Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс

На правах рукописи
АФАНАСЬЕВА Марина Алексеевна
РАЗВИТИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС:
НЕЙРОЭНДОКРИНО-ИММУННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Специальность 03.00.13 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в лаборатории гистогенеза Учреждения Российской
академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
МЕЛЬНИКОВА Виктория Ильинична
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
МАНУХИН Борис Николаевич
кандидат биологических наук
СВИРЩЕВСКАЯ Елена Викторовна
Ведущая организация:
Федеральное государственное учреждение
«Научно-исследовательский институт
физико-химической медицины»
Федерального медико-биологического
агентства
Защита диссертации состоится « 18 » ноября 2009 г. в 1500 часов на заседании
диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии
наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
Сайт: http://idbras.comcor.ru
e-mail: idbras@bk.ru.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте
Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН.
Автореферат разослан «___»______________2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
e-mail: ele0806@yandex.ru
2
Е.Б. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Актуальность исследования взаимодействий нейроэндокринной и
иммунной систем в онтогенезе определяется их ключевой ролью в
поддержании гомеостаза и интеграции развивающегося организма.
Формирование
отдельных
структурно-функциональных
элементов
иммунной системы и становление специфических взаимодействий между ними
не являются процессами, строго детерминированными генетически. Они
характеризуются высокой функциональной лабильностью и чувствительностью
ко многим регуляторным факторами, что открывает возможности для
коррекции нарушений процесса развития. Исследования в этой области
позволят расширить представление о механизмах развития иммунной системы
и будут способствовать пониманию причин как врожденных, так и
приобретенных патологий, связанных с нарушением нейроэндокриноиммунных взаимодействий.
Согласно современным представлениям, нейромедиаторы и нейрогормоны,
участвующие в регуляции определенной функции в постнатальный период,
могут влиять на формирование этой функции в ходе перинатального
онтогенеза. И хотя регуляторное влияние медиаторов нейроэндокринной
системы на иммунитет в постнатальном онтогенезе доказано многочисленными
экспериментальными и клиническими данными (Besedovsky, del Rey, 1996;
Barnard et al., 2008), их роль в развитии иммунной системы освещена лишь в
единичных работах. Известно, что удаление в раннем онтогенезе
надпочечников или щитовидной железы приводит к необратимому подавлению
тимус-зависимых функций. Подобные изменения не развиваются, если
операция проведена на половозрелых животных (Fabris et al., 1995).
Неонатальная блокада синтеза гонадотропин-рилизинг гормона или его
рецепторов у крыс и приматов вызывает долгосрочное снижение количества
лимфоцитов в тимусе, селезенке и общей циркуляции, подавление
гуморального и клеточного иммунитета (Morale et al., 1991; Gould et al., 1998).
В то же время установлено, что гонадотропин-рилизинг гормон включается в
регуляцию иммунного ответа уже в пренатальном онтогенезе (Zakharova et al.,
2000).
Остается открытым вопрос о формировании и функционировании
иммунной и нейроэндокринной систем у млекопитающих с интенсивными
физиологическими и биохимическими перестройками организма, в частности, в
отсутствие гипоталамического аргинин-вазопрессина у мутантных крыс
Brattleboro. Известно, что у крыс Brattleboro развиваются существенные
морфофункциональные отклонения в системе иммунитета: ускорение
возрастной инволюции тимуса и cелезенки, подавление антителогенеза,
подавление функциональной активности макрофагов (Захарова и др. 2001;
Хегай и др., 2003). С другой стороны, в отсутствие аргинин-вазопрессина
отмечено усиление активности естественных клеток-киллеров (Yirmiya et al.,
3
1989). В то же время формирование и функционирование Т-системы
иммунитета у этих крыс остается неизученным.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей развития Тсистемы иммунитета и влияния медиаторов нейроэндокринной системы на эти
процессы в перинатальном онтогенезе крыс. Для достижения указанной цели
были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние гипоталамо-гипофизарной системы и тимических пептидов
на основные механизмы регуляции численности клеточных популяций
тимуса и селезенки, такие как апоптоз и пролиферация.
2. Исследовать в тимусе в перинатальном периоде развития динамику
экспрессии иммунных протеасом как показателя становления отрицательной
селекции Т-лимфоцитов.
3. Изучить в раннем онтогенезе особенности миграции Т-лимфоцитов из
тимуса в белую пульпу селезенки для их созревания.
4. Оценить пролиферативный ответ Т-клеток тимуса и селезенки,
индуцированный митогеном, у крыс Brattleboro с наследственным
дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина.
5. Изучить молекулярные механизмы усиления противоопухолевого
иммунитета у крыс Brattleboro: экспрессию основных молекул главного
комплекса гистосовместимости класса I и иммунных протеасом в динамике
роста опухоли Walker 256.
6. Исследовать влияние дефицита моноаминов в пренатальном периоде
развития на формирование Т- и В-клеточного иммунитета.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые показано, что моноамины могут являться морфогенами в
критический период развития иммунной системы. Было установлено, что
пренатальный дефицит серотонина приводит к достоверному повышению
пролиферативного ответа Т-лимфоцитов тимуса и селезенки на митоген у
половозрелых животных, а также к десятикратному увеличению количества
антителообразующих клеток селезенки в ответ на иммунизацию тимусзависимым антигеном; пренатальный дефицит катехоламинов вызывает
подавление пролиферативного ответа на митоген Т-лимфоцитов тимуса и
селезенки половозрелых животных.
Изучена возрастная динамика спонтанного апоптоза и пролиферации
лимфоцитов тимуса и селезенки и впервые выявлена роль гипоталамогипофизарной системы в регуляции этих процессов. Показано, что выключение
гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению пролиферации
клеток селезенки, а выключение гипоталамуса и гипофиза приводит к
увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению уровня апоптоза в
селезенке.
Впервые исследована динамика экспрессии иммунных протеасом в тимусе
в перинатальном онтогенезе у крыс и проведен гистологический анализ их
4
распределения. Было показано, что иммунные протеасомы начинают
экспрессироваться в тимусе уже с 18-го дня пренатального развития и к 21-му
дню достигают уровня, характерного для взрослых животных. Полученные
данные позволили сделать заключение о том, что становление отрицательной
селекции лимфоцитов в тимусе может происходить уже в конце пренатального
периода развития.
Получены новые данные об особенностях первичной миграции Тлимфоцитов из тимуса в развивающуюся селезенку в раннем онтогенезе. Было
обнаружено, что у животных в неонатальном периоде развития, в отличие от
половозрелых, Т-лимфоциты, покидающие тимус, первично заселяют красную
пульпу селезенки и только потом мигрируют в соответствующие зоны белой
пульпы.
