Три новые мутации в гене порфобилиногендезаминазы
advertisement
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА ТРИ НОВЫЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ ПОРФОБИЛИНОГЕНДЕЗАМИНАЗЫ, ОБНАРУЖЕННЫЕ У БОЛЬНЫХ ОСТРОЙ ПЕРЕМЕЖАЮЩЕЙСЯ ПОРФИРИЕЙ ИЗ РОССИИ © 2001 г. В. Л. Сурин, А. В. Лукьяненко, И. В. Карпова, А. В. Мисюрин, Я. С. Пустовойт, А. В. Пивник Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва /25167; факс: (095) 212-42-52: e-mail: alukjan@blood.ru Поступила в редакцию 21.03.2000 г. Порфобилиногендезаминаза (ПБГД) является одним из ключевых ферментов системы биосинтеза гема. Нарушения в гене ПБГД приводят к аутосомному доминантно наследуемому заболеванию - острой перемежающейся порфирии (ОПП). Почти все носители ОПП, за редкими исключениями, гетерозиготны по дефектному гену. В настоящее время идентифицировано свыше 160 различных мутаций, приводящих к ОПП. Интенсивные исследования в этом направлении ведутся во многих странах мира. В России подобные работы до сих пор не проводились. Настоящее сообщение посвящено молекулярно-генетическому обследованию четырех российских больных с клиническим диагнозом ОПП. При помощи прямого секвенирования PCR-фрагментов гена или кДНК ПБГД мы обнаружили четыре мутации, три из которых ранее в мировой популяции не встречались. Этоделеция TAAG между позициями +2 и +5 интрона 7 (IVS7 2-5 del TAAG) и замена G-C в позиции -1 интрона 5 (IVS5 as -1 G-C), приводящие к нарушению сплайсинга, а также делеция -Т в инициирующем кодоне ATG экзона 3. Кроме того, у одной больной найдена известная делеция -СТ в кодоне 68. У двух больных обнаружена значительная диспропорция в экспрессии аллелей гена ПБГД с преобладанием в одном случае нормальной, а в другом - мутантной мРНК неэритроидного типа. Делеция в интроне 7 легко обнаруживается по образующимся непосредственно в ходе PCR гетеродуплексным фрагментам, обладающим аномальной электрофоретической подвижностью. Такой простой гетеродуплексный анализ позволил исключить носительство ОПП у сына и дочери пациентки, имеющей этот генетический дефект. Порфирии - это группа наследственных болезней, обусловленных дефицитом ферментов системы биосинтеза гема [1]. Наиболее распространенной и тяжелой разновидностью этого типа заболеваний считается острая перемежающаяся порфирия (ОПП), ассоциированная с пониженной активностью порфобилиногендезаминазы (ЕС 4.3.1.8) (ПБГД) [2, З], катализирующей третью стадию биосинтеза гема, во время которой происходит последовательное дезаминирование и конденсация четырех молекул порфобилиногена с образованием нестабильного линейного тетрапиррола 1-оксиметилбилана [4]. Ген ПБГД локализован на хромосоме 11 (1 lq24.1-24.2) [5], имеет размер 10024 пн и состоит из 15экзонов [6] (рис. 1). ПБГД существует в двух изоформах, одна из которых экспрессируется только в эритроидных клетках, а другая присутствует практически во всех клетках неэритроидного происхождения [7,8]. Изо-формы ПБГД кодируются двумя различными мРНК, транскрибирующимися с разных промо-торов, один из которых ("housekeeping") локализован в 5-области гена, а другой (эритроидный) -в интроне 1. Эритроидная мРНК ПБГД начинается с экзона 2 и имеет инициирующий кодон в экзоне 3, в то время как неэритроидная мРНК имеет инициирующий кодон в экзоне 1 и не содержит экзона 2, который удаляется из нее путем альтернативного сплайсинга (рис. 1). Почти все носители ОПП, за редкими исключениями [9, 10], гетерозиготны по дефектному гену ПБГД и большинство из них не имеет очевидных симптомов заболевания. ОПП не является эндемичным заболеванием и широко распространена во всем мире. Частота встречаемости пациентов с острыми проявлениями заболевания в развитых странах по разным оценкам составляет от 1 : 10000 до 1 : 50000 [II], в то время как асимптоматичные носители ОПП встречаются значительно чаще (в среднем 1 : 1000) [12, 13]. Болезнь проявляется в виде острых приступов, в основном неврологического характера, провоцируемых целым рядом лекарственных и гормональных препаратов, а также различными стрессовыми факторами, и нередко завершается летальным исходом, что чаще всего '' происходит из-за ошибочной или запоздалой диагностики