Суркова С.А. - Московский государственный медико
advertisement
На правах рукописи УДК 616.311-002.72-07-085 CУРКОВА Светлана Александровна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ОБОСНОВАНИЕ ТЕРАПИИ КАНДИДОЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА 14.01.14 – Стоматология (мед. науки) 03.02.03 – Микробиология (мед. науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 1 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России) Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Ушаков Рафаэль Васильевич Доктор медицинских наук, профессор Царёв Виктор Николаевич Официальные оппоненты: Максимовская Людмила Николаевна, заслуженный врач России, доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, заведующая кафедрой стоматологии общей практики ФПДО) Червинец Вячеслав Михайлович, доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава России, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии). Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства России» Защита состоится «____» 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.07, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1 Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения России (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) Автореферат разослан «____»__________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент 2 О.П. Дашкова ОБАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время проблема воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта занимает одно из ведущих мест в современной стоматологии. (Максимовский Ю.М., 1997; Иванов В.С., 2001; Барер Г.М., 2006). Однако, эффективность методов лечения (терапевтического, пародонтологического, хирургического), существенно снижается при развитии воспалительных процессов, ассоцированных с дрожжевыми грибами рода кандида (Олейник И.И., 1991, 2000; Тимирбаев М.А., 1999, 2009; Плахтий Л.Я., 2004; Царёв В.Н., 2006, 2009). Торпидные (устойчивые) к лечению формы заболеваний СОПР и пародонта в последние годы встречаются всё чаще, что по данным современной литературы, может быть связано с активизацией грибковой микрофлоры (Дмитриева Л.А., Чернышова С.В., 2000; Царёв В.Н., 2006, 2009). В зарубежной литературе, а в последние годы, также и у отечественных авторов появился термин – кандида-ассоциированный пародонтит (J.Vinkelhoff, 1996; Waltimo T.M. e.a., 2000). Как отмечает в своих исследованиях Носик А.С. (2004), микотическое воспаление тканей пародонта отличается от хронического пародонтита бактериальной этиологии проникновением псевдомицелия в десневой эпителий и более глубокие ткани пародонта. Слизистая оболочка полости рта и ткани пародонта подвергаются специфической грибковой патологией в связи с неправильным выбором антибактериальной терапии, что ведет в свою очередь к развитию дисбиоза и иммуноспецифическим ситуациям различного генеза. Как оказалось, многие химиопрепараты и антибиотики, эффективные в отношении пародонтопатогенных видов бактерий, действуют негативно механизмы иммунной защиты и, тем самым, приводить к прогрессированию микотического процесса в организме (Бажанов Н.Н., Тер-Асатуров Г.П., 3 2000; Хмельницкий О.К., 2002; Ахмедов Г.Д. с соавт., 2010; Караулов А.В. с соавт., 2012). Углубленное изучение основных причин возникновения и механизмов развития кандидо-ассоциированных процессов в современной отечественной медицинской литературе мы не обнаружили. Новые дальнейшие исследования в области современных микологических и молекулярных методов открывают перспективы совершенствования не только диагностики, но и лечения, в частности, разработки алгоритмов применения новых химиопрепаратов фунгицидного (противогрибкового) действия. К сожалению, местное применение антимикотиков в виде инстилляций, наложения повязок или применения гелевых форм, не даёт стойкого лечебного эффекта, поэтому, приоритетными являются сегодня работы по внедрению новых антимикотиков – из группы триазоловых производных (итраконазол, флюконазол, вориконазол) и производных тербинафина (ламизил). Как свидетельствуют данные литературы, последние при кандидозе менее эффективны. Комплексного исследования оценке