Обнаружены отклонения в Т-системе иммунитета у крыс Brattleboro с
отсутствием гипоталамического аргинин-вазопрессина, а именно, снижение
пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на митоген в 2 раза в тимусе и в 2-4
раза в селезенке на протяжении всего постнатального периода развития. Кроме
того, были выявлены новые механизмы усиления противоопухолевого
иммунитета у крыс Brattleboro: в опухоли Walker 256, развивающейся у крыс
Brattleboro с дефицитом аргинин-вазопрессина, восстанавливается экспрессия
молекул главного комплекса гистосовместимости класса I и образуется
уникальный пул протеасом, приводящие к ее регрессии.
Результаты выполненной работы могут найти практическое применение в
медицине при разработке подходов к лечению патологий у беременных
женщин, в частности в вопросах о возможности применения тех или иных
лекарственных средств на определенных сроках беременности и их
безопасности для плода. Полученные данные могут быть использованы в
экспериментальной и клинической иммунологии при изучении патогенеза
иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями секреции
нейромедиаторов и нейрогормонов. Кроме того, понимание механизмов
морфогенетического влияния нейромедиаторов на развитие иммунной системы
открывает новые возможности для коррекции врожденных нарушений системы
иммунитета на ранних этапах онтогенеза.
Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов
лекций по физиологии развития, иммунологии, а также учитываться при
проведении биомедицинских исследований.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были
представлены на Иммунологическом Форуме с международным участием
(Санкт-Петербург, 2008), VI симпозиуме «Химия протеолитических
ферментов» (Москва, 2007), 11-й международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука 21 века» (Пущино, 2007), 5-м
Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы.
Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и
аллергических заболеваний» (Москва, 2006), Конференциях молодых ученых
Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2005, 2006,
2007, 2008), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития»
5
(Звенигород, 2008), VI European Congress of Reproductive Immunology (Moskow,
2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных
работ. Статей в журналах – 8, из них статей в журналах, соответствующих
Перечню ВАК - 7, тезисов докладов в материалах конференций – 12.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 114
страницах, содержит 24 рисунка и состоит из следующих разделов: введения,
обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и
обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 185 цитируемых
источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные. В экспериментах были использованы крысы Wistar (питомник
"Столбовая" РАН), Brattleboro и WAG (Институт цитологии и генетики, СО
РАН, Новосибирск). Для получения самок с датированным сроком
беременности использовали 3-4-х месячных крыс. День обнаружения спермы в
мазке считали первым днем эмбрионального развития (Э1).
У части плодов проводили in utero декапитацию методом, разработанным
A. Jost (Jost, 1947) или энцефалэктомию методом, разработанным в ИБР РАН
(Мицкевич и др., 1970).
Уровень апоптоза и пролиферации клеток тимуса и селезенки в
онтогенезе крыс Wistar оценивали с помощью проточной цитометрии после
окрашивания фиксированных клеток йодистым пропидием (PI) у плодов на
Э18 и Э21, а также на 7-й день постнатального развития (П7), П15 и П30. В
отдельных экспериментах плодов на Э18 подвергали эцефалэктомии или
декапитации. У этих животных уровень апоптоза и пролиферации клеток
тимуса и селезенки на Э21 также определяли методом проточной цитометрии.
Для изучения влияния тимических пептидов на уровень апоптоза
тимоцитов in vitro суспензии клеток тимуса крыс Wistar на П30
культивировали в течение 2 часов в присутствии коммерческого препарата
тимических пептидов, Тактивина (Arion, 1989), в концентрациях 0,01, 0,1, 1, 10
и 50 мкг/мл, и без препарата. Затем в культуру тимоцитов добавляли
дексаметазон в концентрации 10-6М. Через 4, 6 или 8 часов клетки
фиксировали, окрашивали PI и оценивали уровень апоптоза методом проточной
цитометрии.
Определение уровня апоптоза и пролиферации методом проточной
цитометрии. Клетки тимуса и селезенки фиксировали охлажденным 70%-ным
этанолом, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), и инкубировали с
рибонуклеазой А (100 мкг/мл, Sigma, США) при 37оС в течение 20 мин, затем с
PI (1 мкг/мл, Sigma, США) 20 мин при комнатной температуре. Анализ
внутриклеточного содержания ДНК осуществляли с помощью проточного
цитофлуориметра «Coulter EPICS XL-MCL». С использованием программы
«MultiCycle» определяли количество апоптотических и пролиферирующих
клеток.
6
Для фармакологического подавления синтеза серотонина у плодов
беременным самкам Wistar ежедневно с Э13 по Э17 вводили ингибитор
триптофангидроксилазы пара-хлорфенилаланин (п-ХФА) в/б в дозе 100мг/кг.
Для фармакологического подавления синтеза катехоламинов у плодов
беременным самкам Wistar ежедневно с Э13 по Э17 вводили ингибитор
тирозингидроксилазы -метил-п-тирозин (-МПТ) в/б в дозе 100мг/кг.
Контрольной группе вводили равный объем 0,9% р-ра NaCl. У потомства на
Э21, П3, П18, П70 и П90 оценивали индуцированный Конканавалином А (Кон
А) пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса, а на П3, П18, П70 и П90 –
лимфоцитов селезенки. Количество антителообразующих клеток (АОК) к
эритроцитам барана (ЭБ) оценивали на П18 и П70. Для этого в указанные сроки
крыс иммунизировали внутрибрюшинно 50% взвесью ЭБ в 0,5 мл 0,9%
раствора NaCl однократно. На 5-е сут после иммунизации получали суспензию
клеток селезенки. Количество АОК определяли модифицированным методом
Каннингхама (Cunningham, 1965). В отдельных экспериментах ингибитор
синтеза серотонина или катехоламинов вводили взрослым крысам в течение 3-х
дней и затем оценивали пролиферативный ответ на Кон А и гуморальный
иммунный ответ на ЭБ на 1-й, 10-й и 43-й дни после последней инъекции.
Исследование динамики содержания различных субъединиц протеасом
и молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I в
опухоли Walker 256 проводили на самцах крыс Brattleboro и WAG в возрасте 3
мес. Суспензию клеток линейнонеспецифической карциносаркомы Walker 256
вводили крысам в мышцу бедра в дозе 8х105 клеток. Через 7, 14, 17 и 24 сут
фрагменты опухоли извлекали из крыс, промывали 0,01М ФСБ, взвешивали и
хранили при –70оС. Затем готовили осветленные гомогенаты и определяли
содержание различных субъединиц протеасом и основных молекул ГКГ класса
I методом Вестерн-блоттинга.
