1.1. Строение и химические свойства краун
advertisement
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» На правах рукописи Тимонин Андрей Николаевич БИОСЕНСОРНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ КРАУНЭФИРОВ 03.01.04-биохимия 03.01.06-биотехнология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор Зайцев Сергей Юрьевич, доктор химических наук, профессор Царькова Марина Сергеевна Москва – 2011 ОГЛАВЛЕНИЕ УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ…………………………….4 ВВЕДЕНИЕ………………… ……………………………………...….………….5 ГЛАВА 1. Обзор литературы…….……………………………………………..11 1.1. Строение и химические свойства краун-эфиров в качестве синтетических аналогов природных макроциклов……………………………….………….…15 1.2. Получение краун-эфиров…………………………………………………...21 1.3. Супрамолекулярная органическая фотохимия краунсодержащих стириловых красителей………………………………………………………...25 1.4. Строение краунсодержащих стириловых красителей…………...............26 1.5. Электронные спектры, темновое и фотоиндуцированное комплексообразование краунсодержащих стириловых красителей…………28 1.6. Полимерные пленки, содержащие производные краун-эфиров………. 37 1.7. Методы определения ионов кальция……………………………………....40 1.8. Создание системы очувствления ВМР для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта……………………………………………………..43 ГЛАВА 2. Материалы и методы ………..……………………………………...45 2.1. Перечень используемых реактивов …………………………..…….……..45 2.2. Перечень используемой посуды и вспомогательных устройств………...47 2.3. Методики, применявшиеся в работе………………………………………47 2.3.1. Приготовление растворов полимеров…………………………………...47 2.3.2. Приготовление растворов краун-эфиров………………………………..50 2.3.3. Проверка совместимости растворов полимера и краун-эфира…….…..50 2.3.4. Приготовление растворов солей…………………………………………51 2.3.5. Приготовление совместных растворов полимеров и краун-эфиров для отлива пленок…………………………………………………………..........51 2.3.6. Получение полимерных пленок……………………………………….....51 2.3.7. Определение концентрации катионов кальция в водном растворе посредством хелатометрического титрования………………………………...53 2 2.3.8. Получение монослоев смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты…..……..54 2.3.9. Методика измерения спектров поглощения……………………….…....54 2.3.10. Методика измерения спектров флуоресценции ……………………....58 2.3.11. Методика построения графиков в "OriginPro70"……………………...62 ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение………..63 3.1 Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода………………………………………….65 3.1.1 Сущность модифицированной методики ………………………………..66 3.1.2 Приложение экспериментально-расчетного метода для определения глубины иммобилизации КЭ в ЦАФ…………………………..........................68 3.2 Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами ...........................................74 3.3. Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция...................................................................................................................80 3.4 Разработка метода контролируемой диффузии для изучения процессов комплексообразования КЭ с катионом кальция……………………………….94 3.4.1 Результаты и обсуждения по титриметрическому анализу………….…94 3.4.2 Сущность метода контролируемой диффузии……………......................96 3.5. Исследование комплексобразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция ……………………………….102 ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….111 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................................112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………….……………..113 ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………...124 3 Условные обозначения и сокращения ХМ хемосенсорные материалы ПВБ поливинилбутираль ПАВ поверхностно-активное вещество ПВХ поливинилхлорид МКД метод контролируемой диффузии ЭРМ экспериментально-расчетный метод КЭ краун-эфиры КЭ №1 бензо-18-краун-6 ПС полистирол ЦАБ целлюлозы ацетатбутират ЦАГФ целлюлозы ацетатгидрофталат длина волны поглощения или флуоресценции max максимум длины волны поглощения или флуоресценции I интенсивность поглощения или флуоресценции Ед единицы интенсивности (∆m/m0) влагопоглощение нм нанометры мкм микрометры 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Последние десятилетия отмечены заметно возросшим интересом к наукам и технологиям, связанным с жизнедеятельностью человека и других живых организмов – медицине, биотехнологии, микробиологии и других. В том числе это относится к созданию и исследованию материалов, предназначенных для использования в этих областях. Круг таких материалов достаточно широк. Однако наиболее широкие возможности связаны с различными полимерами и композитами на их основе. К основным направлениям использования полимеров в медикобиологических областях, помимо материалов, применяемых в замене (замещении) органов и тканей и других методах лечения, относятся материалы для биоинженерных методов и материалы для биоанализа. В разных случаях к используемому материалу предъявляются различные требования, определяемые условиями его функционирования, поэтому нельзя выделить какой-то один материал, пригодный для применения во всех случаях. При этом может быть отмечен ряд общих требований, относящихся ко всем объектам, вводимым в организм: они не должны после введения в организм выделять вредные вещества, то есть должны обладать биологической инертностью (не оказывать биологического действия на окружающие ткани и организм в целом и, в свою очередь, быть устойчивыми к их воздействию); стерилизации стандартными должны методами; выдерживать должны условия изготавливаться из пригодных материалов по достаточно простой технологии. В принципе, самый безвредный материал только условно может быть отнесен к биоинертным материалам, поскольку уже сам факт введения постороннего объекта в организм в любом случае вызывает некую ответную реакцию организма. Более точно характеризует благоприятную ситуацию с взаимодействием в системе «введенный объект – организм» понятие 5 «биосовместимость». Под биологической совместимостью понимают свойства материала выполнять определенную функцию в организме в течение требуемого времени без вреда для него. Наконец, обсуждая поведение полимера и изготовленного из него изделия в организме, следует отметить, что образующиеся при распаде материала продукты в той или иной степени могут включаться в процессы метаболизма (обмена веществ), лежащего в основе жизнедеятельности организма, аккумулироваться в тканях организма или могут быть выведены из него без или после дополнительных химических превращений. Разработка хемосенсорных материалов (ХМ), состоящих из полимерных матриц, содержащих краситель или люминофор, фрагменты краун-эфиров, которые впоследствии должны использоваться в составе хемосенсора, находящегося во внутрисосудистом биороботе, является актуальной проблемой, требующей понимания выше названных проблем. Проблема создания хемосенсоров как на различные биологически важные катионы, так и на биоорганические соединения в настоящее время также является весьма актуальной в связи с задачами медицинской диагностики, мониторинга окружающей воздушной и водной среды, развития наукоемких высокотехнологичных отраслей промышленного производства, поэтому исследования и коммерческие разработки в этой области ведутся широким фронтом во всех индустриально развитых странах. В практику экологического мониторинга внедряются новые сенсорные технологи на основе ферментных биосенсоров, молекулярных маркеров, сенсоры на основе ДНК и РНК. Известны способы экологического мониторинга путем создания системы слежения за экологическим состоянием населенных пунктов и промышленных предприятий. Для этого применяются различные технические системы сбора информации: группы датчиков экологического контроля состояния среды, контрольные и диспетчерские пункты промышленных стоков предприятий и т.п. Такие системы позволяют оценить экологическое состояние всего региона, однако 6 они являются сложными, многостадийными, продолжительными по времени измерения и дорогостоящими. Конечной целью разработок является производство разнообразных сравнительно дешевых индивидуальных переносных сенсорных устройств, с помощью которых контролировать состояние окружающей среды мог бы не только специально обученный персонал, но и каждый желающий охранять природу [1,7,9]. Число исследований в областях создания новых сенсоров и сенсорных методик анализа стремительно растет. Сенсоры являются мощным средством не только аналитической химии, но и диагностики в самом широком смысле этого слова: в медицине, биотехнологии, экологии, ветеринарии и зоотехнии. Однако все разработки, имеющиеся в научно-технической литературе, существуют только в лабораторном исполнении. Наиболее перспективным направлением представляется создание хемосенсорных хемосенсоров, композитных что материалов предполагает (ХМ) получение для оптических полимерной матрицы, обладающей рядом необходимых свойств (пленкообразующей способностью, оптической прозрачностью, механической прочностью, определенным влагопоглощением), и последующая иммобилизация в нее фотохромного соединения, чувствительного к катионам металлов и биологически активным веществам. Данная работа проводилась в рамках проекта «2007-3-2.3-11-02-003» по федеральной научно-технической целевой программе ФНТЦП Минобрнауки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме «Создание системы очувствления внутрисосудистого микроробота для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта» на 2007-2009 г.г. кафедры органической и биологической химии ФГОУ ВПО МГАВМиБ (совместно с МГТУ имени Н.Э. Баумана и ЦФ РАН). 7 Цель работы – разработка методики, получение и исследование хемосенсорных наноструктурированных материалов на основе фоточувствительных производных краун-эфиров для детекции аминокислот и катионов кальция. Исходя из этой цели, были поставлены задачи: 1. Получить и исследовать хемосенсорные материалы (ХМ) на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включением биоорганических соединений типа азокраун-эфирных производных стириловых красителей (КЭ). Изучить оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах. Оптимизировать методы получения и свойства ХМ. 2. Провести спектральный анализ хемосенсорных материалов с КЭ №5 в присутствии ряда аминокислот. 3. Разработать экспериментально-расчетные подходы и методики исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция. 4. Разработать рецептуру получения хемосенсорных материалов на основе желатина и иммобилизованных в него производных краун-эфиров. 5. Оценить перспективность полученных монослоев и краун- содержащих композитных материалов с основой из биополимерной матрицы и для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля щелочноземельных металлов (на примере кальция) и малых органических молекул (на примере аминокислот). Научная новизна работы. Разработан экспериментально-расчетный метод (ЭРМ) для математического описания процессов при исследовании и получении ХМ. Разработана новая методика исследования производных краун-эфиров, селективных к катионам кальция, названная «методом контролируемой диффузии» (МКД). Посредством данной методики были изучены особенности процесса комплексообразования некоторых производных краун-эфиров с катионами кальция. Предложена новая 8 рецептура получения сенсорных материалов на основе двух типов краунэфиров, иммобилизованных в пленку из желатина. Теоретическая и практическая значимость. Получены фундаментальные результаты по фоточувствительным свойствам краунсодержащих стириловых красителей в полимерных матрицах при взаимодействии с катионами кальция и рядом аминокислот. Получены краунсодержащие композитные материалы для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля катионов кальция и ряда аминокислот. Результаты диссертационной работы используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета и в рамках НОЦ (ГК № 02.740.11.0270 и ГК № 02.740.11.0718) ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии». Результаты работы использованы совместно с МГТУ имени Н.Э. Баумана и ЦФ РАН в рамках гос. контракта №02.523.12.3009 «Создание микророботехнического микроробота для комплекса на осуществления основе внутрисосудистого диагностических, терапевтических (доставка лекарственных препаратов) и хирургических процедур при атеросклеротических заболеваниях трубчатых органов», включая совместный патент РФ № 2389745 (см. список работ). Основные положения, выносимые на защиту: 1. Методики получения оптимальных по составу и свойствам матриц из синтетических и биологических полимеров. 2. Методики изучения поведения биоорганических молекул в растворах и матричном окружении на модели фотохромных производных краунэфиров. 3. Данные по спектральным характеристикам комплексов биоорганического азакраун-содержащего соединения (КЭ №5) с аминокислотами: 9 глицином, фенилаланином, аланином, серином, аргинином, изолейцином, лизином. 4. Спектральные характеристики комплексов биоорганических азакраунсодержащих соединений (КЭ №3, №4, №6) с катионами кальция. 5. Хемосенсорные материалы с иммобилизированными биоорганическими соединениями как элементы сенсорных устройств оптического контроля катионов кальция и некоторых аминокислот. Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на III международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (МГУ, Москва, 2008); на международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ, Москва, 2008); на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГОУ ВПО МГАВМиБ (2006-2009); на V Каргинской конференции (МГУ, Москва, 2010); на V Международной научной конференции «Актуальные проблемы в животноводстве» (ГНУ ВНИИФБиП с./х. животных, Боровск, 2010);на 2-й международной молодежной школе-конференции по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов (Туапсе, 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 статей (в т.ч. 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК), 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях, 1 патент РФ. Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ На молекулярно-биологическом уровне организации живой материи биологические мембраны являются одним из главных объектов изучения настоящего и будущего времени. Биологическая мембрана – это не только клеточный инструмент компартментализации – фундаментальная значимость биомембран – морфо-функциональное сопряжение разделенных сред и их структур посредством информационно-энергетического и вещественного сообщения. Данный принцип, выявляемый на молекулярно-биологическом уровне, при его реализации в многоклеточных организмах, приводит к формированию столь сложных механизмов регуляции и управления процессами в норме и патологии. При этом понятийный аппарат, используемый при изучении данных процессов на различных иерархических уровнях организации живой материи, не может быть ограничен морфофункциональным описанием изучаемого иерархического уровня. Требуется привлечение понятийного аппарата кибернетики и информатики для глубокого материалистического осмысления информационно-вещественного дуализма в живой природе. Поэтому разработка эффективных методов изучения мембран является важным стратегическим направлением в науке. Одним из таких подходов в изучении мембран является использование таких соединений, посредством которых изменяется определяемое мембраной вещественное сообщение между средами. Особенный акцент в этом направлении следует отнести к трансмембранным ионным обменам и транспортам. К таковым соединениям можно отнести ряд антибиотиков, избирательно увеличивающих катионную проницаемость биологических мембран [10]. В шестидесятых годах XX века было обнаружено, что различные природные и синтетические нейтральные макроциклические соединения – депсипептиды, депсиды, пептиды, полиэфиры – способны связывать в растворах катионы таким образом, что последние оказываются включенными во внутреннюю полость молекулы 11 и удерживаются там за счет межмолекулярного взаимодействия с несколькими полярными группировками (эфирными, амидными или сложноэфирными). При этом особенно выделяют донорно-акцепторные взаимодействия при таком комплексообразовании. Кроме того, была обнаружена ионная селективность подобных соединений в процессе комплексообразования, которая зависит не только от числа и природы лигандных групп, но в значительной мере определяется молекулярной конформацией. Благодаря этой специфической особенности макроциклических комплексонов среди них встречаются соединения, способные проявлять выраженную селективность в отношении определенных ионов. Комплексы, образуемые нейтральными макроциклическими соединениями, несут положительный заряд, причем стехиометрия комплексобразования, как правило, не зависит от природы связываемого катиона [10]. В таких комплексных соединениях ион металла экранирован от взаимодействия с растворителем и противоионами, что позволяет этому иону в соответствии с природой макроциклического соединения реализовывать фазовые переходы, например из раствора воды (в качестве примера полярных растворителей) «растворяться» в растворе данного макроциклического соединения, растворителем которого является хлороформ (в качестве примера неполярных растворителей). Повышенный интерес к подобным соединениям продиктован не только их комплексообразовательной селективностью в отношении способностью, но, что определенных катионов важно, их металлов, и обеспечивании, тем самым, избирательной проницаемости для данных катионов в естественных или искусственных мембранах. С этим связана антибиотическая активность ряда соединений, продуцируемых микроорганизмами, которые являются частным примером общей группы соединений, называемых ионофорами. Ионофоры - это довольно разнородная группа соединений, увеличивающая проницаемость мембран для ионов. Одни ионофоры, например грамицидин А и аламецитин, формируют в бислое каналы, другие 12 образуют стехиометрические комплексы с катионами и тем самым облегчают транспорт этих ионов через липидный бислой. Ионофоры являются весьма полезными инструментами в мембранных исследованиях, особенно при изучении биоэнергетических или иных зависимых от ионного градиента систем. Поскольку такие ионофорно-катионные комплексы могут проявлять довольно высокую специфичность к определенным ионам, с их помощью можно избирательно манипулировать ионными градиентами и электрическим потенциалом на мембране. Некоторые комплексы и катиона не заряжены, и катион переносится в нейтрализованной форме. Другие комплексы заряжены и диффундируют через бислой подобно уже образовавшимся гидрофобным ионам. Рассмотрим наиболее часто используемые ионофоры. СССР (карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон). СССР и близкий к нему (карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидразон) FССР представляют собой слабые кислоты. Протонированная форма электронейтральна и, как показано, легко проникают через мембрану (Р=17см/с), в то время как проницаемость депротонированной (анионной) формы составляет ≈1% от проницаемости формы нейтральной. Растворимость анионных форм этих и других протонфоров в гидрофобной области бислоя обуславливается несколькими причинами. Отрицательный заряд этих молекул делокализован, а благодаря большому ионному радиусу уменьшается энергия Борна. Кроме того, потенциал диполей, ориентированных положительным зарядом внутрь бислоя, стабилизирует анионы в мембране. И наконец, ионофор в мембране стабилизируют гидрофобные группы молекул. СССР, FССР и другие слабые кислоты эффективно увеличивают проницаемость мембраны для протонов, что позволяет достичь электрохимически равновесного распределения протонов по обе стороны бислоя. Валиномицин. Валиномицин – это циклодепсипептид, образующий с одновалентными катионами (предпочтительно 13 с К+) комплекс со стехиометрией 1:1. Структура комплекса напоминает ячейку, в центре которой находится ион калия, стабилизированный взаимодействием карбонилами эфирных групп. Комплекс К+ - валиномицин является гидрофобным ионом и с легкостью проникает через бислой. С помощью этого ионофора можносоздавать калиевый диффузионный потенциал на мембране везикул, концентрация К+ в которых отличается от концентрации снаружи. В системе, где трансмембранный потенциал создается с помощью какого-либо активного процесса, К+ - валиномицин будет устранять электрическую составляющую ΔΨ, не влияя непосредственно на величину ΔрН. Нигерцин и моненсин. Нигерцин и моненсин – это полиэфиры, имеющие одну отрицательно заряженную карбоксильную группу. Как и валиномицин, они образуют комплексы с одновалентными каионами в стехиометрии 1:1, но эти комплексы электронейтральны. Нигерцин селективно связывает К+, а моненсин – Na+. Эти ионовфоры также могут с успехом проникнуть через бислой в нейтральной протонированной форме, поэтому их используют для ускорения обмена H+ на Na+ (моненсин) или H+ на К+ (нигерцин) через мембрану. Добавление рассматриваемых ионофоров к везикулам приводит к выравниванию градиентов H+ и Na (или К+). Чаще всего их применяют для рассеивания ΔрН на мембране. Поскольку при суммарной реакции обмена сохраняется нейтральность, на ΔΨ это прямым образом не сказывается. А23187. карбоксильную Этот катионный группу и с переносчик высокой содержит избирательностью заряженную связывает двухвалентные катионы. Обычно А23187 используют как Са2+ - ионофор. Вероятно, при своей работе этот ионофор образует растворимый в бислое нейтральный комплекс, состоящий из двух молекул А23187 и одной молекулы Са2+; существование таких комплексов со стехиометрией 2:1 доказано экспериментально. 