и, как следствие, неправильного лечения пациента. До настоящего времени летальность при ОПП в среднем составляла 40-60% [14, 15]. Однако своевременная точная диагностика и адекватная терапия позволяют спасти подавляющее большинство больных. В период развернутых клинических проявлений, как правило, удается установить правильный диагноз ОПП по сочетанию характерных клинических признаков с увеличенным содержанием порфиринов и их предшественников в моче и сниженной активностью ПБГД в эритроцитах [1б]. Сложнее обстоит дело с асимптоматичными гетерозиготными носителями ОПП, для которых даже биохимическая диагностика, основанная на измерении активности ПБГД в эритроцитах, далеко не всегда дает однозначный ответ на вопрос о носительстве заболевания, поскольку диапазоны уровней активности ПБГД в норме и при ОПП частично перекрываются [17]. В таких случаях единственным способом установления точного диагноза является молекулярногенетическое исследование, позволяющее выявлять мутации в гене ПБГД. Для обнаружения и точной характеристики мутаций используют прямое секвенирование PCR-фраг-ментов гена или кДНК ПБГД [18, 19], содержащих все кодирующие последовательности и экзон-интронные сочленения, а также различные варианты электрофоретического конформационного анализа, такие как SSCP [20] или DGGE [21,22]... Генетические дефекты, приводящие к ОПП, чрезвычайно гетерогенны. К настоящему времени в гене ПБГД охарактеризовано свыше 160 мутаций (HGMD - Human Gene Mutation Database Cardiff [23-25]), выявленных в различных популяциях Европы, Америки и Азии. Обнаружение и характеристика мутации у больного ОПП дает возможность, .провести , молекулярно-генетическое обследование его родственников на предмет выявления бессимптомного носительства дефектного гена. Данная работа посвящена поиску мутаций в гене ПБГД у больных ОПП из России. Для отечественной популяции подобные исследования ранее не проводились. Рис. 1. Структура гена и двух форм мРНК ПБГД. Вертикальными стрелками обозначены промоторные области в гене ПБГД. Подстрочными линиями обозначены фрагменты гена и мРНК, амплифицированные в данной работе для поиска мутаций, с указанием их размеров в парах нуклеотидов. Горизонтальными стрелками указано расположение праймеров, использованных для RT-PCR. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для данного исследования служили пробы периферической крови от четырех больных с клиническим диагнозом ОПП, перенесших по крайней мере один острый приступ заболевания. Активность ПБГД в эритроцитах определяли согласно [26]. Геномную ДНК выделяли из 5 мл периферической крови после селективного лизиса эритроцитов по стандартной методике, включающей обработку протеиназой К (200 мкг/мл) и додецилсульфатом натрия (0.5%) в течение ночи при 37°С или 3-4 ч при 55°С с последующей фенольной экстракцией. Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартной смеси (25 мкл), содержавшей 20 мМ трис-HCl, рН 8.9, 15 мМ сульфат аммония, 170 мкг/мл БСА, по 200 мкМ каждого dNTP, 2 мМ хлористый магний, 0.1-0.5 мкг геномной ДНК, 15 пмоль каждого из праймеров и 2 ед. активности 7а<?-полимеразы ("Promega", USA). Структура праймеров и их сочетания приведены в табл., 1 и 2. Для всех четырех использованных PCR-систем амплификацию проводили в одинаковых условиях: 94°С - 1 мин,,60°С - 1 мин, 72°С -3 мин (30 циклов) в термоциклере "Perkui Elmer Cetus". Анализ полученных, PCR-продуктов осуществляли при помощи электрофореза, в 4-6%ном полиакриламидном геле с последующей визуализацией в УФ-свете после прокрашивания бромистым этидием. Фрагменты, подлежащие секвенированию, элюировали из геля высокосолевым буфером (20 мМ трис-HCl, рН 8.0, 1 М NaCI, 2 мМ ЭДТА) при 50°С в течение ночи и осаждали тремя объемами этанола с 3-кратным вымораживанием в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли из ядерных клеток периферической крови при помощи лизиса в гуанидинизотиоцианатном буфере с последующей фенольной экстракцией [27]. Реакцию обратной транскрипции (RT) проводили в течение 1 ч при 37°С в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 2-5 мкг тотальной РНК, буфер ("Promega"), смесь четырех dNTP (1 мМ для каждого). 