способствует поддержанию морфологической гомогенности культуры ММСК и сопровождается более высоким уровнем экспрессии некоторых генов, продукты которых участвуют в примембранной реорганизации (SVIL, ANK2) и стабилизации цитоскелета (TUBB3). 2. Уменьшение концентрации кислорода (5% - 1% О2) активирует клоногенный потенциал, пролиферацию и вызывает изменение кинетики роста ММСК. Увеличенный уровень экспрессии генов, кодирующих циклины (PCNA, CCND2), циклин-зависимую киназу (CKS2) и низкий уровень экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) коррелирует со стабильно высокой пролиферацией ММСК при 5% О2. Более низкий уровень концентрации кислорода (3% - 1%) оказывает наибольший стимулирующий эффект на начальных этапах экспозиции. 3. Длительное культивирование ММСК in vitro не влияет на экспрессию основных поверхностных антигенов стромальных клеток – CD54, CD73, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC. Экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода (5% 1% О2) вызывает кратковременное (в течение 1 пассажа) изменение популяционного состава, проявляющееся в сокращении доли CD54+- и CD73+-клеток с последующим возвращением их числа к исходному уровню. 4. Экспансия ММСК in vitro сопровождается постепенной элиминацией клеток, спонтанно экспрессирующих щелочную фосфатазу. При индукции дифференцировки 21 ММСК в условиях пониженного содержания кислорода показано, что замедление процесса коммитирования клеток в остеогенном направлении отмечается при 5% и 1% О2, тогда как выраженное подавление направленной дифференцировки в адипогенном направлении происходит только при 1% О2. 5. Показано, что культивирование ММСК при различном содержании кислорода (20%, 5%, 3%, 1% О2) сопровождается сокращением потребления глюкозы и продукции лактата, что соотносится с кинетикой роста культуры. Экспансия ММСК до состояния предмонослоя в условиях пониженного содержания кислорода сопровождается увеличением уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза (ALDOC, PFKFB, LDHA, PGK-1, FBP-1 и др.), увеличением молярного соотношения La/Glu и снижением трансмембранного потенциала митохондрий. 6. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% О2) не оказывает повреждающего воздействия на ММСК. Отмечено снижение доли апоптотических клеток в результате NF-κB-зависимого увеличения уровня экспрессии антиапоптотических белков-регуляторов апоптоза (STAMBPL1, BIRC5, BCL2L1), а также уменьшения экспрессии проапоптотических белков (TIMP3, BNIP3, IGFBP3). 7. Постоянная экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода поддерживает клетки в менее коммитированном состоянии. Эффекты пониженного содержания кислорода на ММСК являются обратимыми: увеличение концентрации кислорода с 5% до 20% сопровождается уменьшением клоногенного, пролиферативного и увеличением остеогенного дифференцировочного потенциала. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б., Рылова Ю.В., Косовский Г.Ю. Пониженное содержание О2 замедляет коммитирование культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников из жировой ткани в ответ на остеогенные стимулы.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 147. – № 6. – С. 704-707. 2. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Рылова Ю.В. Модификация свойств мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани с помощью снижения содержания кислорода в среде культивирования. // В кн. «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения». Под редакцией В.А. Ткачука. – М.: Литтерра, 2009, С. 125-145. 3. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Пролиферация и метаболический статус мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани при различном содержании кислорода в среде культивирования. // Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2010. – Т.44. – №5. – С.38-41. 4. Буравкова Л.Б., Рылова Ю.В., Гальчук С.В., Андреева Е.Р. Особенности метаболизма и экспрессии генов ММСК из жировой ткани человека, культивируемых при различном содержании кислорода. // В кн. «Стволовые клетки и регенеративная медицина». Под редакцией В.А. Ткачука. – М.: Макс Пресс, 2010, С. 113-130. 22 5. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Rylova J.V., Grigoriev A.I. Resistance of multipotent mesenchymal stromal cells to anoxia in vitro. // Anoxia, InTech, Texas, USA, 2012, P.61-80. 6. Рылова Ю.В. Культивирование мезенхимальных стромальных клетокпредшественников из жировой ткани при пониженном содержании кислорода. // VIII «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики. г. Москва, 2009. С. 45-46. 7. Рылова Ю.В., Гальчук С.В., Буравкова Л.Б. Влияние аноксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из жировой ткани человека. // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». г. Звенигород, 2009, С. 78. 8. Рылова Ю.В. Метаболический статус и пролиферативный потенциал МСК при различном содержании кислорода в среде культивирования. // IX «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная Дню космонавтики. г. Москва, 2010. С.66-67. 9. Рылова Ю.В. Модификация способа культивирования мультипотентных мезенхимальных сромальных клеток с целью применения в клеточной инженерии. // Всероссийская научная школа по биомедицинской инженерии «БМИ – 2010». г. СанктПетербург, 2010, С.21-28. 10. Рылова Ю.В. Кислород - опосредованное изменение дифференциальной экспрессии генов ММСК из жировой ткани. // X «Конференция молодых ученых, специалистов и студентов», посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос. г. Москва, 2011. С. 59. 11. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Изменения экспрессии генов ММСК из жировой ткани культивируемых при пониженном содержании кислорода. // VI Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция». г. Москва, 2011. 12. Rylova J.V., Grinakovskaya O.S., Andreeva E.R., Buravkova L.B. The long-term effects of reduced oxygen tension on cultured mesenchymal stem cells. // French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers, France, 2010. P. 44. 13. Rylova J.V., Andreeva E.R., Buravkova L.B. Metabolic and gene expression profile of MMSCs under low oxygen. // World Conference on Regenerative Medicine. Leipzig, Germany, 2011. 14. Buravkova L.B., Andreeva E.R., Rylova J.V. O2-influence on MMSCs metabolic and differentiation status. // 2nd International Conference on Medical Physiology «Recent researches in modern medicine». Cambridge, UK, 2011. P. 43-48. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ММСК – мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки СВФ – стромально-васкулярная фракция ВКМ – внеклеточный матрикс CD – кластер дифференцировки FITC – флюоресцеинизотиоционат PE – фикоэритрин SAPK – стресс-активируемая киназа семейства митоген-активируемых киназ PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа AP-1 – белок активатор 1 IAP – белок ингибирующий апоптоз IGF – инсулиноподобный фактор роста Akt или PKB – протеинкиназа В FADD – Fas-ассоциированный белок с доменом гибели (Fas-Associated protein with Death Domain) JNK – C-Jun N-концевая киназа (c-Jun N-terminal kinase) 23