Текст автореферата - ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева

На правах рукописи
ЦАУР
Григорий Анатольевич
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОНИТОРИНГ
МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ В ЛЕЧЕНИИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ У
ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
14.01.21 – Гематология и переливание крови
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва 2015
2
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, Государственном автономном
учреждении здравоохранения Свердловской области «Центр специализированных видов
медицинской помощи «Институт медицинских клеточных технологий»
Научные консультанты:
Доктор медицинских наук, профессор
Румянцев Сергей Александрович
заместитель директора по научной и учебной работу ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия
Рогачева» Минздрава России
Доктор медицинских наук, профессор
Цвиренко Сергей Васильевич
заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики и бактериологии ГБОУ ВПО
УГМУ Минздрава России
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Голенков Анатолий Константинович
руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского
областного научно-исследовательского клинического института им. Н.Ф.Владимирского.
доктор медицинских наук, профессор
Маякова Светлана Александровна
главный научный сотрудник НИИ детской онкологии и гематологии ФГБНУ
«РОНЦ
им.
Н.Н.Блохина» РАМН
доктор медицинских наук, профессор
Луговская Светлана Алексеевна
кафедра клинической лабораторной диагностики ФГБОУ РМАПО Минздрава России
Ведущая организация:
Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой ФГБОУ ВПО СанктПетербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова Минздрава
России
Защита состоится «___»_________ 2015 года в ______ часов на заседании диссертационного
совета Д 208.050.01 Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный
научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия
Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГСП-7 117997, г. Москва,
ул. Саморы Машела, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им.
Дмитрия Рогачева» Минздрава Российской Федерации www.fnkc.ru
Автореферат разослан «
» …. 2015 года
Ученый секретарь диссертационного совета:
Доктор медицинских наук, профессор
В.М. Чернов
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Среди всех онкологических заболеваний у детей первого года жизни острые лейкозы
(ОЛ) находятся на втором месте по частоте встречаемости: заболеваемость в разных странах
мира колеблется в пределах 30,0-32,0 на 1 млн. детского населения соответствующего
возраста (Савва Н.Н., 2008; Gurney J., 1999; Coebergh J., 2006). Острый лимфобластный
лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни составляет от 2,5 до 5% всех случаев ОЛЛ у детей
(Pui C.-H., 1995; Greaves M., 1996; Reaman G. 1985: Dördelmann M., 1999). На долю острого
миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей первого года жизни приходится 7-13% от общего числа
случаев ОМЛ у детей (Pui C.-H., 1988; Stevens R.,1998; Webb D,. 2001; Creutzig U., 2012;
Pession A., 2013).
В настоящее время в Российской Федерации (РФ) достигнуты значительные успехи в
лечении ОЛЛ и ОМЛ у детей старше 1 года, неуклонно повышается бессобытийная (БСВ) и
общая выживаемость (ОВ) пациентов, снижается частота развития рецидивов (Самочатова
Е.В., 2007, Шнейдер М.М., 2008, Румянцева Ю.В., 2010, Карачунский А.И., 2011). В то же
время,
результаты
терапии
ОЛЛ
у
детей
первого
года
жизни
остаются
неудовлетворительными: БСВ редко превышает 45%, а основной причиной неудачи терапии
являются рецидивы (Шориков Е.В., 2005; Ferster A., 1994; Frankel L., 1997; Silverman L.,
1997; Reaman G., 1999; Dördelmann M., 1999; Chessells J., 2002; Hilden J., 2006; Biondi A.,
2006; Pieters R., 2007; Tomizawa D., 2007). На сегодняшний день наиболее эффективным
способом прогнозировать развитие рецидивов считается определение минимальной
остаточной болезни (МОБ). Для этой цели применяются такие высокочувствительные
методы клинической лабораторной диагностики как многоцветная проточная цитометрия и
различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако биологические
особенности ОЛ у детей первого года жизни требуют создания специальных методов
выявления МОБ с последующим сравнительным анализом полученных результатов между
собой и оценкой вероятности развития рецидивов.
Актуальность создания системы мониторинга МОБ при ОЛ у детей этой возрастной
группы обусловлена еще и тем, что в РФ Л.Г. Фечиной разработан оригинальный
отечественный протокол MLL-Baby для терапии ОЛЛ у детей первого года жизни (Fechina
L., 2007), который предусматривает многократное определение МОБ. Это, в свою очередь,
обуславливает необходимость установления роли наличия и величины МОБ в различные
точки наблюдения (ТН) для прогнозирования исходов терапии.
Определение МОБ невозможно без всесторонней оценки инициальных характеристик
лейкозных клеток, включая наличие и тип перестройки гена MLL (myeloid-lymphoid leukemia,
mixed-lineage leukemia), расположенного в хромосомном районе 11q23 (Ziemin-van der Poel
4
S., 1991; Cimino G., 1991; Tkachuk D., 1992), других молекулярно-генетических и
цитогенетических характеристик ОЛ,
использованием
стандартного
а также иммунофенотипа опухолевых бластов с
цитогенетического
исследования,
флуоресцентной
гибридизации in situ (FISH), ПЦР, проточной цитометрии. Более того, считается, что целый
ряд объективных факторов затрудняют диагностику ОЛ у детей первого года жизни:
криптические варианты транслокаций, большое разнообразие перестроек 11q23/MLL,
существование
различных
типов химерных
транскриптов
с
участием
гена
MLL,
нестабильность иммунофенотипа опухолевых бластов, однако изучению этих аспектов
посвящены лишь единичные работы (Borkhardt A., 2002; Pieters R., 2003; Reaman G.,2003;
Meyer C., 2009).
Показано, что клинические особенности ОЛ и чувствительность к терапии зависят не
только от наличия перестройки гена MLL, но и от его гена-партнера (Pui C-H., 2002;
Balgobind B., 2009), которых на сегодняшний день известно 79 (Meyer C., 2013). Наиболее
частыми партнерами MLL являются гены AF4, MLLT1 MLLT3, MLLT10, MLLT4, ELL, на долю
которых суммарно приходится около 85% всех случаев MLL-позитивных ОЛ, как у детей,
так и у взрослых (Meyer C., 2009). В то же время, за счет оставшихся 15% и достигается
большое разнообразие химерных генов с участием MLL, и именно их биологические
особенности и клинические характеристики ОЛ, ассоциированных с редкими перестройками
гена MLL, являются наименее изученными. Традиционно считается, что наиболее
неблагоприятной при ОЛЛ является транслокация t(4;11)/MLL-AF4, в то время как прогноз
для пациентов с t(11;19)/MLL-MLLT1 и t(9;11)/MLL-MLLT3 несколько лучше (Pui C-H., 2002).
С другой стороны, в рамках проспективного исследования Interfant-99 пациенты с любой из
вышеперечисленных транслокаций имели сходную величину БСВ (Pieters R., 2007).
Наиболее
неблагоприятными
транслокациями
при
ОМЛ
у
детей
считаются
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 и t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4 (Balgobind B., 2009).
Ранее изучение ОЛ у детей первого года жизни часто сводилось к исследованию
характеристик пациентов, имеющих перестройки 11q23/MLL, и не уделялось должного
внимания группе пациентов без данных перестроек. Вместе с тем, помимо перестроек
11q23/MLL в исследуемой возрастной группе могут выявляться и другие цитогенетические и
молекулярно-генетические аберрации, среди которых особый интерес представляет
транслокация t(7;12)(q36;p13) (Tosi S., 1998), которая специфична для ОМЛ у детей первого
года жизни, ассоциирована с неблагоприятным прогнозом заболевания и во многих случаях
является криптической.
Таким образом, оценка МОБ, базирующаяся на основе анализа инициальных
цитогенетических,
молекулярно-генетических
и
иммунофенотипических
свойств
опухолевых бластов при ОЛ у детей первого года жизни является актуальным вопросом
5
детской гематологии/онкологии.
Цель исследования
Разработать и внедрить в практику систему определения минимальной остаточной
болезни для мониторинга лечения острых лейкозов у детей первого года жизни на основе
инициальных молекулярно-генетических и иммунологических характеристик бластных
клеток.
Задачи исследования
1. Изучить кариотип опухолевых бластов, а также спектр и частоту
перестроек
11q23/MLL при ОЛ у детей первого года жизни.
2. Найти взаимосвязь между возрастом и выявлением перестроек 11q23/MLL при
ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни.
3. Установить взаимосвязь между структурой химерных генов с участием MLL и
клинико-лабораторными характеристиками ОЛ у детей первого года жизни.
4. Разработать методический подход для выявления транслокации t(7;12)(q36;p13).
5. Дать характеристику иммунофенотипу опухолевых бластов при ОЛЛ и ОМЛ у
детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек 11q23/MLL.
6. Оценить возможность использования антигена NG2 для мониторинга МОБ при
ОЛЛ из B-линейных предшественников.
7. Провести сравнительный анализ двух методов определения МОБ при ОЛЛ у детей
первого года жизни - проточной цитометрии и обратно-транскриптазной полимеразной
цепной реакции с детекцией химерных транскриптов с участием MLL.
8. Оценить связь МОБ в костном мозге с бессобытийной выживаемостью и развитием
рецидивов при терапии ОЛЛ у детей первого года жизни по протоколу MLL-Baby.
9. Оценить роль использования периферической крови для определения МОБ у детей
первого года жизни с ОЛЛ, получающих лечение по протоколу MLL-Baby.
Научная новизна исследования
Впервые в РФ в группе пациентов первого года жизни с ОЛ определены частота и
спектр перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ и ОМЛ, а также описаны различные механизмы
формирования химерных генов с участием MLL, включая реципрокные транслокации
(73,6%), транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%).
Были выявлены закономерности в локализации точек разрыва в ДНК гена MLL в
зависимости от типа ОЛ у детей первого года жизни. При ОЛЛ наиболее частой зоной
разрыва в ДНК гена MLL является 11-й интрон, а при ОМЛ — 9-й интрон.
Впервые в нашей стране были описаны различные типы химерных транскриптов в
6
зависимости от зоны слияния в MLL и генах-партнерах. У пациентов с ОЛЛ выявлено 9
транскриптных вариантов химерного гена MLL-AF4, 5 транскриптных вариантов MLLMLLT3, 3 — MLL-MLLT1, 2 — MLL-EPS15. Среди различных транскриптов MLL-AF4
наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 11-го экзона гена MLL и 4-го экзона AF4
(e11e4) – в 8 случаях из 26 (30,8%). Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLLMLLT3 преобладал e11e6. Из 14 пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 7 имели
вариант с местами слияния в 11-м экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLT1, 6 — вариант е10е2 и
двое — е9е2. При ОМЛ оценка структуры химерных транскриптов выявила по 4
транскриптных варианта MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10 и 1 — MLL-MLLT11. У пациентов с
MLL-MLLT3 преобладал вариант e11e6, также обнаруженный в 4 из 7 случаев. Среди
пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных транскриптов
е8е15, е9е9, e9е10 и 1 случай e9e4. Среди генов-партнеров MLL наиболее разнообразна была
локализация зон слияния в генах AF4 (при ОЛЛ) и MLLT10 (при ОМЛ)
Впервые определена частота встречаемости перестроек гена MLL с одновременной
делецией 3’-конца гена MLL при ОЛ у детей первого года жизни, которая составляет 7,6%.
Охарактеризован иммунофенотип опухолевых бластов у детей первого года жизни с
ОЛЛ и ОМЛ, который ассоциирован с наличием перестроек 11q23/MLL.
Впервые установлена негативная прогностическая роль сохранения МОБ в костном
мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан алгоритм диагностики и определения МОБ, позволяющий выявлять
любую перестройку 11q23/MLL, а также проводить оценку МОБ при острых лейкозах у
детей первого года жизни.
Показано, что длительное сохранение МОБ в костном мозге при ОЛЛ у детей первого
года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby, связано с высокой вероятностью
развития рецидива.
Детально охарактеризованы частые и редкие перестройки 11q23/MLL. При ОЛЛ
установлена взаимосвязь возраста пациентов с выявлением перестроек 11q23/MLL.
Разработана комбинация праймеров и флуоресцентных зондов для выявления
химерных транскриптов MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-MYO1F методом
ПЦР в режиме реального времени.
Показана возможность выявления транслокации t(7;12)(q36;p13) методом FISH с
использованием трехцветного флуоресцентного зонда.
Описаны аберрации иммунофенотипа, выявление которых дает возможность
предположить наличие перестроек 11q23/MLL и требует их верификации с использованием
7
всех доступных молекулярно-генетических методов.
Использование предложенного алгоритма мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого
года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластов дает возможность
надежно выявлять перестройки 11q23/MLL, в том числе редкие, ранее неописанные, что
позволяет
развивать
знания
о
биологии
опухолевого
процесса
и,
тем
самым,
совершенствовать терапию.
Эффективность разработанного диагностического метода у детей первого года жизни
позволяет считать перспективным его использование для улучшения результатов лечения
ОЛ у пациентов различных возрастных групп.
Положения, выносимые на защиту
1. С целью поиска маркеров для последующего мониторинга МОБ необходимо
использование комплекса методов клинической лабораторной диагностики, включая
проточную цитометрию, стандартное цитогенетическое исследование, флуоресцентную
гибридизацию in situ и различные варианты полимеразной цепной реакции.
2. Предложенный комплексный подход к определению МОБ показал высокую
качественную сопоставимость между результатами проточной цитометрии и обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции.
3. Использование данных определения МОБ позволило прогнозировать результаты
лечения детей первого года жизни с ОЛЛ по протоколу MLL-Baby.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности полученных результатов основана на достаточном количестве
выполненных
исследований
с
использованием
лабораторной
диагностики,
применении
современных
коммерчески
методов
доступных
клинической
калибраторов
и
контрольных материалов, участии в международных системах контроля качества, а также на
использовании адекватных сформулированным задачам методов статистической обработки
данных с применением специального программного обеспечения.
Материалы
работы
были
представлены
на
V-IX
Российских
симпозиумах
«Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва,
2007, 2009, 2011, 2013, 2015), Совещании мультицентровой группы «Москва-Берлин» по
изучению острых лейкозов у детей (Москва, 2007), Х Международной научно-практической
конференции «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 2007), 4 м
съезде Детских онкологов России (Москва, 2008), I Всероссийском конгрессе «Генетика
опухолей кроветворной системы» (Ростов-на-Дону, 2010), Российском конгрессе с
международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и
8
реальное» (Санкт-Петербург, 2010), Национальных днях Лабораторной медицины России
(Москва, 2011), Научной конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011),
XV и XVII Российских онкологических конгрессах, (Москва, 2011, 2013), Всероссийской
научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и
службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), I и II Конгрессах гематологов России (Москва, 2012,
2014), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и
иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург,
2013), IV Межрегиональном совещании Национального общества детских гематологов и
онкологов (Москва,2014), 12-19м конгрессах Европейской гематологической ассоциации
(Вена, 2007; Берлин, 2008; Копенгаген, 2009; Барселона, 2010; Лондон, 2011; Амстердам,
2012; Стокгольм, 2013; Милан, 2014), 49-56й ежегодных конференциях Американского
общества гематологов (Атланта, 2007; Сан-Франциско, 2008; Новый Орлеан, 2009; Орландо,
2010; Сан Диего, 2011; Атланта, 2012; Новый Орлеан, 2013, Сан-Франциско, 2014), 39-42м и
44-46м конгрессах Международного общества детской онкологии (Мумбай, 2007, Берлин,
2008, Сан-Паулу, 2009, Бостон, 2010, Лондон, 2012, Гонконг 2013, Торонто, 2014).
По теме диссертации опубликовано 17 статей, в том числе 15 — в изданиях,
рекомендованных в перечне Высшей Аттестационной Комиссии Министерства образования
и науки РФ, а также 1 статья в зарубежном журнале.
