Индуцирующий эффект a-токоферола на активности ферментов

На правах рукописи
Михайлова Ольга Николаевна
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ
ГЕНОВ ЦИТОХРОМА Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 1А
В ПЕЧЕНИ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ МЫШЕЙ
Специальность:
03.00.04 – биохимия
03.00.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2007
Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной
биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)
Научные руководители:
доктор биологических наук,
профессор
Людмила Федоровна Гуляева
кандидат биологических наук
Максим Леонидович Филипенко
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
Иван Федорович. Усынин
доктор медицинских наук,
профессор
Андрей Георгиевич Покровский
Ведущая организация:
Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск)
Защита диссертации состоится « 17 » апреля 2007 г. в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском
институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск,
ул. Академика
Тимакова, 2; тел. 8 (3833) 33-54-81).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
исследовательского института биохимии СО РАМН.
ГУ
Научно-
Автореферат диссертации разослан «___» _________2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук,
2
Г.С. Русских
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А
окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов,
способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки,
что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе
канцерогенезу (Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). Канцерогены,
особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам
(ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным
увеличением уровня их мРНК и ферментативных активностей (Cheung et al,
1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в
живой организм, определяется количеством его активного метаболита,
который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что
напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450,
активирующей канцероген. CYP1А1 и CYP1А2 осуществляют биоактивацию
многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 – бенз[а]пирена и
других ПАУ, Р450 1А2 – ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов,
парацетамола, гетероциклических аминов (Ioannides, Lewis, 2004).
Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие
цитозольного белка – Ah-рецептора (AhR) с ксенобиотиком, транслокация
активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с
ядерным фактором ARNT и взаимодействие комплекса AhR– ARNT с цисактивными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Fujii-Kuriyama, 2005).
В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в
популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм
генов CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). Впервые такие
генетические различия показаны на инбредных линиях мышей. Так, введение
ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих Ah+ генотипом, приводит к
значительному увеличению активности CYP1A, тогда как у мышей,
обладающих Ah- генотипом, этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные
линии мышей широко используются в качестве модели для изучения
механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического
канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности
к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений
(Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1999; Гуляева и др.,
2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не
исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции
цитохрома Р450 1A2 (Chaloupka et al., 1994). Все это говорит о более сложной
картине регуляции экспрессии CYP1A в генетически различающихся линиях
мышей, чем существующие на сегодняшний день представления,
объясняющие это явление лишь различиями в генотипе AhR. В связи с этим
представляется весьма актуальным исследование индукции CYP1A в норме и
3
при воздействии ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по
чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений.
Целью настоящей работы является исследование регуляции
экспрессии генов цитохрома Р450 1А в печени мышей, различающихся по
генотипу Ah рецептора, при индукции химическими канцерогенами и под
влиянием физиологических факторов.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1. Определить содержание мРНК, наличие белка и ферментативную
активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей,
различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3метилхолантреном и о-аминоазотолуолом;
2. Для выяснения роли транскрипционных факторов в регуляции
экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А определить уровень
экспрессии генов AhR и ARNT в печени инбредных линий мышей,
различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3метилхолантреном;
3. Провести сравнительный анализ регуляторной последовательности
гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащей энхансерные модули,
необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у инбредных
линий мышей;
4. На модели иммобилизационного стресса исследовать влияние
физиологических факторов на индукцию цитохрома Р4501А у молодых и
старых животных.
Научная новизна работы
Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов
Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на
протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных
транскрипционных факторов AhR и ARNT, оставался нерешенным. В данной
работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в
печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к
индукции
цитохрома
Р4501А
различными
канцерогенными
полициклическими углеводородами (ПАУ).
Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии
транскрипционных факторов AhR, ARNT и их генов-мишеней CYP1А1 и
CYP1А2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК
исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10 - 20 часов
после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как
чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и
дефектных по этому рецептору линиях (Ah-), определяется существенное
количество мРНК СYP1А2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие
транскрипта гена CYP1А1 при индукции МХ и ОАТ в печени линий SWR,
4
AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции
линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме
формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это
считалось ранее.
Наличие при индукции МХ увеличения содержания мРНК CYP1А у
всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что
межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные
данные позволяют предположить существование транскрипционных
механизмов регуляции CYP1А у мышей Ah+ линий и CYP1А2 у линии SWR
(Ah-), и посттранскрипционных – у мышей AKR и DBA (Ah-).
В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию
генов CYP1А1, CYP1А2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов,
за исключением CYP1A1, различается между группами взрослых и старых
животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей
заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание
мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме
того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1А2, AhR и
ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные
результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на
стресс у старых животных.
Научно-практическая значимость
По
своему
содержанию
работа
носит
преимущественно
фундаментальный характер и представляет собой исследование
молекулярных механизмов индукции CYP1А в печени инбредных линий
мышей. Важность исследования экспрессии генов AhR, ARNT, CYP1А1 и
CYP1А2, прежде всего, определяется вовлечением кодируемых ими белков в
процессы канцерогенеза, особенно на его инициирующих этапах. Этот факт
имеет фундаментальное значение для понимания механизма действия
канцерогенных химических соединений на организм животных и человека и
ведет к раскрытию природы фундаментальных биологических процессов в
клетке.
Изучение механизмов воздействия канцерогенов на организм имеет
также важное практическое значение как для экспериментальной работы, так
и клинических исследований в ближайшем будущем.
Так, результаты, свидетельствующие об индивидуальных различиях в
индукции
CYP1A
у
мышей,
генетически
различающихся
по
чувствительности к ПАУ, важно учитывать при изучении механизмов
химически индуцированного канцерогенеза, где традиционно используются
данные линии мышей. Данные об экспрессии генов CYP1A и их
транскрипционных
факторов
важны
в
разработке
новых
высокочувствительных тестов по определению канцерогенной активности
химических
соединений.
Понимание
механизмов
биоактивации
5
проканцерогенов раскрывает широкие перспективы для предотвращения
и/или модификации канцерогенеза в терапевтических целях.
Основные положения, выносимые на защиту
1.
При введении как МХ, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в
печени мышей увеличивается у линий с генотипом Ah+, и не изменяется у
мышей с генотипом Ah-, что подтверждает наличие генетических различий в
индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.
2.
Под действием как МХ, так и ОАТ, содержание мРНК СYP1А2
увеличивается у мышей всех линий, за исключением мышей SWR.
Содержание мРНК CYP1А1 также увеличивается у всех линий мышей,
независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и
DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.
3.
Вне зависимости от генотипа Ah рецептора в печени мышей
определяется мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT, причем
введение МХ существенно не влияет на уровень их экспрессии. Вместе с
результатами по экспрессии генов СYP1А1 и СYP1А2 это свидетельствует о
том, что межлинейные различия у мышей в чувствительности к индукции
ПАУ обусловлены не только дефектом Ah-рецептора.
4.
Последовательность регуляторной области гена CYP1A2 (от -4675 до
-4204), содержащая энхансерные модули, необходимые для конститутивной
экспрессии гена CYP1A2, у различных инбредных линий мышей является
консервативной и не связана с межлинейными различиями в экспрессии
CYP1A2 и чувствительностью к гепатоканцерогенному действию ОАТ.
5.
Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1А1,
различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса.
Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше,
чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у
старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием
стресса увеличивается экспрессия генов CYP1А2, AhR и ARNT, что в большей
мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об
отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции
адаптации на стресс.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на
международном симпозиуме «13th International Symposium on Microsomes and
Drug Oxidations» Стреза, Италия, 2000; на международном конгрессе «7th
ESACP Congress» Кон, Франция, 2001; на международной конференции «18th
European Workshop on Drug Metabolism» Валенсия, Испания, 2002; на Второй
научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция
физиологических функций в норме и патологии" Новосибирск, Россия, 2002;
на международной конференции «11th North American ISSX Meeting»
6
Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of
Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции
«8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном
симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in
Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th
International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004.
Публикации. По материалам диссертации имеется 13 печатных работ.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 120
страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 5
таблиц и 15 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы,
материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а
также списка цитируемой литературы, содержащего 13 отечественных и 218
зарубежных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы мыши линий C57BL, CBA, A/Sn, DBA,
AKR, SWR, CC57BR, A/He, BALB/c, C3H/a и DD, получаемые из питомника
ИЦиГ СО РАН г. Новосибирска. Животные содержались по 2 - 3 особи в
условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище.
Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с
использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу
Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755). Животные
находились на стандартной диете и перед забоем сутки не получали еды.
В экспериментах по определению межлинейных различий в экспрессии
CYP1A индукцию микросомных ферментов осуществляли однократным
внутрибрюшинным введением растворенным в 0,3 мл растительного масла
МХ (80 мг/кг веса) или ОАТ (225 мг/кг веса). Микросомальную фракцию
печени в этих случаях получали через 72 часа, а препараты РНК – через 4 – 72
часа после введения индуктора. Контролем служили животные, получавшие
растительное масло (25 мл/кг веса).
В экспериментах по влиянию стресса на экспрессию CYP1A каждая
экспериментальная группа мышей («молодые» и «старые») была разделена на
две подгруппы из семи животных: интактные и те, которые подвергались
иммобилизационному стрессу посредством фиксации в положении лежа на
спине в течение двух часов. Через час после завершения
иммобилизационного воздействия проводили декапитацию животных. В
течение семи дней непосредственно перед экспериментом мыши содержались
в индивидуальных клетках для снятия эффекта групповых отношений.
7
Микросомы печени выделяли при температуре +4C общепринятым
методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в
микросомах определяли по методу Лоури, общее содержание цитохрома P450
измеряли как описано Омура T. и Сато P. (Omura, Sato, 1964). Скорость Одеалкилирования ряда алкоксирезоруфинов – ЭР, МР определялась
спектрофлуориметрически по методу Бурке и Майера (Burke, Mayer, 1974).
(Burke et al., 1985).
Для детекции белков CYP1A микросомальные белки разделяли
электрофорезом (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозную
мембрану полусухим способом в буфере 25 мМ Трис-HCl, 195 мМ глицин,
20% этанол на приборе Fastblot “Biometra” (Германия) в соответствии с
инструкцией производителя. Мембрану инкубировали с первичными
антителами (клон 14H5) против Р450 1А1/2 крыс. Белки визуализировали
окрашивая мембраны раствором 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP)
и р-нитротетразолиума голубого (NBT) в буфере АР 9,5. Работа проводилась
совместно с Захаровой Л.Ю.
Препараты суммарной РНК получали SDS/фенольным методом, как
описано (Chattopadhyay et al., 1993). Относительное содержание мРНК генов
CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР
(Wong et al., 1994). В качестве эндогенного внутреннего контроля,
относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации
исследуемых генов, были выбраны гены «домашнего хозяйства» β-актин,
RPL30 и GAPDH. Для синтеза кДНК in vitro брали по 1 мкг РНК на пробу.
ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, концентрации Mg2+,
количеству праймеров. Каждая амплификационная смесь содержала в
качестве матрицы количество кДНК, соответствующее 100 нг суммарной
РНК, 1 X буфер для ПЦР, 50 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата,
20 пкМ каждого праймера для амплификации кДНК CYP1A1, CYP1A1, AhR,
ARNT, COMT или GSTМ1 и 2 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Равные
количества (20 пкМ) праймеров для амплификации β-актина, циклофилина
или GAPDH были добавлены через несколько циклов. Чтобы определить
количество циклов, необходимых, чтобы, с одной стороны, визуализировать
продукты амплификации, а, с другой – остановить ПЦР в экспоненциальной
фазе амплификации, реакцию амплификации останавливали на разных
циклах, и продукты амплификации анализировали гель-электрофорезом. В
наших условиях наиболее подходящее число циклов было для β-актина,
RPL30 или GAPDH – 22, для CYP1A1 – 30, для CYP1A2 – 27, для AhR и
ARNT - 36. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР
анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле. Гель окрашивали
бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer»
(Литех,Москва) и денситометрировали с помощью программы ”ScionImage”.
Относительное содержание мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT
оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности
8
окрашивания специфической полосы генов к интенсивности полосы гена
«домашнего хозяйства» β–актина, RPL30 или GAPDH.
Препараты геномной ДНК получали из печени мышей, как описано
ранее (Aljanabi, Martinez, 1997). Очистку продуктов ПЦР (472 п.н.) проводили
на спин-колонках (Qiagen, Германия) и далее проводили прямое
секвенирование согласно протоколу (dye-terminator method) для ABI-системы
капиллярного электрофореза (Applied Biosystems, Великобритания) в
соответствии с протоколом производителя. Все продукты ПЦР были
секвенированы в обоих направлениях с использованием прямого и обратного
праймеров.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью
программ STATISTICA и Excel. Результаты представлены в виде M ± m, где
М - среднее, m – ошибка среднего. Для оценки статистически значимых
различий между выборками использовался t -критерий Стьюдента. В
экспериментах по изучению влияния стресса использовали многофакторный
анализ вариации (MANOVA) и метод Tukey для итогового многофакторного
сравнения средних величин.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей,
обработанных 3-метилхолантреном (МХ) и о-аминоазотолуолом (ОАТ)
В нашем исследовании были использованы классический индуктор
МХ, относящийся к классу ПАУ-соединений (Nebert, 1989; Carretero et al.,
2001), и относящийся к классу азобензолов о-аминоазотолуол (ОАТ). По
оценке Международного агентства изучения рака (IARC) ОАТ является
возможным канцерогеном для человека (IARC, 1975). ОАТ интересен прежде
всего тем, что вызывает развитие опухолей исключительно в печени мышей,
но не крыс, причем мыши разных инбредных линий различаются по
чувствительности к его действию (Каледин и др., 1990).
Для выявления межлинейных различий при индукции канцерогенными
соединениями были проведены эксперименты по определению содержания
белков CYP1A1 и CYP1A2 и их ферментативной активности в печени
инбредных линий мышей.
Для определения белка был использован метод Вестерн-блот анализа
(белковый иммуноблоттинг) с применением моноклональных антител против
P450 1А. Данные этого эксперимента приведены на рисунке 1.
9
Рисунок 1. Вестерн-блот анализ белков CYP1A в печени мышей с различным
генотипом Ah рецептора. К – в норме; МХ – при индукции 3-метилхолантреном, OAT
–при индукции о-аминоазотолуолом.
Видно, что в печени мышей всех линий, не обработанных индукторами,
регистрировался CYP1A2, что подтверждает его конститутивную экспрессию
независимо от генотипа Ah-рецептора. Введение как МХ, так и ОАТ, мышам
ПАУ-индуцибельных линий, C57BL, CBA и A/Sn, приводит к увеличению
содержания CYP1А2, а также к индукции CYP1А1. В тоже время, при
введении индукторов мышам Ah--линий SWR, AKR и DBA (ПАУнеиндуцибельные линии), подобного эффекта, не обнаружилось. Однако в
отдельных
случаях
регистрировалось
незначительное
усиление
интенсивности белковой полосы, соответствующей CYP1A2 (линии AKR,
DBA).