0.2 мкг рассеянной затравки (гексамеры), 40 ед. активности РНКазина ("Promega") и 200 ед. активности обратной транскриптазы ("Promega"). PCR проводи ли в стандартных условиях, описанных выше, в две стадии ("nested" PCR): PCR I - с аликвотой RT-смеси (2 мкл) в качестве матрицы и парой внешних праймеров PPld/PP15r (табл. 1 и 2) в температурном режиме: 94 °С - 1 мин, 5б°С - 1 мин, 72°С - 3 мин, 30 циклов; PCR П - с аликвотой PCR I x смеси и парой внутренних праймеров PP3d/PP14r в режиме: 94°С - 1 мин, 62°С - 1 мин, 72°С - 3 мин, 30 циклов. Секвенирование PCR-фрагментов проводили по модифицированному методу Сэнгера [28] с использованием системы "Macrophore" (Sweden). Таблица 1. Структура и локализация праймеров, использованных в данной работе для амплификации и секвенирования фрагментов гена и кДНК ПБГД Праймер Первичная структура Локализация в гене ПБГД (NCBI Асс. № М95623) PP1d 5’-dCCCACACACAGCCTACTTTC-3’ 1070-1089 (экзон 1) PP2d 5’-dGTCCTACTATCGCCTCCCTC-3’ 4081-4099 (экзон 2) PP3-1 5’-dACACTAGAAACAGAGGGGAC-3’ 4270-4289 (интрон 2) PP3d 5’-dAGATGAGAGTGATTCGCGTG-3’ 4331-4350 (экзон 3) PP4-2 5’-dACGGGCTTTAGCTATAGGCA-3’ 4864-4845 (интрон 4) PP6-2 5’-dGCAAGAGACCTAGCATACTA-3’ 5403-5384 (интрон 6) PP7-1 5’-dCTCATACCCTTTCTCTTTGCC-3’ 5702-5722 (интрон 6) PP9-2 5’-dGCTGTCTCCGTCACTCTTCC-3’ 6376-6357 (интрон 9) PP10-1 5’-dGCAGAGGGAACCGCACGAGG-3’ 7409-7428 (интрон 9) PP10-2 5’-dAAGGAGATGCAGATGAGCTG-3’ 7630-7611 (интрон 10) PP11-1 5’-dGGAACTCCCATCTCACTGCC-3’ 8106-8125 (интрон 10) PP12-2 5’-dCAGCTCCCAAGTCCCCAGC-3’ 8628-8609 (интрон 12) PP14r 5’-dGACTCCAGACTCCTCCAGTC-3’ 9020-9001 (экзон 14) PP15r 5’-dAGTGATGCCTACCAACTGTG-3’ 9212-9393 (экзон 15) Таблица 2. Сочетания праймеров, использованные в данной работе, и размеры амплифицируемых фрагментов гена и кДНК ПБГД Пара праймеров Амплифицируемая область Размер PCR-фрагмента, пн PP3-1/PP6-2 4270-5403 [IVS2(-45) IVS6(+71)] 1135(A), включает экзоны 3-6 PP7-1/PP9-2 5702-6376 [IVS6(-41) IVS9(+51)] 675(B), включает экзоны 7-9 PP10-1/PP12-2 7409-8628 [IVS9(-63) IVS12(+47)] 1220(C), включает экзоны 10-12 PP11-1/PP15-r 8106-9212 [IVS10(-77) ex 15 (+45)] 1107(D), включает экзоны 11-14 PP1d/PP15r (PCR I) +31 – CD320 988, включает экзоны 1-14 и частично экзон 15 PP3d/PP14r (PCR II) CL17 – CD285 804, включает экзоны 4-13 и частично экзон 3 и14 Геномная ДНК кДНК ПБГД РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В 1999 г. в ГНЦ РАМН начата работа по изучению молекулярных основ и ДНК-диагностике ОПП в России. В настоящем исследовании мы провели анализ мутаций в гене ПБГД у четырех больных ОПП. Диагноз ОПП был поставлен на основе характерных клинических признаков, проявлявшихся во время острых приступов заболевания, которые все обследованные больные переносили неоднократно, а также по результатам определения концентраций общих порфиринов, порфобилиногена и 5-аминолевулиновой кислоты в моче, общих порфиринов в кале и активности ПБГД в эритроцитах (табл. 3). Поиск мутаций проводили при помощи прямого секвенирования амплифицированных с использованием методов PCR или RT-PCR фрагментов гена или мРНК ПБГД, содержащих основную часть кодирующих последовательностей и экзон-интронных сочленений. Для получения фрагментов гена ПБГД использовали 4 PCR-системы (рис. 1 и табл. 2), которые позволяют суммарно охватить область, включающую экзоны с 3 по 14, в которой сосредоточено свыше 90% известных к настоящему времени мутаций. Фрагмент В секвенировали с использованием концевых праймеров, а при секвенировании фрагментов А, С и D наряду с концевыми праймерами использовали также внутренние: РР4-2 - для А, РР10-2 и РР111 - для С, РР12-2 и РР14г - для D (табл. 1). Фрагмент кДНК ПБГД длиной 804 пн, содержащий полностью экзоны 4—13 и частично экзоны 3 и 14, амп-лифицировали при помощи системы "nested" RT-PCR. В качестве праймеров для реакции обратной транскрипции использовали рандомизированную смесь гексамеров. PCR проводили в два раунда с парами внешних и внутренних праймеров (рис. 1; табл. 1 и 2). Секвенирование полученного фрагмента кДНК проводили, используя концевые праймеры PP3d и РР14г. При помощи анализа PCR-фрагментов гена ПБГД мы обнаружили мутации у трех больных ОПП. Мутация у пациентки Пп16 была первоначально локализована в области экзонов 7-9, поскольку при PCR в системе РР7-1/РР9-2 кроме нормального фрагмента В (675 пн) наблюдалось образование еще двух аномальных фрагментов с меньшей электрофоретической подвижностью Рис. 2. а - PCR-анализ образцов ДНК от больных ОПП в системе РР7-1/РР9-2 (фрагмент В). Электрофорез в 6%-ном ПААГ. / - Пп1, 2 - Пп40, 3 - Пп47, 4 - Пп16; б - тестирование мутации (IVS7 2-5 del TAAG) в системе РР7-1/РР9-2 у детей больной Пп16. / - Пп19 (сын), 2 - Пп20 (дочь), 3 - Пп16. '••*'...