Тургунова Г.М. - Московский государственный медико
advertisement
На правах рукописи Тургунова Гульноза Мураджоновна КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АУТОИММУНИТЕТА И ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ У ПАЦИЕНТОК С ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИЕЙ 14.01.01 – акушерство и гинекология (медицинские науки) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва 2013 1 Работа выполнена учреждении в Государственном высшего государственный бюджетном образовательном профессионального образования «Московский медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России) Научный руководитель: Доктор медицинских наук, профессор Манухин Игорь Борисович Официальные оппоненты: Дамиров Михаил Михайлович – доктор медицинских наук, профессор (НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, заведующий научным отделением острых гинекологических заболеваний) Зуев Владимир Михайлович – доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, профессор кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета) Ведущее учреждение: ГБУЗ МО «Московский областной научно – исследовательский институт акушерства и гинекологии» Защита состоится « 2013 г. в » часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06, созданного на базе ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. С диссертацией государственного можно ознакомиться в медико-стоматологического библиотеке университета Московского имени А.И. Евдокимова (125206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а). Автореферат разослан « » 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Пономарева Юлия Николаевна 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Рак шейки матки остается одной из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей женских гениталий. Частота заболеваемости во всем мире варьирует от 10 до 40 на 100 тыс. женского населения, при этом почти половина больных умирают в течение первого года в связи с поздним диагностированием заболевания (Аксель Е.М., 2009; Чиссов В.В. и соавт., 2007; Урмачеева А.Ф. и соавт., 2004). Развитию рака шейки матки предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN). По современным представлениям, изменения эпителия шейки матки при CIN могут спонтанно регрессировать без лечения, подвергаться дальнейшей прогрессии и персистировать без каких-либо проявлений в течение длительного времени. Вероятность этих событий зависит от степени тяжести CIN. CIN II-III относятся к группе истинных предраковых поражений шейки матки с высокой вероятностью прогрессирования в рак при отсутствии лечебных мероприятий. При CIN I регресс заболевания составляет 40-75% случаев, прогрессирование – 5-10%, персистенция – 29-43% наблюдений (Подзолкова Н.М. и соавт., 2012; Фролова И.И., 2008). Согласно современным представлениям о канцерогенезе шейки матки цервикальные неоплазии различной степени тяжести, внутриэпителиальный рак и инвазивный рак являются последовательными стадиями малигнизации эпителия шейки матки (Заридзе Д.Г., 2004; Минкина Г.Н., 2012; Роговская С.И., 2008). Существуют убедительные данные, что в основе злокачественного роста лежат стойкие изменения на уровне генома определенных популяций клеток, приводящие к патологической активации собственных протоонкогенов, контролирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку клеток и созревание (Автандилов Г.Г. и соавт.,2007; Hazelbag S. et al., 2004). С другой стороны не менее важным условием развития злокачественных неоплазий является нарушения общей активности иммунной системы организма, так как 3 состояние естественного аутоиммунитета во многом и определяет механизмы межклеточного взаимодействия цервиковагинального биотопа, реализацию нейрогуморальных эффектов, предопределяя характер клинических проявлений и исход различных патологических процессов шейки матки (Дамиров М.М. и соавт., 2011; Полетаев А.Б., 2008, 2010). В связи с этим исследование состояния аутоиммунитета, отражающее состояние иммунореактивности организма является весьма перспективным прогностическим маркером при формировании патологических процессов шейки матки. Объективно оценить состояние аутоиммунитета позволяет метод Эли-ПТест, основанный на иммуноферментном анализе, выявляющим изменения в сывороточном содержании аутоантител (ауто-АТ) класса IgG, направленных к интерферону-гамма, интерферону альфа, β2-гликопротеину, двуспиральной ДНК, Fc-фрагменту иммуноглобулинов и коллагену (Полетаев А.Б. и соавт., 2001). Отмечено, что формирование цервикальных интраэпителиальных неоплазий сопровождается изменениями аутоиммунитета, связанными с аномальной выработкой определенных аутоантител к опухолеассоциированным антигенам (АГ) (Дамиров М.