Данные по анализу белка CYP1А были сопоставлены с
ферментативной активностью цитохромов Р4501А1 и 1А2 в метаболизме 7этокси- и 7-метоксирезоруфина соответственно. Результаты этого
эксперимента представлены в таблице 1.
Как следует из полученных результатов, у контрольных животных не
существует статистически значимых межлинейных различий в параметрах
ЭРОД и МРОД. Таким образом, базальный уровень активности CYP1A1 и
CYP1A2 практически одинаков для всех исследуемых линий мышей.
Введение как МХ, так и ОАТ, вызывало многократное увеличение
ЭРОД и МРОД в печени мышей, обладающих Ah+ генотипом (C57BL, CBA и
A/Sn). У мышей линий SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah -,
введение как МХ, так и ОАТ, не приводило к статистически значимому
увеличению общего содержания Р450 и ферментативной активности CYP1A1
и СYP1A2. Эти результаты согласуются с данными белкового иммуноблота и
с результатами исследований группы Неберта, полученными ранее на
ограниченном количестве линий мышей (Nebert, 1989). Таким образом, наши
данные подтверждают наличие генетических различий в индуцибельности
цитохрома 1А у мышей.
10
Таблица 1. 7-этоксирезоруфин- (ЭРОД) и 7-метоксирезоруфин(МРОД)-О-деалкилазные активности цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени
мышей инбредных линий при индукции МХ и ОАТ.
Линия
Индуктор
Р450
нмоль/мг белка
ЭРОД
пкмоль
резоруфина/мин/ мг
белка
МРОД
пкмоль
резоруфина/мин/ мг
белка
SWR
контроль
МХ
ОАТ
0,47 ± 0,04
0,45 ± 0,03
0,42 ± 0,08
126 ± 25
173 ± 30
178 ± 19
109 ± 15
148 ± 22
165  30
AKR
контроль
МХ
ОАТ
0,6 ± 0,04
0,58 ± 0,1
0,55 ± 0,12
89 ± 25
75 ± 28
69 ± 15
100 ± 19
115 ± 14
125  21
DBA
контроль
МХ
ОАТ
0,45 ± 0,11
0,5 ± 0,11
0,47 ± 0,08
144 ± 14
185 ± 70
178  20
182 ± 25
220 ± 41
192  27
CBA
контроль
МХ
ОАТ
0,62 ± 0,05
0,89 ± 0,03
н.о.
76 ± 22
685 ± 64 (9,01)*
н.о
89 ±16
730 ± 49 (8,20)*
н.о
A/Sn
контроль
МХ
ОАТ
0,55 ± 0,05
1,1±0,14 (2,0)*
1,2 ± 0,22 (2,18)*
90 ± 11
1695 ± 148 (18,83)*
1878± 320 (20,86)*
82 ± 15
1934 ± 200 (23,59)*
2194 ± 250 (26,76)*
C57BL
контроль
МХ
ОАТ
0,78 ± 0,01
1,5±0,07 (1,92)*
1,36 ± 0,04 (1,74)*
153 ± 20
2472 ± 190 (16,16)*
2911 ± 580 (19,03)*
144 ± 34
3682 ±301 (25,57)*
3261 ± 428 (22,65)*
В таблице приведены средние значения данных, полученные для групп
животных из 6-ти особей,  стандартное отклонение. Степень индукции указана в
скобках. *Статистически значимое отличие от контроля по критерию Стьюдента (P 
0,05). Н.о. – не определяли.
Исследование экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT в
зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора
Общепринятым на сегодняшний день, является представление о
дефекте Ah рецептора, как о причине различий в индуцибельности цитохрома
1А у мышей. Однако до сих пор не исследовали, существует ли корреляция
между увеличением ферментативной активности и транскрипцией
соответствующего гена, а также существует ли прямая взаимосвязь с
11
изменением экспрессии соответствующих транскрипционных факторов.
Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение методом
мультиплексной ОТ-ПЦР уровня мРНК CYP1A1 и CYP1A2, а также AhR и
ARNT в норме и при индукции МХ и ОАТ.
На первом этапе необходимо было определить максимум накопления
мРНК в зависимости от времени после введения индуктора. Для ответа на
вопрос, существует ли корреляция между увеличением ферментативной
активности и транскрипцией соответствующего гена были проведены
эксперименты по определению уровня мРНК CYP1A1 и CYP1A2, а также
транскрипционных факторов AhR и ARNT в норме и при индукции МХ и
ОАТ.
A)
← CYP1A1
← GAPDH
← CYP1A2
← GAPDH
← AhR
← GAPDH
Б)
Относительное содержание
мРНК
← ARNT
← GAPDH
ARNT
AhR
Cyp1a1
Cyp1a2
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
Время, ч
Рисунок 2. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от
времени после введения МХ в качестве индуктора у мышей линии DBA (Ahнечувствительная). А). Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной
ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле. К – контрольная группа животных. Б). Данные
представлены как средние значения для групп животных из шести особей 
стандартное отклонение.
12
А)
← CYP1A1
← GAPDH
← CYP1A2
← GAPDH
← AhR
← GAPDH
← ARNT
← GAPDH
Относительное содержание
мРНК
Б)
ARNT
AhR
Cyp1a1
Cyp1a2
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
Время, ч
60
80
Рисунок 3. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от
времени после введения МХ в качестве индуктора у мышей линии CBA (Ahчувствительная). А). Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТПЦР в 2%-агарозном геле. К – контрольная группа животных. Б). Данные
представлены как средние значения для групп животных из шести особей 
стандартное отклонение.
Для определения экспрессии генов транскрипционных факторов AhR,
ARNT и цитохромов Р4501А в печени мышей был использован метод
мультиплексной ОТ-ПЦР, ранее используемый в нашей лаборатории и
адаптированный для наших условий. Для определения максимального уровня
экспрессии исследуемых генов после введения мышам индуктора 3метилхолантрена (МХ), было взято несколько временных точек: 4, 8, 16, 20,
24 и 72 часа после действия индуктора. В эксперимент были взяты две линии
мышей – DBA (Ah-нечувствительная) и CBA (Ah-чувствительная) (Nebert,
1989; Nebert et al., 2004). Результаты этого эксперимента приведены на
рисунках 2 и 3.
Как видно, максимальный уровень экспрессии исследуемых генов
приходится на 16 – 20-ти часовой интервал после введения индуктора. В
дальнейших экспериментах содержание мРНК определяли через 20 часов
после введения мышам индуктора.
13
Содержание мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей в
норме и при индукции МХ и ОАТ
Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК
цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 6-ти инбредных линий мышей,
различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к
индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов
(ПАУ), в норме и при индукции МХ.
А)
← RPL30
← CYP1A1
Относительное содержание мРНК
CYP1A2
Б)
Относительное содержание мРНК
CYP1A1
← CYP1A2
← RPL 30
3
***
Контроль
***
МХ - 20 ч
2,5
ОАТ- 20 ч
1,5
***
***
2
***
***
***
***
1
***
***
AKR
SWR
0,5
***
0
C57/BL
A/Sn
CBA
Контроль
3
2,5
DBA
***
***
МХ - 20 ч
***
***
ОАТ - 20 ч
**
2
**
1,5
*
**
1
*
0,5
0
C57/BL
A/Sn
CBA
AKR
SWR
DBA
Рисунок 4. Уровень экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей
инбредных линий в норме и при индукции МХ и ОАТ. А) Электрофореграмма
разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле: к, группа
контрольных мышей; м, при индукции МХ; o, при индукции ОАТ (у мышей линии
CBA индукцию ОАТ не исследовали). Б) Данные представлены как средние значения
для групп животных из восьми особей,  стандартное отклонение. *P<0.05; **P<0.01;
***P<0.001. (Статистически значимые различия между индуцированными и
интактными животными по критерию Стьюдента).
