Ахмерова Лариса Григорьевна - Институт цитологии и генетики
advertisement
на правах рукописи УДК 576.3:577.17.05:591.3:599.323.4 Ахмерова Лариса Григорьевна ДИАЛЛЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТАНОВЛЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ КЛЕТОК ЛЕЙДИГА В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ 03.00.15. – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2007 1 Работа выполнена в лаборатории эндокринологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Научный руководитель: кандидат биологических наук Осадчук Александр Владимирович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Маркель Аркадий Львович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, профессор Мошкин Михаил Павлович, Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, г. Санкт-Петербург Защита состоится “__“ ______________2007 г. на утренн ем заседании диссертационного совета на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц зале (630090, г. Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, д. 10, тел. (383)333 31-17; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан “___” _______________2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 Актуальность проблемы. В изучении происхождения, роста и регуляции функционирования клеток Лейдига в пре и постнатальном онтогенезе млекопитающих за последнее время достигнуты большие успехи. Известно, что в ходе постнатального развития они проходят через определенные этапы развития клеточной пролиферации и дифференцировки, достигая своей дефинитивной формы (у крыс и мышей) приблизительно к концу периода полового созревания. Главным фактором, регулирующим этот процесс, является гормон аденогипофиза – лютеинезирующий гормон (ЛГ). Однако, регуляция стероидогенеза в клетках Лейдига – сложный процесс, в который вовлечены практически все уровни гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной системы. К тому же, в различные периоды онтогенеза, в ходе сложного "жизненного цикла" клеток Лейдига, значение того или иного уровня регуляции меняется (Tähkä, 1986; Saez, 1994; Ge et al., 1996; Huhtaniemi, 1996; Pelliniemi et al., 1996; Lejeune et al., 1998). С одной стороны, для исследования стероидогенной функции семенников широко используется метод инкубации к леток Лейдига in vitro (Bilińska, Szołtys, 1981; Chase, Payne, 1983; Ge et al., 1999; Sultana et al., 2000). С другой стороны, использование моделей инбредных линий животных с известными функциональными характеристиками клеток Лейдига дает возможность оцен ить влияние генетических факторов на исследуемые эндокринные показатели. Ранее, в исследованиях на клетках Лейдига у взрослых мышей шести инбредных линий (PT, YT, DD, C57BL/6J, A/He и CBA/Lac), была выявлена межлинейная изменчивость по цАМФ - и субстратзависимой продукции тестостерона, которая носила координированный характер, и в ее основе лежала коррелятивная изменчивость по четырем активностям микросомальных ферментов стероидогенеза (Осадчук, Свечников, 1994, 1995, 1998). Во-первых, обнаруженная нами меж линейная изменчивость по гормональной функции клеток Лейдига у взрослых самцов позволяет изучить становление дефинитивных н аследственных различий в гормональной активности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе. Во-вторых, дальнейшее обоснование координированности генетического контроля нуждается в проведении генетического (гибридологич еского) анализа тестикулярного стероидогенеза. Очевидно, что гормональная функция гонад – это сложный фенотипический признак, характер наследования и формирование которого в ходе онтогенеза может зависеть как от стадии постнатального онтогенеза, в частности, от стадии 3 дифференцировки клеток Лейдига, так и от множества других регуляторных процессов. В свою очередь, каждый из этих процессов определяется функционированием ряда генов. В основе наследственной изменчивости гормональной функции мужской репродуктивной системы может лежать генетическая изменчивость по любому из звеньев гипоталамо-гипофизарно-семенникового комплекса. Поэтому, изучение генетического контроля гормональной функции мужских гонад и, в частности, формирования наследственной изменчивости в ходе постнатального развития, является фундаментальной задачей в решении проблемы генетической детерминации репродуктивной функции. В данной работе, с целью изучения процес са формирования дефинитивного паттерна наследования гормональной функции клеток Лейдига в ходе постнатального развития у контрастных по андроген-зависимым признакам линиям мышей, проведено исследование различных цАМФ- и субстрат-зависимых звеньев биосинтеза тестостерона клетками Лейдига in vitro и изучение формирования генетических компонент фенотипической изменчивости по продукции тестостерона клетками Лейдига при действии различных стимуляторов стероидогенеза. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выявлении возрастных закономерностей и межлинейных особенностей формирования гормональной функции клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе в критические периоды развития и в выяснении генетического контроля этого процесса у 16 кроссов диаллельной матрицы между 4 линиями лабораторных мышей, контрастных по гормональной активности клеток Лейдига взрослых самцов. В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи: 1. На самцах, полученных по полной схеме диаллельных скрещиваний, исследовать влияние генотипа и возраста животных, а также взаимодействия этих двух факторов на горм ональную реактивность клеток Лейдига при действии различных стимуляторов стероидогенеза: хорионического гонадотропина, цАМФ и прегненолона в ходе постнатального ра звития. 2. Изучить формирование наследственных различий по гормональной реактивности клеток Лейдига по их цАМФ - и субстрат зависимой продукции тестостерона при половом созревании. 3. Установить, на какой стадии онтогенеза появляется наследственная межлинейная изменчивость, свойственная взрослым самцам выбранных контрастных генотипов, и какие изменения она претерпевает в ходе постнатального развития. 4 4. Изучить формирование генетических компонент фенотипической изменчивости по продукции тестостерона клетками Лейдига в критические периоды постнатального созревания при действии различных стимуляторов стероидогенеза. Следует отметить, что для решения поставленных задач нами был использован системный подход – сочетание физиологического исследования и генетического анализа для оценки генотипической изменчивости in vitro и характера наследования гормональной реактивности клеток Лейдига в ходе постнатального развития. Научная новизна исследования. В данном исследовании впервые на основе системного подхода к изучению гормональной активности клеток Лейдига в сочетании с генетическим диаллельным анализом установлены существенные наследственно обусловленные различия по гормональной функции клеток Лейдига при половом созревании. Важным фактом является координированный генетический контроль всех трех изученных показателей гормональной активности клеток Лейдига, что отражает их цАМФ- и субстрат-зависимую реактивность. Установлено, что в ходе постнатального развития показатели стероидогенной активности клеток Лейдига претерпев ают существенные и индивидуальные для каждой линии (кросса) изменения, достигая своей дефинитивной формы лишь к возрасту двух месяцев, что связано с окончанием полового созревания. Настоящую работу следует рассматривать как пионерскую в данной области исследования, поскольку впервые проведен генетический анализ характера наследования особенностей функционирования гормональной активности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе в ходе полового созревания. Положения, выносимые на защиту. В результате проведенного генетического анализа впервые было установлено наличие значительных генотипических и возрастных различий по цАМФ- и субстрат-зависимой реактивности клеток Лейдига мышей в постнатальном онтогенезе у контрастных по андроген -зависимым признакам линий мышей. Установлено, что данный признак имеет, главным образам, аддитивный характер наследования. Генетический контроль гормональной активности клеток Лейдига оказался координированным и в то же время полигенным. Теоретическая и практическая значимость исслед ования. Полученные результаты развивают теоретическое представление о закономерностях развития в онтогенезе гипоталамо -гипофизарнотестикулярной системы, функциональной активности клеток Лейдига при половом созревании и особенностях характера наследования гормональной функции клеток Лейдига. Исследования выполнены на стыке наук – генетики и физиологии (эндокринологии). В работе было использовано сочетание методов 5 этих дисциплин: различные линии животных и генетический метод анализа и изучение гормональной активности интерстициальных клеток в постнатальном онтогенезе при инкубировании in vitro. В настоящей работе генетический диаллельный анализ системной регуляции гормональной функции клеток Лейдига выполнен на четырех контрастных по андроген -зависимым признакам линиях лабораторных мышей (PT, BALB/c, A/He и CBA/Lac), а также реципрокных гибридах первого поколения между всеми указанными родительскими линиями. Данное