Культивирование клеток тимуса и селезенки проводили в атмосфере 5%
CO2 при 37С в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плодов
крупного рогатого скота, 2 мМ L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина.
Плотность клеток составляла 1106 ядросодержащих клеток в 1 мл среды.
Оценка пролиферативного ответа лимфоцитов на митоген in vitro.
Клетки тимуса и селезенки культивировали в течение 72 часов в присутствии
Кон А (2,5 мкг/мл), как описано ранее (Захарова и др., 2000).
Иммуногистохимическое
окрашивание.
Были
использованы
поликлональные антитела кролика к иммунным субъединицам LMP2 и LMP7
протеасом (Affiniti, Великобритания, 1:2500), моноклональные антитела мыши
к CD3 (BD Biosciences, США, 1:500), смесь моноклональных антител мыши к
цитокератинам 10,14,18,19 (Novocastra, Великобритания, 1:25), антитела овцы к
IgG кролика, меченные Cy3 (Sigma, США, 1:500), антитела козы к IgG мыши,
меченные FITC (Sigma, США, 1:100). Ткань фиксировали 4% раствором
параформальдегида, иммуногистохимическое окрашивание проводили на на
криостатных срезах толщиной 10 мкм в соотвествии с протоколом, описанным
Соза с соавт. (Soza et al., 1997). Для контроля специфичности реакцию
7
проводили в отсутствие первых антител. Анализ изображения проводили с
помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRXA2 (Германия).
Анализ содержания иммунных протеасом в тимоцитах методом
проточной цитометрии. Образцы, содержащие 1106 тимоцитов в 100 мкл
буфера для цитометрии, содержащем 0,02М ФСБ, 0,05% азида натрия (Amresco,
США) и 2% бычьего сывороточного альбумина (Amresco, США), инкубировали
с антителами к CD90 (1:10000), конъюгированными с фикоэритрином (BD
Biosciences, США), 30 мин при +4C. Клетки фиксировали 4%
параформальдегидом (30 мин, tкомн), инкубировали с поликлональными
антителами кролика к LMP7 или LMP2 (Affiniti, Великобритания, 1:2500) в
течение ночи при +4C, затем с антителами овцы к IgG кролика,
конъюгированными с Alexa488 (Invirtogen, США, 1:1000) в течение 2 часов при
комнатной температуре. Мечение клеток анализировали на цитофлуориметре
Cell Lab Quanta с помощью прилагаемого к прибору программного обеспечения
(Beckman Coulter, США).
Вестерн-блоттинг. Осветленные гомогенаты получали методом,
описанным ранее (Астахова, Шарова, 2006). Электрофорез белков в
полиакриламидном геле проводили в соответствии с методом Лэммли
(Laemmli, 1970). Для полусухого переноса полипептидов из геля на
нитроцеллюлозную мембрану использовали прибор Trans-Blot SD (Bio-Rad),
придерживаясь протокола производителя. Для выявления молекул ГКГ класса I
использовали мокрый перенос с помощью прибора Mini Trans-Blot Cell (BioRad). Мембрану окрашивали ранее описанным способом (Астахова, Шарова,
2006), используя поликлональные антитела кролика к LMP7, моноклональные
антитела мыши к LMP2, Rpt6 или 1,2,3,5,6,7 в разведении 1:2500 (Affiniti,
Великобритания) или моноклональные антитела мыши к -цепи основных
молекул ГКГ класса I крыс - RT1A - в разведении 1:100 (BD Biosciences, США).
В качестве вторичных антител использовали антитела к IgG кролика или IgG
мыши, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:2500 (Amersham,
Великобритания). Окрашенные мембраны подвергали стандартной обработке
системой ECL (Amersham, Великобритания). Для анализа оптической
плотности полос на рентгеновской пленке использовали компьютерную
программу Image J.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью
непараметрического критериия Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Возрастная динамика уровня естественного апоптоза и пролиферации
в тимусе и селезенке крыс. Программированная гибель клеток и их
пролиферация - два процесса, контролирующие численность клеточных
популяций в иммунной системе. Без поддержания сбалансированного
соотношения различных популяций лимфоцитов невозможно нормальное
функционирование иммунной системы. Апоптоз, кроме того, является основой
8
положительного и отрицательного отбора лимфоцитов в тимусе. Во вторичном
лимфоидном органе – селезенке – апоптозу по окончании иммунного ответа
подвергается избыточный пул лимфоцитов, образовавшийся путем
пролиферации нескольких активированных предшественников.
Согласно полученным данным, уровень апоптоза в тимусе плодов на Э18
достигал 25%, затем падал до 4-5% на Э21 и оставался приблизительно на том
же уровне в ходе последующего развития (рис. 1, а). Количество делящихся
клеток в тимусе достоверно не отличалось на всех исследованных сроках
развития и составляло 20-25% (рис. 1, б). Согласно данным литературы, около
20% всех тимоцитов, содержащихся в тимусе 5-недельных мышей, также
составляют делящиеся клетки (Egerton et al., 1990).
Уровень апоптоза в селезенке плодов на Э18 достигал 15%, на Э21
увеличивался до 25% и на П30 - до 37% (рис. 1, а). Количество делящихся
клеток в селезенке было максимально на Э18 и составляло 32% (рис. 1, б). На
Э21 их численность падала в два раза и составляла около 17%. На П7
пролиферация клеток вновь повышалась до 22% и затем постепенно убывала до
7% к П30. Выявленная динамика пролиферации клеток селезенки коррелирует
с изменениями интенсивности в ней гемопоэза (Van Den Heuvel et al., 1987). С
П7 по П15 пролиферация клеток селезенки снижается, а апоптоз увеличивается,
по-видимому, в основном за счет кроветворных клеток.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
а
35
*
*
*
30
25
б
*
*
*
*
20
15
10
5
0
Э18
Э21
П7
П15 П30
Э18
Э21
П7
П15 П30
Рис. 1. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса ( ) и
селезенки ( ) крыс в перинатальном онтогенезе. По оси ординат – количество клеток,
вступивших в апоптоз (а) и пролиферирующих клеток (б), % от общего количества
проанализированных клеток. * р <0,05 между указанными значениями.
Влияние гипоталамо-гипофизарной системы на уровень апоптоза и
пролиферации в тимусе и селезенке в пренатальном периоде развития.
После энцефалэктомии плодов in utero на Э18 (выключение гипоталамуса)
уровень апоптоза в тимусе на Э21 оставался таким же, как и у
ложнооперированных плодов и составлял около 9-10% (рис. 2, а). Однако у
интактных плодов процент клеток, подвергшихся апоптозу, был в два раза
ниже (4%), чем у ложнооперированных и энцефалэктомированных плодов (рис.