14
Среди выбранных мышей три линии обладали AhR+ генотипом (CBA,
C57BL, A/Sn) и три линии были нечувствительны к индукции ПАУ (DBA,
AKR и SWR – AhR—генотип) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Полученные
данные представлены на рисунке 4.
В печени интактных мышей исследуемых линий мРНК СYР1А1
практически не регистрировался, в то время как конститутивный уровень
экспрессии гена СYР1А2 был достаточно высок, что вполне согласуется с
результатами Вестерн-иммуноблота, а также с ранее полученными
результатами (Kimura et al., 1986).
Обнаружено, что в печени всех исследуемых линий мышей
регистрируется значительное увеличение количества мРНК цитохрома Р450
1А1 (рис. 4) при индукции 3-метилхолантреном. Этот факт оказался
неожиданным, поскольку мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно
считаются ПАУ-неиндуцибельными (Nebert, 1989), т.е. обладают генотипом
Ahd Ahd. Увеличение содержания уровня мРНК CYP1A1 достаточно трудно
оценить вследствие её низкого содержания в контроле. Тем не менее, видна
разница в уровне мРНК CYP1A1 среди исследуемых линий. Особенно это
заметно для линий Ah+ генотипа. У линий, дефектных по Ah-рецептору,
также наблюдалось увеличение содержания мРНК CYP1А1, хотя оно было не
столь ярко выраженным: в 2 - 3 раза ниже по сравнению с Ah+ линиями.
При исследовании экспрессии гена CYP1А2 обнаружено, что, в отличие
от CYP1А1, в печени необработанных индуктором мышей регистрируется
заметное количество мРНК (рис. 4). Количество мРНК CYP1А2 различается
среди исследуемых линий не значительно. Исключение составляют мыши
линии SWR, у которых количество мРНК CYP1А2 в контроле в 3-4 раза
выше, по сравнению с мышами линий C57BL, A/Sn, CBA, AKR и DBA и
сравним с индуцированным МХ.
Введение животным 3-метилхолантрена сопровождалось усилением
экспрессии CYP1А2 в печени мышей A/Sn, C57BL, CBA и AKR в 3-4 раза.
Содержание мРНК CYP1A2 не изменялось у SWR мышей, но статистически
значимо (p < 0.05), увеличивалось у DBA мышей при индукции МХ.
Аналогичные эксперименты были проведены с использованием ОАТ в
качестве индуктора. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены
уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 5-ти инбредных линий
мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора. Полученные данные
представлены на рисунке 4.
Как видно, индукция ОАТ проходит схожим с МХ образом. Можно
лишь отметить, что уровень индукции в случае ОАТ выше, чем в случае с
МХ.
Таким образом, вне зависимости от генотипа индуцибельности
(генотипа Ah-рецептора) все исследуемые линии мышей реагировали на
введение химических канцерогенов (МХ или ОАТ) усилением экспрессии
генов CYP1A1 и CYP1A2. Этот факт оказался неожиданным, поскольку
15
мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУнеиндуцибельными. Полученные результаты выявили несоответствие между
усилением транскрипции генов CYP1A1 и CYP1A2 и индуцибельностью
соответствующих ферментов в печени мышей, что не согласуется с
общепринятыми представлениями о механизмах индукции CYP1A1 и
CYP1A2. Наличие при индукции МХ и ОАТ увеличения мРНК CYP1A1 у
всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора указывает на то, что
межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора, и позволяет
предположить
существование
посттранскрипционных
механизмов
регуляции CYP1A. Однако невозможно все объяснить с точки зрения только
посттранскрипционных механизмов регуляции. Так у Ah+ линий обнаружено
увеличение как уровня мРНК для генов CYP1A, так и уровня
ферментативных активностей соответствующих ферментов. Также линия
SWR ведет себя, как классическая неиндуцибельная линия в отношении
CYP1A2. Скорее всего, существует вклад в межлинейные различия
индуцибельности CYP1A и на транскрипционном уровне.
Содержание мРНК генов AhR и ARNT в печени мышей в норме и
при индукции МХ
До настоящего времени тестируемые линии не были охарактеризованы
по уровню экспрессии генов AhR и ARNT. Поэтому следующим шагом в
нашей работе было определение уровня мРНК этих транскрипционных
факторов в норме и при индукции. Поскольку предварительно не было
обнаружено существенных отличий при индукции CYP1A ОАТ и МХ, то
дальнейшие эксперименты проводили только с использованием МХ в
качестве индуктора.
Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК
транскрипционных факторов AhR и ARNT в печени 6-ти инбредных линий
мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности
к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов
(ПАУ). Результаты представлены на рисунке 5.
На рисунке 5а приведены значения относительного содержания мРНК
Ah-рецептора в печени мышей исследуемых линий. Видно, что вне
зависимости от генотипа AhR, его экспрессия практически одинакова у всех
мышей. И лишь для линии SWR можно отметить почти двукратное снижение
его экспрессии по сравнению с другими линиями. Видно также, что
экспрессия этого фактора практически не изменяется при введении мышам
индуктора. При индукции МХ содержание мРНК AhR статистически значимо
(p < 0.05) увеличивалось только у мышей линий AKR и DBA, тогда как у
C57BL, A/Sn, CBA и SWR мышей – не изменялось.
16
А
Относительное содержание
мРНК AhR
Аналогичные эксперименты были проведены для ARNT (рис. 5б). И в
этом случае нами не было выявлено существенных межлинейных различий и
зависимости от введения индуктора. Конститутивный уровень мРНК ARNT
различался статистически значимо (p < 0.05), но лишь незначительно среди
исследуемых линий мышей: немного повышен у мышей линий CBA и SWR и
слегка понижен у AKR и DBA по сравнению с C57BL и A/Sn. После
индукции МХ содержание мРНК ARNT не изменялось у мышей с Ah+генотипом и слегка уменьшалось у мышей с Ah--генотипом.
Таким образом, проведенные эксперименты показали, что уровень
экспрессии генов AhR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah
рецептора и индукции 3-метилхолантреном.
1,2
1
контроль
Относительное содержание
мРНК ARNT
**
0,8
0,6
0,4
0,2
0
C57BL
Б
*
МХ - 20 ч
A/Sn
1,6
контроль
1,4
МХ - 20 ч
CBA
AKR
SWR
DBA
*
1,2
1
*
0,8
**
0,6
0,4
0,2
0
C57BL
A/Sn
CBA
AKR
SWR
DBA
Рисунок 5. Эффект МХ на относительное содержание мРНК AhR (А) и ARNT
(Б) в печени мышей разных линий. Данные представлены как средние значения для
групп животных из шести особей  стандартное отклонение. *P<0,05; **P<0,01;
***P<0,001 (Статистически значимые различия между МХ-индуцированными и
интактными животными по Критерию Стьюдента).
17
Анализ полученных данных позволяет сделать ряд важных
заключений. Во-первых, стабильная экспрессия AhR и ARNT, регулирующих
транскрипцию генов CYP1A, обнаруживается у всех исследуемых линий
мышей, различающихся по чувствительности к ПАУ-индукции, причем
введение МХ не влияет существенно на их экспрессию. Во-вторых,
изменение экспрессии генов CYP1A в ответ на индукцию МХ обнаруживается
у всех исследуемых линий мышей независимо от генотипа Ah рецептора.