Личный вклад автора
Личный вклад состоит в детальном планировании научной работы, тщательном
анализе научной литературы, посвященной проблеме ОЛ у детей первого года жизни. Автор
принимал непосредственное участие подборе, отработке условий проведения молекулярногенетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени. Автором были
сформированы базы данных по каждому из направлений диссертационной работы,
проведены статистическая обработка полученных данных, обобщение и интерпретация
полученных результатов, сформулированы научно обоснованные выводы, а также
положения, выносимые на защиту, и практические рекомендации, написаны текст
диссертации и автореферата, основные публикации.
Внедрение результатов работы в практику
Разработаны методические рекомендации «Мониторинг минимальной остаточной
болезни при острых лейкозах у детей первого года жизни», которые утверждены ФГБУ
«Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ (выписка из протокола
заседания ученого совета №7 от 23.09.2014) и ГБОУ ВПО «Российский национальный
9
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства
здравоохранения РФ (Выписка из протокола №1 заседания цикловой методической комиссии
по педиатрии от 13.10.2014).
Результаты исследования внедрены в работу Областной детской клинической
больницы №1 (г. Екатеринбург), Федерального научно-клинического центра детской
гематологии, онкологии
и
иммунологии
им. Дмитрия
Рогачева,
Первого
Санкт-
Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.
Павлова, Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и
иммунологии Министерства Здравоохранения Республики Беларусь, НИИ канцерогенеза
Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина.
Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и
семинаров при подготовке врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре
клинической лабораторной диагностики и бактериологии Уральского государственного
медицинского университета.
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на 299 страницах машинописного текста, содержит 42
таблицы и 50 рисунков. Библиография включает 15 источников отечественной и 458
источников иностранной литературы. Диссертация состоит из следующих разделов:
введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов с
обсуждением, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В работе проанализированы данные 254 пациентов в возрасте от 1 до 365 дней с
установленным диагнозом ОЛ в период с 08.06.1999 по 24.03.2013гг., получавших лечение в
31 клинике Российской Федерации и Республики Беларусь. Всего в исследование было
включено 109 (42,9%) мальчиков и 145 (57,1%) девочек; медиана возраста составила 6,8 мес.
(диапазон 0,1-11,9). ОЛЛ был выявлен у 172 пациентов, ОМЛ — у 75, острый
недифференцированный лейкоз (ОНдЛ) — у 4, острый билинейный лейкоз (ОБлЛ) — у 2,
острый бифенотипический лейкоз (ОБфЛ) — у 1. Последние три варианта ОЛ были
отнесены нами в группу «другие варианты ОЛ» и в дальнейшем рассматривались совместно.
Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследованных разными методами
приведено в табл.1.
При исследовании иммунофенотипа опухолевых клеток результаты, полученные у
детей первого года жизни, сравнивались с 427 пациентами старше 1 года, включая 371
10
пациента с ОЛЛ, 49 с ОМЛ, 1 с ОБлЛ, 4 с ОБфЛ, 2 с.ОНдЛ. Морфологический вариант по
FAB-классификации был известен у 68 пациентов с ОМЛ. Пациенты с синдромом Дауна
(n=3) в анализ не включались.
Таблица 1. Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследованных разными
методами
Диагностический метод
Цитогенетика
FISH
ОТ-ПЦР
Иммунофенотипирование
Секвенирование
ДИ-ПЦР
ПЦР-РВ КМ
ПЦР-РВ ПК
Проточная цитометрия
Количество пациентов (обследованных образцов)
Всего
ОЛЛ (n=172)
ОМЛ (n=75) Другие ОЛ (n=7)
(n=254)
Инициальная диагностика
107
63
6
176
78
44
4
126
153
51
5
209
169
75
7
251
51
17
—
68
52
19
1
72
Мониторинг МОБ
74 (491)
10 / 43
—
84 (554)
53 / (142)
—
—
53 (142)
71 / (458)
—
3 (13)
74 (471)
В исследование по выявлению транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH было
включено 8 пациентов с MLL-негативным ОМЛ, а также 1 пациент с ОБфЛ. Медиана
возраста составила 8,7 мес. (диапазон 5,2-11,7). В исследуемой группе было 2 мальчика и 6
девочек.
Сопоставимость результатов определения МОБ методами проточной цитометрии и
ОТ-ПЦР оценивали в 401 образце костного мозга, взятых от 61 пациента с ОЛЛ из Влинейных предшественников и различными перестройками гена MLL.
В исследование по оценке прогностической значимости МОБ в костном мозге (КМ)
было включено 39 пациентов с ОЛЛ и установленным типом перестроек гена MLL,
включенных в протокол MLL-Baby с сентября 2003 г. по июнь 2011 г. В исследуемой группе
было 12 мальчиков (31%) и 27 девочек (69%), медиана возраста составила 4,4 мес (диапазон
0,1-11,8). Для оценки прогностической роли выявления МОБ в периферической крови (ПК)
было проведено исследование 142 парных образцов (КМ и ПК) от 53 пациентов c
различными перестройками гена MLL, получавших терапию по протоколу MLL-Baby. Схема
протокола с указанием точек наблюдения (ТН), в которые проводилась оценка МОБ,
приведены на рис.1.
Диагноз
ОЛЛ
устанавливался
на
основании
стандартных
морфологических
показателей (Bennett J., 1976) и данных иммунофенотипирования согласно критериям
группы EGIL (Bene M.C., 1995; Bene M.C., 2011), ОМЛ – на основании морфологических
11
критериев Франко-Американо-Британской (FAB) классификации (Bennett J., 1976), а ОНдЛ,
ОБфЛ и ОБлЛ — по данным иммунофенотипирования.
Рисунок 1. Схема протокола MLL-Baby с указанием ТН определения МОБ.
Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге производилось
методом 4-10-цветной проточной цитометрии на приборах «FACS Canto», «FACS Canto II» и
«FACS Aria» (Becton & Dickinson (BD), США). Для иммунофенотипирования применялись
первичномеченные
моноклональные
антитела.
Результаты
иммунофенотипирования
оценивались при помощи программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD, США).
Популяцию считали позитивной по тому или иному маркеру, если 20% и более клеток
экспрессировали исследуемый антиген. Результат определения МОБ рассчитывали в виде
процентного содержания опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного
мозга. Для определения экспрессии NG2 применяли антитело 7.1-PE (Beckman Coulter,
США). Для сравнений экспрессии NG2 на разных этапах терапии использовали значения
средней интенсивности флюоресценции (Mean Fluorescence Intensity, MFI). Для сравнения
данных экспрессии, полученных на разных приборах, MFI пересчитывали в количество
молекул эквивалентного растворимого флюорохрома (MESF) при помощи калибровочных
частиц “Quanti Brite” (BD, США), содержащих известное количество молекул PE.
При
проведении
цитогенетического
исследования
применялась
техника
приготовления «прямых препаратов» или краткосрочное культивирование клеток (24, 48
часов). Дифференциальную окраску хромосом на G-полосы проводили красителем Гимзы
после предварительной обработки
препаратов трипсином. В большинстве случаев
анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Анализ хромосом выполняли в
12
соответствии с международной номенклатурой хромосом человека (ISCN), принятой на
момент выполнения стандартного цитогенетического исследования (ISCN 1995, 2005, 2009).
В ходе данной работы все кариотипы были повторно оценены с учетом рекомендаций ISCN
2013 (Schaffer L., 2013). Дополнительными хромосомными аберрациями (ДХА) считали все
клональные аномалии, сочетавшиеся с перестройками 11q23/MLL (Coenen E., 2011).
Кариотип считали комплексным, если у пациентов с ОМЛ каждая клетка лейкозного клона
содержала не менее трех хромосомных изменений, включая перестройки района 11q23 (Betts
D., 2007; Swerdlow S., 2008).
Для выявления перестроек гена MLL методом FISH был использован двухцветный
ДНК-зонд Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular,
США). В случае стандартной (типичной) перестройки гена MLL выявляются 1 красный, 1
зеленый и 1 желтый совмещенный (сливной) сигналы (1R1G1F). В ряде случаев наряду с
перестройкой гена MLL одновременно могут наблюдаться делеции данного гена,
располагающиеся дистальнее (3’) по отношению к зоне перекрытия двух частей зонда, что
приводит к исчезновению красного сигнала (1G1F).
Для выявления транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH по нашему заказу
компанией
«Metasystems»
(Германия)
был
специально
разработан
трехцветный
флуоресцентный зонд, состоящий из (1) зонда на точку разрыва в хромосомном районе
12p13 центромерная часть которого, меченная оранжевым флуоресцентным красителем,
расположена проксимальнее гена ETV6, а теломерная, меченная зеленым флуоресцентным
красителем, — дистальнее гена ETV6 с небольшой зоной перекрытия самого гена; (2) двух
последовательностей,
меченных
голубым
флуоресцентным
красителем
(Aqua),
фланкирующих нуклеотидную последовательность гена HLXB9 (MNX1) в хромосомном
районе 7q36 (рис.2).
Рисунок 2. Схема трехцветного флуоресцентного зонда для выявления t(7;12)(q36;p12).
13
При использовании зонда нормальное распределение флуоресцентных сигналов,
соответствующее отсутствию транслокации t(7;12)(q36;p12) будет следующим: на каждой
12-й хромосоме должен располагаться 1 оранжевый сигнал (О) от центромерной и 1 зеленый
(G) от теломерной частей зонда, комплементарных хромосомному району 12p13; на каждой 7
хромосоме — по 2 голубых сигнала (B), гибридизующихся по обе стороны от гена HLXB9
(MNX1) в 7q36.
ОТ-ПЦР проводилась в двух модификациях: либо с детекцией методом гельэлектрофореза (n=147), либо при помощи наборов «ЛК-Биочип» (n=62) (Биочип-ИМБ,
Москва). Полученные в ходе ОТ-ПЦР ампликоны очищали при помощи набора «Wizard SV
Gel and PCR Clean-Up System» (Promega, Германия). Секвенирующую реакцию проводили с
применением праймеров, использовавшихся во втором раунде гнездной ОТ-ПЦР и набора
«BigDye Terminator 3.1» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.
Секвенирование поводили в двух направлениях на генетическом анализаторе ABI Prism 3130
(Applied Biosystems, США).
При наличии перестроек гена MLL в диагностическом материале, выявленных
методом ОТ-ПЦР, проводили ПЦР-РВ для количественной оценки химерного транскрипта
как в диагностическом образце, так и во всех доступных образцах, полученных в ходе
терапии. ПЦР-РВ проведена 84 пациентам. Для выявления химерных транскриптов MLLAF4,
MLL-MLLT1,
MLL-MLLT3
нуклеотидная
последовательность
праймеров
и
флуоресцентных зондов была взята из работы (Jansen M., 2007). Для большинства других
химерных транскриптов — MLL-EPS15, MLL-MLLT11, MLL-MLLT10, MLL-MYO1F —
использовались комбинации праймеров и зондов к гену MLL, взятых из работы (Jansen M.,
2007), с праймерами комплементарными основным зонам разрыва исследуемых геновпартнеров, которые были подобраны с использованием программного обеспечения «Clone
Manager Suite 7.0» (Scientific & Educational Software, США). В силу вариабельности зон
слияния в химерных транскриптах MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10 при их
выявлении методом ПЦР-РВ использовался мультиплексный вариант. Чувствительность
ПЦР-РВ, оценивавшаяся методом лимитирующих разведений клеточных культур RS4;11,
MV4-11 и THP-1, составила 110-4. В качестве калибраторов для ПЦР-РВ использовались
плазмиды, несущие фрагменты генов MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10,
MLL-MLLT4, ABL (все Ipsogen, Франция), MLL-EPS15 (Лаборатория генной инженерии ГНЦ
РАМН). В дальнейший анализ брались образцы, в которых экспрессия контрольного гена
ABL, превышала 104 копий. Для количественной оценки величины МОБ на основании
данных, полученных в ПЦР-РВ, использовалась методика расчета, рекомендованная
консорциумом «Европа против рака» (Формула 1), основанная на отношении величин
экспрессии химерного (ХГ) и нормального генов (НГ) в конкретной ТН и на момент
14
установления диагноза (DS) (Beillard E., 2003):
(1)
Для проведения длинной инвертированной ПЦР (ДИ-ПЦР) в качестве исходного
материала использовали геномную ДНК в количестве 1 мкг, выделенную из смеси
лейкоцитов и бластных клеток костного мозга, взятого в момент установления диагноза.
Для мониторирования МОБ с использованием геномной ДНК комбинацию праймеров
и зондов подбирали с использованием программного обеспечения «Clone Manager Suite 7.0»
(Scientific & Educational Software, США), исходя из структуры зоны слияния генов MLL и
EPS15, индивидуальной для каждого пациента. Условия проведения ПЦР и интерпретация
результатов ПЦР-РВ соответствовали рекомендациям Европейской рабочей группы по
изучению МОБ при ОЛЛ ESG-MRD-ALL (Velden van der V., 2007) c дополнениями
(Burmeister T., 2006).
Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение «SPSS
17.0», «STATISTICA 8.0», «R-statistics» и «Analyse-it». В зависимости от величины групп
пациентов при сравнении по качественным признакам использовался точный критерий
Фишера, либо критерий χ2 с поправкой Йетса. При сравнении двух групп пациентов по
количественным признакам использовали критерий Манна-Уитни, при одновременном
сравнении нескольких групп — критерий Крускала-Уоллиса. Для выявления порогового
значения с наибольшей диагностической эффективностью разделяющей образцы пациентов
был использован метод характеристических кривых (receiver operator characteristic, ROCкривых) (Zweig M., 1993; Obuchovski N., 2005). С целью прогнозирования наличия
перестроек
гена
MLL
диагностическую
положительного
для
каждого
чувствительность,
и
отрицательного
иммунологического
специфичность,
результатов,
а
маркера
рассчитывали
прогностическую
также
общую
ценность
диагностическую
эффективность теста (Weinstein S., 2005). Результаты терапии оценивались по кривым БСВ,
построенным по методу Каплана-Майера (Kaplan E., 1958), а также по кумулятивной
вероятности развития рецидива. Для сравнения кривых использовались непараметрические
log-rank критерий и критерий Грея, соответственно. Расчет отношения опасности с 95%
доверительным интервалом (ДИ) был проведен по методу Кокса (Cox D., 1972) в
однофакторной и многофакторной моделях. Различия считались достоверными при р0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цитогенетическая характеристика ОЛЛ у детей первого года жизни
Цитогенетический анализ был проведен у 107 из 172 пациентов с ОЛЛ. Среди этого
15
числа наиболее часто встречались перестройки хромосомного района 11q23, а аберрации,
типичные для детей старше 1 года, обнаружены лишь в единичных случаях. Нормальный
кариотип зафиксирован у четверти пациентов (24,3%) (табл. 2).
Таблица 2. Цитогенетические подгруппы ОЛЛ у детей первого года жизни
Цитогенетическая аберрация
Количество пациентов
%
107
100
Нормальный кариотип
26
24,3
Высокая гипердиплоидия (n=51-65)
2
1,9
Гиподиплоидия (n≤44)
1
0,9
t(1;19)(q23;p13)/TCF3-PBX1
1
0,9
t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1
1
0,9
t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1
—
—
Транслокации с вовлечением 11q23
641
59,8
Сложный кариотип
7
6,5
del(1)(p)/STIL-TAL1
1
0,9
Другие
4
3,7
Проведено цитогенетическое исследование
Примечания:
1 - Количество и доля пациентов даны без учета данных ОТ-ПЦР и FISH
Перестройки 11q23/MLL у детей первого года жизни с ОЛЛ
Перестройки хромосомного района 11q23 с вовлечением гена MLL выявлены у 113 из
172 обследованных пациентов с ОЛЛ, что составило 65,7%. Исследование относительной
частоты перестроек 11q23/MLL показало, что наиболее частыми были t(4;11)(q21;q23)/MLLAF4, t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3. Важно подчеркнуть, что
наряду с ними были обнаружены и относительно редкие химерные гены, такие как MLLEPS15 и MLL-AFF3, которые были обнаружены методом ДИ-ПЦР (табл. 3).