сравнительной по обоснованию применения или по эффективности перечисленных фунгицидных химиопрепаратов при кандидозе СОПР с применением современных микологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов не проводилось. Исследования именного такого рода могут существенно продвинуть вперёд решение проблемы борьбы с микотическими процессами, которые крайне актуальны для современной стоматологии, особенно, в современных условиях высокой частоты иммунодефицитных ситуаций. Учитывая это, цель нашей работы - совершенствование комплексной диагностики кандидозных процессов полости рта и персонификация выбора фунгицидных и иммуномодулирующих химиопрепаратов для лечения пациентов на основании анализа результатов клинико-лабораторного, микологического (культурального), иммунологического и молекулярнобиологического методов исследования. 4 Задачи исследования 1. Дать комплексную характеристику клинико-лабораторных данных и уточнить дифференциально-диагностические признаки кандидоза у пациентов стоматологического профиля. 2. Испытать новые хромогенные питательные среды для ускоренной диагностики кандидоза, дифференциации и видовой идентификации дрожжевых грибов, встречающихся при воспалительных процессах рта. 3. Провести анализ чувствительности и резистентности возбудителей кандидоза in vitro к антимикотикам и обосновать их применение для лечения кандидоза. 4. Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности отечественного набора реактивов для мультиплексной молекулярной диагностики кандидоза по сравнению с культуральным микологическим методом. 5. Провести выбор методов оценки иммунитета у больных кандидаассоциированными воспалительными процессами полости рта и сопоставить их с данными молекулярного и культурального микологического исследования. 6. Изучить клиническую эффективность современных фунгицидных препаратов активных в отношении потенциальных возбудителей кандидоза, разработать параметры оценки эффективности их применения и алгоритм проведения этиотропной терапии. Научная новизна Уточнёна видовая принадлежность дрожжевых грибов рода кандида, встречающихся при кандидозе СОПР – впервые при данной патологии у стоматологических пациентов выделены и идентифицированы представители видов C. tropicalis, C. glabrata. Впервые установлена высокая специфичность и чувствительность набора реактивов отечественного производства 5 для молекулярной диагностики кандида-ассоциированных воспалительных процессов с помощью мультиплексной ПЦР. Получены новые данные о чувствительности и резистентности дрожжевых грибов кандида к новым, ранее не применявшимся для лечения кандидоза химиопрепаратам, включая новую лекарственную форму флюконазола - препарат Хайконазол (Himedia, Индия). Обосновано применение иммуноферментного анализа для выявления различных форм кандидоза слизистой оболочки полости рта (кандидозного стоматита и пародонтита). Разработан алгоритм применения фунгицидных иммуномодулирующих препаратов в комплексном лечении и кандида- ассоциированных воспалительных процессов полости рта. Проведена оценка клиническая и микробиологическая (микологическая) эффективности стоматита с химиотерапии использованием кандида-ассоциированного сочетания флюконазола и иммуномодулирующего препарата ликопида. Практическая значимость Уточнены клинико-лабораторные патогномоничные признаки кандидаассоциированных воспалительных процессов полости рта. Апробированы новые дифференциально-диагностические хромогенные среды для ускоренной видовой идентификации возбудителей кандидоза. Обоснована эффективность новой диагностической тест-системы (набора реактивов) для быстрой и эффективной индикации возбудителей кандидоза с помощью ПЦР. Изучена возможность применения ИФА для диагностики кандидаассоциированных воспалительных процессов полости рта. Внедрён алгоритм диагностики и показания для комбинированного лечения кандидоза, включающей использование иммуномодулирующих препаратов. 6 фунгицидных и Положения, выносимые на защиту 1. Комплексная диагностика кандидоза базируется на результатах клинических исследований с учётом данных анамнеза, лабораторного обследования, включая иммуноферментное (скрининговый экспресс-метод) количественными методами определение АТ к кандида и выявлении культуральным - возбудителя микологическим или молекулярным (ПЦР-диагностика) при постановке окончательного диагноза. 