исследование расширяет представления о механизмах генетического контроля формирования эндокринно й функции половых желез самцов при половом созревании, что может способствовать выработке стратегии идентификации и картирования генетических локусов, детерминирующих наследственные различия по тестикулярному стероидогенезу. Апробация работы. Результаты работы были представленны на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 1999, 2003), на IV съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2002), на международной конференции "Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии" (Новосибирск, 2002), на международном симпозиуме "Genetic and developmental psychoneuroendocrinology" (Новосибирск, 1999), на II и III съездах ВОГиС (Санкт -Петербург, 2000; Москва, 2004), а также на 16-й международной конференции "International Mouse Genome Conference" (San Antonio, USA, 2002). По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ. Структура и объём работы. Диссертация изложена на 149 стр. текста, содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который включает 224 литературных источника, из них 201 иностранный. Материалы диссертации включают 13 рисунков и 8 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальные животные. Использовали самцов мышей 4 инбредных линий: BALB/c, PT, A/He, CBA/Lac 16 кроссов в возрасте 20, 35, 60 и 100 суток, полученных по полной схеме диаллельных скрещиваний (Табл. 1). Для упрощения изложения материала нами введены дополнительные обозначения генотипов: для линии A/He − А, для CBA/Lac − CBA, для BALB/c − общепринятое обозначение С и для РТ без изменения. 6 В обозначениях генотипов гибридов F1 Таблица 1. Полная матрица диаллельных первая буква соответствует скрещиваний между четырьмя линиями генотипу самки, вторая – лабораторных мышей самца. Данные линии выбраны как наиболее самцы контрастные по С PT CBA A самки гормональной активности Х12 Х13 Х14 С С клеток Лейдига взрослых самцов, по уровню Х21 Х23 Х24 PT PТ тестостерона в плазме Х31 Х32 Х34 CBA CВА крови, репродуктивному успеху и социальному Х41 Х42 Х43 A A доминированию. Количество животных в каждой возрастной группе одного кросса составляло в среднем 11 самцов. Всего в эксперименте использовали 701 самца. Стимуляторы стероидогенеза. Хорионический гонадотропин (ХГ): концентрация в инкубационной среде с клетками Лейдига составляла 50 мЕД/мл ("Serva", USA); Дибутирил-цАМФ (цАМФ): концентрация в инкубационной среде − 200 мкМ ("Calbiochem", Switzerland); Прегненолон: концентрация в инкубационной среде − 2 мкг/мл ("Sigma", USA). Кроме того, использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция 5 ("Sigma", USA) в виде 0.1% раствора в среде Игла. Инкубирование клеток Лейдига in vitro. Мышей забивали путем декапитации, извлеченные семенники декапсу лировали и помещали в среду Игла, насыщенную карбог еном (95%О 2 +5%СО 2 ) и содержащую 0.1% БСА. Семенники диспергировали, т.е. последовательно пропускали через набор наконечников для автоматического дозатора объемом 5 см 3 , выпускные отверстия которых имели постепенно уменьшающиеся диаметры. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с величиной отверстий около 90 мкм, клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в 1 мл среды Игла. Данная методика позволяет получить суспензию, содержащую 4050% клеток Лейдига, выживаемость составляет около 90%. Кол ичество клеток Лейдига подсчитывали в камере Горяева с помощью микроскопа с фазово-контрастным объективом (увеличение ×400). Их идентифицировали по специфическому ярко-желтому свечению в среде Игла, содержащей феноловый красный (10 г/л). Полученную суспензию клеток разводили средой Игла до рабочей концентрации 7 таким образом, чтобы в 1 мл ее содержалось: 10 5 клеток Лейдига для 60- и 100-суточных животных; 0.75 10 5 клеток для 35суточных и 0.25 10 5 клеток для 20-суточных животных. Суспензию клеток в объеме 100 мкл, содержащую соответственно возрасту 10000, 7500 и 2500 клеток Лейдига, инкубировали со 100 мкл препарата. Для определения контрольной продукции клетки инкубировали со 100 мкл среды без стимуляторов. Продукцию тестостерона пересчитывали в нг на 10 5 клеток Лейдига за 3 часа для всех возрастов. Количество тестостерона в инкубационной среде определяли радиоиммунологическим методом при помощи [1, 2, 6, 7 3 H]тестостерона ("Amersham", Санкт -Петербург) и высоко специфической антисыворотки, полученной из Института физиологии РАН им. И.П. Павлова (г. Санкт -Петербург). В эксперименте определено содержание тестостерона в 2804 пробах. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку материала проводили на основе одно - и двухфакторного дисперсионного анализа, корреляционного анализа и регрессионного анализа с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 5.0). Различия между выборо чными средними оценивались с использованием методов множественных сравнений Newman-Kauls или планируемых сравнений, главным образом, при двухфакторном дисперсионном анализе. Использование сравнений в рамках о днофакторного анализа дополнительно отмечали. Дальнейшую статистическую обработку материала проводили на основе методов многомерной статистики (метод главных компонент) с использованием пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 5.0) и дисперсионного анализа по Райту, запрограммированного в пакете электронных таблиц EXCEL. Дисперсионный диаллельный анализ. Метод позволяет разложить генотипическую вариансу на вариансу общей комбинационной способности, которая определяется в основном аддитивным действием генов, вариансу специфической комбинационной способности, зависящей от генов с доминантными и эпистатическими эффектами, и на вариансу реципрокных эффектов. Для каждой из родительских линий (х i i ) среднее определяется просто ее отклонением (v i ) от среднего родительского уровня (m v ): x i i =m v +2v i +e i i . Для гибридов 1-го поколения, т.е. для внедиагональных элементов диаллельной матрицы, среднее определяется более сложным образом по уравнению x i j =m v +h+g i +g j +s ij +r i +r j +r ij +e i j и зависит от следующих параметров: 8 1) от эффекта среднего гетерозиса или среднего доминирования (h), который определяется как разность между средним по всем гибридным комбинациям F1 и средним родительским уровнем; 2) от эффектов общей комбинационной способности i-ой линии (g i ), равных среднему проявлению признака в тех гибридных комбинациях, где присутствует данный генотип; 3) от специфической комбинационной способности (s ij ), равной отклонениям в реципрокных суммах, не описываемых эффектами общей комбинационной способности; 4) от реципрокных эффектов. Последние разлагаются на два эффекта: средний реципрокный эффект i -ой линии (r i ), равный разности между средним проявлением признака в гибридных комбинациях, в которых данная линия используется как отцо вская и материнская, и остаточный реципрокный эффект (r ij ), который равен отклонениям, не учтенным в средних реципрокных эффектах. Случайные отклонения e ij =1/n ij ∑e ijk (где i,j=1,…,p; k=1,…,n ij ) независимы и нормально распределены. При этом налагаются следующие ограничения: ∑g i =0, ∑s i j =0, ∑r ij =0, s ij =s j i , r i j =-r ji . Вышеуказанные эффекты рассчитывали для каждого кросса. Результаты исследований Результаты дисперсионного анализа как контрольной, так и стимулированной ХГ, цАМФ и прегненолоном продукции тестостерона клетками Лейдига показали, что она существенно изменялась с возрастом и зависела от генотипа (Табл. 2, Рис. 1). Наибольшую среднюю контрольную продукцию тестостерона имели кроссы (C х PT)F1 и (C х CBA)F1, а наименьшую (CBA х A)F1 и (A х CBA)F1 (р<0.05). В возрасте 35 суток контрольная продукция тестостерона кросса (C х PT)F1 в 2.3 раза превышала среднее значение продукции остальных 15 кроссов (F 1 ,636 =22.74, p<0.00001). Влияние генетических факторов на контрольную продукцию тестостерона клетками Лейдига значительно модифицировалось в ходе полового созревания мышей. Об этом свидетельс твуют изменение степени межгрупповых различий в постнатальном онтогенезе и изменение порядка (ранга) кроссов по контрольной продукции тестостерона в постнатальном онтоген езе (Рис.2а), на что указывает отсутствие достоверных межгрупповых корреляций между показателями контрольной продукции в различные возрастные периоды (Табл. 3). Продукция тестостерона клетками Лейдига при их стимуляции ХГ, цАМФ и прегненолоном значительно с ильнее, чем контрольная, зависела от возраста животного (Табл. 2). При добавлении в инкубационную среду стимуляторов максимальную усредненную по возрасту продукцию имели клетки Лейдига кроссов ( C x PT)F1, (PT x C)F1, а минимальную кроссов (CBA x A)F1 и A (p<0.04). 9 Однако существенное влияние эффекта взаимодейс твия главных факторов генотипа и возраста животного (Табл. 2) указывает на значительные изменения характера генетических различий в реактивности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе. Таким образом, характер наследственных различий в реактивности клеток Лейдига к ХГ, цАМФ и прегненолону в различные периоды постнатального развития претерпевал существенные изменения. Таблица 2. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа цАМФ- и субстрат-зависимой продукции тестостерона клетками Лейдига в постнатальном онтогенезе в полных диаллельных скрещиваниях между четырьмя инбредными линиями мышей (Ахмерова и др. Генетика. 2002. Т. 38. №2. С. 196 -206) Источник изменчивости Контрольная продукция: Генотип Возраст Взаимодействие Случайные отклонения Продукция, стимулированная ХГ: Генотип Возраст Взаимодействие Случайные отклонения Продукция, стимулированная цАМФ: Генотип Возраст Взаимодействие Случайные отклонения Продукция, стимулированная прегненолоном: Генотип Возраст Взаимодействие Случайные отклонения Число степеней свободы df Средний квадрат M Критерий Фишера F Уровень значимости p 15 3 45 636 6745.80 32093.07 5117.81 2601.27 2.59 12.34 1.97 0.001 0.00001 0.0002 15 3 45 636 643047 7.18 13803300 154.06 384525 4.29 89595 0.00001 0.00001 0.00001 15 3 45 636 378335 3.50 15440000 142.71 368270 3.40 108187 0.00001 0.00001 0.00001 15 3 45 636 2245207 6.84 40951800 124.76 1485049 4.52 328251 0.00001 0.00001 0.00001 В период полового созревания процесс становления стероидогенной функции клеток Лейдига семенников протекал по разному у 16 изученных нами кроссов: каждый кросс имел свою характерную онтогенетическую динамику продукции тестостерона. В период 2035 суток установлено препубертатное п овышение стимулированной продукции тестостерона различной интенсивности у 16 диаллельных кроссов. В результате чего в 10 Тестостерон (нг / 105 клеток / 3ч) контроль ХГ цАМФ прегненолон 1500 1200 900 600 300 50 25 0 20 40 60 80 100 Возраст (сутки) Рис. 1. Среднее изменение показателей цАМФ- и субстрат-зависимой реактивности клеток Лейдига по 16 кроссам в постнатальном онтогенезе возрасте 35 суток межгрупповые различия между отдельными кроссами при стимуляции биосинтеза тестостерона достигли 3-4-кратных величин. Самая высокая продукция тестостерона при действии любого из трех стимуляторов обнаружена в возрасте 35 суток у кросса (CBA PT)F1. У этого кросса по данному признаку наблюдается сверхдоминирование. Анализ генотипических (межгрупповых) корреляций между показателями реактивности клеток Лейдига к различным стимуляторам стероидогенеза не выявил достоверных связей в возрастные периоды 20-35 и 35-60 суток, что подтверждает перераспределение рангов кроссов к 60-м суткам. Корреляции между показателями гормональной активности были выражены только между 60 и 100 сутками после рождения (Табл. 3), т.е. к концу пубертатного периода развития. Именно к 60 суткам после рождения у самцов мышей начинает складываться дефинитивный паттерн наследования гормональной активности клеток Лейдига. Причем в конце полового созревания и у взрослых животных F1 реципрокные гибриды обеих высоко реактивных и обеих низко реактивных линий имели аналогичную родительским линиям гормональную активность клеток Лейдига: потомки высоко реактивных линий имели также высокие показатели, а потомки низко реактивных линий – низкие. По степени активации стероидогенеза ХГ, цАМФ и прегненолоном в клетках Лейдига в исследованные возрастные периоды порядок (ранг) кроссов оставался практически одинаковым (Рис. 2, б-г). Следовательно, в каждом исследованном возрастном периоде постнатального онтогенеза нами установлена координированная генетическая изменчивость по трем показателям гормональной активности клеток Лейдига их цАМФ- и субстрат зависимой продукции тестостерона. Наличие сильных положительных межгрупповых (генотипических) корреляций между всеми тремя показателями их реактивности в изученные возрастные периоды также указывает на координированный генетический контроль гормональной активности клеток Лейдига. В основе этой координации, как и у взрослых животных, может лежать коррелятивная межлинейная 11 изменчивость активностей микросомальных ферментов стероидогенеза (Осадчук, Свечников, 1995, 1998), которая, в свою очередь, может зависеть от координированной экспрессии их генов в исследованные периоды постнатального развития. Генетический диаллельный анализ гормональной функции клеток Лейдига. Метод главных компонент корреляционной матрицы для каждого из четырех периодов постнатального онтогенеза (20, 35, 60 и 100 суток) выявил, что генетическая изменчивость, соответственно на 91, 87, 83 и 92%, определяется одной компонентой или фактором, что также указывает на координированный генетический контроль их гормональной активности. Поскольку значения факторных нагрузок для выделенного фактора в каждом возрастном периоде оказались высокими и имели положительные значения, то, следовательно, мы можем ввести интегральную оценку – координированную реактивность клеток Лейдига (КРКЛ), что позволит