1 Министерство здравоохранения Российской Федерации
advertisement
1 Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Читинская государственная медицинская академия На правах рукописи Изместьев Сергей Валерьевич ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОМПЕНСАЦИИ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИИ (Клинико-экспериментальное исследование) 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель д.м.н., профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Чита – 2013 г. 2 Оглавление Стр. Введение ………………………………………………………………. 5 Глава 1 Роль гипергомоцистеинемии в патологии (Обзор литературы)…………………………………………………………… 11 1.1 Гомоцистеин, его метаболизм и роль в патологии человека 11 1.2 Роль модифицированных гомоцистеином белков в развитии атеросклероза ………………………………………… 1.3 Нагрузочный метиониновый тест для 18 выявления гипергомоцистеинемии ………………………………………… 29 Глава 2 Материалы и методы исследования …………………….. 36 2.1 Получение комплекса альбумина с гомоцистеином ……… 36 2.2 Изучение аутоантител к комплексу крысиного альбумина с гомоцистеином и уровня гомоцистеина …………………….. 36 2.3 Определение циркулирующих иммунных комплексов ….. 41 2.4 Изучение морфологических изменений тканей миокарда и показателей периферической крови …………………………… 41 2.5 Изучение экспрессии тканевого фактора на фоне гипергомоцистеинемии ………………………………………… 42 2.6 Описание исследованных групп пациентов ……………… 43 2.7 Определение аутоантител, уровня гомоцистеина и циркулирующих иммунных комплексов ………………………. 45 2.8 Проведение метионинового нагрузочного теста …………. 46 2.9 Статистическая обработка результатов ……………………. 47 Глава 3 Некоторые сведения о патогенном действии гомоцистеина и его элиминации (Результаты собственных исследований)…………………………………………………………. 3.1 Результаты экспериментального исследования …………… 48 48 3 3.1.1 Получение модифицированного белка …………… 48 3.1.2 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у интактных крыс …………………………………………… 50 3.1.3 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у крыс с иммунодефицитом ……………………………………….. 52 3.1.4 Изменения иммунного статуса у крыс на фоне введения гомоцистеина ………………………………….. 58 3.1.5 Уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных крыс………………………………… 3.1.6 Изменения периферической в крови морфологии у миокарда животных на и фоне гипергомоцистеинемии ………………………………….. 3.1.7 Экспрессия тканевого 61 фактора 63 у экспериментальных животных ………………………….. 70 3.2 Результаты исследования больных сердечно-сосудистой патологией ……………………………………………………….. 3.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител 72 к модифицированному альбумину и тромбину …………... 72 3.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы у больных сердечно-сосудистой патологией……………………….. 74 3.2.3 Результаты проведения корреляционного анализа между исследованными показателями …………………. 76 3.2.4 Метиониновый нагрузочный тест с определением уровня гомоцистеина в ротовой жидкости …………….. 78 Глава 4 Обсуждение полученных результатов …………………… 81 4.1 Обсуждение результатов экспериментального исследования ……………………………………………………. 4.1.1 Уровень гомоцистеина и титр аутоантител к 81 4 модифицированному альбумину ………………………… 81 4.1.2 Показатели иммунитета, форменные элементы крови и морфологические изменения миокарда у экспериментальных животных ………………………….. 84 4.2 Обсуждение результатов исследования больных сердечнососудистой патологией …………………………………………. 4.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител 89 к модифицированному альбумину и тромбину ………….. 89 4.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы …………. 91 4.2.3 Метиониновый нагрузочный тест ………………… 92 Выводы …………………………………………………………………. 95 Список сокращений…………………………………………………… 97 Список литературы …………………………………………………… 99 5 Введение Актуальность проблемы Известно, что в качестве одного из независимых факторов риска атеросклероза коронарных, церебральных и других сосудов, наряду с гиперхолестеринемией, курением, избыточной массой тела и т.д., рассматривают повышенный уровень гомоцистеина, который инициирует повреждение эндотелиальных клеток и тем самым запускает процесс образования атеросклеротической бляшки [27, 40, 41, 42, 44, 45, 65, 91, 93]. Более того, согласно многочисленным исследованиям, гомоцистеин является причиной тромбоза с последующим развитием фатальных катастроф в различных отделах сосудистой системы [10, 13, 28, 36, 38, 49, 50, 69]. Гипергомоцистеинемия приводит к развитию патологии беременности [16]. Однако в последнее время в литературе появились сведения о том, что действие этого аминотиола не ограничивается повреждением эндотелия с запуском атеротромбоза. Описана способность гомоцистеина связываться с особой группой глутаматных рецепторов, имеющихся на мембранах нейронов и ряда других клеток [7, 63]. Влияние гомоцистеина при этом сопровождается развитием окислительного стресса, повреждением и гибелью клетки, что вносит свой вклад в общую картину патогенного действия этой аминокислоты. Наряду со сказанным известно, что метаболит данной аминокислоты гомоцистеин-тиолактон обладает выраженной способностью образовывать химически прочные связи с белками организма с модификацией последних [126]. Известно, что сам гомоцистеин также комплексируется с белками плазмы крови, особенно, с альбумином [152]. Не исключено, что комплексы альбумина с гомоцистеином и альбумина с гомоцистеинтиолактоном обладают аутоантигенными свойствами и вызывают 6 образование аутоантител [54, 81]. Сформированные иммунные комплексы могут явиться как фактором повреждения эндотелия, так и дополнительным механизмом элиминации высоких доз гомоцистеина. Данный вопрос в доступной нам литературе до настоящего времени освещен не достаточно. Кроме того, сопровождается хорошо усилением известно, что коагуляционного гипергомоцистеинемия потенциала крови и позитивными тестами генерации тромбина [50]. Тромбин, с одной стороны, способен вызывать тромбообразование, а с другой, явиться причиной образования аутоантител [43]. До настоящего времени актуален вопрос об эффективном и своевременном выявлении гипергомоцистеинемии у лиц с риском развития сердечно-сосудистой патологии. Для здоровых лиц нормальной концентрацией гомоцистеина в сыворотке крови, взятой натощак, считают 5 – 15 мкмоль/л [12]. При явной гипергомоцистеинемии, развивающейся при генетических и негенетических нарушениях метаболизма гомоцистеина, повышение его уровня выявляется утром, до приема пищи. Однако приблизительно у 50% обследуемых с нормальным уровнем гомоцистеина существуют скрытые нарушения его метаболизма. Причем отмечено, что латентные нарушения обмена гомоцистеина с нормальным исходным уровнем чаще отмечаются у наиболее клинически тяжелых больных. Гомоцистеин не входит в состав белков, потребляемых с пищей, а образуется в организме при деметилировании метионина, поэтому для диагностики скрытой гипергомоцистеинемии у больных с нормальным базальным уровнем гомоцистеина используют нагрузочный тест с метионином (определение толерантности к метионину) [19, 56, 131]. Применение теста показано пациентам, у которых нормальный уровень гомоцистеина, но имеются другие факторы риска сердечно-сосудистых 7 заболеваний. Данная проба является информативной, но предполагает двух- или многократный забор венозной крови в течение суток. Существуют различные схемы проведения метионинового теста, в которых гомоцистеин рекомендуется определять спустя 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч, или только через 2 и 4, или 4 и 6, или 4 и 8 часов [70, 131]. В связи с этим мы считаем актуальным создание неинвазивной технологии проведения метионинового теста с исследованием уровня гомоцистеина в смешанной слюне (ротовой жидкости). Несмотря на достаточно обширные литературные сведения до сих пор остаются малоизвестными механизмы элиминации гомоцистеина в норме и патологии, что и составило предмет нашего исследования. Цель исследования. Изучение иммунных механизмов элиминации гомоцистеина при гипергомоцистеинемических состояниях. Задачи исследования. 1. Получить конъюгат сывороточного альбумина человека и крысы с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном (модифицированный альбумин). 2. Определить уровень гомоцистеина и аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном у интактных крыс и животных с экспериментальным иммунодефицитом. 3. Изучить морфологические изменения миокарда и количественные показатели гемограммы у крыс на фоне гипергомоцистеинемии. Оценить экспрессию тканевого фактора у животных при высокой концентрации гомоцистеина. 4. Определить содержание гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину в сыворотке крови и смешанной слюне у здоровых лиц и больных сердечно-сосудистой патологией. 8 5. Изучить уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных животных и человека. 6. Исследовать динамику концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости при проведении метионинового нагрузочного теста. Научная новизна Получен комплекс сывороточного альбумина крысы и человека с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном в условиях in vitro. Впервые установлено, что у животных при введении в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона уровень общего гомоцистеина плазмы крови остается на исходном уровне на фоне резкого повышения титра аутоантител к модифицированному альбумину. При моделировании гуморального иммунодефицита у крыс выявлено резкое увеличение как исходного уровня общего гомоцистеина в плазме крови, так и после введения в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеинтиолактона. Установлены корреляционные взаимосвязи между уровнями гомоцистеина, аутоантител к модифицированным гомоцистеином белкам и циркулирующих иммунных комплексов у лиц с сердечно-сосудистой патологией. Впервые выполнен анализ уровня гомоцистеина в ротовой жидкости пациентов при проведении метионинового нагрузочного теста, что позволяет избежать многократного инвазивного вмешательства, связанного с забором крови. Теоретическая значимость работы состоит в обнаружении механизма элиминации гомоцистеина при повышении его уровня в организме путем развития гуморального иммунного ответа с образованием 9 аутоантител к белкам, модифицированным гомоцистеином и гомоцистеинтиолактоном. Положения, выносимые на защиту 1. Иммунная система способна регулировать уровень общего гомоцистеина в плазме крови в пределах физиологических значений путем образования аутоантител против комплекса гомоцистеина с сывороточным альбумином. 2. При физиологических гипергомоцистеинемии значениях уровня происходит гомоцистеина сенсибилизация и к модифицированным гомоцистеином белкам, образованные антитела класса S-IgA поступают в секреты, в том числе, в ротовую жидкость, что обеспечивает быструю элиминацию гомоцистеина, и может быть зарегистрировано при проведении нагрузочного метионинового теста. 3. Гомоцистеин оказывает токсическое действие на клетки и структуры организма, несущие на поверхности NMDA-рецепторы, через активацию последних, и усиление экспрессии тканевого фактора в эндотелиоцитах, но не в фибробластах и нейтрофилах. Апробация работы Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медикобиологический конгресс» г. Барнаул, 2011 г.; III Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2011 г.; IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» г. Новосибирск, 2012 г.; Научно-практической конференции «I Съезд терапевтов Забайкальского края» г. Чита, 2013 г.; V Международной 10 научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт» г. Чита, 2013 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» г. Чита, 2013 г. Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 в ведущих рецензируемых научных журналах, входящих в список, определенный ВАК для публикации результатов работ на соискание ученой степени кандидата и доктора наук. Структура и объем диссертации Работа изложена на 117 страницах печатного текста, включает введение, 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводы, список литературы. Диссертация содержит 18 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 50 отечественных и 114 зарубежных источников. 11 Глава 1 Роль гипергомоцистеинемии в патологии (Обзор литературы) 1.1 Гомоцистеин, его метаболизм и роль в патологии человека Как известно, заболевания сердечно-сосудистой системы, связанные с развитием атеросклероза и тромбоза коронарных и мозговых сосудов, занимают первое место среди причин смертности человека. В качестве одного из независимых факторов риска атеросклероза и тромбоза коронарных, церебральных и других сосудов, наряду с гиперхолестеринемией, курением, избыточной массой тела и т. д., рассматривают повышенный уровень гомоцистеина [24, 25, 46, 47, 87]. Гипергомоцистеинемию выявляют у больных ИБС, и оценивают как маркер развития этого заболевания [1, 14, 34, 37, 40, 41, 60, 67, 68, 86, 131]. Гомоцистеин (Нсу) – это серосодержащая аминокислота (аминотиол), не входящая в состав белков, потребляемых с пищей, а образующаяся в клетках организма как промежуточный продукт превращения (деметилирования) метионина в цистеин. Реакция деметилирования метионина – необходимый метаболический процесс, так как в ходе этого промежуточным продуктом также является S-аденозилметионин – главный источник метильных групп при синтезе многих соединений (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеиновых кислот, белков и др.) (рис. 1). Потребление метильных групп в организме усиливается при регенерации и росте тканей, поэтому источниками гомоцистеина в плазме крови выступают в большей степени пролиферирующие клетки. Метаболизм гомоцистеина протекает преимущественно в печени и почках двумя основными путями: реметилирование с образованием метионина (подвергается около 50% гомоцистеина) и транссульфирование с превращением в цистеин. 12 Реакцию реметилирования метионинсинтетаза, донором катализирует метильной группы фермент выступает 5- метилтетрагидрофолат, образующийся из тетрагидрофолата под действием (МТГФР), 5-10-метилентетрагидрофолатредуктазы фермента является переносчиком метильной метилкобаламин метильной производное группы (производное группы для витамина в витамина реакции кофактором В 2. Промежуточным этой реакции В12). Другим реметилирования этого выступает источником служит бетаин (производное глицина). В данном случае реакция катализируется ферментом бетаин-гомоцистеин-метилтрансферазой (рис. 1) [47; 79, 129]. Другой путь метаболизма – транссульфирование, при котором гомоцистеин конденсируется с серином с образованием цистатионина. Ферментом этого пути является цистатионин-β-синтетаза (ЦβС), содержащая в качестве кофермента пиридоксальфосфат (производное витамина В6) [46]. Цистатионин далее подвергается гидролизу с образованием цистеина (Cуs). 13 Рис. 1. Схема метаболизма гомоцистеина Таким образом, в основе повышения уровня гомоцистеина в организме лежит недостаточная активность ферментов, осуществляющих метаболизм этого соединения: бетаингомоцистеинметилтрансферазы, метионинсинтетазы, цистатион-β-синтетазы и метилентетрагидрофолатредуктазы. Причины данной недостаточности подразделяют на наследственные и приобретенные. Наследственными причинами могут являться либо генетический дефект (или полиморфизм) ферментов [129], либо генетические нарушения метаболизма витаминов группы В (В6, В12, В2) и фолиевой кислоты, так как они являются кофакторами в метаболизме метионина [107, 153]. 14 Приобретенные причины заключаются в недостатке в пище соответствующих витаминов, нарушении их всасывания (синдром мальабсорбции) [28, 95, 112, 135]. Кроме того, гипергомоцистеинемия может развиться вследствие нарушения процессов метаболического превращения гомоцистеина. Утилизация гомоцистеина осуществляется в значительной степени почками, в которых протекают описанные выше пути метаболизма, поэтому умеренная гипергомоцистеинемия обнаруживается у больных с почечной недостаточностью [113]. Выделение гомоцистеина с мочой крайне незначительно из-за связывания его в плазме крови с белками и реабсорбции. Повышению уровня гомоцистеина способствуют: возраст, мужской пол, курение, потребление алкоголя и кофе, низкая физическая активность, стресс, вегетарианство, а прием витаминов, сбалансированное питание, беременность способствуют снижению его концентрации [22, 50, 82, 130]. Возрастание уровня гомоцистеина вызывает прием ряда лекарственных препаратов. Метотрексат является антагонистом фолиевой кислоты, противосудорожные препараты уменьшают депо фолиевой кислоты в печени, закись азота – инактивирует витамин В12, тем самым нарушая реметилирование гомоцистеина [83], уровень гомоцистеина может увеличивать прием гормональных контрацептивов, теофиллина и др. [50]. Повышение концентрации гомоцистеина наблюдается при ряде заболеваний. Прежде всего это, как уже сказано, почечная недостаточность и заболевания ЖКТ, нарушающие всасывание необходимых витаминов, кроме того, сахарный диабет, псориаз, патология щитовидной железы [50]. Частота встречаемости гипергомоцистеинемии достаточно большая. По данным лаборатории свертывания крови РосНИИГТ у больных с артериальными тромбозами гопергомоцистеинемия выявлена в 56% случаев, при венозных тромбозах - в 46% случаев [49]. Повышенный 15 уровень гомоцистеина является независимым фактором риска, сочетание которого с курением, гиперхолестеринемией, артериальной гипертензией резко увеличивает вероятность развития тромбоза. Так, показано, что у пациентов с гипертонической болезнью и нормальным уровнем гомоцистеина риск развития артериального тромбоза увеличен в 3,8 раза, а у больных гипертонической болезнью с повышенным уровнем этой аминокислоты – в 10,8 раза [61, 66]. В циркуляции гомоцистеин находится в различных формах: связанный с белком (альбумином) – 70-85%, в окисленной до дисульфида форме – 15-30% и только 1-2% представлено в свободной форме [3, 4, 29, 67, 131]. Суммарное определение всех форм позволяет оценить уровень общего гомоцистеина в плазме крови. Для этой цели в клинической практике наиболее широко используются методы ВЭЖХ и ИФА [23, 139]. Для здорового взрослого человека нормальной концентрацией общего гомоцистеина в плазме крови большинство авторов считают 5–15 мкмоль/л [24, 50], при этом у мужчин обычно выше, чем у женщин репродуктивного возраста: у женщин 5 – 12 мкмоль/л, у мужчин 5 – 15 мкмоль/л [52]. У беременных женщин уровень гомоцистеина существенно ниже, чем у небеременных того же возраста. У детей концентрация гомоцистеина составляет примерно 5 мкмоль/л. В течение жизни уровень этой аминокислоты увеличивается у обоих полов. Рассчитан оптимальный интервал уровня гомоцистеина для разных возрастных категорий. У лиц до 30 лет он составляет 4,6–8,1 мкмоль/л; в возрасте от 30 до 59 лет – 4,5–7,9 мкмоль/л для женщин и 6,3–11,2 мкмоль/л для мужчин. Для лиц старше 60 лет – 5,8–11,9 мкмоль/л [149]. При этом в изученной нами литературе не дается объяснение повышения с возрастом концентрации гомоцистеина. Гипергомоцистеинемию условно делят на легкую (или умеренную) – 15–30 мкмоль/л; среднюю – 30–100 мкмоль/л и тяжелую – более 100 мкмоль/л [50]. Однако, у лиц старше 50 лет при наличии факторов риска 16 концентрацию рассматривать гомоцистеина как 10–12 умеренную мкмоль/л рекомендуется гипергомоцистеинемию [46, 79]. Установлено, что не менее чем 10% людей в общей популяции имеют умеренное повышение уровня гипергомоцистеинемию и гомоцистеина, – 0,02% 1% – тяжелую. среднюю Умеренная гипергомоцистеинемия развивается чаще всего при дефиците витаминов группы В и фолатов в продуктах питания, при наличии рассмотренных выше вредных привычек, почечной недостаточности. Гипергомоцистеинемия средней степени развивается, как правило, при наличии мутации С677Т в гене фермента МТГФР. Тяжелая гипергомоцистеинемия возникает обычно у лиц с гомозиготной мутацией гена ЦβС. В настоящее время приняты показания к исследованию в крови больных уровня гомоцистеина с целью выявления степени тромбогенного риска и прогнозирования возможных осложнений сердечно-сосудистых заболеваний, а также для контроля за эффективностью проводимой гомоцистеинкоррегирующей терапии [29]. Существует множество работ, посвященных исследованию патогенного действия гомоцистеина. Предположительных механизмов повреждающего эффекта гипергомоцистеинемии описано в настоящее время также довольно много. Прежде всего, стоит выделить окислительное повреждение эндотелия в результате аутоокисления молекулы гомоцистеина с образованием свободных радикалов [129] и снижения активности