Для исследования взаимосвязи между перестройками 11q23/MLL и возрастом
пациентов все случаи ОЛЛ у детей первого года жизни были разделены на 2 возрастные
группы – старше и младше 6 мес. Выявлено, что в возрасте младше 6 мес. перестройки
11q23/MLL были обнаружены достоверно чаще (86,1% случаев) по сравнению с пациентами
в возрасте от 6 до 12 месяцев (48,4% случаев) (р<0,001). Статистически значимые различия
сохранялись для t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 (51,9% и 26,9%, соответственно, p=0,001), и
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 (24,1% и 3,2%, соответственно, р<0,001).
16
Таблица 3 Относительная частота выявления перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ у детей
первого года жизни (n=172)
Тип перестройки 11q23/MLL
Количество пациентов
%
113
100
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4
66
58,4
t(11;19)(q23;p13) / MLL-MLLT1
22
19,5
t(9;11)(p22;q23) / MLL-MLLT3
12
10,6
t(10;11)(p12;q23) / MLL-MLLT10
5
4,4
t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15
6
5,3
t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3
1
0,9
Неизвестный ген-партнер MLL
1
0,9
Всего выявлено перестроек 11q23/MLL
При
исследовании
структуры
химерных
транскриптов
было
выявлено
9
транскриптных вариантов химерного гена MLL-AF4 (n=26), 5 транскриптных вариантов —
MLL-MLLT3 (n=7), 3 — MLL-MLLT1 (n=14), 2 — MLL-EPS15 (n=4). Среди различных
транскриптов MLL-AF4 наиболее часто был обнаружен вариант со слиянием 11-го экзона
гена MLL и 4-го экзона гена AF4 (e11e4) – в 8 случаях из 26 (30,8%). Реже выявлялись
химерные транскрипты e10e4 – 6 случаев, е9е4 — 5 случаев, e11e5 — 2 случая. Остальные
варианты химерных транскриптов — е9е5, е9е6, е10е5, e11e6, е12е6 – были найдены
однократно. Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLL-MLLT3 преобладал
e11e6, обнаруженный в 3 из 7 случаев, еще 4 варианта — е9е6, е10е5, е10е6 и е11е5 — были
выявлены по 1 разу. Меньшим разнообразием отличались химерные транскрипты MLLMLLT1 и MLL-EPS15. Из 14 пациентов с MLL-MLLT1 7 имели вариант с местами слияния в
11-м экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLT1, 6 — вариант е10е2 и двое — е9е2. Поровну
распределись пациенты с наличием химерного транскрипта с MLL-EPS15: у 2 был выявлен
вариант e10e2, еще у двоих – е11е2. Суммарно наиболее частой зоной слияния в гене MLL
являлся 11-й экзон, на долю которого приходилось 24 случая (47,0%), 10-й экзон участвовал
в образовании химерных транскриптов в 16 случаях (31,4%), 9-й — в 10 (19,6%).
Цитогенетические характеристики ОМЛ у детей первого года жизни
При ОМЛ цитогенетический анализ был проведен у 63 из 75 пациентов (табл. 4). При
этом было выявлено 3 случая (4,8%) inv16(p13q22), в то время как другие маркеры
благоприятного прогноза — t(15;17)(q22;q21) и t(8;21)(q22;q22) — не были обнаружены.
Комплексный кариотип выявлен нами у 10 пациентов (15,9%), включая 5 случаев с наличием
перестроек 11q23/MLL. Нормальный кариотип клеток лейкозного клона имели 9,5%
пациентов.
17
Таблица 4. Цитогенетические подгруппы ОМЛ у детей первого года жизни
Цитогенетическая аберрация
Количество пациентов
%
Проведено цитогенетическое исследование
63
100
Нормальный кариотип
6
9,5
t(8;21)(q22;q22)
—
—
t(15;17)(q22;q11)
—
—
inv(16)(p13q22)
3
4,8
281
44,4
t(1;22)(p13;q13)
5
7,9
t(7;12)(q36;p12)2
3
-
Комплексный кариотип (11q23(+))3
10
15,9
Комплексный кариотип (11q23(-))4
5
7,9
Другие
8
12,7
Транслокации с вовлечением 11q23
Примечания:
1 - Количество пациентов дано без учета данных ОТ-ПЦР и FISH;
2 - Выявлена при помощи FISH;
3 - Клоны клеток с тремя и более хромосомными аномалиями, включая перестройки
11q23/MLL без маркеров благоприятного прогноза;
4 - Классический вариант комплексного кариотипа
Для
MLL-негативных
ОМЛ
(n=35)
характерными
являлись
транслокации
t(7;12)(q36;p12) и t(1;22)(p13;q13), выявленные нами в 3 и 5 случаях, соответственно.
Последняя была обнаружена только среди пациентов с ОМЛ М7; во всех случаях t(1;22)
была единственной аномалией кариотипа. В 12 случаях лейкозные клетки содержали
клональные хромосомные нарушения, не затрагивающие район 11q23, среди которых были
как редкие аномалии, так и характерные для ОМЛ, такие как del(3)(q26), add(5q), -7, add(7q),
del(7q), del(20q),+21.
Выявление транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH
Использование нового трехцветного зонда для FISH позволило выявить транслокацию
t(7;12) в 4 случаях, включая три случая MLL-негативного ОМЛ, и один случай ОБфЛ, когда
клетки лейкозного клона содержали делеции del(7)(q11) и del(12)(p13). Интересно отметить,
что все позитивные случаи выявлены у девочек, и в трех из четырех случаев
цитогенетически определялась трисомия 19 хромосомы. Взаимосвязи с FAB-вариантом не
прослеживалось (табл. 5).
18
Таблица 5. Результаты использования флуоресцентного зонда для выявления транслокации
t(7;12)
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Распределение
Уточненный кариотип с
флуоресцентных
Данные
FAB Кариотип начальный
учетом результатов
сигналов на
FISH
FISH
хромосомах
7 (N) – B
48,XX,+19,+22,
48,XX,+19+22,
der(7) – B+G
М5 inv(16)(p13;q22),
t(7;12) +
t(7;12)(q36;p13),
12 (N) – O+G
del(12)(p12-13?)
inv(16)(p13q22)
Der(12) – O+G+B
7 (N) – B
47,XX,+19 [14] /idem, der(7) – B+G
47,XX,+19/idem, t(7;12)
М7
t(7;12) +
add(7q) [4]
12 (N) – O+G
(q36;p13), +mar
Der(12) – O+G+B
7 (N) – B
der(7) – B+G
48,XX,+19,
М0 47,XX,+19 [20]
t(7;12) +
12 (N) – O+G
t(7;12)(q36;p13)
Der(12) – O+B
7 (N) – B
ОБ 46,XX,del(7)(q11),del(1 der(7) – G
t(7;12) +
46,XX,der(7)t(7;12)(q11;
фЛ 2) (p13) ish ETV6 mv
12 (N) – O+G
del(7)(q) p13)del(7)(q11q36)
Der(12) – O+G+B
7 (N) - B
7 (N) - B
t(7;12) Mx 47,XY,+6 [11]
47,XY,+6
12 (N) - 1O+G
del(12)(p13)
Del(12)(p13)
47,XY,+6,-10,-21,
7 (N) - B
47,XY,+6,-10,-21,
add(10p),del(3q),
7 (N) - B
t(7;12) add(10p),del(3q),
M7
del(6q),der(19),
12 (N) - 1O+G
del(12)(p13) del(6q),der(19),
der(19),+2 mar
Del(12)(p13)
der(19),+2 mar
7 (N) - B
7 (N) - B
M5 46,XX
t(7;12) 46,XX
12 (N) - 1O+G
12 (N) - 1O+G
7 (N) - B
7 (N) - B
Mx 46,XX
t(7;12) 46,XX
12 (N) - 1O+G
12 (N) - 1O+G
7 (N) - B
46,XX,t(5;6)(q31;q157 (N) - B
М1
t(7;12) 46,XX,t(5;6)(q31;q15-16)
16)
12 (N) - 1O+G
12 (N) - 1O+G
Для
оценки
специфичности
флуоресцентного
зонда
были
использованы
цитогенетические препараты 5 пациентов с ОМЛ исследуемой возрастной группы, включая 2
случая с нормальным кариотипом, и 3 — со случайными цитогенетическим аберрациями.
Всего
в
исследуемой
группе
нами
выявлено
4
различных
комбинации
флуоресцентных сигналов, две из которых соответствуют отсутствию транслокации
(2O+G/2B и 1O+G/2B), две другие — различным вариантам транслокации t(7;12)(q36;p12),
19
но ключевым в этих случаях является совместное расположение голубого сигнала c
комбинацией зеленого и оранжевого. У двух пациентов (№№ 5 и 6 в табл. 5) нами было
выявлено только по одному красному и зеленому сигналу при наличии двух голубых. Так
как по данным цитогенетического исследования у данных пациентов присутствовали обе
хромосомы 12, и они были неизмененные, то это было расценено как внутрихромосомная
делеция 12p13 с возможным вовлечением гена ETV6.
Основываясь
на
результатах
исследования
методом
FISH,
была
показана
гетерогенность точек разрыва в хромосомном районе 7q36. В трех случаях (№№ 1-3 в табл.
5) точка разрыва располагалась непосредственно в гене HLXB9. При этом голубой сигнал
был найден на трех хромосомах — на неизмененной 7 хромосоме, деривате 7 и деривате 12.
У одного пациента (№4 в табл. 5) точка разрыва в хромосомном районе 7q36 локализовалась
проксимальнее гена HLXB9. Это привело к тому, что зеленый сигнал находился на деривате
7 хромосомы, а голубой — дистальнее комбинации зеленого и оранжевого — на деривате 12
хромосомы. Также в этом случае была выявлена делеция длинного плеча 7 хромосомы
del(7)(q11q36). В регионе 12p13 точки разрыва локализовались внутри зоны, окрашенной
зеленой флуоресцентным красителем, и это мог быть как фрагмент гена ETV6, так и рядом
расположенные участки хромосомы. При этом в двух случаях (№№ 1-2 в табл. 5) было
отмечено расщепление зеленого флуоресцентного сигнала, который в этих случаях был
расположен на трех хромосомах — на интактной 12-й хромосоме, деривате 12 хромосомы и
деривате 7 хромосомы. При отсутствии расщепления сигналов визуализировалось два
зеленых сигнала, расположенных на деривате 7-й хромосомы, и неизмененной 12-й.
Мы также оценили экспрессию CD34 и СD117 у пациентов с транслокацией t(7;12).
Для сравнения была использована группа из 31 пациента с ОМЛ в возрасте младше 12 мес,
включая 15 пациентов с перестройками гена MLL и 16 без таковых. Было показано, что
экспрессия CD34, но не CD117, достоверно чаще выявлялась у пациентов при наличии
t(7;12) (табл. 6). Различия для СD34 становились более значимыми в том случае, когда
группа пациентов с t(7;12) сравнивалась с MLL-позитивным ОМЛ (p=0,009).
Таблица 6. Экспрессия антигенов CD34 и CD117 опухолевыми бластами
Показатель
Количество
пациентов,
опухолевые
бласты которых экспрессируют CD34
Количество
пациентов,
опухолевые
бласты которых экспрессируют CD117
t(7;12)
t(7;12) не
обнаружена (n=4)
обнаружена (n=31)
4
10
p=0,019
4
14
p=0,104
p
20
Таким образом, нами показана возможность выявления криптической транслокации
t(7;12)(q36;p13) путем использования трехцветного флуоресцентного зонда. Выявлена
гетерогенность точек разрыва в хромосомных районах 12p13 и 7q36, что ведет в различным
механизмам образования химерного гена HLXB9(MNX1)-ETV6. У пациентов с наличием
транслокации
t(7;12)
опухолевые
бласты
достоверно
чаще
имеют
менее
зрелый
иммунофенотип по сравнению по сравнению со случаями ОМЛ без данной транслокации.
Перестройки 11q23/MLL у детей первого года жизни с ОМЛ
В исследованной группе перестройки 11q23/MLL выявлены у 42 из 75 пациентов
Самыми
(56,0%).
частыми
перестройками
были
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3
и
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10. Кроме этого были обнаружены редкие и нетипичные для
данной
возрастной
группы
перестройки
11q23/MLL.
К
первым
следует
отнести
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MYO1F, t(11;17)(q23;q25)/MLL-SEPT9, t(X;11)(q24;q23)/MLL-SEPT6, ко
вторым — t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4 и MLL-PTD (табл. 7).
Таблица 7. Относительная частота выявления перестроек 11q23/MLL при ОМЛ у детей
первого года жизни (n=75)
Тип перестройки 11q23/MLL
Количество пациентов
%
42
100
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3
12
28,6
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10
12
28,6
t(1;11)(q21;q23)/MLL-MLLT11
2
4,8
t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
2
4,8
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MYO1F
2
4,8
t(11;19)(q23;p13.1)/MLL-ELL
1
2,4
t(11;19)(q23;p13.3)/MLL-MLLT1
1
2,4
t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4
1
2,4
t(11;17)(q23;q25)/MLL-SEPT9
1
2,4
t(X;11)(q24;q23)/MLL-SEPT6
1
2,4
MLL-PTD
1
2,4
Неизвестный ген-партнер MLL
5
11,9
Всего выявлено перестроек 11q23/MLL
Также как и при ОЛЛ, мы оценили взаимосвязь между типом перестроек 11q23/MLL и
возрастом пациентов с ОМЛ. Перестройки 11q23/MLL встречались приблизительно с равной
частой у детей младше и старше 6 мес (56,2% и 55,8%, соответственно, p=0,843).
Цитоморфологическое исследование костного мозга было выполнено у 68 пациентов
21
(89,3%), в том числе у 40 с перестройками 11q23/MLL и у 28 – без них (табл. 8).
Таблица 8. Количество пациентов с ОМЛ и различными перестройками 11q23/MLL в
зависимости от FAB-варианта
Тип перестройки 11q23/MLL
Всего 11q23/MLL (+) n=42
Морфологические варианты ОМЛ
М0
М1
М2
М4
М5
М7
Мх1
1
1
4
7
26
1
2
(66,7)
(70,0)
(81,3)
(7,7)
(28,6)
(33,3)2 (25,0)
Перестройки 11q23/MLL не
выявлены (n=33)
Итого
2
3
2
3
6
12
5
(66,7)
(75,0)
(33,3)
(30,0)
(18,7)
(93,2)
(71,4)
3
4
6
10
32
13
7
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
Примечание (здесь и далее в таблицах):
1- «Мх» - FAB-вариант неизвестен
2- указаны абсолютные величины, и в скобках — проценты
Ни в одном случае не были диагностированы морфологические варианты ОМЛ М3
или ОМЛ М6. У большинства 11q23/MLL-позитивных пациентов был выявлен ОМЛ М5 по
FAB-классификации (26 человек, 61,9%). Суммарно на долю М4 и М5 вариантов
приходилось 78,5% всех случаев MLL-позитивного ОМЛ в исследуемой группе. В группе без
перестроек 11q23/MLL преобладающим морфологическим вариантом был М7 (12 пациентов,
36,4%), М5 был выявлен у 6 человек (18,2%), М1 и М4 – по 3 пациента (9,1%), М2 и М0 – по
2 (6,1%). У пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL ОМЛ М5 диагностировался
достоверно чаще (р<0,001), а М7 – значительно реже (р<0,001), по сравнению с группой
пациентов, у которых перестройки 11q23/MLL не были обнаружены. Существенных
различий в частоте встречаемости других цитоморфологических вариантов ОМЛ между
сравниваемыми группами не обнаружено.
ДХА выявлены у 10 из 34 пациентов (29,4%) с наличием перестроек 11q23/MLL и
информативным цитогенетическим исследованием, в том числе комплексный кариотип — у
5 (14,7%). В трех случаях обнаружены только количественные ДХА, в двух — только
структурные; в 5 случаях — сочетание количественных и структурных. Наиболее частыми
количественными ДХА являлись дополнительные хромосомы 8 (3 случая), 6 и 19 (по 2
случая), а также моносомия 10 (2 случая).