Можно допустить, что у мышей с Ah+ генотипом (C57BL, CBA и A/Sn)
индукция CYP1A осуществляется через традиционный транскрипционный
механизм, как это было предложено ранее другими исследователями (Nebert,
1989; Gonzalez et al., 1984). В то же время у мышей с Ah- генотипом (SWR,
AKR и DBA) включается другой механизм индукции CYP1A, который,
возможно, не связан напрямую с AhR-опосредованным механизмом
регуляции. Эти результаты свидетельствуют в пользу AhR-независимого
механизма индукции CYP1A1 и CYP1A2, что подтверждается случаями,
известными для CYP1A2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993; Adams et
al., 1993). Механизм феномена AhR-независимого пути остается
неизвестным. Предполагается, что он реализуется благодаря активации
посттранскрипционных
механизмов
стабилизации
мРНК
и/или
посттрансляционной стабилизации комплекса фермент-индуктор. Повидимому, также в отсутствие Ah рецептора, другие транскрипционные
факторы способны связываться со специфической последовательностью ДНК
(DRE) с последующей инициацией транскрипции гена CYP1A2 (Corcos et al.,
1998), хотя для CYP1A1 такой механизм до сих пор не показан. Другая
гипотеза может быть связана с существованием у мышей с Ah- генотипом
посттранскрипционного механизма регуляции CYP1A, который ингибирует
синтез белков CYP1A. Отсутствие накопления белков во время стабильной
транскрипции соответствующих генов может указывать на дефекты в
трансляции CYP1A1 и CYP1A2. Для определения точного механизма данного
явления требуется более глубокое исследование молекулярной генетики Ah
рецептора, а также дальнейшее исследование посттранскрипционных
механизмов регуляции генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных
инбредных линий.
В результате нашего исследования показаны индивидуальные различия
в конститутивном и индуцированном уровне экспрессии генов CYP1A1,
CYP1A2, AhR и ARNT для каждой исследуемой линии мышей, даже если
некоторая корреляция была обнаружена в отношении генотипа Ah рецептора.
Таким образом, инбредные линии мышей представляют уникальную модель
для изучения индивидуальных различий в механизме экспрессии генов
цитохрома P450 1A, что, возможно, является основной причиной различной
индивидуальной чувствительности к канцерогенам.
18
Сравнительный анализ регуляторной последовательности гена
CYP1A2 (от -4675 до -4204) у мышей инбредных линий
В настоящей работе было показано, что в случае мышей линии SWR
содержание мРНК в норме существенно повышено по сравнению с мышами
других исследуемых линий. К тому же, не было обнаружено увеличения
количества мРНК CYP1A2 при индукции МХ и ОАТ, как в случае мышей
остальных тестируемых линий мышей (рис. 4). Мы предположили, что такая
неодинаковая картина экспрессии гена CYP1A2 под действием индукторов у
инбредных линий при стабильной экспрессии транскрипционных факторов
может быть связана с мутациями/заменами в ДНК-связывающей области
промотора гена CYP1A2. Ранее в промоторе гена CYP1A2 мыши была
идентифицирована область, содержащая два энхансерных элемента, которая,
как было показано, необходима для конститутивной экспрессии гена CYP1A2
(Uchida et al., 2002) (рис. 7). В нашем эксперименте мы проверили гипотезу,
что возможные полиморфизмы в этой регуляторной области гена CYP1A2
могут вносить вклад в генетические различия экспресии и/или индукции
CYP1A2 среди различных инбредных линий мышей.
Для этого в микросомах печени мышей была определена МРОД
активность, которая, как считается, отражает ферментативную активность
CYP1A2. Для анализа использовали 11 линий мышей, различающихся по
генотипу Ah рецептора и чувствительности к гепатоканцерогенному
действию ОАТ (табл. 2).
Таблица 2. Используемые в эксперименте линии мышей
Чувствительные
к
индуцированному
канцерогенезу *
Устойчивые
к
индуцированному
канцерогенезу *
ОАТОАТ-
Чувствительные
к индукции ПАУ**
C57BL, A/Sn, A/He, CBA,
C3H/а
Нечувствительные
к индукции ПАУ**
DBA, SWR, DD
BALB/c, CC57BR
AKR
*Каледин, Захарова, 1984; Каледин и др., 1990; ** Nebert, 1989
Результаты эксперимента представлены на рисунке 6. Можно заметить
различия среди исследуемых линий: некоторые из них имеют сравнимый
конститутивный уровень ферментативной активности CYP1A2, в то время
как у других он повышен (CC57BR) или понижен (C3H/a, A/Sn, AKR, SWR).
19
(пкмоль/мг белка/мин)
350
300
250
200
150
100
50
C3H/a
A/Sn
AKR
SWR
1
C57BL
BALB/c
CBA
DD
DBA
A/He
CC57BR
0
Рисунок 6. Конститутивная активность МРОД в печени мышей различных
линий.Статистический анализ проведен с использованием Критерия Стьюдента.
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из восьми
животных.
Для проверки, не является ли причиной обнаруженных различий
возможный полиморфизм в регуляторном районе гена CYP1A2, была
секвенирована последовательность ДНК гена CYP1A2 от -4675 до -4204,
содержащая необходимые для конститутивной экспрессии элементы E1 и E2,
у всех исследуемых линий мышей (рис. 7).
- 4675
ccacatcttggctcattactgcctataattccagtctcaagggaatttgatgcccccttc
tggcccccgtgggtgctgcacccatgtgatccacaaacatgcatgaaggcaaaacattca
cacatgcttataataagataatttttgtttgtttaactttgtattggttctttatgaatt
tcacatcatgcaccccagtcccacccatcccctggttcccttgtactcaccctatgccct
tccacttcctcccaaaagaaaacaaaatcttgtgGAAGTTGTAGTGAGTCATTGATCTGG
TTCAAGGCCTCTGGCTTCGGCTACACTATCAGTACTGGACCTCACTGAGACTCCTCTCAG
ATACCCTGCTGTTGCTCTGTGTCAtagtgattctgcagatttggacctgtagaagcagtc
ccttcatgtgctctggcagttcatagatgaggtagatgttggcgtgggacaa
- 4204
Рисунок 7. Нуклеотидная последовательность исследуемого района.
Энхансерный район и 5- и 3-фланкирующие последовательности представлены
заглавными и прописными буквами соответственно. Энхансерные элементы E1 и E2
подчеркнуты.
20
В результате анализа не было обнаружено полиморфизмов в
исследуемом
фрагменте
ДНК,
который,
по-видимому,
является
консервативным и не связан с межлинейными различиями в экспрессии
CYP1A2 и чувствительности к гепатоканцерогенному действию ОАТ.
С другой стороны, подобная стабильность в регуляторном районе гена
может отражать ключевую роль, которую этот район играет в конститутивной
экспрессии гена CYP1A2. В этом случае фенотипические различия могли бы
быть связаны с регуляцией экспрессии этого гена или, возможно, с
полиморфизмами других районов гена CYP1A2.
Идентификация возможных полиморфных вариантов гена имеет
значение для фармакогенетических исследований, включая экспрессию гена
CYP1A2, так же как и поиск новых детерминант метаболизма ксенобиотиков
в токсикологии. Действительно, недавно несколько полиморфизмов были
обнаружены в гене CYP1A2 в экспериментах с APN и C3H/HeJ мышами,
различающимися по скорости метаболизма кофеина (Casley et al., 1999;
Casley et al., 2000). Таким образом, представляют интерес дальнейшие
исследования других районов гена CYP1A2 среди различных линий мышей.