2. Различные штаммы грибов рода кандида различаются по своей чувствительности к фунгицидным препаратам, что нередко связано с видовой принадлежностью грибов. Наибольшая частота штаммов устойчивых к воздействию фунгицидных препаратов выявляется среди штаммов, относящихся к видам C. krusei и C. glabrata. 3. Прединвазивный и инвазивный кандидоз СОПР у стоматологических пациентов в зависимости от комплекса сочетания причинных и патогенетических факторов может иметь различные проявления, которые соответствуют клинической картине атрофического или гипертрофического кандидоза, включая возможность инвазивного поражения тканей пародонта, с острым или хроническим течением. 4. Фунгицидные препараты группы производных триазола в сочетании с иммуномодулирующим препаратом ликопидом являются эффективным средством комплексного лечения кандидидоза СОПР и пародонта. Личный вклад автора Личный вклад автора заключается в самостоятельном обследовании 211 пациентов и лечении, организации специальных исследований и дополнительных консультаций. Автор инструментально-лабораторной диагностике, материала препаратов и подготовку 7 принимала лично для участие в проводила взятие микробиологических, молекулярно-биологических и иммунологических исследований. Автор самостоятельно анализировала материал и проводила статистическую обработку полученных данных. Апробация работы Результаты исследований апробированы на XXXIII конференции молодых учёных МГМСУ (март, 2011), XI конференции НИМСИ «От науки – к практике» (декабрь, 2011), XII национальном конгрессе с международным участием межкафедральной стоматологии «Человек конференции и лекарство» отдела Научно-исследовательского (Москва, фундаментальных 2012), основ медико-стоматологического института и кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ МГМСУ им. А.И. Евдокимова от 6 ноября 2012 года (протокол № 11). Публикации 5 печатных работ по теме диссертации, в том числе, 2 статьи - в журналах рецензируемых РИНЦ в соответствии с рекомендациями ВАК Минобрнауки Российской Федерации. Внедрение результатов исследования Авторские результаты внедрены в программу педагогического процесса на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом по теме учебного модуля «Инфекционные и оппортунистические стоматиты», практическую работу Клинико-диагностического Центра стоматологии и ЧЛХ МГМСУ. центра и Подготовлено к печати учебное пособие по совершенствованию лабораторной диагностики заболеваний пародонта. Объём и структура диссертации Диссертационная работа включает: обзор литературы, главу «Материалы и методы исследования», три главы собственных результатов 8 исследований, раздела обсуждения результатов, а также заключение, выводы и практические рекомендации. Список литературы: 279 источников, в том числе – 162 отечественных и 117 - иностранных изданий. Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного машинописного текста, иллюстрации - 17 таблиц, 30 рисунок. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Контингент обследованных включал пациентов, обратившихся к врачустоматологу КДЦ или стоматологической клиники ФПДО МГМСУ за период с 2009 по 2012 гг. Всего было обследовано 211 пациентов с заболеваниями СОПР и пародонта, из которых 81 пациенту по данным проведённой клинико-лабораторной диагностики был поставлен диагноз: кандидоз слизистой оболочки полости рта (СОПР). Возраст пациентов был от 23 до 69 лет, в том числе, 45 женщин и 36 мужчин. В соответствии с задачами исследования сформированы 2 группы сравнения: 1 группа включала 60 пациентов с типичными клиническими проявлениями (в том числе, 31 женщина и 29 мужчин), которым был поставлен диагноз кандидоз СОПР. Данная группа характеризовалась отсутствием связи с протезированием. 2 группа включала всего 151 пациентов (в том числе 86 женщин, 65 мужчин), из числа которых у 21 диагноз кандидоза был поставлен в течение 3-х лет после протезирования и первоначально квалифицировался как протезный стоматит, а затем диагноз был сформулирован согласно Международной классификации МКБ-10 (ВОЗ, Женева, 1997): В 37.0 «Кандидозный стоматит». 