14 Грамицидин. Грамицидин представляет собой линейный пептид, состоящий из 14 чередующихся аминокислот. В гидрофобном окружении (например, в неполярных растворителях) он способен образовывать спираль. Две таких спиральных молекулы грамицидина совместно образуют "цилиндр", пронизывающий насквозь липидный бислой биомембран и являющийся каналом для переноса различных одновалентных катионов. Макроциклические соединения широко распространены в природе. Они ответственны за целый ряд химических процессов, протекающих в живой материи, таких как фотосинтез, транспорт атмосферного кислорода в клетки, транспорт ионов через мембраны, ферментативные превращения. Важнейшей особенностью этих процессов является селективность взаимодействий «гость-хозяин». В процессе развития органической химии были получены синтетические макроциклы. Одним из успешных примеров таковым соединениям является синтез Педерсеном [40-42] макроциклических полиэфиров (краун-эфиров), способных селективно связывать катионы щелочных металлов, вызвал огромный интерес и явился толчком к бурному развитию макроциклической химии. Последующие успехи в синтезе макроциклических соединений [43,48] и изучении комплексообразования в системах «гость-хозяин» заложили фундамент новой междисциплинарной супрамолекулярной хими области [49], научных находящейся в исследований – тесной с связи мембранологией. Важность этого направления заключается также в том, что синтетические макроциклы могут являться перспективными моделями широкого спектра природных макроциклов, что необходимо как в фундаментальных исследований, так и для развития прикладной науки. 1.1. Строение и химические свойства краун-эфиров в качестве синтетических аналогов природных макроциклов Краун-эфиры (от англ. crown – корона) – крупные циклические молекулы (макроциклы), которые состоят из чередующихся этиленовых 15 мостиков –СН2–СН2– и атомов кислорода. В некоторых случаях часть атомов О заменена атомами N или S. Форма таких молекул напоминает корону, что и определило их название (англ. crown – корона). Были впервые синтезированы в 1967-1968 годах химиком Чарльзом Педерсеном (в общей сложности им было получено более 60 таких соединений) [47]. Эти соединения содержат в цикле более 11 атомов, из которых не менее 4 атомов – гетероатомы (в качестве гетероатомов могут выступать атомы азота, кислорода или серы, и, в зависимости от этого, различают азакраун-эфиры, тиокраун-эфиры и пр.). Это вязкие жидкости или кристаллические вещества; хорошо растворимы в большинстве органических растворителей (хлороформ, ацетонитрил, тетрахлорэтан и т.д.), слабо - в воде. В названии краун-эфиров содержатся две цифры: первая обозначает общее число атомов в цикле, а вторая – число атомов кислорода. Рисунок 1.1.1 Строение молекулы бутадиенильного дитиа-краун-эфира [46] Формально гетероциклических все краун-эфиры соединений, однако можно отнести необычные к свойства классу таких соединений позволили выделить их в самостоятельный класс, в связи с чем для составления названий были предложены специальные правила. Название содержит слово «краун», цифра перед этим словом обозначает общее число атомов в цикле, а цифра в конце названия указывает на количество гетероатомов O, N и S. В названии не указывают наличие в цикле атомов О (это подразумевается), но если в цикле есть иные гетероатомы (кроме 16 кислорода), например, азот или сера, то их количество указывают, добавляя к названию приставки ди- или три-, а положение в цикле – с помощью числовых индексов, предварительно нумеруются все атомы в цикле. Рисунок 1.1.2 Примеры структуры краун-эфиров Краун-эфиры содержат фрагмент С–О–С, характерный для простых эфиров, а также могут включать фрагменты амина C–NH–C, или тиоэфира 17 C–S–C. Характерное свойство этих классов соединений – образовывать комплексы за счет неподеленных электронных пар кислорода, азота и серы. Это свойство многократно усилено в краун-эфирах из-за большого числа гетероатомов в цикле, к тому же неподеленные электронные пары ориентированы внутрь цикла. В результате ионы щелочных и щелочноземельных металлов входят внутрь цикла, образуя прочные комплексы. Меняя величину цикла и, соответственно, размер внутренней полости, можно точно настроить краун-эфир на удерживание катиона определенного размера, например, 12-краун-4 наиболее прочно захватывает катион лития, 15-краун-5 соответствует по размеру катиону натрия, а 18краун-6 «подходит по размеру» катиону калия. Рисунок 1.1.3 Комплексы краун-эфиров с катионами щелочных металлов (пунктирными линиями показаны координационные связи) У краун-эфиров склонность к «захвату» катионов выражена настолько сильно, что даже если катион не соответствует по размеру внутренней полости цикла, то все равно оказываются возможными варианты, при которых катион все же удерживается. Например, если катион по размеру 18 много больше внутренней полости, то он может окружить себя двумя молекулами краун-эфира, образуя подобие бутерброда, если же ситуация обратная, то внутрь молекулы краун-эфира может поместиться два катиона. Подобные комплексы менее устойчивы, чем те, у которых размер катиона точно соответствует величине внутренней полости. [37] Мерой устойчивости комплексов краун-эфиров с катионами металлов является константа устойчивости KS KS = [LM+]/[L][M+], отвечающая простейшей схеме комплексообразования: L + M+ = LM+, где [L], [M+] и [LM+] – концентрации свободного рецептора, катиона и комплекса соответственно. Например, значение lg K для натриевого и калиевого комплексов дициклогексано-18-краун-6 равны соответственно 6,4 и 8,3, следовательно, при экстрагировании этим краун-эфиром раствора, содержащего равные концентрации ионов натрия и калия, на каждые 100 связываемых ионов калия будет приходиться только один ион натрия. Введение дополнительных функциональных групп приводит к получению аналогов краун-эфиров с новыми свойствами. Так, например, были получены несколько типов переключаемых краун-эфиров, имитирующих природные вещества, осуществляющие перенос ионов щелочных металлов через клеточную мембрану (ионофоры). К pHоткликающимся ионофорам относится производное 18-краун-6, на конце боковой цепи которого располагается NH-группа. В нейтральной или слабощелочной среде это вещество образует с ионом калия обычный комплекс. При переходе в область с кислым pH аминогруппа протонируется, и аммониевый ион вытесняет катион калия из полости, образуя внутримолекулярный комплекс. Когда полученный аммониевый комплекс вновь попадает в нейтральную среду, содержащую избыток ионов калия, 19 последний занимает место аммониевой группы, которая при этом депротонируется [21]. Краун-эфиры открыли новые горизонты в синтетической органической химии, с их помощью оказалось возможным вводить в растворенном виде (т.е. гомогенно), неорганические реагенты в органическую среду. Например, широко применяемый окислитель перманганат калия KMnO4 практически нерастворим в органических растворителях, но в присутствии 18-краун-6 он легко растворяется в бензоле, приобретая при этом высокую окисляющую способность. Причина в том, что в водном растворе анионы MnO4–, осуществляющие окисление, окружены водной сольватной оболочкой, а в бензольном растворе они как бы обнажены и потому высокоактивны. Известно, что замена одного или нескольких атомов кислорода в краунэфире на другие донорные атомы может существенно изменить способность лиганда связывать катионы металлов. Например, 1,10-дитиа-18-краун-6-эфир проявляет очень низкое сродство к катионам щелочных металлов по сравнению с 18-краун-6-эфиром, но в то же время образует намного более устойчивые комплексы с Hg2+ и Ag+ как в органических растворителях, так и в воде. Ранее были предприняты попытки использовать селективные свойства тиакраун-эфиров для создания фотопереключаемых лигандов и хромогенных реагентов для катионов тяжелых металлов. Было показано, что стириловые красители, содержащие фрагмент дитиа-15-краун-5- (1a) или дитиа-18-краун-6-эфира ацетонитриле; (1b), селективно комплексообразование связывают ионы сопровождается Hg2+ в гипсохромным эффектом, величина которого, однако, существенно ниже по сравнению с величиной, наблюдаемой при взаимодействии катионов щелочноземельных металлов с аналогичными системами на основе краун-эфиров. 20 n=1 (а), 2 (b) Рисунок 1.1.4 Строение молекулы дитиа- краун- эфиров [4] Большой интерес представляют соединения, способные образовывать комплексы типа «гость-хозяин» с органическими молекулами. Изучаются комплексанты для катехоламинов, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Например, открыт бициклический лиганд, состоящий из фрагментов краун-эфира и дипротонированного полиамина, способного образовывать комплекс состава 1:1 с аминокислотами. В этом случае положительно заряженный полиамин связывает карбоксилат-анион, а остаток краун-эфира комплексует аммониевую группу [45]. 1.2. Получение краун-эфиров При конденсации дихлоралкилов, содержащих в цепи простые эфирные группировки С–О–С, с полиэтиленгликолями протекает циклизация, приводящая к образованию краун-эфира. В зависимости от длины цепочки исходных соединений получают краун-эфиры с различной величиной цикла. Азотсодержащие краун-эфиры получают конденсацией диаминов, содержащих эфирные группировки, с хлорангидридами дикарбоновых кислот. В результате получаются циклические амиды, которые затем восстанавливают, при этом карбонильные группы С=О превращаются в метиленовые СН2. Применение краун-эфиров определяется, прежде всего, их избирательной способностью захватывать катионы определенного размера. Наибольшее распространение получили краун-эфиры, содержащие только гетероатомы О. Их применяют в технологических процессах, связанных с выделением и очисткой солей щелочных и щелочноземельных металлов, в 21 аналитических исследованиях и работах, связанных с синтезом, когда нужно перевести неорганические соединения из водной фазы в органическую среду. Краун-эфиры обладают противомикробной и противопаразитарной активностью, кроме того, из организма с их помощью выводятся ионы токсичных тяжелых металлов, а также радиоактивных изотопов цезия и стронция. В радиохимии краун-эфиры помогают решать проблему переработки отходов ядерных производств. Первый этап – удаление с помощью краун-эфиров из переработанного ядерного горючего наиболее активных изотопов (стронций-90, цезий-137, технеций-99), на этой стадии предпочтительны S-содержащие краун-эфиры, поскольку они обладают повышенной радиационной стойкостью. Извлеченные изотопы используются затем в установках радиодиагностики, заменяющих рентгеновские аппараты, а также при создании долговременных источников тока для метеостанций, метеозондов и космических аппаратов. Следующий этап переработки ядерного топлива – извлечение с помощью краун-эфиров (специально подобранного состава) неизрасходованных урана и плутония, после чего объем подлежащих утилизации отходов становятся заметно меньше и к тому же отходы обладают слабой радиоактивностью. На основе краун-эфиров созданы электропроводящие материалы нового типа. За развитие химии макрогетероциклических соединений американский химик Ч.Педерсен, фактически создавший новый класс соединений – краун-эфиры, в 1987 (совместно Д.Крамом и Ж.Леном) был удостоен Нобелевской премии. Данная краткая характеристика краун-эфиров объясняет интерес научной общественности к этим соединения, причем у специалистов самого разного научного профиля (химиков, физиков, биологов, медиков и т.д.). Важнейшей особенностью этих соединений является возможность образовывать стабильные, высокоспецифические комплексы с катионами металлов, а также с иными катионами (аминами как пример). Путем химического синтеза к макроциклу 22 кольца краун-эфира можно “пришивать” различные радикалы, придавая этим соединениям дополнительные свойства. Например, путем химического синтеза можно синтезировать ряд классов амфифильных производных краун-эфиров, обладающих фоточувствительными свойствами. Существуют методы синтеза иных производных краун-эфиров обладающих чувствительностью к изменению рН, и рядом иных чувствительностей, суть которых заключается в изменении структуры и свойств данной системы. Комплексообразование краун-эфиров с соответствующими катионами, детектируется с помощью спектрофотометрических и флуоресцентных методов. Подобная возможность предопределяет их использования в самых разнообразных исследовательских работах, посвященных моделированию разнообразных процессов в природе. Например, разнообразные производные краун-эфиров используются в моделировании природных и некоторых синтетических мембран. В первом случае работы посвящаются изучению аналогичных процессов в биомембранах с целью экстраполяции полученных результатов на модельных системах на соответствующие процессы в биомембранах и клеточных компартментах, а во втором случае исследования проводятся с целью создания таких материалов, свойства которых будут соответствовать требованиям данной технологии и экономической целесообразности. Из вышесказанного видна теснейшая взаимосвязь супрамолекулярной химии, биоорганической химии и биологической химии. Так, например, многие конкретно интересующие исследователя - биохимика процессы изучаются главным образом путем особых приемов экстракции, выделения и очистки интересующих исследователя биосупрамолекулярных систем. Путем подходов супрамолекулярной химии, можно искусственно реконструировать аналогичные системы в “чистом виде” и исследовать интересующий исследователя конкретный процесс с последующей экстраполяцией полученных результатов на биосистемы. Например, были получены несколько типов переключаемых краун-эфиров, имитирующих 23 природные вещества, осуществляющие перенос ионов щелочных металлов через клеточную мембрану (ионофоры). К pH-откликающимся ионофорам относится производное 18-краун-6, на конце боковой цепи которого располагается NH-группа. В нейтральной или слабощелочной среде это вещество образует с ионом калия обычный комплекс. При переходе в область с кислым pH аминогруппа протонируется, и аммониевый ион вытесняет катион калия из полости, образуя внутримолекулярный комплекс. Когда полученный аммониевый комплекс вновь попадает в нейтральную среду, содержащую избыток ионов калия, последний занимает место аммониевой группы, которая при этом депротонируется. Особый интерес представляют амфифильные производные краунэфиров, обладающих фоточувствительными свойствами [6]. В качестве примера можно привести один из классов фотохромных соединений, являющийся краун-содержащим стироловым красителем на примере молекулы КЭ №3 (лабораторное название): Me O N + R N O O O O І Очевидно, что ионоселективность в этой структуре определяется наличием краун-эфирного обусловлены возможностью фрагмента, а превращений фотохромные свойства их в молекул ходе фотоиндуцированных обратимых реакций: Е-Z – изомеризация двойной связи и (2+2)-фотоциклоприсоединение с образованием замещенных циклобутанов. [11,12] Схематично это можно проиллюстрировать так: 24 Рисунок 1.2.1 Реакция обратимой транс-цис изомеризации Причем такая реакция протекает под действием света видимого диапазона. Из вышесказанного следует, что супрамолекулярным комплексам их с катионами металлов присуща способность к фотопереключению. К числу наиболее интересных и перспективных фрагментов, чутко реагирующих на изменение структуры молекулы при фотопереключении, можно отнести краун-соединения, на основе которых созданы синтетические аналоги ферментов [2,56] и некоторые фоточувствительные системы. Краун-соединения содержат несколько гетероатомов с неподеленными электронными парами, которые могут участвовать в образовании координационных связей с катионами металлов. Способность краунсоединений к комплексообразованию сильно зависит от их строения и пространственной структуры. Поэтому «фотохимическое поведение в отсутствие и в присутствии ионов металлов — один из наиболее интригующих аспектов непредельных краунсоединений»[61]. Однако краунсодержащих фотопереключаемою преимущества непредельных связь С=С, до и возможности соединений, имеющих настоящего времени остаются нереализованными. 1.3. Супрамолекулярная органическая фотохимия краунсодержащих стириловых красителей В работе [51] в качестве объекта исследований были выбраны стириловые красители, которые подобно 25 стильбену имеют два ароматических заместителя у связи С=СО. Они отличаются высоким квантовым выходом фотоизомеризации, которая сопровождается значительным изменением структуры хромофора и характеризуется высокой степенью фотообратимости. Если связать ковалентными связями фрагменты краунсоединения и стирилового красителя таким образом, чтобы один или два гетероатома макроцикла находились в сопряжении с хромофором, то можно было ожидать, что это приведет к нарушению аддитивности в проявлении специфических свойств таких краунсодержащих стириловых красителей (КСК). Таким образом, фотоструктурные превращения фрагмента красителя приведут к изменению эффективности связывания катионов металлов фрагментом краунсоединения, а комплексообразование должно в свою очередь изменить спектральные и фотохимические характеристики фрагмента красителя. Сопряженные реакции этого типа, по-видимому, могут происходить в супрамолекулярных структурах, образованных в результате самосборки [44,47] с участием молекул КСК, что может быть использовано для разработки и создания неизвестных ранее типов молекулярных фотохимических и фотофизических устройств [60]. Наиболее перспективным способом управления такими устройствами может стать легкодоступное селективное облучение светом. 