Влияние стресса на индукцию цитохрома Р4501А, AhR и ARNT
В возрастных изменениях особое значение имеют сдвиги на двух
уровнях: изменения в регуляции работы генов и изменения в нервной и
гормональной регуляции. Известно, что и при стрессе в основе многих
изменений клеточного метаболизма лежат гормональные сдвиги (Frolkis,
1993). У человека активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в
печени существенно снижается при старении (Anantharaju et al., 2002).
Данные по экспрессии цитохромов Р450 у экспериментальных животных при
старении на сегодняшний день не систематизированы. Из многочисленных
исследований следует, что возрастная зависимость экспрессии этих
ферментов различается у различных видов и линий животных, у мужских и
женских особей (Pegram et al., 1995; Mote et al., 1990; Cao et al., 2001).
Показано, что продолжительность жизни животных, находящихся в
обычных условиях, в условиях умеренных стрессов, больше, чем тех, которые
жили при резком ограничении стрессовых воздействий или, наоборот, в
условиях частых “сильных” стрессов. Многие проявления старения сходны с
теми изменениями, которые наступают у взрослых животных, у людей при
стрессе. Например, общими для старения и стресса являются повышение
концентрации адреналина, вазопрессина, АКТГ и кортизола в крови,
снижение концентрации тестостерона, тироксина, трийодглобулина, падение
инсулиновой активности крови.
Недавние исследования обнаружили непосредственное влияние как
психологического, так и физиологического стресса на экспрессию генов
21
CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей и крыс (Konstandi et al., 2004; Konstandi et
al., 1998). Очевидно, реакция системы фементов метаболизма ксенобиотиков
на внешние регуляторные факторы может модифицироваться в условиях с
измененной физиологической регуляцией. Широко известно, что рак чаще
всего развивается при старении, что, в свою очередь, связано с динамикой
возрастных генорегуляторных изменений. Таким образом, существует
очевидная связь между стрессом, старением и системой ферментов
цитохрома Р450.
Поскольку CYP1A участвуют в метаболизме не только экзогенных, но
также и эндогенных соединений, то определенный интерес представляют
исследования воздействия физиологических и психологических факторов на
систему ферментов метаболизма ксенобиотиков. В связи с этим, следующим
этапом нашей работы было изучение влияния стресса и старения на
регуляцию генов CYP1A1 и CYP1A2.
В работе проведено исследование экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2,
AhR и ARNT в печени взрослых (3-месячных) и старых (26 месячных) мышейсамцов линии C3H/a, подвергнутых иммобилизационному стрессу.
На рисунке 8 показана типичная электрофореграмма разделения
продуктов амплификации мультиплексной ПЦР. Результаты эксперимента
представлены на рисунке 9. В печени мышей исследуемых линий мРНК
CYP1A1 не регистрировался, как у интактных животных, так и у
подверженных иммобилизационному стрессу (данные не представлены).
Содержание мРНК ARNT было чрезвычайно низким у молодых животных и
достаточно высоким у старых.
Статистическая обработка данных с использованием многофакторного
анализа вариации (MANOVA) показала эффекты старения (F A) и стресса (FS)
на экспрессию гена CYP1A2 (FA(1,22) = 173,02, P<0,00001; FS(1,22) = 11,70,
P<0,003) и AhR (FA(1,22) = 721,34, P<0,00001; FS(1,22) = 113,47, P<0,00001), а
также взаимодействие двух факторов Старение×Стресс (F(1,22) = 31,50,
P<0,00002 для CYP1A2; F(1,22) = 62,90, P<0,00001 для AhR).
Методом Tukey для итогового многофакторного сравнения средних
величин были обнаружены различия между экспериментальными группами.
В печени старых интактных мышей по сравнению с молодыми интактными
значительно увеличивалось содержание мРНК CYP1A2 (в 3,9 раза, P<0,001) и
уменьшалось содержание мРНК AhR (в 2,9 раза, P<0,001). В печени молодых
животных, подверженных стрессу, по сравнению с молодыми контрольными
увеличивалось содержание мРНК CYP1A2 и AhR (в 2,4 раза, P<0,001 и в 1,6
раза, P<0,001 соответственно). В печени старых, подверженных стрессу
мышей по сравнению со старыми контрольными животными содержание
мРНК статистически значимо увеличивалось в случае AhR (в 1,3 раза,
P<0,05) и ARNT (в 1,6 раза, P<0,001) и не изменялось в случае CYP1A2.
Из результатов нашего эксперимента видно, что имеет место ощутимое
влияние стресса на экспрессию исследуемых генов, которое в большей мере
22
проявляется у молодых особей (рис. 9). Обнаружены статистически значимые
различия между молодыми и старыми животными внутри контрольной
группы для всех исследуемых генов, за исключением CYP1A1. Так
содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей выше, чем в
печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых
животных понижено по сравнению с молодыми.
старые–контроль старые–стресс
молодые–контроль
молодые–стресс
← CYP1A2
← β-actin
Рисунок 8. Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТПЦР в 2%-агарозном геле.
Относительное количество
мРНК
4,5
4
молодые - контроль
молодые - стресс
старые - контроль
старые - стресс
***
3,5
3
2,5
***
###
2
***
1,5
#
1
***
0,5
0
CYP1A2
AHR
ARNT
Рисунок 9. Относительное количество мРНК в печени мышей. Данные
представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из семи животных.
***P<0,001 в сравнении с молодыми контрольными животными; ###P<0,001, #P<0,05 в
сравнении со старыми контрольными животными.
В печени интактных взрослых мышей мРНК CYP1A1 практически не
регистрировалась, в то время как содержание мРНК CYP1A2 было
достаточно высоким, что подтверждает результаты наших исследований и
вполне согласуется с полученными ранее данными (Kimura et al., 1986; Tukey,
Nebert, 1984). По нашим оценкам содержание мРНК CYP1A1 у интактных
животных было приблизительно на два порядка ниже содержания мРНК
CYP1A2 (данные не представлены). Не обнаружено влияния стресса и
23
старения на содержание мРНК CYP1A1. Напротив, содержание мРНК
CYP1A2 было выше у старых интактных животных по сравнению с
молодыми и увеличивалось под воздействием стресса у молодых особей. У
старых животных содержание мРНК CYP1A2 было почти в 4 раза выше по
сравнению с молодыми и практически не изменялось при стрессе.
Ранее было показано, что ЭРОД и ацетанилид-4-гидроксилазная
активности, отражающие ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2
соответственно, были одинаковы как у молодых (10-недельного возраста), так
и у старых (28-месячного возраста) мышей линии C57BL/6N (Pegram et al.,
1995). У мышей линии B10.RIII (H-2r) 28-месячного возраста содержание
мРНК CYP1A1 и CYP1A2 существенно уменьшалось на 65 и 95%
соответственно, по сравнению с мышами 4-месячного возраста. Однако у
мышей линии C57BL/10 (H-2b) не было обнаружено существенных
изменений в конститутивном содержании мРНК CYP1A1 и CYP1A2 (Mote et
al., 1990). У женских особей мышиной линии C3B10RF1 было показано
уменьшение экспрессии генов N-сульфотрансферазы и трех генов цитохрома
P450, включая CYP1A2, а также гена S-трансферазы omega 1 (фермента II
фазы) при старении (Cao et al., 2001). Эти данные противоречат результатам
нашего исследования, где у старых интактных мышей-самцов линии C3H/a
содержание мРНК CYP1A2 было почти в 4 раза выше по сравнению с
молодыми. Повышенное содержание мРНК CYP1A2 у старых животных
могло бы быть объяснен гипотезой, что хронические индукции этого
фермента ПАУ и многими другими ксенобиотиками на протяжении всей
жизни приводят к высокому уровню конститутивной экспрессии гена
CYP1A2. Однако это может зависеть и от используемой линии мышей или,
что наиболее вероятно, являться сложной функцией от изменений в генной
экспрессии, включая несколько ядерных факторов, и гормонального статуса.