•. •.•••-.-'Я (рис. 2,а). Такую картину дают обычно мутации, представляющие собой микроделеции или мик-роинсерции размером 3 пн и более, если они встречаются в гетерозиготном состоянии. Секвенирование нормального и аномальных PCR-фраг-ментов показало, что у больной Пп16 имеет место делеция четырех пар оснований в донорном сайте сплайсинга интрона 7 одного из аллелей гена ПБГД [IVS7 2-5 del TAAG] (рис. 3). PCR-фраг-менты с аномальной ЭФподвижностью представляют собой гетеродуплексы между нормальными и мутантными цепями: фрагмент с меньшей ЭФ-подвижностью (а) состоит из нормальной (+)-цепи и мутантной (-)-цепи, а фрагмент с большей ЭФ-подвижностью (о) - из нормальной (-)-цепи и мутантной (+)-цепи (см. рис. 2). Интересно отметить, что в области, затронутой данной микроделецией, имеется достаточно протяженный прямой повтор длиной 10 пн (рис. 3). Такие прямые повторы (обычно они имеют меньшие размеры) характерны для многих известных микроделеции в различных генах человека [29]. По всей вероятности, они каким-то образом задействованы в молекулярных механизмах возникновения подобных мутаций. Обнаруженная делеция в интроне 7 гена ПБГД должна приводить к нарушению сплайсинга. Чаще всего мутации в донорном сайге сплайсинга сопровождаются удалением из молекулы мРНК соседнего экзо-на [30], которым в данном случае является экзон 7. Таблица 3. Биохимические показатели порфиринового обмена у исследуемых больных ОПП № Общие ПБГ в моче АЛК в моче Общие Активность порфирины в мг/л (N<2) мг/л (N=0,1 – порфины в ПБГД в 4,5) кале, нмоль/г, эритроцитах, сухой массы мЕд/г Hb (N=3,2 мг/л (N<200) – 4.4) моче мкг/л (N<150) Пп1 1744,3 40,2 8,52 3046,7 1,53 Пп47 402,9 174,5 35,0 185,3 1,63 Пп40 616,2 109,0 30,2 259,9 1,7 Пп16 587,8 85,4 13,1 ------ 2,58 Пп19 (сын Пп16) ------ ------ ------ ------ 3,64 Пп20 (дочь Пп16) ------ ------ ------ ------ 2,75 Примечание. ПБГ - порфобилиноген, АЛК - Д-аминолевулиновая кислота, N - норма, мЕд - нмоль уропорфириногена/мин. Рис. 3. Мутации в гене ПБГД, обнаруженные в данной работе. Прописными буквами обозначены области делеций. Сплошной линией подчеркнут прямой повтор. Двойной линией подчеркнуты аномальные терминирующие кодоны. В некоторых случаях вместо поврежденного истинного сайта сплайсинга могут использоваться расположенные поблизости от него криптические сайты сплайсинга, вследствие чего в мРНК возникают делеций или инсерции [24, 31]. В нашем случае ближайшие криптические сайты сплайсинга расположены с З'-стороны от повреждённого сайта на расстоянии 15 и 34 пн. Однако анализ при помощи описанной выше системы RJ-PCR показал наличие в ядерных клетках крови больной Пп1б только нормальных молекул мРНК ПБГД. В результате RT-PCR амплифицировался единственный фрагмент, соответствующий по размеру нормальному (804 пн). Секвенирование этого фрагмента выявило наличие в нем правильного сочленения экзонов 7 и 8. Следует отметить, что данное наблюдение относится только к мРНК ПБГД, экспрессирующейся в неэритроидных клетках, поскольку в реакции RT-PCR на стадии PCR I мы использовали праймер PPId, локализованный в экзоне 1. который в эритроспецифической мРНК. как известно, отсутствует [8]. Подобное отсутствие экспрессии мутантных мРНК ПБГД или значительное ее снижение наблюдалось в ряде случаев и другими авторами [32. 