глютатионпероксидазы [79]. Изучен эффект снижения под действием гомоцистеина выработки оксида азота – вазодилататора и антиагреганта, что приводит к сужению сосудов и развитию дисфункции эндотелия [72, 73, 79, 137]. К патогенным эффектам высокого уровня гомоцистеина относят также стимуляцию пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, активацию коагуляционного гемостаза, усиление 17 агрегации тромбоцитов [92, 134]. При гипергомоцистеинемии происходит повышение уровня тромбин-активируемого фибринолитического ингибитора (TAFI), что приводит к нарушению процесса фибринолиза [51, 134]. Таким образом, механизмы развития эндотелиальной дисфункции, атеросклероза и тромбоза в настоящее время изучены достаточно широко. Наряду с этим известно повреждающее действие высокой концентрации гомоцистеина на ряд клеток организма, в частности на кардиомиоциты [77, 104], лейкоциты [31], клетки клубочков и канальцев почек [15, 96, 143], нейроны [48, 163] и др., данное направление исследований является сравнительно новым. В 2003 году на основании проспективных исследований были опубликованы данные, согласно которым повышение концентрации гомоцистеина в плазме крови выше среднеполовых значений связано с более высокой частотой развития застойной сердечной недостаточности [142], существуют экспериментальные данные о развитии гипертрофии миокарда на фоне гипергомоцистеинемии [108]. При изучении влияния длительной гипергомоцистеинемии на функциональную активность миокардиоцитов учеными Бостонского университета показано развитие реактивного интерстициального фиброза тканей миокарда, что привело к снижению систолических показателей [76]. В то же время, ученные из Германии в своих экспериментах не обнаружили патологическое ремоделирование миокарда у крыс с экспериментальной гипергомоцистеинемией [94]. Исходя из этого, кардиотоксический детального изучения. эффект гипергомоцистеинемии требует более 18 1.2 Роль модифицированных гомоцистеином белков в развитии атеросклероза Вопрос о механизме атерогенного эффекта гомоцистеина продолжает оставаться актуальным. В последние годы выдвинута идея об аутоиммунном повреждении эндотелия сосудов при гипергомоцистеинемии. Суть которой заключается в том, что молекула гомоцистеина, вступая в химическую связь с белками организма модифицирует их и придает им аутоантигенные свойства (появление неоантигенов). Такие белки в зарубежной литературе называют гомоцистеинилированные [121, 123]. В организме гомоцистеин присутствует в различных формах: свободный гомоцистеин (около 1%); в виде дисульфидов Hcy-S-S-Cys или Hcy-S-S-Hcy (около 15%) и в виде дисульфидов, образованных с молекулой альбумина, обозначаемый как S-Hcy-альбумин (около 80%) [3, 24]. В образовании дисульфидной связи с гомоцистеином в молекуле сывороточного альбумина человека принимает участие свободная SHгруппа аминокислотного остатка Cys-34 (рис. 2) [85]. Рис. 2. Комплекс гомоцистеина с альбумином 19 Суммарное содержание этих форм определяется лабораторно и составляет общий гомоцистеин плазмы крови (tHcy). Способностью связывать гомоцистеин посредством образования дисульфидной связи обладают и другие белки плазмы крови, такие как трансферрин, фибронектин и др. Известно, что при гипергомоцистеинемии гомоцистеин связывается не только с альбумином (как у здорового человека), а также с глобулиновыми фракциями плазмы крови, в частности с α-2-макроглобулином. Причем связывание гомоцистеина с α-2- макроглобулином становится возможным после активации последнего, когда в молекуле белка освобождаются свободные тиоловые группы, и образуется соединение по типу S-Нсу-белок. При этом образуются более прочные дисульфидные соединения с белком, которые могут быть восстановлены только в более жестких условиях, чем другие дисульфиды, образующиеся при физиологической концентрации гомоцистеина [4]. Исходя из этого возможно, что при гипергомоцистеинемии такие соединения гомоцистеина не могут быть полностью элиминированы описанными выше предполагать, путями включение метаболизма. в данном Следовательно, случае системы можно иммуно- биологического надзора, с образованием аутоантител к связанным с гомоцистеином белкам, что составило предмет нашего исследования. Связывание возможно, имеет гомоцистеина значение гипергомоцистеинемии, в активированным патогенезе поскольку макроглобулином, атеросклероза активированный на фоне макроглобулин извлекается из кровотока макрофагами. Активированные макрофаги в большом количестве обнаруживаются при развитии атеросклероза. Этот факт, возможно, объясняет ускорение процесса атерогенеза за счет трансформации макрофагов [4]. В меньшей гомоцистеина, степени образуется обозначаемая как другая форма N-Hcy-белок связанного (или N- 20 гомоцистеинилированный белок). Рассмотрим как она образуется. Одной из особенностей обмена гомоцистеина, лежащей в основе его патогенного воздействия, является преобразование его в тиолактон (HCTL) [98, 116]. Это вещество, присутствующее в плазме крови человека, реакционноспособно в плане образования комплексов с белками организма, гомоцистеин-тиолактон модифицирует белки, формируя аддукты, обозначаемые как N-Hcy-белок [71, 86, 124, 140]. Гомоцистеин-тиолактон составляет примерно 1,4% от общего гомоцистеина плазмы крови. Преобразование гомоцистеина в тиолактон происходит в результате нарушения процесса биосинтеза белка, когда некоторые аминоацил-тРНК синтетазы (в частности метионил-тРНК синтетаза) ошибочно образуют связь с молекулой гомоцистеина вместо соответствующей аминокислоты (в частности метионина) [114, 120]. Схематически этот процесс можно представить в виде следующей реакции: AARS+Нсу+АТФ AARS×Нсу~АМФ+РРi Где AARS – аминоацил-тРНК синтетаза; РРi – неорганический пирофосфат. Далее Hсу~AMФ подвергается реакции, в которой происходит отщепление остатка АМФ с образованием тиолактона (рис. 3) [125]. Рис. 3. Образование гомоцистеин-тиолактона 21 Энергия связи Hсу~AMФ сохраняется во внутримолекулярной тиоэфирной связи тиолактона, следовательно, гомоцистеин-тиолактон химически активен и может образовывать аддукты с белками [118]. В настоящее время известно, что метионил-тРНК синтетаза участвует в синтезе тиолактона во всех типах клеток человека. Тиолактон способен к накоплению в культуре клеток [125]. Синтез тиолактона из гомоцистеина особенно интенсивен в случае нарушения активности других путей его метаболизма (реакция трансметилирования с образованием метионина и транссульфирование с превращением в цистеин, что возможно при снижении активности соответствующих ферментов). Показано, что в человеческих клетках, в которых метаболизм гомоцистеина нарушен (при наличии мутации гена цистатионин-β-синтетазы, или воздействии аминоптерина, который предотвращает реметилирование гомоцистеина в метионин ферментом метионин-синтазой) образуется больше гомоцистеин-тиолактона [119]. Часть гомоцистеин-тиолактона выводится из организма, часть гидролизуется в гомоцистеин, остальная часть модифицирует клеточные и внеклеточные белки [119]. У млекопитающих и человека функционирует фермент гомоцистеин-тиолактоназа или параоксоназа-1 (PON1), гидролизующий гомоцистеин-тиолактон с образованием гомоцистеина. Экспериментально доказано, что, чем выше активность гомоцистеинтиолактоназы, тем меньше образуется модифицированных N-Hсу-белков [127, 141]. Токсичность гомоцистеин-тиолактона была изучена еще в 1974 году. В экспериментальных работах Harker L. и соавт. длительное введение экспериментальным животным этого вещества приводило к десквамации эндотелия сосудов и развитию артериальных тромбозов [100]. Тиолактон вызывал грубые изменения в морфологии эндотелиальных клеток [154]. В более поздних исследованиях изучено действие гомоцистеин-тиолактона 22 на культуру клеток эндотелия человека. Показано, что гомоцистеинтиолактон является более сильным индуктором гибели эндотелиоцитов, чем сам гомоцистеин. Гомоцистеин-тиолактон вызывает каспаз- независимую гибель клеток эндотелия сосудов путем апоптоза [99]. Важно рассмотреть какие факторы детерминируют образование тиолактона из гомоцистеина. Степень преобразования эндогенного гомоцистеина в тиолактон прямо пропорциональна концентрации гомоцистеина и обратно пропорциональна уровню метионина. Фолиевая кислота, облегчая реакцию трансметилирования гомоцистеина в метионин, косвенно ингибирует синтез тиолактона за счет снижения уровня гомоцистеина и повышение концентрации метионина в клетках эндотелия. Синтез тиолактона, следовательно, возрастет с увеличением соотношения гомоцистеин/метионин, которое, в свою очередь зависит от уровня в организме фолиевой кислоты. Тем самым, отсутствие или недостаток фолиевой кислоты является одним из основных детерминирующих условий преобразования гомоцистеина в тиолактон и последующей модификации белков тиолактоном [124]. Также известно, что степень модификации белка тиолактоном возрастает с увеличением уровня гомоцистеина, но уменьшается с увеличением фолиевой кислоты и ЛПВП в культурах эндотелиальных клеток. ЛПВП химически связаны с ферментом гомоцистеин- тиолактоназой, гидролизующей тиолактон, по-видимому, за счет этого ЛПВП минимизируют модифицирование белков. Это новый механизм, объясняющий антиатерогенную роль ЛПВП. Недостаточность функционирования гомоцистеин-тиолактоназы может играть важную роль в развитии гомоцистеин-индуцированных заболеваний сердечно- сосудистой системы [124, 141]. Таким образом, образование тиолактона из гомоцистиена определяется факторами, причастными к развитию сердечно-сосудистых 23 заболеваний у людей. Это подтверждает гипотезу, что метаболическое превращение гомоцистеина гомоцистеинилирование) в тиолактон белков играет и модифицирование роль в (N- гомоцистеин- индуцированном повреждении сосудов при атеросклерозе [128]. Генетически обусловленная или приобретенная гипергомоцистеинемия приводят к усилению образования тиолактона и повышению степени N-гомоцистеинилирования белков, это подтверждено в естественных условиях при лабораторных исследованиях у людей и в экспериментах у животных. Например, уровень гомоцистеин-тиолактона в плазме крови у пациентов с гипергомоцистеинемией, обусловленной мутацией в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTГФР) или цистатионин-β-синтазы (ЦβС) в 59-72 раза превышает его содержание у здоровых лиц. Содержание N-Hсу-белка повышается в 24-30 раз при наличии мутаций генов MTГФР или ЦβС, как у обследованных пациентов, так и у экспериментальных мышей. Концентрация гомоцистеин- тиолактона и содержание N-Hсу-модифицированного белка в плазме крови также повышается в 30 раз у экспериментальных мышей с гипергомоцистеинемией, вызванной метиониновой диетой [126]. При взаимодействии белка с гомоцистеин-тиолактоном происходит взаимодействие свободной ɛ-аминогруппы остатков лизина в молекуле белка с карбоксильной группой тиолактона [119]. Образующийся в результате такой химической модификации белок получил название Nгомоцистеинилированный, или N-ɛ-Hсу-Lys-белок (рис. 4) [115]. 24 Рис. 4. Взаимодействие белка с Нсу-тиолактоном Такая модификация физиологических белков концентрациях тиолактоном гомоцистеина. происходит Данный при процесс затрагивает различные белки в организме: фибриноген, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности, альбумин, гемоглобин и ферритин [126]. В плазме крови N-Hcy-белки представлены в основном N-Hcy-гемоглобином и N-Hcy-альбумином (75% и 22% соответственно от всего пула N-Hcy-белков). Данный пул гомоцистеина в плазме крови человека больше, чем пул общего гомоцистеина [121]. Гомоцистеинилирование приводит к включению дополнительных тиоловых групп, которые изменяют физико-химические свойства и биологическую активность белков. Модифицированные таким образом белки способствуют атерогенезу у лиц с гипергомоцистеинемией. В частности, гомоцистеинилирование липопротеидов низкой плотности усиливает процесс их окисления и ускоряет поглощение их макрофагами. N-ɛ-Нсу-Lys-ЛПНП вызывают окислительное повреждение и гибель клеток в культуре эндотелиоцитов [101, 122]. N-ɛ-Нсу-Lys-альбумины более подвержены протеолитическому воздействию и окислению, чем нативные белки [85]. Показано, что в молекуле сывороточного альбумина человека в естественных условиях и при воспроизведении в эксперименте участком связывания с гомоцистеин-тиолактоном является 25 аминокислотный остаток Lys-525. Реакционная способность остатков лизина, в том числе Lys-525 зависит от того, в каком состоянии находится остаток Cys-34. Так, дисульфидные формы циркулирующих альбуминов и (альбумин-Cys-34-S-S-Cys альбумин-Cys-S-S-Нсу) подвергаются моцификации гомоцистеин-тиолактоном быстрее, чем альбумины со свободной SH-группой (альбумин-Cys-34-SH) [85]. Но наибольший интерес представляет появление у модифицированных гомоцистеином белков аутоантигенных свойств и запуск иммунного ответа [54, 55, 115]. Еще в восьмидесятых годах ХХ века исследователи отмечали, что наиболее тесная корреляция состояния различных звеньев иммунитета выявляется именно с уровнем серосодержащих аминокислот [2]. В 1998 году экспериментально были обнаружены антитела против модифицированных гомоцистеин- тиолактоном ЛПНП [84]. Антитела к N-ɛ-Hcy-белкам классов IgG и IgM обнаруживаются в плазме здоровых людей, их титр повышен у пациентов с ишемической болезнью сердца и ишемическим инсультом [123]. Методом количественного определения данных антител в сыворотке крови человека является ИФА. Человеческие иммуноглобулины специфичны к N-ɛ-Нсу-Lys-эпитопам на модифицированных тиолактоном белках [57]. Аутоантитела, признавая данный эпитоп, вступают в реакцию с модифицированными белками во многих тканях и, возможно, именно эти реакции лежат в основе патологических последствий гипергомоцистеинемии. Можно предположить, что аутоантитела, как изначально защитный модифицированные положительное белки значение. механизм, из призваны циркуляции Однако, если в элиминировать плазме, что имеет модифицированные белки фиксированы на эндотелиальных клетках, это приводит к образованию иммунных комплексов на поверхности эндотелия. Эндотелиоциты, покрытые антителами к Нсу-белковым аддуктам активно распознаются 26 макрофагами через Fс-рецепторы, что, безусловно, приводит к повреждению эндотелиальной поверхности медиаторами воспаления. Если нео-антиген, который индуцировал такую реакцию, присутствует длительное время и идет непрерывный процесс повреждения и репарации сосудистой стенки, то в этой зоне возможно формирование атеросклеротической бляшки [59]. Уровень аутоантитела к N-Hсу-альбумину у больных ИБС в 5 раз выше, чем в контрольной группе (52,3% и 10,0% соответственно, при р<0,0001) [54, 115]. При этом концентрация общего гомоцистеина в плазме у больных ИБС также значительно выше, чем в группе контроля (13,0 мкмоль/л и 12,1 мкмоль/л соответственно, при р=0,026). Важно отметить, что среди лиц с нормальной концентрацией общего гомоцистеина в плазме аутоантитела к N-Hсу-альбумину выявляются у 25,5%, в то время как, среди пациентов с уровнем общего гомоцистеина более 14,5 ммоль/л (при норме 5 – 15 мкмоль/л) 41,2% являются серопозитивными [54, 115]. Как показали проспективные исследования, наличие аутоантител к N-ɛ-Hсу-альбумину – независимый предиктор раннего развития ИБС. При этом корреляционная связь между уровнем аутоантител и C677Tполиморфизмом гена МТГФР (генетической детерминантой гипергомоцистеинемии) отсутствует [54]. Существует положительная корреляция между содержанием антител к модифицированным N-Hсубелкам и уровнем общего гомоцистеина в плазме. Таким образом, гомоцистеин является независимым предиктором концентрации сывороточных аутоантител. Уровень антител отрицательно коррелирует с концентрацией цистеина, метионина и фолиевой кислоты [53]. Изучен уровень аутоантител к модифицированным гомоцистеинтиолактоном белкам и у пациентов с атеросклерозом и тромбозом церебральных сосудов. В группе больных ишемическим инсультом средний уровень аутоантител класса IgG к N-ɛ-Hсу-Lys-белкам на 50% 27 выше, чем в группе здоровых испытуемых. Лица, перенесшие инсульт имеют также более высокий уровень общего гомоцистеина плазмы, чем здоровые. При этом не выявлено различий в концентрации цистеина и метионина у пациентов с инсультом и в группе контроля [57]. Таким образом, антитела к модифицированным белкам коррелируют с уровнем общего гомоцистеина и развитием инсульта. Эти данные подтверждают гипотезу, что модифицированные гомоцистеин-тиолактоном аутоантигены являются важным модулятором атерогенеза. Кроме того, увеличение риска атеротромбоза у лиц с гомоцистеинтиолактон-белковыми аддуктами объясняется также повышенным уровнем в плазме модифицированного N-Нсу-фибриногена, обладающего более выраженными протромбогенными свойствами по сравнению с немодифицированным [126]. В недавних исследованиях показано, что пациенты, находящиеся на долгосрочном гемодиализе, имеют более высокие уровни общего гомоцистеина, сывороточных аутоантител к N-Hсу-альбумину и N-Hсугемоглобину по сравнению с контрольной группой [53, 58]. Таким образом, у них более выражен аутоиммунный ответ, направленный против N-Hсу-белков. Известно, что гипергомоцистеинемия встречается чаще, чем в общей популяции у пациентов с СКВ, что способствует прогрессированию атеросклероза. У таких больных также выше, чем в контрольной группе уровень антител к N-Hсу-альбумину, у больных СКВ содержание данных антител коррелирует с общим гомоцистеином и длительностью заболевания. У больных СКВ независимыми предикторами уровня антител к модифицированным белкам, кроме концентрации общего гомоцистеина, является содержание С-реактивного белка, а также длительность заболевания, при этом корреляции между уровнем анти-Нсу-белок-антител и антиядерных антител не обнаружено [55]. Корреляция между значениями 28 антител и С-реактивного белка описаны также у больных ИБС [54]. Аутоиммунный ответ против модифицированных альбуминов может способствовать повышенному риску развития сосудистых осложнений у больных СКВ. Таким образом, одним из предполагаемых механизмов повреждающего действия высокого уровня гомоцистеина, наряду с известными (окислительное повреждение эндотелия, усиление адгезии и агрегации тромбоцитов, нарушение баланса про- и антикоагулянтов и др.), является модификация гомоцистеин-тиолактоном белков и приобретение последними аутоантигенных свойств. Многочисленные исследования патогенных эффектов гомоцистеина показывают, что наиболее выраженные последствия гипергомоцистеинемии связаны с действием высоких концентраций этого аминотиола в клетках. Проатерогенное действие гомоцистеина в стенке сосуда, по-видимому, связано с его накоплением в эндотелии. Содержание гомоцистеина в клетке может резко усиливаться за счет его эндоцитоза вместе с альбумином – основным переносчиком гомоцистеина, или, как уже было указано, в комплексе с макроглобулином, при активации последнего. Исходя из сказанного, можно предположить, что аутоантитела к комплексам Нсу-белок могут являться посредниками в процессе эндоцитоза, облегчая этот процесс связыванием с Fc-рецепторами эндотелиоцитов или макрофагов. В то же время аутоантитела, выполняя свою регуляторную функцию, должны обеспечивать процесс элиминации высокого уровня гомоцистеина. Но свидетельств этого в доступной нам литературе не обнаружено. Возможность защитно-компенсаторной функции аутоантител к модифицированным белкам нуждается в дальнейшем изучении. 29 1.3 Нагрузочный метиониновый тест для выявления гипергомоцистеинемии Гомоцистеин не входит в состав белков, потребляемых с пищей, а образуется при деметилировании поступающего с пищей метионина. Основываясь на этой особенности метаболизма, для диагностики повышенного уровня гомоцистеина весьма часто используются нагрузочные пробы с метионином. Умеренная гипергомоцистеинемия у лиц в возрасте до сорока лет, как правило, протекает бессимптомно, и обнаружить ее удается далеко не всегда. Для оценки состояния метаболизма гомоцистеина, для выявления склонности к гипергомоцистеинемии используют метиониновый тест. Еще в 1974 году было выявлено, что умеренная гипергомоцистеинемия с гомоцистеинурией, вызванная дефицитом ЦβС, проявляется только после нагрузочного теста с метионином. При этом уровни гомоцистеина до нагрузки не различаются со здоровыми лицами [74]. В наблюдениях Wilcken D. и соавторов (1976 г.) был использован метиониновый нагрузочный тест для проверки гипотезы о действии умеренной гипергомоцистеинемии как атерогенного фактора. По результатам исследований у 7 из 25 пациентов (28%) регистрировался высокий уровень гомоцистеина через 4 часа после нагрузки в значениях, соответствующих гипергомоцистеинемии у больных с облигатной гетерозиготностью по дефициту ЦβС [164]. По данным Boers G. и соавторов [90, 91] постнагрузочная умеренная гипергомоцистеинемия периферическим или также определялась цереброваскулярным у 28% пациентов атеросклерозом, с что подтверждает гипотезу об умеренно повышенном уровне гомоцистеина как факторе риска атеросклероза. 