Отклонения в развитии нервно-психических функций у детей

АПОПТОЗ НЕЙРОНОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА ДЕТЕЙ ПРИ
ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
И.А.Швед, Н.К.Сугак, Т.Э.Владимирская, Г.Я.Хулуп
Отклонения в развитии нервно-психических функций у детей раннего возраста в
большинстве случаев своими корнями уходят в перинатальный период и привлекают в
настоящее время все большее внимание исследователей. Цитомегаловирус – один из часто
встречающихся инфекционных
агентов, определяющих пренатальную
постнатальную
патологию
инфекционную
новорожденных
[1-4].
и
Один
раннюю
из
20
инфицированных цитомегаловирусом детей может иметь клинические симптомы
заболевания, у 4 из 20 при проспективном наблюдении могут выявиться признаки
задержки развития или умственной отсталости [5,6].
Выявление в 1972 г. Kerr такого явления, как апоптоз, открыло перспективы для
разработки уникальных высокоэффективных диагностических и терапевтических (в том
числе
нейропротективных),
стратегий.
Поскольку
апоптоз
представляет
собой
регулируемый процесс, блокада синтеза, активации и/или экспрессии ряда его ключевых
белков сможет предотвратить гибель нейронов 7-9. Апоптоз в норме представляет собой
фундаментальный механизм развития и ремоделирования различных тканей и органов, в
т.ч. и головного мозга (ГМ) [10]. Под воздействием различных патологических стимулов
(гипоксии-ишемии, последующей реоксигенации-реперфузии с развитием «кислородного
парадокса», инфекции и пр.) возможна активация апоптотического каскада ферментов,
приводящая к гибели клеток [11,12].
Целью данного исследования было охарактеризовать особенности апоптотической
гибели
нейронов
и
морфологических
изменений
головного
мозга
детей
при
цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции.
Для исследования использовали ГМ 10 умерших детей с менингоэнцефалитом
(МЭ), вызванным ЦМВ. У всех детей патологический процесс развился в перинатальном
периоде (с 22 недель гестации до 7 суток жизни). Интервал между смертью ребенка и
аутопсией колебался от 4,5 до 22,5 часов, и в среднем составил 14,4±0,8 часа.
Причинами смерти послужили дыхательная, церебральная либо полиорганная
недостаточность.
После извлечения и макроскопического изучения ГМ вырезались кусочки из
цитоархитектонических полей (ЦАП) 4, 10 с подлежащим белым веществом, срок
фиксации которых в 10% растворе нейтрального забуференного формалина составил в
среднем 31,1±1,5 часа. Изготовление парафиновых микропрепаратов проводилось по
стандартной методике. Кроме этого, вырезались кусочки из перивентрикулярных отделов,
1
очагов поражения (перивентрикулярная лейкомаляция - ПВЛ, кисты), мозжечка, моста,
продолговатого мозга. После фиксации в 10% растворе нейтрального забуференного
формалина в течение 14-18 суток фрагменты ГМ заливались в парафин по стандартной
методике. Затем готовили срезы толщиной 4-6 мкм, которые окрашивали гематоксилином
и эозином, Luxol Fast Blue по Клювер-Баррера в модификации Викторова.
Для
выявления
апоптоза
использовали
метод
Использовался
TUNEL.
коммерческий набор NeuroTACSTM (Trevigen, США). Апоптотический индекс (АИ)
вычислялся по TUNEL-позитивным нейронам на 100 нервных клеток 2–6 слоев
цитоархитектонических полей (ЦАП) 4 (АИ4) и 10 (АИ10) при увеличении 400 (в 20 полях
зрения, минимальное количество подсчитанных клеток в каждом наблюдении 400).
Для выявления механизмов развития использовали антитела к активной каспазе-3.
С
целью
определения
экспрессии
активной
каспазы
3
(АК-3)
использовался
иммуногистохимический метод. Индекс экспрессии (ИЭ) АК-3 вычислялся по позитивно
окрашенным нейронам на 100 нервных клеток 26 слоев ЦАП 4 (ИЭак34) и 10 (ИЭак310).