33]. Используя факт стабильного образования в ходе PCR гетеродуплексов между нормальными и мутантными цепями, мы провели по этому критерию поиск выявленной делеционной мутации у сына и дочери больной Пп1б (Пп19 и Пп20). По результатам измерения активности ПБГД в эритроцитах (2.75 мЕд/г НЬ при норме > 4 мЕд/г Нb) у дочери больной предполагалось носительство ОПП (табл. 3). Однако ни в том, ни в другом случае гетеродуплексных фрагментов, свидетельствующих о присутствии мутации, мы не наблюдали (рис. 2,6) и таким образом, можно сделать однозначный вывод о том, что оба ребенка больной Пп1б не являются носителями ОПП. Полученный результат иллюстрирует известное положение о недостаточной надежности биохимической диагностики носительства ОПП в случае отсутствия очевидных симптомов заболевания. Как показали исследования, проведенные на большой выборке носителей ОПП (385 пациентов), диагноз, поставленный на основе результатов измерения активности ПБГД в эритроцитах, может быть ошибочным в 10-15% случаев [17]. Еще одна мутация микроделеционного типа обнаружена нами у пациента Пп1. Она представляет собой делецию центрального основания Т в инициирующем кодоне ATG (рис. 3), который локализован в экзоне 3 и соответствует эритроидной изоформе фермента. Для неэритроидной формы ПБГД, в которой данный триплет кодирует остаток Met. в точке делеций происходит сдвиг; рамки трансляции, приводящий к образованию терминирующего кодона через один триплет. Эта мутация безусловно делает нефункциональными обе изоформы мРНК ПБГД. Третий генетический дефект, приводящий к ОПП, найден при секвенировании фрагмента А (рис. 1, табл. 2) у больного Пп47. Он связан с нуклеотидной заменой G-C в акцепторном сайте сплайсинга интрона 5 (IVS5 -1 as G-C). Подавляющее большинство известных к настоящему времени мутаций в акцепторных сайтах сплайсинга гена ПБГД приводит к исключению из мРНК следующих за ними экзонов [30]. По всей вероятности, обнаруженное нами нарушение в акцепторном сайте сплайсинга интрона 5 должно приводить к устранению из мРНК ПБГД экзона 6. К сожалению, мы не имели в своем распоряжении образца РНК достаточно хорошего качества от данного больного (РНК выделяли из замороженных клеток) и нам не удалось проверить эту версию экспериментально. Существенно отметить, что ни одна из трех описанных выше мутаций ранее в мировой пoпyляции не встречалась. Еще одно нарушение в гене ПБГД, обнаруженное нами в данном исследовании у больной Пп40, - микроделеция -СТ в кодоне 68 экзона 5. Эта мутация известна в литературе, она была найдена ранее у одного из пациентов с ОПП во Франции [34]. Сдвиг рамки считывания, вызываей мый этой делецией, приводит к образованию на месте кодона 68 ТСТ (Ser) терминирующего кодо-на ТАА (рис. 3). Эта мутация была выявлена при помощи секвенирования фрагмента кДНК ПБГД, причем в этом опыте нормальной мРНК ПБГД мы не обнаружили, т.е. ситуация оказалась прямо противоположной той, с которой мы столкнулись при анализе экспрессии гена ПБГД у больной Пп16, где наблюдалась только нормальная мРНК. Столь значительная диспропорция в экспрессии двух аллелей гена ПБГД в ядерных клетках крови у больных ОПП с преобладанием в одном случае нормальной, а в другом - мутантной мРНК, по всей вероятности, свидетельствует о существовании достаточно сложной системы регуляции транскрипции данного гена (во всяком случае в неэритроидных клетках). Вполне возможно, что характер и степень этой диспропорции определяются не только (а может быть, даже и не столько) типом мутации, но и определенными различиями в экспрессии двух аллелей гена ПБГД даже в том случае, если оба они являются нормальными. Нет никаких сомнений в том, что детальное изучение особенностей экспрессии гена ПБГД в норме и при ОПП представляет значительный интерес и может существенно продвинуть наши знания о молекулярных механизмах патогенеза не только ОПП, но, возможно, и других доминантно наследуемых болезней человека. Использованная в нашей работе схема поиска мутаций в гене ПБГД, основанная на прямом секвенировании фрагментов гена и кДНК, оказалась достаточно эффективной, хотя она не является полной и требует определенной доработки. Мы предполагаем дополнить ее PCRсистемами для амплификации 5'- и З'-областей гена ПБГД (промоторная область, экзоны 1 и 15) и несколькими праймерами для секвенирования. Реальную эффективность данного подхода мы сможем оценить в процессе работы на расширенной выборке больных ОПП. Весьма привлекательно выглядят схемы анализа