30 При проведении метионинового теста первоначально делают контрольное исследование. Образец крови забирают натощак и через 2, 4, 6 и 8 часов. В норме транзиторный пик повышения концентрации гомоцистеина приходится на интервал между 4 и 8 часов. На второй день кровь для исследования берут непосредственно перед нагрузкой и через 2, 4, 6 и 8 часов после перорального приёма метионина в дозе 100 мг/кг, растворенного в воде или соке. Концентрация гомоцистеина достигает максимальных значений через 4 – 6 часов, и возрастает обычно в 2 – 3 раза. Тест считают положительным, если уровень гомоцистеина в крови после нагрузки превышает начальный уровень на величину, равную или превышающую 2 стандартных отклонения. Вариации уровня гомоцистеина у одних и тех же лиц при повторном многократном исследовании составляют от 7% до 15% при простом определении (натощак) и 23% после нагрузки метионином [47]. Cattaneo M. (2006 г.) описывает измерение уровня гомоцистеина в плазме крови через 4 до 8 часов после стандартизированного приема метионина (3,8 г/м2 поверхности или 0,1 г/кг массы тела). Нормальный уровень общего гомоцистеина у здоровых лиц соответствует натощак приблизительно 15 мкмоль/л в плазме крови. Референтные значения содержания общего гомоцистеина при нагрузке метионином определены менее широко [68]. По мнению Malinow R. и соавторов (1999 г.) наиболее информативным для выявления гипергомоцистеинемии является образец, взятый через 2 часа после нагрузки метионином. По их данным этот тест может выявить 39% лиц с гомоцистеин-ассоциированным риском сердечно-сосудистых заболеваний. При проведении мтионинового теста авторы оценивали абсолютный уровень гомоцистеина после нагрузки а также разницу донагрузочного и постнагрузочного уровней этого соединения. По данным проведения метионинового нагрузочного теста у 31 исследуемых без клинически выявленных сердечно-сосудистых заболеваний авторы исследования утверждают, что женщины имеют более высокую разницу уровня гомоцистеина до- и после нагрузки и более высокий его абсолютный уровень после нагрузки, чем мужчины. С возрастом эти цифры у женщин повышаются, у мужчин абсолютный постнагрузочный уровень гомоцистеина и разница концентрации гомоцистеина до- и после нагрузки остаются на прежнем уровне [131]. Суммированные данные нагрузочных метиониновых тестов, выполненных у пациентов с патологией сосудов и у лиц контрольной группы, показали, что постнагрузочная умеренная гипергомоцистеинемия обнаруживалась у 21% пациентов с ИБС, у 24% - с заболеваниями сосудов головного мозга, у 32% - с заболеваниями периферических сосудов и в 2% - в контрольной группе. Базальная (зарегистрированная натощак) умеренная гипергомоцистеинемия может быть определена у 10-24% пациентов с ИБС, 23-47% пациентов с заболеваниями мозговых или периферических сосудов и у 7% пациентов в контрольной группе. Более того, доказано, что повышение уровня гомоцистеина на 5 ммоль/л, т.е. одно стандартное отклонение от среднего значения, повышает риск ИБС в 1,4 раза, что не меньше идентичного повышения сывороточного холестерина. Все это подтверждает равнозначность данных факторов риска [60]. Keijzer M. и соавторы (2006 г.) указывают, что клинические рекомендации различаются в своих предписаниях по поводу того, измерять уровень гомоцистеина только натощак или после метиониновой нагрузки. По мнению этих авторов, метиониновая нагрузка не несет дополнительной информации о содержании гомоцистеина по сравнению с измерением концентрации этой аминокислоты только натощак [138]. Однако анализ литературных источников позволяет заключить, что около 30% исследованных с постнагрузочной гипергомоцистеинемией не 32 имеют повышенного уровня гомоцистиена натощак. Следовательно, определение только его донагрузочного уровня приводит к недостаточной оценке скрытой гипергомоцистеинемии. Вместе с тем в эпидемиологических исследованиях допускается исследование уровней гомоцистеина натощак у больших групп пациентов [60]. Проведение пробы с нагрузкой метионином позволяет дополнительно выявить в среднем до 30% больных, склонных к повышенному уровню гомоцистеина, со скрытой латентной формой гипергомоцистеинемии [29, 145]. По результатам Европейского исследования гомоцистеина 27% обследованных были отнесены к группе риска на основании выявленной интолерантности к метионину [47]. Определение концентрации гомоцистиена в плазме крови и проведение нагрузочного метионинового теста проводилось в исследовании Мукарова М.А. (2008 г.). Доза метионина составляла 100 мг на кг веса (в среднем от 6 до 8 г). В день исследования пациенты воздерживались от приема кофе и курения. Концентрацию гомоцистиена определяли в плазме крови до исследования и через 2, 4, 8 и 24 часа после приема метионина. В результате постнагрузочная гипергомоцистеинемия выявлена в 41,2% случаях у больных с нарушенной толерантностью к глюкозе и в 66,7% случаях у больных сахарным диабетом 2 типа, что свидетельствует о латентном нарушении метаболизма гомоцистеина. При сочетании нарушенной толерантности к глюкозе с ИБС в 42,9% и при сочетании сахарного диабета с ИБС в 75% случаев выявлена постнагрузочная гипергомоцистеинемия, что говорит о более выраженном характере нарушений метаболизма гомоцистиена у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Учитывая, что основные метаболиты этой аминокислоты являются дисульфидами, выделяемыми с мочой, поражение почек может иметь значение в патологическом приросте уровня гомоцистеина в плазме после 33 метиониновой нагрузки. По данным Мукарова М.А. маркеры поражения почек коррелировали с базальной концентрацией и с постнагрузочным уровнем гомоцистеина [32]. Andrew Bostom и соавторы (1995 г.) оценивали постнагрузочную гипергомоцистеинемию в плазме крови у лиц с нормальным уровнем общего гомоцистеина натощак. Необходимость проведения теста с метиониновой нагрузкой связана с тем, что не до конца ясно, является ли уровень общего гомоцистеина натощак единственным определяющим фактором для адекватного выявления гипергомоцистеинемии. В данной работе измерили уровень общего гомоцистеина плазмы натощак и через 4 часа после метиониновой нагрузки (0,1 г L-метионина на 1 кг веса) у участников исследования NHLBI Family Heart Study. Из общего числа лиц с гипергомоцистеинемией 43% были выявлены только с помощью метиониновой нагрузки. Авторы исследования указывают, что определение только уровня общего гомоцистеина в плазме крови натощак недостаточно для выявления всех лиц с клинически значимой гипергомоцистеинемией [144]. Renе Van der Griend и соавторы (2002 г.) определяли уровень гомоцистеина после метиониновой нагрузки для диагностики гипергомоцистеинемии и эффективности гомоцистеинснижающй терапии. Они подтвердили, что высокая концентрация гомоцистеина – независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. При проведении гомоцистеинснижающей терапии снижается постнагрузочный уровень гомоцистеина. Это говорит о том, что при этом лечении нормализуется метаболизм гомоцистеина даже при метиониновой нагрузке. В связи с этим, возможно использование этого теста для индивидуального контроля проводимой терапии. По их данным у 50% лиц гипергомоцистеинемия может быть нагрузочного выявлена теста. Эти только после пациенты проведения имеют метионинового нормальный уровень 34 гомоцистеина натощак (базальный уровень). Проведенное ими исследование дает понять, что риск сердечно-сосудистых заболеваний может повышаться, начиная с постнагрузочной концентрации гомоцистеина свыше 38 ммоль/л [161]. В исследовании WENBIT (Western Norway B-vitamin Intervention Trial - исследование эффекта от гомоцистеин-снижающей терапии на уровень смертности при сердечно-сосудистых заболеваниях) метиониновый нагрузочный тест также применяли для оценки влияния витаминов группы В на метаболизм гомоцистеина. Произвели сравнение эффекта витамина В6 с эффектом фолиевой кислоты и витамина В12 по снижению исходного и постнагрузочного уровня гомоцистеина и цистатионина. был Нагрузочный метиониновый тест выполнен исследуемым сразу и через три месяца после начала лечения. В результате лечение фолиевой кислотой и витамином В12 привело к скорому и существенному снижению начального (на 31%) и постнагрузочного уровня гомоцистеина (на 22%). Витамин В6 не изменил начального содержания гомоцистеина, но оказал существенный эффект на постнагрузочный уровень. Авторы отмечают, что большинство исследований уровня гомоцистеина при ИБС проводятся с оценкой его базального уровня, хотя измерение концентрации этой аминокислоты после метиониновой нагрузки может выявить лиц со скрытой гипергомоцистеинемией [70]. Имеется мнение о том, что высокая распространенность постнагрузочной умеренной гипергомоцистеинемии среди пациентов с сосудистой патологией является независимым фактором риска, наряду с другими общими факторами включая гиперхолестеринемию, гипертензию, курение [106]. Резюмируя сказанное, можно отметить, что применение метионинового теста дает дополнительные возможности в своевременном выявлении гипергомоцистеинемии, которая может быть легко 35 скорректирована гомоцистеин-снижающей терапией с соблюдением простой, безопасной и недорогой витаминной диеты. Повышенный уровень гомоцистеина, выявляемый метиониновым тестом, может быть нормализован более чем у 90% пациентов путем назначения 100 мг витамина В6 вместе с 5 мг фолиевой кислоты в день. Это сочетание показало снижение постнагрузочных концентраций в среднем на 50% [60]. Существенным моментом, отличающим тромбофилию при повышенном уровне гомоцистеина, является наличие патогенетических и в то же время доступных и безопасных подходов к лечению [49]. Следовательно, как мы считаем, смысл в своевременном выявлении скрытой гипергомоцистеинемии можно считать достаточно большим. 36 Глава 2 Материалы и методы исследования 2.1 Получение комплекса альбумина с гомоцистеином Для получения модифицированного сывороточного альбумина человека гомоцистеин ("Fluco", Германия) в концентрации 150 мкмоль/л инкубировали с 5% раствором сывороточного альбумина человека (ФГУП НПО "Микроген", Москва) в течение 24 часов при температуре 4°С и затем 60 минут при 37°С. Полученный образец подвергли центрифугированию с ультрафильтрацией с порогом разделения по молекулярной массе 50 кДа с целью отделить свободный гомоцистеин от образовавшего связь с альбумином. Ультрафильтрацию проводили с помощью набора для центрифужной микрофильтрации AmiconUltra, 0,5 мл, 50 кДа (Millipore, USA). Объем супернатанта 500 мкл. Ультрацентрифуга Sigma 3-30K, ротор 12100, 15 мин при 14000 g. Концентрацию гомоцистеина в образцах до, после фильтрации и в фильтрате определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой детекцией при 330 нм (колонка Chromolith 100×4,6 мм, элюент ацетонитрил - 0,05 М/лимонная кислота в соотношении 10/90) [20]. Полученный результат выражали в мкмоль/л. Для пересчета мВ в нг/мл использовали внутренний стандарт гомоцистеина 100 нг/мл, соответствующий 15,1 мВ. Перевод нг/мл в мкмоль/л осуществляли по формуле: концентрация в нг/мл ÷ молекулярный вес гомоцистеина, равный 135 г/моль. 2.2 Изучение аутоантител к комплексу крысиного альбумина с гомоцистеином и уровня гомоцистеина Животные всех исследуемых групп содержались в стандартных идентичных условиях. Экспериментальное исследование проводилось в 37 соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986 г.). В эксперимент включены сорок белых беспородных крыс-самцов, средней массой 150 г, из которых у двадцати крыс вызывали иммунодефицит, другие двадцать составили контрольную группу. На первом этапе получали модель иммунодефицита путем внутрибрюшинного введения раствора циклофосфана быстрорастворимого (ООО «ЛЭНС-фарм», дочерняя компания ОАО «Верофарм». Регистрационный номер: Р N 000459/01) в дозе 100 мг/м2 2 раза в неделю. Расчет площади поверхности тела животных производили по формуле Миха: S (см2) = К3√m2 (г), где К – коэффициент, равный для крысы – 9,13– 11,05. Наличие иммунограммы иммунодефицита методом подтверждали проточной определением цитофлюориметрии. Для иммунофенотипирования кровь забирали в пробирку Vacutainer (BD), содержащую динатриевую соль ЭДТА, объемом 2,5 мл. Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли стандартным методом прямого окрашивания трехпараметрического цельной крови с иммунофлюоресцентного использованием коммерческого лизирующего/фиксирующего раствора VERSALYZE/IOTest3 (Beckman Coulter) и панели моноклональных антител IOTest (Beckman Coulter): первая панель – CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC; вторая панель – CD3FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC. Контрольные пробы инкубировали с иммуноглобулинами, мечеными флуорохромами (FITC, PC7, APC) соответствующего изотипа – мышиные IgG1, IgG2a IOTest (Beckman Coulter). Цитофлюориметрию осуществляли на проточном цитофлюориметре «Cytomics FC-500» (Beckman Coulter, USA), при этом 38 регистрировали суммарно не менее 10000 событий. Данные анализировали с помощью программы CXP Cytometer (Beckman Coulter). На втором этапе у крыс забирали кровь из подключичной вены, затем десяти интактным и десяти крысам с иммунодефицитом ввели гомоцистеин в концентрации 100 мкмоль на 1 мл ОЦК. Другим десяти интактным и десяти иммунодефектным крысам ввели гомоцистеинтиолактон в дозе 100 мкмоль на 1 мл ОЦК. Расчет ОЦК крысы проводили в соответствии с соотношением 5-7 мл/100 г веса. Через 6 часов после инъекции гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона кровь забирали вновь. Далее ежедневно вводили гомоцистеин и гомоцистеин-тиолактон в течение девяти дней интактным крысам и животным с иммунодефицитом, после чего вновь проводили забор крови. Полученную сыворотку анализировали в РПГА. Животных выводили из эксперимента путем летальной кровопотери под наркозом. Получение крысиного альбумина осуществляли центрифугированием сыворотки крови с ультрафильтацией с порогом разделения 100 кДа для отделения крупнодисперсных белков, а затем ультрафильтрацией с порогом 60 кДа с целью отделить белки меньшей молекулярной массы. Далее получали модифицированный крысиный альбумин и конъюгировали его глутаровым альдегидом на эритроцитах. Гомоцистеин-тиолактон ("Fluco", Германия) в концентрации 150 мкмоль/л инкубировали с 5% сывороточном альбумином крысы в течение 24 часов при температуре 4°С и 60 минут – при 37°С. Гомоцистеином крысиный альбумин модифицировали также как сывороточный альбумин человека. Трижды отмытый физиологическим раствором осадок эритроцитов охлаждали до 0°С на водяной бане. 25% глутаровый альдегид разводили до 1% раствором следующего состава: 1 часть 0,15 М Na2HPO4 c pH 8,2 + 9 39 частей 0,15 М NaCl + 5 частей дистиллированной воды, охлаждали смесь на ледяной бане. Отмытые эритроциты разводили 1% глутаровым альдегидом до 5% суспензии, инкубировали 30 мин при 0°С при периодическом перемешивании (фиксация). Фиксированные эритроциты отмывали 5 раз 0,15 М NaCl и 5 раз дистиллированной водой. Отмытый осадок фиксированных эритроцитов в объеме 0,5 мл добавляли к 2,5 мл раствора модифицированного альбумина в 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,4. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре. После трехкратной отмывки эритроциты, конъюгированные модифицированным альбумином, использовали для проведения РПГА. РПГА проводили в двух вариантах: с определением всех классов Ig и с определением цистеин-устойчивых антител (класса IgG) согласно методическим рекомендациям гемагглютинации сальмонеллезов здравоохранения с по цистеиновой (Центральный СССР). постановке реакции пробой целью НИИ с эпидемиологии Основанием для пассивной диагностики Министерства подобного дифференцированного определения иммуноглобулинов является то, что при обработке сыворотки некоторыми редуцирующими веществами, в частности цистеином, IgG-антитела относительно устойчивы, тогда как IgM и IgA-антитела не специфически инактивируются, выпадая в осадок, что связано с большей молекулярной массой их по сравнению с IgG. Это позволяет определить удельное содержание IgG в сыворотке. Цистеин в соотношении 15 мг на 1 мл растворяли 0,1 М раствором NaOH и при значении рН 7,0-7,2 доводили до нужного объема 0,85% раствором NaCl. Одну часть сыворотки экспериментальных крыс, разведенную 1:5 физиологическим раствором, смешивали с равным объемом раствора цистеина, помещали в пробирку и заливали слоем стерильного вазелинового масла, вторую часть сыворотки (без цистеина) также заливали слоем вазелинового масла. Пробирки с сыворотками, 40 обработанными и необработанными цистеином, выдерживали в термостате при 37°С в течение 18 часов. Далее обе части сыворотки титровали в нескольких парных рядах соответственно разведения числу 1:30, в эритроцитарных диагностикумов, планшетах иммунологических для начиная с реакций однократного применения. Для разведения использовали забуференный 0,85% раствор NaCl (фосфатный буфер с рН 7,0-7,2). Эритроциты, конъюгированные глутаровым альдегидом с альбумином, модифицированным гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном, в 2,5% разведении вносили в каждую лунку разведения сыворотки в равном объеме (0,1 мл). Каждый эритроцитарный диагностикум вносили в два ряда разведений сыворотки (обработанной и необработанной цистеином). В одну из лунок, содержащую растворитель без испытуемой сыворотки, вносили равный объем диагностикума для контроля спонтанной агглютинации. Контролем служили разведения исследуемых сывороток с несенсибилизированными эритроцитами, а также с эритроцитами, сенсибилизированными немодифицированным альбумином. Через 2 часа учитывали результаты по обычной для РПГА методике. Положительной считали реакцию в случае образования ровного слоя агглютинированных эритроцитов по всей поверхности лунки («зонтик»), отрицательной – компактный осадок эритроцитов в центре лунки («пуговка»). Количественную оценку проводили через отрицательный десятичный логарифм от титра разведения сыворотки, при котором регистрировалась положительная реакция. Уровень гомоцистеина у экспериментальных животных определяли также высокоэффективной жидкостной хроматографией по методу Дутова А.А. и соавторов (2010 г.). Результат пересчитывали в мкмоль/л. 41 2.3 Определение циркулирующих иммунных комплексов Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) у вышеописанных групп лабораторных животных определяли методом преципитации с раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) в концентрации 3,5%; 7% и 10%. Показано, что линейный незаряженный полимер ПЭГ-6000 избирательно осаждает иммунные комплексы в зависимости от их молекулярной массы, сводя к минимуму преципитацию свободных сывороточных белков. При концентрации 3,5% ПЭГ-6000 осаждает крупные комплексы. 7% ПЭГ-6000 осаждает ЦИК со средней молекулярной массой, 10% ПЭГ-6000 низкомолекулярные комплексы, которые избегают захвата фагоцитами и могут образовывать депозиты под эндотелием сосудов, приводя к значительному повреждению тканей. Раствор полиэтиленгликоля готовили на 0,1 М боратном буфере рН 8,4. 20 мкл исследуемой сыворотки смешивали с 0,5 мл боратного буфера указанной концентрации; 0,4 мл этой смеси приливали к 0,4 мл 7%, 14% и 20% раствора полиэтиленгликоля (конечная концентрация 3,5%, 7% и 10%). 2.4 Изучение морфологических изменений тканей миокарда и показателей периферической крови Данный эксперимент поставлен на сорока белых лабораторных крысах – самцах средней массой 150 г, одного возраста. Животные были разделены на четыре группы (n=10). Крысам первой и второй группы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, а животным третьей и четвертой группы – гомоцистеин в дозе 0,001 мг на 1 мл ОЦК. Крысы первой и третьей группы были выведены из эксперимента на 7 сутки, а второй и четвертой – на 14 сутки. Уровень гомоцистеина определяли методом высоко эффективной жидкостной хроматографии, описанным выше. 42 Для гистологического исследования ткани сердца фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Серийные парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм изготавливали по стандартной методике. С целью обзорной окраски гистологические срезы окрашивали гематоксилинэозином; для выявления компонентов соединительной ткани окрашивали пикрофуксином по Ван Гизону. Исследование и мофометрический анализ тканей проводили с помощью микроскопа «Opticam PRO5» с использованием цифровой фотокамеры «Olympus CX-41» и программы анализа изображений «Optika Vision Pro»ver. 2.7. Количественные изменения в периферической крови оценивали с помощью автоматического гематологического анализатора PENTRA 120 Retic согласно прилагаемой инструкции. Статистическую обработку результатов проводили с использованием элементов непараметрической статистики, с помощью пакета программ Statistica 6.0 производства StatSoft. 