1.4. Строение краунсодержащих стириловых красителей Осуществлен синтез ряда соединений этого нового типа [30] и впервые исследованы их спектральные и фотохимические свойства. Структура одного из них — trans-1— установлена методом РСА (ІІ) [4, 31]. ІІ trans-1 26 Рисунок 1.4.1 Строение trans-1 в проекции на плоскость наименьшего перекрывания. Хромоген молекулы имеет плоское строение, определяемое, повидимому, сильным сопряжением бензотиазольного остатка, этиленовой связи, бензольного цикла и двух атомов кислорода фрагмента бензокраунэфира, а также характеризуется высокой степенью выровненности порядков π-связей хромофора. Плоское строение хромогена trans-1 приводит к возникновению невалентных взаимодействий, проявляющихся в уменьшении некоторых межатомных расстояний по сравнению с суммой их ван-дер-ваальсовых радиусов и в искажении ряда углов. Существование невалентных взаимодействий между атомами Н(2) и H(6), S и Н(3), Н(3) и Н(4), атомов Н этильной группы с Н(1) и Н(2) свидетельствует о наличии значительного стерического напряжения в молекуле trans-1. Все эти закономерности строения фрагмента красителя в trans-1, по-видимому, носят общий характер для всех КСК и могут влиять на их спектральные и фотохимические свойства. Еще одной особенностью строения trans-1 в отличие, например, от бензо-15-краун-5-эфира является ориентация неподеленных электронных пар атомов 0(2), 0(3) и О(4) макроцикла вне его полости, что указывает на необходимость изменения его конформации для эффективного связывания катиона металла при комплексообразовании. Причина этого эффекта, 27 возможно, — электроноакцепторное влияние фрагмента красителя на связанные с бензольным циклом атомы О макроцикла. 1.5. Электронные спектры, темновое и фотоиндуцированное комплексообразование краунсодержащих стириловых красителей КСК имеют глубокую и интенсивную окраску в желтой (420—460 нм) и красной (520—550 нм) областях, которая связана с присутствием в параположении к двойной связи атома О (или N) краун-эфирного фрагмента. Все полученные КСК в растворе характеризуются транс-конфигурацией двойной связи. Общими свойствами КСК являются значительный гипсохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения (ДПП) и увеличение стоксова сдвига спектра флуоресценции с ростом полярности растворителя. При облучении раствора, например, trans-2 в воде светом с λ=436 нм поглощение в области ДПП уменьшается с одновременным увеличением поглощения в коротковолновой части спектра, пока не достигается фотостационарное состояние. Обратное изменение спектра происходит при облучении того же раствора светом с λ = 365 нм вплоть до перехода в новое фотостационарное состояние. связаны с протеканием Наблюдаемые обратимой фотохимической фотоизомеризации (рисунок 1.5.1, схема 1) [32]. 28 спектральные изменения транс—цис- Рисунок 1.5.1 Электронные спектры поглощения транс- (1) и цисизомеров КСК 2 (2) и нескорректированный спектр флуоресценции трансизомера 2 (3). Вода, Т- 295 К. Схема 1 цис-2 Значения квантовых выходов как прямой, так и обратной фотоизомеризации для всех КСК в полярных растворителях близки и находятся в диапазоне 0.4-0.5. Эффективность фотореакции не зависит от наличия в растворе кислорода воздуха. 29 После облучения КСК в растворах происходит быстрое темновое восстановление спектров, что связано с протеканием термической цис— транс-изомеризации. Сравнительное исследование КСК 2 и его аналога 3 показало, что макроциклический фрагмент не оказывает какого-либо специфического влияния на спектральные, и фотохимические свойства красителей [31]. trans-3 Различие между этими соединениями проявилось при исследовании комплексообразования в МеCN (схема 2). Было найдено, что добавление в раствор перхлоратов щелочноземельных значительному гипсохромному сдвигу металлов приводит к ДПП trans-2, тогда как при добавлении тех же количеств солей металлов в раствор trans -3 происходят лишь незначительные спектральные изменения. Схема 2 trans-2 30 Как показали расчеты [4,12,13,32], ДПП в электронных спектрах КСК относится к электронному переходу с небольшим переносом заряда (-0.2 е) с бензокраун-эфира (донор) на гетероцикл (акцептор). Связывание краунэфирного фрагмента с катионом металла приводит к появлению кулоновского взаимодействия, которое делает такое смещение электронной плотности энергетически невыгодным (электронная плотность смешается от катиона). Этим объясняется наблюдаемый экспериментально гипсохромный сдвиг ДПП. Добавление в раствор цис-изомеров КСК перхлоратов щелочноземельных металлов обычно также приводит к гипсохромным сдвигам ДПП, однако их величины заметно уступают соответствующим сдвигам ДПП транс-изомеров. Это связано, по-видимому, с нарушением эффективного сопряжения в неплоском цис-изомере КСК. С учетом известных [14] эмпирических правил для краун-эфиров более простого строения следовало ожидать, что величина сдвига ДПП при комплексообразовании КСК будет зависеть от пространственного соответствия размеров полости краун-эфира и иона металла, плотности заряда на катионе металла и природы растворителя. Действительно, Мg2+ вызывает сдвиг ДПП trans-2 в МеСN более чем на 40 нм. В то же время сдвиг ДПП trans-4 при добавлении Мg2+ составляет всего 1 нм. Повидимому, размер полости фрагмента 15-краун-5-эфира trans-2 в наибольшей степени соответствует размеру Мg2+, что и предопределяет его эффективное взаимодействие с донорными атомами кислорода краун-эфира, 31 в том числе с атомом кислорода, находящимся в сопряжении с хромофором. Аналогично, при добавлении Еu3+ к раствору trans-4, содержащего фрагмент 18-краун-6-эфира, наблюдается значительный гипсохромный сдвиг ДПП на 44 нм. Из катионов щелочноземельных металлов наибольшим пространственным соответствием полости краун-эфира trans-4 обладает Sr2+ [33]. Сравнение катионов щелочных и щелочноземельных металлов показывает, что последние вызывают гораздо более сильные сдвиги ДПП. Соответственно, для катионов трехвалентных металлов с еще большей плотностью заряда наблюдается дальнейший рост величины сдвига. Следует отметить, что для КСК регистрируется заметное уменьшение величины сдвига при переходе от МеСN к МeОН. Это, по-видимому, связано с темт что молекулы МеОН в большей степени, чем МеСN, конкурируют с краун-эфирами при комплексообразовании. Можно предположить, что значения констант комплексообразования в ряду Мg2+, Са2*, Ва2+ будут симбатны величинам гипсохромных сдвигов ДПП в спектрах их комплексов с КСК. С этой целью были измерены константы устойчивости комплексов trans-5 с этими ионами [20]. V 32 Простейшей схеме комплексообразования (схема 3), в которой L — молекула красителя, М — катион металла, K1 — константа устойчивости комплекса, соответствует уравнение См/αC L = 1+(K 1 C 1 ) -1 *(1-α) -1 где α — степень комплексообразования, которая вычисляется по формуле α = (DL-D)/(DL- DLM) (DL, D и DLM - оптические плотности исходного раствора, текущая и при полном комплексообразовании, соответственно). Схема 3 L+ + M+ (LM)3+ Таблица 1 Константы устойчивости комплексов и изменения положений максимумов ДПП trans-5 с перхлоратами щелочноземельных металлов (См = 1∙10-2 моль∙л-1) в МеСN при Т = 295 К Катион CL∙10-5/моль∙л-1 lgK1 lgK2 λL - λLM/нм Mg2+ 2,1 4,5 2,8 39 Ca2+ 2,0 4,0 2,8 36 Ba2+ 2,0 3,7 2,8 28 На основании этих данных можно сделать вывод, что величины сдвигов ДПП симбатны lgК1 комплексов trans-5 с ионами металлов. Найденная закономерность позволяет качественно оценивать эффективность связывания КСК различными катионами металлов, по крайней мере, для 33 красителей, содержащих только атомы О в макрогетероциклическом фрагменте. Следует отметить, что устойчивость комплексов М и L стехиометрии 1:1с ионом Мg2+ для trans-5 почти на три порядка ниже, чем для бензо-15краун-5-эфира (Б15К5) [20]. Этот эффект можно объяснить тем, что при переходе от Б15К5 к КСК электронная плотность на атомах О краунэфирного фрагмента, непосредственно связанных с бензольным кольцом, значительно снижается из-за сильного электроноакцепторного влияния положительно заряженного гетероциклического остатка. Представляло интерес исследовать стириловые красители, содержащие вместо бензокраун-эфирного N-фенилаза-15-краун-5-эфирный фрагмент. При такой замене ДПП КСК смещается батохромно (почти на 90 нм для trans-6) из-за участия неподеленной пары электронов атома азота краунэфирного фрагмента в сопряжении с хромофором [4]. 350 400 450 500 550 λ/нм 600 650 700 Рисунок 1.5.2 Зависимость спектров поглощения (а) и флуоресценции (b) trans-6 (СL = 1,0∙10-5 моль∙л-1) в MeCN от концентрации ионов Са2+ ( СM/CL = 50, 100, 200, 300, 400, 500) при постоянной концентрации перхлорат-ионов СА = 0,01 моль∙л-1. Пунктиром показаны вычисленные спектры комплекса На рис. 1.5.2. представлена зависимость спектра поглощения trans-6 от концентрации ионов Са2+. Значительный ионохромный эффект, наблюдаемый в дайной системе, может быть приписан, как и в случае trans- 34 2, комплексoобразованию катиона металла с краун-зфирным фрагментом красителя. Измеренная в рамках простейшей схемы комплексообразования (см. схему 3) константа устойчивости для комплекса trans-6 с Са2+ (lgK = 2.4) является эффективной величиной, поскольку в расчетах не учитывался процесс ассоциации трехзарядного комплекса с ионом СlO4-. Однако можно показать, что в условиях эксперимента зависимость D от Сm должна с хорошей точностью описываться уравнением (1) с эффективной константой: K ≈ KLM(1+KLMACL)/(1+ KMACL). Для сравнения способности краун-эфирных фрагментов trans-5 и trans-6 к образованию комплекса с Са2+ можно оценить эффективную константу К для trans-5 аналогичным образом, используя значения lgKLM = 4.0 и lgKLMА = 2.8 (см. табл. 1). Полученная оценка показывает, что устойчивость комплексов при переходе от trans-5 к trans-6 снижается более чем на два порядка [4,20,57]. относительно Снижение устойчивости N-фенилаза-15-краун-5 электроноакцепторным влиянием можно комплексов объяснить положительно trans-6 сильным заряженного бензотиазольного остатка в молекуле красителя. При облучении растворов trans-6 видимым светом происходят спектральные изменения, характерные для реакции транс-цис- изомеризации. Образующийся в ходе реакции цис-изомер нестабилен и в темноте переходит в соответствующий транс-изомер [34]. Константа скорости темновой цис—транс-изомеризации более чем на три порядка выше, чем для КСК типа trans-5 [38]. Это обусловлено более высокой степенью сопряжения в хромофорном фрагменте cis-6 по сравнению с cis-5 из-за наличия атома азота с неподеленной электронной парой в параположении к связи С=С. Для (cis-6) • Сa2+ кинетика темновой цис—транс-изомеризации, за которой следили по изменению оптической плотности раствора при 522 35 нм, строго соответствовала уравнению первого порядка. Зависимость была проанализирована в рамках схемы 3. Данные при См = 0.05 моль∙л-1 показывают, что kс-t для полного комплекса много ниже, чем для свободного сis-6. Тогда при степенях комлексообразования от 0 до 0.8 отношение концентрации свободного цисизомера к его общей концентрации в растворе можно принять равным отношению текущего значения kс-t к k0c-t при См = 0. Рисунок 1.5.3 Экспериментальная (точки) и теоретическая (уравнение (1)) (кривая) зависимости константы скорости темновой цис—транс-изомеризации в МеСN красителя 6 (CL= 1.0∙10-5 моль∙л-1) от концентрации ионов Са2+ при постоянной концентрации Cl04- (СА = 0.01 моль∙л-1) Из рис. 1.5.3 видно, что экспериментальные точки хорошо ложатся на теоретическую кривую. Константа устойчивости lgК комплексов cis-6 с Са2+, полученная при аппроксимации, составляет 2.85. При переходе trans-6 в цис-форму устойчивость комплексов возрастает в 2.5 раза. Этот небольшой эффект обусловлен, по-видимому, ослаблением электроноакцепторного влияния положительно заряженного бензотиазольного остатка на связывание катиона металла, так как известно, 36 что в цис-изомерах алкенов по сравнению с транс-изомерами эффекты заместителей передаются через связь С=С хуже. Другой причиной этого ослабления может быть нарушение сопряжения в цис-6 из-за его неплоского строения. Тиакраун-соединения мало изучены, хотя они имеют значительные преимущества перед кислородными и азакраун-эфирами, поскольку обладают повышенной склонностью к образованию комплексов с тяжелыми и переходными металлами [35, 36, 39, 52, 54, 55, 58]. Таким образом, функциональные возможности КСК до проведения вышеупомянутых работ не изучались. Удалось обнаружить целый ряд новых эффектов и исследовать механизмы связанных с ними процессов, среди которых наиболее перспективными являются ион-селективное образование анион-«накрытых» комплексов и стереоспецифическое ион-селективное авто-ФЦП КСК. Полученные результаты позволяют прогнозировать возможность использования КСК для создания селективных хромо- и флуороионофоров, в том числе для катионов большого ионного радиуса, небольших органических катионов тяжелых металлов; фотохромных ионофоров для фотоуправляемого ионного транспорта через мембраны; полимерных пленок и пленок ЛБ с фотопереключаемыми свойствами; фотопереключаемых синзимов и молекулярных устройств для молекулярной электроники. Можно надеяться, что супрамолекулярная органическая фотохимия КСК будет развиваться далее и эти системы найдут практическое применение. 1.6. Полимерные пленки, содержащие производные краун-эфиров Теперь рассмотрим полимерные матрицы на основе готовых полимеров, растворенных в соответствующих растворителях. Надо сразу оговориться, что подобные матрицы, как правило, не служат моделями биомембран, однако они перспективны как компоненты наноматериалов для создания хемосенсоров. Их цель – быстрое и высоко достоверное 37 улавливание даже самых низких концентраций веществ в различных средах. Важным достоинством метода получения пленок из раствора [5] является то, что отлив пленок производится при сравнительно низкой температуре, возможно введение нетермостойких добавок, определяющих дальнейшее применение пленки (пластификаторов, красителей, лекарственных препаратов и т. п.). При этом важно отметить, что существует возможность задавания необходимой толщины пленки, встраивания кроме КЭ дополнительных компонентов в структуру пленки (например, пластификаторов). Это достигается с помощью отработанного метода полива пленок, суть которого заключается в равномерном распределении раствора полимера со смешанным с ним раствором КЭ, а также растворов других компонентов на поверхности подложки. Однако, несмотря на видимую простоту метода, требуется подобрать к соответствующему КЭ полимер, оптимальные растворители и другие компоненты. Важно отметить, что необходимо подбирать оптимальные концентрации веществ в соответствующих растворах. Так растворение полимера принципиально отличается от растворения низкомолекулярных веществ, что необходимо учитывать концентраций раствора полимера. при подборе оптимальных Полимеры в растворах, особенно концентрированных, образуют структуры, форма и размер которых зависят как от характера взаимодействия полимера с растворителем, так и от условий, в которых находится раствор (температура, механическое воздействие). Принципиальное различие в механизме растворения низкомолекулярных веществ и полимеров заключается в том, что низкомолекулярное вещество диффундирует в растворитель, а в случае высокомолекулярных соединений растворитель проникает в полимер [5]. Растворение полимеров происходит в две стадии: 1) набухание полимера вследствие проникновения малых частиц растворителя; оно вызвано большой разницей в коэффициентах диффузии 38 полимера и растворителя; 2) собственно растворение, заключающееся во взаимодиффузии полимера и растворителя, приводящей к разделению элементов структуры полимера и образованию истинного раствора. В связи с этим выгодно использовать смесь растворителей, из которых один обладает лучшим сродством к полимеру, а другой — лучшими кинетическими свойствами (небольшие компактные молекулы, легко проникающие в полимер). 1.7. Методы определения ионов кальция Оценка методов оптического контроля компонентов биологических жидкостей. Контроль компонентов биологических жидкостей, и в частности биологически активных соединений крови, занимает особое место и очень важен как для оценки физиолого-биохимического статуса организма, так и для своевременной диагностики патологических состояний организма человека и животных. Среди множества биохимических показателей, которые исследуются в современной медицинской практике оптическими методами, наиболее перспективными являются определения таких соединений как стероиды и катионы биологически важных металлов (натрия, калия и кальция). Среди названных металлов для данного проекта особой строкой можно выделить кальций. Роль кальция в метаболических процессах многообразна: он является основным элементом костной ткани, играет важнейшую «регуляторную» роль внутри клеток. Ионы кальция принимают участие более чем в 30 химических реакциях организма. Кроме того, определение кальция важно для внутрисосудистой диагностики атеросклероза, что является основной задачей, на решение которой направлена работа. В настоящее время из всего многообразия оптических методов количественного определения стероидов в биологических объектах – прежде 39 всего в крови - наиболее эффективными являются иммуноферментный, радиоиммуноферментный и люминесцентный иммуноферментный (аналитическая чувствительность достигает 8.7 пмоль/л) методы анализа [15]. В качестве иллюстрации приведем тест–систему «19-Нортестостерон– ИФА». Она предназначена для количественного определения 19- нортестостерона в физиологических жидкостях, органах и тканях животных методом иммуноферментного анализа на стрипованных полистироловых планшетах. Предел обнаружения в биологических жидкостях 0,4- 0,5 мкг/л при длине волны измерения 450 нм. Для определения содержания ионов кальция используется очень большое количество методов: гравиметрия, титриметрические методы (комплексиметрия, титрование), окислительно-восстановительное электрохимические методы и осадительное (амперометрическое и высокочастотное титрование, определение с помощью ионселективных электродов), спектроскопии, оптические методы метод (метод пламенной атомно-абсорбционной эмиссионной спектроскопии, люминесцентный или флуоресцентный метод). Но только некоторые из них могут быть использованы для определения кальция в крови. Кальций в крови находится в нескольких формах: связанный (или в комплексе) и свободный (или ионизированный). Измерение концентрации ионизированного кальция необходимо, поскольку только ионизированная форма физиологически активна. В последнее время для определения катионов кальция в биологических жидкостях используются следующие методики: - титрометрическое определение (амперометрическое, Ваарда и др.); - флуориметрические методы; - ферментативные методы (с использованием ферментов: панкреатической α-амилазы (КФ 3.2.11.1), фосфолипазы D (КФ 3.1.4), амидогидролазы мочевины (КФ 3.5.1.45); 40 - фотометрические методы (пламенная фотометрия, атомно- адсорбционная и атомно-эмиссионная спектрометрия, масс – спектрометрия с изотопным разведением и др.) [15-19]. Фотометрические методы основаны на способности ионов кальция селективно связываться различными металлохромными индикаторами или красителями. Содержание кальция в исследуемом материале определяют по величине поглощения комплекса Ca2+индикатор: Ca2+ + индикатор → окрашенный комплекс Различают «прямые» и «непрямые» методы. В «прямых» методах реакция между ионами кальция и индикатором протекает в инкубационной среде. В «непрямых» методах образец предварительно разводят в большом объеме жидкости, чтобы высвободить кальций из комплекса с белками и другими соединениями и устранить вмешательство белков в реакцию. В настоящее время апробированных отдают предпочтение кальцийсвязывающих «прямым» методам. красителей, Из включая метилтимоловый синий, ализарин, кальцеин, хлорфосфоазо III и другие, наибольшее распространение получили о-крезолфталеин (ОКФ) и арсеназо III. O-крезолфталеин — металлосвязывающий краситель, образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс. О содержании кальция в исследуемом материале судят по величине поглощения при длине волны 570–575 нм при pH 10–12. Для повышения чувствительности метода и поддержания постоянного щелочного значения рН (около 12) во многих тест-системах используют диэтиламин, несмотря на то, что он обладает раздражающим действием. В ряде модификаций метода используют менее капризный 2амино-2-метил-1-пропанол (AMP) или 41 2-этиламиноэтанол в качестве буферного раствора. В настоящее время полностью отказались от опасных цианидов. Рисунок 1.7.1 Структурная формула красителя ОКФ Для уменьшения интенсивности окраски контроля рекомендуют добавление этанола или других органических растворителей. Методы определения кальция с ОКФ адаптированы ко многим автоанализаторам, при этом была решена существенная проблема данного метода — обеспечение температурного оптимума реакции. Результаты, полученные при определении кальция с ОКФ, завышают результаты по сравнению с методом атомно-абсорбционной фотометрии на 10–15 мг/л. Арсеназо III стали шире использовать в последние несколько лет в качестве кальцийсвязывающего реактива. Рисунок 1.7.2 Структурная формула арсеназо III Он обладает высоким сродством к кальцию, при слабо кислых значениях pH=6 — большим, чем к магнию. В качестве буферного раствора 42 используют растворы имидазола с достаточной буферной емкостью. Величину поглощения определяют при 650 нм. Арсеназо III устойчив в виде отдельного реактива. И ОКФ, и арсеназо III широко используют для анализа кальция. По данным КАП, в США в 2001 г. около 45% лабораторий для определения кальция использовали ОКФ, 39% — арсеназо III, остальные — ионоселективный электрод. На основе арсеназо III был разработан наиболее совершенный метод определения кальция в сыворотке крови. 