В большинстве известных случаев, индукция CYP1A1 и CYP1A2
осуществляется через так называемый Ah-зависимый рецепторный механизм,
в котором непосредственное участие принимают транскрипционные факторы
Ah рецептор и ARNT. В связи с этим, возникает определенный интерес
изучить особенности экспрессии AhR и ARNT при стрессе и старении.
В настоящей работе показано, что содержание мРНК AhR у старых
интактных животных почти в три раза ниже по сравнению с молодыми. Эти
результаты согласуются с данными по онтогенезу AhR у крыс SpragueDawley: концентрация печеночного и легочного Ah рецепторов быстро
увеличивалась после рождения и оставалась на максимальном уровне со 2-ого
по 21-ый день. После этого концентрация AhR в этих тканях медленно
снижалась с возрастом (Gasiewicz et al., 1984). Интересно, что мы не смогли
оценить уровень экспрессии ARNT у молодых животных вследствие весьма
низкого содержания его мРНК, хотя линия C3H/a традиционно считается
ПАУ-индуцибельной. Кроме того, в других экспериментах мы обнаружили
24
достаточно высокую экспрессию ARNT у молодых мышей других линий, как
ПАУ-индуцибельных, так и ПАУ-неиндуцибельных.
У старых животных, однако, содержание мРНК ARNT было
достаточно высоким. Можно предположить, что подобное увеличение
экспрессии ARNT при старении могло бы способствовать транслокации Ah
рецептора и его аккумуляции в ядре, приводя к транскрипционно активному
комплексу AhR-ARNT, способному индуцировать экспрессию геновмишеней, включая CYP1A2, содержание мРНК которого было значительно
увеличенным у старых мышей по сравнению с молодыми.
В некоторых исследований было показано, что как психологический,
так и физиологический стресс могут модулировать экспрессию генов
ферментов ММС (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al., 2004). У грызунов
под воздействием различных стрессов было показано уменьшение скорости
оксидативного метаболизма ксенобиотиков (Pollack et al., 1991), что могло
модифицировать токсичность этих соединений. Различные модели стресса,
как было установлено, различаются по своим эффектам на ферменты
биотрансформации. Например, при стрессе ограничения пространства
(restraint stress) увеличиваются некоторые ферментативные активности в
печени мышей и уменьшаются другие, в то время как умеренный
непредсказуемый стресс (unpredictable mild stress) действует по другому,
иногда даже противоположному пути (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al.,
2004; Matamoros, Levine, 1996).
До сих пор при изучении животных используются многие стрессовые
воздействия, такие как касание или ношение в руках, иммобилизационный
стресс, ожидание болевых стимулов и гипотензивное кровотечение. Ханс
Селье был первым исследователем, применившим иммобилизационный
стресс в экспериментах на крысах (Selye, 1936). Впоследствии данный тип
стресса был хорошо изучен в отношении различных аспектов эндокринной и
нервной системы. В нашем эксперименте мы использовали в качестве модели
модель иммобилизационного стресса, описанную ранее (Kvetnansky, Mikulaj,
1970). Было показано, что воздействие иммобилизационного стресса в
течение 30-180 мин приводит к изменениям мРНК уровня ряда генов в
тканях различных органов (Pacak, Palkovits, 2001; Kvetnansky et al., 1995).
Однако до сих пор немного известно о системе ферментов метаболизма в
период поздних стадий развития организма и в условиях стресса.
Можно предположить, что благодаря индукции CYP1A2 у мышей,
подвергнутых иммобилизационному стрессу, и повышенному уровню
экспрессии гена CYP1A2 у старых животных, в печени может происходить
ускоренное
разложение
какого-либо
эндогенного
субстрата,
и,
соответственно, падение его уровня в крови. В этом случае нарушается
сигнальная система, функционирующая по принципу обратной связи, что
может способствовать усиленной гормональной секреции, и, как следствие,
развитию опухолей. Так, например, гипофиз, в который не поступает
25
тироксин, постоянно выделяет ТТГ (тиреотропный гормон), что вызывает
пролиферацию клеток щитовидной железы с последующим развитием
опухоли (Fagin, 1994).
Полученные нами результаты определенным образом согласуются с
данными по исследованию активности НАДН: и НАД(Ф)Н: 2,6дихлорфенолиндофенол редуктаз в микросомах печени взрослых и старых
крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу. Было показано, что
активность обеих редуктаз резко снижена у старых животных по сравнению
со взрослыми. При стрессе у взрослых крыс происходило выраженное
уменьшение активности НАДН-редуктазы (Рудько, Давыдов, 2001).
Таким образом, нами показано, что содержание мРНК исследуемых генов, за
исключением CYP1A1, различается между контрольными группами взрослых
и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых
мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как
содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со
взрослыми.
Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов
CYP1А2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей.
Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции
адаптации на стресс у старых животных. Дальнейшее изучение данного
вопроса помогло бы объяснить причины изменений функции печени при
старении и установить роль стресса в формировании возрастной патологии
этого органа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Инбредные линии мышей, различающиеся по чувствительности к
индуцирующему действию ПАУ, являются общепризнанной удобной
моделью не только для изучения индуцирующего действия многих
химических соединений на живые организмы, но и для изучения механизмов
химически индуцированного канцерогенеза. Поэтому исследование
различных этапов индукции, начиная от активации генов и заканчивая
«созреванием» ферментативной активности, является актуальной проблемой
современной биохимии и токсикологии. В настоящей работе было проведено
исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени инбредных
линий мышей с различным генотипом Ah рецептора с одновременным
измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия
соответствующих генов, а также уровень экспрессии транскрипционных
факторов, вовлеченных в индукцию.
В ходе выполнения работы было показано, что индукция цитохромов
Р450 подсемейства 1А зависит не только от генотипа Ah-рецептора, но и от
26
таких физиологических факторов, как возраст и стресс. Количество мРНК
генов CYP1А1, CYP1А2, AhR и ARNT различается у молодых и старых мышей
в норме и под воздействием стресса. Влияние стресса в большей мере
проявляется у молодых особей, что, по-видимому, демонстрирует отсутствие
или существенное ослабление у старых животных реакции адаптации на
стресс.
В печени взрослых мышей, как чувствительных к индуцирующему
действию ПАУ (Ah+ генотип), так и нечувствительных линиях (Ah- генотип),
регистрировалась существенная конститутивная экспрессии генов СYP1A2,
AhR, ARNT при отсутствии экспрессии гена СYP1A1. Последний, будучи
конститутивно неактивным, высоко чувствителен к индукции многими
планарными ПАУ, как это показано и в нашем случае, когда в эксперимент
были взяты линии C57BL, A/Sn и CBA (Ah+ генотипом). Для этих мышей
увеличение содержания мРНК СYP1A1 сопровождалось многократным
усилением ферментативной активности, специфичной для этой формы
цитохрома Р450. Этот факт свидетельствует о классическом варианте
индукции, когда увеличению ферментативной активности предшествует
усиление транскрипции гена.