провести генетический анализ гормональной активности клеток Лейдига на основе КРКЛ и значительно облегчит изложение и восприятие материала. При помощи метода главных компонент удалось эффективно, без потери существенной информации сократить размерность анализируемых признаков (нормализация на среднее значение п ризнака по всем кроссам), получить интегральную оценку гормональной активности клеток Лейдига и провести ее генетический анализ. Значения фактора КРКЛ были вычислены для каждого кросса в каждом возрастном периоде. Как и следовало ожидать, межкроссная вариабельность по выделенным факторам являлась фактически интегральным отражением наследственно обусловленной изменчивости по исследуемым показателям цАМФ и субстрат-зависимой продукции тестостерона клетками Лейдига in vitro (Рис. 3). Иными словами, динамика к оординированной реактивности клеток Лейдига, построенной для каждого из 16 кроссов по всем трем стимуляторам, практически совпадает с таковой для межгрупповой изменчивости реактивности клеток Лейдига при действии любого из трех стимуляторов стероидогенеза (Рис. 2, б-г). Для того чтобы выяснить, какие эффекты детерминируют выявленные онтогенетические особенности генотипической изменчивости, проведен генетический диаллельный анализ гормональной функции клеток Лейдига в критические периоды постнатального онтогенеза (как по трем показателям реактивности клеток Лейдига, так и по их интегральной оценке – КРКЛ), рассчитаны оценки вышеопределенных генотипических эффектов и произведена оценка их значимости по критерию Фишера. Дисперсионный диаллельный анализ показал, что генетическая изменчивость во все исследованные периоды постнатального онтогенеза зависит, главным образам, от межлинейных эффектов 12 Таблица 3. Матрица парных коэффициентов межгрупповой (генотипической) корреляции между цАМФ - и субстрат-зависимой продукциями тестостерона клетками Лейдига в различные периоды постнатального онтогенеза в полных диаллельных скрещиваниях между четырьмя инбре дными линиями мышей (Ахмерова и др. Генетика. 2002. Т. 38. №2. С. 196-206) Признаки 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16. Прегн100 1. Контр.-20 2. ХГ-20 3. цАМФ-20 4. Прегн.-20 5. Контр.-35 6. ХГ-35 7. цАМФ-35 8. Прегн.-35 0.51 0.13 0.46 -0.07 0.06 -0.04 0.06 0.23 0.21 0.16 0.21 0.20 0.02 -0.10 0.15 0.81 0.93 -0.16 -0.30 -0.33 -0.27 0.12 0.19 0.13 0.13 0.42 0.06 -0.06 0.11 0.84 -0.04 -0.42 -0.45 -0.47 -0.12 0.03 0.03 -0.08 0.43 0.10 0.01 0.03 -0.21 -0.30 -0.38 -0.32 0.26 0.37 0.31 0.29 0.36 0.17 0.04 0.19 0.06 0.32 0.07 -0.04 -0.18 -0.23 0.04 0.45 0.43 0.37 0.34 0.82 0.85 -0.16 0.15 -0.02 -0.07 -0.01 0.07 0.03 0.05 0.73** -0.05 0.00 -0.21 -0.15 0.17 0.13 0.03 0.16 -0.03 0.25 0.13 -0.02 0.08 0.21 0.11 0.04 0.60 0.60 0.56 0.20 0.50 0.42 0.61 0.95 0.67 0.01 0.55 0.50 0.41 0.62 -0.06 0.52 0.52 0.34 -0.10 0.45 0.39 0.49 0.54 0.32 0.45 0.93 0.87 9. Контр.-60 10. ХГ-60 11. цАМФ-60 12. Прегн.-60 13.Контр.-100 14. ХГ-100 0.84 15. цАМФ-100 Примечание: Контр. контрольная продукция тестостерона клетками Лейдига у самцов в возрасте 20, 35, 60 и 100 суток. ХГ, цАМФ и Прегн. продукция тестостерона, стимулированная, соответственно, хорионическим гонадотропином, дибутирил-цАМФ и прегненолоном в те же временные периоды. p<0.05; p<0.01; p<0.001 13 5 Тестостерон (нг/ 10 клеток/ 3ч) 5 Тестостерон (нг/ 10 клеток/ 3 ч) а 160 140 120 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100 б 1500 1250 1000 750 500 250 0 20 40 в 1500 1250 1000 750 500 250 0 20 40 60 Возраст(сутки) 60 80 100 Возраст(сутки) 80 100 5 Тестостерон (нг/ 10 клеток/ 3ч) 5 Тестостерон (нг/ 10 клеток/ 3ч) Возраст (сутки) г 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 Возраст(сутки) Рис.2. Межгрупповые различия в контрольной (а) продукции тестостерона клетками Лейдига и при стимуляции ХГ (б), цАМФ (в) и прегненолоном (г) in vitro в постнатальном онтогенезе у мышей 16 кроссов диаллельной матрицы. Обозначения линий кроссов даны на Рис. 3 14 (v i ), эффектов общей комбинационной способности остаточных реципрокных эффектов (r i j ) (Табл. 4). ( gi) и Поскольку, в каждом исследованном периоде постнатального онтогенеза наблюдали коррелятивную межгрупповую изменчивость по всем трем параметрам реактивности клеток Лейдига, то, очевидно, что характер наследования, как этих признаков, так и их интегрального показателя КРКЛ, был практически одинаков. Поэтому, очевидно, что для дальнейшего изложения результатов достаточно привести данные по КРКЛ (Рис. 3). Для выяснения формирования генетического контроля гормональной функции клеток Лейдига в ходе постнатального развития был