мутаций, использующие предварительную локализацию дефекта в определенном участке гена при помощи метода DGGE. Они обладают высокой эффективностью и успешно применяются для поиска мутаций у больных ОПП [21, 22], но имеют сложный и дорогостоящий праймерный дизайн. Итак, из четырех первых выявленных нами мутаций в гене ПБГД у российских больных ОПП три ранее в мировой популяции не встречались. Этот факт лишний раз подтверждает чрезвычайно большое разнообразие генетических дефектов, приводящих к ОПП. Аномально высокие частоты встречаемости отдельных мутаций в некоторых популяциях, таких как W198X в Швеции, R116W в Голландии и G111R в Аргентине, объясняются "эффектом основателя" [25, 35, 36]. В настоящее время известны, по крайней мере, 167 различных мутаций в гене ПБГД (HGMD [23-25]) и почти половину из них можно назвать уникальными, поскольку они встретились всего один раз. “ Наиболее интенсивно изучаются молекулярные основы ОПП в Финляндии [37], Швеции [38], Франции [34], Англии [19], Испании [23], Аргентине [25]. Фонд существующих мутаций в гене ПБГД обновляется достаточно медленно. Частота их возникновения de novo составляет около 3% [39], что вполне соответствует небольшому размеру гена. При исследовании каждой новой популяции выявляются как уже известные мутации, так и не встречавшиеся ранее, причем доля последних всегда бывает весьма значительной. Судя по первым результатам нашей работы, российская популяция не станет исключением из этого правила. Частоты встречаемости различных типов мутаций в популяциях с большим числом об- следованных больных ОПП приблизительно одинаковы и в целом соответствуют их доле в общем списке дефектов гена ПБГД (табл. 4). Чаще всего встречаются одиночные нуклеотидные замены в кодирующих областях (миссенс- или нонсенс-мутации), далее следуют замены, приводящие к нарушению сплайсинга, микроделеции и микроин-серции, очень редки большие делеции или инсер-ции и практически отсутствуют дефекты в регуляторных областях гена. Интересно отметить, что около 50% известных мутаций сосредоточены в экзонах 10, 12 и 14. Возможно, это объясняется, с одной стороны, несколько большими размерами указанных экзонов по сравнению с остальными, а с другой - тем, что они кодируют функционально важные участки ПБГД. Тот факт, что из четырех выявленных нами мутаций три относятся к микроделециям и ни одна не затрагивает область экзонов 10, 12 и 14, пока не дает серьезных оснований предполагать, что распределение мутаций по типам и областям гена ПБГД у российских больных ОПП будет принципиально отличаться от такового в других популяциях, поскольку изученная в данной работе выборка пациентов была хотя и случайной, но слишком маленькой. Реальный спектр мутаций в гене ПБГД, характерный для российской популяции, будет определен в ходе исследования, которое мы проводим в настоящее время на расширенной выборке из нескольких десятков больных с клиническим диагнозом ОПП. Таблица 4. Частоты встречаемости различных типов мутаций в гене ПБГД (HGMD [23-25]) . Тип мутации Число мутаций Частота встречаемости,% Миссенс/нонсенс 77 46.1 Мутации сплайсинга 34 20.3 Микроделеции 32 19.2 Микроинсерции 20 12.0 Микроделеции/инсерции 1 0.6 Крупные делеции 1 0.6 Крупные инсерции 2 1.2 Всего 167 100.0 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Hindmarsh J.T. The porphyrias: recent advances // Clin. Chem. 1986. V. 32. P. 1255-1263. 2. ИдельсонЛ.И. Патогенез, клиника и лечение пор-фирий//Тер. арх. 1987. Т. 59. № 6. С. 143-150. 3. Kappas A., Sassa S., Galbraith R.A., Nordmann Y. The porphyrias // The metabolic basis of inherited diseases / Eds Scriver C.R. et al. 7th ed. N.Y.: McGraw Hill, 1995 V. 2. P.2103-2159. 4. Shoolingin-Jordan P.M. Structure and mechanism of enzymes involved in the assembly of the tetraphyrrole macrocycle//Biochem. Soc. Trans. 1998. V. 26. P. 326-336. 5. Namba H., Narahara К., Yokoyama Y. et al. Assignment of human porphobilinogen deaminase to 1 lq24.1q24.2 by in situ hybridization and gene dosage studies // Cyto-genet. Cell. Genet. 1991. V. 57. P. 105108. ,& 6. Yoo H.W., Warner C.A., Chen C.H. et al. Hydroxyme-thylbilane synthase: Complete genomic sequence and am-plifiable polymorphisms in the human gene // Genomics. 