Изучение препаратов и изготовление микрофотографий проводили с помощью
микроскопа DMLS с программным обеспечением («Leica», Германия). Статистическую
обработку проводили с использованием пакета программ STATISTICA 6,0.
Изменения ГМ детей с перинатально приобретенной ЦМВ-инфекцией зависели от
срока гестации и продолжительности жизни. Основные данные, характеризующие
особенности анамнеза детей и поражения ГМ, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Особенности анамнеза и поражения головного мозга детей с ЦМВ-инфекцией
№
Срок
п/п
гестации,
Пол
недели
Масса тела
Продолжи-
при рождении,
тельность
г
жизни
Вид поражения ГМ
1
2
3
4
5
6
1
23
М
620,0
10 сут.
Острый МЭ, ПИВК 2
2
27
Ж
1100,0
44 дня
3
29
М
1650,0
5 сут.
4
30
М
1780,0
1 год
5
32
Ж
1690,0
6,5 мес.
Хронический
энцефалит, ПИВК 1
Острый МЭ, ПИВК 1
Хронический
МЭ, киста, гидроцефалия
Хронический МЭ, кисты
2
1
2
3
4
5
6
33
М
1820,0
8 мес.
7Ц
34
М
2110,0
1,5 года
Хронический МЭ, кисты
8Ц
36
М
2890,0
27 сут.
Острый МЭ, ПИВК 1
9Ц
37
Ж
3160,0
11 мес.
10Ц
6
Хронический энцефалит,
гидроцефалия
Хронический МЭ,
гидроцефалия
Хронический МЭ, киста,
40
Ж
4,5 мес.
3345,0
гидроцефалия
Выявлялся ряд общих признаков поражения ГМ:
1) Гигантоклеточная трансформация нейронов и/или глиоцитов и эндотелиоцитов
сосудов – цитомегалические клетки (характерный вид по типу «совиного глаза»,
возникающий в результате формирования крупного внутриядерного гиперхромного
включения с ободком просветления) (рис. 1). Данные клетки локализовались в
перивентрикулярных отделах, белом веществе больших полушарий ГМ, мосте,
продолговатом мозге. У детей старше 2-х месяцев выявлялись петрифицированные ЦМВклетки преимущественно в субвентрикулярной зоне больших полушарий ГМ и стволовых
отделах. Располагались поодиночке либо небольшими группами по 2-5 клеток. ЦМВтрансформации постоянно подвергалась нейроглия (10 наблюдений, 100%), реже нейроны
(7 наблюдений, 70%) и эндотелиоциты сосудов белого вещества больших полушарий ГМ
(3 наблюдения, 30%).
2) Наличие скудных очаговых периваскулярных инфильтратов, состоящих из
лимфоцитов. Данные инфильтраты выявлялись в мягкой мозговой оболочке (8
наблюдений, 80%), белом веществе больших полушарий ГМ (9 наблюдений, 90%),
стволовых отделах ГМ (6 наблюдений, 60%).
3)
Патологическая
незрелость
ГМ,
характеризовавшаяся
отставанием
его
созревания на 2 и более недель по сравнению с постконцептуальной нормой. Нарушение
перинатального развития ГМ характеризовалось также наличием ряда других тканевых
дисплазий (врожденных и приобретенных): гетеротопий нейронов в пределах корковой
пластинки больших полушарий ГМ, наличие аномальных (атрофированных) нейронов,
нарушения миело- и цитоархитектоники и васкуляризации (рис. 2); гипоплазией белого
вещества больших полушарий ГМ.
3
Рис. 1. Цитомегалические клетки,
окраска гематоксилином и эозином,
ув. 400.
Рис. 2.. Дисплазии неокортекса у ребенка с
хронической ЦМВ-инфекцией,
окраска гематоксилином и эозином, ув. 50.
Кроме этого у детей сроками 23-29 и 36 недель гестации выявлялись ПИВК 1 и 2. У
детей,
проживших
4,5
месяца
и
более,
в
области
базальных
ганглиев
и
перивентрикулярных отделов больших полушарий ГМ определялись кисты диаметром до
3,0 см, не сообщавшиеся с полостью боковых желудочков (ложная порэнцефалия),
содержавшие
прозрачную
жидкость.