Оценка структуры химерных транскриптов выявила по 4 транскриптных варианта
MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10 и 1 — MLL-MLLT11. У единственного пациента с наличием
MLL-AF4 химерный транскрипт образовался при слиянии 11-го экзона гена MLL с 5 экзоном
22
AF4 (e9e5). Этот же тип химерного транскрипта MLL-AF4 был выявлен лишь у 2 из 26
пациентов с ОЛЛ. У пациентов с MLL-MLLT3 преобладал вариант e11e6, обнаруженный в 4
из 7 случаев. Выявлено также по 1 случаю транскриптных вариантов е9е5, е9е6, е10е6, Все
они, за исключением е10е6, встречались и в группе пациентов с MLL-MLLT3-позитивным
ОЛЛ, а доминирующий вариант e11e6 был самым частым и среди пациентов с ОЛЛ. Среди
пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных транскриптов
е8е15, е9е9, e9е10 и 1 случай e9e4. Оба пациента, у которых был найден MLL-MLLT11, имели
транскриптный вариант е9е2. Суммарно, наиболее частой зоной слияния был 9 экзон гена
MLL, что было выявлено в 10 случаях (59%), реже — экзоны 11 и 8 (24% и 12%,
соответственно). А среди генов-партнеров MLL наиболее разнообразна была локализация зон
слияния в гене MLLT10.
Цитогенетическая характеристика других вариантов ОЛ
Выявлено 3 пациента с ОНдЛ и нормальным кариотипом, причем в одном из этих
случаев методом ОТ-ПЦР был выявлен химерный транскрипт MLL-MLLT3. Лейкозные
клетки одной пациентки с ОБфЛ содержали делеции del(7)(q11) и del(12)(p13), что позволило
предположить нам наличие t(7;12)(q36;p12), которая была верифицирована методом FISH.
Перестройки 11q23/MLL у детей первого года жизни с другими вариантами ОЛ
В этой группе перестройки 11q23/MLL были выявлены у 4 из 7 пациентов. В одном
случае у пациента с ОНдЛ и нормальным кариотипом лейкозных клеток методом ОТ-ПЦР
был выявлен химерный транскрипт MLL-MLLT3. В другом, также у пациента с ОНдЛ при
отсутствии метафаз был выявлен химерный транскрипт MLL-MLLT10. Кроме того,
транслокации с участием 11q23 наблюдались еще у двух пациентов с ОБлЛ: t(4;11)(q21;q23)
и t(11;15)(q23;q22).
Использование метода флуоресцентной гибридизации in situ
для выявления перестроек гена MLL
При использовании метода FISH перестройки гена MLL были выявлены у 92 из 126
обследованных пациентов (73,0%), в том числе, в 57 из 78 случаев ОЛЛ (73,1%) и в 33 из 44
случаев ОМЛ (75,0%), а также у 2-х пациентов с другими вариантами ОЛ. Одновременно с
этим информативное цитогенетическое исследование проведено у 96 из 126 пациентов
(76,2%), при этом транслокации с вовлечением хромосомного района 11q23 выявлены у 60
(62,5%). Несмотря на более частое обнаружение перестроек гена MLL методом FISH, по
сравнению с транслокациями хромосомного района 11q23, выявляемыми цитогенетически,
достоверных различий в эффективности этих методов не найдено (p=0,127).
При исследовании методом FISH в 85 случаях (92,4%) было выявлено стандартное
распределение флуоресцентных сигналов, типичное для перестройки гена MLL (1R1G1F). В
7 случаях (7,6%) дополнительно была обнаружена делеция 3’-конца данного гена (1G1F), в
23
том числе 1 случай - с дупликацией и 1 случай - с трипликацией 5’-конца гена MLL (2G1F и
3G1F, соответственно). 3’ делеция гена MLL примерно с равной частотой выявлялась у
пациентов с ОЛЛ — 7,0% (4 случая из 57) и ОМЛ — 6,1% (2 из 33) (p=0,639). Седьмой
пациент имел ОНдЛ. У всех 7 пациентов с нестандартным распределением флуоресцентных
сигналов был определен тип химерного гена, а также локализация точки разрыва в ДНК гена
MLL. Было выявлено 3 случая MLL-MLLT3 и по 2 случая MLL-AF4 и MLL-MLLT10. Ни в
одном случае у пациентов с 3’ делецией гена MLL нам не удалось обнаружить реципрокный
ген методом ДИ-ПЦР. Нами не найдено взаимосвязи между наличием 3’ делеций MLL и
локализацией точки разрыва в гене MLL (табл. 9).
Таблица 9. Локализация точек разрыва в ДНК гена MLL в зависимости от типа
распределения флуоресцентных сигналов
Количество пациентов
Локализация
точки разрыва в
Стандартное распределение
3’ делеция гена MLL
гене MLL
флуоресцентных сигналов (n=64)
(n=7)
Интрон 8
1
1
0,189
Интрон 9
12
1
1,000
Интрон 10
16
0
0,337
Экзон 10
1
1
0,189
Интрон 11
27
3
1,000
Экзон 11
3
1
0,346
Другие
4
0
1,000
p
Интересно, что ни у одного из 7 пациентов с делецией 3’ конца гена MLL не выявлена
точка разрыва в интроне 10, который находится на втором по частоте месте у пациентов со
стандартным
распределением
флуоресцентных
сигналов.
Нами
проведена
оценка
кумулятивной вероятности развития рецидивов внутри группы с наличием перестроек гена
MLL — у 7 пациентов с наличием перестройки гена MLL и 3’ делеции по сравнению с 64
пациентами со стандартным
распределением флуоресцентных сигналов. Достоверных
различий между группами не найдено (0,48±0,05 и 0,57±0,01 соответственно, p=0,489).
Медиана наблюдения составила 20 мес. (диапазон 3-84).
Структура химерных генов с участием MLL и ее взаимосвязь с клиниколабораторными характеристиками острых лейкозов
При ОЛЛ у детей первого года жизни наиболее часто точка разрыва в ДНК гена MLL
локализовалась в 11-м интроне — 25 из 52 случаев (48,1%). Кроме частых локализаций точек
24
разрыва (интроны 9, 10, 11), на долю которых приходилось 85,6% случаев, нами были
выявлены и более редкие. При ОЛЛ наибольшей вариабельностью обладал химерный ген
MLL-AF4: только в 11 из 28 (39,3%) случаев место разрыва в ДНК гена MLL было
расположено в интроне 11, в 6 (21,4%) — в 9-м интроне, по 4 (14,3%) случая приходилось на
10-й интрон и 11-й экзон. Наиболее стабильно точки разрыва локализовались при
образовании химерного гена MLL-MLLT1: в 8 из 12 (66,7%) случаев местом слияния
выступал 11-й интрон гена MLL. При ОМЛ самым частым местом, в котором происходили
разрывы в ДНК гена MLL, являлся 9-й интрон — 8 случаев из 19 (42,1%). При этом наиболее
стабильную локализацию имели точки разрыва при образовании химерного гена MLLMLLT10: 4 случая из 5 (80,0%) — в 9-м интроне, а наиболее гетерогенную — при наличии
химерного гена MLL-MLLT3. В последнем случае примерно равное количество приходилось
на 9 и 11 интроны.
Пациенты с ОЛЛ, у которых точка разрыва располагалась в 11-м интроне гена MLL,
были достоверно младше по сравнению со всеми остальными (p=0,025), а также теми, у кого
точка разрыва находилось в интроне 9 (p=0,017). Для ОМЛ подобной ассоциации возраста и
локализации точек разрыва не выявлено (табл.10). В то же время, нами не было выявлено
взаимосвязи между локализацией точки разрыва в гене MLL и типом гена-партнера, а также
полом пациентов и инициальным лейкоцитозом (p>0,05).
Таблица 10. Связь возраста с локализацией точек разрыва в ДНК гена MLL у пациентов с ОЛ
Острый лимфобластный лейкоз
Острый миелоидный лейкоз
Медиана
Диапазон
Медиана
Диапазон
3,6
0,03-11,9
8,0
0,8-11,9
3,0
0,03-11,6
—
10,8
6,1-11,0
0,109
5,6
0,7-11,9
0,025
—
—
—
Интрон 9
6,6
3,1-11,9
0,017
5,8
0,8-11,2
—
Интрон 10
4,2
0,7-9,2
0,324
6,8
2,2-11,9
0,570
—
—
—
9,3
2,2-11,9
0,114
Локализация точек
разрыва в ДНК гена MLL
Все пациенты
Интрон 11
Все
остальные
кроме
интрона 11 (ОЛЛ)
Все
остальные,
кроме
интрона 9 (ОМЛ)
p1
p2
Примечание:
1 - p рассчитано по отношению к пациентам с ОЛЛ, у которых точка разрыва в ДНК гена
MLL располагалась в интроне 11;
2 - p рассчитано по отношению к пациентам с ОМЛ, у которых точка разрыва в ДНК гена
MLL располагалась в интроне 9.
25
Необходимо отметить, что такие редкие химерные гены как MLL-AFF3, MLL-MYO1F,
MLL-SEPT6, MLL-SEPT9 не были обнаружены на этапе первичной диагностики, а впервые
были выявлены только после проведения ДИ-ПЦР. Также ДИ-ПЦР помогла в двух случаях
верифицировать наличие нетипичных вариантов химерного гена MLL-AF4. В первом случае
точка разрыва локализовалась в 7-м интроне гена MLL, в то время как использовавшиеся
праймеры для гена MLL в ОТ-ПЦР комплементарны 8-му экзону, во втором случае точка
разрыва в гене AF4 лежала в 10-м интроне, находящимся за пределами покрытия
использовавшихся праймеров, которые комплементарны 8-му экзону.
В ходе работы мы описали различные механизмы образования химерных генов с
участием MLL, наиболее частым из которых были реципрокные транслокации (73,6%), реже
— транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%) (табл.11).
Таблица 11. Механизмы образования химерных генов в исследуемой группе пациентов
Химерный ген
Реципрокная
(количество случаев)
транслокация
Инсерция
Транс-сплайсинг
MLL-AF4 (n=29)
29
—
—
MLLT1 (n=12)
3
—
9
MLLT3 (n=14)
14
—
—
MLLT10 (n=6)
—
5
—
EPS15 (n=4)
3
—
1
MLLT11 (n=2)
2
—
—
MYO1F (n=2)
1
—
1
AFF3 (n=1)
—
1
—
SEPT6 (n=1)
—
1
—
SEPT9 (n=1)
1
—
—
53
8
11
ИТОГО
При транс-сплайсинге точки разрыва в ДНК располагались за пределами генапартнера MLL (на расстоянии от 0,7 до 25,4 тыс. п.н. от 1 экзона). Тем не менее, на уровне
кДНК это приводило к образованию химерных транскриптов, выявленных в ходе ОТ-ПЦР
и/или ПЦР-РВ, и верифицированных методом секвенирования. В этих случаях зона слияния
в химерных транскриптах состояла из экзона предшествующего интрону, в котором
произошел разрыв геномной ДНК гена MLL, и второго экзона гена-партнера.
Мы также оценили расположение точек разрыва в генах-партнерах MLL. Зоны
разрыва в генах-партнерах MLL чаще всего затрагивают один или два интрона, за
26
исключением генов AF4 и MLLT10, в которых основные зоны разрывов более протяженные.
Так, в гене AF4 основная зона разрывов включала в себя 3-й интрон (19 случаев, 65%), 4-й (6
случаев, 21%) и 5-й (2 случая, 7%). Также нами выявлено по 1 случаю локализации точки
разрыва в интронах 6 и 10. В гене MLLT10 нами было обнаружено три зоны разрывов: 3-й
интрон (1 случай), 8-й интрон (3 случая) и 9-й интрон (1 случай).
Иммунофенотипическая характеристика ОЛЛ у детей первого года жизни
У детей первого года жизни ОЛЛ был выявлен реже по сравнению с пациентами
старше 1 года (67,3% и 86,9% соответственно, р<0,001). Распределение иммунологических
вариантов ОЛЛ у пациентов первого года жизни (n=169) и более старших детей (n=371)
также было различно. В исследуемой группе доминировал BI-ОЛЛ, который был выявлен
чаще, чем у пациентов старше 1 года (53,8% и 3,2% соответственно, р<0,001), в то время как
BII-ОЛЛ у детей первого года жизни встречался значительно реже (28,4% и 77,9%,
соответственно, р<0,001). Иммунологический вариант BIII-ОЛЛ был обнаружен у 14,2%, что
было достоверно чаще чем в возрастной категории старше 1 года — 1,3% (р<0,001). Для Тлинейных ОЛЛ зафиксирована противоположная картина: у детей первого года жизни они
были найдены реже (3,0% и 14,6%, соответственно, р<0,001). Для BIV-ОЛЛ значимых
различий обнаружено не было (р=0,156). Детальные результаты иммунофенотипирования
опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ первого года жизни представлены в табл. 12.
Иммунофенотипы ОЛЛ из В-линейных предшественников существенно отличались у
детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек 11q23/MLL. У пациентов с
наличием перестроек 11q23/MLL варианты BI-ОЛЛ и BIII-ОЛЛ встречались достоверно
чаще, по сравнению с BII-ОЛЛ (p<0,001 в обоих случаях). Кроме того, при BII-ОЛЛ у
пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL опухолевая популяция чаще всего была
гетерогенна по экспрессии CD10, в то время как у MLL-негативных пациентов данный
антиген экспрессировался преимущественно гомогенно (медиана доли позитивных клеток
49,4%, диапазон 20,4-99,9%; и медиана 96,7%, диапазон 54,2-99,9% соответственно, p<0,001).
Были выявлены также различия в количестве MLL-позитивных и MLL-негативных
пациентов, опухолевые клетки которых экспрессировали CD10, CD20, CD45, CD133, CD15,
CD65, NG2. Кроме того, доля CD22-позитивных клеток была ниже у детей с перестройками
11q23/MLL (медиана 86,1%, диапазон 20,2-99,9% и медиана 99,9%, диапазон 63,4-99,9%
соответственно, р=0,004).
Отсутствие экспрессии CD10 и CD20, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65,
CD133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек
11q23/MLL.
Диагностическая
эффективность
выявления
экспрессии
NG2
для
прогнозирования наличия перестроек 11q23/MLL оказалась наиболее высокой (90,6%), в то
время как для остальных маркеров она была значительно ниже. CD10, предлагаемый
27
некоторыми авторами для разграничения пациентов с наличием и отсутствием перестроек
11q23/MLL, показал диагностическую эффективность ниже (76,4%), чем у NG2, CD45
(81,9%) и CD20 (81,2%). Еще ниже диагностическая эффективность была у экспрессии
CD133 (76,5%), CD15 (67,7%), CD65 (53,7%).
Таблица 12. Иммунологические варианты ОЛЛ в исследуемой группе пациентов
Иммунофенотип
Тип перестройки 11q23/MLL
BI-
BII-
BIII-
BIV-
Т-
Нет
ОЛЛ
ОЛЛ
ОЛЛ
ОЛЛ
ОЛЛ
данных
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4 (n=66)
57
5
4
—
—
—
t(11;19)(q23;p13) / MLL-MLLT1(n=22)
11
4
6
—
—
1
t(9;11)(p22;q23) / MLL-MLLT3 (n=12)
5
3
4
—
—
—
t(10;11)(p12;q23) / MLL-MLLT10 (n=5)
2
—
3
—
—
—
t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 (n=6)
6
—
—
—
—
—
t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3 (n=1)
1
—
—
—
—
—
Неизвестный ген-партнер MLL (n=1)
1
—
—
—
—
—
83
12
17
(91,2)
(25,5)
(70,8)
—
—
8
35
7
2
5
Всего 11q23/MLL (+)
(n=113)
Перестройки 11q23/MLL не выявлены
(n=59)
1
(33,3)
2
(8,8%) (74,5%) (29,2%) (100%) (28,0%) (66,7%)
Итого
91
47
24
2
5
(100%) (100%) (100%) (100%) (100%)
3
(100%)
Иммунофенотипическая характеристика ОМЛ у детей первого года жизни
У детей первого года жизни ОМЛ бы выявлен чаще (29,9% и 11,5% соответственно,
р<0,001) по сравнению с пациентами старше 1 года. Для ОБфЛ, ОБлЛ и ОНдЛ значимых
различий
обнаружено
не
было
(р=0,744,
р=0,644,
р=0,277,
соответственно).