проведен анализ онтогенетической изменчивости вышеуказанных генетических эффектов. Оказалось, что онтогенетическая динамика межлинейных эффектов и эффектов общей комбинационной способности очень схожа. Очевидно, что онтогенетический паттер н этих эффектов является главной причиной формирования дефинитивного паттерна наследования гормональной функции клеток Лейдига к концу периода полового созревания (60 суток) и последующего его поддержания до 100 -суточного возраста. Таблица 4. Результаты дисперсионного диаллельного анализа (данные представлены только по КРКЛ) Признаки df Источник вариации 1. КРКЛ 20 суток 2. КРКЛ 35 суток 3. КРКЛ 60 суток 4. КРКЛ 100 суток F р F р F р F р Компоненты математической модели 3 1 3 4 3 vi h gi sij ri 5.06 0.002 3.51 0.02 1.67 0.18 20.03 0.000 0.63 0.43 2.95 0.09 56.59 0.000 1.43 0.23 9.00 0.000 9.19 0.000 12.18 0.000 28.79 0.000 0.82 0.44 4.68 0.01 1.33 0.27 1.95 0.15 3.18 0.03 1.72 0.16 1.33 0.27 8.76 0.000 3 rij 5.95 0.001 3.17 0.03 7.59 0.000 6.67 0.000 Df для Ме 156 156 147 178 Примечание: КРКЛ − координированная реактивность клеток Лейдига; F − F-критерий; v i − межлинейные эффекты; g i − эффекты общей комбинационной способности; r i j − остаточные реципрокные эффекты; h − гетерозис; s ij − специфическая комбинационная способность; r i − средний реципрокный эффект; r ij − остаточный реципрокный эффект. Достоверные значения (р<0.05) выделены жирным шрифтом. 15 C (CxPT)F1 (CxA)F1 (CxCBA)F1 (PTxC)F1 PT (PTxA)F1 (PTxCBA)F1 (AxC)F1 (AxPT)F1 A (AxCBA)F1 (CBAxC)F1 (CBAxPT)F1 (CBAxA)F1 CBA 3,0 2,5 КРКЛ 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 20 40 60 80 100 Возраст (сутки) Рис. 3. Формирование межгрупповой (генотипической) изменчивости КРКЛ у мышей16 кроссов диаллельной матрицы в постнатальном онтогенезе C PT A CBA 0,8 Межлинейные эффекты Эффекты общей комбинационной способности Об этом свидетельствует практически одинаковый порядок и динамика данных рассчитанных генетических эффектов между 60 и 100 сутками после рождения (Рис. 4, 5). Как у межлинейных эффектов, так и у эффектов общей комбинационной способности в возрастной период 20-60 суток происходит реверсия значений. 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 20 40 60 80 100 Возраст (сутки) Рис. 4. Изменение межлинейных эффектов по КРКЛ в постнатальном онтогенезе у мышей 0,8 0,6 0,4 С РТ А СВА 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 20 40 60 80 100 Возраст (сутки) Рис. 5. Изменение эффектов общей комбинационной способности по КРКЛ в постнатальном онтогенезе у мышей Межлинейные различия в КРКЛ, появляющиеся в возрастном периоде 60-100 суток после рождения (Рис. 4), повторяются в среднем и у гибридов первого поколения в тот же возрастной 16 период, что отражено в динамике эффектов общей комбинационной способности (Рис. 5). Этот факт свидетельствует о том, что в Остаточные реципрокные эффекты детерминации дефинитивного паттерна наследования КРКЛ большое участие принимает аддитивная генетическая компонента. В исследуемых (CxPT)F1 (CxA)F1 (CxCBA)F1 гибридных (PTxA)F1 (PTxCBA)F1 (AxCBA)F1 комбинациях линии РТ 0,8 и С делают основной 0,6 0,4 вклад в формирование 0,2 высокой КРКЛ. Линии 0,0 CBA и A, напротив, -0,2 обусловливают в -0,4 исследованных -0,6 -0,8 гибридных -1,0 комбинациях 20 40 60 80 100 уменьшение Возраст (сутки) показателей КРКЛ. Вероятно, первые две линии имеют большее Рис. 6. Изменение остаточных реципрокных эффектов по КРКЛ в постнатальном о нтогенезе количество генов, у мышей детерминирующих высокую реактивность клеток Лейдига к стимуляторам стероидогенеза, вторые две линии − гены, детерминирующие низкую реактивность. Остаточные реципрокные эффекты значительно влияют на формирование КРКЛ на всем протяжении постнатального онтогенеза, однако имеет совершенно иную онтогенетическую динамику (Рис. 6). В препубертатном периоде развития (с 20 п о 35 сутки после рождения) у гибридов первого поколения по данным эффектам сохраняется практически одинаковый паттерн генотипической изменчивости. Подтверждением этому служит также высокий коэффициент корреляции между эффектами в возрастном периоде 20-35 суток. Далее, в возрастном периоде 35 100 суток, у гибридов первого поколения происходит постепенная реверсия значений остаточных реципрокных эффектов, т.е. изменение направления эффектов на противоположный (Рис. 6). Однако этот процесс по сравнению с межли нейными эффектами и эффектами общей комбинационной способности затягивается во времени и, возможно, заканчивается только к 100 суткам после рождения или позже, т.