М. и соавт., 2011). Таким образом, изменение состояния аутоиммунитета у пациенток с заболеваниями шейки матки при всем разнообразии клинических проявлений данной патологии, общности патогенетических механизмов ее формирования может быть важным диагностическим маркером, с высокой вероятностью указывающий на начинающийся злокачественный процесс, позволяющий оценить эффективность лечения, обосновать выбор врачебной тактики и прогноз заболевания у данной категории больных. Цель исследования Совершенствование цервикальными подходов к интраэпителиальными исследования состояния аутоиммунитета. 4 тактике лечения неоплазиями пациенток на с основании Задачи исследования 1. Проанализировать особенности клинико-анамнестических и лабораторных данных обследования у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями. 2. Изучить структуру инфицированности онкогенными типами вируса папилломы человека у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями. 3. Оценить уровень вирусной нагрузки у пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями. 4. Исследовать иммунореактивность у пациенток цервикальными интраэпителиальными неоплазиями. 5. Оценить эффективность комплексной терапии цервикальной интраэпителиальной неоплазии в зависимости от состояния аутоиммунитета. 6. Разработать методологические подходы к комплексной терапии и тактике ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией различной степени тяжести и оценить ее эффективность. Научная новизна Впервые с помощью иммуноферментного анализа Эли-П-тест получены данные о прогностическом значении состояния аутоиммунитета у пациенток с цервикальными интраэпителиальными поражениями. Выявлено, что у большинства пациенток с тяжелыми интраэпителиальными поражениями наблюдается гипореактивный тип состояния аутоиммунитета в сочетании с высокой вирусной нагрузкой. Проанализированы результаты лечения пациенток с интраэпителиальными поражениями в зависимости от состояния аутоиммунитета и вирусной нагрузки. Разработаны прогностические критерии течения данного заболевания. Предложены новые рациональные клинические подходы к ведению пациенток с ВПЧ-ассоциированным цервицитом и цервикальными интраэпителиальными поражениями. 5 Практическая значимость Исследование аутоиммунитета в сочетании с определением уровня вирусной нагрузки у пациенток с ВПЧ-ассоциированными воспалительными поражениями шейки матки неоплазиями позволяют и цервикальными выявить группы интраэпителиальными риска по реализации прогрессирования патологического процесса шейки матки, что позволяет более дифференцированно подходить к назначаемой патогенетической терапии. Предложены новые рациональные клинические подходы к лечению пациенток с цервикальными интраэпителиальными поражениями. Положения, выносимые на защиту: 1. Цервикальные интраэпителиальные поражения тяжелой степени формируются на фоне персистирующей инфекции онкогенными типами ВПЧ и гипореактивными реакциями иммунной системы. 2. Высокая вирусная нагрузка в сочетании с гипореактивным типом иммунной системы является неблагоприятным прогностическим критерием клинического течения цервикальных интраэпителиальных поражений шейки матки. 3. Петлевая электрохирургическая эксцизия в сочетании с иммуномодулирующим лечением является высокоэффективным способом лечения CIN II-III и в большинстве случаев сопровождается элиминацией вирусной инфекции. Личное участие Автором цитологического лично проводился исследования забор и материала для ВПЧ-тестирования, жидкостного расширенная кольпоскопия, выполнялась прицельная биопсия шейки матки. После забора материал проведена статистическая обработка данных и их интерпретация с использованием современных статистических методов. Внедрение результатов исследования Результаты проведенного исследования внедрены в практику лечебной работы ГКБ №36,68 ДЗ г. Москвы, используются в учебном процессе на 6 кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета МГМСУ имени А.И. Евдокимова. Апробация материалов диссертации Материалы диссертации представлены и доложены на Российских Форумах «Мать и дитя» (2011-2012), Международном Конгрессе «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии» (Москва, 2011), XXV Международном Конгрессе c курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (2012). Публикации Основной материал исследования опубликован в 4 публикациях, 1 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 115 страницах текста, содержит 25 таблицу, 3 рисунков. Список литературы состоит из 194 источников, 52 – на русском языке и 142 – на иностранных языках. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Проведено клинико-лабораторное обследование 470 пациенток, направленных в специализированный кабинет патологии шейки матки с целью профилактического осмотра (скринингового обследования) или в связи с наличием аномальных цитологических мазков, позитивного ВПЧ – теста и/или сомнительными результатами кольпоскопического исследования. Основную группу составили 250 пациенток с позитивным ВПЧ тестом, обратившиеся с целью обследования и лечения заболеваний шейки матки, контрольную группу составили 220 здоровых ВПЧ негативных пациенток, которым проводилось ежегодное скрининговое обследование. У всех пациенток контрольной группы цитологическая картина соответствовала негативной по интраэпителиальной патологии и малигнизации. 7 По данным цитологического исследования, верифицированного результатами гистологического исследования среди пациенток основной группы было выделено 50 пациенток с хроническим ВПЧ-ассоциированным цервицитом, мазки которых были отнесены к ASCUS и 200 пациенток у которых по результатам обследования выявлено цервикальное интраэпителиальное поражение, оцениваемое как L-SIL (CIN I) – 60 пациенток и H-SIL (CIN II,III) – 65 и 75 пациенток, соответственно. Все исследования выполнялись с информированного согласия пациентов и соответствовали этическим принципам, предъявляемым Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000). Основные диагностические мероприятия до и после лечения включали: клиническое обследование, жидкостное цитологическое, кольпоскопическое исследование, ПЦР-тестирование на присутствие ВПЧ ВКР, молекулярное генотипирование ВПЧ ВКР и определение степени вирусной нагрузки. Также всем пациенткам проведена оценка иммунореактивности и исследование аутоиммунитета в соответствии с отраслевыми стандартами объемов обследования и лечения в гинекологии (Кулаков В.И. и соавт., 1999). Критерием отбора больных был возраст от 16 до 44 лет и информированное согласие. Клиническое анамнестические обследование и было объективные традиционным данные: и репродуктивный включало анамнез, сопутствующая соматическая патология, анамнез настоящего заболевания и проводимое ранее лечение, жалобы пациентки. Особое внимание уделялось возрасту начала половой жизни, количеству половых партнеров, используемым методам контрацепции, курению - как факторам риска CIN. Для цитологического исследования использована новая технология приготовления цитопрепаратов – тонкослойная жидкостная цитология (ЖЦ). Всем обследованным пациенткам после получения цитологического 8 материала произведено расширенное кольпоскопическое исследование. Во всех случаях применялся тест с 5% уксусной кислотой и проба Шиллера. Для описания кольпоскопических картин использовали терминологию Международной кольпоскопической классификации (Барселона, 2002 г.) Окончательные диагнозы адаптированы к морфологической классификации Бетесда. Гистологическое исследование биоптатов шейки матки и операционного материала выполняли в отделении патоморфологии МНИОИ им. П.А. Герцена. Результаты гистологического исследования трактовались согласно классификациям CIN и Бетесда. ВПЧ-тестирование и генотипирование проводилось на базе ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ тест-системами «Амплисенс® ВПЧ ВКР скрин-титр FRT» (Москва) методом ПЦР-анализа. Исследования по выявлению ДНК сопутствующих хламидий, генитальных уреаплазм, микоплазм, вируса простого герпеса I и II типов, цитомегаловируса, осуществлялись на основе метода ПЦР - диагностики и проводились в лаборатории молекулярной диагностики в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» (ГК СЭН, 1995). С целью изучения сывороточной иммунореактивности, отражающей количество некоторых видов естественных аутоантител, взаимодействующих с белками – регуляторами эмбриогенеза нами был применен метод «ЭЛИ-П-тест» (ELISA-detected Probably of pathology), основанный на стандартном иммуноферментном анализе. Определение ауто-АТ к АГ проводилось на базе специализированной лаборатории Медицинского исследовательского центра «Иммункулус». Статистическая обработка полученного материала проводилась непосредственно автором. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми 9 факторами был использован комплексный статистический анализ полученных количественных данных и порядковых величин. Пороговая величина вероятности ошибки устанавливалась равной 0,05. Для расчета достоверности различий в группах применялись непараметрические критерии (Манна-Уитни, Вилкоксона, Хи-квадрат, ранговый критерий Краскелла-Уоллеса) [11]. Расчеты выполнены с помощью персонального компьютера с использованием лицензионных статистических пакетов «Statistica 7,0» и «Microsoft Excel XP» в лицензионной программной оболочке «Windows Vista SP1». Результаты собственных исследований и их обсуждение I. Медико-социальная характеристика обследованных групп Цервикальная интраэпителиальная неоплазия развивается в течение длительного времени через отчетливую преинвазивную стадию, которая может быть определена эффективному цитологических морфологически лечению. Усилия, технологий, и подвергнута направленные стремительное на своевременному и совершенствование развитие молекулярно- биологических методов