2.5 Изучение экспрессии тканевого фактора на фоне гипергомоцистеинемии Оценку экспрессии тканевого фактора у вышеописанных групп экспериментальных крыс выполняли иммуногистохимическим методом. Исследование было выполнено с использованием парафиновых срезов миокарда экспериментальных иммунопероксидазным методом животных с биотин-стрептавидиновым крысинными моноклональными антителами к тканевому фактору человека - TF (TF9-10H10) производства Santa Cruz biotechnology (USA). Отобранный материал фиксировался в забуференном 10% растворе формальдегида в течении 24 часов, после чего заливался в парафиновые блоки по общепринятой методике. 43 Срезы толщиной 4 мкм получали стандартным способом, депарафинизация выполнялась в растворе орто-ксилола. Для демаскировки антигенов проводили однократную обработку в фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью аппарата DC2002 (USA), при 1150 в течении 1 мин 10 сек. В дальнейшем, после инактивации активной эндогенной пероксидазы, срезы инкубировали с первичными антителами в разведениях 1:250 на протяжении 30 мин при температуре 360С. В качестве вторичных антител использовали биотинилированные козьи антитела, в составе рекомендованной производителем системы визуализации LSAB Staining System (Santa Cruz biotechnology; USA), использующей для визуализации реакции раствор диаминобензидина. Последующая докраска срезов, в частности ядер клеток, осуществлялась водным раствором гематоксилина Гаррисона. Использовались рекомендованные контрольные срезы: для исключения неспецифического окрашивания (без первичных антител); и, в качестве положительного контроля, фрагмент плаценты. Результат оценивали полуколичественно: как отрицательный, если окрашенных клеток определялось менее чем 10%; в остальных случаях, положительный результат оценивался количественно по шкале от 1 до 4 баллов. Шкала была построена следующим образом: 1 балл – 10-25% окрашенных клеток; 2 балла – 25-50% окрашенных клеток; 3 балла – 5075% окрашенных клеток; 4 балла – более 75% окрашенных клеток. 2.6 Описание исследованных групп пациентов В исследовании приняли участие следующие группы больных мужского пола. Первая группа с диагнозом гипертоническая болезнь I стадии, 1 – 2 степени подъема артериального давления, со степенью риска 2 (10 человек). Диагноз выставлен на основании синдрома артериальной гипертензии, отсутствия признаков поражения органов мишеней, с 44 исключением артериальных гипертензий другого генеза: нефрогенных, эндокринных, нейрогенных, гемодинамических, лекарственных. Вторая группа – пациенты с гипертонической болезнью II стадии, 2 – 3 степени подъема артериального давления, со степенью риска 3 (12 человек). Диагноз выставлен на основании синдрома артериальной гипертензии и наличия признаков поражения в органах-мишенях: гипертрофия левого желудочка; сужение артерий сетчатки; протеинурия или небольшое повышение концентрации креатинина в плазме крови; признаки атеросклероза аорты, крупных артерий. Третью группу составили больные с диагнозом ИБС: стабильная стенокардия III ФК, осложнения: НК II A, III ФК (12 человек). Диагноз выставлен на основании синдрома ангинозных болей (сжимающего, давящего характера, локализованных за грудиной, связанных с небольшой физической нагрузкой, купирующихся приемом нитратов), синдрома хронической сердечной недостаточности (одышка смешанного характера при небольшой физической нагрузке – ходьба до 100 м, подъем на 1 этаж), данных ЭКГ и коронароангиографии. Четвертая группа – ИБС: прогрессирующая стенокардия, осложнения: НК II A, III ФК (12 человек). Диагноз выставлен на основании отрицательной динамики ангинозного синдрома (учащение и усиление ангинозных болей, увеличение дозы потребляемых нитратов, снижение толерантности к физической нагрузке), с исключением острого инфаркта миокарда. Пятая группа – больные с Q-инфарктом миокарда в острую стадию (10 человек). Диагноз выставлен на основании синдрома ангинозных болей, синдрома ЭКГ-изменений, резорбционно-некротического синдрома, синдрома острой левожелудочковой недостаточности, аритмического синдрома. У данной группы материал забирали в первые и седьмые сутки госпитализации. 45 Средний возраст пациентов составил 61,2±9,7 лет. Критериями исключения из исследования служили: острый пиелонефрит, гломерулонефрит, острая патология желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, патология онкозаболевания, щитовидной псориаз, железы, прием сахарный лекарственных диабет, препаратов, повышающих уровень гомоцистеина, курение, вегетарианство. В группу контроля вошли практически здоровые лица, сопоставимые по полу и возрасту (12 человек). У исследуемых лиц осуществляли забор венозной крови системой Vacutainer и ротовой жидкости натощак. В работе принципы, с обследуемыми предъявляемые людьми Хельсинской соблюдались Декларацией этические Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.). Проведена экспертиза исследования в локальном этическом комитете ГБОУ ВПО ЧГМА. 2.7 Определение аутоантител, уровня гомоцистеина и циркулирующих иммунных комплексов Аутоантитела к комплексу гомоцистеин-альбумин и человеческому тромбину (фактор IIа) определяли оригинальным методом. Лунки планшетов для иммунологических исследований сенсибилизировали либо чистым альбумином для исключения возможности неспецифического взаимодействия аутоантител с ним, либо модифицированным альбумином, либо тромбином (Sigma, США) в количестве по 20 мкг на лунку в объеме 200 мкл фосфатного буфера (РВS). После 24 часовой инкубации при температуре 4°С лунки планшетов трижды отмывали фосфатным буфером и вводили по 20 мкг глицина в объеме 200 мкл фосфатного буфера для связывания реактивно способных участков полистирола. Исследуемые образцы сыворотки крови и смешанной слюны разводили 1/200 и 1/100, 46 соответственно, забуференным физиологическим раствором и проводили реакцию ИФА. Детекцию аутоантител осуществляли анти-G-антителами (для образцов сыворотки крови) и анти-S-IgA-антителами (для образцов слюны), меченными пероксидазой хрена ("Вектор-бест", Новосибирск). Уровень антител оценивали по разнице экстинкции между лунками, сенсибилизированными модифицированным и чистым альбумином. Полученный результат выражали в единицах оптической плотности (OD450). Уровень гомоцистеина в образцах сыворотки и смешанной слюны определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовой детекцией при 330 нм и разделением на колонке 150×4,6 мм с октадецилсиликагелем (С18) в изократическом режиме с использованием в качестве элюента ацетонитрил : 0,05 М цитратно-фосфатный буфер с рН 2,4 : изопропанол (15:85:1) [20]. Полученный результат выражали также в мкмоль/л. Содержание циркулирующих иммунных комплексов в плазме крови исследованных пациентов осуществляли по методике, аналогичной использованной у лабораторных животных. 2.8 Проведение метионинового нагрузочного теста В исследовании динамики уровня гомоцистеина при проведении метионинового нагрузочного теста приняли участие 21 человек с основным диагнозом: гипертоническая болезнь II стадии, 2 степени, риск 3; фоновым: атеросклероз аорты, мозговых артерий, 14 мужчин (средний возраст 51,5±9,5 лет) и 6 женщин (средний возраст 53,4±8,6 лет). Диагноз выставлен на основании синдрома артериальной гипертензии, наличия поражений органов-мишеней и факторов риска. Контрольную группу составили 10 человек, сопоставимых по полу и возрасту, без выявленных сердечно-сосудистых заболеваний. Критериями исключения из 47 исследования служили: онкологические заболевания, сахарный диабет, почечная недостаточность, патология щитовидной железы, псориаз, наличие воспалительных и аутоиммунных заболеваний, прием лекарственных препаратов, повышающих уровень гомоцистеина, курение, вегетарианство. Все исследуемые дали добровольное информированное согласие на проведение метионинового теста. Забор венозной крови и слюны осуществляли натощак и через 4 часа после перорального приема таблетированного метионина в дозе 100 мг/кг веса (или 3,8 г/м2 поверхности тела) [33, 131]. Кровь забирали в пробирки (Vacutainer) и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, слюну центрифугировали и собирали супернатант. Уровень гомоцистеина в образцах сыворотки крови и смешанной слюны у исследуемых лиц определяли по той же методике, что была описана выше [20]. 2.9 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 6. Достоверность различий между до- и постнагрузочным уровнем гомоцистеина оценивали непараметрическим критерием Вилкоксона для сравнения двух зависимых переменных; для определения достоверности различий во всех остальных случаях пользовались непараметрическим критерием Манна-Уитни для независимых переменных. Корреляционный анализ проводили по методу Спирмена. Статистически достоверными считались различия при значениях р<0,05. 48 Глава 3 Некоторые сведения о патогенном действии гомоцистеина и его элиминации (Результаты собственных исследований) 3.1 Результаты экспериментального исследования 3.1.1 Получение модифицированного белка Для изучения аутоантител на первом этапе работы получали комплекс сывороточного альбумина с гомоцистеином. Модификация альбумина с гомоцистеином осуществлялась способом, описанным в главе «Материалы и методы исследования». Следует лишь указать на полную идентичность результатов модификации альбумина человека и альбумина крысы в нашей работе. Напомним, что модификация альбумина человека и крысы производилась путем инкубации альбумина с гомоцистеином в течение суток при температуре 4°С, дополнительно – 1 час в термостате при 37°С, затем полученную смесь подвергали ультрафильтрации с порогом разделения 50 кДа, осадок десорбировали с фильтра физиологическим раствором и анализировали методом ВЭЖХ. Оказалось, что содержание гомоцистеина в образце до фильтрации составило 189,3 нг/мкл, после фильтрации и десорбции с фильтра - 74,3 нг/мкл, в фильтрате - 120 нг/мкл. Данные отображены на хроматограммах (рис. 5). Таким образом, 40% гомоцистеина комплексировалось с альбумином с образованием модифицированного белка в условиях in vitro. В условиях in vivo, как известно из литературных источников, около 70% гомоцистеина в плазме крови образует связь с альбумином [3]. 49 мВ 50 мВ 50 45 45 45 40 40 40 35 35 35 30 30 25 25 25 20 20 20 15 15 15 10 10 10 5 5 5 Hcy Cys 30 Cys Hcy Hcy Cys мВ 50 кнл2 кнл2 0 1 2 3 4 5 6 7 кнл2 мин0 1 до фильтрации 2 3 4 5 6 7 мин0 1 после фильтрации 2 3 4 5 6 7 фильтрат Рис. 5. Хроматограммы исследованных образцов (Нсу – пик, отражающий концентрацию гомоцистеина) В первой серии экспериментов исследовался уровень аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови крыс. Полученные образцы модифицированного альбумина крысы использовали для сенсибилизации глютаровых эритроцитов, которые применяли в РПГА. Титр аутоантител к модифицированному альбумину изучали в сыворотке крови сорока белых беспородных крыс-самцов, средней массой 150 г, из которых у двадцати крыс вызывали иммунодефицит, другие двадцать – составили контрольную группу. Модель иммунодефицита получали путем, описанным в главе «Материалы определением и методы», наличие иммунограммы цитофлюориметре. иммунодефицита методом цитометрии подтверждали на проточном мин 50 3.1.2 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у интактных крыс При использовании в реакции гемагглютинации эритроцитов, сенсибилизированных нативным сывороточным альбумином крысы и несенсибилизированных эритроцитов, получен отрицательный результат (см. стр. 55 рис. 6). Как видно из табл. 1 у интактных крыс до нагрузки гомоцистеином и гомоцистен-тиолактоном обнаруживаются аутоантитела IgG и других классов к альбумину, модифицированному гомоцистеином в титре 1:30 (0; 1:30) и 1:60 (1:15; 1:60) соответственно. Через 6 часов после введения гомоцистеина и гомоцистеинтиолактона титр аутоантител класса IgG увеличился в 8 раз, а титр всех классов Ig возрос в еще большей степени: в 24 раза после введения гомоцистеина и в 32 раза после нагрузки животных гомоцистеинтиолактоном. После девятидневного введения гомоцистеина титр аутоантител всех классов оставался столь же высоким. Нагрузка гомоцистеин-тиолактоном различий с уровнем аутоантител до введения тиола не выявила. Таблица 1 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у интактных крыс (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после введения После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеингомоцистеина гомоцистеина тиолактона тиолактона Все Все Все Все Все классы IgG классы IgG классы IgG классы IgG классы Ig Ig Ig Ig Ig 1:60 1:480* 1:720* 1:480* 1:960* 1:480* 1:960* 0 1:480 (1:15; (1:480; (1:480; (1:480; (1:960; (1:480; (1:480; (0; 0) (1:60; 1:60) 1:480) 1:960) 1:480) 1:960) 1:960) 1:960) 1:960) До нагрузки IgG 1:30 (0; 1:30) Примечание: *р<0,05 в сравнении с титром до нагрузки. 51 Наряду с этим, определялись аутоантитела к комплексу альбумина с гомоцистеин-тиолактоном: антитела класса IgG в титре 1:45 (0; 1:300), аутоантитела всех классов – 1:60 (1:45; 1:480). При этом отсутствовала динамика их уровня как через 6 часов после введения тиолов, так и в течение девятидневного их введения. Последнее, возможно, указывает на более низкие иммуногенные свойства альбумина, модифицированного гомоцистеин-тиолактоном, по сравнению с комплексом этого белка с гомоцистеином (табл. 2). Таблица 2 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеин-тиолактоном у интактных крыс (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки Все классы Ig 1:60 (1:45; 1:480) IgG 1:45 (0; 1:300) Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 1:30 1:60 0 1:30 (0; (0; (0; 0) (0; 1:30) 1:60) 1:60) После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 1:30 1:60 1:30 1:60 (1:30; (1:60; (1:30; (1:60; 1:30) 1:60) 1:30) 1:960) У этой же группы крыс исследовали уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови до и после введения экзогенного гомоцистеина (100 мкмоль на 1 мл ОЦК) и гомоцистеина-тиолактона (100 мкмоль на 1 мл ОЦК). Оказалось, что как через 6 часов после введения гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона, так и после девятидневного их введения уровень эндогенного гомоцистеина у интактных крыс не отличался от значений, зарегистрированных при заборе крови до нагрузки экзогенными тиолами (табл. 3). Можно наблюдать лишь незначительное возрастание уровня 52 гомоцистеина, не подтвержденное статистически, после девятидневного введения тиолов. Таблица 3 Уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови у интактных крыс (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после введения До нагрузки гомоцистеина гомоцистеинтиолактона После 9 дней введения гомоцистеина гомоцистеинтиолактона 3,81 2,92 3,90 4,24 4,48 (3,03; 4,38) (2,02; 2,99) (3,57; 4,54) (3,74; 5,52) (3,73; 5,25) Отсутствие ожидаемого увеличения уровня общего гомоцистеина в сыворотке крови после введения экзогенных тиолов, на наш взгляд, может быть связано с повышением титра аутоантител к комплексу сывороточного альбумина с гомоцистеином (табл. 1). Эти данные могут свидетельствовать о включении в работу иммунных механизмов элиминации высокого уровня гомоцистеина аутоантителами к модифицированному альбумину путем развития вторичного иммунного ответа. Последующее образование иммунных комплексов может обусловливать патогенное действие гипергомоцистеинемии, наряду с известными повреждающими эффектами гомоцистеина, такими как активация системы гемостаза, индукция окислительного стресса и др. 3.1.3 Титр аутоантител и уровень гомоцистеина у крыс с иммунодефицитом Для подтверждения ИДС оценивали иммунограмму интактных крыс и животных, получавших цитостатик. Как видно из табл. 4, у животных, получавших циклофосфан, внутрибрюшинно, в дозе 100 мг/м2 2 раза в 53 неделю на протяжении 14 дней, регистрировались следующие изменения. Отмечалось снижение абсолютного количества В-лимфоцитов на 30% с сохранением их относительного содержания; уменьшение соотношения Тхелперы/Т-киллеры в 5 раз ниже контроля со снижением Т-хелперов (CD3 CD4) на 39% и увеличением количества Т-киллеров (CD3 CD8) на 42%; увеличение процентного количества Т-лимфоцитов на 34% по сравнению с соответствующими показателями у интактных крыс. Таблица 4 Иммунограмма крыс до введения тиолов (Ме (25-й; 75-й)) Группы Лимфоциты (%) Т (%) CD3CD4 CD3CD8 Т-хелп./ (%) (%) Т-ЦТЛ B (%) B (абс. число) 30,35 44,3 60,3 36,46 1,65 44,57 1090 (21,5; (37,43; (54,23; (35,24; (1,33; (31,34; (905; 34,87) 48,8) 62,43) 41,87) 1,74) 53,11) 1617) Крысы, 26,8 78,23* 21,09* 78,42* 0,27* 37,02 797,5* получавшие (19,12; (74,04; (15,22; (72,96; (0,18; (27,69; (589,5; цитостатик 33,03) 80,89) 26,42) 84,52) 0,36) 53,06) 887) Интактные крысы Примечание *р<0,05 в сравнении с показателями в группе контроля. Таким образом, показатели иммунограммы до введения аминотиолов подтверждают наличие иммунодефицита как в клеточном, так и в гуморальном звене иммунного ответа у животных, которым вводили циклофосфан. Результат определения аутоантител к альбумину в комплексе с гомоцистеином у крыс с ИДС представлен в табл. 5. До введения экзогенных тиолов содержание аутоантител сопоставимо с данными у интактных животных. Спустя 6 часов после введения как гомоцистеина, так и его тиолактона титр иммуноглобулинов значимо ниже по сравнению с 54 таковым у интактных крыс, у которых на этом сроке эксперимента наблюдалось увеличение титра аутоантител. На этом сроке эксперимента отличия от титра аутоантител до введения экзогенных аминотиолов у крыс с ИДС не выявлялись. После девятидневного введения гомоцистеина и гомоцистеинтиолактона отличия от донагрузочного уровня аутоантител у крыс с ИДС также не выявлялись, но при этом их содержание было значимо меньше, чем у интактных крыс на том же сроке эксперимента. Таблица 5 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у крыс с иммунодефицитом (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки IgG 0 (0; 0) Все классы Ig 1:30 (1:30; 1:60) Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 1:30* 1:60* 1:30* 1:60* (1:30; (1:60; (1:30; (1:60; 1:30) 1:60) 1:30) 1:60) После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 1:15* 1:30* 0 1:60* (0; (0; (0; (0; 1:30) 1:60) 1:30) 1:60) Примечание: *р<0,05 в сравнении с титром у интактных крыс. Для иллюстрации проведенного эксперимента планшеты с результатами РПГА сыворотки интактных и иммунодефектных животных приведены на рис. 6. 55 А Б В Сыворотка интактных крыс А Б В Сыворотка крыс с ИДС Рис. 6. Результат РПГА. А – эритроциты, сенсибилизированные комплексом альбумина с гомоцистеином; Б – эритроциты, сенсибилизированные нативным альбумином; В – несенсибилизированные эритроциты. 56 При исследовании у животных с ИДС аутоантител к комплексу альбумина с тиолактоном гомоцистеина (табл. 6) также не выявлялось отличие их титра через 6 часов и спустя 9 суток в сравнении с исходным значением. В сравнении с интактными крысами зарегистрирован меньший титр иммуноглобулинов в сыворотке крови, взятой у крыс до введения тиолов. Таблица 6 Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеин-тиолактоном у крыс с иммунодефицитом (Ме (25-й; 75-й)) До нагрузки IgG 0* (0; 1:15) Все классы Ig 1:30 (1:30; 1:60) Через 6 ч после введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 0 1:60 0 1:30 (0; 0) (1:30; (0; 0) (1:30; 1:60) 1:60) После 9 дней введения гомоцистеингомоцистеина тиолактона Все Все IgG классы IgG классы Ig Ig 1:15 1:60 1:30 1:60 (0; (0; (0; (0; 1:30) 1:60) 1:30) 1:60) Примечание: *р<0,05 в сравнении с титром в группе контроля. Результат исследования уровня общего гомоцистеина сыворотки крови в группе крыс с ИДС отражен в табл. 7. При заборе крови до введения экзогенного гомоцистеина его концентрация оказалась почти в 2 раза выше, чем у интактных крыс. Изначально высокое содержание этого вещества у иммунодефектных животных может подтверждать регуляторную роль иммунной системы. Спустя 6 часов после инъекции экзогенного гомоцистеина его уровень в сыворотке крови у крыс с ИДС в 3 раза превышал значения в группе контроля; после введения гомоцистеин-тиолактона уровень эндогенного гомоцистеина также, по нашим данным, повышался почти в 2 раза, что можно объяснить образованием гомоцистеина из тиолактона под действием гомоцистеин-тиолактоназы [127]. 