9 Таким образом, всего было обследован и пролечен 81 пациент в возрасте от 32 до 87 лет с разными формами кандидоза СОПР и пародонта (табл. 1). Для подтверждения диагноза кандидоза использовали клинические и лабораторные методы – микроскопический, культуральный (микологический), иммуноферментный и молекулярно-биологический (Мороз, 2009; Царёв, 2009). Таблица 1 Частота основных нозологических форм кандидоза СОПР Код Название нозологической формы МК Б 10 Колич Частота ество в % (на 81 пациентов пациент) с диагнозом В 37.00 В 37.01 В 37.02 Острый псевдомембранозный 8 9,88 4 4,94 23 28,4 25 30,9 21 25,9 кандидозный стоматит Острый эритематозный кандидозный стоматит Хронический псевдомембранозный кандидозный стоматит В 37.03 К 05.3 Хронический атрофический кандидозный стоматит Кандида-ассоциированный пародонтит 10 Клиническое стоматологическое обследования включало: оценку состояния пародонта (индекс гигиены OHI-s; кровоточивости десневых сосочков по Muhlemann; пародонтальный индекс по Rassell; определяли степень потери прикрепления десны и резорбцию альвеолярной кости рентгенологически на ортопантомографе (рис. 1). Рис.1 Ортопантомограмма пациентки К…, 56 лет. Диагноз: кандида-ассоциированный пародонтит тяжелой степени Проводили обследование слизистой оболочки полости рта; проводили микробиологические (культивирование и идентификация бактерий и грибов), молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция и иммуноферментное определение антител к кандида) и иммунологические исследования (фенотипирование лейкоцитов с набором моноклональных СD антител методом проточной цитофлюориметрии). Молекулярно- биологическое исследование включало постановку полимеразной цепной реакции с применением отечественных диагностических систем (НПФ «ГенЛаб», РФ) на отечественной аппаратуре для амплификации ДНК «Терцик». Оценку уровня АТ к грибам Candida осуществляли с помощью твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на спектрофотометре «Мультискан» (Швеция). 11 Для количественного определения дрожжевых грибов выполняли посев на агаризованную среду Сабуро и дифференциально-диагностические среды ХайХром Кандида-агар М1297А и М1297AR. Микологическое исследование выполняли по традиционному алгоритму медицинской микологии (А.И.Сергеев, 2000). Результаты количественной оценки выделения грибов регистрировали в lg КОЕ на 1 мл. Культуральная оценка образования псевдомицелия грибов или тип филаментации, а также формирование ростовых трубок и хламидоспор (Candida, Mycocandida, Mycotorula и др.) проводили на специальных средах (рисовый агар, сыворотка крови). Для идентификации по биохимическим свойствам использовали, тест систему API C, среды с углеводами и индикатором бромтимоловый синий. Полученные данные идентификации сравнивали с результатами идентификации в первичном посеве на хромогенные селективные и дифференциально-диагностические среды ХайХром Кандида-агар М1297А и М1297AR . Всего выделено, идентифицировано и проанализировано 105 штаммов грибов рода Candida. Оценку чувствительности выделенных штаммов к фунгицидным препаратам проводили традиционным диско-диффузионным методом и кассетным микрометодом разведения в агаризованной среде Сабуро (для оценки минимальной подавляющей концентрации - МПК). Изучали чувствительность кетоконазол, производных вориконазол) и азола (флюконазол, полиенового итраконазол, антибиотика (нистатин) в диапазоне концентраций от 0,5 до 256 мкг/мл. Методы статистической обработки результатов. Использовали методики параметрической (средняя величина, ошибка средней величины M+m, коэффициент Стьюдента, вероятность различий Р) и непараметрической обработки результатов. Для относительных величин (частота случаев, отношение числа выделенных штаммов к общему числу и т.п.) определяли частоту (%). В подгруппах с малой выборкой использовали критерий х2. При статистической 12 обработке результатов использовали компьютерную программу Excel для Microsoft. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Полученные данные комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов позволили разделить всех пациентов на несколько группы сравнения с учётом выявления грибов в исследуемом материале и их количества, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Клинические проявления кандидозного поражения слизистой оболочки полости рта отличаются многообразием, но при соблюдении правильных методических подходов, не вызывают затруднения при диагностике. При более глубоком поражении тканей полости рта – кандида-ассоциированном пародонтите, помимо описанных ранее (А.С. Носик, 2004), нами выявлены дополнительные биопленки с клинические симптомы. В частности: формирование характерной «творожистой» или «сметаноподобной» консистенции, которая определяется в десневых карманах при пародонтите средней и тяжелой степени тяжести, не плотное прилегания краевой десны к зубам («зияющие карманы»), быстрое формирование зубных отложений. При выявлении данных признаков рекомендуется проводить у пациентов расширенное микологическое обследование. Для выявления специальные этиологического исследования. фактора следует проводить Для подтверждения диагноза кандидоза проводили микроскопическое исследование (с окраской по Граму), при котором в материале пародонтального кармана, взятого при кюретаже обнаружены фрагменты псевдомицелия. Аналогичная картина отмечена нами при исследовании мазка-соскоба со слизистой у пациентов с перечисленными клиническими формами кандидозного стоматита. Для выделенных определения со СОПР видового и из состава дрожжеподобных грибов, пародонтального кармана пациентов использовали новые питательные среды из класса хромогенных - ХайХром 13 Кандида-агар M1297A и ХайХром Кандида-агар M1297AR, позволяющие выделить в первичном посеве и одновременно идентифицировать 4 и 5 видов Candida соответственно. Несоответствие результатов традиционной идентификации с идентификацией на новых хромогенных средах выявлено в единичных случаях. По результатам исследования и идентификации выделенных штаммов у 67 пациентов с кандидозом СОПР или пародонта, установлено преобладание вида C. albicans (свыше 82 % пациентов), причём у некоторых пациентов (около 10 %) он выделялся в ассоциациях: C. Krusei – у 4-х, C. tropicalis – у 3-х и C. glabrata – у 2-х пациентов. Таким образом, вид C. albicans доминировал по частоте выделения у больных кандидозом СОПР и хроническим пародонтитом в стадии обострения (кандида - ассоциированным пародонтитом). Второе место занимал вид C. Krusei (11 пациентов, что составило около 13 %), причём, у 4-х больных – только вместе с C. albicans (в ассоциации). Единичные находки отмечены для представителей видов, некоторые из них ранее не были идентифицированы при заболеваниях СОПР и пародонта: C. tropicalis, C. glabrata и C. brumptii, а также C. guilliermondii и C.parapsilosis, выявленные только в ассоциациях с C.albicans (рис. 2). Рисунок 2 Частота выделения штаммов Candida разных видов у пациентов с кандидозом СОПР и пародонта (%) Candida albicans Candida spp. Candida Krusei 14 Всего выделено 105 штаммов дрожжевых грибов данного рода, в том числе: 80 штаммов C. albicans, 11 - C. Krusei, 6 - C. glabrata, 2 - C. tropicalis, по одному штамму - C. brumptii, C.parapsilosis и C. guilliermondii, что составило 76,2 %, 10,5 %, 5,7 %, 1,9 % и по 0,95 % соответственно. Для повышения точности диагностики мы впервые провели выявление молекулярных маркеров дрожжевых грибов (образцы экстрагированной ДНК из материала) при заболеваниях СОПР и пародонта, используя отечественный набор реактивов для ПЦР-исследования (фирмы «ГенЛаб»). Из 121 пациента (включая 81 - с подтверждённым диагнозом кандидоза СОПР и пародонта), которым проводили ПЦР-диагностику, у 96 в исследуемом материале (соскобе со СОПР или содержимом пародонтального кармана) выявлена искомая ДНК, что составило 93,8 % от общего числа пациентов с подтверждённым диагнозом (81 чел.), обследованных данным методом. ПЦР была положительна у 76 человек из группы с подтверждённым диагнозом (81 чел.), но также ещё у 20 человек с отрицательным (по данным культурального исследования). Совпадение положительных результатов детектируемых обоими методами из расчёта на 81 пациент, наблюдалось в 93,8% случаев (табл. 2). Таблица 2 Частота совпадения результатов культурального микологического и молекулярного исследования (121 пациент) Группа выборки Число больных, абс. Число больных, % Культуральное исследованию: 1.