1.8 Создание системы очувствления ВМР для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта Рисунок 1.8.1 Фотография модели микроробота внутри «сосуда» Хирургический микроробот, разработанный специалистами нескольких российских институтов и предприятий, позволит диагностировать и лечить сосуды и другие трубчатые органы (кишки, желудок, мочеточники и др.) без проведения полостных операций, что существенно сократит операционное и послеоперационное время. Клинические испытания прибора должны начаться через два года. В проекте по созданию маленького механического устройства, способного изменить привычную медицинскую практику, участвуют более сотни специалистов из МГТУ им. Н.Э. Баумана, РНЦ, «Курчатовского института», Института повышения квалификации Федерального медикобиологического агентства, ЗАО «Экоинвент», ОАО «Красный пролетарий» и 43 Центра фотохимии РАН. Работы ведутся в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы». Проект рассчитан на пять лет и имеет бюджет в 210 миллионов рублей. Подробнее о разработке: Микроробот представляет собой устройство диаметром 8 мм и длиной 20 мм, изготовленное из материала, чувствительного к компонентам крови, и оснащённое миниатюрной видеокамерой, ультразвуковыми приборами, электроникой для химического анализа крови и системой для удаления операционных отходов. Вводить его в организм будут через небольшой надрез в артерии или любом другом крупном или среднем сосуде, управлять извне с помощью специальной труКЭ №1и. “Микрохирург”, подобно гусенице, начнёт перемещаться по сосудам, оценивать их состояние, а также делать химический анализ крови в зоне операции, доставлять лекарства в поражённое место, вырезать бляшки и удалять отходы. Процесс операции будет транслироваться на мониторе компьютера лечащего врача. Выполнив все задачи, устройство выйдет из организма пациента, не травмируя его. Данная работа является частью исследований, связанных с разработкой элементов для микробота. 44 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Перечень используемых реактивов В работе были использованы следующие реактивы: Полимеры 1. Целлюлозы ацетатгидрофталат (ЦАГФ). Общая формула ЦАГФ [(C6H8O3)(CH3COO)(COOC6H4COOH)]n. 2. Целлюлозы ацетатбутират (ЦАБ). Общая формула ЦАБ (ЦАФ). Общая формула ЦАФ [(C6H8O3)(CH3COO)(C3H7COO)]n. 3. Целлюлозы ацетатфталат [(C6H8O3)(CH3COO)(C6H5COO)]n. 4. Поливинилбутираль (ПВБ). Общая формула ПВБ (C4H6O2C4H8)n.. 5. Полистирол (ПС). Общая формула ПС (C2H3C6H5)n. 6. Поливинилхлорид (ПВХ). Общая формула (C2H3Cl)n. (все полимеры фирмы Aldrich). В работе использовались, помимо полимерных, гелевые матрицы. Основным гелем при получении матричного окружения являлся желатин. Растворители Ацетон (чда); хлороформ (чда); ацетонитрил (чда); дихлорэтан (чда); метанол (чда). Вода бидистиллированная. Соли Для исследования использовались перхлораты кальция и натрия и бария СaClO42, NaClO4, Ba(ClO4)2; хлориды кальция и натрия NaCl, CaCl2 (реактивы фирмы Aldrich). Аминокислоты В работе использовались следующие аминокислоты: глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин, изолейцин, лизин (реактивы фирмы Aldrich). 45 Краун-эфиры (оптические молекулярные сенсоры) Исследования проводились на биоорганических соединениях на основе краун-эфиров (КЭ), в особенности – фоточувствительных КЭ, синтезированных в ЦФ РAH (КЭ № 3,4,5,6), представленных в таблице 2.1. Таблица 2.1 Биоорганические производные КЭ Название Структура Молекулярная масса КЭ №1 312 КЭ №2 360 Me КЭ №3 O N + R N O O O 570 O КЭ №4 607 O O O O + O N КЭ №5 O 1113 + N O O O O O O КЭ №6 613 46 2.2. Перечень используемой посуды и вспомогательных устройств Колбы конические на 25 мл, 10 мл Пробирки с притертыми пробками Пипетки на слив на 10 мл, 2 мл, 1 мл, 0,1 мл Микрошприцы емкостью 50 мкм Стекла предметные 2,5см7,5см Стекла кварцевые 2,5 см1,2 см Колбы мерные на 100 мл Чашки Петри Эппендорфы Столик для изготовления пленок горизонтальный с регулируемым уровнем 2.3. Методики, применявшиеся в работе 2.3.1. Приготовление растворов полимеров Приготовление растворов поливинилбутираля в дихлорэтане Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ПВБ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавляли 6,4 мл (9,6 г) дихлорэтана. Перемешивание полимера проводили в течение 60 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ПВБ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавляли 6,4 мл (9,6 г) дихлорэтана. Перемешивание полимера проводили в течение 60 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Приготовление растворов целлюлозы ацетатгидрофталата в ацетонитриле Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетонитрила. Перемешивание 47 полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм. Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетонитрила. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм. Приготовление растворов целлюлозы ацетатгидрофталата в ацетоне Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм. Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм. Приготовление растворов целлюлозы ацетатфталата Подбор растворителя для полимера осуществлялся экспериментально. Хлороформ непригоден в качестве растворителя для ЦАФ в связи с плохой растворимость в нем полимера (не удавалось улучшить растворимость даже путем добавления этилового спирта по каплям) и большой летучести (невозможно отлить ровные тонкие пленки). В связи с этим было принято 48 решение использовать в качестве растворителя ацетон, оказавшийся оптимальным по вышеперечисленным показателям. Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм. Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм. Приготовление растворов желатина в воде Для приготовления раствора желатина брали 10 г желатина, растворяли в 10 мл кипящей дистиллированной воды. Далее полученный раствор желатина объемом 3 мл добавляли в пробирку площадью 1 см2 для отлива пленки толщиной 40 мкм по стандартной методике полива пленок. Приготовление растворов желатина с бензо-18-краун-6 (КЭ №1) в воде Для приготовления раствора желатина брали 10 г желатина, растворяли в 10 мл кипящей дистиллированной воды. К 3 мл полученного раствора желатина для отлива пленки толщиной 40 мкм по стандартной методике добавляли 500 мг КЭ №1, и получали желатиновую систему, содержащую сенсор и КЭ №1 в расчетном соотношении. 49 2.3.2. Приготовление растворов краун-эфиров Приготовление раствора краун-эфира № 3 в ацетонитриле Навеску 0,00057 г КЭ №3 растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и получали раствор КЭ №3 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в ацетонитриле получался прозрачный раствор вишневого цвета. Приготовление раствора краун-эфира № 3 в хлороформе Навеску 0,00057 г КЭ №3 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №3 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор вишневого цвета. Приготовление раствора краун-эфира №6 в хлороформе Навеску 0,00061 г КЭ №6 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №6 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор темно-вишневого цвета. Приготовление раствора краун-эфира № 4 в хлороформе Навеску 0,0006 г КЭ №4 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №4 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор синего цвета. Приготовление раствора краун-эфира № 5 в ацетонитриле Навеску 0,0011 г КЭ №5 растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и получали раствор КЭ №5 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в ацетонитриле получается прозрачный раствор желто-зеленого цвета. 2.3.3. Проверка совместимости растворов полимера и краун-эфира Перед получением пленок проверялась совместимость раствора полимера с растворами КЭ. Для этого в пробирку помещали небольшое количество смеси исследуемых растворов и наблюдали за возможным помутнением. Если не наблюдалось ни выпадения осадка, ни помутнения растворов, считали, что растворы полимера и красителя совмещаются хорошо. 50 2.3.4. Приготовление растворов солей Для приготовления растворов перхлората кальция Са(ClO4)2, хлорида кальция СаCl2 использовалась бидистиллированная вода. Готовились растворы с концентрацией 1, 2, 5, 50, 60 ммоль/л. В работе также использовались смеси хлоридов кальция и натрия с концентрациями, равными 5:150 и 5:50 ммоль/л, соответственно (растворитель - бидистиллированная вода). 2.3.5. Приготовление совместных растворов полимеров и краунэфиров для полива пленок Совместные растворы получали введением по каплям раствора краунэфира в раствор полимера. В полученном растворе масса краун-эфира всегда составляла 1% от массы полимера. Приготовление раствора краун-эфира № 3 и ПВБ для полива пленки Для полива одной пленки в 0,18 мл 4% раствора ПВБ в дихлорэтане по каплям добавляли 0,068 мл раствора КЭ №3 в хлороформе. После перемешивания растворов проводили полив пленок. Приготовление раствора краун-эфира № 3 в ЦАГФ для полива пленки Для полива одной пленки в 0,26 мл 4% раствора ЦАГФ в ацетонитриле и 0,074 мл раствора КЭ №3 в ацетоне. После перемешивания растворов проводили полив пленок. 2.3.6. Получение полимерных пленок Из приготовленных растворов отливали тонкие пленок на стеклянных подложках (для исследования влагопоглощения) и кварцевых подложках (для получения спектров поглощения и флуоресценции). Стекла готовили к поливу пленок путем обезжиривания с помощью погружения на 15 мин в хромовую смесь. После тщательного промывания в дистиллированной воде стекла просушивали на воздухе до полного высыхания. После этого стекла располагали на специальном горизонтальном столике с регулируемым 51 уровнем. На стекла с помощью пипетки наносили раствор полимера по каплям по всей площади стекла. Пленки отливали под вытяжкой при комнатной температуре и накрывали чашкой Петри, чтобы создать внутри насыщенную атмосферу паров растворителя, необходимую для равномерного высыхания пленки (во избежание волнистости пленки, приводящей к неравномерной ее толщине на разных участках). Рисунок 2.1.1 Столик с кварцевыми подложками для полива полимерных пленок. Расчет количества полимера, необходимого для нанесения на подложку Масса полимера на одну пленку вычисляется по формуле: M=ρ∙S∙h∙10-4 где ρ - плотность раствора полимера (г/см3); S - площадь подложки (см2); h - толщина слоя полимера для полива на подложку. Объем раствора полимера вычисляли, исходя из процентной концентрации и плотности раствора. 52 Получение полимерных пленок с краун-эфирами Для полива пленок использовали стандартные кварцевые стекла размером 3712 мм. Предварительно стекла обезжиривали, погружая на 15 мин. в хромовую смесь. После тщательного промывания в дистиллированной воде стекла просушивали на воздухе до полного высыхания. После этого стекла располагали на специальном горизонтальном столике с регулируемым уровнем. На стекла с помощью пипетки на 1 мл наносили раствор полимера и КЭ по каплям по всей площади стекла. Пленки отливали под вытяжкой при обычных условиях. После полива пленки накрывали чашкой Петри, покрытой сверху фольгой. Высушивали пленки в парах растворителя в течение суток. Полученные пленки хранили в холодильнике в контейнерах, защищенных от света. Толщина краунсодержащих пленок составляла 10 – 40 мкм. Достоинством метода является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и краунсодержащего соединения (КЭ) в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо. 2.3.7. Определение концентрации катионов кальция в водном растворе посредством хелатометрического титрования Для титрования катионов кальция использовали стандартный раствор ЭДТА. Индикатором являлся мурексид. Ход определения: 50 мл исходного водного раствора переносится в колбу для титрования, переливается 2,5 мл 2 н. раствора NaOH. Далее вносится на конце шпателя 30-40 мг смеси индикатора мурексида с хлоридом натрия. Затем медленно титруется полученная жидкость 0,05 н. раствором ЭДТА до перехода розовой окраски в сине-фиолетовую, не исчезающую в течение 3 мин. Далее проводится 3-4 разовое повторение опыта и из исходящего отчета выбирается среднее значение. Концентрация кальция вычисляется по следующей формуле: 53 С(Са)=С(ЭДТА)∙V(ЭДТА)/V(Са), где: С(Са) – концентрация Са2+( моль/л) С(ЭДТА) – концентрация ЭДТА (моль/л) V(ЭДТА) – объем водного раствора ЭДТА (л) V(Са) – объем водного раствора Са2+(л). В ходе проведения экспериментов выбранные оптимальные значение объемов и концентраций компонентов опыта не всегда совпадали, однако соотношения этих компонентов сохранялись. 2.3.8. Получение монослоев смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты Получение монослоев КЭ №5 осуществлялось посредством метода Лэнгмюра-Блоджет. Для КЭ №5 растворяли в ацетоне в концентрации 1 мМ и на водную поверхность в ванне Лэнгмюра распределяли полученный раствор КЭ №5 в объеме 2 мл. Далее готовили раствор стеариновой кислоты (С18) в хлороформе с концентрацией 1 мМ. Полученный раствор, объемом 4 мл, также распределяли на водную поверхность ванны Лэнгмюра с уже внесенным раствором КЭ №5. В результате получали монослой смеси КЭ №5:С18 в отношении 1:2. Этот монослой также получали не на водной поверхности, а на поверхности водного раствора лизина, с концентрацией 1 мМ. Далее снимали изотермы поверхностного давления и поверхностного потенциала полученного монослоя. После перенесения монослоя на твердый носитель снимали спектры поглощения и флуоресценции. 2.3.9. Методика измерения спектров поглощения Для снятия спектров поглощения использовали полимерные пленки, отлитые на кварцевых подложках, а также растворы краун-эфиров. Исследования проводили на спектрофотометре Hitachi 330 (Япония) и «Helios β», (Германия) с использованием кварцевых кювет и носителей. Сравнивали спектры поглощения чистого полимера и полимера с добавлением КЭ в области 300-700 нм. В пленке, где присутствует КЭ, наблюдалось появление характерного выраженного пика, максимум которого наблюдался при соответствующей длине волны. 54 Затем пленки, содержащие КЭ, подвергали воздействию водных растворов солей с концентрацией 1 М в течение 10 - 60 мин. Снова снимали спектры поглощения и наблюдали изменения интенсивности и длины волны максимума поглощения. Для измерения использовали сухие пленки или растворы, помещенные в кювету для спектрометрии с длиной оптического пути 10 мм и высотой 45 мм, заполненную раствором «аналита» и закрытую фторопластовой прокладкой. 1) Образец помещается в кюветное отделение спектрофотометра. 2) В кювету сравнения помещается образец без сенсорного материала (раствор «аналита»). 3) Кювета с образцом и кювета сравнения помещается в соответствующие кюветные отделения спектрофотометра. 4) Измерение спектра производится в спектральном диапазоне 300-700 нм с шагом 1 нм в соответствии с техническим описанием спектрофотометра. 5) Спектр записывается на электронном носителе в текстовом формате и в виде графического файла в формате Origin, также предоставляются параметры записи спектров. 6) Пункты 2 - 5 выполняются дважды: один раз - без «аналита», а второй раз в присутствии «аналита». Статистическая обработка результатов Приборная ошибка при снятии спектров поглощения составляет 1%. Ошибка измерения длины волны максимума поглощения, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 2 нм (0,7%). Ошибка измерения интенсивности поглощения, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,043 (0,7%). Пример расчета ошибки приведен ниже. 55 Таблица 2.2 Расчет ошибки измерения длины волны поглощения Xcp № Xi, нм Xi d2 d Xi Xcp n )2 S t (XiXcp n n1 S XiXcp 2 Результат, нм n=5 α=0,95 tα=2,78 1 446 1 1 2 447 0 1 3 448 1 1 4 447 447, 0 1 5 448 1 1 2 1,25 ∑ ∑ (Xi- Xi=2200 X)=20 1,5 447±2 Таблица 2.3. Расчет ошибки измерений интенсивности поглощения № Xi, ед. Xcp d d2 Xi Xcp XiXcp Xi S 2 n )2 S t (XiXcp n n1 Результат, ед. n=5 α=0,95 tα=2,78 1 0,158 0,004 0,000016 2 0,161 0,007 0,000049 3 0,141 0,013 0,000169 4 0,162 0,008 0,000064 5 0,146 0,008 0,000064 0,153 ∑ ∑ (Xi- Xi=0,768 X)= 0,000262 56 0,0001 0,012 0,153±0,012 Рисунок 2.2.1 Спектрофотометр HITACHI 330. Рисунок 2.3.1 Кюветное отделение спектрофотометра HITACHI 330. 57 2.3.10. Методика измерения спектров флуоресценции Для снятия спектров флуоресценции использовали тонкие пленки, отлитые на кварцевых подложках, а также растворы краун-эфиров. Исследования проводили на спектрофотометрах «Hitachi 550» и SHIMADZU RF 5001 (Япония) с использованием кварцевых кювет и носителей. Сравнивали спектры флуоресценции чистого полимера и полимера с добавлением КЭ в области 300-700 нм. В пленке, где присутствует КЭ, наблюдалось появление характерного выраженного пика, максимум которого наблюдался при соответствующей длине волны. Затем пленки, содержащие КЭ, подвергали воздействию водных растворов солей с концентрацией 1 М в течение 10 - 60 мин. Снова снимали спектры флуоресценции и наблюдали изменения интенсивности и длины волны максимума флуоресценции. Для измерения использовали сухие пленки или растворы, помещенные в кювету для флуориметрии с длиной оптического пути 10 мм и высотой 45 мм, заполненную раствором «аналита» и закрытую фторопластовой прокладкой. 1) Образец помещается в кюветное отделение спектрофлуориметра. 2) В кювету сравнения помещается образец без сенсорного материала (раствор «аналита»). 3) Кювета с образцом и кювета сравнения помещается в соответствующие кюветные отделения спектрофлуориметра. 4) Измерение спектра производится в спектральном диапазоне 300-700 нм с шагом 1 нм в соответствии с техническим описанием спектрофлуориметра. 5) Спектр записывается на электронном носителе в формате данных и в виде графического файла в формате Origin, также предоставляются параметры записи спектров. 6) Пункты 2 - 5 выполняются дважды: один раз - без «аналита», а второй раз в присутствии «аналита» (время воздействия «аналита» 10 - 60 мин). 