2, а). В селезенке уровень апоптоза у ложнооперированных и
энцефалэктомированных плодов увеличивался на треть по сравнению с
неоперированными плодами (рис. 2, а). Наблюдаемое увеличение численности
9
апоптозных клеток в тимусе и селезенке связано, по-видимому, с влиянием
хирургического стресса.
*
а
40
35 б
*
*
35
**
30
30
25
25
20
**
20
15
10
*
15
**
10
5
5
0
0
**
селезенка
тимус
тимус
селезенка
Рис. 2. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса и
селезенки у интактных (
), ложнооперированных (
) и энцефалэктомированных (
)
плодов крыс. По оси ординат – количество клеток, вступивших в апоптоз (а) и
пролиферирующих клеток (б), % от общего количества проанализированных клеток.
* р <0,05 между указанными значениями, **р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
Количество делящихся клеток в тимусе ложнооперированных и
энцефалэктомированных плодов также было достоверно выше по сравнению с
интактными плодами (рис. 2, б). Количество делящихся клеток в селезенке
энцефалэктомированных плодов оставалось на том же уровне, что и у
интактных (около 18%), но выше, чем у ложнооперированных плодов (около
13%), (рис. 2, б).
а
30
30
*
**
25
25
**
20
20
15
б
**
15
10
10
5
5
0
0
тимус
селезенка
тимус
селезенка
Рис. 3. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса и
селезенки у интактных (
), ложнооперированных (
) и декапитированных (
) плодов
крыс. Далее см. рис. 2.
После декапитации плодов in utero на Э18 (выключение одновременно
гипоталамуса и гипофиза) количество апоптозных клеток в тимусе на Э21
оставалось на одном уровне у всех исследованных групп животных и
составляло 4-5% (рис. 3, а). Количество пролиферирующих клеток при этом
10
повышалось (на 18%) по сравнению с контрольной группой (рис. 3, б). В
селезенке декапитированных плодов уровень апоптоза снижался почти в два
раза, тогда как пролиферативная активность клеток не менялась (рис. 3).
Таким образом, выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит
к усилению пролиферации клеток селезенки, а выключение гипоталамуса и
гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению
уровня апоптоза в селезенке. Полученные данные показывают, что численность
клеток в тимусе и селезенке в эмбриональном развитии контролируется
гипоталамо-гипофизарной системой.
Влияние тимических пептидов на уровень апоптоза тимоцитов in
vitro. Предполагается, что дифференцировка лимфоцитов находится под
контролем гормонов тимуса, имеющих пептидную природу. В последние годы
получены данные о регуляторном влиянии тимических пептидов на апоптоз
лимфоцитов селезенки крыс, а также лейкоцитов периферической крови
человека (Иванова и др., 2000; Хавинсон, Кветной, 2000).
Нами было исследовано влияние тимических пептидов (Тактивина) на
естественный апоптоз тимоцитов крыс на П30 в модели in vitro. Тактивин
представляет собой смесь пептидов с молекулярной массой от 1200 до 6000 Да,
выделенных из тимуса крупного рогатого скота и обладающих
иммунокорригирующей активностью, а также регулирующих ряд важных
биологических процессов (Arion, 1989). Ни в одной из исследованных
концентраций (0,01-50 мкг/мл) Тактивин не оказывал влияния на уровень
естественного апоптоза. Ранее было показано, что Тактивин также не влияет на
апоптотическую гибель клеток селезенки у взрослых особей in vivo (Захарова и
др., 2004).
Однако при индукции апоптоза дексаметазоном предварительное
добавление в культуру тимоцитов Тактивина значительно снижало уровень
апоптоза через 8 часов культивирования. Протекторные свойства Тактивина не
зависели от использованной концентрации, что позволяет предположить, что в
реализации его действия участвует целый ряд пептидов, одним из которых
может являться α1-тимозин (Baumann et al., 2000). На основании полученных
данных можно заключить, что тимические пептиды предотвращают развитие
индуцированного апоптоза и не влияют на уровень естественной гибели клеток.
Динамика содержания иммунных протеасом в тимусе в
перинатальном онтогенезе крыс. На разных этапах дифференцировки в
тимусе лимфоциты подвергаются процессам селекции. Не прошедшие
селекцию тимоциты элиминируются по механизму апоптоза. Выявленная
стабильность уровня естественного апоптоза в тимусе, начиная с Э21 (рис. 1, а),
позволяет предположить, что и процесс селекции тимоцитов может
устанавливаться еще до рождения. В связи с этим было исследовано
содержание внутриклеточных участников процесса отрицательной селекции –
иммунных протеасом – в перинатальном онтогенезе.
С помощью Вестерн-блоттинга иммунные субъединицы LMP7 и LMP2
обнаружены уже на Э18 (рис. 4). На Э21 и П1 их количество возрастало в 2–4
раза и практически не менялось до П19. Увеличение количества иммунных
11
протеасом в конце пренатального периода развития связано, по-видимому,
тем, что именно на этом этапе происходит активная дифференцировка
формирование функционально зрелых эпителиальных клеток кортикальной
медуллярной зон тимуса, способных обеспечивать положительную
отрицательную селекцию (Naquet et al., 1999; Manley, 2000).
Оптическая плотность, %
LMP7
с
и
и
и
LMP2
140
120
100
120
*
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
*
Э18 Э21 П1 П3 П5 П8 П19
Э18 Э21 П1 П3 П5 П8 П19
Рис. 4. Содержание иммунных субъединиц протеасом LMP7 и LMP2 в тимусе крыс в
перинатальном онтогенезе. * р <0,05 между указанными значениями.
LMP7
Цитокератины
Иммуногистохимически
субъединицы LMP2 и LMP7
также обнаружены в тимусе
крыс всех исследованных
возрастов (рис. 5). Наибольшее
их
количество
было 50 мкм
локализовано
в
клетках
LMP2
Цитокератины
стромы тимуса. При помощи
двойного
иммунофлуоресцентного
мечения LMP2- и LMP7субъединицы
выявлены
в
эпителиальных клетках тимуса 50 мкм
как в корковой, так и в
медуллярной зоне.
Рис. 5. Иммуногистохимическое выявление LMP7, LMP2
и цитокератинов. Стрелками указаны клетки с двойным мечением.