диагностики и разработка оптимальных скрининговых схем формируют новые научные подходы с целью своевременной детекции цервикальной патологии и, таким образом, сокращают путь пациентки от возникновения незначительного морфологического изменения к диагнозу и лечению. Средний возраст пациенток основной группы составил - 34,9 ± 4,9 лет, пациенток контрольной группы – 33,5 ±3,8 лет. Однако, при анализе повозрастного распределения пациенток выявлено, что среди обследованных преобладают пациентки в возрасте от 20 до 24 лет и от 25 до 29 лет, частота встречаемости заболеваний шейки матки в данной возрастной категории значительно выше, чем в контрольной 32,0% и 45,2% против 13,6% и 21,8% соответственно. Анализ социального статуса обследуемых пациенток свидетельствует, что среди пациенток патологией шейки матки преобладают женщины, 10 входящие в категорию служащих и учащихся – 72,0% и 18,0%, значительно реже встречались неработающие пациентки и представители рабочих профессий – 4,0% и 3,6% соответственно. Полученные в ходе анкетирования данные подтвердили высокую частоту курения среди пациенток с патологией шейки матки - 44,5%. При этом доля курящих увеличивается до 78,3% среди больных с тяжелыми интраэпителиальными поражениями шейки матки. На ранний сексуальный дебют (до 18лет) указывала 80% пациенток, 60,0% обследованных имели двух и более половых партнеров, на частую смену половых партнеров указывали 10,0% пациенток основной группы. Барьерные методы контрацепции использовали только 16,4% пациенток, при этом отмечено, что многие из них использовали презерватив или спермициды нерегулярно, чередуя их с календарным методом. Вместе с тем считается, что барьерные методы недостаточно эффективны для профилактики ВПЧ-инфекции, и для инфицирования нередко бывает достаточно тесного контакта кожи в области гениталий(Winer R.L. и соавт., 2006). Как следствие низкой культуры полового поведения, при изучении репродуктивного анамнеза отмечена высокая частота неблагоприятных исходов беременностей. Важную роль в патогенезе заболеваний шейки матки играет воспаление. Выявлено значительное увеличение частоты инфекций передаваемых половым путем среди пациенток с патологией шейки матки (хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, неспецифические вагиниты) – 51,2%. Практически каждая третья из обследованных пациенток имела длительный анамнез и ранее подвергалась деструктивному лечению шейки матки. Среди методов лечения превалировали ДЭК и радиохирургический метод. 26,1% пациенток перенесли несколько деструктивных и/или эксцизионных процедур. Таким образом, анализ анамнестических и объективных данных в клинической части работы, показал, что среди обследованных пациенток с заболеваниями шейки матки доминировали женщины раннего репродуктивного 11 возраста (от 18 до 29 лет), имеющие высокий инфекционный индекс. Для данной категории пациенток характерна высокая распространенность курения, ранний половой дебют и наличие более 2 половых партнеров, нерегулярное использование барьерной контрацепции, наличие аблативного лечения шейки матки в анамнезе. II. Результаты ВПЧ-типирования, генотипирования и определения вирусной нагрузки при заболеваниях шейки матки В последние годы в большинстве работ иностранных авторов активно обсуждается роль ДНК ВПЧ тестирования в цервикальных скрининговых программах. Считается, что молекулярно- биологические исследования с целью определения ВПЧ ВКР позволят не только выявить пациенток с высоким риском развития дисплазии и РШМ, но и сформулировать возможный прогноз развития цервикальной неоплазии у конкретной пациентки (Almog B. и соавт., 2003; Arbyn M. и соавт., 2008; Hellberg D. и соавт., 2005). По результатам исследования присутствие ВПЧ ВКР констатировано у 98,8% всех комплексно обследованных пациенток основной группы (таб. 1). У 3 (1,2%) пациенток с CIN III вышеперечисленных онкогенных типов ВПЧ выявлено не было. Пересмотр гистологических препаратов подтвердил наличие цервикальной интраэпителиальной неоплазии высокой степени тяжести. Результат ВПЧ-теста мог быть негативным вследствие погрешностей в заборе материала или возможным наличием у пациентки редкого типа ВПЧ, не идентифицированного используемой тест-системой. Кроме того, отсутствие ДНК ВПЧ у пациентки с CIN III может быть следствием интегрированной вирусной инфекции и утратой вирусом способности к репродукции. К актуальным вопросам патогенеза папилломаврусной инфекции относят изучение способности различных типов ВПЧ индуцировать предраковые заболевания и рак шейки матки. С этой целью мы проанализировали распространенность конкретных типов ВПЧ в структуре цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) и у пациенток с ВПЧ ассоциированным 12 цервицитом. Таблица 1 Результаты ВПЧ-тестирования у пациенток основной группы, n=250 Гистология Эндоцервикоз (ASCUS) CIN I (L-SIL) CIN II (H-SIL) CIN III (H-SIL) Всего Результаты Негативный 3 3 исследования показали, ВПЧ-тест Позитивный 50 60 65 72 247 что среди Всего 50 60 65 75 250 пациенток с интраэпителиальными поражениями низкой степени (CIN I) наиболее часто были обнаружены 16 тип ВПЧ – в 24 (40,0%) наблюдениях, 31 тип – 16 (26,7%) и 52 тип – в 12 (20,0%) случаях. В равном количестве случаев определялись 33 и 39 типы (15,0%), 18 тип был выявлен в 8 (13,3%) случаях, 51 тип – в 6 (10,0%) наблюдений. Другие онкогенные типы ВПЧ были найдены менее чем в 10,0% наблюдений: 56, 45, 58, 59 и 35 типы (8,3%, 8,3%, 6,7%, 5,0% и 3,3% соответственно) (рис. 1). 