Положительный результат 81 66,9 2.Отрицательный результат 40 33,1 121 100,0 Всего: 15 ПЦР-диагностика: 1.Положительный результат 96 79,3 2.Отрицательный результат 25 20,7 121 100,0 76 из 81 93,8 Всего: Совпадение результатов Таким образом, по критерию специфичности данной тест-системы для ПЦР по сравнению с культуральным методом получена цифра 93,8 %. Кроме того, дрожжевые грибы рода Candida выделялись из пародонтального кармана культуральным микологическим методом. Примерно у 1/3 пациентов обнаружены фрагменты псевдомицелия, прорастающего в десневой эпителий больных. По результатам исследований (табл. 3), установлено, что при высокой и умеренной обсеменённости пародонтального кармана грибами другой метод исследования - ИФА практически всегда даёт положительный результат и процент совпадения результатов приближается к 100%. При низком количестве грибов, напротив, антитела с помощью ИФА выявляются в 1/3-1/4 случаев. Таблица 3 Взаимосвязь степени обсеменённости содержимого пародонтального кармана грибами кандида по данным культурального микологического исследования и частоты обнаружения АТ к грибам с помощью ИФА Количественная обсеменённость грибами: 1. Высокая степень: Число больных, абс. Положительный результат определения антител в ИФА абс. % совпадения 25 25 100,0 17 16 94,1 количество >6,0 2. Умеренная степень: 16 количество 3,0-5,0 3. Низкая степень: 15 5 33,3 24 5 20,8 81 51 63,0 количество <2,0 4. Грибы не выделены, при положительной ПЦР Всего пациентов: Кандидоз слизистой оболочки полости рта является нередким осложнением протезирования, развивающимся на протяжении 1-3 лет после протезирования или перебазировки, однако при прочих равных условиях наиболее частой полиакриловых причиной развития конструкций, кандидоза изготовленных является из применение «Фторакса» или «Протакрила». Сплавы металлов, полиуретан и современные композитные материалы существенно снижали частоту осложнений кандидозной природы. Клинико-лабораторное обоснование и мониторинг эффективности лечения. Для обоснования выбора препарата изучена чувствительность штаммов дрожжевых грибов Candida albicans, С .tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, С. glabrata. В качестве контроля использовали референтные штаммы из коллекции НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина: C.albicans NCTC 885-653 и др. Исследованные штаммы грибов кандида оказались высоко чувствительны к флюконазолу, итраконазолу и их дженерикам – орунгалу, хайконазолу, но при этом была выявлена высокая резистентность к кетоконазолу и наличие мутантов устойчивых к нистатину. Наиболее чувствительными грибы кандида были к флюко- и итраконазолу (0,5-1,0 до 50 мкг/мл), а к кетоконазолу, нистатину - 50-100 мкг/мл и выше для устойчивых мутантов. Более устойчивыми к действию флюконазола и итраконазола были представители С. krusei и С. glabrata (50 17 мкг/мл и выше), причём МИК нистатина не превышала 50-100 мкг/мл, что позволило рекомендовать этот препарат при устойчивости к производным триазола. Достоверных различий противогрибковой активности флюконазола с дженериком хайконазолом не выявлено. Результаты фунгицидным исследования препаратам с чувствительности помощью штаммов грибов диско-диффузионного к метода представлены в табл. 4. Таблица 4 Результаты определения чувствительности штаммов грибов рода Сandida к фунгицидным препаратам Вид N Различия: Кетоконазол C. albicans 80 Чувствит. 72 90 % 76 95 % 76 95 % 62 77,5 Резистент. 28 10 % 4 5% 4 5% 18 22,5 Чувствит. 0 0% 0 0% 0 0% 9 81,8 Резистент. 11 100 % 11 100 % 11 100% 3 27,2 Чувствит. 1 16,7% 4 66,6% 2 33,3% 3 50% Резистент. 5 83,3% 2 33,3% 4 66,6% 3 50% Чувствит. 