Функция иммунных протеасом генерировать как собственные, так и
чужеродные антигенные олигопептиды для последующего их представления Тлимфоцитам не единственная и, по-видимому, не первичная. С использованием
антител к иммунным субъединицам протеасом и антигену Т-лимфоцитов CD3
субъединицы LMP2 и LMP7 обнаружены и в лимфоцитах тимуса. При этом
количество иммунопозитивного материала в лимфоцитах было ниже, чем в
эпителиальных клетках. Наличие иммунных протеасом в тимоцитах было
подтверждено методом проточной цитометрии, с помощью двойного мечения
на иммунные субъединицы протеасом (LMP2, LMP7) и маркер Т-лимфоцитов
(CD90) как в эмбриональном, так и в постнатальном периоде (рис. 6). Известно,
что Т-клетки мышей с нокаутом генов субъединиц LMP7 и LMP10 обладают
12
повышенной пролиферативной активностью в ответ на поликлональные
митогены, что не связано с функцией генерации антигенных эпитопов (Caudill
et al., 2006). В связи с этим можно предположить, что наряду с представлением
антигенных эпитопов иммунные протеасомы в тимоцитах также могут
выполнять и другие важные функции, например, участвовать в образовании
биологически активных пептидов.
Э19
CD90+LMP7
CD90+LMP2
П30
CD90+LMP2
CD90-LgPE
CD90-LgPE
CD90+LMP7
LMP7-LgAlexa488 LMP2-LgAlexa488
LMP7-LgAlexa488 LMP2-LgAlexa488
Рис. 6. Цитофлуориметрический анализ содержания иммунных субъединиц протеасом
LMP7 и LMP2 в клетках тимуса на Э19 и П30. CD90 – маркер тимоцитов.
Таким образом, экспрессия иммунных протеасом, вовлеченных в
представление аутоантигенов тимоцитам при отрицательной селекции,
наблюдается в тимусе крыс не только в половозрелом возрасте, но и в раннем
онтогенезе. Становление процесса отрицательной селекции у крыс происходит,
по-видимому, уже в пренатальном периоде развития.
Особенности миграции Т-лимфоцитов в белую пульпу селезенки в
раннем постнатальном онтогенезе. Как известно, наивные Т-лимфоциты
мигрируют в селезенку из первичного лимфоидного органа - тимуса - для
завершения их дифференцировки и осуществления эффекторных функций.
Нами было изучено заселение белой пульпы селезенки Т-лимфоцитами в
процессе ее формирования в раннем онтогенезе. Метод двойного
иммунофлуоресцентного мечения с использованием антител к субъединице
LMP7, а также маркеру Т-клеток CD3 позволил установить, что миграция Тлимфоцитов в белую пульпу селезенки в процессе ее формирования в
онтогенезе происходит характерным способом, не свойственным взрослым
животным. У половозрелых животных Т-лимфоциты поступают из первичных
лимфоидных органов с током крови и лимфы непосредственно в белую пульпу
(Düllmanna et al., 2000), тогда как в развивающейся селезенке лимфоциты
сначала заселяют красную пульпу и только потом непосредственно мигрируют
в специфические зоны белой пульпы. Кроме того, показано, что иммунные
субъединицы протеасом экспрессируются на всех стадиях дифференцировки Тлимфоцитов. По-видимому, в Т-лимфоцитах иммунные протеасомы участвуют
в регуляции пролиферации или осуществляют другие неизвестные функции.
Пролиферативный ответ Т-клеток тимуса и селезенки на митоген у
крыс Brattleboro с дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина
(АВП). АВП является одним из гормонов, участвующих в нейроэндокриноиммунных взаимодействиях. Исследование роли АВП в формировании и
13
Включение [3Н]тимидина
имп/мин, 2 . 105 клеток
функционировании иммунной системы на протяжении всего периода жизни
проводили на мутантных крысах линии Brattleboro с дефицитом синтеза АВП в
гипоталамусе. Известно, что у крыс Brattleboro развиваются существенные
морфофункциональные отклонения в системе иммунитета (Захарова и др.,
2001; Хегай и др., 2003).
Согласно полученным данным, у мутантных крыс всех изученных
возрастов отсутствие АВП приводило к снижению индуцированного Кон А
пролиферативного ответа лимфоцитов тимуса в 2 раза и селезенки в 2-4 раза по
сравнению с нормальными крысами WAG (рис. 7). Сниженный
пролиферативный ответ в тимусе и селезенке крыс Brattleboro, вероятно,
обусловлен уменьшением количества функционально зрелых Т-лимфоцитов в
этих органах, поскольку, как известно, возрастная инволюция тимуса у крыс
Brattleboro протекает быстрее, чем у крыс WAG (Хегай и др., 2003).
Очевидно, что снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов не
обусловлено быстрым гормональным эффектом. Согласно данным литературы,
хроническое системное введение АВП взрослым крысам Brattleboro
нормализует у них водно-солевой баланс, но не влияет на повышенную
активность
естественных
клеток-киллеров
и
сниженный
уровень
кортикостерона в крови (Yirmiya et al., 1989). Таким образом, дефицит АВП в
онтогенезе у крыс Brattleboro, приводит к необратимым изменениям в
иммунной системе.
70000
90000
а
80000
60000
70000
50000
60000
40000
50000
30000
20000
б
*
*
*
40000
*
30000
20000
10000
*
0
1
3
6
*
*
10000
8
12
Возраст, мес.
*
*
0
1
3
6
*
12
8
Возраст, мес.
Рис. 7. Возрастная динамика индуцированного Кон А пролиферативного ответа
лимфоцитов тимуса (а) и селезенки (б) у крыс Brattleboro ( ) и WAG ( ).
* р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
Молекулярные механизмы усиления противоопухолевого иммунитета у
крыс Brattleboro с дефицитом гипоталамического АВП. Крысы Brattleboro
характеризуются усилением как активности естественных клеток-киллеров
(эффекторных клеток врожденного иммунитета), так и адаптивного
противоопухолевого иммунитета (Yirmiya et al., 1989; Хегай и др., 2006).
Согласно полученным ранее данным, у крыс Brattleboro наблюдается регрессия
линейно-неспецифической карциносаркомы Walker 256. Для нормальных крыс
характерен непрерывный рост этой опухоли, приводящий к летальному исходу
в среднем через 4 недели после прививки. У крыс Brattleboro увеличение
14
опухоли выражено слабо и продолжается только в течение первых 15-18 сут,
после чего наблюдается регрессия и полное исчезновение опухоли. При
повторном введении клеток Walker 256 опухоль не возникает. Это
свидетельствует о непосредственном участии иммунной системы в
обнаруженном феномене и формировании клеток памяти (Хегай и др., 2006).
Специфический иммунный ответ невозможен без эффективного
представления опухолевых антигенов. Важнейшими этапами этого процесса
являются, во-первых, протеолитическое расщепление белков с участием
протеасом, во-вторых, представление образовавшихся антигенных пептидов на
поверхности клетки в комплексе с молекулами ГКГ класса I.