Стенки
этих
кист
были
представлены
глиофибриллярной мембраной.
В ряде наблюдений (5 случаев, 50%) имели место нарушения васкуляризации по
типу избыточной пролиферации кровеносных капилляров в различных отделах ГМ (более
выражена в больших полушариях ГМ, мягкой мозговой оболочке). Постоянной находкой
являлись петрифицированные нейроны и цитомегалические клетки в области базальных
ганглиев и стволовых отделов ГМ. Характерным признаком являлся глиоз: фибриллярный
(белого вещества больших полушарий ГМ, мозжечка, в т.ч. субэпендимальный) и
протоплазматический с формированием тучных астроцитов Ниссля, имевших овальное
крупное ядро (реже 2-3 ядра) и обильную эозинофильную цитоплазму; глиоз 1 слоя
неокортекса.
При исследовании микропрепаратов в световом микроскопе в различных отделах
ГМ выявлялись TUNEL-позитивные нейроны со следующими признаками апоптоза:
конденсация и краевая маргинация хроматина, пикноз ядра, отдельные апоптотические
тельца и их группы (рис. 3, 4); фагоцитоз апоптотических телец окружающими клетками
выявлялся крайне редко. Интенсивность апоптотической гибели была различной как в ГМ
разных детей, так и в различных отделах ГМ одного и того же ребенка. Во всех
наблюдения преобладала апоптотическая гибель нейронов неокортекса и гиппокампа над
интенсивностью апоптоза нервных клеток других отделов ГМ.
4
Рис. 3. Апоптоз нейронов неокортекса (4
ЦАП) у ребенка с острой ЦМВинфекцией,
TUNEL-метод, ув. 1000
Рис. 4. Апоптоз нейронов неокортекса (10
ЦАП) у ребенка с острой ЦМВинфекцией,
TUNEL-метод, ув. 1000
В 4 ЦАП апоптотические нейроны определялись в 16 слоях с преимущественной
локализацией во 2 и 4 слоях. TUNEL-позитивные клетки Беца отсутствовали. В 10 ЦАП
данные клетки распределялись относительно равномерно в 24 слоях. Выявлена прямая
корреляционная связь между АИ4 и АИ10 – острый МЭ (r=0,76; р0,01), хронический МЭ
(r=0,72; р0,01). Установлены также прямые корреляционные связи между степенью
активности процесса (острое либо хроническое воспаление) и АИ4 (rs=0,41; р0,05), АИ10
(rs=0,40; р0,01).
При иммуногистохимическом изучении экспрессии АК-3 выявлено слабое либо
умеренное позитивное окрашивание цитоплазмы нейронов 4 и 10 ЦАП. Распределение
данных нейронов в корковой пластинке (определялись в 16 слоях с преимущественной
локализацией во 24 слоях) в целом соответствовало распределению TUNEL-позитивных
клеток. Выявлено позитивное окрашивание цитоплазмы единичных клеток КахалаРетциуса, а также клеток Беца нормальной морфологической структуры либо с
признаками набухания. Кроме того, выявлялось позитивное окрашивание цитоплазмы
глиоцитов подкоркового белого вещества, эпендимоцитов, клеток субэпендимальных
псевдожелез.
Выявлена прямая корреляционная связь между АИ4 и ИЭак34 – при остром МЭ
(r=0,79; р0,01), при хроническом МЭ (r=0,69; р0,001), а также между АИ10 и ИЭак34 –
при остром МЭ (r=0,76; р0,01), при хроническом МЭ (r=0,54; р0,01). Установлены
также обратные корреляционные связи между степенью активностью процесса в головном
мозге (острое либо хроническое воспаление) и ИЭак34 (rs=0,46; р0,01), ИЭак310 (rs=0,44;
р0,01).
5
Результаты морфометрического исследования апоптоза нейронов 4 и 10 ЦАП, а
также экспрессии АК-3 в нейронных представлены в таблице 2.