5 100 % 5 100 % 5 100% 5 100 C. krusei 11 C. glabrata Candida spp. 6 5 Флюконазол Интраконазол Нистатин Полученные данные позволили рекомендовать дифференцированное назначение противогрибковых препаратов. Общее лечение. Назначали внутрь противогрибковые препараты флюконазола или итраконазола в капсулах по 100 и 200 мг соответственно (в зависимости от результатов определения чувствительности) 1 раз в сутки в течение 7 суток. Производные кетоконазола имеют длительный период полувыведения. При выделении C. Кrusei, устойчивой к азоловым производным применяли нистатин по 500 000 ЕД 2 раза в сутки в течение 7 суток. В комплекс лечения иммуномодулирующим также был действием – ликопид включён в препарат с дозе 10 мг натощак ежедневно, курсами по 10 суток (при необходимости – повтор курса через 20 18 дней). Больным кандидозом необходимо полноценное высококачественное питание с уменьшением количества легкоусвояемых углеводов. Внутрь назначали витамины группы В (В1, В2, В6), РР, С (аскорутин и поливитаминный комплекс «Мультивит»). Местное лечение. Хороший противогрибковый эффект наблюдался при сосании декамина в форме карамели: по 1-2 карамели 6 раз в день (каждые 3 часа). В одной карамели содержится 0,00015 г декамина. Одну-две карамели помещали под язык или за щеку и держат до полного рассасывания, не производя по возможности глотательных движений, чтобы препарат как можно дольше находился в контакте со слизистой оболочкой рта. Для аппликаций и смазывания использовали 20 % раствор буры в глицерине, люголевский раствор в глицерине, 1 % спиртовой раствор сангвиритрина, красителей. При дрожжевой заеде и хейлите была эффективна нистатиновая мазь (по 100 000 ЕД на 1 г основы) или крем клотримазола. Контрольное исследование Проведённое после завершения курса лечения (через 1 месяц) продемонстрировало высокую эффективность по результатам клинического и лабораторного исследования. У 94% исчезали клинические проявления кандидозного стоматита, наблюдалась ремиссия кандида-ассоциированного пародонтита, исчезали кандидозные заеды. У 82% грибы не выявляли культуральным методом, у 75% - с помощью ПЦР. Однако у 64% оставались положительными результаты ИФА, что может быть объяснено формированием выраженной иммунной реакции организма. Заключение В нашей работе мы проводили комплексное лабораторное исследование разными методами. ИФА в твёрдой фазе использовали как скриннинговый метод для определения высокого уровня антител сыворотки крови к грибам Candida albicans для последующего 19 сопоставления данных культурального и молекулярно-биологического обнаружения грибов с уровнем антител к ним. высоком уровне обосновать Полученные нами ложноположительных целесообразность данные реакций применения для свидетельствую о ИФА, и позволяют подтверждения диагноза кандидоза СОПР культурального метода с применением современных хромогенных сред и ПЦР-диагностики. Оба метода позволяют быстро и эффективно (с высоким уровнем чувствительности и специфичности) выявить представителей основных видов дрожжеподобных грибов, которые, по нашим данным, встречаются при кандидозе СОПР (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata). Исходя из результатов мониторинга присутствия кандида в ассоциации условно-патогенных бактерий (2012) заключению, пришли к при пародонтите А.Ю. Миронов с что присутствие грибов соавт. кандида в пародонтальном кармане сопряжено с изменением чувствительности бактерий к антибиотикам и приводит к повышению количества резистентных штаммов бактерий, что, соответственно, снижает эффективность проводимой антибактериальной терапии. По данным известного морфолога-исследователя проблемы кандидоза О.К Хмельницкого (2002) при дифференциальной диагностике различных форм кандидозного процесса, основанной на комплексном подходе к применению разных клинико-лабораторных методов, необходимо учитывать возможные формы взаимодействия кандида с макроорганизмом, что позволит обосновать адекватное этиологическое и патогенетическое лечение. Результаты комплексного клинико-лабораторного подхода, использованного в нашем исследовании, подтвердил данное положение. ВЫВОДЫ 1. В современной структуре кандидоза СОПР (по обращаемости к стоматологу) ведущее место занимают хронические формы (гипертрофический кандидоз – у 28,4 %; атрофический кандидоз – у 30,9 %). В 25,9 % случаев мы диагностировали атипичное течение кандидозного 20 процесса полости рта, охарактеризованное