1993. V. 15. P. 21-29. 7. Grandchamp В., de Verneuil H., Beaumont C. et al. Tissue-specific expression of porphobilinogen deaminase. Two izoenzymes from a single gene // Eur. J. Biochem. 1987. V.162.P.105-110. 8. Chretien S., Duhart A., Beaupain D et al. Alternative transcription and splicing of the human porphobilinogen deaminase gene result either in tissue-specific or in housekeeping expression // Proc. NatI Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6-9. .9. Beukeveld GJJ., Wolthers B.G., Nordmann Y. et al. A retrospective study of a patient with homozygous form of acute intermittent porphyria // J. Inher. Metab. Dis. 1990. V. 13. P. 673-683. 10. Elder G.H. Hepatic porphyrias in children // J. Inher. Metab. Dis. 1997. V. 20. P. 237-246. 11. Schreiber W.E. A molecular view of the neurologic porphyrias // Clin. Lab. Med. 1997. V. 17. P. 73-83. 12. Mustajoki P., Kauppinen R., Lannfelt L. et al. Frequency of low erythrocyte porphobilinogen deaminase activity in Finland//;. Intern. Med. 1992. V. 231. P. 389-395. 13. Nordmann Y., Puy H., Da Silva V. et al. Acute intermittent porphyria: prevalence of mutations in the porphobilinogen deaminase gene in blood donors in France // J. Intern. Med. 1997. V. 242. P. 213-217. 14. Буторов А.В., Борисов Б.А., Мариос Ц. Анестезия и интенсивная терапия у больных с острой перемежающейся порфирией // Вести, интенсивной терапии, 1995. № 2. С. 49-52. 15. Jeans J.B., Savik K., Gross C.R. et al. Mortality in patients with acute intermittent porphyria requiring hospi-talization: A United States case series // Amer. J. Med. Genet. 1996. V. 65. P. 269-273. 16. Карпова И.В., Сурин ВЛ., Тагиев А.Ф., Пив-никА.В. Лабораторная диагностика острой перемежающейся порфирии // Пробл. гематол. 1998. №1.043-^8. 17. Gross U., Jacob К., Frank M., Doss M.O. Haem precursors and porphobilinogen deaminase in erythrocytes and lymphocytes of patients with acute intermittent porphyria//Cell. Mol. Biol. 1997. V. 43. P. 29-35. 18. Astrin K.H., Desnick R.J. Molecular basis of acute intermittent porphyria: Mutations and polymorphisms in the human hydroxymethylbilane synthase gene // Hum. Mu-tat. 1994. V. 4. P. 243-253. 19. Whatley S.D., Woolf J.R., Elder G.H. Comparison of complementary and genomic DNA sequencing for the detection of mutations in the HMBS gene in British patients with acute intermittent porphyria: identification of 25 novel mutations//Hum. Genet. 1999. V. 104. P. 505-510. 20. Schreiber W.E., Fong F., JamaniA. Molecular diagnosis of acute intermittent porphyria by analysis of DNA extracted from hair roots // Clin. Chem. 1994. V. 40. P. 1744-1748. 21. Nissen H., Petersen N.E., Mustajoki S. et al. Diagnostic strategy, genetic diagnosis and identification of new mutations in intermittent porphyria by denaturing gradient gel electrophoresis // Hum. Mutat. 1997. V. 9. P. 122-130. 22. Puy H., Aquaron R., Lamoril J. et al. Acute intermittent porphyria: rapid molecular diagnosis // Cell. Mol. Biol 1997, V. 43. P. 37-45. 23. Sniis С., Lopez-Echaniz /., Scfariy-Gidncilu 0. ci al. Identincation and expression of mutations in the hydroxymelhylbilane synlhasc gene causing acute intermittent porphyria (AIP)// Mol. Mcd. 1999. V. 5. P. 664-671. 24. De Siervi A., Mendez M., Parera V.E. el al. Acute intcr-millcnt porphyria: characterization of two novel mutations in the porphobilinogen dcaminase gene, one amino acid deletion (453-455 del AGC) and one splicing acceptor site mutation (1VS8 -I G > T) // Hum. Mulut. 1999. V. 14. P. 355. 25. De Siervi A..RosseftiM.V., Parera V.E. elal. Identification and characterization of hydroxymethylbilane synthase mutations causing acute intermittent porphyrin: evidence for an ancestral founder of the common G 111R mutation //Am. J. Med. Genel. 1999. V. 86. P. 366375. 26. Mognussen C.R., Levine J.B., DohcilyJ.M. cl al A red cell enzyme method for the diagnosis of acute intermittent porphyria // Blood. 1974. V. 44. P. 857-868. 27. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatc-phcnolchio-rofonm extraction // Anal. Biochem. 1987. V. 162. 