57 Причем, следует обратить внимание на то, что через 6 часов после введения экзогенного гомоцистеина его уровень в сыворотке крови у крыс с ИДС превышал на 30% исходное значение (табл. 7), чего не наблюдалось у интактных крыс, где уровень гомоцистеина до и после его введения статистически равен (табл. 3). По прошествии девятидневного введения тиолов уровень эндогенного гомоцистеина по-прежнему оставался почти в 2 раза выше у иммунодефектных крыс по сравнению с концентрацией у интактных. Таблица 7 Уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови у крыс с ИДС (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после введения До нагрузки гомоцистеина гомоцистеинтиолактона После 9 дней введения гомоцистеина гомоцистеинтиолактона 7,18* 9,38*∆ 6,20* 7,50* 8,67* (6,61; 7,59) (7,65; 12,1) (4,92; 10,2) (6,05; 9,29) (6,73; 9,50) Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями в группе контроля; ∆ р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки. После девятидневного введения тиолов уровень гомоцистеина в сыворотке крови не отличался от его содержания до нагрузки. Возврат концентрации гомоцистеина к исходному (донагрузочному) уровню у иммунодефектных крыс через 9 суток, вероятно, связан с включением других, более отсроченных, механизмов его элиминации (реметилирование в метионин ферментом МТГФР и превращение в цистеин под действием ЦβС). 58 3.1.4 Изменения иммунного статуса у крыс на фоне введения гомоцистеина Известно, что гомоцистеин оказывает патогенное действие на лимфоциты [31, 157]. Исходя из этого, в процессе проведения эксперимента нам представилось интересным оценить иммунограмму животных в динамике на фоне введения гомоцистеина. Количество и соотношения лимфоцитов у интактных крыс представлены в табл. 8. Статистически значимых изменений между показателями функционирования иммунной системы до и после введения экзогенного гомоцистеина не выявлено, за исключением относительного числа лимфоцитов. Данный показатель увеличивался в крови животных после девятидневного введения аминотиола по сравнению с исходным значением (до нагрузки). Таблица 8 Динамика количества лимфоцитов у интактных крыс на фоне введения гомоцистеина (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после После 9 дней введения введения гомоцистеина гомоцистеина 30,35 26,49 44,68* (21,5; 34,87) (20,95; 29,56) (31,61; 49,96) Лимфоциты 6226 4977 6404 (абсолютное число) (4295; 8283) (3376; 6370) (3928; 7132) 44,3 43,21 41,1 (37,43; 48,8) (40,92; 49,26) (38,63; 47,56) Т 2658 2143 2562 (абсолютное число) (1414; 3540) (1346; 3138) (1822; 3464) 60,3 60,72 55,04 (54,23; 62,43) (54,43; 69,38) (48,88; 59,67) Исследуемый показатель Лимфоциты (%) Т (%) CD3CD4 (%) До нагрузки 59 Продолжение таблицы 8 Через 6 ч после После 9 дней введения введения гомоцистеина гомоцистеина 36,46 36,27 42,3 (35,24; 41,87) (29,21; 42,6) (39,08; 49,73) 1,648 1,676 1,29 (1,335; 1,737) (1,278; 2,375) (0,983; 1,531) 44,57 46 34,79 (31,34; 53,11) (37,34; 62,36) (31,2; 41,47) B 1090 997,5 1191 (абсолютное число) (905; 1617) (743; 1844) (716; 1501) Исследуемый показатель CD3CD8 (%) Т-хелперы/Т-ЦТЛ B (%) До нагрузки Примечание: *р<0,05 в сравнении со значением, полученным до нагрузки и спустя 6 часов. У иммунодефектных крыс на фоне поступления экзогенного гомоцистеина наблюдались следующие изменения в иммунограмме (табл. 9). Как и у интактных крыс спустя 9 суток введения аминотиола происходило возрастание общего процентного числа лимфоцитов по сравнению со значением до нагрузки гомоцистеином; со стороны общего количества Т-лимфоцитов значимых изменений не наблюдалось, но имело место снижение числа цитотоксических лимфоцитов (CD3CD8) также на 9 сутки. Показатели гуморального иммунитета претерпевали более значительные изменения: относительное количество В-лимфоцитов падало в 4 раза, а абсолютное – в 10 раз. Причем абсолютное число В-лимфоцитов снижалось уже на 6 сутки эксперимента. Также у крыс с иммунодефицитом по сравнению с интактными животными наблюдалось уменьшение всех исследованных показателей иммунограммы, кроме общего относительного количества лимфоцитов и относительного числа В-лимфоцитов до введения гомоцистеина (табл. 9), 60 что, безусловно, объясняется введением этой группы животных цитостатика (как указано в главе «Материалы и методы). Спустя 6 и 9 суток введения гомоцистеина и эти показатели становились значимо ниже, чем у интактных крыс. Таблица 9 Динамика количества лимфоцитов у крыс с ИДС на фоне введения гомоцистеина (Ме (25-й; 75-й)) Через 6 ч после После 9 дней введения введения гомоцистеина гомоцистеина 26,8 11,84* 41,73∆ (19,12; 33,03) (8,852; 19,57) (33,97; 46,83) 78,23* 72,53* 81,67* (74,04; 80,89) (67,33; 80,78) (75,62; 85,25) 21,09* 31,63* 28,78* (15,22; 26,42) (27,19; 43,77) (23,4; 35,06) 78,42* 67,07* 66,66*∆ (72,96; 84,52) (55,32; 71,5) (49,54; 71,92) 0,274* 0,472* 0,407* (0,18; 0,362) (0,38; 0,791) (0,308; 0,546) 37,02 30* 8,241*∆ (27,69; 53,06) (26,03; 33,28) (4,696; 19,04) B 797,5* 440*∆ 81,5*∆ (абсолютное число) (589,5; 887) (243; 586) (33; 164,5) Исследуемый До нагрузки показатель Лимфоциты (%) Т (%) CD3CD4 (%) CD3CD8 (%) Т-хелперы/Т-ЦТЛ B (%) Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями у интактных крыс; ∆ р<0,05 в сравнении с исходным уровнем. Таким образом, выявлено, что у интактных крыс введение экзогенного гомоцистеина не вызывало каких-либо заметных изменений в показателях иммунограммы, зато у животных с уже имеющимся 61 иммунодефицитным состоянием гомоцистеин оказвал негативное влияние как на клеточный, так и на гуморальный иммунитет. 3.1.5 Уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных крыс Уровень циркулирующих иммунных комплексов средней (осажденных 7% ПЭГ) и низкой (осажденных 10% ПЭГ) молекулярной массы в сыворотке крови животных отображен в табл. 10. До введения экзогенных тиолов отсутствовали различия у интактных и иммунодефектных крыс в содержании ЦИК. У крыс с иммунодефицитом спустя 6 часов после введения гомоцистеина содержание ЦИК средней молекулярной массы выше на 28%, а низкомолекулярных ЦИК в 3 раза выше, чем у интактных. После нагрузки гомоцистеин-тиолактоном различия еще более выраженные: уровень среднемолекулярных ЦИК возрос более чем в 2 раза, а низкомолекулярных – в 8 раз по сравнению с соответствующим показателем у интактных крыс. Спустя 9 суток нагрузки метаболитами изменения концентрации иммунных комплексов отмечались только у животных, которым вводили гомоцистеин, причем эти изменения заключались, наоборот, в более низком уровне ЦИК у иммунодефектных животных, чем у интактных: ЦИК средней молекулярной массы почти в 3 раза, а низкомолекулярных почти в 5 раз. У крыс, получавших гомоцистеин-тиолактон содержание ЦИК в сыворотке крови спустя 9 суток как у интактных животных. 62 Таблица 10 Уровень ЦИК у экспериментальных крыс (ед. оп. пл. OD450) (Ме (25-й; 75-й)) Средней молекулярной массы Группа Интактные крысы Крысы с ИДС Через 6 ч после введения До После 9 дней введения гомоцистеин- гомоцистеин- нагрузки гомоцистеина 0,560 0,695 0,347 0,862 0,799 (0,250; (0,503; (0,252; (0,692; (0,004; 0,789) 0,751) 0,581) 0,866) 0,941) 0,305 0,86* 0,742* 0,349* 0,365 (0,036; (0,733; (0,712; (0,266; (0,151; 0,977) 1,228) 1,118) 0,478) 0,588) гомоцистеина тиолактона тиолактона Низкой молекулярной массы Группа Интактные крысы Крысы с ИДС Через 6 ч после введения До гомоцистеин- После 9 дней введения гомоцистеин- нагрузки гомоцистеина 0,338 0,184 0,093 0,792 0,535 (0,178; (0,05; (0,025; (0,581; (0,005; 0,629) 0,328) 0,347) 1,041) 0,781) 0,142 0,627* 0,765* 0,168* 0,154 (0,007; (0,303; (0,647; (0,128; (0,028; 0,775) 1,133) 0,978) 0,24) 0,275) тиолактона гомоцистеина тиолактона Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями в контрольной группе. Возрастание гомоцистеина и количества ЦИК после гомоцистеин-тиолактона введения указывает на экзогенных связывание последних аутоантителами, описанными в разделах 3.1.2 и 3.1.3, и включение в состав иммунных комплексов. Тот факт, что у интактных животных увеличения уровня ЦИК не происходило, объясняется, повидимому, более быстрой элиминацией иммунных комплексов из 63 кровотока путем фагоцитоза, что нарушено у животных, получавших цитостатик. 3.1.6 Изменения в морфологии миокарда и периферической крови у животных на фоне гипергомоцистеинемии В последние годы стало известно, что патогенное действие гомоцистеина заключается не только в индуцировании дисфункции эндотелия, атеросклероза и тромбоза, повышенный уровень этой аминокислоты оказывает повреждающее воздействие на ряд клеток. Как указано в главе «Материалы и методы», во второй серии экспериментов животных разделили на четыре группы: крысам первой и второй групп вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, а третьей и четвертой группам – гомоцистеин в дозе 0,001 мг на 1 мл ОЦК. С целью сопоставить динамику изменений, крысы первой и третьей групп выведены из эксперимента на седьмые сутки, а животные второй и четвертой групп – на четырнадцатые сутки. Концентрация гомоцистеина у исследуемых групп животных представлена в табл. 11. Таблица 11 Уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 3,9 4,16 4,46 14,6* (3,01; 4,48) (3,06; 4,46) (3,9; 4,81) (10,5; 16,2) Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем в контрольных группах. Уровень гомоцистеина у обеих контрольных групп не имел статистических различий. Содержание гомоцистеина у животных третьей 64 группы также не отличалось от показателей в контроле. У крыс четвертой группы концентрация гомоцистеина значимо выше по сравнению с уровнем у крыс, получавших физиологический раствор (первой и второй групп). При проведении макроскопических исследований сердца показатели у экспериментальных групп, получавших гомоцистеин, и контрольных животных не имели статистически значимых различий: геометрические размеры органов были практически идентичны, было лишь зафиксировано небольшое уменьшение массы сердца (на 6% по сравнению со значениями в группах контроля). При изучении гистологического строения миокарда желудочков во всех экспериментальных группах (получавших гомоцистеин) были выявлены следующие изменения: зафиксированы статистически значимые изменения геометрических показателей кардиомиоцитов, в том числе уменьшение их диаметра (порядка 10,9%), снизилось число одноядерных клеточных элементов с соответствующим изменением соотношения одноядерных к многоядерным кардиомиоцитам в сравнении с соответствующими показателями у интактных крыс (первой и второй групп) (табл. 12). Таблица 12 Морфометрические показатели миокарда левого желудочка крыс (Mе (25-й; 75-й)) Показатель Масса сердца (г) Диаметр кардиомиоцитов (мкм) 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 0,91 0,9 0,89 0,85 (0,88; 0,93) (0,88; 0,92) (0,88; 0,9) (0,83; 0,88) 12,25 12,75 9,75* 8,5* (11,5; 13,0) (12,0; 14,0) (9,0; 10,5) (7,0; 10,0) 65 Продолжение таблицы 12 Показатель 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа Количество клеток (%) 16,5 17,0 12,25* 9,5* (15,0; 18,0) (16,0; 18,5) (12,0; 13,0) (8,0; 11,0) двух- и 83,5 83,0 88,0* 90,5* многоядерных (82,0; 85,0) (81,5; 84,0) (87,0; 88,5) (89,0; 92,0) одноядерных к 0,2 0,2 0,14* 0,1* многоядерным (0,18; 0,22) (0,19; 0,23) (0,14; 0,15) (0,09; 0,12) одноядерных соотношение кардиомиоцитам Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы. Гистоморфологически характеризовался миокард межуточным и экспериментальных межклеточным отеком, животных белковой дистрофией основного массива кардиомиоцитов, наряду с несколько неравномерной, диффузно-очаговой гипертрофией части мышечных волокон (их клетки с крупными гиперхромными ядрами и линейными размерами, превышающими средние значения контрольной группы в 1,2 и 1,4 раза), и диффузным перимускулярным кардиосклерозом, максимально выраженным в субэндокардиальной зоне. Причем дистрофические и склеротические процессы в миокарде от четвертой группы животных были выражены резче, чем в тканях животных третьей группы. Так же в ряде случаев (около 30%), на четырнадцатые сутки, в межуточной строме было отмечено формирование диффузных лимфогистиоцитарных инфильтратов с примесью плазматических клеток, эффект фибриноидного набухания периваскулярной стромы и признаки развивающихся васкулитов и капилляритов (рис. 7). 66 Микрофото 1. Миокард левого желудочка крысы первой группы Окраска гематоксилин-эозином; увеличение Х100 Микрофото 2. Миокард левого желудочка крысы первой группы Окраска пикрофуксином по Ван Гизону; увеличение Х100 Рис. 7. Микрофотографии миокарда крыс 67 Микрофото 3. Миокард левого желудочка крысы четвертой группы Окраска пикрофуксином по Ван Гизону; увеличение Х100 Микрофото 4. Миокард левого желудочка крысы третьей группы Окраска гематоксилин-эозином; увеличение Х100 Продолжение рис.7 68 Микрофото 5. Миокард левого желудочка крысы третей группы Окраска пикрофуксином по Ван Гизону; увеличение Х100 Микрофото 6. Миокард левого желудочка крысы четвертой группы Окраска гематоксилин-эозином; увеличение Х100 Продолжение рис. 7 69 В этой же серии экспериментов при исследовании периферической крови отличия с показателями у интактных животных были обнаружены у крыс четвертой группы (т.е. с гипергомоцистеинемией). Изменения заключались в трехкратном снижении числа тромбоцитов, снижении количества эритроцитов на 11% и уровня гемоглобина на 7%, со стороны белой крови зарегистрировано снижение относительного числа лимфоцитов и эозинофилов, повышение количества моноцитов и нейтрофилов у животных, получавших экзогенный гомоцистеин по сравнению с показателями у интактных крыс (табл. 13). Таблица 13 Показатели периферической крови крыс (Ме (25-й; 75-й)) Интактные Получавшие экзогенный (2 группа) гомоцистеин (4 группа) Гемоглобин 149,0 138,0* (г/л) (144,0; 156,0) (136,0; 140,0) Эритроциты 7,8 6,99* (×1012/л) (7,7; 8,1) (6,5; 7,1) Тромбоциты 718,5 238,5* (×109/л) (627,0; 760,5) (200,0; 248,0) Лейкоциты 7,45 6,45 (×109/л) (5,15; 9,75) (4,4; 8,7) 69,75 54,45* (66,05; 74,1) (43; 60,1) 5,4 12,15* (4,2; 6,6) (11,6; 16,7) 18,95 27,35* (16,9; 21,2) (25,6; 29,8) 7,4 1,65* (6,65; 8,15) (0,3; 2,2) Показатель Лимфоциты (%) Моноциты (%) Нейтрофилы (%) Эозинофилы (%) 70 Продолжение таблицы 13 Группа Базофилы (%) Интактные Получавшие экзогенный (2 группа) гомоцистеин (4 группа) 1 1,2 (0,95; 1,05) (0,9; 2,3) Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями у интактных крыс. Таким образом, в этой серии экспериментов получено подтверждение токсичного влияния высокого уровня гомоцистеина на кардиомиоциты, эритроциты и тромбоциты. 3.1.7 Экспрессия тканевого фактора у экспериментальных животных При оценке результатов исследования экспрессии тканевого фактора в образцах миокарда экспериментальных животных в баллах по шкале от 1 до 4 (как описано в главе «Материалы и методы») получены следующие данные. У интактных крыс (первой группы) средний балл экспрессии тканевого фактора эндотелиоцитами соответствовал 1 (10 – 25% окрашенных клеток), в то время как у животных с гипергомоцистеинемией (четвертой группы) – 2 баллам (от 25 – до 50% окрашенных клеток). Интенсивность экспрессии тканевого фактора фибробластами у обеих групп крыс одинакова и соответствовала 1 баллу. При визуальной оценке окрашивания нейтрофилов и фиброцитов в обеих группах получен отрицательный результат (менее 10% окрашенных клеток). Микрофотографии препаратов, из подвергнутых визуальной оценке, представлены на рис. 8. 71 Миокард интактной крысы (увеличение Х400) Миокард крысы четвертой группы (увеличение Х400) (экспрессия тканевого фактора эндотелием указана стрелкой) Рис. 8. Экспрессия тканевого фактора 72 Интенсивная экспрессия тканевого фактора эндотелиоцитами в образцах миокарда крыс на фоне введения гомоцистеина подтверждает прокоагулянтный эффект этой аминокислоты, что вносит значительный вклад в развитие тромботических осложнений на фоне гипергомоцистеинемии. 3.2 Результаты исследования больных сердечно-сосудистой патологией 3.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину По результатам проведенного иммуноферментного анализа уровень аутоантител к модифицированному альбумину в сыворотке крови максимален у больных стабильной и прогрессирующей стенокардией. В то же время у таких больных отмечался минимальный уровень аутоантител в ротовой жидкости в сравнении с показателем в группе контроля. Уровень аутоантител к тромбину в сыворотке крови также значимо выше в группе больных с прогрессирующей стенокардией (табл. 14). Таблица 14 Содержание аутоантител к комплексу гомоцистеин-альбумин и тромбину (ед. оп. пл.) (Ме (25-й; 75-й)) Группа Аутоантитела Аутоантитела класса IgG к класса S-IgA к модифицированному модифицированному Аутоантитела класса IgG к тромбину в альбумину в альбумину в сыворотке ротовой жидкости Kонтрольная группа 0,026 0,014 0,055 (n=12) (0,010; 0,038) (0,010; 0,057) (0,036; 0,140) Стабильная 0,075* 0,010 0,081 стенокардия (n=12) (0,000; 0,076) (0,000; 0,057) (0,034; 0,185) сыворотке 73 Продолжение таблицы 14 Группа Аутоантитела Аутоантитела класса IgG к класса S-IgA к модифицированному модифицированному Аутоантитела класса IgG к тромбину в альбумину в альбумину в сыворотке ротовой жидкости Прогрессирующая 0,066* 0,012* 0,144* стенокардия (n=12) (0,039; 0,111) (0,001; 0,020) (0,079; 0,181) Острый инфаркт 0,043 0,023* 0,092 миокарда (n=10) (0,026; 0,049) (0,007; 0,038) (0,039; 0,278) сыворотке Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями в группе контроля. Как следует из табл. 14, у здоровых лиц выявлены аутоантитела класса IgG к модифицированному альбумину в сыворотке крови и класса S-IgА смешанной слюне. Вместе с этим, в сыворотке крови исследованных лиц выявлены аутоантитела к тромбину. В сыворотке крови лиц контрольной группы и страдающих гипертонической болезнью уровень гомоцистеина находился в пределах нормы (табл. 15). У больных стабильной стенокардией концентрация гомоцистеина также не выходила за пределы установленной верхней границы нормы (15 мкмоль/л), однако регистрировалось статистически значимое повышение этого показателя по сравнению с таковым у здоровых лиц. У пациентов с прогрессирующей стенокардией и острым инфарктом миокарда, как в момент поступления в стационар, так и по прошествии 7 суток лечения уровень гомоцистеина в сыворотке крови можно расценивать как умеренную гипергомоцистеинемию. 74 Таблица 15 Содержание общего гомоцистеина в сыворотке крови (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Группа Контрольная группа (n=12) Гипертоническая болезнь I – II ст. (n=22) Стабильная стенокардия (n=12) Прогрессирующая стенокардия (n=12) Острый инфаркт миокарда 1 сутки (n=10) Инфаркт миокарда 7 суток (n=10) Сыворотка крови Ротовая жидкость 5,988 0,232 (5,079; 7,876) (0,083; 0,281) 8,107 0,231 (7,077; 10,82) (0,153; 0,511) 10,21* 0,366 (9,059; 12,01) (0,201; 0,451) 17,13* 0,111 (12,278; 27,86) (0,044; 0,167) 24,911* 0,261 (23,677; 28,454) (0,209; 0,303) 28,945* 0,132 (27,267; 31,132) (0,103; 0,174) Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем в контрольной группе. Полученные в этой части исследования данные согласуются с общепринятыми в литературе и не позволяют выявить отличий показателей у исследованных нами лиц от общеизвестных значений. В смешанной слюне (ротовой жидкости) отмечено содержание гомоцистеина в среднем в 120 раз ниже, чем в сыворотке крови. При этом, каких либо значимых различий между показателями у здоровых лиц и исследованных групп больных нами не выявлено. 3.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы у больных сердечно-сосудистой патологией Крупномолекулярные циркулирующие иммунные комплексы (осажденные 3,5% раствором ПЭГ) в сыворотке крови во всех исследованных нами группах не выявлены (табл. 16). В содержании ЦИК 75 средней молекулярной массы (осажденные 7% раствором ПЭГ) в сыворотке крови у лиц с гипертонической болезнью I и II стадий не выявлены отличия по сравнению с показателями у здоровых. Содержание же ЦИК средней молекулярной массы у больных как стабильной, так и прогрессирующей стенокардией на 40% выше в сравнении с уровнем у контрольной группы. У пациентов с острым инфарктом миокарда на первые сутки поступления в стационар отмечался на 40% меньший уровень ЦИК, чем у лиц контрольной группы. На седьмые сутки этот показатель приближался к таковому в группе контроля. В содержании сывороточных ЦИК низкой молекулярной массы (осажденные 10% раствором ПЭГ) у исследованных нами больных мы наблюдали сходную картину. У лиц с гипертонической болезнью I и II стадий отличия от здоровых в этом показателе также не выявлялись. Среди пациентов с ИБС повышение приблизительно на 16%, чем в группе контроля, низкомолекулярных ЦИК отмечалось только при стабильной стенокардии. У пациентов с острым инфарктом миокарда на первые сутки имелось снижение более чем в два раза ЦИК с возвратом на седьмые сутки к уровню, зарегистрированному у контрольной группы. В ротовой жидкости регистрировалось наличие иммунных комплексов средней и высокой молекулярной массы у больных стабильной стенокардией, комплексов средней и низкой молекулярной массы у пациентов с инфарктом миокарда, как на первые, так и на седьмые сутки (табл. 16). 