58 Статистическая обработка результатов измерения спектров флуоресценции Приборная ошибка при снятии спектров флуоресценции составляет 0,1%. Ошибка измерения длины волны максимума флуоресценции, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,6 нм (0,1%). Ошибка измерения интенсивности флуоресценции, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,6 (0,1%). Пример расчета процента ошибки приведен ниже. Таблица 2.4 Расчет ошибки измерений длины волны флуоресценции. № Xi, нм Xср. d2 d S εα Результат, нм 1 592 1 1 2 591 0 0 3 591 0 0 4 592 1 1 5 592 1 1 ∑ Xi=2951 591 ∑ (Xi- 1, 0, X)=3 5 6 542±1 Таблица 2.5 Расчет ошибки измерений интенсивности флуоресценции. № Xi, ед. Xср. d2 d S εα Результат , ед. 1 801 0 1 2 802 1 1 3 801 0 1 4 802 1 1 5 800 1 1 801 ∑ Xi=4006 ∑ (XiX)=5 59 2,5 0, 6 409±1 Рисунок 2.4.1 Спектрофлуориметр SHIMADZU RF 5001 Рисунок 2.5.1 Кюветное отделение спектрофлуориметра SHIMADZU RF 5001 60 Рисунок 2.6.1 Держатель для пленок на кварцевых или стеклянных подложках Рисунок 2.7.1 Держатель для кювет 61 2.3.11. Методика построения графиков в "OriginPro70" 1. Запускается программа "OriginPro70". 2. С помощью функции "Import ACSII" открывается файл данных полученный со спектрофотометра или спектрофлуориметра. 3. Обозначаются колонки значений как Х и Y. 4. Выделяется колонки правой клавишей мыши. 5. Используя функцию "Line" в подменю "Plot" на панели инструментов, строится график. 6. Проводится корректировка графика, для этого его нужно выделить, нажать правую кнопку мыши и, используя функцию "Axis", задать необходимые параметры. 7. Для определения пика используется функция "Pick Peaks" в подменю Tools. 8. Для апроксимации графика Гауссовской кривой используется функция "Fit Gaussian" в подменю "Analysis". 62 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В работе использовали полимерные матрицы с иммобилизованными КЭ, которые, при контакте с биогенными «аналитами», дают молекулярные комплексы. Такую систему можно рассматривать как продукт бионанотехнологий, поскольку все реагенты образуют наноразмерные комплексы, а процесс получения хемосенсорного материала проводится по оригинальной технологии. КЭ являются соединениями, моделирующими ряд биохимических функций биологически активных соединений (БАС) и позволяющими создавать супрамолекулярные системы, имеющие как фундаментальное, так и практическое значение. Одной из таких важнейших функций является образование комплексов БАС с катионами металлов и малыми органическими молекулами. Достоинством производных КЭ, используемых в данной работе, являются их способность к изменению оптических характеристик (спектров абсорбции и флуоресценции) при их комплексообразовании. Для возможности оценки комплексообразования КЭ с катионами металлов, находящихся в водном растворе, в качестве модели было проведено исследование процесса взаимодействия КЭ №3 с катионами бария в растворе ацетонитрила. Как уже упоминалось в литературном обзоре, такое взаимодействие, приводящее к комплексообразованию, хорошо выявляется изменением таких спектральных характеристик системы, как сдвиг максимума длины волны в спектрах поглощения и/или флуоресценции. Для снятия спектров флуоресценции использовали раствор КЭ №3 в ацетонитриле с концентрацией 10-3 М в отсутствие и в присутствии катионов бария, концентрация которого также составляла 10-3 М. Данные приведены на рис. 3.1. Видно, что в спектре КЭ №3, растворенного в ацетонитриле, 63 наблюдается максимум при длине волны λ=660 нм (кривая 1). При добавлении перхлората бария, растворенного в ацетонитриле, к раствору КЭ №3 в ацетонитриле, в объемном соотношении 1:1, наблюдается сдвиг максимума длины волны флуоресценции с 660 нм до 596 нм (кривая 2). При использовании объемного соотношения КЭ №3 : Ba(ClO4)2 = 1:10 наблюдается сдвиг максимума длины волны флуоресценции с 660 нм до 555 Интенсивность, отн. ед. нм (кривая 3). 1 800 700 600 3 500 2 400 300 200 100 0 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.1.1 Спектры флуоресценции КЭ №3, растворенного в ацетонитриле: до взаимодействия с Ba(ClO4)2 (кривая 1); после взаимодействия с Ba(ClO4)2 в объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:1 (кривая 2); после взаимодействия с Ba(ClO4)2 в объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:10 (кривая 3). [КЭ №3] = 10-3 M, [Ba(ClO4)2]= 10-3 M. Приведенные данные показали, что при взаимодействии катиона Ba2+ c КЭ №3 наблюдается явно выраженный сдвиг максимума длины волны флуоресценции в коротковолновую область (гипсохромный сдвиг), который зависит от количества указанного катиона. Так, этот сдвиг Δλ=λ – λ0 (где λ0 – 64 максимум длины волны КЭ №3 в ацетонитриле, λ – то же, но после взаимодействия с катионом) при объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2=1:1 составил -64 нм (в коротковолновую область), а при соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:10 составил -105 нм (в коротковолновую область). Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными и свидетельствуют о наличии комплексообразования между КЭ №3 и катионом бария в растворе ацетонитрила. Это позволяет предположить, что КЭ №3 можно использовать для детекции и других катионов металлов, например, катионов кальция. 3.1 Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода Достоинством получения пленок методом полива является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и КЭ в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо. С целью повышения чувствительности ХМ и экономии КЭ была разработана модифицированная методика, суть которой стандартном методе получения пленок состоит в следующем. При из раствора (содержащего одновременно и полимер, и КЭ) КЭ распределяется в полимерной матрице равномерно по всей толщине. Поскольку среда пленки гидрофобна, то это создает препятствия для проникновения катиона растворенного в воде «аналита» вглубь пленки. В модифицированном методе изготавливают двухслойную пленку, первый слой которой получен из раствора полимера, а второй — из раствора КЭ, причем могут быть использованы разные растворители. В такой пленке концентрация КЭ в поверхностном слое возрастает, что должно приводить к повышению чувствительности ХМ и, соответственно, выражаться в спектральных данных. 65 3.1.1 Сущность модифицированной методики Сущность модифицированного метода состоит в следующем. На стекло наносят раствор полимера с концентрацией 4%, смешанный с чистым растворителем, объем которого равен или превышает объем предполагаемого раствора КЭ. При этом важно отметить, что растворитель может быть идентичным растворителю раствора полимера, может быть близок ему по свойствам и растворению определенной группы полимеров (например, хлороформ и ДХЭ), а может быть представлен смесью растворителей, из которых один растворитель растворяет полимер, а другой - нет. Такой раствор наносят на стекло и накрывают чашкой Петри. В микропробирку вносят раствор КЭ, в который добавляют растворитель, объем которого может соответствовать предполагаемому раствору полимера (как в случае стандартной методики), и эту смесь наносят на уже распределенный на стекле раствор полимера. Отмечено, что внесение избыточного объема растворителя для создания насыщенного пара положительно влияет на характер формирования пленки. При этом растворитель в жидкой фазе можно нанести непосредственно на общее стекло, где пленка формируется, а можно внести в единый замкнутый объем (под чашку Петри), а нанесение КЭ осуществлять, как описано в модифицированной методике. Экспериментально установлено, что, варьируя концентрации растворенных веществ (полимера и КЭ), можно добиться более эффективной регуляции кинетики удаления растворителя, особенно в сочетании с дополнительным внесением в объем избыточного пара растворителя, удобства распределения материала на подложке и получение качественной пленки. Было предположено, что от метода изготовления пленки зависит и ее молекулярная структура. Это основано на том, что в одних случаях удается встроить КЭ на поверхность, а в других нет, при этом от метода получения зависит оптическая плотность пленок. Например, при слишком быстром 66 испарении растворителя из формирующейся пленки, она мутнеет. Было выяснено, что чем меньше концентрация полимера в растворе, из которого формируется пленка, тем лучше качество пленки (нет помутнения, возможна иммобилизация КЭ без смешивания с дополнительным раствором полимера и т.д.). Спектры поглощения ХМ, состоящего из КЭ №5, иммобилизованного в пленку ЦАГФ, полученного по стандартной и модифицированной методике, изображены воздействию на рис. «аналита» 3.1.1. в Хемосенсорный виде материал подвергался гептаметиленаммоний бромида, растворенного в воде. а б Рисунок 3.1.1 Спектры поглощения КЭ №5 в пленках ЦАГФ до (кривая 1) и после (кривая 2) контакта с раствором «аналита», полученные по стандартной (а) и модифицированной (б) методике 67 Результаты эксперимента показывают, что материал, полученный по модифицированной методике, обладает большей чувствительностью. В этом случае (рис. б) на спектрах виден значительно больший сдвиг максимума длины волны поглощения, чем на спектре, полученном стандартным методом полива (рис. а). Еще одно преимущество модифицированной методики перед стандартной состоит в получении более гладких и однородных пленок. Важно также, что появляется возможность встраивания любого КЭ в любую полимерную матрицу за счет варьирования растворителями на базе двух самостоятельных растворов при их нанесении на стекло, что снимает необходимость в проведении исследований на совместимость раствора полимера и раствора КЭ и является технологическим преимуществом. На базе вышеописанной методики было предложена оптимальная схема, используемая в приготовлении сенсорных материалов на основе КЭ №3 и желатина. На распределенный по поверхности кварцевой подложки раствор полимера (например, желатина) наносится по каплям строго рассчитанный объем раствора сенсора в определенном окружении (системе растворителей) для вещественной иммобилизации данного сенсора в предлагаемую матрицу. Результаты этих экспериментов будут описаны ниже. 3.1.2 Приложение экспериментально-расчетного метода для определения глубины иммобилизации КЭ в ЦАФ Получение полимерных матриц с иммобилизованными в них КЭ требует информации о характере этого процесса в зависимости от выбранной технологии получения ХМ. В частности, важной информацией является глубина вещественной иммобилизации в матричное окружение. Это связано с задачей получения ультратонких пленок или рабочей хемосенсорной зоны, поскольку, чем больше эта зона, тем больше время, идущее на вещественный массоперенос раствора определяемой соли в хемосенсорный материал (ХМ). 68 Поэтому необходимо минимизировать такую область в рамках технологии получения ХМ. Для этого требуется получать ультратонкие пленки, толщина которых исчисляема в пределах сотен нанометров, или получить рабочую область в этих пределах. В процессе получения ХМ на твердых подложках методом полива была установлена невозможность получения подобных ультратонких пленок (метод достоверно позволяет получать пленки в пределах 10-15 мкм). Однако реализовать рабочую область в пределах сотни нанометров представляется возможным посредством модифицированной методики полива. Для реализации подобной задачи, а также для решения ряда других важнейших задач работы был разработан экспериментальнорасчетный метод (ЭРМ). Данный экспериментально-расчетный метод (ЭРМ) основан на модифицированной методике полива пленок и идее послойного нанесения компонентов ХМ. Его цель – количественно, посредством выведенных формул, описать картину вещественной иммобилизации в матричное окружение. Перспективность данного метода состоит также в том, что он может стать фундаментом для разработок технологии управляемой вещественной иммобилизации. Рассмотрим универсальный процесс послойного нанесения компонентов ХМ в частном случае модифицированной методики полива пленок. Первый этап – полив полимерной матрицы без КЭ. Известно, что данный полимер растворяется в определенных растворителях, при этом скорость растворения в различных растворителях неодинакова. Процесс формирования полимерной пленки из раствора во многом определяется скоростью испарения растворителя данного полимера. Второй этап – нанесение на сформированную пленку раствора КЭ в соответствующем растворителе. При этом растворитель может быть идентичен тому, в котором был растворен полимер, а может быть представлен иным растворителем, в котором данный полимер может растворяться или не растворяться. У данного растворителя также своя скорость испарения, которая, в свою 69 очередь, во многом определяет кинетику иммобилизации КЭ (и не только КЭ) в полимерное окружение. Проведенные многочисленные опыты на основе модифицированной методики полива пленок свидетельствуют, что процесс вещественной иммобилизации определяется по существу двумя параметрами – скоростью растворения полимера данным растворителем и скоростью испарения растворителя. Для количественной оценки толщины активной зоны, т.е. преимущественное зоны полимерной концентрирование матрицы, где иммобилизованного наблюдается вещества, требуется предложить математические формулы, учитывающие эти два параметра. В этом и заключается смысловое содержание экспериментальнорасчетного метода – ЭРМ. Известна следующая формула: ω=m/(m+ρV0), где ω – массовая доля растворенного вещества, m – масса растворенного вещества (г), ρ – плотность растворителя (г/мл), V0 – объем растворителя (мл). При учете двух ведущих процессов пленкообразования и вещественной иммобилизации – скорости растворения вещества в растворителе и скорости испарения растворителя – получаем в общем виде две функции. Будем считать, что скорость растворения полимера (или любого вещества) – это функция отношения бесконечно малого приращения массовой доли к бесконечно малому приращению времени, а также существует обратная скорости функция отношения бесконечно малого приращения времени к бесконечно малому приращению массовой доли: dω/dt=v(t) и dt/dω=r(ω). Соответственно: ω= ∫v(t)dt=H(t) и t=∫r(ω)dω=R(ω) Аналогичное рассуждение выстраивается и при выводе общей формулы скорости испарения растворителя. В данном случае под скоростью испарения будем считать функцию отношения бесконечно малого приращения объема растворителя к бесконечно малому приращению времени: dV/dt=f(t) 70 Тогда V=∫f(t)dt=F(t). Поскольку послойное вещественное нанесение связано с одновременной реализацией двух процессов – растворения полимера в растворителе и испарения растворителя, то получаем общую формулу ЭРМ: ω=m/(m+ρ(V0-F(R(ω)) Далее для определения глубины проникновения иммобилизованного вещества в полимер воспользуемся соотношением значения массы из данной формулы с массой общего полимера на пленку с заданной толщиной следующим образом: m/m0=h/h0 где m0 - масса пленки, h0 – толщина пленки, m – масса полимера, растворенного в растворе КЭ, h – искомая толщина. Таким образом, толщина активной зоны полностью должна определяться соотношением скоростей растворения полимера и испарением данного растворителя, а не количеством сформированного полимера на кварцевой подложке. На основе общей теории ЭРМ формулируются основные экспериментальные эмпирических параметров, а подходы также для получения выстраивается требуемых методология по организации и постановке соответствующих экспериментов. В общем виде они могут быть представлены следующим образом: 1. Экспериментальное определение кинетики растворения полимера в соответствующем растворителе. 2. Экспериментальное определение кинетики испарения растворителя для системы полимер - растворитель. 3. Нахождение функции скорости растворения полимера в растворителя в соответствующем растворителе в интегральном виде. 4. Нахождение функции скорости интегральном виде. 71 испарения 5. Определение зависимости интегральной функции скорости испарения от массовой доли раствора полимера для соответствующего растворителя. 6. Нахождение глубины проникновения раствора КЭ в толщину сформированной пленки при изготовлении ХМ по модифицированной методике полива пленок. Отталкиваясь от общих рассуждений и выводов ЭРМ, удалось экспериментально вывести эмпирическую формулу для системы ЦАФ в ацетоне. Постановка экспериментов: Определение времени полного растворения ЦАФ в ацетоне при приготовлении 4% раствора. Оно составило 54 минуты. Определение оптимального экспериментального значения массы ЦАФ при приготовлении 4% раствора ЦАФ в ацетоне. Оно составило 0,4г. на 12,3мл ацетона. Определение экспериментально-незначительных массовых изменений при получении растворов ЦАФ, близких к 4% в ацетоне. Такими массами являются 0,01 г, 0,02 г, 0.03 г. Взятие для приготовления раствора ЦАФ в ацетоне полимера с незначительным изменением массы от 0,4 г в указанных пределах (в граммах): 0,39, 0,41, 0,42, 0,43. Измерение времени полного растворения полимера в растворителе. Это время составляло: 47 минут, 60 минут, 65 минут и 70 минут соответственно. Проверка воспроизводимости полученных результатов. Анализ полученных данных и поиск эмпирической формулы функции скорости. Эта функция соответствовала в дифференциальном виде следующей: dω%/dt=1/t. При интегрировании этого уравнения получаем: ω%= ∫dt/t=lnt+C. При С=0 получаем: ω%= lnt или t=eω%. 72 Экспериментальная проверка предложенной эмпирической формулы. Извлекаем известную массу ЦАФ и приготавливаем раствор с известной массовой долей, например 5% раствор ЦАФ в ацетоне. Рассчитываем по формуле теоретически ожидаемую величину, при этом измеряем время полного растворения полимера. Теоретически ожидаемое время растворения полимера составляло 146,2 минуты, что примерно равно 2,4 часа. Экспериментальное время растворения составляло 2 часа 30 минут. Для 10%-ного раствора теоретическое время составило 21365 минут. Экспериментально полное растворение ЦАФ в ацетоне обнаружено на пятнадцатые сутки, что согласуется с прогнозом. Определение скорости испарения растворителя. В данном случае растворителем является ацетон. В нем растворяется как ЦАФ, так и КЭ. В процессе экспериментальных исследований было установлено, что его скорость испарения математически выражается как прямая пропорциональность при фиксированной площади поверхности стандартных пленок (3 см2): V=10-2t (объем - в мл, а время - в минутах). Подставляем полученные формулы для ЦАФ в ацетоне в общую формулу ЭРМ. Получаем: ω= m:(m+ρ(V0 -10-2eω% )), где ω – массовая доля полимера, m – масса полимера, растворенного раствором КЭ, ω% - массовая доля полимера, выраженная в процентах, ρ – плотность растворителя (г/мл), V0 – начальный объем раствора КЭ (мл). В соответствии с формулой для ЦАФ в ацетоне становится ясно, что увеличение массовой доли полимера в условно образующемся временном растворе определяется кинетикой растворения полимера и скоростью испарения растворителя, которая на соответственном этапе будет определять увеличение массовой доли, а скоростью растворения полимера можно будет пренебречь. 73 В соответствии с формулами была определена толщина активной зоны ХМ, которая для ЦАФ в ацетоне составляет примерно 1,45мкм. Таким образом, использование модельных исследований в разработке ХМ на основе КЭ оказалось перспективным. Их активное применение в данной работе формированию привело к решению эффективного ряда важнейших вопросов и экспериментально-исследовательского аппарата. 3.2 Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами Была исследована возможность определения ряда аминокислот в водных растворах с помощью КЭ №5, иммобилизованного в матрицу на основе ЦАФ. В качестве аминокислот применяли глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин и изолейцин. Также исследовались монослои КЭ №5 с лизином (в присутствии стеариновой кислоты). Полученные результаты приведены ниже на графиках и в таблицах, а также в приложении. Исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №5 до и после воздействия водного раствора соответствующей аминокислоты с концентрацией 10-3 М в области 300-700 нм. Как следует из литературных данных, об образовании супрамолекулярных комплексов краун-эфира и катиона металла (комплексы типа «гость-хозяин») судят по сдвигу ∆λ максимума длины волны поглощения и/или флуоресценции. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ. Снимали спектры поглощения и флуоресценции с полученных ХМ на основе КЭ №5, иммобилизованного в ЦАФ, до и после контакта с водными растворами выше указанных аминокислот при их концентрации 10-3 М. Поскольку сдвиги максимумов длины волны на спектрах флуоресценции были выражены сильнее, далее в графическом выражении приводятся именно спектры флуоресценции. 74 Рисунок 3.2.1 Спектр флуоресценции КЭ№ 5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе аланина с концентрацией 10-3 моль/л Рисунок 3.2.2 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе фенилаланина с концентрацией 10 -3 М. 75 700 Интенсивность, отн. ед. 1 600 2 500 400 300 200 100 0 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.2.3 Спектр флуоресценции КЭ- 5 в ЦАФ до (1) и после (2) контакта с раствором серина (конц. 10-3 М) Интенсивность, отн. ед. 12000 1 10000 2 8000 6000 4000 2000 0 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.2.4 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе аргинина с концентрацией 10-3 моль/л 76 2 14000 Интенсивность, отн. ед. 1 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.2.5 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе изолейцина с концентрацией 10 -3 моль/л 2 7000 Интенсивность, отн. ед. 6000 1 5000 4000 3000 2000 1000 0 450 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.2.6 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе глицина с концентрацией 10-3 моль/л. Данные из спектров флуоресценции ХМ, содержащих КЭ №5, до и после взаимодействия с аминокислотами, приведены в таблице 3.2.1. 77 Таблица 3.2.1 Флуоресценция полимерных пленок на основе ЦАФ, содержащих КЭ № 5, до и после выдерживания в водных растворах аминокислот с концентрацией 1 мМ. глицин , нм, (до пропитки) 512±1 , нм, (после пропитки) 520±1 сдвиг , нм +8 фенилаланин 512±1 524±1 +12 аланин 512±1 517±1 +5 серин 512±1 520±1 +8 аргинин 512±1 521±1 +9 изолейцин 512±1 519±1 +7 Аминокислота Видно, что после воздействия на полимерную матрицу ЦАФ с КЭ №5 водными растворами аминокислот в спектрах наблюдаются следующие сдвиги длины волны максимума флуоресценции: для раствора фенилаланина он составляет 12 нм, аргинина - 9 нм, для глицина и серина - 8 нм, изолейцина - 7 нм и аланина - 5 нм. На основе полученных результатов наибольший сдвиг наблюдается для раствора фенилаланина по сравнению с остальными растворами, что может быть интерпретировано как селективная хемосенсорная активность полученной ХМ для определенной аминокислоты. Эти данные свидетельствуют о возможном использовании ХМ на основе ЦАФ и КЭ № 5 для возможной детекции аминокислот. Для получения наноразмерных пленок была использована альтернативная технология (Лэнгмюра). Этой технологией были получены монослои КЭ №5 со стеариновой кислотой (мольное соотношение 1:2) в присутствии и в отсутствие водного раствора лизина (концентрации лизина 1 мМ). Были построены изотермы поверхностного давления и поверхностного потенциала полученных монослоев (рис. 3.2.7), а также проведены спектральные исследования данных монослоев до и после контакта с раствором лизина при концентрации 1 мМ (табл. 3.2.2.). 78 0,2 50 0,1 40 1 30 3 0,0 2 4 -0,1 20 -0,2 10 -0,3 0 -10 -0,4 0,0 0,2 0,4 0,6 Поерхностный потенциал (Вольт) Поверхностное давление (мН/м) 60 0,8 2 Площадь поверхности на молекулу (нм /м) Рисунок 3.2.7 Изотермы поверхностного давления (1;3) и поверхностного потенциала (2;4) для смеси КЭ №5(1мМ):C18(1мМ)=1:2 на субфазе 1мМ водного раствора лизина Таблица 3.2.2 Спектр флуоресценции монослоя смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты (С18) в соотношении КЭ №5:С18=1:2 без контакта и с контактом водного раствора лизина с концентрацией 1 мМ , нм, , нм, , (нет контакта) (есть контакт) сдвиг нм 534±1 536±1 Монослой Смеси КЭ №5:С18=1:2 Спектр флуоресценции +2 монослоя смеси КЭ №5:С18=1:2 показал батохромный сдвиг +2 нм, что не является достоверным доказательством процесса комплексообразования КЭ №5 с лизином при исследованной концентрации последнего. 79 3.3 Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция Была изучена возможность определения ионов Са2+ в водных растворах с помощью КЭ №6, иммобилизованного в матрицу на основе ЦАФ и ЦА. Полученные результаты приведены ниже на графиках и в таблицах. Исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 до и после воздействия «аналита» (водные растворы перхлората кальция с концентрацией 10-4 М) в области 300-700 нм. Как следует из литературных данных, об образовании супрамолекулярных комплексов краун-эфира и катиона металла (комплексы типа «гость-хозяин») судят по сдвигу ∆λ максимума поглощения и флуоресценции, а также по изменению их Интенсивность, отн. ед. интенсивности. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ. 0,50 0,45 0,40 2 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 1 0,10 0,05 0,00 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.1 Спектр поглощения КЭ №6в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц 10 -4 М 80 Интенсивность, отн. ед. 9000 8000 1 7000 6000 5000 4000 3000 2 2000 1000 0 550 600 650 700 750 800 850 900 Длина волны, нм Рисунок 3.3.2 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-4 М Из рисунков видно, что интенсивность поглощения увеличивается от 0,187 до 0,446. Наблюдается гашение флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция с конц. 10 -4 М снижается от 8328 до 6545, а пик максимума флуоресценции сдвигается в длинноволновую область от λ=630 нм до λ=649 нм (∆λ=19 нм). Далее, исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 Интенсивность, отн. ед. при концентрации 10-3 М. Полимер ЦАФ. 0,30 0,25 0,20 0,15 2 0,10 1 0,05 0,00 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.3 Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10 -3 М 81 Интенсивность, отн. ед. 800 600 2 400 200 1 0 600 700 800 900 Длина волны, нм Рисунок 3.3.4 Спектр флуоресценции КЭ №6в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-3М В этом случае интенсивность поглощения увеличивается от 0,100 до 0,221. Интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция разгорается от 523 до 627, и наблюдается сдвиг в длинноволновую область от λ=610 нм до λ=632 нм (∆λ=22 нм). Далее, исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 при концентрации 10-2 М. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ. 82 Интенсивность, отн. ед. 0,35 0,30 0,25 2 0,20 0,15 0,10 1 0,05 0,00 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Интенсивность, отн. ед. Рисунок 3.3.5 Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-2 М 13000 12000 11000 10000 9000 2 8000 7000 6000 1 5000 4000 3000 2000 1000 0 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм Рисунок 3.3.6 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10 -2 М Из рис. 3.3.5 видно, что интенсивность поглощения увеличивается от 0,099 до 0,240. Наблюдается разгорание флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция увеличивается от 8359 до 11803 (рис. 3.3.6), а пик максимума флуоресценции сдвигается в длинноволновую область от λ=630 нм до λ=649 нм (∆λ=19 нм). 83 Поскольку в биологических жидкостях организма присутствуют ионы натрия в высоких концентрациях, были исследованы спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 в присутствии катионов кальция и натрия. Концентрация обоих ионов составляла 10-2 М. В качестве полимера использовали ЦАФ. Результаты эксперимента приведены на рисунках и в Интенсивность, отн. ед. таблицах. 0,35 0,30 0,25 0,20 2 0,15 0,10 1 0,05 0,00 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.7. Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция и натрия с конц 10 -2 М Интенсивность, отн. ед. 13000 12000 11000 10000 2 9000 8000 7000 6000 5000 4000 1 3000 2000 1000 0 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм Рисунок 3.3.8 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция и натрия с конц. 10-2 М 84 Из приведенного рис. 3.3.7 видно, что интенсивность поглощения в присутствии катионов кальция и натрия увеличивается от 0,116 до 0,246. Наблюдается разгорание флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции в присутствии этих катионов увеличивается от 7723 до 11740, а сдвиг пика флуоресценции составляет 16 нм (рис. 3.3.8). Поскольку комплексообразование краунсодержащих красителей с катионами металлов исследовали в водных растворах, необходимо было выяснить вклад воды в этот процесс. С этой целью исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 до и после воздействия воды Интенсивность, отн. ед. (бидистиллата) в области 300-700 нм. Полимер ЦАФ (рис. 3.3.9 – 3.3.10). 0,30 0,25 1 0,20 2 0,15 0,10 0,05 0,00 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Интенсивность, отн. ед. Рисунок 3.3.9 Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в воде 16000 14000 12000 10000 1 8000 6000 4000 2 2000 0 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм Рисунок 3.3.10 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в воде 85 Из приведенных результатов видно, что в присутствии воды интенсивность поглощения увеличивается от 0,105 до 0,244. Интенсивность пиков флуоресценции, как в присутствии, так и в отсутствие воды одинакова, но наблюдается сдвиг в длинноволновую область от λ=620 нм до λ=638 нм (∆λ=18 нм). Это является свидетельством взаимодействия воды и исследованного КЭ (сольватохромный эффект). В табл. 3.3.1 и 3.3.2 суммированы полученные результаты. Таблица 3.3.1 Поглощение в матрице ЦАФ + КЭ №6 до и после воздействия водными растворами Ca(ClO4)2, Ca(ClO4)2+NaClO4 и водой (бидистиллат) конц 0 конц. 10 –2 М конц. 10 –3 М конц. 10 –4 М ∆λ I0/I ∆λ, нм I0/I ∆λ, нм I0/I ∆λ, нм I0/I Ca2+ - - 6 2,42 8 2,21 7 2,39 Ca2++Na+ - - 7 2,12 - - - - вода 6 2,32 - - - - - - Таблица 3.3.2 Флуоресценция в матрице ЦАФ + КЭ №6 до и после воздействия водными растворами Ca(ClO4)2, Ca(ClO4)2+NaClO4 и водой (бидистиллат) конц 0 конц. 10 –2 М конц. 10 –3 М конц. 10 –4 М ∆λ нм ∆λ, нм I0/I ∆λ, нм I0/I ∆λ, нм I0/I Ca2+ - 16 1,41 20 1,20 13 0,79 Ca2++Na+ - 18 1,52 - - - - вода 18 - - - - - - Аналогичным образом были исследованы спектры поглощения и флуоресценции ХМ на основе КЭ № №4 различных полимерных матриц ПВБ, ЦАФ - в присутствии воды, катионов кальция и натрия (рис. 3.3.113.3.14). 86 Интенсивность, отн. ед. 0,6 2 0,5 3 0,4 1 0,3 0,2 0,1 0,0 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Интенсивность, отн. ед. Рисунок 3.3.11 Спектр поглощения КЭ №4 в ПВБ: сухая пленка (1), после выдерживания в воде (2) и после выдерживания в растворе перхлората натрия с конц. 10-3 М (3) 12000 2 10000 3 8000 1 6000 4000 2000 0 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм Рисунок 3.3.12 Спектр флуоресценции КЭ №4 в ПВБ: сухая пленка (1), после выдерживания в воде (2) и после выдерживания в растворе перхлората натрия с конц. 10-3 М (3) Как видно из рис. 3.3.11, интенсивность поглощения увеличивается от 0,439 до 0,521 (после выдерживания в воде) и до 0,501 (после выдерживания в растворе перхлората натрия с конц. 10-3 М). Наблюдается разгорание флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции увеличивается от 8595 87 до 11969 (после выдерживания в воде) и до 10250 (после выдерживания в растворе перхлората натрия с конц. 10-3 М). Сдвиг пика флуоресценции Интенсивность, отн. ед. составляет Δλ=7 нм (рис. 3.3.12). 0,40 2 0,35 3 0,30 1 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 300 400 500 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.13 Спектр поглощения КЭ №4 в ПВБ: сухая пленка (1), после выдерживания в воде (2) и с последующим выдерживании в растворе перхлората Са с конц. 10-3 М (3) Интенсивность, отн. ед. 16000 15000 2 14000 13000 3 12000 11000 10000 9000 8000 1 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 550 600 650 700 750 800 Длина волны, нм Рисунок 3.3.14 Спектр флуоресценции КЭ №4 в ПВБ: сухая пленка (1), после выдерживания в воде (2) и с последующим выдерживании в растворе перхлората Са с конц. 10-3 М (3) 88 Из рис. 3.3.13 видно, что интенсивность поглощения увеличивается от 0,342 до 0,389 (после выдерживания в воде, рис. 3.3.) и от 0,342 до 0,347 (после выдерживания в растворе перхлората Са с конц. 10-3 М). Наблюдается разгорание флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции увеличивается от 8313 до 14431 (после выдерживания в воде) и до 13144 (после выдерживания в растворе перхлората Са с конц. 10-3 М), а сдвиг максимума флуоресценции составляет Δλ=2 нм (рис. 3.3.14). В следующей части работы для определения спектральных характеристик использовали пленки с хемосенсором типа КЭ №3, иммобилизованным в матрицы из ПВБ и ЦАГФ. Получали пленки толщиной 10 мкм, отлитые на кварцевых подложках. Спектры поглощения и флуоресценции пленок на основе ПВБ приведены на рис. 3.3.14, 3.3.15 и интенсивность, отн.ед. табл. 3.3.3, 3.3.4, а пленок из ЦАГФ – на рис. 3.3.16, 3.3.17 и табл. 3.3.5. 1 2,0 2 1,5 1,0 0,5 0,0 300 400 500 600 700 длина волны, нм Рисунок 3.3.15 Спектр поглощения КЭ №3 в пленке ПВБ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 10-3 М 89 В спектрах ПВБ с КЭ №3 без контакта с солью кальция наблюдали максимум поглощения при длине волны λ= 445 нм. Концентрация водных растворов перхлоратов кальция, в которых выдерживали в течение 30 минут полученные ХМ, составляла 10-3, 10-2, 10-1, 1 М.После воздействия на полимерную матрицу ПВБ с КЭ №3 водными растворами перхлоратов кальция в спектрах наблюдаются незначительные сдвиги максимума длины волны поглощения (см. табл. 3.3.2), которые не являются достоверными. Таблица 3.3.3 Характеристики спектров поглощения полимерных пленок на основе ПВБ, содержащих КЭ №3, до и после выдерживания в растворе перхлората кальция. , нм, (до выдерживания) I0, ЕД, (до выдерживания) С (Са+2) моль/л 446±2 1,55 ±0,12 10-3 , нм, (после выдерживания) 446±2 444±2 1,51 ±0,12 10-2 445±2 447±2 1,60 ±0,12 1,62 ±0,12 10-1 448±2 1 445±2 445±2 I, ЕД, (после выдерживания) 2,03 ±0,12 2,01 ±0,12 2,06 ±0,12 2,07 ±0,12 сдвиг , нм I I0, % 0 31,0 +1 33,1 +1 28,8 0 27,8 Для снятия спектров флуоресценции использовали пленки ПВБ, содержащие КЭ №3, толщиной 10мкм, полученные методом полива из раствора полимера на кварцевых подложках. В спектрах ПВБ с КЭ №3 наблюдали максимум флуоресценции при длине волны λ= 592 нм. После воздействия на полимерную матрицу ПВБ с КЭ №3 водными растворами перхлората кальция с концентрацией 10-3, 10-2, 10-1 и 1 М в спектрах наблюдаются сдвиги длины волны длинноволновую область Δλ=2-7 нм. 90 максимума флуоресценции в Иненсивность, отн. ед. 1200 1000 1 2 800 600 400 200 0 500 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.16 Спектр флуоресценции КЭ №3 в пленке ПВБ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 10-3 М Таблица 3.3.4 Флуоресцентные характеристики полимерных пленок на основе ПВБ, содержащих КЭ №3, до и после выдерживания растворами перхлората кальция , нм, I0, ЕД, (до выдерживания) Са+2, моль/л I, ЕД, (после выдерживания) 1040±1 сдвиг , нм I I0, % С=10-3 , нм, (после выдерживания) 596±1 592 ±1 810±1 +4 28,4 591 ±1 798±1 С=10-2 598±1 892±1 +7 11,8 593 ±1 807±1 С=10-1 595±1 950±1 +2 17,7 593 ±1 803±1 С=1 599±1 1030±1 +6 28,3 Сдвиги длин волн максимума флуоресценции не очень велики, что затрудняет оптическое определение Са+2 при использовании этого композиционного материала. В спектрах ЦАГФ с КЭ №3 наблюдали максимум флуоресценции при длине волны λ= 564 нм (рис. 3.3.16). 91 Увеличение интенсивности флуоресценции свидетельствует о разгорании флуоресценции и возможности детекции по двум параметрам Интенсивность, отн. ед. и I . 2 900 800 700 600 1 500 400 300 200 100 0 500 550 600 650 700 Длина волны, нм Рисунок 3.3.17 Спектр флуоресценции КЭ №3 в пленке ЦАГФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 10-3 М Таблица 3.3.5 Флуоресцентные характеристики полимерных пленок на основе ЦАГФ, содержащих КЭ №3, до и после выдерживания в растворах перхлората кальция с концентрацией 10-3 М , нм, (до выдерживания) 562±1 I0, ЕД, , нм, (до выдер- (после выдерживания) живания) 408±1 586±1 I, ЕД, (после выдерживания) 955±1 сдвиг , нм I I0, % +24 134 После воздействия на полимерную матрицу ЦАГФ с КЭ №3 водными растворами перхлората кальция с концентрацией 10-3 М в спектрах наблюдаются значительные сдвиги длины волны максимума флуоресценции и существенное повышение интенсивности. 92 Это указывает на перспективность данной композиции для создания оптических сенсоров на катионы щелочноземельных металлов на примере катионов кальция. Данные из спектров флуоресценции ХМ на основе различных полимеров, содержащих КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 до и после взаимодействия с солями кальция, приведены в таблице 3.3.6. Таблица 3.3.6 Флуоресценция полимерных пленок на основе ЦАФ, ЦАГФ, ПВБ, содержащих КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 до и после выдерживания в растворах перхлората кальция с концентрацией 1 мМ , нм, (до пропитки) 592 ±1 , нм, (после пропитки) 596±1 КЭ №3+ЦАГФ 562±1 586±1 +24 КЭ №4+ПВБ 652±1 654±2 +2 КЭ№6+ЦАФ 610±1 632±1 +22 КЭ+ полимер КЭ №3+ПВБ сдвиг , нм +4 Видно, что природа полимера оказывает существенное влияние на спектральные характеристики образцов. Для ХМ на основе ПВБ в присутствии КЭ № 3 и КЭ № 4 после взаимодействия с раствором перхлората кальция сдвиги не превышают 4 нм. После воздействия на полимерную матрицу ЦАФ с КЭ №6 водных растворов перхлората кальция в спектрах наблюдаются значительные сдвиги длины волны максимума флуоресценции (на 22 нм). Наибольшие изменения после контакта с раствором перхлората кальция наблюдаются для ХМ на основе ЦАГФ и КЭ №3 (max 24 нм). Наличие таких сдвигов максимума длины волны флуоресценции указывает на перспективность данной композиции для создания оптических сенсоров на катионы кальция. 