Иммунофенотипы ОМЛ существенно различались в зависимости от наличия/отсутствия
перестроек 11q23/MLL.
Отсутствие экспрессии CD61, а также высокая экспрессия CD11b, CD99, CD15, CD65,
CD4, CD133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии
перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность выявления экспрессии CD11b для
прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой (95,0%), в то
время как диагностическая эффективность остальных маркеров была ниже, включая NG2
(89,7%), CD65 (83,3%), CD15 (80,6%), CD99 (78,3%), CD133 и CD4 (по 75,0%), отсутствие
28
экспрессии CD61 (71,9%). Так как экспрессия CD15, CD65, CD133 и NG2 характерна для
наличия перестроек 11q23/MLL и при ОЛЛ, можно утверждать, что ОЛЛ и ОМЛ у детей
первого года жизни с наличием перестроек гена MLL имеют ряд общих особенностей
иммунофенотипа.
Среди пациентов с ОМЛ без перестроек 11q23/MLL наиболее часто встречался острый
мегакариобластный лейкоз с характерной экспрессией CD61. Интересно отметить, что среди
пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL группы был выявлен один случай ОМЛ М7.
Этот случай является нетипичным, поскольку при данном варианте ОМЛ перестройки гена
MLL обнаруживаются относительно редко. Однако и при ОМЛ М7 эффективность CD11b и
NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась очень высока.
Высокая эффективность прогнозирования наличия любых перестроек 11q23/MLL с
помощью определения экспрессии NG2 (при ОЛЛ) и NG2 и/или CD11b (при ОМЛ)
обусловливает
необходимость
применения
данных
антигенов
при
первичном
иммунофенотипировании ОЛ у детей первого года жизни. При обнаружении экспрессии
опухолевыми клетками этих маркеров следует проводить углубленный поиск перестроек
11q23/MLL при помощи мультиплексной ОТ-ПЦР, ДИ-ПЦР и FISH, а не ограничиваться
стандартным определением нескольких наиболее частыx химерных генов.
Возможность использования экспрессии NG2 для мониторинга МОБ
Показано, что NG2 является специфическим маркером, ассоциированным с
перестройками гена MLL. Однако в большинстве исследованных нами случаев отмечалась
гетерогенная экспрессия данного антигена с наличием значительной популяции NG2негативных клеток. Кроме того, как экспрессия NG2, так и доля NG2-положительных клеток
существенно снижались во время лечения, а при рецидиве у части пациентов все опухолевые
клетки были NG2-негативны (рис. 3).
Определенное на разных этапах терапии количество CD19(+)NG2(+)-клеток,
оказалось достоверно ниже (р<0,001) величин МОБ, выявленных в тех же образцах при
помощи 6-8-цветной проточной цитометрии. Несмотря на то, что во время индукционной
терапии экспрессия NG2 не отличалась от инициальной, даже на 15-й и 36-й дни терапии
количество остаточных бластов, определенное только при помощи NG2 оказалось также
достоверно ниже (р=0,001).
Таким образом, NG2 нельзя использовать как единственный маркер для выделения
опухолевых клеток при мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Тем не менее, в
комбинации с другими антигенами NG2 может использоваться для определения МОБ, но не
для выделения популяции опухолевых клеток, а для дополнительной характеристики
популяций, выделенных по другим маркерам.
29
p = 0,002
p = 0,009
Рисунок.3 Экспрессия NG2 (a) и доля NG2-позитивных клеток (б) в образцах костного мозга
у пациентов исследуемой группы (n=15), взятых на момент диагностики (Д) (n=12), во время
индукционной терапии (ИТ) (n=15), консолидации/интенсификации (К/И) (n=18), при
рецидиве(Р) (n=6), при лечении рецидива(ТР) (n=14). На графиках для каждого этапа терапии
показаны медиана (■), межквартильный интервал (▓), а также 1-й (┴) и 99-й (┬) процентили.
Определение минимальной остаточной болезни методом ПЦР в режиме реального
времени у пациентов с наличием химерных гена и транскрипта MLL-EPS15
Клинико-лабораторные
характеристики
пациентов
с
наличием
транслокации
t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15, приведены в табл. 13.
Для проведения количественного определения МОБ с целью оценки эффективности
лечения нами была создана комбинация флуоресцентных зондов, праймеров и плазмиды,
несущей фрагмент химерного транскрипта MLL-EPS15. На основании 10-кратных
разведений плазмиды была получена калибровочная кривая, использовавшаяся для расчетов
количества химерного транскрипта MLL-EPS15 для пациентов с наличием химерного гена
MLL-EPS15 (табл. 14).
Специфичность комбинации зондов и праймеров была проверена исследованием 15
пациентов с ОЛ и нормальным кариотипом и 15 пациентов с ОЛ и другими химерными
транскриптами с участием MLL. Ни в одном случае неспецифических реакций не выявлено.
При разведении РНК, выделенной из исходного образца костного мозга пациента № 3 из
табл. 13, смесью РНК 10 пациентов без онкогематологических заболеваний была определена
чувствительность системы для выявления химерного транскрипта MLL-EPS15 методом ПЦРРВ. Она составила 110-5. Аналитические характеристики полученной калибровочной
кривой для химерного транскрипта MLL-EPS15 приведены в табл. 14. Мониторинг МОБ
путем качественного и количественного определения химерного транскрипта MLL-EPS15
30
проведен 5 пациентам. Для пациентов №№ 3,4 и 5 из табл. 13 проведено также определение
МОБ путем количественной оценки химерного гена в геномной ДНК. Параметры
калибровочных кривых, полученные при использовании индивидуально подобранных
комбинаций зондов и праймеров приведены в табл. 14.
Таблица 13. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОЛЛ и наличием
t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15
№ Пол Возраст
1
2
3
ж
м
ж
5 мес.
7 мес.
9 мес.
Кариотип клеток Химерный Химерный
лейкозного клона
46,XX,t(1;11)
(p32;q23)[11]
46,XX,t(1;11)
(p32;q23),+8[11]
м
1 день
6
ж
ж
3 мес.
4 мес.
—
—
терапии
Пациент жив в ППР со сроком
наблюдения 39 мес
Отсутствие ответа на терапию,
—
—
смерть через 2 мес. от начала
лечения
интрон 10 экзон 10 – Пациент жив в ППР со сроком
(p32;q23)[11]
–интрон 1
(p32;q23)[13]/
46,XY[1]
5
транскрипт
46,XX,t(1;11)
46,XY,t(1;11)
4
ген
Исход
экзон 2
интрон 11 экзон 11 –
–интрон 1
наблюдения 64 мес
Рецидив в сроке 18 мес, смерть
интрон 11 экзон 11 –
—
–интрон 1
46,XX,t(1;11)
(p32;q23)[11]
от рецидива через 28 мес от
экзон 2
начала терапии
Рецидив в сроке 7 мес, смерть
экзон 2
от рецидива через 9 мес от
начала терапии
интрон 10 экзон 10 – Пациент жив в ППР со сроком
– 1p32
экзон 2
наблюдения 20 мес
Таблица 14. Аналитические характеристики полученных калибровочных кривых
Пациенты
Коэффициент
Угол наклона кривой
Точка пересечения с осью
корреляции (R2)
(Slope)
ординат (Y-intercept)
ПЦР-РВ химерного транскрипта
№№1, 3-6
0,999
-3,356
38,790
ПЦР-РВ химерного гена в ДНК
Пациент № 3
0,990
-3,323
25,602
Пациент № 4
0,992
-2,987
21,987
Пациент № 5
0,996
-3,244
21,491
Примечание. Нумерация пациентов дана в соответствии с их порядковыми номерами в табл. 13.
31
Сравнение результатов качественного определения МОБ в кДНК и геномной ДНК у
пациентов с наличием MLL-EPS15 проведено в 23 образцах, полученных от пациентов №№
3-5 из табл. 13. В 21 из них (91,3%) были получены идентичные результаты. В двух случаях
МОБ была выявлена только в кДНК, но не геномной ДНК, что, скорее всего, связано с более
высокой чувствительностью методики по определению химерного транскрипта. Несмотря на
различные
величины
мониторирования
МОБ,
получаемые
MLL-EPS15, нами
при
использовании
разных
способов
была выявлена сходная кинетика МОБ при
исследовании геномной ДНК и кДНК (рис. 4).
Рисунок 4. Кинетика МОБ, определенной в ДНК (верхняя кривая) и кДНК (нижняя кривая) у
пациента № 5. Жирными горизонтальными линиями указаны пределы чувствительности в
ДНК и кДНК соответственно.
На примере MLL-EPS15 был отработан механизм подбора условий для успешного
выявления МОБ при наличии редких вариантов химерных транскриптов с участием гена
MLL, который в последующем был использован для MLL-MLLT10, MLL-MLLT11 и MLLMYO1F. Единственное отличие состояло в том, что из-за потенциальных различий в
структуре химерного транскрипта MLL-MLLT10 был использован мультиплексный вариант
ПЦР-РВ, при котором использовалось два праймера и два зонда, комлементарные 8-му и 10му экзонам гена MLL, вместе с тремя праймерами, комплементарными 7-му, 10-му и 18-му
экзонам гена MLLT10. В гене MLLT11 последовательность праймеров была локализована в
32
начале 2-го экзона. Таким образом мы смогли провести мониторинг МОБ у 8 пациентов с
наличием химерного транскрипта MLL-MLLT10 и 2 с MLL-MLLT11. У двух пациентов с ОМЛ
и наличием химерного транскрипта MLL-MLLT11 было показано, что химерный транскрипт
сохранялся длительное время, а молекулярная ремиссия, достигнутая одним из пациентов,
была кратковременной (менее 5 мес.) (рис. 5), что в дальнейшем привело к развитию
гематологического рецидива.
Рисунок 5. Мониторинг МОБ у пациента с наличием химерного транскрипта MLL-MLLT11.
Верхняя кривая - динамика МОБ, нижняя – чувствительность. В тех местах, где кривые
сходятся, пациент становился МОБ-негативен.
На основании результатов мониторинга МОБ в кДНК была проведена оценка
прогностического значения МОБ, определенной методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ при ОЛЛ у
детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby.
Сравнительный анализ результатов диагностики минимальной остаточной
болезни методами проточной цитометрии и обратно-транскриптазной ПЦР у
детей первого года жизни c ОЛЛ и перестройками 11q23/MLL
Качественная сопоставимость результатов проточной цитометрии и ОТ-ПЦР в 401
образце КМ составила 87,0%. При этом в 50 образцах МОБ была обнаружена только в ходе
33
ПЦР, и лишь в 2 – только проточной цитометрией. Сопоставимость результатов была
достоверно ниже в образцах, взятых на этапе индукционной терапии (78,6%; n=131) по
сравнению с образцами этапов консолидации/интенсификации (n=209; 90,4%) и терапии
рецидива (n=61; 93,4%) (p=0,002). В то же время не выявлено значимых различий между
тремя ТН (день 15, день 36, день 43) во время индукционной терапии (p=0,098). Образцы
пациентов с наличием химерного транскрипта MLL-MLLT3 имели наименьшие показатели
сопоставимости данных проточной цитометрии и ОТ-ПЦР по сравнению с теми, у которых
выявлялись MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-EPS15 (p<0,001). Наличие в образце нормальных Bлинейных предшественников не влияло на сопоставимость результатов (p=0,838).
Несмотря на то, что прямое количественное сопоставление результатов определения
МОБ двумя данными методами невозможно, кинетика величины МОБ во время терапии
сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие этого, у пациентов, у которых
определяется химерный транскрипт, возможно одновременное применение данных методов.
Во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда
необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные
проточной цитометрии. В то же время, в последующие ТН достаточно только качественного
определения МОБ, поэтому целесообразнее использовать результаты определения химерных
транскриптов методом ОТ-ПЦР вследствие более высокой чувствительности метода.
Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в костном мозге,
выявленной методами обратно-транскриптазной ПЦР и ПЦР в режиме реального
времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих
лечение по протоколу MLL-Baby
Методами гнёздной ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ МОБ была обнаружена в 120 из 182
исследованных образцов, в то время как негативный результат при использовании как ОТПЦР, так и ПЦР-РВ был зафиксирован в 57 случаях. В 4 образцах МОБ была выявлена
только методом ОТ-ПЦР, в 1 – только ПЦР-РВ. Общая сходимость двух методов составила
97,3%. Во всех 5 дискордантных образцах экспрессия гена ABL, используемого для
нормализации, была выше порогового значения 1,00×104 копий; медиана составила 7,38×104
копий (диапазон 3,12×104 – 1,18×105), что исключает низкое качество исходного материала
как причину расхождений. Тем не менее, образцы с дискордантными результатами не были
взяты в дальнейший анализ.
Мы оценили количество МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов в различных
ТН. Все пациенты были МОБ-позитивны в ТН1. Затем происходило постепенно нарастание
доли МОБ-негативных пациентов: с 8% в ТН2 до 67% в ТН5. При разделении пациентов на
группы высокого и промежуточного риска согласно критериям протокола MLL-Baby,
выявленная тенденция сохранялась, за исключением того, что в ТН5 ни у одного из
34
пациентов группы промежуточного риска МОБ не была выявлена. Результаты сравнения
величин БСВ и кумулятивной вероятности развития рецидива, полученные при разделении
пациентов на группы в зависимости от выявления МОБ в ТН2, ТН3, ТН4, ТН5 приведены в
табл. 15.
Таблица 15. Прогностическое значение выявления МОБ в различные ТН протокола MLLBaby
Точка
Количество
Бессобытийная выживаемость
наблюдения пациентов
БСВ
СО
р
Кумулятивная вероятность
развития рецидива (КВР)
КВР
СО
0,46
0,01
0,0
—
0,55
0,01
0,16
0,01
0,85
0,03
0,20
0,01
0,86
0,02
0,19
0,01
р
ТН2
МОБ(+)
35
0,48
0,08
МОБ(-)
3
1,0
—
МОБ(+)
24
0,44
0,01
МОБ(-)
12
0,83
0,10
МОБ(+)
12
0,13
0,11
МОБ(-)
21
0,79
0,09
МОБ(+)
10
0,14
0,12
МОБ(-)
21
0,80
0,08
0,092
0,152
ТН3
0,054
0,071
ТН4
0,001
0,001
ТН5
0,006
0,005
Наиболее ранней ТН, для которой были получены достоверные различия в
результатах терапии между группами МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов,
являлась ТН4. Выявление МОБ в следующей ТН – ТН5 также было связано с
неблагоприятным прогнозом.
На следующем этапе мы оценили прогностическое значение последовательного
качественного выявления МОБ в ТН4 и ТН5, однако наличие МОБ в ТН5 не дает
дополнительных данных по сравнению с ТН4 (рис. 6). Исходя из этого ТН4 была выбрана
нами в качестве основной ТН для качественного определения МОБ с целью прогнозирования
исходов терапии при лечении по протоколу MLL-Baby.
Группы пациентов МОБ-позитивных и МОБ-негативных в ТН4 статистически
значимо не отличались между собой по возрасту, полу, инициальным характеристикам ОЛЛ
(величина инициального лейкоцитоза, наличие поражения ЦНС, иммунофенотип, тип
35
перестройки 11q23/MLL), показателям ответа на терапию (количество бластов на 8-й день
терапии дексаметазоном, количество бластных клеток в костном мозге на 15-й день
индукции ремиссии, достижение клинико-гематологической ремиссии на 36-й индукционной
фазы терапии по протоколу MLL-Baby), а также распределению пациентов по группам риска
протокола MLL-Baby.
Рисунок 6. Оценка прогностического значения последовательного качественного выявления
МОБ в ТН3, ТН4 и ТН5. p указывает на различия между кумулятивными вероятностями
развития рецидива (КВР) у МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов в ТН4 и ТН5.
Оценка влияния различных факторов на развитие рецидивов приведена в табл. 16.
Было показано, что прогностически неблагоприятными факторами в исследуемой группе
пациентов, являлись сохранение МОБ-позитивности в ТН4 (p=0,003) и возраст младше 6 мес.