76 Таблица 16 Уровень ЦИК (ед. оп. пл. OD450) (Ме (25-й; 75-й)) Группа Контроль (n=12) ГБ I стадии (n=10) ГБ II стадии (n=12) ИБС: стабильная стенокардия (n=12) ИБС: прогрессии рующая стенокардия (n=12) Острый инфаркт миокарда 1 сутки (n=10) Острый инфаркт миокарда 7 суток (n=10) 3,5% ПЭГ 0 0 0 Сыворотка 7% ПЭГ 0,206 (0,112; 0,255) 0,223 (0,144; 0,293) 0,214 (0,147; 0,341) 10% ПЭГ 0,236 (0,1; 0,267) 0,209 (0,123; 0,273) 0,151 (0,137; 0,283) 3,5% ПЭГ Ротовая жидкость 7% 10% ПЭГ ПЭГ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,284* (0,197; 0,312) 0,275* (0,275; 0,383) 0,002 (0; 0,014) 0,005* (0; 0,007) 0 0 0,282* (0,169; 0,324) 0,174 (0,138; 0,266) 0 0 0 0 0,125* (0,075; 0,16) 0,1* (0,07; 0,11) 0 0,004 (0,001; 0,005) 0,005* (0,001; 0,008) 0 0,184 (0,113; 0,221) 0,118 (0,114; 0,18) 0 0,007* (0,001; 0,01) 0,002 (0; 0,007) Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями в группе контроля. 3.2.3 Результаты проведения корреляционного анализа между исследованными показателями По данным оценки корреляционной взаимосвязи по методу Спирмена составлена табл. 17. 77 Таблица 17 Коэффициенты корреляции между исследованными показателями в сыворотке крови Контрольная группа Исследованный показатель Гомоцистеин ЦИК низкой ЦИК средней молекулярной молекулярной массы массы Аутоантитела -0,8* 0,8 0,1 Гомоцистеин - 0,2 -0,6* Стабильная стенокардия Исследованный показатель Гомоцистеин ЦИК низкой ЦИК средней молекулярной молекулярной массы массы Аутоантитела -0,8* 0,2 0,2 Гомоцистеин - -0,6* -0,6* Прогрессирующая стенокардия Исследованный показатель Гомоцистеин ЦИК низкой ЦИК средней молекулярной молекулярной массы массы Аутоантитела 0,5 0,4 0,9 Гомоцистеин - 0,4 0,4 Острый инфаркт миокарда Исследованный показатель Гомоцистеин ЦИК низкой ЦИК средней молекулярной молекулярной массы массы Аутоантитела 0,2 0,4 0,4 Гомоцистеин - -0,7* 0,6 Примечание: *р<0,05. При проведении корреляционного анализа обнаружена сильная отрицательная связь (коэффициент r=0,8) между уровнями гомоцистеина и 78 аутоантител в группе больных стабильной стенокардией и в контрольной группе. Это может подтверждать выполнение аутоантителами к альбумину, модифицированному гомоцистеином регуляторной функции, заключающейся в элиминации возрастающего уровня гомоцистеина у лиц со стабильной стенокардией и о наличии сенсибилизации организма к комплексу альбумина и гомоцистеина у здоровых лиц. При оценке результатов корреляционного анализа обнаружена также отрицательная связь средней силы между концентрацией гомоцистеина и содержанием иммунных комплексов средней и низкой молекулярной массы в группе больных стабильной стенокардией (r=0,6); между концентрацией гомоцистеина и содержанием иммунных комплексов низкой молекулярной массы у лиц с инфарктом миокарда (r=0,7) и между концентрацией гомоцистеина и содержанием иммунных комплексов средней молекулярной массы в группе контроля (r=0,6) (табл. 17). Что говорит о возможном включении комплексов альбумина с гомоцистеином в состав таких ЦИК. 3.2.4 Метиониновый нагрузочный тест с определением уровня гомоцистеина в ротовой жидкости Результат, полученный при проведении метионинового нагрузочного теста, представлен в табл. 18. Уровень гомоцистеина в сыворотке крови соответствовал всем литературным нормативам и не позволил выявить отличия у жителей Забайкалья по сравнению с представителями других регионов России [18, 50] и стран мира [111, 131, 144]. У здоровых лиц после проведения метиониновой нагрузки по методике, описанной в главе «Материалы и методы», в сыворотке крови наблюдалось повышение уровня общего гомоцистеина на 60% от исходного. В ротовой жидкости при этом, напротив, отмечалось снижение 79 концентрации гомоцистеина на 30% через 4 часа после перорального приема метионина. Таблица 18 Динамика уровня общего гомоцистеина (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)) Сыворотка Ротовая жидкость Через 4 ч Группа До нагрузки Через 4 ч после До нагрузки после нагрузки нагрузки Контроль 4,25 6,95* 0,04 0,03* (n=10) (3,33; 4,81) (5,56; 8,89) (0,01; 0,08) (0,01; 0,03) 5,96∆ 7,77 0,92∆ 0,78*∆ (5; 6,7) (5,56; 9,41) (0,33; 2,42) (0,37; 1,22) Гипертоническая болезнь (n=21) Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки; ∆ р<0,05 в сравнении с показателями у контрольной группы. У пациентов с гипертонической болезнью исходный уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови выше на 50%, чем у лиц контрольной группы. Обращает на себя внимание то, что в ротовой жидкости исходный уровень гомоцистеина у лиц с гипертонической болезнью более чем в 20 раз выше, чем в контрольной группе. После метионинового нагрузочного теста у больных гипертонической болезнью также отмечалось повышение сывороточного гомоцистеина. В слюне, аналогично показателям контрольной группы имело место снижение концентрации гомоцистеина на 20%, при этом его уровень, по-прежнему, более чем в 20 раз превышал таковой у здоровых лиц. Проведение метионинового нагрузочного теста для выявления скрытой гипергомоцистеинемии с определением концентрации 80 гомоцистеина в ротовой жидкости является актуальным направлением исследований, поскольку методика получения материала неинвазивной и позволяет избежать многократного забора крови. Глава 4 Обсуждение полученных результатов является 81 4.1 Обсуждение результатов экспериментального исследования Уровень 4.1.1 гомоцистеина и титр аутоантител к модифицированному альбумину Известно, что большая часть гомоцистеина в плазме крови связана с альбумином (от 70% до 80%) [3]. В нашей работе, на первом этапе, получен комплекс сывороточного альбумина с гомоцистеином в условиях in vitro. При технологии, описанной в главе «Материалы и методы», отличающейся от физиологических условий, прежде всего, температурным режимом и, следовательно, скоростью реакций, приблизительно 40% гомоцистеина образовало химическую связь с альбумином. Следует заметить, что сам гомоцистеин связывается с белком путем образования дисульфидной связи с SH-группой аминокислотного остатка цистеина. В связанном с альбумином состоянии в кровотоке находится и его метаболит гомоцистеин-тиолактон. Сайтами связывания в молекуле белка для этого соединения служит свободная аминогруппа остатков лизина. Общепринято, что альбумин, комплексируясь с гомоцистеином, выполняет транспортную функцию. Показано, что альбумин является основным белком, транспортирующим гомоцистеин [133, 152]. При выполнении транспортной функции конформация и свойства альбуминовых центров изменяются [17]. В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что альбумин в комплексе с гомоцистеин-тиолактоном (или гомоцистеинилированный альбумин) подвергается модификации и приобретает аутоантигенные свойства [115, 126], и поэтому инициирует гуморальный иммунный ответ. В нашей работе исследована модифицированному гомоцистеином. динамика как аутоантител гомоцистеин-тиолактоном, к так альбумину, и самим 82 Исследованные аутоантитела в литературе рассматриваются, прежде всего, как фактор повреждения и инициации атеросклеротического процесса на фоне гипергомоцистеинемии [59]. Согласно известным данным, иммунные комплексы, фиксируясь на мембране эндотелиоцитов, активируют систему комплемента с последующим образованием спектра повреждающих медиаторов, вызывают выделение из клеток, имеющих Fcрецепторы, лизосомальные ферменты и активные формы кислорода. Описанные эффекторные механизмы, завершающие аутоиммунный ответ на циркулирующий в кровотоке антиген, приводят к очаговому повреждению эндотелия с последующим формированием атеросклеротической бляшки. Однако любой иммунный ответ первоначально имеет защитное значение, и в нашем экспериментальном исследовании продемонстрировано, что образующиеся к модифицированному альбумину аутоантитела, являются одним из механизмов элиминации гомоцистеина и его производного гомоцистеин-тиолактона. Можно полагать, что при достаточно хорошем клиренсе из кровотока циркулирующих иммунных комплексов (например, путем фагоцитоза), аутоантитела несут защитную функцию, контролируя тем самым уровень гомоцистеина в пределах физиологических значений. Но в случае ослабления механизмов элиминации из циркуляции иммунных комплексов, они преципитируют на эндотелии и оказывают повреждающий эффект. Наличие аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином у интактных крыс до введения им экзогенного тиола (табл. 1), говорит о том, что этот комплекс вызывает иммунизацию при физиологических концентрациях гомоцистеина. Сформировавшийся гуморальный иммунный ответ сопровождается сохранением в организме В-клеток памяти, которые при последующих встречах с антигеном обеспечивают вторичный иммунный ответ. Этим можно объяснить 83 возрастание титра аутоантител у интактных крыс через 6 часов после поступления в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеинтиолактона. Уровень гомоцистеина (табл. 3) у интактных крыс после его введения не отличался от исходного на фоне роста титра аутоантител, что свидетельствует об их регуляторной функции, направленной на поддержание концентрации гомоцистеина в пределах физиологических значений. У крыс, которым вызвали иммунодефицит, содержание гомоцистеина в сыворотке крови изначально (до введения экзогенных аминотиолов) значимо выше, чем у интактных (табл. 7). Этот факт также позволяет предполагать наличие регуляторной роли аутоиммунного ответа на модифицированные гомоцистеином белки. Содержание аутоантител к альбумину, модифицированному как гомоцистеином (табл. 5), так и гомоцистеин-тиолактоном (табл. 6) сопоставимо с интактными животными как до, так и после введения экзогенных гомоцистеина и его тиолактона. Таким образом, иммунная система не отвечает развертыванием иммунного ответа с образованием аутоантител на поступивший извне антиген. Соответственно не происходит такого ответа и в течение 9 дней эксперимента. На фоне описанных изменений мы наблюдали резкий подъем в плазме крови уровня гомоцистеина, в сравнении с исходным, после его инъекции экспериментальным животным (табл. 7). На фоне введения гомоцистеин-тиолактона уровень эндогенного гомоцистеина также, по нашим данным, повышался почти в 2 раза, что можно объяснить образованием гомоцистеина из тиолактона под действием гомоцистеинтиолактоназы. 84 По прошествии девяти суток введения тиолов уровень эндогенного гомоцистеина по прежнему оставался почти в 2 раза выше у иммунодефектных крыс по сравнению с интактными. После девятидневного введения тиолов уровень гомоцистеина в сыворотке крови не отличался от его содержания до нагрузки. Возврат уровня гомоцистеина к (исходному) донагрузочному уровню у иммунодефектных крыс через 9 суток, вероятно, связан с включением других, более отсроченных, механизмов его элиминации (реметилирование в метионин ферментом метионинсинтетазой при участии фермента МТГФР и превращение в цистеин под действием ЦβС). Все вышеизложенные факты подчеркивают роль иммунной системы в поддержании уровня гомоцистеина в пределах физиологических цифр, путем элиминации модифицированного альбумина. Данные, полученные при исследовании ЦИК в эксперименте, можно объяснить снижением степени элиминации иммунных комплексов из кровотока путем фагоцитоза в результате снижения числа фагоцитирующих клеток на фоне применения цитостатика, а также развитием дисфункции эндотелия на фоне повышения уровня гомоцистеина. 4.1.2 Показатели иммунитета, форменные элементы крови и морфологические изменения миокарда у экспериментальных животных В процессе проведения экспериментальной работы представилось интересным рассмотреть влияние введения экзогенного гомоцистеина на ряд систем. У интактных крыс на фоне введения экзогенных гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона практически не происходило каких-либо изменений количества и соотношения лимфоцитов. Имелось лишь 85 увеличение общего относительного числа лимфоцитов, зарегистрированное после девятидневного введения тиолов, что можно объяснить естественной реакцией организма на многократные инвазивные вмешательства. Для объяснения действия гомоцистеина на кардиомиоциты, лейкоциты, эритроциты и тромбоциты необходимо отметить, что гомоцистеин способен взаимодействовать с группой глутаматных рецепторов – рецепторами к N-метил-D-аспартату. Структура молекулы гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты имеет сходство с N-метил-Dаспартатом (NMDA) (рис. 9). Рис. 9. Структурные формулы N-метил-D-аспартата, гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты Исходя из этого, столь выраженное токсическое действие гомоцистеина на иммуннокомпетентные можно объяснить активацией NMDA-рецепторов на мембране лимфоцитов, что вызывает вход ионов кальция в клетку с последующей индукцией апоптоза, а также рост содержания активных форм кислорода в цитоплазме, гибель клеток и подавление иммунного ответа [5, 6, 9, 31, 157]. Количество этих рецепторов зависит от функционального состояния клеток. При активации лимфоцитов (наличие в организме воспаления) увеличивается доля клеток, 86 синтезирующих и экспрессирующих на своей мембране NMDA- рецепторы. Тот факт, что у интактных крыс нами не выявлено изменений в иммунограмме на фоне введения экзогенного гомоцистеина и его тиолактона, возможно, связан с гораздо меньшей долей лимфоцитов, несущих NMDA-рецепторы у этих животных, по сравнению с крысами, получавшими цитостатик. У последних, на фоне лимфоцитопении и, сопровождаемых ею инфекционно-воспалительных процессов, имела место активация клеток, экспрессия ими рецепторов к N-метил-Dаспартату, что позволило гомоцистеину на фоне введения циклофосфана, вызывать еще более выраженную гибель лимфоцитов. Известно влияние гомоцистеина на систему коагуляционного гемостаза, заключающееся в инициации фибринообразования [11, 12]. Гомоцистеин стимулирует агрегацию и адгезию тромбоцитов, увеличивает генерацию тромбина, снижает синтез антикоагулянтов. Усиление агрегации тромбоцитов может быть обусловлено ингибированием синтеза простациклина. В норме эндотелиальные клетки препятствуют адгезии клеток циркулирующей крови к поверхности сосудов, а также обладают антитромботическими и фибринолитическими свойствами [64, 88]. Повреждение эндотелия, спровоцированное гипергомоцистеинемией, сопровождается активацией зависимого от эндотелия звена гемостаза и усилением агрегации тромбоцитов. В литературе имеются сведения о том, что гомоцистеин нарушает функцию тканевого активатора плазминогена, способствует связыванию липопротеина(а) с фибрином, что ведет к угнетению фибринолиза. Также гомоцистеин в повышенной концентрации ингибирует функцию естественных антикоагулянтов, таких, как антитромбин III и протеин С [158, 162]. Кроме того, он способен изменять нормальные антитромботические свойства эндотелия, что приводит к 87 увеличению активности факторов свертывания – V, X и XII [21, 97, 150, 154]. В нашей работе было зарегистрировано резкое снижение количества тромбоцитов у животных на фоне введения гомоцистеина. Данный факт также укладывается в картину токсического действия изучаемой аминокислоты. Описанные выше NMDA-рецепторы недавно обнаружены на мегакариоцитах [6]. Исходя из этого, можно предположить токсическое действие гомоцистеина, заключающееся в индукции процессов ПОЛ, поступлении в цитоплазму ионов кальция, и на предшественники тромбоцитов в костном мозге. Такое резкое снижение количества тромбоцитов не может быть объяснено только их потреблением вследствие усиленной агрегации, обусловленной высоким уровнем гомоцистеина. Выявленная тромбоцитопения подтверждает токсическое действие гомоцистеина, вызывающее гибель клеток, в том числе мегакариоцитов, имеющих NMDA-рецепторы. Обнаруженное нами резкое снижение количества тромбоцитов на фоне введения экзогенного гомоцистеина также может вносить свой вклад в формирование повреждения эндотелия и индукции атеросклероза, так как нарушена трофическая функция тромбоцитов по отношению к эндотелию. При исследовании показателей периферической крови у экспериментальных животных полученный нами результат согласуется с литературными данными, из которых следует выделить работы Арзуманян Е.С. и соавторов (2008 г.). В их исследованиях обнаружено, что при инкубации эритроцитов с гомоцистеиновой кислотой (рис. 9) усиливается их гемолиз, вызываемый различными факторами [26]. Профессор Болдырев А.А. связывает данный эффект с фактом обнаружения на мембране эритроцитов белка, реагирующего с антителами к NMDA- 88 рецепторам. Этот протеин вызывает поступление кальция в эритроциты после их инкубации с N-метил-D-аспартатом [62]. Сказанное позволяет предположить, что данный белок является молекулярной мишенью токсического действия гомоцистеиновой кислоты. Разрушение эритроцитарной мембраны при этом объясняется ростом содержания активных форм кислорода и усилением процесса перекисного окисления липидов. Описанный процесс может лежать в основе выявленного нами снижения количества эритроцитов на фоне введения экзогенного гомоцистеина, так как большая часть несвязанного с белками Нсу в плазме крови подвергается окислению с образованием гомоцистеиновой кислоты. Исходя из данных эксперимента по изучению морфологических изменений миокарда, нами было установлено, что интоксикация животных гомоцистеином вызывает значительные изменения в структурной организации миокарда, что влияет на нарушение кровообращения как в самом сердце, так и во всем организме. Gill S. и соавторы (2007 г.) указывают на наличие в кардиомиоцитах NMDA-рецепторов [104]. Исходя из этого, в основе токсического эффекта гомоцистеина на миокард также лежит способность самого гомоцистеина и продукта его аутоокисления гомоцистеиновой кислоты (рис. 9) активировать NMDA-рецепторы, создавая в клетках повышенный уровень ионов кальция и активных форм кислорода, что приводит к повреждению и гибели клеток. Окислительный стресс считается основным механизмом патогенного действия гомоцистеина. Последний также нарушает нормальную продукцию оксида азота эндотелиальными клетками, понижает его биодоступность за счет повышения окислительной инактивации. Одновременно повышается экспрессия матриксных металлопротеиназ, что обуславливает повышение синтеза коллагена гипергомоцистеинемии в интерстиции являются миокарда. повреждения клеток, Следствием развитие 89 воспалительной реакции в поврежденных тканях. В нашей работе мы получили наглядное подтверждение этого: количество миокардиоцитов уменьшилось, в тканях миокарда появились признаки воспаления, репаративные процессы снизились, развилась рабочая гипертрофия миокардиоцитов. 4.2 Обсуждение результатов исследования больных сердечно-сосудистой патологией 4.2.1 Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину и тромбину В сыворотке крови и ротовой жидкости здоровых людей выявляются аутоантитела к модифицированному альбумину, данный факт говорит о возможности комплексирования гомоцистеина с альбумином в физиологических условиях и о сенсибилизации организма к этому комплексу. Обращает внимание содержание аутоантител класса S-IgА к конъюгатам альбумина в ротовой жидкости. Этот факт указывает на интенсивное образование аутоантител в реакции местного иммунитета. Наряду со сказанным, в сыворотке крови доноров выявлены аутоантитела к тромбину. Ранее Н.