е. у взрослых животных. Другие генетические компоненты межгрупповой фенотипической изменчивости (специфическая комбинационная способность, средние реципрокные эффекты и средний гетерозис) 17 вносят меньший вклад в формирование КРКЛ, осуществляя свое влияние лишь в определенные периоды постнатального онтогенеза. Онтогенетические изменения остаточных ре ципрокных эффектов свидетельствуют о неаддитивном генном взаимодействии, которое может зависеть от доминантных (внутри одного локуса) и эпистатических (межлокусных) взаимодействий генов в определенных генетических комбинациях. Таким образом, в целом полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе наблюдаемых генотипических различий лежат генетические особенности, которые определяют степень реактивности клеток Лейдига на стимуляторы стероидогенеза в различные возрастные периоды и обусловливают координированное функционирование гипоталамо -гипофизарносеменникового комплекса в ходе постнатального развития. Подводя итоги, мы можем заключить, что предложенная модель исследования является лишь первой попыткой анализа и в дальнейшем нуждается в молекулярно-генетических разработках. ВЫВОДЫ 1. В полных диаллельных скрещиваниях четырех инбредных линий лабораторных мышей выявлены генетические и возрастные различия по контрольной, цАМФ- и субстрат зависимой продукции тестостерона клетками Лейдига в ходе полового созревания. 2. В каждом исследованном возрастном периоде по всем цАМФ и субстрат зависимым показателям активности клеток Лейдига выявлен одинаковый паттерн наследования и наличие достоверных положительных межкроссных (генотипических) коррелятивных связей, что свидетельствует о координированном генетическом контроле гормональной активности клеток Лейдига. 3. Координированный генетический контроль претерпевал существенные преобразования в ходе полового созревания. Об этом свидетельствуют значительные изменения ка к характера наследственных различий в реактивности клеток Лейдига к ХГ, цАМФ и прегненолону, так и изменения коррелятивных связей в различные периоды постнатального развития. 4. Диаллельный анализ показал, что характер наследования продукции тестостерона клетками Лейдига в постнатальном онтогенезе является сложным, полигенным и определяется, главным образом, межлинейными эффектами, эффектами общей комбинационной способности и остаточными реципрокными эффектами. Влияние аддитивных генетических компонент преобладает. 5. Становление дефинитивного паттерна наследования показателей реактивности клеток Лейдига происходит к концу полового созревания, что совпадает с формированием взрослой 18 зрелой популяции клеток. Этот процесс в основном обусловлен постпубертатной стабилизацией межлинейных эффектов и эффектов общей комбинационной способности. Материалы диссертации опубликованы в следующих работах: 1. Ахмерова Л.Г., Свечников К.В., Осадчук А.В. Влияние генотипа на формирование гормональной функции клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе у лабораторных мышей //Онтогенез. 2002. Т. 33. № 4. с. 268-275. 2. Ахмерова Л.Г., Свечников К.В., Осадчук А.В. Значение генотипа в становлении гормональной функции клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе в диаллельных скрещиваниях у лабораторных мышей //Генетика. 2002. Т. 38. №. 2. С. 196 -206. 3. Ahmerova L.G., Osadchuk A.V. The role of genotype in the formation of Leydig cell hormone function during postnatal ontogeny in diallele crosses of laboratory mice //16 th IMGC, San Antonio, Texas: Abstr. of Intern. Sympos. 2002.P. 79. 4. Osadchuk A.V., Ahmerova L.G., Svechnikov K.V. Genetic control of the Leydig cell responsiveness during the postnatal development in mice //3th Joint Meeting of the British Andrology Society, the British Fertility Sosiety and the Sosiety for Reproduction and Fertility, (Aberdeen, Scotland), Reproduction, 2003, Abstr. Ser. № 30, O38. 5. Ахмерова Л.Г., Осадчук А.В. Диаллельный анализ гормональной функции клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе у лабораторных мышей //III ВОГиС "Генетика в ΧΧI веке: современное состояние и перспективы развития": Тез. докл. научн. конфер. Москва. 2004. Т. II. С. 396. 6. Osadchuk A.V., Ahmerova L.G., Osadchuk L.V., O Shaughnessy P.J. Coordinated expression of microsomal steroidogenic enzyme genes as the main cause of the inherited variation in testicular steroidogenesis in inbred mouse strains //12-th European Workshop on Molecular and cellular Endocrinology of the Testis, Dunblane, Scotland. 2004. C4. 7. Ахмерова Л.Г. Развитие клеток Лейдига //Успехи физиологических наук. 2006. Т. 37. № 4. С. 28-36. Всего по теме диссертации опубликовано 15 печатных работ. 19