(p=0,001). При сравнении этих параметров в многофакторной модели единственным
независимым прогностическим фактором осталось сохранение МОБ в ТН4 (p=0,044).
Нами также проанализирована возможность использования данных количественного
анализа МОБ методом ПЦР-РВ в ТН2 и ТН3. Известно, что в большинстве протоколов
терапии, использующих величину МОБ для стратификации пациентов по группам риска,
принята шкала оценки МОБ кратная 10. Принимая это во внимание, а также то, что методом
анализа характеристических кривых (ROC-кривых) было выявлено, что пороговым
значением МОБ в ТН3, наиболее эффективно разделяющим группы пациентов с различным
исходом заболевания, является величина равная 0,332%, которая близка к значению 0,1%,
нами было принято решение использовать именно величину 0,1% в качестве пороговой, и по
36
отношению к ней разделить пациентов с разным значением МОБ в ТН3.
Таблица 16. Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение рецидивов у
пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу MLL-Baby с
учетом МОБ в ТН4
анализ
анализ
События
Многофакторный
Пациенты
Однофакторный
ОО
Старше 6 мес.
14
1
1
Младше 6 мес.
19
11 10,559 1,361-81,903
CD10(-/+)cytμ(-)
7
5
CD10(-)cytμ(-)
21
7
CD10(-)cytμ(+)
5
0
Показатель
95% ДИ
—
p
ОО
95% ДИ
1
—
6,171
0,728-52,277
p
Возраст
0,001
0,095
Иммунофенотип
1
—
—
0,792 0,359-1,745 0,560
—
—
Наличие химерного гена MLL-AF4
Нет
15
4
Есть
18
8
1
—
1,899 0,571-6,316
0,302
—
0,704
—
0,193
—
0,268
—
Инициальный лейкоцитоз, ×109/Л
100
20
7
≥100
13
5
1
—
1,252 0,396-3,960
Инициальное поражение ЦНС
Нет
24
7
Есть
7
4
1
—
2,316 0,669-8,018
Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии
Хороший
29
9
Плохой
4
3
Отсутствие
21
4
Наличие
12
8
1
—
2,087 0,563-7,734
Выявление МОБ в ТН4
1
—
6,761 1,934-23,638
0,003
1
—
3,771
1,033-13,674
0,044
Данная диагностическая модель позволила с высокой долей достоверности
прогнозировать исходы терапии по протоколу MLL-Baby. Пациенты, имевшие величину
МОБ в ТН3 более 0,1% (n=7) имели достоверно более низкую БСВ и более высокую
кумулятивную вероятность развития рецидива по сравнению с пациентами, у которых МОБ
37
была ниже 0,1% (n=21) (p=0,011 и p=0,017 соответственно) (рис. 7). Также как и для ТН4, мы
провели одно- и многофакторный анализ в данной группе пациентов с целью поиска
факторов, влияющих на развитие рецидивов (табл. 17).
Таблица 17. Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение рецидивов у
пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу MLL-Baby с
учетом величины МОБ в ТН3
Пациенты
События
Однофакторный анализ
Старше 6 мес.
13
1
Младше 6 мес.
15
9
CD10(-/+)cytμ(-)
6
4
CD10(-)cytμ(-)
18
6
CD10(-)cytμ(+)
4
0
—
—
Нет
14
3
1
—
Есть
14
7
Показатель
ОО
95% ДИ
1
—
p
Многофакторный анализ
ОО
95% ДИ
1
—
5,614
0,661-47,657
p
Возраст
8,606 1,088-68,073
0,041
0,114
Иммунофенотип
—
1
—
0,435 0,118-1,599 0,435
Наличие MLL-AF4
2,347 0,606-9,093
0,217
—
0,300
—
0,257
—
0,605
—
Инициальный лейкоцитоз ×109/Л
100
19
6
≥100
9
4
1
—
1,961 0,549-7,006
Инициальное поражение ЦНС
Нет
20
6
Есть
6
3
1
—
2,260 0,552-9,248
Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии
Да
26
9
Нет
2
1
Менее 0,1%
21
5
Более 0,1%
7
5
1
—
1,726 0,218-13,695
Величина МОБ в ТН3
1
—
7,059 1,976-25,225
0,003
1
—
4,250
1,159-15,585
0,029
Возраст младше 6 мес. и величина МОБ в ТН3 выше 0,1% были двумя статистически
значимыми
прогностически
неблагоприятными
факторами
(p=0,041
и
p=0,003,
38
соответственно), однако в многофакторной модели только величина МОБ в ТН3 выше 0,1%
сохранила свою значимость (p=0,029).
Рисунок 7. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива пациентов с величиной МОБ
в ТН3 более и менее 0,1%.
Для определения какой из параметров вносит наибольший вклад в неблагоприятный
прогноз заболевания было проведено сравнение степени влияния наличия МОБ в ТН4 и
величины МОБ выше 0,1% в ТН3 на риск развития рецидива.
Основываясь на величине отношения опасности, было показано, что ни один из этих
факторов не имеет преимущества перед другим (p=0,099 и 0,332, соответственно), а
выделяемые по ним группы пациентов приблизительно одинаковы. Отчасти это может быть
связано с небольшим размером исследуемых групп, отчасти — возможной взаимной
компенсацией сравниваемых параметров. Все 7 пациентов, имевших в ТН3 величину МОБ
более 0,1% были также МОБ-позитивны в ТН4, и наоборот, из 21 пациента, имевших
величину ТН3 величину МОБ менее 0,1% 18 были МОБ-негативны в ТН4 (табл.18).
Таблица 18. Связь величины МОБ в ТН3 с выявлением МОБ в ТН4 (в скобках приведено
количество рецидивов)
Результат определения МОБ ТН3
Результат определения МОБ в ТН4
МОБ (+)
МОБ (-)
Всего
МОБ < 0,1%
3 (2)
18 (3)
21 (5)
МОБ > 0,1%
7 (5)
0
7 (5)
10 (7)
18 (3)
28 (10)
Всего
39
Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в периферической крови,
выявленной методом ПЦР в режиме реального времени, при остром лимфобластном
лейкозе у детей первого года жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby
На первом этапе мы сравнили выявление МОБ в 142 образцах ПК по сравнению с
парными образцами КМ, взятыми в идентичные ТН протокола MLL-Baby. Общая
сопоставимость результатов качественного выявления МОБ двумя методами составила
84,5% (рис. 8). Во всех 22 (15,5%) дискордантных образцах МОБ была выявлена в КМ, но не
в ПК. Минимальная сопоставимость зафиксирована в ТН3 и ТН5 (77,3% и 76,2%,
соответственно), максимальная – в ТН4 и ТН7 (92,5% и 100%, соответственно) (табл. 19).
Рисунок 8. Сопоставимость результатов определения МОБ в КМ и ПК.
Таблица 19. Сопоставимость выявления МОБ в КМ и ПК в различные ТН протокола MLLBaby
Точка наблюдения
Число образцов
Сопоставимость, %
TН1
19
89,5
TН2
31
80,6
TН3
22
77,3
TН4
26
92,3
TН5
21
76,2
TН6
16
87,5
TН7
7
100
40
Величина абсолютной экспрессии гена ABL, использованного для нормализации,
достоверно не различалась в образцах ПК и КМ; в ПК медиана числа копий ABL составила
4,95*104 (диапазон 1,30*103 – 1,40*106), в КМ — 4,85*104 копий (диапазон 1,08*103 –
3,45*106) (p=0,760).
Затем была проведена оценка прогностической значимости выявления МОБ в ПК в
различные ТН (табл. 20).
Таблица 20. Прогностическое значение наличия МОБ в ПК в различные ТН
Бессобытийная выживаемость
(стандартная ошибка)
ТН
МОБ(+)
МОБ (-)
TН2
0,15 (0,12)
0,50 (0,25)
TН3
0,16 (0,15)
TН4
Кумулятивная вероятность
p
рецидива (стандартная ошибка)
p
МОБ(+)
МОБ (-)
0,433
0,70 (0,09)
0,51 (0.02)
0,460
0,42 (0,10)
0,467
0,83 (0,04)
0,62 (0.04)
0,502
0,20 (0,17)
0,51 (0,18)
0,499
0,80 (0,05)
0,50 (0,03)
0,481
TН5
0
0,57 (0,24)
0,098
0,66 (0,13)
0,42 (0,09)
0,091
TН6
0
0,44 (0,14)
0,056
0,88 (0,11)
0,25 (0,13)
0,030
Примечание:
ТН1 и ТН7 были исключены из анализа по следующим причинам: в ТН1 все образцы были
МОБ-позитивны; в ТН7 было 7 образцов
Единственной ТН, для которой были выявлены различия в исходах терапии между
МОБ-позитивными и МОБ-негативными пациентами в ПК была ТН6.
Мы оценили прогностическое значение наличия МОБ в ТН6 в ПК по сравнению с
МОБ, определенной в ТН4 в КМ на группе из 14 пациентов, которых обследовали в обеих
ТН. Все 10 пациентов, достигших МОБ-негативности к ТН4 в КМ, продолжали сохранять
этот статус и в ТН6 в ПК. В этой группе зарегистрирован только 1 рецидив. Из 4-х пациентов
с наличием МОБ в ТН4 в КМ трое продолжали оставаться МОБ-позитивными в ТН6 в ПК.
Среди этой группы пациентов зарегистрировано 2 рецидива. Еще один МОБ-позитивный
пациент в ТН4 в КМ достиг МОБ-негативности в ТН6 в ПК, но позднее рецидивировал.
Следовательно, использование ПК в ТН6 не дает дополнительных преимуществ, так как
исходы терапии определенные по данным этой ТН, практически полностью дублируют
результаты, полученные в КМ в ТН4.
Исходя из этого, был сделан вывод, что наличие МОБ в ПК на различных этапах
терапии не показало самостоятельной прогностической значимости. Таким образом,
использование ПК вместо КМ для мониторирования МОБ при ОЛЛ у детей первого года
жизни нецелесообразно.
41
Подводя итог всей проведенной работе, нами был сформулирован алгоритм
комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года
жизни на основании сочетанного применения различных методов клинической лабораторной
диагностики (рис. 9).
Рисунок 9. Алгоритм комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у
детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластов.
* ОТ-ПЦР проводится в два этапа, в зависимости от частоты встречаемости отдельных
перестроек гена MLL: У пациентов с ОЛЛ 1-й этап: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3; 2-й
этап: MLL-EPS15, MLL-MLLT10. У пациентов с ОМЛ 1-й этап: MLL-MLLT3, MLL-MLLT10,
MLL-MLLT11, MLL-ELL; 2-й этап: MLL-AF4, MLL-MLLT4, MLL-MYO1F, MLL-FOXO4, MLLSEPT6, MLL-SEPT9; ** FISH t(7;12) проводится пациентам с ОМЛ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложенная нами система определения МОБ на основании инициальных
характеристик опухолевых бластов показала свою эффективность для прогнозирования
исходов лечения детей первого года жизни с ОЛЛ, включенных в российское
мультицентровое
исследование
MLL-Baby.
На
основании
полученных
результатов
представляется целесообразным рестратифицировать пациентов, исходя из сохранения МОБ
в точке наблюдения 4 протокола MLL-Baby: для пациентов промежуточной группы риска –
42
перевод на рукав высокого риска протокола, для пациентов высокой группы риска – поиск
альтернативных способов достижения молекулярной ремиссии с последующим проведением
трансплантации костного мозга.
Кроме того, разработанный алгоритм комплексной диагностики и мониторинга МОБ
позволяет выявлять подавляющее большинство генетических аберраций при ОЛ у детей
первого года жизни, избегать диагностических ошибок, корректно интерпретировать
получаемые результаты. Это, в свою очередь, дает возможность оценить инициальные
факторы риска (вариант ОЛ, тип перестройки 11q23/MLL, наличие транслокации t(7;12)).
Выводы
1.
При ОЛ у детей первого года жизни наиболее часто выявляются перестройки
11q23/MLL (65,7% при ОЛЛ и 56,0% при ОМЛ). Аномалии кариотипа, характерные для ОЛ
детей старших возрастных групп, редко встречаются у детей первого года жизни (3,7%
случаев при ОЛЛ и 4,8% случаев при ОМЛ).
2.
У пациентов с ОЛЛ в возрасте младше 6 месяцев перестройки 11q23/MLL
встречаются достоверно чаще по сравнению с пациентами в возрасте от 6 до 12 месяцев
(86,1% и 48,4%, соответственно). Для ОМЛ подобной взаимосвязи не выявлено.
3.
Установлена взаимосвязь между структурой химерных генов с участием MLL и
видом острого лейкоза, а также возрастом пациентов. В исследованной группе пациентов с
ОЛЛ наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL является 11-й интрон (48,1% случаев),
а при ОМЛ — 9-й интрон (42,1% случаев). Дети с ОЛЛ, у которых точка разрыва находится в
11-м интроне гена MLL, были достоверно младше всех остальных. Для ОМЛ подобной
взаимосвязи не найдено.
4.
Применение метода FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда
позволяет верифицировать транслокацию t(7;12)(q36;p13) и демонстрирует существование
различных механизмов, ведущих к её формированию.
5.
При ОЛЛ у детей первого года жизни отсутствие экспрессии CD10 и CD20, а
также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 дают возможность прогнозировать
наличие перестроек 11q23/MLL. При этом наибольшей диагностической эффективностью
обладает NG2 — 90,6%, для CD45 этот показатель составляет 81,9%, CD20—81,2%, CD133—
76,5%, CD15—67,7%, CD65—53,7%. При ОМЛ в данной возрастной группе с наличием
перестроек 11q23/MLL ассоциированы экспрессия NG2, CD99, CD133, CD15, CD11b и
отсутствие экспрессии CD61. Диагностическая эффективность использования CD11b
составляет 95,0%, NG2—89,7%, CD65—83,3%, CD15—80,6%, CD99—78,3%, CD133 и
CD4—по 75,0%, CD61—71,9%.
6.
Для
определения
минимальной
остаточной
болезни
методом
проточной
43
цитометрии при ОЛЛ у детей первого года жизни NG2 необходимо использовать в
комплексе с другими маркерами, так как его экспрессия, а также доля NG2-положительных
клеток достоверно снижается во время терапии.
7.
Результаты определения МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни методами
проточной цитометрии и ОТ-ПЦР имеют высокую качественную сопоставимость (87,0%).
8.
При ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-
Baby, величина минимальной остаточной болезни в КМ более 0,1% в ТН3 и любое
сохранение МОБ в КМ в ТН4 - наиболее важные параметры, связанные с развитием
рецидивов.
9.
обладает
Выявление МОБ в ПК на различных этапах терапии по протоколу MLL-Baby не
самостоятельной
прогностической
значимостью,
несмотря
на
высокую
качественную сопоставимость выявления МОБ в ПК и КМ (84,5%).
Практические рекомендации
1.
При диагностике ОЛ у детей первого года жизни для поиска маркеров для
последующего определения минимальной остаточной болезни целесообразно проведение
комплекса
лабораторных
исследований,
в
который,
наряду
со
стандартным
цитогенетическим анализом и иммунофенотипированием, рекомендуется включать FISH и
различные варианты ПЦР.
2.
При
выявлении
иммунофенотипа
MLL-ассоциированного
рекомендуется
прицельный поиск перестроек 11q23/MLL всеми возможными методами.
3.
У детей первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек 11q23/MLL
определение минимальной остаточной болезни рекомендуется проводить методами
проточной цитометрии или обратно-транскриптазной ПЦР; при отсутствии перестроек
11q23/MLL — только методом проточной цитометрии.
4.
Учитывая неблагоприятный прогноз пациентов с ОМЛ и наличием транслокации
t(7;12)(q36;p13), а также высокую частоту криптических вариантов этой транслокации, всем
детям первого года жизни с ОМЛ при отсутствии перестроек 11q23/MLL следует проводить
выявление
этой
транслокации
методом
FISH
с
использованием
трехцветного
флуоресцентного зонда.
5.