16 40 35 30 25 % 20 15 31 52 33 39 18 51 56 10 45 58 59 35 5 0 ТИПЫ ВПЧ Рис. 1. Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с СIN I. У пациенток с CIN II и CIN III по результатам генотипирования превалировал 16 тип ВПЧ – у 105 (75,0%) обследованных, 31 тип – 28 (20,0%), 33 тип – 25 (17,8%) и 18 тип. – 14 (10,0%) пациенток. Значительно реже выявлялись - ВПЧ 39 типа – 11 (7,9%), 52 типа – у 9 (6,4%), 51 тип у 8 (5,7%) и 13 58 типа у 7 (5,0%) обследованных. Другие онкогенные типы у пациенток с СIN II и СIN III, были обнаружены в гораздо меньшем числе наблюдений: 45 тип – 4,3%, 56 тип - у 4,3%, 35 тип – у 2,9%, 59 тип у 2,1% пациенток (рис.2) 80 16 70 60 50 % 40 30 31 52 20 33 39 18 10 51 56 45 58 59 35 0 Типы ВПЧ Рис. 2 Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с CIN II/СIN III. Далее проведен анализ распределения генотипов ВПЧ ВКР у 50 пациенток основной группы с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом (рис.3). Выявлено, что у данной категории пациенток преимущественно определяются 16 тип – 18 (36,0%) , 31 тип – 13 (26,0%) случаев и 52 тип 11 (22,0%) наблюдений. Реже определялись 33, 56, 39, 45 и 51 типы ВПЧ (14,0%, 10,0%, 8,0%, 8,0%, 6,0% соответственно). В очень небольшом числе наблюдений выявлены 18, 35, 58 и 59 типы (всего по 4,0%). 40 16 35 30 25 31 52 % 20 33 15 10 39 18 51 56 45 58 59 35 5 0 Типы ВПЧ Рис. 3 Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с ВПЧ-ассоциированным хроническим цервицитом. 14 Таким образом, как следует из представленных данных, по результатам генотипирования выявлено преобладание ВПЧ 16 типа среди других онкогенных вирусов как у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом, так и при интраэпителиальных неоплазиях. Частота его идентификации при тяжелых интраэпителиальных поражениях (CIN II и CINIII) составляет 75,0%, что более чем в 2 раза превышает данный показатель при поражениях низкой степени CIN I и выявляемостью у данного типа ВПЧ пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом. На втором месте по распространенности во всех группах был 31 тип ВПЧ. На третьем месте у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом и интраэпителиальными пораженями низкой степени был 52 тип (20,0% и 22,2%), соответственно, а у пациенток с СIN III и CIN III – 33 тип (таб. 2). Таблица 2 Распространенность онкогенных типов ВПЧ у пациенток с хроническим ВПЧ ассоиированным цервицитом и наличием интраэпителиального поражения Типы ВПЧ 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 Эндоцервикоз (n=50) Кол-во % 18 36,0 3 4,0 13 26,0 7 14,0 3 4,0 4 8,0 4 8,0 3 6,0 11 22,0 5 10,0 3 4,0 3 4,0 CIN I (n=60) Кол-во % 24 40,0 8 13,3 16 26,7 9 15,0 2 3,3 9 15,0 5 8,3 6 10,0 12 20,0 5 8,3 4 6,7 3 5,0 CIN II +CIN III (n=140) Кол-во % 105 75,0 14 10,0 28 20,0 25 17,8 4 2,9 11 7,9 6 4,3 8 5,7 9 6,4 6 4,3 7 5,0 3 2,1 Также отмечено, что, несмотря на наличие интраэпителиального поражения низкой степени тяжести, а также у пациенток с хроническими ВПЧассоциированными цервицитами, хоть и с редкой частотой, но были выявлены и все другие тестируемые типы ВПЧ, 15 что подчеркивает важность использования в скрининге заболеваний шейки матки тест системы для идентификации 12 типов ВПЧ ВКР. Отмечено, что по мере нарастания тяжести поражения распространенность ВПЧ 16 и 18 типов увеличивалась. Также выявлено, что распространенные типы ВПЧ ВКР (16, 18, 31, 33) встречались как в ассоциациях, так и изолировано, типы ВПЧ ВКР (35, 39, 56, 59) в основном участвовали в ассоциациях. При мультиинфекциях в ассоциациях участвовали от 2 до 8 онкогенных типов ВПЧ, при этом степень тяжести поражения не зависела от количества идентифицированных ВПЧ типов. Анализ степени вирусной нагрузки Одной из задач настоящего исследования явилось определение роли вирусной нагрузки в диагностике заболеваний шейки матки у пациенток основной группы, для решения которой была использована отечественная методика количественного определения ДНК ВПЧ на основе ПЦР в реальном времени, с помощью которой определяли пороговый уровень клинически значимого количества вируса - 10⁵ геномных эквивалентов ВПЧ. На сегодняшний день установлено, что число вирусных копий может отражать тяжесть и