Можно предположить, что у крыс Brattleboro распознавание опухоли
иммунной системой происходит более эффективно. В связи с этим нами был
проведен сравнительный анализ динамики содержания множественных форм
протеасом, а также исследована экспрессия молекул ГКГ класса I в опухоли
Walker 256 у нормальных крыс и крыс Brattleboro с дефицитом АВП.
Особенности экспрессии различных пулов протеасом в опухоли Walker 256
у крыс Brattleboro. В опухоли у крыс WAG с нормальной секрецией АВП
уровень тотального пула протеасом не изменялся в ходе ее роста. У мутантных
крыс Brattleboro наблюдалось повышение тотального пула на 20% с 7-х по 14-е
сут и двукратное его падение в промежутке между 17-ми и 24-ми сут. Следует
отметить, что на 24 сут регрессия опухоли у крыс Brattleboro практически
завершена, с чем, по-видимому, связано падение общего содержания
протеасом.
Оптическая плотность, %
Rpt6
140
LMP2
WAG
Brattleboro
7 14 17 24
7 14 17 24
сут
-55кДа
WAG
Brattleboro
7 14 17 24
*
**
200
*
120
7 14 17 24
сут
-28кДа
*
**
150
100
80
100
**
60
40
50
20
0
**
*
24*
0
7
14
17
7
14
17
24
Сутки после трансплантации
Сутки после трансплантации
опухоли
Рис. 8.опухоли
Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов
опухоли Walker 256,
выделенной на разных сроках после трансплантации крысам Brattleboro ( ) и WAG ( ),
с использованием антител к субъединицам Rpt6 и LMP2. * р <0,05 между указанными
значениями, ** р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
Субъединица Rpt6 (маркер 19S-субчастицы 26S-протеасом) практически не
выявлялась иммуноблоттингом в опухоли крыс Brattleboro на 24-е сут после
трансплантации, тогда как в опухоли у контрольных животных ее содержание
15
было практически неизменно (рис. 8). 19S-субчастица является необходимой
частью 26S-протеасом, с помощью которой осуществляется распознавание и
подготовка убиквитинированных белков к гидролизу (DeMartino, Gillette, 2007).
В ее отсутствие, к 24-м сут, в клетках опухоли у крыс Brattleboro нарушена
регуляция многочисленных процессов, в том числе, клеточного цикла.
Уровень иммунных протеасом оставался практически неизменным в ходе
роста опухоли у крыс WAG. У крыс Brattleboro на 7-е сут после прививки
содержание иммунных субъединиц протеасом LMP2 и LMP7 было снижено на
четверть по сравнению с крысами WAG. Однако в промежутке с 7-ых по 14-е
сут количество LMP2 и LMP7 возрастало и оставалось на том же уровне на 17-е
сут. При этом количество LMP2 в опухоли у крыс Brattleboro почти вдвое
превышало таковое в опухоли у крыс WAG (рис. 8), количество же LMP7 было
лишь незначительно выше. Поскольку иммунные протеасомы более
эффективны для генерации антигенных эпитопов, чем конститутивные,
увеличение их доли в общем пуле протеасом к 14-м сут должно способствовать
распознаванию опухолевых клеток иммунной системой и развитию иммунного
ответа. Это согласуется с тем, что регрессия опухоли начинается на 15-е – 18-е
сут после прививки.
Экспрессия молекул ГКГ класса I в опухоли Walker 256 в динамике роста у
крыс Brattleboro. Анализ содержания основной молекулы класса I – RT1A –
показал, что в опухоли у крыс WAG на всех этапах ее развития наблюдается
чрезвычайно слабая экспрессия этого белка. У крыс Brattleboro на 7-е сут после
прививки выявить экспрессию RT1A не удалось, однако на 14-е сут
наблюдалась выраженная экспрессия, сохранявшаяся и на 17-е сут, когда
опухоль уже находится в процессе регрессии.
Таким образом, в опухоли Walker 256, развивающейся у крыс Brattleboro в
отсутствие гипоталамического АВП, восстанавливается экспрессия молекул
ГКГ класса I и образуется уникальный пул протеасом, приводящие к ее
регрессии.
Морфогенетическое влияние пренатального дефицита серотонина на
иммунитет. Наряду с АВП, одним из регуляторов развития различных тканей
плода является серотонин (Buznikov et al., 1999). Однако данные об его участии
в развитии иммунной системы отсутствуют. Было исследовано влияние
пренатального дефицита серотонина на клеточный и гуморальный иммунный
ответ в онтогенезе крыс. Согласно полученным данным, пренатальный дефицит
серотонина приводил к существенным изменениям в Т-системе иммунитета в
постнатальном периоде развития.
У крысят на П3 пренатальный дефицит серотонина приводил к снижению
пролиферативного ответа тимоцитов, индуцированного Кон А, в 2 раза по
сравнению с контролем, в то время как во все последующие сроки наблюдалось
достоверное увеличение этого параметра (рис. 9, а). Пролиферативный ответ
клеток селезенки не менялся по сравнению с контролем на П3 и П18 и
значительно усиливался в последующие сроки развития (рис. 15, б).
16
Включение [3H]тимидина,
имп/мин, 2 х 105 клеток
60000
а
80000
*
*
50000
70000
б
*
60000
40000
*
50000
30000
40000
20000
30000
*
*
20000
10000
10000
0
0
Э21
П3
П18
П70 П90
П3
П18
П70
П90
Возраст, дни
Возраст, дни
Рис. 9. Индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса (а) и
селезенки (б) крыс, у которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез серотонина.
- Контроль.
- п-ХФА. * р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
Наблюдаемое изменение функциональной активности Т-лимфоцитов
связано, по-видимому, с тем, что пренатальный дефицит серотонина приводит к
стойким морфогенетическим изменениям стромальных элементов тимуса.
Первая волна миграции предшественников Т-лимфоцитов в эпителиальную
закладку тимуса происходит на Э13-16 (Brelinska, Malinska, 2005), и от
взаимодействия с первыми лимфопоэтическими предшественниками
принципиальным образом зависит дифференцировка стромы тимуса (Anderson
et al., 2006). В использованной модели синтез серотонина был подавлен в этот
период.
В трактовке полученных данных следует учитывать также природу Тклеток, населяющих тимус и селезенку на разных этапах онтогенеза. На П3 в
тимусе дифференцируются клетки, предшественники которых мигрировали в
тимус с первой волной из эмбриональной печени в период дефицита
серотонина. У грызунов к П14 потомки первой волны миграции
предшественников полностью покидают тимус (Anderson et al., 2006), поэтому
на П18 и позднее тимус населяют предшественники Т-лимфоцитов, которые
мигрируют уже из костного мозга. Именно с этим может быть связано
наблюдаемое подавление пролиферативного ответа тимоцитов у крысят на П3,
в отличие от его повышения у более взрослых животных.