28. Tagiev A.F., Surin V.L., Gol'tsov A.A. el al. The spectrum beta-thalassemia mutations in Azerbaijan republic // Hum. Mutat. 1993. V. 2. P. 152-154. 29. Krawczak M., Cooper D.N. Gene deletions causing human genetic disease: Mechanism of mulagenesis and the role of the local DNA sequence environment // Hum. Genet. 1991. V. 86. P. 425-441. 3U. Grandchamp В., Puy H., Lamoril J. el al. Review; Molecular pathogencsis of hepatic acute porphyrias // J. Gastroenterol. Hcpatol. 1996. V. 11. P. 1046-1052. 31. Puy H„ Gross U., Deyhach J.C. et al. Exon 1 donor splice site mutations in the porphobilinogen deaminasc gene in the nonerylhrokl variant form of acute intermitent porphyria//Hum. Genet. 1998. V. 103. P. 570-575. 32 Miisiajoki S.. Качрртсп R., Mustajoki P. et al. Steady-stale transcript levels of the porphobilinogen deaminase gene in patients with acute intermittent porphyria //Genome Res, 1997. V. 7. P. 1054-1060. 33. Mustajoki S., Ahoh H., Musiajnki P., Kauppincn R. Insertion ofAlu clement responsible for acute intermittent porphyria // Hum. Mulat. 1999. V. 13. P. 431-^38. 34. РчуН., Deyhach J.,LanwrilJ. el at. Molecular epidemiology and diagnosis of PBG deaminase gene defects in acute intermittent porphyria // Amer. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. P. 1373-1383. 35. Lee J.S., Anveil M. Identification of the most common mutation within the porphobilinogen denminasc gene in Swedish patients with acute intermittent porphyria // Proc. NatI Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 10912-10915. 36. GuX.K.,deRooij F., Lee J.S. High prevalence of a point mutation in the porphobilinogen deaminase gene in Dutch patients with acute intermittent porphyria // Hum. Genet. 1993. V. 91. P.128-130. 37. Kauppinen R., Mustajoki S., Pihiaja H. el al. Acute intermittent porphyria in Finland: 19 mutations in the porphobilinogen deaminase gene//Hum. Mol. Genet. 1995. V. 27. P.215-222. 38. Lundin С., Lee J., Thunell S., Anvert M. Genetic investigation of the porphobilinogen deaminase gene in Swedish acute intermittent porphyria families // Hum. Genet. 1997. V. 100. P. 63-66. i 39. Whatley S.D., Roberts A.G., Elder G.H. De nova mutation and sporadic presentation of acute intermittent porphyria//Lancet. 1995. V, 346. P. 1007-1008. Three Novel Mutations in Porphobinnogen Deaminase Gene Identified ^K in Russian Patients with Acute Intermittent Porphyria V. L. Surin, A. V. Luk'yanenko, I. V. Karpova, A. V. Misyurin, Ya.S. Pustovoit, and A. V. Pivnik HematohglcalResearch Center of Medicine. Russian Academy of Medical Science, Moscow ] 25167 Russia • fax: (095) 212-42-52; e-mail: alukjan@btood.ru Porphobilinogen deaminase (PBGD) is a key enzyme of the heme biosynthetic pathway. Defects in the PBGD gene lead to an autosomal dominant disease, acute intermittent porphyria (AIP). Almost all AIP patients with rare exceptions are hetcrozygoUs for the defective gene. To date, at least 160 different mutations causing AIP are indetified. Extensive investigations along this line are conducted in many countries of the world. In Russia these studies had not been hitherto performed. Here we report the results of molecular genetic examination of four Russian patients with AIP diagnosed from clinical .symptoms. By direct sequencing of the PBGD gene or he corresponding cDNA, we have detected four mutations, three of which were not previously encountered in the world population. These are TAAG deletion in intron 7 between position +2 and +5 (IVS7 2-5 delTAAG); T deletion in the initiation codon ATG of exon 3, and the G for С replacement at position -1 of intron 5 (IVS5 as –1 G:C),which dlsrupts splicing. In addition, in one female patient, a known deletion СT in codon 68 was revealed. In two patients? Expression of PBGD gene alleles was significantly disproportional, so that normal mRNA prevailed in one case and mRNA of nonerythroid type in the other. Deletion in intron 7 was easily detectable due to the formation of a heteroduplex fragment with abnormal electrophoretic mobility directly in PCR. This simple heteroduplex analysis allowed us to exclude AIP carriage in son and daughter of a famele patient with the genetic defect.