прогноз течения папилломавирусной инфекции. Вирусная нагрузка менее 10⁵ геномных эквивалентов ВПЧ ВКР в соскобе или 10³ геномных эквивалентов приходящихся на 10⁵ клеток человека считается клинически малозначимой, так как практически не встречается при тяжелой дисплазии и РШМ, а также ассоциирована с минимальным риском их развития. Напротив, количество вируса более 10⁵ геномных эквивалентов ВПЧ ВКР приходящихся на 10⁵ клеток человека при установленном факте латентного течения ВПЧинфекции (ВПЧ выявляется более 1 года) считается повышенной вирусной нагрузкой и ассоциировано с в высоким риском тяжелых интраэпителиальных поражений (Guo M. и соавт., 2007; Josefsson A.M. и соавт., 2000; Snijders J. и соавт., 2006). Анализ полученных результатов 16 позволил выявить клинически значимую (более 3*10⁵ клеток) вирусную нагрузку у 52 (37,1%) пациенток и высокую вирусную нагрузку у 88 (62,9%) пациенток с CIN II и CIN III. Незначимой (менее 3*10⁵ клеток) вирусной нагрузки у данной категории пациенток выявлено не было (таб. 3). У пациенток с CIN I в 51 (85,0%) случаев определялась низкая вирусная нагрузка, у 9 (15%) пациенток диагностирована высокая вирусная нагрузка. При анализе вирусной нагрузки у пациенток с хроническим ВПЧ ассоциированным цервицитом только в 4 (8,0%) случаев была диагностирована высокая вирусная нагрузка, у остальной части данной категории пациенток определялась низкая вирусная нагрузка. Таблица 3 Оценка вирусной нагрузки у пациенток основной группы Гистологический диагноз Уровень вирусной Эндоцервикоз CIN I CIN II + CIN III нагрузки N=50 n=65 n=140 абс. % абс. % абс. % Клинически значимая 0 0,0 0 0,0 52 37,1 (>3*105) 4 8,0 9 15,0 88 62,9 Высокая (3*105) 5 46 92,0 51 85,0 0 0,0 Низкая (<3*10 ) Таким образом, на основании проведенного исследования у пациенток с CIN II, III выявлены достоверно более высокие концентрации ДНК вируса по сравнению с ВПЧ позитивными пациентками с отсутствием интраэпителиального поражения и, имеющими поражения низкой степени тяжести (CIN I). III. Иммунореактивность пациенток с патологией шейки матки Для изучения патологией шейки особенностей иммунореактивности матки, проведено исследование у пациенток с 16 маркерных опухолеассоциированных аутоантител при помощи мультикомпонентных тестсистем с Исследование сорбированными проведено у опухолеассоциированными 250 пациенток с антигенами. интраэпителиальными поражениями и ВПЧ-ассоцированным цервицитом. В соответствии с оценкой сывороточного содержания аутоантител все 17 пациентки основной группы были выделены в 3 подгруппы: Нормореактивные – 55 (22,0%) пациенток с нормальным уровнем аутоантител в диапазоне от (-30 до 20 у.е); Гиперреактивные – 98 (39,2%) пациенток с повышенным уровнем исследуемых аутоантител от (+20 и выше у.е.); Гипореактивные – 97 (38,8%) пациенток с пониженным содержанием исследуемых аутоантител (от -30 и ниже у.е.). При анализе данных Эли-П теста выявлено, что среди пациенток с хроническим ВПЧ-ассоциированным преобладал нормальный тип цервицитом реагирования (n=50) у иммунной 40 (80,0%) системы, гиперреактивный тип был отмечен у 8 (16,0%) пациенток, у 2 (4,0%) обследованных диагностирован гипореактивный тип иммунной системы (таб. 4). При наличии интраэпителиального поражения выявлено, что среди пациенток с гистологически верифицированным диагнозом CIN I (n=60) у 35 (58,3%) обследованных наблюдается гиперреактивный тип иммунной системы, у 15 (25,0%) - уровень аутоантител соответствовал нормореактивному типу и у 10 (16,7%) диагностирован гипореактивный тип. Таблица 4 Оценка состояния аутоиммунитета у пациенток основной группы Тип аутоиммунитета Нормореактивный Гиперреактивный Гипореактивный Гистологический диагноз Эндоцервикоз CIN I CIN II (n=50) (n=60 (n=65) абс. % абс. % абс. % 40 80,0 15 25,0 0 0,0 8 16,0 35 58,3 55 84,6 2 4,0 10 16,7 10 15,4 CIN III (n=75) абс. % 0 0,0 0 0,0 75 100,0 У пациенток с наличием CIN II (n=65) в 84,6% наблюдений выявлен гиперреактивный тип иммунной системы, в 15,4% случаев соответствовали гипореактивному типу. У всех пациенток с CIN III (n=75) уровень сывороточных аутоантител соответствовал гипореактивному типу. Таким образом, результаты данного исследования показали важность 18 изучения состояния естественного аутоиммунитета у пациенток с патологией шейки, что позволило выявить группы больных, требующих дифференцированного подхода в комплексной терапии и прогноза лечения патологии шейки матки. IV. Патогенетическая терапия воспалительных заболеваний шейки матки и цервикальной интраэпителиальной неоплазии Патогенетическое лечение пациенток основной группы было комплексным и включало сочетанное использование хирургического метода, системной антибактериальной терапии и применение иммуномодулирующей терапии. У пациенток основной группы с наличием ASCUS (n=50) по данным цитологического исследования и L-SIL (n=65) электроэксцизия шейки матки выполнялась как одномоментное лечебно-диагностическое мероприятие, а также как повторное лечение вследствие неэффективности предшествующих деструктивных методов лечения. По стандартам ведения больных с патологией шейки матки, у пациенток с предварительным диагнозом H-SIL (n=140) перед выполнением электроэксцизии выполнялся кюретаж цервикального канала. В иностранных работах подчеркнуто, что у молодых нерожавших женщин объем удаляемой ткани должен быть, по возможности, минимальным (Ferenczy J. и соавт., 1996; Gold M. и соавт., 1996; Howe D.T. и соавт., 1991; Mitchel M.F. и соавт., 1998). Принимая во внимание эти рекомендации, в случае гистологической верификации CIN II-III шейки матки через 1,5-2 месяца 140 пациенткам основной группы проводилась конизация шейки матки. Осложнений при выполнении хирургического лечения не отмечено. Всем пациенткам основной группы (n=250) помимо хирургического лечения проведена иммуномодулирующая терапия. Пациенткам с хроническим ВПЧ-ассоциированным эндоцервицитом проведено лечение с помощью иммуномодулирующей терапии гроприносина (по 3 г. в сутки в течение 5 дней 19 до эксцизии и по 3 г. в сутки в течение 7 – 10 дней после лечения) в сочетании с использованием антибиотика широкого спектра действия (джозамицин по 500 мг. 3 раза вдень в течение 10 дней). Также комплексное лечение включало использование НПВС (ибупрофен по 0,2 г ректально виде свечей на ночь), назначаемых курсом сразу после процедуры электроэксцизии/конизации шейки матки. Пациенткам с CIN II и III проведена электроэсцизия шейки матки в сочетании с комплексным лечением включающее иммуномодулирующий препарат гроприносин. По данным повторного цитологического исследования выявлено, что у 38 (76,0%) пациенток с ВПЧ-ассоциированным эндоцервицитом через 3 месяца после комплексного лечения наблюдается нормализация результатов цитологического исследования (таб. 5). Таблица 5 Итоги цитологического исследования у пациенток с ВПЧассоциированным эндоцервицитом, n=50 Цитологический диагноз Сроки постлечебного наблюдения 3мес. 6 мес. 12 мес. 24 мес. Норма 38 45 47 47 ASCUS 12 5 3 3 По итогам ВПЧ-тестирования у пациенток с ВПЧ-ассоциированным эндоцервицитом выявлено, что у 80,0% обследованных наблюдается полная элиминация ВПЧ через 3 месяца после проведения комплексного лечения, при оценке через 12 месяцев только у 6,0% обследованных определялся положительный ВПЧ-тест. При сопоставлении эффекта от проведенного лечения с результатами исследования аутоиммунитета у пациенток с ВПЧассоциированным эндоцервицитом выявлено, что положительный постлечебный эффект наблюдается у всех пациенток с нормореактивным уровнем аутоантител, у 7(14,0%) обследованных с гиперреактивным уровнем аутоиммунитета. Отсутствие эффекта от лечения отмечено у 3 пациенток, из них у 2 (4,0%) с гипореактивным уровнем и 1 (2,0%) с гиперреактивным 20 уровнем аутоантител. Таким образом, выявлено, значительное преобладание пациенток с нормореактивным уровнем антител у больных с положительным постлечебным эффектом, по сравнению с пациентками с неэффективным лечением у которых в большинстве наблюдений определялся гипореактивный уровень аутоантител. Таблица 6 Итоги цитологического исследования у пациенток с интраэпителиальными неоплазиями через 3 мес. после лечения. Цитологический диагноз после лечения норма L-SIL H-SIL Гистологический диагноз до лечения CIN I (n=60) CIN II (n=65) CIN III (n=75) абс. 48 12 - % 80,0 20,0 0,0 абс. 46 10 9 % 70,8 15,4 13,8 абс. 30 45 % 0,0 40,0 60,0 При оценке эффективности терапии у пациенток с интраэпителиальными неоплазиями (n=200), положительный эффект от лечения выявлен только у 94 (47,0%) обследованных. При этом среди пациенток с CIN I нормальные результаты цитологического исследования выявлены у 48 (80,0%) пациенток, из них у всех пациенток отмечался отрицательный ВПЧ-тест (таб. 6). При сопоставлении полученных данных с исследованием аутоиммунитета больных с положительным эффектом от лечения при CIN I отмечено, что частота встречаемости нормореактивных и гиперреактивных пациенток среди них выше, чем гипореактивных и составляет 83,3% против 16,7% (2=24,7; p<0,001). Среди пациенток с CIN II в 29,3% наблюдений выявлены остаточное поражение, при этом при сопоставлении данных состояния аутоиммунитета у данной категории больных выявлялось значительное преобладание пациенток с гипореактивным уровнем аутоантител, по сравнению с показателями у пациенток с положительным эффектом от проводимой терапии, уровень аутоиммунитета у которых соотаветстввал гиперреактивному – 84,6% против 15,4% (2=28,9; p<0,001). При изучении результатов цитологического 21 исследования после лечения у пациенток с CIN III у всех пациенток подтверждено наличие остаточного поражения. При сопоставлении полученных данных с результатами исследования аутоиммунитета у всех