Н. Цыбиковым (1982 г.) было показано, что аутоантитела к тромбину регистрируются в высоком титре в цитратной плазме крови, а в сыворотке их концентрация не определяется или определяется в крайне низких цифрах, что может быть объяснено связыванием аутоантител генерирующимся тромбином в процессе свертывания плазмы [43]. Следует отметить, что у больных стабильной и прогрессирующей стенокардией возрастало содержание аутоантител к комплексу гомоцистеин-альбумин в сыворотке крови, а в слюне снижалось (табл. 14). Увеличение уровня аутоантител в сыворотке крови может быть связано с иммунизирующим действием модифицированного альбумина, так как в 90 эту стадию коронарного атеросклероза отмечен высокий уровень гомоцистеина (табл. 15). Снижение же концентрации аутоантител в ротовой жидкости, вероятно, обусловлено их связыванием с антигеном с последующим включением в состав иммунных комплексов. Следует отметить также, что у этих же групп пациентов в сыворотке крови выявлялся наибольший уровень циркулирующих иммунных комплексов из всех исследованных нами групп больных (табл. 16). У пациентов с острым инфарктом миокарда, несмотря на то, что уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови максимален (табл. 15), концентрация аутоантител значимо не отличается от таковой в контрольной группе, что может быть объяснено развитием иммунодепрессии на фоне острого инфаркта миокарда. У больных с прогрессирующей стенокардией значительно увеличивалось содержание аутоантител к тромбину, что, возможно, является косвенным признаком интенсификации перманентного внутрисосудистого свертывания крови, усилением генерации тромбина и проявлением его иммуногенной активности. Следует полагать, что рост уровня аутоантител к тромбину отражает компенсаторную реакцию системы иммунитета на угрозу фибринообразования. Отрицательная корреляционная связь, обнаруженная между уровнем гомоцистеина и аутоантител в группе больных стабильной стенокардией и у здоровых лиц, говорит о выполнении аутоантителами к альбумину, модифицированному гомоцистеином, регуляторной функции, заключающейся в элиминации возрастающего уровня гомоцистеина у лиц со стабильной стенокардией и о наличии сенсибилизации организма к комплексу альбумина и гомоцистеина у здоровых лиц. Исходя из выявленных закономерностей, можно сделать предположение о том, что повышение уровня общего гомоцистеина в 91 плазме крови с возрастом объясняется ослаблением у пожилых системы иммуно-биологического надзора. 4.2.2 Циркулирующие иммунные комплексы Известно, что размер ЦИК является существенным фактором, имеющим значение для проявления их патогенных свойств [132, 136, 155]. Низкомолекулярные комплексы, по сравнению с крупными, хуже активируют комплемент [75; 102]. Результатом этого является их длительное присутствие в циркуляции и, как следствие, повышение вероятности отложения агрегатов в различных тканях [89, 136]. Поэтому, определяя параметр размерности ЦИК, можно косвенно оценивать их биологические свойства и возможные негативные последствия. Считается, что при низкой концентрации ПЭГ осаждаются крупные ЦИК, а с увеличением его концентрации преципитируют как крупные, так и меньшие по размерам протеиновые структуры [156]. С ростом концентрации ПЭГ в растворе происходит дополнительное осаждение более мелких по размерам белковых молекул. По результатам нашего исследования в сыворотке крови у лиц всех исследованных групп не обнаружены крупномолекулярные ЦИК, что можно объяснить эффективной их элиминацией из кровотока за счет работы системы комплемента и фагоцитоза (табл. 16). Концентрация ЦИК средней и низкой молекулярной массы у пациентов с гипертонической болезнью не отличалась от таковой у лиц из контрольной группы, у больных стабильной и прогрессирующей стенокардией отмечалось увеличение уровня ЦИК (табл. 16), также как и аутоантител к модифицированному альбумину (табл. 14). У пациентов с острым инфарктом миокарда на первые сутки отмечено снижение содержания ЦИК средне- и низкомолекулярных, что можно объяснить увеличением фагоцитарной активности на фоне абсолютного нейтрофильного 92 лейкоцитоза. На седьмые сутки у исследованных лиц с острым инфарктом миокарда уровень ЦИК приближался к таковому в группе контроля. 4.2.3 Метиониновый нагрузочный тест При проведении метионинового нагрузочного теста с измерением уровня гомоцистеина в ротовой жидкости представляет определенный интерес уже описанный факт обнаружения гомоцистеина в данном биологическом секрете [30]. Возникает вопрос об его источнике в смешанной слюне. На наш взгляд, гомоцистеин может выделяться в составе секрета слюнных желез, а также транссудироваться через сосуды ротовой полости. Не исключено, что основным путем поступления гомоцистеина в ротовую жидкость является зубодесневая бороздка, по аналогии с другими низкомолекулярными соединениями. У больных гипертонической болезнью концентрация гомоцистеина была значительно выше в слюне по сравнению с уровнем у лиц контрольной группы как до, так и после нагрузки метионином, а в сыворотке крови такой закономерности не выявлено. Этот факт позволяет предполагать, что один из возможных механизмов компенсации гипергомоцистеинемии может быть связан со «сбросом» избытка этого метаболита в различные секреты, в том числе в ротовую жидкость. Следует указать, что через 4 часа после нагрузки метионином не обнаружено особых изменений концентрации гомоцистеина в сыворотке крови. В ротовой жидкости уровень гомоцистеина, по нашим данным, у здоровых лиц и больных значимо снижался (табл. 18). Этот сдвиг позволяет предполагать включение механизмов элиминации гомоцистеина как ферментами, так и, возможно, альтернативными путями, в том числе – иммунными. Можно предположить, что элиминация гомоцистеина как потенциально повреждающего агента связана с активацией местного иммунитета и выработкой аутоантител класса S-IgA. В литературе 93 описаны исследования, свидетельствующие о возможности комплексирования гомоцистеина с различными белками плазмы крови и, особенно, с альбумином [4, 152]. Конъюгат гомоцистеин-альбумин способен обладать аутоантигенными свойствами и вызывать образование аутоантител [81]. Известно, что сывороточный альбумин человека содержится в смешанной слюне в количестве 0,05 – 0,3 г/л [148], попадая туда большей частью из десневой жидкости, и, безусловно, также модифицируется гомоцистеином, приобретая иммуногенные свойства. Сформированные иммунные комплексы могут явиться дополнительным механизмом элиминации гомоцистеина, более срочным, чем метаболические превращения в цистеин или реметилирование в метионин. Обращает на себя внимание кратно большее содержание гомоцистеина в ротовой жидкости больных гипертонической болезнью по сравнению с уровнем в контрольной группе, что может свидетельствовать о более интенсивной транссудации его из плазмы крови, что компенсирует гипергомоцистеинемию на ранних сроках развития. Этот факт может объяснить то, что превышение нормального уровня гомоцистеина зарегистрировано нами только в 6% случаев у больных гипертонической болезнью; метиониновый нагрузочный тест у всех исследованных явился отрицательным. Наличие гомоцистеина в ротовой жидкости свидетельствует о возможности выведения его через этот биологический секрет. Уменьшение его уровня после метиониновой нагрузки может быть связано с действием аутоантител класса S-IgA к модифицированному гомоцистеином альбумину. Таким образом, полученные данные позволяют актуализировать дальнейшее изучение альтернативных путей элиминации гомоцистеина, в том числе выведение его в различные секреты, а также иммунные механизмы регуляции его уровня. 94 Исследование концентрации гомоцистеина в ротовой жидкости делает возможным в перспективе неинвазивное измерение уровня этого вещества у пациентов с целью своевременного выявления ранних нарушений его метаболизма. Выводы 95 1. Инкубация сывороточного альбумина с гомоцистеином in vitro сопровождается образованием комплекса, в котором 40% гомоцистеина конъюгирует с белком. 2. У интактных крыс уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови остается в пределах нормальных значений как до, так и после введения высоких доз экзогенных аминотиолов на фоне увеличения титра аутоантител к модифицированному гомоцистеином альбумину. У животных с иммунодефицитом увеличивается как исходный уровень гомоцистеина, так и его содержание после введения экзогенных аминотиолов при отсутствии динамики со стороны аутоантител. 3. На фоне высокой концентрации гомоцистеина отмечаются структурные нарушения миокарда, уменьшение количества клеток и форменных элементов экспрессии тканевого периферической фактора крови и эндотелиоцитами, увеличение но не фибробластами и нейтрофилами. 4. Наличие аутоантител к комплексу гомоцистеина с альбумином у здоровых лиц свидетельствует о сенсибилизации данным антигеном при нормальных значениях гомоцистеина. У больных сердечнососудистой патологией наибольший уровень гомоцистеина в сыворотке крови зарегистрирован при остром инфаркте миокарда, аутоантител – при прогрессирующей стенокардии. 5. У крыс с иммунодефицитом, в отличие от интактных, отмечается увеличение концентрации ЦИК средней и низкой молекулярной массы через 6 часов после введения гомоцистеина и снижение – спустя 9 суток. Среди больных сердечно-сосудистой патологией уровень ЦИК средней и низкой молекулярной массы наибольший при стабильной стенокардии. 96 6. При проведении метионинового нагрузочного теста наблюдается повышение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и снижение – в ротовой жидкости через 4 часа после перорального приема метионина. Список сокращений 97 АМФ – аденозинмонофосфат ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГБ – гипертоническая болезнь ед. оп. пл. – единицы оптической плотности ИБС – ишемическая болезнь сердца ИДС – иммунодефицитное состояние ИФА – иммуноферментный анализ кДа – килодальтон ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности мВ – миливольт МТГФР – метилентетрагидрофолатредуктаза ОЦК – объем циркулирующей крови ПОЛ – перекисное окисление липидов ПЭГ – полиэтиленгликоль РНК – рибонуклеиновая кислота РПГА – реакция пассивной гемагглютинации ФК – функциональный класс ЦИК – циркулирующий иммунный комплекс ЦТЛ – цитотоксический лимфоцит ЦβС – цистатионин-β-синтетаза Cys – цистеин HCTL – гомоцистеин-тиолактон Нсу – гомоцистеин IgG – иммуноглобулин класса G IgM – иммуноглобулин класса М Lys – лизин NK – натуральный киллер NMDA – N-метил-D-аспартат 98 S-IgA – секреторный иммуноглобулин класса А TF – тканевой фактор Список литературы 99 1. Белая О.Л. Изучение содержания гомоцистеина, липидов и продуктов их перекисного окисления в сыворотке крови у больных ишемической болезнью сердца / О.Л. Белая, Н.В. Федорова // Клиническая медицина. – 2005. – №11. – С. 30-33. 2. Белокрылов Г. Аминокислоты как стимуляторы иммуногенеза / Г. Белокрылов, И. Молчанова, Е. Сорочинская // Докл. АН СССР. – 1986. – Т. 26, №2. – С. 471-473. 3. Блашко Э.Л. Исследование транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма : автореф. дис. : канд. биол. наук / Э.Л. Блашко; Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова. – СПб., 2007. – 22 с. 4. Блашко Э.Л. Связывание гомоцистеина высокомолекулярными белками и альфа-2-макроглобулином в плазме крови у пациентов с гипергомоцистеинемией / Э.Л. Блашко, А.А. Жлоба, Е.В. Шляхто // Неделя здорового сердца и мозга. Бюллетень научно исследовательского института кардиологии имени Алмазова В.А. – СПб., 2005. – Т. 3, №1. – С. 67. 5. Болдырев А.А. Гомоцистеиновая кислота вызывает окислитальный стресс лимфоцитов, усиливая токсический эффект NMDA / А.А. Болдырев // Бюлл. экспер. биол. и мед. – 2005. – Т. 140, №7. – С. 39-42. 6. Болдырев А.А. Почему токсичен гомоцистеин? / А.А. Болдырев // Природа. – 2009. – №10. – С. 18-23. 7. Болдырев А.А. NMDA-рецепторы в клетках иммунной системы / А.А. Болдырев, Е.А. Брюшкова, Е.А. Владыченская // Биохимия. – 2012. – Т. 77, №2. – С. 160-168. 8. Брюшкова Е.А. Влияние гомоцистеина на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами крыс : автореф. дис. : канд. биол. 100 наук / Е.А. Брюшкова; МГУ им. М.В. Ломоносова. – М., 2012. – 24 с. 9. Владыченская Е.А. Влияние гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты на глутаматные рецепторы лимфоцитов крысы / Е.А. Владыченская, О.В. Тюлина, А.А. Болдырев // Бюлл. эксп. биол. мед. – 2006. – Т. 142, №1. – С. 47-50. 10. Влияние гипергомоцистеинемии на риск развития рестеноза после операции коронарной ангиопластики и стентирования / О.А. Смирнова [и др.] // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. – 2008. – Т. 1, №4. – С. 21-23. 11. Гипергомоцистеинемия – значимый предиктор развития и неблагоприятного клинического течения венозных тромбозов / В.М. Шмелева [и др.] // Клинико-лабораторный консилиум. – 2009. – №1 (26). – С. 61-68. 12. Гипергомоцистеинемия – значимый фактор риска развития артериальных и венозных тромбозов / В.М. Шмелева [и др.] // Медицинский академический журнал. – 2003. – Т. 3, №7. – С. 2834. 13. Гипергомоцистеинемия – предиктор развития тромбозов при заболеваниях щитовидной железы / Б.Г. Андрюков [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – №9. – С. 21-22. 14. Говорин А.В. Особенности развития и прогрессирования сердечно-сосудистых нарушений в клинике внутренних болезней / А.В. Говорин // Заб. мед. вестник. – 2008. – № 2. – С. 19-25. 15. Гомоцистеин вызывает повреждение не только клубочкового, но и канальцевого отдела нефрона (экспериментальное исследование) / А.В. Смирнов [и др.] // Нефрология. – 2005. – Т. 9, №3. – С. 81-87. 101 16. Гомоцистеин – предиктор патологических изменений в организме человека / И.И. Мирошниченко [и др.] // Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2009. – №1. – С. 53-61. 17. Грызунов Ю.А. Свойства связывающих центров альбумина: метод исследования в биологических жидкостях и опыт его применения для оценки состояния организма : автореф. дис. : д-ра биол. наук / Ю.А. Грызунов. – М., 2003. – 180 с. 18. Гуржий А.А. Диагностика скрытой гипергомоцистеинемии у больных атеросклерозом артерий нижних конечностей : автореф. дис. : канд. мед. наук / А.А. Гуржий; Российский НИИ гематологии и трансфузиологии. – СПб., 2008. – 19 с. 19. Диагностика скрытой гипергомоцистеинемии у больных атеросклерозом артерий нижних конечностей / А.А. Гуржий [и др.] // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. – 2008. – №1. – С. 96-99. 20. Дутов А.А. Определение гомоцистеина и цистеина в плазме/сыворотке крови ВЭЖХ методом с УФ детекцией и твердофазной экстракцией на полимерном сорбенте / А.А. Дутов, Д.А. Никитин, А.А. Федотова // Биомедицинская химия. – 2010. – Т. 56, вып. 5. – С. 609-615. 21. Ежов М.В. Липопротеид(а) – независимый фактор риска атеросклероза / М.В. Ежов, А.А. Лякишев, С.Н. Покровский // Тер. Архив. – 2001. – Т. 9. – С. 76-82. 22. Жлоба А.А. Выявление и лечение гипергомоцистеинемий. Пособие для врачей / А.А. Жлоба, В.В. Никитина. – М.: Дружба народов, 2004. – 40 с. 23. Жлоба А.А. Диагностика, патогенез и интерпретация лабораторного исследования при гипергомоцистеинемии / А.А. Жлоба // Клиническая и экспериментальная кардиология. Под ред. 102 чл.-корр. РАМН проф. Е.В. Шляхто. – СПб.: Академический медицинский центр, 2005. – С. 198-208. 24. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии. Лекция. Часть 1 / А.А. Жлоба // Клиниколабораторный консилиум. – 2009. – №1. – С. 49-60. 25. Жлоба А.А. Лабораторная диагностика при гипергомоцистеинемии. Лекция. Часть 2 / А.А. Жлоба // Клиниколабораторный консилиум. – 2009. – №2. – С. 64-70. 26. Карнозин защищает эритроциты от окислительного стресса, вызываемого гомоцистеиновой кислотой / Е.С. Арзуманян [и др.] // Доклады РАН. – 2008. – Т. 418. – С. 834-837. 27. Клинические аспекты гипергомоцистеинемии : монография / В.А. Снежицкий [и др.]; под общей ред. В.А. Снежицкого, В.М. Пырочкина. – Гродно : ГрГМУ, 2011. – 292 с. 28. Козлова Т.В. Распространенность гипергомоцистеинемии и ее связь с мутациями в гене метилентетрагидрофолатредуктазы у больных с венозными тромбозами и здоровых лиц / Т.В. Козлова // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2006. – Т. 12, №1. – С. 32-38. 29. Костюченко Г.И. Диагностика и методы коррекции гипергомоцистеинемии в кардиологической практике. Пособие для врачей [Электронный ресурс] / Г.И. Костюченко, З.С. Баркаган. – М., 2007. – Режим доступа: http: // www. altayvitamin. ru / ru / information / to specialists / about preparation / diagnostika i metody. html. 30. Малежик М.С. Состояние гуморальных защитных систем при хроническом генерализованном пародонтите у людей пожилого возраста : автореф. дис. : канд. мед. наук / М.С. Малежик. – Чита, 2010. – 134 с. 103 31. Машкина А.П. Обнаружение NMDA-рецепторов в лимфоцитах и их характеристика : автореф. дис. : канд. биол. наук / А.П. Машкина. – М., 2010. – 24 с. 32. Мукаров М.А. Гомоцистеинемия при сахарном диабете и нарушенной толерантности к глюкозе в сочетании с ишемической болезнью сердца : автореф. дис. : канд. мед. наук / М.А. Мукаров. – Караганда, 2008. – 28 с. 33. Мукаров М.А. Пероральный тест с метионином в диагностике латентного нарушения метаболизма гомоцистеина у больных с нарушенной толерантностью к глюкозе / М.А. Мукаров, Т.З. Сейсембеков, Б.К. Искакова // Сборник тезисов V конгресса Ассоциации кардиологов стран СНГ «Научные достижения на службе здоровья». – Ташкент, 2005. – С.127. 34. Оганов Р.Г. Несбывшиеся надежды и парадоксы профилактической кардиологии / Р.Г. Оганов // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2009. – Т. 8, №7. – С. 4-9. 35. Радзивил Т.Т. Показатели гомоцистеина и особенности иммунного статуса у лиц, работающих на химическом производстве / Т.Т. Радзивил, И.В. Крат, И.В. Орадовская // Бюллетень сибирской медицины. – 2006. – №4. – С. 52-56. 36. Рогова И.П. Влияние обмена гомоцистеина на состояние гемостаза и развитие диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 1 типа : автореф. дис. : канд. мед. наук / И.П. Рогова. – Новосибирск, 2006. – 22 с. 37. Роль гипергомоцистеинемии в развитии ишемической болезни сердца и нарушениях гемостаза у больных сахарным диабетом 2 типа / И.А. Бондарь [и др.] // Клин. медицина. – 2007. – №5. – С. 3033. 104 38. Салтыкова Н.Б. Гипергомоцистеинемия и атеротромботические заболевания артерий нижних конечностей / Н.Б. Салтыкова, В.Д. Каргин, А.А. Гуржий // Вестник гематологии. – 2007. – Т. 3, №2. – С. 80. 39. Серосодержащие аминокислоты в диагностике, целенаправленном поддержании и формировании здоровья / В.К. Чокинэ [и др.] // Buletinul ASM Stiintele vietii. – 2011. – №3 (315). – P. 15-35. 40. Смирнова О.А. Особенности нарушений в системе гемостаза у пациентов с острым коронарным синдромом в зависимости от уровня гомоцистеина / О.А. Смирнова // Клинико-лабораторный консилиум. – 2007. – №16. – С. 35-39. 41. Смирнова О.А. Прогностическое значение гипергомоцистеинемии у больных с различными формами ишемической болезни сердца : автореф. дис. : канд. мед. наук / О.А. Смирнова; Российский НИИ гематологии и трансфузиологии. – СПб., 2008. – 19 с. 42. Цыбикова Н.М. Гомоцистеин: роль в патологии человека и методы коррекции / Н.М. Цыбикова, М.Н. Цыбиков // Забайкальский медицинский вестник. – 2006. – №4. – С. 32-36. 43. Цыбиков Н.Н. Доказательство иммунного механизма регуляции ферментов гемостаза / Н.Н. Цыбиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1982. – №5. – С. 8-9. 44. Цыбиков Н.Н. Роль гомоцистеина в патологии человека / Н.Н. Цыбиков, Н.М. Цыбикова // Успехи современной биологии. – 2007. – Т. 127, №5. – С. 471-482. 45. Черкас Ю.В. Гипергомоцистеинемия как фактор риска развития ишемической болезни сердца : дис. : канд. биол. наук / Ю.В. Черкас. – СПб., 2001. – 110 с. 46. Шевченко О.П. Гомоцистеин / О.П. Шевченко, Г.А. Олефиренко, Н.В. Червякова. – М., 2002. – 47 с. 105 47. Шевченко О.П. Гомоцистеин – новый фактор риска атеросклероза и тромбоза (лекция) / О.П. Шевченко // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. – № 10. – С. 25-31. 48. Широков Е.А. Неврологические синдромы, связанные с нарушениями обмена гомоцистеина / Е.А. Широков, С.Ф. Леонова // Клин. мед. – 2006. – Т. 84, №12. – С. 39-42. 49. Шмелева В.М. Гипергомоцистеинемия в патогенезе тромботических заболеваний / В.М. Шмелева // Трансфузиология. Научно-практический журнал. – 2006. – Т. 7, № 1. – С. 33-47. 50. Шмелева В.М. Роль гипергомоцистеинемии в формировании протромботических нарушений системы гемостаза : автореф. дис. : д-ра мед. наук / В.М. Шмелева; Российский НИИ гематологии и трансфузиологии. – СПб., 2010. – 47 с. 51. Absolute risk of venous and arterial thromboembolism in thrombophilic families is not increased by high thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) levels / N. Folkeringa [et al.] // Thromb. Haemost. – 2008. – Vol. 100 (1). – P. 38-44. 52. Age and gender specific reference intervals for total homocysteine and methylmalonic acid in plasma before and after vitamin supplementation / K. Rasmussen [et al.] // Clin. Chem. – 1996. – Vol. 42. – P. 630-636. 53. Antibodies against N-homocysteinylated proteins and their determinants in patients on long-term hemodialysis [Text] / M. Kolarz [et al.] // Pol. Arch. Med. Wewn. – 2010. – Vol. 120(6). – Р. 223-230. 