Таблица 2
Интенсивность апоптотической гибели нейронов 4 и 10 ЦАП детей с ЦМВ-инфекцией
Вид поражения
АИ4, %,
ИЭак34, %
АИ10, %
ИЭак310, %
ГМ
(X±mx)
(X±mx)
(X±mx)
(X±mx)
Острый МЭ
3,10±0,08*†‡
5,19±0,10†*
3,76±0,08†‡
6,21±0,12†
1,30±0,04*‡
2,02±0,05
1,53±0,05‡
2,14±0,06
Хронический
МЭ/энцефалит
Примечание: * различия достоверны между соответствующими АИ4 и АИ10 и между
ИЭак34 и ИЭак310(р<0,01);
†
различия достоверны между острым и хроническим
воспалением (р<0,01); ‡ различия достоверны между соответствующими показателями
одного ЦАП (АИ и ИЭак3) (р<0,01)
Заключение. Для детей с ЦМВ – инфекцией характерна патологическая активация
апоптотической гибели нервных клеток неокортекса, интенсивность которой зависит от
активности воспалительного процесса (острое либо хроническое воспаление). При остром
воспалении апоптотические индексы цитоархитектонических полей 4 и 10 составили
соответственно 3,10±0,08% и 3,76±0,08%. При хроническом воспалении соответствующие
апоптотические индексы цитоархитектонических полей 4 и 10 были достоверно ниже
(р<0,01) и составили соответственно 1,30±0,04% и 1,53±0,05%. Апоптотическая гибель
нейронов 4 и 10 цитоархитектонических полей неокортекса детей с ЦМВ – инфекцией
осуществляется преимущественно каспазозависимым путем.
Литература:
1. Серов В.Н., Музыкантова B.C., Калашников В.Г. Врожденная цитомегалия – клиникоанатомическая характеристика // Акушерство и гинекология. – 1992. - № 7. – С. 33-36.
2.Кистенева Л.Б. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной
патологии: этиология, патогенез, диагностика // Российский вестник перинаталогии и
педиатрии. – 2003. – №4. – С. 55-59.
3.Griffits P.D. Strategies to prevent CMV infection in the neonate // Semin Neonatol. - 2002. –
Vol. 7, №4. – P. 293-299.
4.Wen L.Z., Xing W., Liu L. Q. et al. Cytomegalovius infection in pregnancy // Int J Gynaecol
Obstet. – 2002. - Vol. 79, №4. – P. 111-116.
6
5.Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the
literature. Gaytant M.A., Rours G.I., Steegers E.A. et al. // Eur J Pediat. – 2003. - Vol. 162, №4. –
P. 248-253.
6.Arav-Boger R., Pass R.F. Diagnosis and management of cytomegalovirus infection in
newborn // Pediat Ann. – 2002. - Vol. 31, №11. – P. 719-725.
7.Программированная клеточная гибель / Под ред. В.С.Новикова. – СПб., 1996. – 277 с.
8.Berger R., Garnier Y., Jensen A. Perinatal brain damage: underlying mechanisms and
neuroprotective strategies // J. Soc. Gynecol. Investig. – 2002. – Vol. 9, № 6. – Р. 319–328.
9.Protection against ischemic brain injury by inhibition of mitochondrial oxidative stress.
G.Fiskum, R.E.Rosenthal, V.Vereczki e.a. // J. Bioenerg. Biomembr. – 2004. – Vol. 36, № 4. – Р.
347–352.
10. Antiapoptotic role of the p38 mitogen-activated protein kinase-myocyte enhancer factor 2
transcription factor pathway during neuronal differentiation. S.Okamoto, D.Krainc, K.Sherman,
S.A.Lipton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97, № 13. – P. 7561–7566.
11. Apoptotic neurodegeneration following trauma is markedly enhanced in the immature
brain. P.Bittigau, M.Sifringer, D.Pohl e.a. // Ann. Neurol. – 1999. – Vol. 45, № 6. – Р. 724–735.
12. Intrauterine infection induces programmed cell death in rabbit periventricular white matter.
T.Debillon, C.Gras-Leguen, V.Verielle e.a. // Pediatr. Res. – 2000. – Vol. 47, № 6. – P. 736–742.
7