Влияние дефицита серотонина на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в
селезенке не наблюдалось до П18 в связи с тем, вероятно, что селезенка
формируется в онтогенезе как полноценный лимфоидный орган лишь к 3-ей
неделе после рождения. Таким образом, пролиферативная активность клеток
селезенки с запаздыванием отражает изменения, наблюдаемые в тимусе.
Оценка содержания АОК в селезенке после иммунизации ЭБ показала, что
пренатальный дефицит серотонина приводит к достоверному увеличению
числа АОК к ЭБ в 6 раз у крыс на П18 и в 10 раз у крыс на П70 (рис. 10).
Механизмы этого эффекта пока не ясны. Наиболее вероятно, что дефицит
серотонина оказал морфогенетическое влияние на дифференцировку Тлимфоцитов CD4 фенотипа в тимусе, которые в постнатальном периоде
17
осуществляют функцию клеток-помощников в кооперации с В-лимфоцитами
селезенки при ответе на тимус-зависимый антиген - эритроциты барана.
Количество АОК
на 1 х 108 клеток
селезенки
3000
0
2500
0
2000
0
1500
0
1000
0
500
0
0
*
*
П18
П70
Рис. 10. Количество АОК к ЭБ в селезенке крыс, у
которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез серотонина.
- Контроль.
- п-ХФА. Иммунизацию ЭБ
проводили на П18 и П70.
* р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
В отличие от плодов, подавление синтеза серотонина у половозрелых
животных приводило лишь к обратимым изменениям в пролиферативной
активности клеток селезенки, что подтверждает морфогенетическую роль
серотонина в критический период онтогенеза иммунной системы.
Необходимо принимать во внимание, что серотонин в ходе
эмбрионального развития стимулирует дифференцировку структур мозга,
которые у взрослых животных получают серотонинергическую иннервацию
(Lauder et al., 1981; Butkevich et al., 2003). Таким образом, недостаток
серотонина может опосредованно влиять на развитие иммунной системы через
стойкое изменение в других компонентах нейроэндокринной системы. Нельзя
также исключить, что кроме прямого и опосредованного гормонального
действия серотонин может осуществлять в развитии тимуса локальную ауто- и
паракринную регуляцию.
Морфогенетическое влияние пренатального дефицита катехоламинов
на иммунитет. Не только серотонин, но и другие моноамины могут
выполнять морфогенетические функции в раннем развитии (Bernabe et al., 1996;
Beltramo et al., 1997). У взрослых животных катехоламины являются
регуляторами функций иммунной системы. Было исследовано влияние
пренатального дефицита катехоламинов на индуцированный Кон А
пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, а также на количество
АОК селезенки в ответ на иммунизацию ЭБ в различные периоды онтогенеза.
Введение ингибитора синтеза катехоламинов, -МПТ, в критический
период развития тимуса, на Э13-Э17, привело к двукратному снижению
пролиферативного ответа на Кон А в тимусе уже на Э21, которое сохранялось
на П3, П18 и П70 (рис. 11, а). В селезенке пренатальное подавление синтеза
катехоламинов приводило к снижению пролиферативного ответа на митоген на
П18 и П70, но не на П3 (рис. 11, б). Как было описано выше, пролиферативная
активность клеток селезенки с запаздыванием отражает изменения,
наблюдаемые в тимусе.
18
Включение [3H]тимидина,
имп/мин, 2 х 105 клеток
120000
16000
0
14000
а
100000
8000
0
6000
0
4000
0
2000
0
0
*
*
*
0
12000
0
10000
*
08000
0
6000
0
4000
0
2000
*
б
*
0 0
П70
П3
П18
П70
Э21
П3
П18
Рис. 11. Индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса (а) и
селезенки (б) крыс, у которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез катехоламинов.
- Контроль.
- α-МПТ. * р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.
Введение -МПТ беременным самкам на Э13-Э17 не оказало влияния на
количество АОК к ЭБ у потомства на П18 и П70.
В отличие от плодов, внутрибрюшинное введение -МПТ половозрелым
животным не повлияло на индуцированный Кон А пролиферативный ответ
лимфоцитов тимуса и селезенки, а также на количество АОК к ЭБ в селезенке.
Таким образом, полученные данные указывают на особую значимость
катехоламинов именно в развитии иммунной системы плода.
По данным литературы, в общей циркуляции плодов обнаружена высокая
концентрация L-ДОФА и дофамина, которая значительно снижается в
постнатальном развитии (Лаврентьева и др., 2006; Мельникова и др., 2006).
Преобладающими катехоламинами в крови и в мозгу плодов являются именно
L-ДОФА и дофамин, при этом уровень норадреналина и адреналина
значительно ниже (Peleg et al., 1984). Таким образом, вероятно, именно LДОФА и дофамин ответственны за обнаруженные эффекты. Об этом
свидетельствует и отсутствие нарушений в развитии иммунной системы у
мышей с нокаутом гена дофамин-β-гидроксилазы, необходимой для синтеза
норадреналина и адреналина (Alaniz et al., 1999). Учитывая приведенные факты
и то, что пренатальный дефицит катехоламинов отражается на Т-клетках
половозрелых животных, можно считать, что L-ДОФА и/или дофамин
выполняют морфогенетическую функцию в развитии иммунной системы.
В оценке полученных результатов необходимо принимать во внимание
также возможность непрямого действия ингибирования синтеза катехоламинов
на развитие иммунной системы, поскольку этот дефицит способен оказать
влияние на дифференцировку пептидергических структур мозга, также
участвующих в иммуномодуляции у половозрелых животных.
Таким образом, дефицит катехоламинов в критический период онтогенеза
приводит к необратимым морфогенетическим изменениям в Т-клеточном звене
иммунитета.
19
ВЫВОДЫ
1. Дефицит серотонина в пренатальном периоде развития оказывает
морфогенетическое влияние на формирование клеточного и гуморального
иммунитета, в то время как дефицит катехоламинов  на формирование
только клеточного иммунитета у крыс.
2. Численность клеточных популяций тимуса и селезенки в пренатальном
периоде развития контролируется гипоталамо-гипофизарной системой.
Выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению
пролиферации клеток селезенки, а одновременное выключение
гипоталамуса и гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в
тимусе и снижению уровня апоптоза в селезенке.
3. Экспрессия иммунных протеасом, участвующих в представлении
собственных антигенов Т-лимфоцитам при их обучении, наблюдается в
тимусе плодов уже на 18-й день и достигает характерного для взрослых
животных уровня к 21-му дню эмбрионального развития.