У детей первого года жизни с ОЛ при отрицательных результатах определения
наиболее частых перестроек 11q23/MLL: (t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4, t(11;19)(q23;p13)/MLLMLLT1, t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3) целесообразно применять разработанные нами условия
выявления и мониторинга редких перестроек гена MLL методом ПЦР в режиме реального
времени.
44
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина, Савельев Л.И., Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина Использование
полимеразной цепной реакции для обнаружения перестроек гена MLL у детей раннего
возраста с острым лейкозом // Вестник Уральской медицинской академической науки. —
2006. — №4. — С.151-156.
2.
Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина, Л.И. Савельев, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина. Использование
ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для обнаружения перестроек гена MLL-AF4 у
пациента, лечившегося по протоколу MLL-BABY 2006 // Вопросы гематологии,
онкологии и иммунологии в педиатрии. — 2006. — том 5, №4. — С.25. – Материалы V
симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», Москва 0910 февраля 2007 г.
3.
G. Tsaur, E. Semenikhina, L. Saveliev, L. Fechina Consecutive detection of MLL
rearrangements in infants’ acute lymphoblastic leukemia during treatment with all-trans
retinoic acid in combination with conventional chemotherapy // Hematologica. — 2007. —
Vol.92, Suppl. 1. — P.452-453. 12th Congress of the European Hematology Association,
Vienna, Austria, June 7-10, 2007.
4.
G. Tsaur, E. Semenikhina, A. Ivanova, L. Saveliev, E. Shorikov, G. Henze, L. Fechina
Efficacy of new treatment protocol, contained all trans-retinoic acid, in infants leukemia /
Pediatric Blood & Cancer. — 2007. — Vol. 49, Issue 4. — P. 463-464. 39th Annual Congress
of International Society of Pediatric Oncology SIOP 2007, Mumbai, India, November 1-3,
2007
5.
G. Tsaur, E. Semenikhina, A. Ivanova, T. Nasedkina, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, L.
Fechina. Achievement of Molecular Remission in MLL/AF4-Positive Infants’ Leukemia
Treated with All Trans-Retinoic Acid Based Protocol ‘MLL-Baby’ // Blood. — 2007. —
Volume 110, issue 11. — p131B. — Abstract #4254. 49th Annual Meeting of the American
Society of Hematology ASH, Atlanta, USA, December 08-11, 2007
6.
G. Tsaur, S. Kovalev, A. Misurin, A. Ivanova, A. Kustanovich, A. Popov, L. Saveliev, O.
Aleinikova, L. Fechina. Development of quantitative Real-time PCR assay for MRD
monitoring of MLL/EPS15 fusion gene in infants’ leukemia // Annals of Hematology. —
2008. — Vol.87, Suppl. 1. — P.10. International Symposium «Acute Leukemias XII. Biology
and Treatment Strategies», Munich, Germany, February 16-20, 2008.
7.
Г.А. Цаур, Е.Р. Семенихина, А.С. Иванова, Ю.А. Яковлева, Т.О. Ригер, О.М.Плеханова,
М.В. Стригалева, А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Т.В. Наседкина, Н.А. Гусева, К.Л.
Кондратчик, H.В. Мякова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, А.И. Карачунский, Л.Г.Фечина.
Выявление и мониторирование перестройки MLL-AF4 у детей первого года жизни с
острым лимфобластным лейкозом, лечившихся по протоколу MLL-BABY // Детская
45
Онкология. — 2008. — №2. — С.63-68.
8.
G. Tsaur, A. Ivanova, S. Kovalev, A. Misurin, M. Suchkova, A. Kustanovich, Yu. Yakovleva,
A. Popov, L. Saveliev, E. Shorikov, O. Aleinikova, L. Fechina. Detection and monitoring of
minimal residual disease for rare MLL rearrangements in infant’s acute leukemia using
quantitative real-time PCR assay // Hematologica. — 2008. — Vol.93, Suppl. 1. — P.461-462.
— Abstr. # 1182. — 13th Congress of the European Hematology Association, Copenhagen,
Denmark, June 12-15, 2008.
9.
G. Tsaur, S. Kovalev, A. Ivanova, Y. Yakovleva, A. Popov, E. Shorikov, L. Saveliev, C.
Meyer, R. Marschalek, A. von Stackelberg, L. Fechina. Real-time PCR for quantitation of
MLL-MLLT10 fusion gene in an infant with acute myeloid leukemia // SIOP abstract book
2008 — P. 84-85 — 40th Annual conference of International Society of Paediatric Oncology
(SIOP), Berlin, Germany, October 3-6, 2008
10.
A. Popov, T.Verzhbitskaya, G. Tsaur, A. Ivanova, E. Shorikov, L. Saveliev, R. Arceci, A von
Stackelberg, M. Dworzak, L. Fechina.
Myeloperoxidase Expression by very early B-cell
Progenitors in infants treated with All-trans retinoic acid // SIOP abstract book 2008 — P. 2627 — 40th Annual conference of International Society of Paediatric Oncology (SIOP), Berlin,
Germany, October 3-6, 2008
11.
О.М. Плеханова, Г.А. Цаур, А.С. Иванова, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина. Использование
флюоресцентной гибридизации in situ для выявления транслокации t(6;11)(q27;q23):
описание
3
случаев
//
Онкогематология.—2008.—№4.—С.64-65—Материалы
VI
симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических
заболеваний», Москва, 29-31 января, 2009.
12.
А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, А.С. Иванова, О. В. Стренева, О.П.
Хлебникова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Мониторинг минимальной
остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей с В-линейным ALL во
время индукционной терапии по протоколам ALL-MB 2002 и MLL-Baby //
Онкогематология. — 2008.—№4. — С.68—Материалы VI симпозиума «Биологические
основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 29-31
января, 2009.
13.
Г.А. Цаур, А.С. Иванова, А.М. Кустанович, С.Ю. Ковалев, А.М. Мисюрин, М.В.
Сучкова, О.М. Плеханова, Ю.А.Яковлева, А.М. Попов, Л.И. Савельев, О.В. Алейникова,
Л.Г. Фечина Мониторинг химерного транскрипта MLL-EPS15 методом ПЦР в реальном
времени у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом //
Онкогематология.—2008.—№4.—С.79-80 — Материалы VI симпозиума «Биологические
основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 29-31
января, 2009.
46
14.
G. Tsaur, A. Ivanova, O. Plekhanova, T. Riger, Y. Yakovleva, A. Popov, Y. Svechnikova, O.
Makarova, E. Shorikov, L. Saveliev, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina. MRD Monitoring in
AML patients with MLL-MLLT4 by quantification of fusion gene transcripts and genomic
chromosomal breakpoint sequences //Blood.—2008—Vol. 112, issue 11.—abstract # 4888
15.
A. Popov, G. Tsaur, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Verzhbitskaya, T. Riger. E. Shorikov, L.
Saveliev, L. Fechina. Qualitative and quantitative concordance in MRD data, assessed by flow
cytometry and RT-PCR of fusion gene transcripts in infants with MLL-rearranged ALL //
Hematologica. — 2009. — Vol.93, Suppl. 2. —P.31-32. — Abstr. # 0080. — 14th Congress of
the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 4-7, 2009.
16.
G. Tsaur, T. Nasedkina, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Riger, A. Popov, E. Shorikov, L.
Saveliev, L. Fechina Different molecular remission achievement time in infants with MLLrearranged acute lymphoblastic leukemia corresponds to outcome – report from MLL-Baby
study group // Hematologica. — 2009. — Vol.93, Suppl. 2. —P.561. — Abstr. # 1437. — 14th
Congress of the European Hematology Association, Berlin, Germany, June 4-7, 2009.
17.
G. Tsaur, T. Nasedkina, A. Ivanova, Y. Yakovleva, T. Riger, A. Popov, E. Shorikov, L.
Saveliev, L. Fechina Prediction of outcome in infants with MLL-rearranged acute
lymphoblastic leukemia by time to achievement of molecular remission // Pediatric Blood and
Cancer.— 2009.—Vol. 53, N 5.—P. 777.— 41st Annual Conference of International Society of
Hematology (SIOP), Sao Paulo, Brazil, October 5-9, 2009.
18.
A. Popov, T. Verzhbitskaya, G. Tsaur, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina NG2 application
value in flow cytometric minimal residual disease monitoring in infants with MLL-rearranged
acute lymphoblastic leukemia // Pediatric Blood and Cancer.— 2009.—Vol. 53, N 5.—P. 777778.— 41st Annual Conference of International Society of Hematology (SIOP), Sao Paulo,
Brazil, October 5-9, 2009.
19.
А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев,
Л.Г. Фечина Возможности применения NG2 для мониторинга минимальной остаточной
болезни методом проточной цитометрии у детей первого года жизни с острым
лимфобластным лейкозом, ассоциированным с реарранжировками гена MLL //
Гематология и трансфузиология. – 2009.— №6. — С.19-22
20.
Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, А.М. Попов, О.В. Каленник, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер,
Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова, А.Е. Друй, О.М. Плеханова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев,
Л.Г. Фечина Прогностическое значение времени достижения молекулярной ремиссии у
детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом и перестройкам гена MLL,
получавших терапию по протоколу MLL-Baby // Медицинская генетика – Материалы VI
Съезда Российского общества медицинских генетиков и I Всероссийского конгресса
«Генетика опухолей кроветворной системы», Ростов-на-Дону, 15-18 мая 2010 года– С.
47
190.
21.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, Т.В Наседкина, А.М. Кустанович, О.В. Каленник, С.Ю. Ковалев,
Т.О. Ригер, Е.Р. Семенихина, А.С. Иванова, Ю.А. Яковлева, А.Е. Друй, Е.В. Шориков,
О.В. Стренева, О.М. Плеханова, М.В. Стригалева, О.В. Алейникова, C. Meyer, R.
Marschalek, Л.И. Савельев, Л.Г.Фечина Перестройки гена MLL у детей с острыми
лейкозами // Клинико-лабораторный консилиум. – 2010. – № 4. – С.53-54. – Российский
Конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины –
возможное и реальное», Санкт-Петербург, 6-9 июня, 2010
22.
Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, А.М. Попов, О.В. Каленник, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер,
Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова, А.Е. Друй, О.М. Плеханова, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев,
Л.Г. Фечина Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей
первого года жизни острым лимфобластным лейкозом // Онкогематология. – 2010. – №2.
– С.46-54.
23.
А.М. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, Т.О. Ригер, Ю.А. Яковлева, А.С. Иванова,
А.Е. Друй, Е.В. Шориков, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Сравнение
результатов определения минимальной остаточной болезни методом проточной
цитометрии и выявления химерного транскрипта полимеразной цепной реакцией у
детей, больных B-линейным острым лимфобластным лейкозом // Гематология и
трансфузиология. – 2010. – Т55., №2. – С. 3-9.
24.
G.Tsaur, A. Popov, A. Kustanovich, A. Ivanova, O.Plekhanova, Y. Yakovleva, E. Shorikov, S
Kovalev, A.Misyurin, M. Suchkova, O. Aleinikova, C. Meyer, R. Marschalek, T. Burmeister,
L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease monitoring in infants with MLL-EPS15positive acute lymphoblastic leukemia // Pediatric Blood and Cancer.— 2009.—Vol. 55, N
5.—P. 853-854.— 42nd Annual Conference of International Society of Paediatric Oncology
(SIOP), Boston, USA, October 21-24, 2010
25.
G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, O. Kalennik, A. Kustanovich, O. Aleinikova, T. Riger,
Y.Yakovleva, A. Ivanova, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease
monitoring by quantification of fusion gene transcript in infant with MLL-rearranged acute
lymphoblastic leukemia by MLL-Baby protocol // Blood. – 2010. – Vol. 116, N 21. – P. 1126 –
Abstr. 2731. – 52nd Annual meeting of American Society of Hematology, Orlando, USA
December 4-7, 2010.
26.
A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, T. Riger, Y.Yakovleva, A. Ivanova, A. Druy, E.
Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Quantitative and qualitative concordance of minimal residual
disease monitoring by multicolor flow cytometry and PCR of fusion gene transcript in
childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia // Blood. – 2010. – Vol. 116, N 21. –
P. 720 – Abstr. 1720. – 52nd Annual meeting of American Society of Hematology, Orlando,
48
USA December 4-7, 2010.
27.
А.М. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина
Определение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и
выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР у детей с острым лимфобластным
лейкозом из В-линейных предшественников: результаты сравнения методов //
Онкогематология. – 2011. – №2. – С.48-49. – VII Российский симпозиум «Биологические
основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва 1-3 июня,
2011
28.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Каленник, А.М. Кустанович, О.В.
Алейникова, Т.О.Ригер, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина Прогностическое
значение определения минимальной остаточной болезни выявлением химерных
транскриптов у детей первого года жизни, получавших терапию по протоколу MLL-Baby
// Онкогематология. – 2011. – №2. – С.54-55. – VII Российский симпозиум
«Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний»,
Москва 1-3 июня, 2011
29.
Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, А.М. Попов, О.И. Сокова, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко,
Е.В. Волочник, А.С. Иванова, О.В Каленник, Н.П. Кирсанова, К.Л. Кондратчик, А.М.
Кустанович, Е.C. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В.
Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, А.В. Попа, Т.О. Ригер,
Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина Результаты
цитогенетической и молекулярно-генетической диагностики острых лейкозов у детей
первого года жизни // Онкогематология. – 2011. – №2. – С.55. – VII Российский
симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических
заболеваний», Москва 1-3 июня, 2011
30.
G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, O. Kalennik, A. Kustanovich. O Alienikova, T. Riger, A.
Ivanova, O. Streneva, E. Shorikov. A. Solodovnikov, L. Saveliev, L. Fechina Prognostic
significance of minimal residual disease detected by PCR for fusion gene transcripts in infants
with acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-Baby protocol // Hematologica. — 2011.
— Vol.238, Suppl. 2. —P.241. — Abstr. # 0563. — 16th Congress of the European
Hematology Association, London, United Kingdom, June 9-12, 2011.
31.
A. Popov, T. Verzhbitskaya, G. Tsaur, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Applicability of
NG2 for flow cytometric minimal residual disease monitoring in infants with MLL-rearranged
acute lymphoblastic leukemia // Hematologica. — 2011. — Vol.238, Suppl. 2. — P.243. —
Abstr. # 0568. — 16th Congress of the European Hematology Association, London, United
Kingdom, June 9-12, 2011.
32.
Г.А. Цаур, А.М.Попов, Т.О.Ригер, А.С. Иванова, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И.
49
Савельев, Л.Г. Фечина Химерные гены в диагностике и определении минимальной
остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом // Медицинская
генетика.— 2011.— №10. — С.24, «Актуальные вопросы онкогенетики», Москва, 26-27
октября 2011
33.
Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, А.М. Попов, О.И. Сокова, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко,
Е.В. Волочник, А.С. Иванова, О.В Каленник, Н.П. Кирсанова, К.Л. Кондратчик, А.М.
Кустанович, Е.C. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В.
Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, А.В. Попа, Т.О. Ригер,
Л.И.
Савельев,
О.В.
Стренева,
М.В.
Стригалева,
Е.В.
Шориков,
Л.Г.Фечина
Цитогенетическая и молекулярно-генетическая характеристика острых лейкозов у детей
первого года жизни // Клиническая онкогематология: фундаментальные исследования в
клинической практике.— 2011.— Том 4, №2. — С.134-141
34.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, О.В. Алейникова, Э.Г. Бойченко, Т.Ю. Вержбицкая, Е.В.
Волочник, А.С. Иванова, О.В Каленник, С.Ю. Ковалев, К.Л. Кондратчик, А.М.
Кустанович, Е.C. Лапотентова, Д.В. Литвинов, И.С. Мартынкевич, Н.В. Мякова, Т.В.
Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В. Ольшанская, О.М. Плеханова, А.В. Попа, Т.О. Ригер,
Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, И.В. Шмунк, Е.В. Шориков, Л.Г.Фечина
Характеристика перестроек 11q23 (MLL) у детей первого года жизни с острым
лимфобластным лейкозом / / Онкогематология.— 2011.— №3. — С.57-64.
35.
G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, A.Kustanovich, O. Kalennik, , O. Aleinikova, T. Riger, A.