54. Antibodies to N-homocysteinylated albumin as a marker for early-onset coronary artery disease in men [Text] / A. Undas [et al.] // Thromb. Haemost. – 2005. – Vol. 93(2). – Р. 346-350. 55. Antibodies to N-homocysteinylated albumin in patients with systemic lupus erythematosus [Text] / A. Padjas [et al.] // Pol. Arch. Med. Wewn. – 2007. – Vol. 117(3). – Р. 20-25. 106 56. Assessment of pre- and post-methionine load homocysteine for prediction of recurrent stroke and coronary artery disease in the Vitamin Intervention for Stroke Prevention Trial / L. Pettigrew [et al.] // Atherosclerosis. – 2008. – Vol. 200 (2). – P. 345-349. 57. Autoantibodies against N-homocysteinylated proteins in humans: implications for atherosclerosis [Text] / A. Undas [et al.] // Stroke. – 2004. – Vol. 35(6). – Р. 1299-1304. 58. Autoantibodies against N-homocysteinylated proteins in patients on long-term haemodialysis [Text] / A. Undas [et al.] // Nephrol. Dial. Transplant. – 2007. – Vol. 22(6). – Р. 1685-1689. 59. Beltowski J. Protein homocysteinilation: a new mechanism of atherogeneis? / J. Beltowski // Postery Hig Med Dosw. – 2005. – Vol. 59. – P. 392-404. 60. Boers G. Moderate hyperhomocysteinaemia and vascular disease: evidence, relevance and the effect of treatment / G. Boers // Eur. J. Pediatr. – 1998. – Vol. 157 [Suppl 2]. – Р. 127-130. 61. Bolander-Gouaille C. Focus on Homocysteine and the Vitamins involved in its metabolism / C. Bolander-Gouaille // Springer Verlag France, 2002. – 217 p. 62. Boldyrev A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity / A. Boldyrev // Biochemistry (Moscow). – 2009. – Vol. 74. – P. 725-736. 63. Boldyrev A. Molecular mechanisms of homocysteine toxicity and possible protection against hyperhomocysteinemia / A. Boldyrev // Recent Advances on Nutrition and the Prevention of Alzheimer’s Disease. – 2010. – P. 127-143. 64. Bostom A.G. Hyperhomocysteinemia in Chronic Renal Disease / A.G. Bostom, B.F. Culleton // J Am Soc Nephrol. – 1999. – Vol. 10. – P. 891-900. 107 65. Cardiovascular pathogenesis in hyperhomocysteinemia / T. Huang [et al.] // Asia Pac J Clin Nutr. – 2008. – Vol. 17 (1). – P. 8-16. 66. Carmel R. Homocysteine in Health and Disease / R. Carmel, D.W. Jacobsen // Cambridge University Press, 2001. – 500 p. 67. Cattaneo M. Гипергомоцистеинемия, сосудистые заболевания и тромбозы / M. Cattaneo // Лаб. мед. – 1999. – №2. – С. 33-41. 68. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia and venous thromboembolism / M. Cattaneo // Thromb. Haemost. – 2006. – Vol. 32 (7). – P. 716-723. 69. Central retinal vein thrombosis and hyperhomocysteinemia in a young patient with renal transplantation / O. Ates [et al.] // Transplant Proc. – 2008. – Vol. 40 (10). – P. 3755-3758. 70. Changes in basal and postmethionine load concentrations of total homocysteine and cystathionine after B vitamin intervention / Q. Bleic [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. – 2004. – Vol. 80, №3. – Р. 641-648. 71. Cysteinylation and homocysteinylation of plasma protein thiols during ageing of healthy human beings / R. Rossil [et al.] // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2009. – Vol. 13. – P. 3131-3140. 72. Dayal S. ADMA and hyperhomocysteinemia / S. Dayal, S. Lentz // Vascular Medicine. – 2005. – Vol. 10. – P. 27-33. 73. Dayal S. Role of redox reactions in the vascular phenotype of hyperhomocysteinemic animals / S. Dayal, S. Lentz // Antioxid Redox Signal. – 2007. – Vol. 9 (11). – P.1899-1909. 74. Detection of heterozygotes for homocystinuria / I. Sardharwalla [et al.] // Arch. Dis. Child. – 1974. – Vol. 49. – Р. 553-559. 75. DNA/anti-DNA complexes: correlation of size and complement fixation / S.J. Waller [et al.] // Arthritis Rheum. — 1981. —Vol. 24, №5. — P. 651-657. 108 76. Dronedarone for the control of ventricular rate in permanent atrial fibrillation / J.-M. Davy [et al.] // Am. Heart. J. – 2008. – Vol. 156 (527). – P. 1-9. 77. Effect of Experimental Hyperhomocysteinemia on Cardiac Structure and Function in the Rat / E. Walker [et al.] // Annals of Clinical and Laboratory Science. – 2004. – Vol. 34. – P.175-180. 78. Effect of homocysteinylation on high density lipoprotein physicochemical properties / G. Ferretti [et al.] // Chem Phys Lipids. – 2010. – Vol. 163. – P. 228-235. 79. Eldibany M. Hyperhomocysteinemia and thrombosis: an overview / M. Eldibany, J. Caprini // Arch. Pathol. Lab. Med. – 2007. – Vol. 131 (6). – P. 872-884. 80. Facts and recommendations about total homocysteine determinations: an expert opinion / H. Refsum [et al.] // Clin. Chem. – 2004. – Vol. 50, №1. – P. 3-32. 81. Folic acid administration and antibodies against homocysteinylated proteins in subjects with hyperhomocysteinemia / A. Undas [et al.] // Thromb. Haemost. – 2006. – Vol. 96. – P. 342-347. 82. Gene-environment and Gene-gene interaction in the determination of plasma homocysteine levels in healthy middle-aged men / V. Dekou [et al.] // Thromb. Haemost. – 2001. – Vol. 85. – P. 67-74. 83. General anesthesia and methylenetetrahydrofolate reductase deficiency / S. Lentz [et al.] // J Anesth. – 2007. – Vol. 21(4). – P. 493-496. 84. Generation and initial characterization of a novel polyclonal antibody directed against homocysteine thiolactone-modified low density lipoprotein [Text] / E. Ferguson [et al.] // J. Lipid. Res. – 1998. – Vol. 39. – Р. 925-933. 85. Glowacki R. Cross-talk between Cys34 and lysine residues in human serum albumin revealed by N-homocysteinylation [Text] / R. Glowacki, 109 H. Jakubowski // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279(12). – Р. 1086410870. 86. Gold nanoparticle sensor for homocysteine thiolactone-induced protein modification [Text] / A. Gates [et al.] // Langmuir. – 2008. – Vol. 24(8). – Р. 4107-4113. 87. Graham I. Plasma Homocysteine as a Risk Factor for Vascular Disease / I. Graham, L. Daly, H. Refsum // JAMA. – 1997. – Vol. 277, №22. – Р. 1775-1781. 88. Gupta A. Hyperhomocysteinaemia and end stage renal disease / A. Gupta, K. Robinson // J Nephrol. – 1997. – Vol. 10 (2). – P. 77-84. 89. Haakenstad A.O. The disappearance kinetics and glomerular deposition of small-latticed soluble complexes / A.O. Haakenstad, G. E. Striker, M. Mannik // Immunology. – 1982. — V. 47. — P. 407-414. 90. Heterozygosity for homocystinuria: a risk factor of occlusive cerebrovascular disease / G. Boers [et al.] // Clin. Genet. – 1983. – Vol. 24. – Р. 300-301. 91. Heterozygosity for homocystinuria in premature peripheral and cerebral occlusive arterial disease / G. Boers [et al.] // N. Engl. J. Med. – 1985. – Vol. 313. – Р. 709-715. 92. Homocysteine activates platelets in vitro / I.V. Mohan [et al.] // Clin Appl Thromb Haemost. – 2008. – Vol. 14 (1). – P. 8-18. 93. Homocysteine and coronary atherosclerosis: from folate fortification to the recent clinical trials / C. Antoniades [et al.] // European Heart Journal. – 2009. – Vol. 30. – P. 6-15. 94. Homocysteine and Heart Failure: An Overview / E. Vizzardi [et al.] // Recent Patents on Cardiovascular Drug Discover. – 2009. – Vol. 4. – P. 15-21. 110 95. Homocysteine, folate and vitamin B12 in puerperal cerebral venous thrombosis / D. Nagaraja [et al.] // J Neurol Sci. – 2008. – Vol. 272(12). – P. 43-47. 96. Homocysteine induces mesangial cell apoptosis via activation of p38mitogen-activated protein kinase / S. Shastry [et al.] // Kidney Int. – 2007. – Vol. 71, №4. – P. 304-311. 97. Homocysteine Inhibits Inactivation of Factor Va by Activated Protein C / A. Undas [et al.] // J Biol Chem. – 2001. – Vol. 276, Issue 6. – P. 4389-4397. 98. Homocysteine thiolactone and protein homocysteinylation in human endothelial cells: implications for atherosclerosis [Text] / H. Jakubowski [et al.] // Circ. Res. – 2000. – Vol. 87. – Р. 45-51. 99. Homocysteine thiolactone induces caspase-independent vascular endothelial cell death with apoptotic features / P. Mercie [et al.] // Apoptosis. – 2000. – Vol. 5. – P. 403-411. 100. Homocysteinemia: vascular injury and arterial thrombosis / L. Harker [et al.] // N Engl J Med. – 1974. – Vol. 291. – P. 537-541. 101. Homocysteinylation of low-density lipoproteins (LDL) from subjects with type 1 diabetes and human aortic endothelial cells: an in vitro study / L. Nanetti [et al.] // Nutr Metab Cardiovasc Dis. – 2012. – Vol. 22. – P. 9-10. 102. Horgan C. Complement fixation by small, DNase-resistant DNA- anti-DNA immune complexes / C. Horgan, W. Emlen // Mol. Immunol. — 1987. — Vol. 24, №2. — P. 109-116. 103. and Hotoleanu C. Mesenteric venous thrombosis with bowel infarction hyperhomocysteinemia due to homozygous methylenetetrahydrofolate reductase C677T genotype / C. Hotoleanu, O. Andercou, A. Andercou // Vasc. Endovascular. Surg. – 2008. – Vol. 42 (5). – P. 477-481. 111 104. Human Heart Glutamate Receptors – Implications for Toxicology, Food Safety, and Drug Discovery / S. Gill [et al.] // Toxicol. Pathol. – 2007. – Vol. 35. – Р. 411-417. 105. Hyperhomocysteinemia and Myocardial Expression of Brain Natriuretic Peptide in Rats / M. Herrmann [et al.] // Clinical Chemistry. – 2007. – Vol. 53 (4). – P. 773-780. 106. Hyperhomocysteinemia: an independent risk factor for vascular disease / R. Clarke [et al.] // N. Engl. J. Med. – 1991. – Vol. 324. – Р. 1149-1155. 107. Hyperhomocysteinemia in inflammatory bowel disease patients without past intestinal resections: correlations with cobalamin, pyridoxine, folate concentrations, acute phase reactants, disease activity, and prior thromboembolic complications / Y. Erzin [et al.] // J Clin Gastroenterol. – 2008. – Vol. 42(5). – P. 481-486. 108. Hyperhomocysteinemia leads to pathological ventricular hypertrophy in normotensive rats / J. Joseph [et al.] // Am J Physiol Heart and Circulatory Physiolody. – 2003. – Vol. 285 (2). – P. 679-686. 109. Immunohistochemical detection of N-homocysteinylated proteins in human and mice / J. Perla-Kajаn [et al.] // Biomed pharmacother. – 2008. – Vol. 10. 110. Impaired homocysteine methabolism and atherothrombotics disease / P. Durand [et al.] // Lab. Invest. – 2001. – Vol. 81. – P. 645-672. 111. Influence of age, sex and vitamin status on fasting and post- methionine load plasma homocysteine levels / S. Sassi [et al.] // Haematologica. – 2002. – Vol. 87 (9). – P. 957-964. 112. Iqbal M. Methylene Tetrahydrofolate Reductase Gene and Coronary Artery Disease / M. Iqbal, P. Frossard // Journal Of Pakistan Medical Association. – 2003. – Vol. 53, №1. 112 113. Is folate a promising agent in the prevention and treatement of cardiovascular diseases in patient with renal failure? / A.S. De Vriese [et al.] // Kidney Int. – 2002. – Vol. 61, №4. – P. 1199-1209. 114. Jakubowski H. Alternative pathways of editing noncognateamino acids by aminoacyl-tRNA synthetases [Text] / H. Jakubowski, A. Fersht // Nucleic. Acids. Res. – 1981. – Vol. 9. – Р. 3105-3117. 115. Jakubowski H. Anti-N-homocysteinylated protein autoantibodies and cardiovascular disease [Text] / H. Jakubowski // Clin. Chem. Lab. Med. – 2005. – Vol. 43(10). – Р. 1011-1014. 116. Jakubowski H. Biosynthesis and reactions of homocysteine thiolactone. In: Carmel R, Jacobsen DW, eds. Homocysteine in Health and Disease. Oxford, UK: Cambridge University Press, 2000. In press.3. 117. Jakubowski H. Homocysteine-thiolactone and S-nitroso- homocysteine mediate incorporation of homocysteine into protein in humans [Text] / H. Jakubowski // Clin. Chem. Lab. Med. – 2003. – Vol. 41(11). – Р. 1462-1466. 118. Jakubowski H. Homocysteine thiolactone: metabolic origin and protein homocysteinylation in humans [Text] / H. Jakubowski // J. Nutr. – 2000. – Vol. 130. – Р. 377-381. 119. Jakubowski H. Metabolism of homocysteine thiolactone in human cell cultures. Possible mechanism for pathological consequences of elevated homocysteine levels [Text] / H. Jakubowski // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272(3). – Р. 1935-1942. 120. Jakubowski H. Misacylation of tRNALys with noncognate amino acids bylysyl-tRNA synthetase [Text] / H. Jakubowski // Biochemistry. – 1999. – Vol. 38. – Р. 8088-8093. 121. Jakubowski H. Molecular basis of homocysteine toxicity in humans [Text] / H. Jakubowski // Cell. Mol. Life. Sci. – 2004. – Vol. 61(4). – Р. 470-487. 113 122. Jakubowski H. Proofreading in vivo: editing of homocysteine by aminoacyl-tRNA synthetase in Escherichia coli [Text] / H. Jakubowski // J. Biol. Chem. – 1995. – Vol. 270. – Р. 17672-17673. 123. Jakubowski H. Protein homocysteinylation: possible mechanism underlying pathological consequences of elevated homocysteine levels [Text] / H. Jakubowski // FASEB J. – 1999. – Vol. 13. – Р. 2277-2283. 124. Jakubowski H. Protein N-homocysteinylation: implications for atherosclerosis [Text] / H. Jakubowski // Biomed. Pharmacother. – 2001. – Vol. 55(8). – Р. 443-447. 125. Jakubowski H. Synthesis of homocysteine thiolactone by methionyl-tRNA synthetase in cultured mammalian cells [Text] / H. Jakubowski, E. Goldman // FEBS Lett. – 1993. – Vol. 317. – Р. 593598. 126. Jakubowski H. The pathophysiological hypothesis of homocysteine thiolactone-mediated vascular disease [Text] / H. Jakubowski // J. Physiol. Pharmacol. – 2008. – Vol. 59(9). – Р. 155-167. 127. Jakubowski H. The role of paraoxonase 1 in the detoxification of homocysteine thiolactone [Text] / H. Jakubowski // Adv. Exp. Med. Biol. – 2010. – Vol. 660. – Р. 113-127. 128. Karolczak K. Mechanism of action of homocysteine and its thiolactone in hemostasis system / K. Karolczak, B. Olas // Physiol Res. – 2009. – Vol. 58. – P. 623-633. 129. Lentz S. Mechanisms of homocysteine-induced atherothrombosis / S. Lentz // Thromb. Haemost. – 2005. – Vol. 3. – P. 1646-1654. 130. Lifestyle factors and plasma homocysteine concentration in a general population sample / A. De Bree [et al.] // American J. of Epidemiology. – 2001. – Vol. 154. – P. 150-154. 131. Malinow R. Homocyst(e)ine, Diet, and Cardiovascular Diseases: A Statement for Healthcare Professionals From the Nutrition Committee, 114 American Heart Association / R. Malinow, A. Bostom, R. Krauss // Circulation. – 1999. – Vol. 99. – Р. 178-182. 132. Mannik M. Removal of glomerular deposits of immune complexes in mice by administration of excess antigen / M. Mannik, G.E. Striker // Lab. Invest. – 1980. – Vol. 42. – P. 483-489. 133. Mechanism for the formation of protein-bound homocysteine in human plasma / T. Togawa [et al.] // Biochem. Biophis. Commun. – 2000. – Vol. 277. – P. 668-674. 134. Mild hyperhomocysteinemia is associated with increased TAFI levels and reduced plasma fibrinolytic potential / M. Colucci [et al.] // Thromb Haemost. – 2008. – Vol. 6 (9). – P. 1571-1577. 135. Molecular genetic analysis in mild hyperhomocysteinemia: a common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is a genetic risk factor for cardiovascular disease / L. Kluijtmans [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 1996. – Vol. 58. – Р. 35-41. 136. Nangaku M. Mechanisms of immune-deposit formation and the mediation of immune renal injury / M. Nangaku, W.G. Couser // Clinical and experimental nephrology. – 2005. – Vol. 9 (3). – P. 183191. 137. Nitric oxide inhibition of homocysteine-induced human endothelial cell apoptosis by down-regulation of p53-dependent Noxa expression through the formation of S-nitrosohomocysteine / SJ. Lee [et al.] // J Biol Chem. – 2005. – Vol. 280. – P. 5781-5788. 138. No added value of the methionine loading task in assessment for venous thrombosis and cardiovascular disease risk / M. Keijzer [et al.] // Thromb. Haemost. – 2006. – Vol. 95 (2). – Р. 380-385. 139. Performance comparison of three assay methods used in fasting and postmethionine load plasma homocysteine determinations from patients 115 with vascular disease / E. Mourvaki [et al.] // Am. J. Clin. Pathol. – 2005. – Vol. 124(5). – Р. 675-681. 140. Perla-Kajаn J. Mechanisms of homocysteine toxicity in humans / J. Perla-Kajаn, T. Twardowski, J. Jakubowski // Amino Acids. – 2007. – Vol. 32. – P. 561-572. 141. Perla-Kajаn J. Paraoxonase 1 protects against protein N- homocysteinylation in humans [Text] / J. Perla-Kajаn, H. Jakubowski // FASEB J. – 2010. – Vol. 24(3). – Р. 931-936. 142. Plasma homocysteine and risk for congestive heart failure in adults without prior myocardial infarction / R.S. Vasan [et al.] // JAMA. – 2003. – Vol. 289 (10). – P. 1251-1257. 143. Podocyte injury and glomerulosclerosis in hyperhomocysteinemic rats / F. Yi [et al.] // Am J Nephrol. – 2007. – Vol. 27, №3. – P. 262268. 144. Post-methionine load hyperhomocysteinemia in persons with normal fasting total plasma homocysteine: initial results from The NHLBI Family Heart Study / A.G. Bostom [et al.] // Atherosclerosis. – 1995. – Vol. 116, Issue 1. – P. 147-151. 145. Post-methionine load test: а more sensitive tool to reveal hyperhomocysteinemia in Alzheimer patients? / G. Galimberti [et al.] // Clin. Biochem. – 2008. – Vol. 41(10-11). – Р. 914-916. 146. Prevalence of hyperhomocysteinemia and the MTHFR C677T polymorphism in patients with arterial and venous thrombosis from North Western Russia / V. Shmeleva [et al.] // Thrombosis Research. – 2003. – Vol. 11. – P. 351-356. 147. Protein N-homocysteinylation induces the formation of toxic amyloid-like protofibrils / P. Paoli [et al.] // J Mol Biol. – 2010. – Vol. 400. – P. 889-907. 116 148. Rantonen P. Correlations between total protein, lysozyme, immunoglobulins, amylase, and albumin in stimulated whole saliva during daytime / P. Rantonen, J. Meurman // Acta Odontol. Scand. – 2000. – Vol. 58 (4). – P. 160-165. 149. Rasmussen K. Total homocysteine measurement in clinical practice / K. Rasmussen, J. Muller // Ann. Clin. Chem. – 2000. – Vol. 37, №5. – P. 627-648. 150. Ratnoff O.D. Activation of Hageman factor by L-homocystine / O.D. Ratnoff // Science. – 1968. – Vol. 162. – P. 1007-1009. 151. Relationship of Plasma Homocysteine with the Severity of Chronic Heart Failure / M. Herrmann [et al.] // Clinical Chemistry. – 2005. – Vol. 51 (8). – P. 1512-1515. 152. Relative roles of albumin and ceruloplasmin in the formation of homocysteine, homocysteine-cysteine-mixed disulfide, and cysteine circulation / S. Sengupta [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, №50. – P. 46896-46904. 153. Resveratrol supplementation worsen the dysregulation of genes involved in hepatic lipid homeostasis observed in hyperhomocysteinemic mice / C. Noll [et al.] // Food Chem. Toxicol. – 2009. – Vol. 47(1). – P. 230-236. 154. Rodgers G. Activation of endogenous factor V by a homocysteine- induced vascular endothelial cell activator [Text] / G. Rodgers, W. Kane // J. Clin. Invest. – 1986. – Vol. 77. – Р. 1909-1916. 155. Schrieber L. Factors influencing immune complex localization / L. Schrieber, R. Penny // Rheumatol. Int. — 1984. — Vol. 4. — P. 95-109. 156. Shulgin I.L. Preferential hydration and solubility of proteins in aqueous solutions of polyethylene glycol / I.L. Shulgin, E. Ruckenstein // Biophysical Chemistry. — 2006.—Vol. 120.—P. 188-198. 117 157. The excitotoxic effect of NMDA on human lymphocyte immune function / A. Mashkina [et al.] // Neurochem. Int. – 2007. – Vol.51. – P. 356-360. 158. Total Homocysteine Levels and Improve Endothelial Function in Children With Chronic Renal Failure? / K. Bennett-Richards [et al.] // Circulation. – 2002. – Vol. 105. – P.1810. 159. Uppala S. Homocysteine- an amino acid culprit in ill health and disease / S. Uppala, VU. Badikillaya // J Dr NTR Univ Health Sci. – 2012. – Vol. 1. – P. 139-147. 160. Usuki S. Prospective role of β-cell-specific IGF-1 for oxidative stress in the pathogenesis of diabetic neuropathy / S. Usuki // J Diabetes Metab. – 2012. – S-5 161. Van der Griend R. Postmethionine-load homocysteine determination for the diagnosis hyperhomocysteinaemia and efficacy of homocysteine lowering treatment regimens / R. Van der Griend, J-D. Banga, D. Biesma // Vascular Medicine. – 2002. – Vol. 7, №1. – Р. 2933. 162. Van Guldener C. Why is homocysteine elevated in renal failure and what can be expected from homocysteine-lowering? / C. Van Guldener // Nephrology Dialysis Transplantation. – 2006. – Vol. 21 (5). – P. 1161-1166. 163. Why is homocysteine toxic for the nervous and immune systems? / A. Boldyrev [et al.] // Curr Aging Sci. – 2012. – Vol. 4. 164. Wilcken D. The pathogenesis of coronary artery disease. A possible role for methionine metabolism / D. Wilcken, B. Wilcken // J. Clin. Invest. – 1976. – Vol. 57. – Р. 211-215.