4. У животных в неонатальном периоде развития, в отличие от
половозрелых животных, Т-лимфоциты, покидающие тимус, первично
заселяют красную пульпу селезенки и только потом мигрируют в
соответствующие зоны белой пульпы.
5. У крыс Brattleboro с наследственным дефицитом гипоталамического
аргинин-вазопрессина наблюдается снижение пролиферативного ответа
Т-лимфоцитов на митоген в 2 раза в тимусе и в 2-4 раза в селезенке на
протяжении всего постнатального периода развития.
6. Усиление противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro может
быть обусловлено
повышением эффективности представления
опухолевых антигенов за счет повышения содержания иммунных
протеасом и восстановления экспрессии основных молекул главного
комплекса гистосовместимости класса I в динамике роста опухоли Walker
256.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:
1. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Сапожников А.М., Захарова Л.А.
Динамика апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке крыс в
перинатальном онтогенезе // Онтогенез. 2006. Т. 37. №4. С. 286-291.
2. Арион В.Я., Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Москвина С.Н.,
Захарова Л.А. Тактивин в регуляции апоптоза тимоцитов,
индуцированного дексаметазоном // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед. 2007.
Приложение 2. Сборник научных трудов, посвященных 25-летию
создания НИИ Физико-Химической Медицины. С. 109-111.
20
3. Афанасьева М.А., Мельникова В.И., Воронова С.Н., Хегай И.И., Попова
Н.А., академик РАН Иванова Л.Н., Захарова Л.А. Пролиферативный
ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, активированных Конканавалином
А, в онтогенезе крыс Brattleboro с генетическим дефектом синтеза
вазопрессина // ДАН. 2008. Т. 420. №2. С. 1-2.
4. Шарова Н.П, Мельникова В.И., Хегай И.И., Карпова Я.Д., Дмитриева
С.Б., Астахова Т.М., Афанасьева М.А, Попова Н.А., Иванова Л.Н.,
Захарова Л.А. Особенности экспрессии протеасом в клетках опухоли
Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro с генетическим
дефектом синтеза аргинин-вазопрессина // ДАН. 2008. Т. 419. № 6. С.
833–837.
5. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Шарова Н.П.,. Захарова Л.А.
Иммунные протеасомы в развивающемся тимусе крысы // Биохимия.
2008. Т. 73. Вып. 4. С. 553-561.
6. Мельникова В.И., Карпова Я.Д., Афанасьева М.А., Захарова Л.А., Шарова
Н.П. Иммунные протеасомы в формирующейся селезенке крысы // Изв.
Акад. Наук. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 163-168.
7. Афанасьева М.А., Извольская М.С., Воронова С.Н., Захарова Л.А.,
Мельникова В.И. Влияние дефицита серотонина на развитие иммунной
системы крыс // ДАН. 2009. Т. 427. №4. С. 563-565.
Статьи:
1. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И.,
Афанасьева М.А., Карпова Я.Д., Захарова Л.А. Роль иммунных протеасом
в молекулярных механизмах становления иммунитета // Известия
Национальной Академии Наук Белоруссии. Серия медицинских наук.
2008. № 1. С. 106-111.
Тезисы конференций:
1. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Арион В.Я., Захарова Л.А.
Функциональное значение тимуса и гипоталамо-гипофизарной системы в
регуляции апоптоза и пролиферации в иммунокомпетентных органах
крыс в перинатальном онтогенезе // Материалы 5 Симпозиума с
международным
участием
«Физиология
иммунной
системы.
Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и
аллергических заболеваний». Физиология и патология иммунной
системы. 2006. № 10, приложение 1. С. 48-49.
2. Афанасьева М.А. Динамика спонтанного апоптоза и пролиферации в
иммунокомпетентных органах крыс в перинатальном онтогенезе //
Тезисы докладов Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез.
2006. Т. 37. № 4. С. 311.
3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И.,
Бондарева Л.А., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д. Изменение пулов 26S- и
20S-протеасом и становление иммунитета в постнатальном развитии
21
млекопитающих // Тезисы докладов VI симпозиума «Химия
протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 43.
4. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Шарова Н.П., Захарова Л.А.
Иммунные протеасомы в развивающемся тимусе крысы // Сборник
тезисов 11-й международной Пущинской школы-конференции молодых
ученых «Биология – наука 21 века». Пущино. 2007. С. 230.
5. Афанасьева М.А. Особенности селекции тимоцитов на ранних этапах их
дифференцировки в перинатальном онтогенезе крыс // Тезисы докладов
Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2007. Т. 38. № 4. С.
313-314.
6. Афанасьева М.А. Влияние вазопрессина и серотонина на созревание Тсистемы иммунитета в онтогенезе крыс // Тезисы докладов Конференции
молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2008. Т. 39. № 4. С. 309.
7. Афанасьева М.А. Особенности развития опухоли Walker 256 после
трансплантации крысам Brattleboro // Тезисы докладов Конференции
молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2009. Т. 40. № 4. С. 307.
8. Афанасьева М.А., Мельникова В.И. Особенности экспрессии протеасом в
клетках опухоли Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro
с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // XV школа «Актуальные
проблемы биологии развития». Тезисы стендовых докладов молодых
ученых. Звенигород. 2008. С. 5-7.
9. Захарова Л.А., Шарова Н.П., Мельникова В.И., Афанасьева М.А.
Иммунные протеасомы и их роль в развитии иммунитета //
Иммунологический Форум с международным участием. Российский
иммунологический журнал. 2008. Т. 2. № 2-3. С. 121.
10. Афанасьева
М.А.,
Извольская
М.С.,
Мельникова
В.И.
Морфогенетическое влияние дефицита серотонина на иммунную систему
крыс // Иммунологический Форум с международным участием.
Российский иммунологический журнал. Т. 2. № 2-3. 2008. С. 152.
11.Afanasyeva M.A., Melnikova V.I., Izvolskaia M.S., Zakharova L.A. Early-life
serotonin depletion alters humoral and cellular immunity // VIth European
Congress of Reproductive Immunology. Moskow. 2008. 19-20.
12. Melnikova V.I., Afanasyeva M.A., Sharova N.P., Zakharova L.A.
Proteasomes and immunity: immune proteasomes in developing thymus and
spleen // VIth European Congress of Reproductive Immunology. Moscow.
2008. 18-19.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 05-0448830, 08-04-00276) и ФЦП (шифр: 2009-02-1.2-04-45-048).
В работе было использовано оборудование «Центра коллективного
пользования по биологии развития на основе использования клеточных
технологий и оптических методов исследования» на базе Учреждения
Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова
РАН.
22