Demina, E. Shorikov, O. Streneva, A. Solodovnikov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina
Prognostic Significance of Fusion Gene Transcripts Assessment for Minimal Residual Disease
Monitoring in MLL-Rearranged Infant Acute Lymphoblastic Leukemia Within MLL-Baby
Trial // Haematologica Vol. 97 е-Supplement, 2012 pр. 524-525, June, 2012
36.
А.М. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев,
Л.Г. Фечина Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза у
детей первого года жизни // Онкогематология.-2012.-№ 2.- с. 14-21
37.
/ А.М. Попов, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, С.В. Цвиренко, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина
Сравнение
результатов
минимальной
остаточной
болезни
методом
проточной
цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе полимеразной цепной реакции
при ОЛЛ у детей // Гематологий и транфузиология.-2012.- №3.- с.20
38.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Коленник, А.М. Кустанович, О.В.
Алейникова, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И.
Савельев, Л.Г. Фечина Мониторинг химерных транскриптов с участием гена МLL для
оценки прогностического значения минимальной остаточной болезни при остром
лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу
50
MLL-baby // Гематология и трансфузиология.-2012.- №3.- с.27
39.
Prognostic significance of minimal residual disease monitoring by MLL fusion gene transcripts
in infant acute lymphoblastic leukemia within MLL-Baby trial / G. Tsaur, A. Popov, T.
Nasedkina, A.Kustanovich, O. Kalennik, O. Aleinikova, T. Riger, A. Solodovnikov, O.
Streneva, E. Shorikov, T. Tsvirenko, L. Saveliev, L. Fechina // Clinical Chemistry. — 2012. —
Vol. 58, N 10, Suppl. — A41.— Abstract #А145, American Association of Clinical Chemistry
2012 Annual Meeting, Los Angeles, USA, July 15-19, 2012
40.
Г.А. Цаур, О.М. Плеханова, Т.Л. Гиндина, Ю.В. Ольшанская, А.М. Попов, Е.В.
Волочник, А.Н. Казакова, А.М. Кустанович, С. Mayer, R. Marschalek, И.С. Мартынкевич,
Л.С. Мартыненко, Е.Н. Матвеева, В.А. Овсепян, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.И.
Соколова, О.В. Стренева, Е.В. Флейшман, Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина Применение
метода флуоресцентной гибридизации in situ для выявления перестроек гена MLL при
острых лейкозах у детей первого года жизни // Медицинская генетика.-2012.-№ 7.- C. 3545
41.
А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина
Алгоритм
применения
проточной
цитометрии
для
мониторинга
минимальной
остаточной болезни при CD10-негативном остром лимфобластном лейкозе из Влинейных предшественников // Вопросы диагностики в педиатрии.- 2012.-№5.-С.31-36
42.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, Т.В. Наседкина, О.В. Каленник, А.М. Кустанович, О.В.
Алейникова, А.Г. Солодовников, Т.О. Ригер, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И.
Савельев, Л.Г. Фечина Прогностическое значение минимальной остаточной болезни,
определенной путем выявления химерных транскриптов у детей первого года жизни,
больных острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколу MLLBaby // Гематология и трансфузиология – 2012 - Т. 57, №4- С.12-22
43.
G. Tsaur, A. Popov, T. Nasedkina, O. Kalennik, A. Kustanovich, O. Aleinikova, T. Riger, A.
Demina, O. Streneva, A. Solodovnikov, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Prognostic
Significance of MLL Fusion Gene Transcripts (FGT) Monitoring As Marker of Minimal
Residual Disease (MRD) in Infant Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) // Pediatric Blood
& Cancer. — Volume 59, Issue 6. — P.1026. 44th Annual conference of International Society
of Paediatric Oncology (SIOP), London, United Kingdom, October 5-8, 2012
44.
G. Tsaur, A. Popov, E. Fleishman, O. Sokova, A. Demina, T.Gindina, O. Kalennik, A.
Kustanovich, I. Martynkevich, T. Nasedkina, Y. Olshanskaya, V. Ovsepyan, O. Plekhanova, T.
Riger, L. Saveliev, I. Shmunk, E. Shorikov, O.Streneva, M. Strigaleva, T. Verzhbitskaya, A.
Volochnik, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina MLL Gene Rearrangements in 174 Infants
with Acute Leukemia // Blood– 2012. – Vol. 120, N 21. – Abstr. # 2537. – 54th ASH Annual
Meeting and Exposition, Atlanta, USA, 8-11 December, 2012
51
45.
G. Tsaur, O. Plekhanova, A. Popov, T.Gindina, Y. Olshanskaya, A. Volochnik, A. Kazakova,
A.Kustanovich, I. Martynkevich, L. Martynenko, E. Matveeva, V. Ovsepyan, T. Riger, L.
Saveliev, E. Shorikov, E. Fleishman, O. Sokova, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina
Molecular Genetic Characterization of 3’-Deletion of MLL Gene in Infant Acute Leukemia //
Blood– 2012. – Vol. 120, N 21. – Abstr. # 2498. – 54th ASH Annual Meeting and Exposition,
Atlanta, USA, 8-11 December, 2012
46.
A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, O.Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina
Immunophenotypic Investigation of Infant Acute Lymphoblastic Leukemia / // Blood– 2012. –
Vol. 120, N 21. – Abstr. # 2457. – 54th ASH Annual Meeting and Exposition, Atlanta, USA, 811 December, 2012
47.
Цаур Г.А, Флейшман Е.В., Плеханова О.М., Сокова О.И., Попов А.М., Алейникова О.В.,
Волочник Е.В., Каленник О.В., Калинина И.И., Качанов Д.Ю., Кирсанова Н.П.,
Кустанович А.М., Наседкина Т.В., Ольшанская Ю.В., Попа А.В., Ригер Т.О., Савельев
Л.И., Стренева О.В., Шелихова Л.Н., Meyer C., Marschalek R.,
Фечина Л.Г. Редкие
перестройки хромосомного района 11q23 и гена MLL при острых лейкозах у детей
первого года жизни // Вопросы диагностики в педиатрии.- 2012.-№6.-С.16-24.
48.
Г.А. Цаур, Е.В. Флейшман, Т.Л. Гиндина, О.М. Плеханова, А.М. Попов, О.И. Сокова,
О.В. Алейникова, Е.В. Волочник, А.С. Демина, О.В. Каленник, И.И. Калинина, Н.П.
Кирсанова, К.Л. Кондратчик, А.М. Кустанович, Т.В. Наседкина, В.А. Овсепян, Ю.В.
Ольшанская, А.В. Попа, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.В. Стренева, М.В. Стригалева, Е.В.
Шориков, C. Meyer, R. Marschalek, Л.Г.Фечина Характеристика перестроек 11q23/MLL
при острых миелоидных лейкозах у детей первого года жизни //Клиническая
онкогематология. — 2012. — Том 5, №4. — С.365-370.
49.
G. Tsaur, E. Fleischman, A. Popov A. Kustanovich, Y. Olshanskaya, O. Plekhanova, T.
Nasedkina, I. Martynkevich, V. Ovsepyan, A. Volochnik, T. Gindina, T. Riger, A. Demina, O.
Sokova, E. Shorikov, C. Meyer, R. Marschalek, L. Saveliev, L Fechina Distribution of MLL
gene rearrangements in a large cohort of infant acute lymphoblastic leukemia and infant acute
myeloid leukemia patients // Haematologica. — 2013. — Vol. 98, Supplement 1. — P. 263 —
Abs # 622. 18th Congress of the European Hematology Association, Stockholm, Sweden, June
13-16, 2013.
50.
G. Tsaur, O. Plekhanova, T. Gindina, A. Popov, Y. Olshanskaya, A. Volochnik, A. Kazakova,
A. Kustanovich, I. Martynkevich, L. Martynenko, E. Matveeva, V. Ovsepyan, E. Fleischman,
O. Sokova, T.Riger, L. Saveliev, E. Shorikov, C. Meyer, R. Marschalek, L. Fechina Incidence
and prognostic significance of 3’-MLL deletion in infant acute leukemia // Pediatric Blood &
Cancer. — Volume 60 Issue S3. — P.63-64. 45th Annual conference of International Society of
Paediatric Oncology (SIOP), Hong Kong, China, September 25-28, 2013
52
51.
A. Naiel, M. Vetter , O. Plekhanova, E. Fleischman, O. Sokova, G. Tsaur, J. Harbott, S. Tosi
A Novel Three-Colour Fluorescence in Situ Hybridization Approach for the Detection of
t(7;12)(q36;p13) in Acute Myeloid Leukaemia Reveals New Cryptic Three Way Translocation
t(7;12;16) / Cancers. -2013.-N 5. - P.281-295
52.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, О.М. Плеханова, А.М. Кустанович, О.В. Алейникова, Т.Л.
Гиндина, А.С. Демина, А.Е. Друй, С.Ю. Ковалев, К.Л. Кондратчик, А.В. Мисюрин, Н.В.
Мякова, Т.О. Ригер, Л.И. Савельев, О.И. Сокова, О.В. Стренева, М.В. Сучкова, Ю.П.
Финашутина, Е.В. Флейшман, Е.В. Шориков, Р.И. Юцкевич C. Meyer, R. Marschalek,
Л.Г.Фечина Транслокация t(1;11)(p32;q23) с образованием химерного гена MLL-EPS15
при острых лейкозах: обзор литературы и описание 6 случаев. Подходы к
мониторированию минимальной остаточной болезни // Онкогематология.-2013.-№ 1.-С.
17-33.
53.
А.М. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая, О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев,
Л.Г. Фечина Иммунофенотипическая характеристика острого миелоидного лейкоза у
детей первого года жизни // Онкогематология.-2013.-№ 1.-С.33-40.
54.
G. Tsaur, C. Meyer, A. Popov, O. Plekhanova, A. Kustanovich, A.Volochnik, T. Riger, A.
Demina, A. Druy, E. Fleischman, O. Sokova, Y, Olshanskaya, O. Streneva, E. Shorikov, L.
Saveliev, R. Marschalek, L. Fechina MLL genomic DNA Breakpoints In Infant Acute
Leukemia // Annual meeting of American Society of Hematology (ASH), New Orleans, USA,
December 06-10, 2013, Abstract 1350
55.
Г.А. Цаур, C. Meyer, А.М. Попов, О.М. Плеханова, А.М. Кустанович, Е.В. Волочник,
Т.О. Ригер, А.С. Демина, А.Е Друй, Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, Ю.В. Ольшанская,
О.В. Стренева, Е.В. Шориков, Л.И. Савельев, R. Marschalek, С.И. Куцев, С.В. Цвиренко,
Л.Г. Фечина Исследование структуры химерных генов с участием гена MLL при острых
лейкозах у детей первого года жизни / // Гематология и трансфузиология. 2014. т. 59. №
1. С. 29-37.
56.
Г.А. Цаур., А.М. Попов, Т.В. Наседкина, А.М. Кустанович, ТО. Ригер., О.В. Стренева,
Е.В. Шориков, А.Г. Солодовников, Л.И. Савельев, Л.Г. Фечина. Сравнение костного
мозга и периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни при
остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих терапию по
протоколу MLL-baby // Гематология и трансфузиология. 2014. Т. 59. № S1. С. 70, II
Конгресс гематологов России, Москва, 17-19 апреля 2014
57.
A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, O. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina
Immunophenotypic studies in infant acute leukemia // Haematologica. 2014. Vol. 99,
Supplement 1. — Abstract S1313. 19th Congress of the European Hematology Association,
Milan, Italy, June 12-15, 2014.
53
58.
G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A. Kustanovich, O. Aleinikova,
E. Shorikov, O. Streneva, L. Saveliev, L. Fechina Comparison of bone marrow and peripheral
blood samples for minimal residual disease monitoring in infants with MLL-rearranged acute
lymphoblastic leukemia treated by MLL-baby protocol // Haematologica. 2014. Vol. 99,
Supplement 1. — Abstract P121. 19th Congress of the European Hematology Association,
Milan, Italy, June 12-15, 2014.
59.
Г.А. Цаур, А.М. Попов, А.М. Кустанович, Т.В. Наседкина, О.В. Алейникова, Т.О. Ригер,
А.Г. Солодовников, О.В. Стренева, Л.И. Савельев, Е.В. Шориков, Л.Г. Фечина
Использование периферической крови и костного мозга для оценки минимальной
остаточной болезни у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом и
наличием перестроек гена MLL при терапии по протоколу MLL-Baby / // Российский
журнал детской гематологии и онкологии. 2014, №2 С.56, V Межрегиональное
совещание Национального общества детских гематологов и онкологов «Достижения и
перспективы детской гематологии-онкологии», Москва, 5-8 июня 2014
60.
Г.А. Цаур, C. Meyer, А.М. Попов, А.М. Кустанович, Т.О. Ригер, А.С. Демина, А.Е Друй,
Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, Ю.В. Ольшанская, О.В Стренева, Е.В. Шориков, Л.И.
Савельев, R. Marschalek, С.В. Цвиренко, Л.Г.Фечина Изучение структуры химерных
генов с участием гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни // Вестник
гематологии, 2014, том X, № 2, C. 96-97. Всероссийская научно-практическая
конференция с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и
трансфузиологии», Санкт-Петербург, 24-25 июня 2014 г.
61.
G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, T. Nasedkina, A. Solodovnikov, A. Kustanovich, O. Aleinikova,
O. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Application of bone marrow (BM) and
peripheral blood (PB) for minimal residual disease (MRD) monitoring in infants with MLLrearranged ALL enrolled into MLL-baby protocol // Pediatric Blood and Cancer. 2014 Vol. 61,
Issue S2, P. S140, Abstract 0-131, 46th Congress of the International Society of Paediatric
Oncology (SIOP) 2014, Toronto, Canada 22nd–25th October, 2014
62.
G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A. Kustanovich, , S. Tsvirenko,
O. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina Concordance and prognostic significance of
minimal residual disease detection in peripheral blood and bone marrow samples of infants
with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-baby protocol // Blood,
2014 Vol. 124, Issue 21, Abstract 2404, Annual meeting of American Society of Hematology
(ASH), San Francisco, USA, December 06-09, 2014
63.
A. Popov, G. Tsaur, T. Verzhbitskaya, O. Streneva, E. Shorikov, L. Saveliev, L. Fechina
Tumor Cells’ Immunophenotype Predicts the Presence of MLL Gene Rearrangements in Infant
Acute Leukemia // Annals of Hematology. – 2015. – Vol.94, Suppl.1.–S.96.; Abstract 67 –
54
International Symposium «Acute Leukemias XV. Biology and Treatment Strategies», Munich,
Germany, February 22-25, 2015.
64.
G. Tsaur, A. Popov, T. Riger, A. Solodovnikov, T. Nasedkina, A.Kustanovich, O. Aleinikova,
E. Shorikov, O. Streneva, L. Saveliev, L. Fechina Minimal residual disease in peripheral blood
and bone marrow of infants with MLL-rearranged acute lymphoblastic leukemia. concordance
and prognostic significance // Annals of Hematology. – 2015. – Vol.94, Suppl.1.–S.96.;
Abstract 70 - International Symposium «Acute Leukemias XV. Biology and Treatment
Strategies», Munich, Germany, February 22-25, 2015.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
БСВ — бессобытийная выживаемость
ДИ-ПЦР — длинная инвертированная полимеразная цепная реакция
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
КМ — костный мозг
ОБфЛ — острый бифенотипический лейкоз
ОВ — общая выживаемость
ОЛ — острый лейкоз
ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз
ОМЛ — острый миелоидный лейкоз
ОНдЛ — острый недифференцированный лейкоз
ОТ — реакция обратной транскрипции
ОТ-ПЦР — обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
п.н. — пара нуклеотидов
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени
РНК — рибонуклеиновая кислота
ПК — периферическая кровь
ТН — точка наблюдения
ЦНС — центральная нервная система
CD — кластер дифференцировки
FAB — франко-американо-британская классификация морфологических вариантов острых
лейкозов
FISH — флуоресцентная гибридизация in situ
ROC —анализ характеристических кривых