93 3.4 Разработка метода контролируемой диффузии для изучения процессов комплексообразования КЭ с катионом кальция 3.4.1 Результаты и обсуждения по титриметрическому анализу Одним из главных методов контроля и возможности оценки и количественной интерпретации комплексообразования производного краунэфира с соответствующим катионом (или молекулой) является снятие спектров флуоресценции и поглощения образца до и после замачивания в соответствующем растворе соли данного катиона (или молекулы). При наличии сдвигов комплексообразовании максимума поглощения производного делается краун-эфира вывод о с соответствующим катионом. Зная концентрацию соли и имея соответствующую спектральную картину в данных условиях для каждого конкретного материала, можно также провести и количественную оценку данного процесса, определяя при этом чувствительность метода. С целью комплексной оценки данного процесса было решено использовать и другие методы анализа. Одним из таких решений стало внедрение для качественной и количественной оценки комплексобразования и его селективности титриметрических методов анализа. В частности для исследования процессов комплексообразования КЭ №3 и его аналогов с кальцием этот метод оказался весьма информативным. Опираясь на представления об образовании селективных комплексов краун-эфиров и высокоустойчивых катионов в строгом стехиометрическом соотношении, было решено провести титриметрический анализ раствора хлорида кальция при внесении в данный раствор определенного количества КЭ. При условии образования высокоустойчивого комплекса будет происходить потеря определенного количества кальция раствором, и, зная начальное количество кальция, легко узнать количество кальция, вступившего в реакцию. Зная начальную концентрацию КЭ, можно в определенной степени описать поведение индивидуального краун-эфира в 94 растворе соответствующих катионов. Растворителем в данных исследованиях служила вода. Методика: в раствор соли известной концентрации и известного объема добавляли определенный объем раствора (1н) гидроксида натрия (для соответствующего увеличения рН), затем к этому раствору добавляли несколько крупинок индикатора мурексида. В случае появления красной окраски раствора, свидетельствующей о наличии кальция в растворе, проводилось его титрование динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты - ЭДТА (трилон Б) известной концентрации до изменения окраски раствора на сине-фиолетовую, свидетельствующую о том, что индикатор оказался в среде со столь низкой концентрацией кальция, при которой образование их комплекса невозможно. Если определенными методами перевести краун-эфир комплексообразование в растворенное краун-эфира с состояние, кальцием, то, учитывая должно произойти некоторое уменьшение концентрации кальция. Данное уменьшение будет трактоваться как доказательство наличия комплексообразования. Таблица 3.4.1 Объемы ЭДТА, пошедшие на титрование 5мл раствора хлорида кальция с концентрацией 10 -2М при добавлении 1,3мл гидроксида натрия и краун-эфира на примере бензо-18-краун-6 (индикатор мурексид) Масса краун-эфира (г) Объем ЭДТА (мл) 0,02 11,9 0,02 11,8 0,04 11,8 0,04 12,0 0,34 11,9 0,34 11,8 1,019 11,9 Как видно из приведенных в таблице 3.4.1 результатов, несмотря на различную концентрацию бензо-18-краун-6 95 в растворе, количество пошедшего на титрование ЭДТА одно и то же. Можно предположить, что в проведенном опыте бензо-18-краун-6 либо не образует комплекса с Са2+ , или этот комплекс не является достаточно устойчивым в данных условиях (водный раствор, присутствие сильного комплексона). 3.4.2 Сущность метода контролируемой диффузии Метод контролируемой диффузии (МКД) заключается в следующем. В пробирку последовательно наслаивают друг на друга три раствора: р1 водный высоко концентрированный раствор «аналита» с высокой плотностью, р2 - органический, не смешивающийся с водой раствор сенсора с известной концентрацией и более низкой плотностью, чем р1; р3 дистиллированная вода. При этом известны и строго фиксированы объемы данных растворов, а значит и их соотношение. Основные результаты, полученные в ходе разработки метода МКД, следующие. При контакте р2 и р1 цвет р2 из синего переходит в желтый (время полного изменения окраски 45 сек.). После контакта раствора р2 с р3 цвет р2 из желтого постепенно (начиная с контактирующей с р3 части) переходит в синий (время полного изменения окраски 60 сек.). Цвет устойчив и не меняется после 1 часа выдерживания. Однако после 24 часового выдерживания синий цвет р2 вновь переходит в желтый. Из раствора р3 отбирается проба и проводится комплексометрическое титрование ЭДТА, в соответствии с которым концентрация Са2+ в растворе равна 0,05М (т.е. 50 мМ). В процессе постановки данного эксперимента были выявлены два важных наблюдения – последовательное изменение цвета р2 (восстановление первоначального цвета), названное эффектом ретрохромии, и концентрационная асимметрия р1 и р3 [7]. На основе полученных на базе МКД результатов было выдвинуто предположение о характере комплексообразования КЭ №3 в отношении к катионам Са2+ – наличию концентрационного порога для Са2+, что связано с 96 существенным влиянием водного окружения на комплексообразование между молекулами КЭ №3 и катионами Са2+. В случае, когда концентрация катионов кальция уменьшается ниже пороговой (<0,05M), то процесс комплексообразования прекращается. Обоснование этого предположения – наличие устойчивой концентрационной асимметрии и эффекта ретрохромии в системе растворов МКД. Подобные результаты были подтверждены на примере КЭ №4 в хлороформе, а также на примере КЭ №2 в хлороформе. Так, использовался раствор КЭ №2 в хлороформе с массовой долей КЭ №2 4%, объемом 3мл (n=5,21∙10-4 моль) и 5мл раствора хлорида кальция с концентрацией 60 мМ (n=3∙10-4 моль). После их контакта в течение суток наблюдалось помутнение раствора КЭ №2 в хлороформе (до контакта с раствором хлорида кальция раствор был прозрачным), а также изменение концентрации Са2+ в растворе хлорида Са2+ с 60 мМ до 50 мМ. При этом по количеству вещества КЭ №2был в избытке. Данный опыт неоднократно воспроизводился. Кроме того, был поставлен контроль - данный вариант раствора выдерживался 10 дней, и титровался водный раствор, первоначально содержащий 60 мМ катионов Са2+. Титрование показывало концентрацию Са2+, равную 50 мМ. В процессе дальнейшей работы были широко использованы методы МКД на различных средах с целью получения ХМ на основе КЭ. Так, в качестве матрицы для ХМ были выбраны полимерные пленки и гели. В качестве полимерных пленок были использованы ПВБ и ЦАГФ, а в качестве геля – желатин. Серия экспериментов по выбору и изучению перспективных матриц для ХМ свелась к тому, что на основе технологии пленкоформирования на жидкой подложке в пробирке удалось сформировать пленки в методе МКД, где р2 являлась пленка толщиной 10 мкм. Также по аналогии с этими пленками, сформированными в пробирке, был использован желатин с водой в соотношении 1:1. Толщина геля в качестве р2 примерно 0,8 – 1 мм. После пятидневного выдерживания пленок в МКД не обнаружено изменения содержания катионов кальция в р3. Такой же эффект был 97 обнаружен при выдерживании желатина в МКД, но при этом было зафиксировано увеличение толщины геля примерно на 80%. Впоследствии на желатиновом геле были разработаны и поставлены следующие эксперименты. Так, была использована система желатин:вода 1:1 и 1:10. 5 г сформированного геля добавляли в различные жидкости объемом 10 мл. При этом испарение исключалось. В качестве жидкостей использовалась вода, раствор перхлората кальция с концентрацией 60 мМ. Вначале были исследованы гели с соотношением 1:1: к 5 г геля добавляли 10 мл воды, и систему выдерживали сутки. Через сутки вода сливалась и повторно взвешивалась. При этом наблюдалось уменьшение массы воды на 10 - 12% (т.е. масса повторного взвешивания составляла 9 - 8,9г). Такой же опыт был проведен с системой 1:10. В этом случае изменение массы воды после суточного выдерживания составило 1,5 – 2 % от массы. Аналогичная серия опытов была поставлена с раствором хлорида кальция с концентрацией 60 мМ. Результаты взвешивания раствора хлорида кальция после суточного отстаивания с системой 1:1 также показали уменьшение массы раствора на 10-12%. После титрования раствора хлорида кальция было обнаружено незначительное изменение концентрации ионов Са2+ на 2,0-2,5%. Поставленные опыты с раствором хлорида кальция для системы 1:10 показали на тот же процент изменения массы раствора (1,5 2,0 %) и отсутствие изменения концентрации ионов Са2+ после суточного выдерживания. По результатам этих экспериментов для исследований была выбрана система 1:1. На ее основе были поставлены следующие эксперименты: введение в желатин (в относительно теплый раствор, не успевший затвердеть) соли хлорида кальция с концентрацией в полученном растворе 60 мМ (условное обозначение первой системы – «желатин+Са»). Для другой системы в желатин вводился КЭ №1 с концентрацией 0,1 М. (условное обозначение второй системы – «желатин+КЭ №1»). К первой системе («желатин+Са») была добавлена вода (в соотношении 10 мл воды на 5 г системы). Ко второй 98 системе («желатин+КЭ №1») был добавлен раствор хлорида кальция с концентрацией 60 мМ. Для системы «желатин+Са» масса воды была повторно взвешена и протитрована; по результатам взвешивания масса воды уменьшилась на 18-20%, а концентрация катионов Са2+ в воде титриметрически обнаружена не была. Для системы «желатин+КЭ №1» масса раствора уменьшилась на 22-25%, а концентрация катионов Са2+, обнаруженная титриметрически, составила значение 49 мМ. При этом по количеству вещества КЭ №1 был в избытке по сравнению с катионами Са2+ в растворе. Для системы «желатин+КЭ №1» был поставлен опыт с заменой раствора хлорида кальция на воду. В результате масса воды также уменьшалась на 22-25%. На основании данных экспериментов было предложено совместное использование двух краун-эфиров в геле в таком количестве, чтобы одного из них (КЭ №1) было в 100 раз больше другого (КЭ №3). Была изготовлена система «желатин:вода» в массовом соотношении 1:1, с концентрацией КЭ №1 100 мМ и концентрацией КЭ №3 1 мМ. Данная система была приведена в контакт с раствором хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. После этого окраска системы изменилась от оранжевокрасной до желто-зеленой. На рисунке 3.4.1 представлены фотографии полученных желатиновых систем. 99 а) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ б) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ после контакта с раствором хлорида кальция c концентрацией 60 мМ. 100 в) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сверху. г) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сбоку. Рисунок 3.4.1 Желатиновые системы до и после контакта с растворами хлорида кальция с концентрациями 60 мМ и 5 мМ: а) Система желатин-КЭ №3 при концентрации 1 мМ; б) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ после контакта с раствором хлорида кальция c концентрацией 60 мМ; в) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сверху; г) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сбоку Полученные результаты коррелируют с результатами Громова и сотр. по исследованию катионами комплексообразования металлов [1,2] и производного свидетельствуют 101 о краун-эфиров с перспективности использования данной системы и общего методологического подхода использования гелей в получении хемосенсорных нанокомпозитных материалов. Таким образом, проведенные исследования показали следующее: 1. Разработана эффективная комплексообразования производных методика исследования краун-эфиров с катионами кальция с использованием различных растворителей, названная авторами «методом контролируемой диффузии». 2. Посредством данной методики были изучены особенности процесса комплексообразования некоторых производных краун-эфиров с катионами кальция. 3. Предложена новая рецептура получения сенсорных материалов на основе двух типов краун-эфиров, иммобилизованных в пленку из желатина. 4. МКД позволяет не только проводить исследования молекулярного поведения в системе растворов, но и является основой для подтверждения достоверности интерпретации получаемых в процессе исследования фактических результатов. 3.5 Исследование комплексообразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция Были изготовлены пленки с расчетной толщиной 50 мкм. Состав пленок: желатин, КЭ №3, КЭ №1. Мольное отношение КЭ №3:КЭ №1 = 1:100. Они были приведены в контакт: 1) с дистиллированной водой; 2) с растворами хлорида кальция с концентрациями 1, 2, 5 мМ; 3) с растворами хлорида кальция и натрия с концентрациями 5 и 150 мМ, соответственно, а также 5 и 50 мМ, соответственно. 102 После этого полученные ХМ были подвергнуты спектроскопическим исследованиям (снятие спектров поглощения и спектров флуоресценции), интенсивность, отн.ед. результаты которых представлены на рис. 3.5.1 – 3.5.5. 0,035 2 0,030 1 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 450 500 550 600 650 700 длина волны, нм Интенсивность, отн. ед. Рисунок 3.5.1 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в воде 0,3 0,2 2 1 400 500 0,1 0,0 300 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.5.2 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 1 мМ 103 Интенсивность, отн. ед. 0,3 2 1 0,2 0,1 0,0 400 500 600 700 Длина волны, нм интенсивность, отн.ед. Рисунок 3.5.3 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 2 мМ 0,8 2 0,7 0,6 0,5 1 0,4 0,3 0,2 0,1 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 длина волны, нм Рисунок 3.5.4 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ 104 интенсивность, отн. ед. 2 0,030 1 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 450 500 550 600 650 700 длина волны, нм Интенсивность, отн. ед. Рисунок 3.5.5 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. 0,3 0,2 2 1 400 500 0,1 0,0 600 700 Длина волны, нм Рисунок 3.5.6 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ и хлорида натрия с концентрацией 150 мМ 105 интенсивность, отн.ед. 0,07 0,06 0,05 2 1 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 450 500 550 600 650 700 длина волны, нм Рисунок 3.5.7 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ и хлорида натрия с концентрацией 50 мМ Из графиков спектров поглощения видно, что для КЭ №3, иммобилизованного в желатиновой системе в присутствии КЭ №1 в отношении к КЭ №3 = 100:1 в присутствии одновременно двух солей (хлоридов натрия и кальция в соотношении 100:1 соответственно) наблюдается гипсохромный сдвиг (Δλmax = -5 нм). В присутствии хлорида кальция при концентрации 2 мМ наблюдается незначительный гипсохромный сдвиг (Δλmax = -3 нм), который можно расценивать в пределах ошибки эксперимента. В присутствии хлорида кальция при концентрации 1 мМ наблюдается незначительный сдвиг максимума поглощения в батохромную область (Δλmax = +8 нм), что указывает на возможное проявление сольватохромного эффекта. В присутствии хлорида кальция при концентрации 5 мМ наблюдается выраженный сдвиг максимума поглощения в гипсохромную область (Δλmax = -39 нм), что указывает на образование комплекса между КЭ №3 и кальцием. В таблице 3.5.1 приведены результаты спектров поглощения для желатиновых пленок с иммобилизованным КЭ №3. 106 Таблица 3.5.1 Положение максимума поглощения для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 в различных водных растворах Желатиновая пленка сдвиг , нм, , нм, на основе КЭ №3/КЭ , нм (до пропитки) (после пропитки) №1=1:100 Р-р CaCl2 1 мМ 444 452 +8 Р-р CaCl2 и NaCl 445 440 -5 Р-р CaCl2 2 мМ 447 444 -3 Р-р CaCl2 5 мМ 443 404 -39 5 и 150 мМ соот. Из графиков спектров флуоресценции видно, что для КЭ №3, иммобилизованного в желатиновой системе в присутствии КЭ №1 в отношении к КЭ №3 = 100:1 в присутствии воды наблюдается батохромный сдвиг флуоресценции (Δλmax = +9 нм). В присутствии одновременно двух солей (хлоридов натрия и кальция в соотношении 10:1 соответственно) наблюдается гипсохромный сдвиг (Δλmax = -9 нм). В присутствии хлорида кальция при концентрации 5 мМ наблюдается выраженный сдвиг максимума флуоресценции в гипсохромную область (Δλmax = -103 нм), что указывает на образование комплекса между КЭ №3 и кальцием. В таблице 3.5.2 приведены результаты спектров флуоресценции для желатиновых пленок с иммобилизованным КЭ №3. Таблица 3.5.2 Положение максимума флуоресценции для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 в различных водных растворах Желатиновая пленка сдвиг , нм, , нм, на основе КЭ №3/КЭ (до пропитки) (после , нм №1=1:100 пропитки) Вода 609 618 +9 Р-р CaCl2 и NaCl 605 596 -9 607 504 -103 5 и 50 мМ соот. Р-р CaCl2 2 мМ 107 Также был снят спектр флуоресценции с контрольной желатиновой пленки, в которую иммобилизовали не КЭ №3, а его заранее приготовленный комплекс интенсивность, отн.ед. с кальцием, обозначенный как [КЭ №3+Са]. 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 450 500 550 600 650 700 длина волны, нм Рисунок 3.5.8 Спектр флуоресценции желатиновой пленки с иммобилизованным готовым комплексом КЭ №3 и кальция – [КЭ №3+Са] Из графика спектра флуоресценции (рис.3.5.8) видно, что для готового комплекса [КЭ №3+Са], иммобилизованного в желатиновую систему, максимум флуоресценции соответствует 503 нм, что примерно равно значению максимума флуоресценции для желатиновой пленки с сопряженными краун-эфирами на основе КЭ №3 после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. В таблице 3.5.3 приведены результаты максимумов флуоресценции для КЭ №3 в растворе (растворитель - ацетонитрил), в желатиновой пленке с иммобилизованным [КЭ №3+Са] и желатиновая пленка на основе сопряженных кран-эфиров. 108 Таблица 3.5.3 Положение максимума флуоресценции для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 1:100 при контакте с раствором хлорида кальция 5 мМ; желатиновой пленки с иммобилизованным готовым комплексом [КЭ №3+Са], а также для КЭ №3 в растворе (растворитель – ацетонитрил) Система сдвиг , нм, , нм, (до (после , нм пропитки) пропитки) Желатин+ [КЭ №3+Са] 503 Желатин КЭ №3/КЭ 607 504 -103 660 555 -105 №1 1:100 КЭ №3 в ацетонитриле Из таблицы видно, что сдвиг максимума флуоресценции для раствора КЭ №3 после добавления к нему перхлората Са составляет -105 нм, что практически совпадает с величиной сдвига максимума флуоресценции для желатиновой пленки КЭ №3/КЭ №1 1:100, после контакта с раствором хлорида Са и составляет -103 нм. При этом значения максимума флуоресценции для этой пленки практически совпадают со значением максимума флуоресценции для желатиновой пленки с иммобилизованным комплексом [КЭ №3+Са] (504 нм и 503 нм соответственно). Полученные результаты указывают на достоверность комплексообразования КЭ №3 в желатиновой системе КЭ №3/КЭ №1= 1:100 с катионом кальция в водном растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. К графикам спектров поглощения и флуоресценции прилагается фотография желатиновой пленки КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 до и после замачивания (оранжевого цвета до и желто-зеленного после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ). 109 Рисунок 3.5.9 Фотография желатиновой пленки с системой КЭ №3/КЭ №1=1:100 до и после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ (до замачивания - оранжевого цвета, после желто-зеленого цвета). 110 Выводы 1. Разработаны методики, получены и исследованы хемосенсорные материалы на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включенными биоорганическими соединениями типа азакраун-эфирных производных стириловых красителей, для детекции катионов кальция и аминокислот в биологических жидкостях. Изучены оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах, установлено влияние матрицы на сдвиги максимумов спектров поглощения и флуоресценции. Оптимизированы методы получения и свойства хемосенсорных материалов. 2. Установлено, что при комплексообразовании соединения №5 с рядом аминокислот (с концентрацией 1 мМ) в пленках целлюлозы ацетатфталата наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в присутствии раствора аланина в длинноволновую область на 5 нм, изолейцина — на 7 нм, глицина и серина – на 8 нм, аргинина — на 9 нм, фенилаланина – на 12 нм, что перспективно для детекции аминокислот. 3. Разработан исследования экспериментально-расчетный комплексообразования метод производных и методика краун-эфиров с катионами кальция с использованием различных растворителей, названная «методом контролируемой диффузии». Посредством этого метода установлен первый концентрационный порог для определения катионов кальция с помощью исследованных производных краун-эфиров, равный 50 мМ. 4. Впервые получены наноструктурированные хемосенсорные материалы на основе желатина и иммобилизованных в него производного азакраун-эфира №4 и бензо-18-краун-6-эфира в массовом соотношении 1:100, что позволило комплексообразования. регулировать Указанные молекулярные бионанотехнологические механизмы решения позволили достичь в желатиновых матрицах сдвига флуоресценции на 103 нм в гипсохромную область для концентрации катионов кальция в водном растворе 5 мМ. 111 5. Получены материалы с монослои основой из и краун-содержащие биополимерной матрицы, композитные и показана перспективность последних для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля в биологических жидкостях катионов кальция и аминокислот. Практические предложения По материалам исследования разработаны: «Технологическая инструкция по изготовлению хемосеносрных бионанотехнологических пленок на основе желатина и иммобилизованного КЭ-3 для детекции катионов «Методика кальция», утвержденная получения бионанотехнологических и ВНИТИБП характеристики материалов для РАСХН (21.10.2010г.); лабораторных сенсорных образцов устройств», утвержденная научно-методическим советом ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 22 от 16.12.2010). Основные результаты диссертации используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии», и в рамках НОЦ ФГОУ ВПО МГАВМиБ (ГК 02.740.11.0270 и ГК 02.740.11.0718). 