пациенток с CIN III диагностирован гипореактивный уровень аутоантител. Таким образом, оценка постлечебного эффекта у пациенток в основной группе показала, что у 141(56,4%) наблюдений отмечается нормализация данных цитологического, кольпоскопического исследований и ВПЧ теста, у 109 (43,6%) пациенток лечение оказалось неэффективным. При сопоставлении данных состояния аутоиммунитета с эффективностью проведенной терапии у больных основной группы выявлено увеличение частоты пациенток с гипореактивным уровнем аутоантител, у которых лечение оказалось неэффективным, по сравнению с данными у пациенток с нормализацией клинико-лабораторных показателей (кольпоскопическое, цитологическое исследование, ВПЧ-тест) в ходе проведенного лечения, у которых по данным ЭЛИ-П-теста диагностирован нормо- или гипореактивный уровень аутоиммунитета. ВЫВОДЫ 1. Большинство пациенток (52,1%) с хроническим цервицитом представляют группу повышенного риска по развитию цервикальных интраэпителиальных неоплазий, вследствие выявления различных типов вируса папилломы человека и высокой вирусной нагрузки. Этой категории больных показано определение типа реагирования иммунной системы и при её гипофункции показано проведение иммуномодулирующей терапии. 2. Среди пациенток с хроническим ВПЧ-ассоциированным цервицитом у 60,0% преобладает нормореактивный тип состояния аутоиммунитета, а у 40,0% выявлен гипореактивный гипореактивным типом тип иммунной иммунной системы. системы Пациенткам показано с проведение иммуномодулирующей терапии с целью профилактики развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии. 22 3. У пациенток с цервикальными интраэпителиальными поражениями определяются различные типы реагирования иммунной системы. Так, при CIN I и CIN II превалирует гиперреактивный тип (58,3% и 84,6% соответственно) и при CIN III в 97,3% выявляется гипореактивный тип иммунных реакций. 4. Выявление вируса папилломы человека в количестве не превышающем порогового уровня (менее 3х105 клеток) при нормальном или гиперреактивном типе состояния аутоиммунитета свидетельствует об отсутствии вероятности тяжелого поражения шейки матки. 5. На основании проведения исследования аутоиммунитета оптимизирована тактика лечения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией различной степени тяжести. Так, при CIN I наряду с коррекцией микробиоценоза влагалища при гипореактивном типе иммунных реакций показано назначение иммуномодулирующей терапии, при CIN II, III после электрохирургической эксцизии иммуностимулирующей терапии, также что показано способствует назначение быстрой и полной эпителизации раневой поверхности, уменьшению вирусной нагрузки и является действенной профилактикой рака шейки матки. 6. Фактором риска неэффективности лечения CIN II, III является гипореактивный тип иммунной системы и высокая вирусная нагрузка, что требует изменения тактики хирургического лечения и проведения длительной иммуномодулирующей терапии (3-6 месяцев) после повторного морфологического исследования и консультации онколога. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Больные с хроническими рецидивирующими цервицитами относятся к группе риска по развитию цервикальной интраэпителиальной неоплазии. 2. При обследовании пациенток с патологическими процессами на шейке матки необходимо проводить комплексное 23 обследование, включающее мультипраймерное генотипирование всех онкогенных типов ВПЧ, определение уровня вирусной нагрузки и показателей иммунореактивности. 3. Пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией при выявлении высокой вирусной нагрузкой и гипореактивного типа реагирования иммунной системы необходимо относить к группе риска прогрессирования цервикальной интраэпителиальной неоплазии, что диктует необходимость соответствующей коррекции общепринятой тактики лечения данной категории больных. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Манухин И.Б., Тургунова Г.М., Пономарева Ю.Н. Факторы риска развития генитальных инфекций, ассоциированных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией // Мать и дитя: материалы XIII Всероссийского научного форума. М. 2012. С. 305-306. 2. Тургунова Г.М., Пономарева Ю.Н. Клиническая значимость цитологической диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки // Мать и дитя: материалы XIII Всероссийского научного форума. М. 2012. С. 374. 3. Тургунова Г.М., Пономарева Ю.Н., Аверина И.В. Диагностическре значение определения иммунореактивности при цервикальной интраэпителиальной неоплазии // Мать и дитя: материалы XIII Всероссийского научного форума. М. 2012. С. 375. 4. Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н., Тургунова Г.М. Роль ВПЧ–типирования, генотипирования и определения уровня вирусной нагрузки при цервикальных интраэпителиальных неоплазий // Московский хирургический журнал. 2013. №2. С. 49-50 24