Однако для мышей линий SWR, AKR и DBA (Ah- генотип),
являющихся нечувствительными к ПАУ-индукции, характерен другой
механизм, когда при наличии транскрипта гена CYP1А1 не регистрируется
увеличение активности фермента.
Этот факт свидетельствует о
посттранскрипционной супрессии синтеза белка, о чем также говорят и
результаты Вестерн-блот анализа. И если до сих пор отсутствие
индуцирующего эффекта ПАУ на монооксигеназы данных линий мышей
объясняли дефектом Ah-рецептора, то полученные результаты опровергают
это предположение. В таком случае целесообразно говорить о дефекте
белкового синтеза у мышей линий SWR, AKR и DBA. Чтобы окончательно
выяснить механизм этого явления, необходимо провести детальное
исследование синтеза белковой молекулы CYP1A, начиная от полисом и
заканчивая фолдингом белка в микросомах.
Проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов
транскрипционных факторов AhR и ARNT существенно не зависит от
генотипа Ah рецептора и индукции ПАУ. Таким образом, полученные
результаты свидетельствуют о различных механизмах индукции CYP1A у
мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, причем эти
различия выявляются для каждой индивидуальной линии. Тогда при
исследовании механизмов канцерогенного действия химических соединений,
в том числе и ПАУ, целесообразно применять индивидуальный подход для
каждой исследуемой линии инбредных мышей.
27
ВЫВОДЫ
1. Уровень ферментативной активности CYP1A1 и CYP1A2 в печени
не различается в норме между мышами всех исследуемых линий. При
введении как МХ, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в 8-27 раз
увеличивается у мышей C57BL, CBA и A/Sn, обладающих Ah+ генотипом, и
не изменяется у мышей SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah -, что
подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома
Р450 1А у мышей.
2. В печени мышей всех исследуемых линий (с Ah+ или Ahгенотипом) в норме определяется мРНК СYP1А2, но не СYP1А1. Под
действием МХ и ОАТ содержание мРНК СYP1А2 увеличивается в 2-4 раза у
мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК
CYP1А1 также увеличивается в 10-200 раз у всех линий мышей, независимо
от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA,
традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.
3. В печени мышей всех исследуемых линий, различающихся по
чувствительности к индукции ПАУ, определяется мРНК транскрипционных
факторов AhR и ARNT, причем введение МХ существенно не влияет на
уровень их экспрессии. Вместе с результатами по экспрессии генов СYP1А1 и
СYP1А2 это свидетельствует о том, что межлинейные различия у мышей в
чувствительности к индукции ПАУ обусловлены не только дефектом Ahрецептора.
4. Последовательность регуляторной области гена CYP1A2 (от -4675
до -4204), содержащая энхансерные модули, необходимые для
конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у различных инбредных линий
мышей является консервативной и не связана с межлинейными различиями в
экспрессии CYP1A2 и чувствительностью к гепатоканцерогенному действию
ОАТ.
5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1А1,
различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса.
Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше,
чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у
старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием
стресса увеличивается экспрессия генов CYP1А2, AhR и ARNT, что в большей
мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об
отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции
адаптации на стресс.
28
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1.
Mikhailova O.N., Filipenko M.L., Timofeeva O.A., Kaledin V.I., Gulyaeva
L.F., Lyakhovich V.V. Induction of CYP1A1 and CYP1A2 gene expression
by different xenobiotics in liver of C57BL mice. // 13th International
Symposium on Microsomes and Drug Oxidations “MDO2000”. – 2000. –
Stresa, Italy. – P. 140.
2. Mikhailova O.N., Filipenko M.L., Timofeeva O.A., Kaledin V.I., Gulyaeva
L.F., Lyakhovich V.V. CYP1A1 and CYP1A2 gene expression during
induction with different xenobiotics in liver of C57BL mice. // Analytical
Cellular Pathology. – 2001. – V. 22. – P. 24-25.
3. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Differences in gene
expression and regulation of biotransformation enzymes in liver of adult and
aged mice during stress. // 18th European Workshop on Drug Metabolism
“DMW2002”. – 2002. – Valencia, Spain. – P.46.
4. Михайлова О.Н., Гуляева Л.Ф., Филипенко М.Л. Возрастные изменения
экспрессии ферментов метаболизма гормонов и других эндогенных
субстратов в печени и влияние стресса. // "Эндокринная регуляция
физиологических функций в норме и патологии". – Сб. докладов. – 2002.
– Новосибирск, Россия. – С. 93.
5. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Effect of immobilization
stress on drug metabolizing enzymes in liver of adult and aged mice. // Drug
Metabolism Reviews. – V. 34 – 2002. – P. 114.
6. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Age-dependent alterations
in expression of metabolizing enzymes in mouse liver during stress. // 3rd
European Congress of Biogerontology. – 2002. – Florence, Italy. – P. 119
7. Zacharova L.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V., Mikhailova O.N.,
Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I. Comparison of cytochrome
P450 1a gene expression in the liver of aromatic hydrocarbon - responsive and
– nonresponsive mice treated with 3-methylcholanthrene or
oaminoazotoluene. // Drug Metabolism Reviews. – 2003. – V. 35. – P. 81.
8. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Age-dependent alterations
in expression of metabolizing enzymes in the mouse liver during stress. //
Endocrine Reguluation. – 2003. – V. 37. – P. 98
9. Zacharova L.Yu., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V., Mikhailova O.N.,
Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I. Cytochrome P4501A1 and
1A2 gene expression in the liver
of 3-methylcholanthrene- and oaminoazotoluene treated mice: A comparison between PAH-responsive and
PAH-nonresponsive strains. // Toxicological Sciences. – 2003. – V. 73. – P.
108-113.
10. Михайлова О.Н., Филипенко М.Л., Тимофеева О.А., Каледин В.И.,.
Гуляева Л.Ф, Ляхович В.В. Уровень мРНК и активность цитохромов
29
Р450 1А в печени мышей линии C57BL при индукции различными
ксенобиотиками. // Биомедицинская химия. – 2003. – Т. 49. – С. 388-393.
11. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L., Kaledin V.I. A
comparative sequencing of enhancer elements in the mouse CYP1A2 gene
among mouse strains. // Drug Metabolism Reviews. – 2004. – V. 36. - P. 72.
12. Mikhailova O.N., Gulyaeva L.F., Filipenko M.L. Gene expression of drug
metabolizing enzymes in adult and aged mouse liver: a modulation by
immobilization stress. // Toxicology. – 2005. – V. 210. – P. 189-196.
13. Mikhailova O.N., Vasyunina E.A., Ovchinnikova L.P., Gulyaeva L.F.,
Timofeeva O.A., Filipenko M.L., Kaledin V.I.. O-Aminoazotoluene does
induce the enzymes of its own mutagenic activation in mouse liver. //
Toxicology. – 2005. – V. 211. – P. 132-138.
Список используемых сокращений:
AhR
АRNT
CYP
CYP1A1, CYP1A2
GAPDH
МХ
МРОД
ОАТ
ПАУ
RPL30
ЭРОД
XRE
арилгидрокарбоновый рецептор
переносчик AhR в ядро
цитохром Р450
цитохром Р450 1А1, цитохром Р450 1А2
глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
3-метилхолантрен
метоксирезоруфин-О-деметилаза
о-аминоазотолуол
полициклические ароматические углеводороды
рибосомный белок L30
этоксирезоруфин-О-деэтилаза
ксенобиотик-чувствительный элемент
Соискатель
О.Н. Михайлова
30