112 Список литературы 1. Алыкова, Т.В. Химический мониторинг объектов окружающей среды/ Т.В. Алыкова. - Астрахань: Астрах. гос. пед. ун-т, 2002. - 210с. 2. Грицкова, И.А. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка / И.А. Грицкова, А.Г. Марков, В.А. Быков, Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.В. Хачатурян, М.А. Мягкова, А.П. Каплун, В.Б. Скопинцев // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника / Москва. – 2005. – Вып. 1-2. – С. 69-75. 3. Грицкова, И.А. The effect of the conditions of the chemical reaction of ionic surfactant formation at the interface on the dispersity of emulsions and polymer suspensions / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Коллоидн. журнал – 1999. – Т. 61. № 2. – С. 264-270. 4. Громов, С.П. Супрамолекулярная органическая фотохимия краунсодержащих стериловых красителей / С.П. Громов, М.В. Алфимов // Известия Академии наук. Серия химическая. – 1997. – №4. – С.641-665. 5. Гуль, В. Е. Физико-химические основы производства полимерных плёнок / В.Е. Гуль, В.П. Дьяконова – М.: Наука, 1978. – 279 с. 6. Давыдова, С.Л. Удивительные макроциклы / С.Л. Давыдова – Л.: Химия, 1989. – 306 с. Дугов, Ю.С. Экологическая аналитическая химия. / Ю.С. Дугов. - М., 2000. - 432 с. 8. Егоров, В.В. Новый сульфатселективный электрод и его применение в анализе / В.В. Егоров, В.А. Назаров, Е.Б. Окаев, Т.Е. Павлова // Журнал аналитической химии / Академиздатцентр "Наука" РАН. – 2006. – Т. 61. – С. 416-432. 9. Ермаков, В.В. Геохимическая экология животных. / В.В. Ермаков, С.Ф. Тютиков. - М.: Наука, 2008. -315 с. 113 10. Зайцев, С. Ю. Мембранные наноструктуры на основе биологически активных соединений для бионанотехнологии / С.Ю. Зайцев // Российские нанотехнологии. – 2009. – Т.4. – № 7-8. – С. 6-18. 11. Зубков, И. Л. Оптические химические сенсоры для контроля герметичности изделий машиностроения / И.Л. Зубков, С.А. Добротин // «Известия Орловского государственного технического университета». – 2003. – № 4. – С. 105-106. 12. Зубков И.Л. Оптический химический сенсор для контроля концентрации аммиака в воздухе: Автореферат дис. … канд. техн. наук. / Зубков И.Л. – Н.Новгород, 2007. – 19 с. 13. Зубов, В.П. Молекулярное конструирование полимерных материалов для биотехнологии и медицины / В.П. Зубов, А.Е. Иванов, Л.С. Жигис, Е.М. Рапопорт, Е.А. Марквичева, Ю.В. Лукин, С.Ю. Зайцев // Биоорганическая химия. – 1999. – Т. 25. № 11. – С. 868-880. 14. Лакшминараянайах, Н. Мембранные электроды / Н. Лакшминараянайах – Л.: Химия, 1979. – 360 с. 15. Лев, А.А. Моделирование ионной избирательности клеточных мембран / А.А. Лев – Л.: Наука, 1976. – 210 с. 16. Легин, А.В. Сенсоры с высокой перекрестной чувствительностью на основе тетрафенилпорфирина для анализаторов типа "электронный язык" / А.В. Легин, С.М. Макарычев-Михайлов, О.Е. Горячева, А.М. Рудницкая, Ю.Г. Власов // Ж. прикл. химии. – 2002. – Т. 75. № 5. – С. 746-751. 17. Легин, А.В. Твердоконтактные полимерные сенсоры на основе композитных материалов / А.В. Легин, С.М. Макарычев-Михайлов, Д.О. Кирсанов, Ю.Г. Власов // Журнал прикладной химии. – 2002. – Т. 75. № 6, – С. 944-948. 18. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников – М.: Просвещение, 1987. – 815 с. 114 19. Платэ, Н. А. Реакции в смесях полимеров: эксперимент и теория / Н.А. Платэ, А.Д. Литманович, Я.В. Кудрявцев // Высокомолек. соед. – 2004. – Т. 46. № 11. – С. 1834-1877. 20. Пожарский, А.Ф. // Соросовский образовательный журнал.– 1997. – №9. – С. 32-39. 21. Прокопов, Н.И. / Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, А.И. Ишков, В.Р. Черкасов // Патент Республики Польша. № 445999 от 1.03.1999. 22. Прокопов, Н.И. Синтез монодисперсных функциональных полимерных микросфер для иммунодиагностических исследований / Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.Р. Черкасов, А.Е. Чалых // Успехи химии. – 1996. – Т.65. № 2. – С. 178-192 (Обзор). 23. Соборовер, Э.И. Высокоэффективная конструкция плосковолноводного оптического химического сенсора / Э.И. Соборовер, И.Л. Зубков // Датчики и системы. – 2003. – Вып.4. – С. 2-7. 24. Соборовер, Э.И. Плосковолноводный оптический химический сенсор для мультисенсорной системы атмосферного мониторинга / Э.И. Соборовер, И.Л. Зубков // Микросистемная техника. – 2004. – №12. – С. 3841. 25. Соборовер, Э.И. Функциональные полимеры – чувствительные материалы химических сенсоров / Э.И. Соборовер, И.Л. Зубков, С.Е. Леонтьев, С.В. Токарев, А.В. Царапкин, В.А. // Тверской «ПОЛИМЕРЫ– 2004». Сборник докладов третьей всероссийской Каргинской конференции. 27 января – 1 февраля 2004 г. / Москва: МГУ. – 2004. – С.78. 26. Соборовер, Э.И. ячейка сенсорного типа для исследования сорбции газов тонкими пленками в области сверхмалых концентраций / Э.И. Соборовер // Химическая физика. – 2007. – Т. 26. № 2. – С. 77-80. 27. Царькова, М.С. Эмульсионная полимеризация стирола в присутствии органических комплексов кобальта в качестве инициаторов / М.С. Царькова, Д.А. Кушлянский, В.А. Крючков, И.А. Грицкова // Высокомолек. соед. – 1999. – Т.41. № 9. – C. 1520. 115 28. Царькова, М.С. Эмульсионная полимеризация акриловых мономеров в присутствии кобальторганических инициаторов / М.С. Царькова, И.А. Грицкова, И.Я. Левитин, А.Л. Сиган // Высокомолек. соед. – 2005. – Т.47. № 2. – C. 376-381. 29. Цивадзе, А.Ю. Супрамолекулярные металлокомплексные системы на основе краунзамещенных тетрапирролов / Цивадзе А.Ю. //Успехи химии. – 2004. – Т. 73(1). – С. 6-25. 30. Хираока, М. Краун-соединения. Свойства и применения / М. Хираока, Пер. с англ. – М.: Мир, 1986. – 363 с., ил. 31. Boeker P. Mechanistic model of diffusion and reaction in thin sensor layers-the DIRMAS model / P. Boeker, O. Wallenfang, G. Horner // Sensors and Actuators B. – 2002. – Vol. 83. – P. 202-208. 32. Di Natale C. Application of a combined artificial olfaction and taste system to the quantification of relevant compounds in red wine / C. Di Natale, R. Paolesse, A. Macagnano, A. Mantini, A. D'Amico, M. Ubigli, A. Legin, L. Lvova, A. Rudnitskaya, Yu. Vlasov // Sensor and Actuators B – 2000. – Vol. 69. – P. 342347. 33. Di Natale C. Electronic nose and electronic tongue integration for improved classification of clinical and food samples / C. Di Natale, R. Paolesse, A. Macagnano, A. Mantini, A. D'Amico, A. Legin, L. Lvova, A. Rudnitskaya, Y. Vlasov // Sensors and Actuators B. – 2000. – Vol. 64. N. 1-3. – P. 15-21. 34. Esbensen K. Fermentation monitoring using multisensor systems: feasibility study of the electronic tongue / K. Esbensen, D. Kirsanov, A. Legin, A. Rudnitskaya, J. Mortensen, J. Pedersen, L. Vognsen, S. Makarychev—Mikhailov, Yu. Vlasov // Analytical and Bioanalytical Chemistry. – 2004. – Vol. 378. – P. 391-395. 35. Ipatov A. Determination of cyanide using flow-injection multisensor system / A. Ipatov, M. Ivanov, S. Makarychev-Mikhailov, V. Kolodnikov, A. Legin, Y. Vlasov // Talanta. – 2002. – Vol. 58. – P. 1071-1076. 116 36. Kim S. Self-assembled monolayer cleaning methods: Towards fabrication of clean high-temperature superconductor nanostructures / S. Kim, I.S. Chang and J.T. McDevitt // Appl. Phys. Lett. – 2005. – Vol. 86. – P. 154. 37. Kimura, K. Cation Binding by Macrocycles: Complexation of Cationic Species by Crown-ether / K. Kimura, T. Shono; Ed. G.W. Yoshihisa Inoue, N.Y.Gokel. – Marcel Dekker Inc. – 1990. – Р. 429-463. 38. Lamb J.D. Effects of Salt Concentration and Anion on the Rate of Carrier-Facilitated Transport of Metal Cations through Bulk Liquid Membranes Containing Crown Ethers / J.D. Lamb, J.J. Christensen, S.R. Izatt, K. Bedke, M.S. Astin, R.M. Izatt // J. Am. Chem. Soc. – 1980. – Vol. 102. N. 10. – P. 3399-3403. 39. Legin A. Cross-sensitivity of chalcogenide glass sensors in solutions of heavy metal ions / A. Legin, Yu. Vlasov, A. Rudnitskaya // Sensors and Actuators B. – 1996. – Vol. 34 N. 1-3. – P. 456-461. 40. Legin A.V. Determination of uranium(VI) and iron in different oxidation states in multicomponent solutions using an array of chemical sensors / A.V. Legin, B.L. Seleznev, A.M. Rudnitskaya, Yu.G. Vlasov // Radiochemistry (Russian). – 1999. – Vol. 41. N. 1. – P. 86-89. 41. Legin A.V. Multisensor system for determination of iron(II), iron(III), uranium(VI) and uranium(IV) in complex solutions / A.V. Legin, B.L. Seleznev, A.M. Rudnitskaya, Yu.G. Vlasov, S.V. Tverdokhlebov, B. Mack, A. Abraham, T. Arnold, L. Baraniak, H. Nitsche // Czechoslovak Journal of Physics. – 1999. – Vol. 49(S1). – P. 679-685. 42. Legin A. Chemical sensor array for multicomponent analysis of biological liquids / A. Legin, A. Smirnova, A. Rudnitskaya, L. Lvova, Yu. Vlasov // Anal. Chim. Acta. – 1999. – Vol. 385. – Р. 131-135. 43. Legin A. Application of electronic tongue for qualitative and quantitative analysis of mineral water and wine / A. Legin, A. Rudnitskaya, Y.Vlasov, C.Di Natale, E. Mazzone, A.D'Amico // Electroanalysis. – 1999. – Vol. 11. N. 10-11. – Р. 814-820. 117 44. Legin A. An electronic tongue distinguishes different mineral waters / A. Legin, A. Rudnitskaya, Y.Vlasov, C. Di Natale, A. Mantini, E. Mazzone, A. Bearzotti, A. D'Amico // Alta Frequenza (Italian). – 1999. – Vol. 10. – Р. 1-3. 45. Legin A.V. The features of the electronic tongue in comparison with characteristics of the discrete ion-selective sensors /A.V. Legin, A.M. Rudnitskaya, Yu.G. Vlasov, C. Di Natale, A. D'Amico // Sensors and Actuators B. – 1999. – Vol. 58. – P. 464-468. 46. Legin A. Application of electronic tongue for qualitative and quantitative analysis of complex media / A. Legin, A. Rudnitskaya, Y.Vlasov, C. Di Natale, E. Mazzone, A.D'Amico // Sensors and Actuators B. – 2000. – Vol.65. № 1-3. – P. 232-234. 47. Legin A. Application of the electronic tongue to milk quality monitoring, in Sensors and Microsystems / A. Legin, A. Rudnitskaya, L. Lvova, Y. Vlasov, A. D'Amico, C. Di Natale, R. Paolesse, C. Di Natale, A. D'Amico // P. Siciliano (eds.), World Scientific, Singapore. – 2000. – P.263-269. 48. Legin A. Recognition of liquid and flesh food using an "electronic tongue" / A. Legin, A. Rudnitskaya, B. Seleznev, Yu. Vlasov // International Journal of Food Science and Technology. – 2002. – Vol.37. – P.375-385. 49. Legin A. Electronic tongues: sensors, systems, applications, in Sensor Update (G.K. Fedder and J.G. Korvink eds.) / A. Legin, A. Rudnitskaya, Yu. Vlasov // WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim. – 2002. – Vol.10 – P. 143-188. 50. Legin A. Cross sensitive chemical sensors based on tetraphenylporphyrin and phthalocyanine / A. Legin, S. Makarychev-Mikhailov, O. Goryacheva, D. Kirsanov, Yu. Vlasov // Anal. Chim. Acta. – 2002. – Vol. 457. Iss. 2. – P. 297-303. 51. Legin A. Evaluation of italian wine by the electronic tongue: recognition, quantitative analysis and correlation with human sensory perception / A. Legin, A. Rudnitskaya, L. Lvova, Yu. Vlasov, C. Di Natale, A. D'Amico // Anal.Chim. Acta. – 2003. – Vol. 484. – P. 33-44. 118 52. Legin A. Electronic tongue distinguishes onions and shallots / A. Legin, A. Rudnitskaya, B. Seleznev, G. Sparfel, C. Dore // Acta Horticulturae. – 2004. – Vol. 634. – P. 183-191. 53. Legin A. tridodecylmethylammonium Solvent polymeric chloride studied membranes by based potentiometry on and electrochemical impedance spectroscopy / A. Legin, S. Makarychev-Mikhailov, D. Kirsanov, J. Mortensen, Yu. Vlasov // Anal.Chim.Acta. – 2004. – Vol. 514/1. – P. 107-113. 54. Legin A. Multicomponent analysis of fermentation growth media using the electronic tongue (ET) / A. Legin, D. Kirsanov, A. Rudnitskaya, J.J.L. Iversen, B. Seleznev, K. H. Esbensen, J. Mortensen, L. P. Houmoller, Yu. Vlasov // Talanta. – 2004. – Vol. 64. – P. 766-772. 55. Legin K. New sensing materials based on chalcogenide glasses containing sulphides of zinc, cadmium and manganese / K. Legin, A. Bolotov, A. Legin, Yu. Vlasov // J. Appl. Chem (Russian). – 2004. – Vol. 77. – P. 720-724. 56. Legin A. Potentiometric and impedance studies of membranes based on anion-exchanger and lipophilic inert electrolyte ETH 500 / A. Legin, S. Makarychev-Mikhailov, J. Mortensen, Yu. Vlasov // Electrochimica Acta. – 2004. – Vol. 49. – P. 5203-5207. 57. Legin A. Electronic tongue for pharmaceutical analytics – quantification of tastes and masking effects / A. Legin, A. Rudnitskaya, D. Clapham, B. Seleznev, K. Lord, Yu. Vlasov // Analytical and Bioanalytical Chemistry. – 2004. – Vol. 380. – P. 36-45. 58. Legin A. Method of multidimensional calibrations for fitting of dynamic response of flow-injection multisensor system / A. Legin, A. Rudnitskaya, K. Legin, A. Ipatov and Yu. Vlasov // J. Appl. Chem (Russian). – 2005. – Vol. 78. Iss. 1. – P. 90-96. 59. Legin A. Electronic tongue for quality assessment of ethanol, vodka and eau-de-vie / A. Legin, A. Rudnitskaya, B. Seleznev, Yu. Vlasov // Anal.Chim. Acta. – 2005. – Vol. 534. – P. 129-135. 119 60. Legin A. Tasting of beverages using an electronic tongue / A. Legin, A. Rudnitskaya, Yu. Vlasov, C. Di Natale, F. Davide, A. D’Amico // Sensors and Actuators B. – 1997. – Vol. 44. N. 1-3. – P. 291-296. 61. Lehn J.M. Cryptates—Inclusion Complexes of Macropolycyclic Receptor Molecules / J.M. Lehn // Pure Appl. Chem. –1978 – N. 50. – P. 871-892. 62. Lehn J.M. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives / J.M. Lehn // Weinheim, New York, Basel, Cambridge, Tokyo, VCH Verlagsgesellschaft mbH. – 1995. – P. 271. 63. Li S.F. Disposable polydimethylsiloxane/silicon hybrid chips for protein detection / S.F. Li, P.N. Floriano, N. Christodoulides, D.Y. Fozdar, D.B. Shao, M.F. Ali, P. Dharshan, S. Mohanty, D. Neikirk, J.T. McDevitt and S.C. Chen // Biosens.Bioelectron. – 2005. – Vol. 21. – P. 574-580. 64. Lvova L. All-solid-state electronic tongue and its application for beverage analysis / L. Lvova, S.S. Kim, A. Legin, Yu. Vlasov, G.S. Chaa , H. Nam // Anal. Chim. Acta. – 2002. – Vol. 468. Iss. 2. – P. 303-314. 65. Lvova L. Multicomponent analysis of Korean green tea by means of disposable all-solid-state potentiometric electronic tongue microsystem / L. Lvova, A. Legin, Yu. Vlasov, G.S. Cha, H. Nam // Sensors and Actuators. – 2003. – Vol. B 91. – P. 32-38. 66. Makarychev-Mikhailov S. Carbonate Sensors Based on 4- Hexyltrifluoroacetophenone Modified by Acceptor Substituents in Phenyl Ring / S. Makarychev-Mikhailov, O. Goryacheva, J. Mortensen, A. Legin, S. Levitchev, Y. Vlasov // Electroanalysis. – 2003. – Vol. 15. N. 15-16. – P. 1291-1296. 67. Makarychev-Mikhailov S. Potentiometric and theoretical studies of the carbonate sensors based on 3-bromo-4-hexyl-5-nitrotrifluoroacetophenone / S. Makarychev-Mikhailov, A. Legin, J. Mortensen, S. Levitchev, Yu. Vlasov // Analyst. – 2004. – Vol. 129. – P. 213–218. 68. Mortensen J. A flow-injection system based on multisensor system for determination of heavy metals in the incinerator waste gases, Journal of Applied Chemistry (Russian) / J. Mortensen, A. Legin, A. Ipatov, A. Rudnitskaya, Yu. 120 Vlasov, K. Hjuler Journal of Applied Chemistry (Russian). – 1999. – Vol. 72. – P. 8533-8536. 69. Mortensen J. A flow-injection system based on chalcogenide glass sensors for determination of heavy metals / J. Mortensen, A. Legin, A. Ipatov, A. Rudnitskaya, Yu. Vlasov, K. Hjuler // Anal. Chim. Acta. – 2000. – Vol. 403. N. 12. – P. 273-277. 70. Mourzina Yu.G. Development of multisensor system based on chalcogenide thin film sensors for the simultaneous multicomponent analysis of metal ions in complex solutions / Yu.G. Mourzina, J. Schubert, W. Zander, A. Legin, Yu. G. Vlasov, H. Luth, M.J. Shoning // Electrochimica Acta. – 2001. – Vol. 47. – P. 251-258. 71. Mourzina Yu.G. A new thin film Pb microsensor based on chalcogenide glasses / Yu.G. Mourzina, M.J. Shoning, J. Schubert, W. Zander, A. V. Legin, Yu. G. Vlasov, Kordos P, Luth H // Sensor and actuators –2000. – Vol. 71. – P. 13-18. 72. Pedersen C.J. // J. Amer. Chem. Soc. –1967. – Vol. 89. – Р. 2495. 73. Pedersen C.J. Cyclic polyethers and their complexes with metal salts// J. Am. Chem. Soc. – 1967. – Vol. 89. N. 26. – P. 7017-7036. 74. Prelog V. // Pure Appl. Chem. – 1978. – Vol. 50. – P. 893-904. 75. Rudnitskaya A. Quality monitoring of fruit juices using an electronic tongue / A. Rudnitskaya, A. Legin, S. Makarychev-Mikhailov, O. Goryacheva, Yu. Vlasov // Analytical Sciences. – 2001. – Vol. 17. – P. 309-312. 76. Rudnitskaya A. Multisensor system on the basis of an array of nonspecific chemical sensors and artificial neural networks for determination of inorganic pollutants in model groundwater / A. Rudnitskaya, A. Ehlert, A. Legin, Yu. Vlasov, S. Buttgenbach // Talanta. – 2001. – Vol. 55. Iss. 2. – P. 425-431. 77. Schoning M. The film sensors on the basis of chalcogenide glass materials prepared by pulsed laser deposition technique / M. Schoning, C. Schmidt, J. Schubert, W. Zander, S. Mester, P. Kordos, H. Luth, A. Legin, B. Seleznev, Yu. Vlasov // Sensors and Actuators B. – 2000. – Vol.68. – P. 254-259. 121 78. Schubert J. Multicomponent thin films for electrochemical sensor applications prepared by pulsed laser deposition / J. Schubert, M.J. Shoning, Yu.G. Mourzina, A. V. Legin, Yu. G. Vlasov, W. Zander, H. Luth // Sensors and Actuators B. – 2001. – Vol. 76. – P. 327-330. 79. Shoning M.J. Can pulse laser deposition serve as an advanced technique in fabricating chemical sensors? / M.J. Shoning, Yu.G. Mourzina, J. Schubert, W. Zander, A. Legin, Yu. G. Vlasov, H. Luth // Sensors and Actuators B. – 2001. – Vol. 78. – P. 273-278. 80. Shoning M.J. Pulsed laser deposition - an innovative technique for preparing inorganic thin films / M.J. Shoning, Yu.G. Mourzina, J. Schubert, W. Zander, A. Legin, Yu. G. Vlasov, H. Luth // Electroanalysis. – 2001. – Vol. 13. N. 8-9. – P. 727-732. 81. Söderström C. Differentiation of Four Aspergillus Species and One Zygosaccharomyces with Two Electronic Tongues Based on Different Measurement Techniques / C. Söderström, A. Rudnitskaya, A. Legin, C. KrantzRülcker // Journal of Biotechnology. – 2005. – Vol. 119. – Iss. 3. – P. 300-308. 82. Turner C. Monitoring batch fermentation with an electronic tongue / C. Turner, A. Rudnitskaya, A.Legin // Journal of Biotechnology. – 2003. – Vol. 103. – P. 87-91. 83. Vlasov Yu. Cross-sensitivity evaluation of chemical sensors for electronic tongue: determination of heavy metal ions / Yu. Vlasov, A. Legin, A. Rudnitskaya // Sensors and Actuators B. – 1997. – V. 44. – P. 532. 84. Vlasov Yu.G. "Electronic tongue" - new analytical tool for liquid analysis on the basis of non-specific sensors and methods of pattern recognition / Yu.G. Vlasov, A.V. Legin, A.M. Rudnitskaya, A. D'Amico, C. Di Natale // Sensors and Actuators B. – 2000. – Vol. 65. N. 1-3. – P. 235-236. 85. Vlasov Yu. Electronic tongues and their analytical application / Yu. Vlasov, A. Legin, A. Rudnitskaya // Analytical and Bioanalytical Chemistry. – 2002. – Vol. 373. N. 6. – P. 136-146. 122 86. Vlasov Yu. Non-specific sensor arrays (“electronic tongue”) for chemical analysis of liquids / Yu. Vlasov, A. Legin, A. Rudnitskaya, C. Di Natale, A. D’Amico // Pure and Applied Chemistry. – 2005. – Vol. 77. N. 11. – P. 19651983. 87. Weber E. Crown Ether and Analogs / Ed. S. Patai, Z. Rappoport. // N.Y.: John Wiley and Sons, 1989. – p. 305-357. 123 ПРИЛОЖЕНИЯ 124