нами как кандида-ассоциированный пародонтит. Клинические проявления такого поражения пародонта имеют свои особенности, позволяющие проводить дифференциальную диагностику от бактериальных поражений. Данные комплексного клинико-лабораторного обследования позволяют провести разделение пациентов на группы с учётом обнаружения грибов в исследуемом материале и степени количественной обсеменённости, начиная от критического числа 103 КОЕ/мл и выше. 2. Для точной этиологической диагностики кандидоза СОПР и пародонта необходимо сочетание культурального, микроскопического, молекулярно- биологического методов диагностики и иммуноферментного анализа, как скриннингового метода. Апробированные в нашей работе новые хромогенные питательные среды для ускоренной диагностики позволяют одновременно провести идентификацию основных видов возбудителей кандидоза (C. albicans, C. Krusei, С.t rоpicalis, C. glabrata, С. parapsilosis). 3. Определение чувствительности грибов в эксперименте на питательной среде in vitro (и, соответственно, устойчивости отдельных штаммов) к используемым противогрибковым химиопрепаратам позволяет выявить круг наиболее эффективных препаратов (флюконазол, итраконазол) и обосновать выбор схемы антимикотической терапии. Обоснован выбор вориконазола и дженерика итраконазола – хайконазола, как возможной лекарственной формы для клинического применения (доклинические исследования). 4. Апробирован отечественный диагностический набор реагентов для детекции генетических маркеров дрожжевых грибов молекулярными методами (чувствительность 93,8 %), проведено сравнение результатов ПЦР-диагностики и культурального микологического исследования при диагностике кандидоза, что позволило рекомендовать методику для комплексной диагностики кандидоза СОПР и контроля эрадикации штаммов возбудителей (через 3-4 недели после завершения фунгицидной химиотерапии). 5. Выявлены особенности иммунного статуса пациентов, свидетельствующие о развитии иммунодефицита Т-системы и недостаточности макрофагально21 гранулоцитарного звена, которые позволили обосновать клиническое применение ликопида и установить его эффективность. 6. Разработаны показания для назначения и параметры оценки эффективности применения фунгицидных препаратов в комплексном лечении кандидоза, которые базируются на совпадении результатов нескольких методов исследования. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе определены характерные местные, общие и анамнестические признаки поражений СОПР, вызванные дрожжевыми грибами кандида. В связи с этим для повышения эффективности диагностики кандидоза рекомендуется: 1. Рекомендации по диагностике В диагностике пародонтита ассоциированного с грибами кандида следует использовать клинические признаки: вялотекущий характер процесса - практически непрерывное течение или короткие промежутки между обострениями заболеваниями; наличие длительно-протекающих и рецидивирующих инфекций в анамнезе, длительные курсы лечения антибиотиками широкого спектра, глюкокортикоидами или иммунодепрессантами, отсутствие клинического эффекта от антибактериального лечения, выделение кандида из респираторного, желудочно-кишечного или урогенитального тракта, свидетельствующее о поражения других органов и систем. Особенно важное значение при дифференциальной диагностике с другими заболеваниями СОПР на наш взгляд имеют: наличие налёта (биопленки) «творожистой» или «сметаноподобной» консистенции, гиперемия, цианоз слизистой оболочке десны, 22 при пародонтите средней и тяжелой степени тяжести не плотное прилегания краевой десны к зубам («зияющие карманы»), быстрое формирование рыхлых и обильных зубных отложений. Во всех случаях стоматита, развившегося после протезирования стоматологических пациентов проведение микроскопического и культурального исследования на грибы рода Candida с применением новых хромогенных сред, позволяющих проводить видовую идентификацию грибов кандида. Для быстрой и эффективной индикации возбудителей кандидоза рекомендуется применять отечественную диагностическую систему для проведения диагностики с помощью полимеразной цепной реакции. Применение ИФА для диагностики кандида-ассоциированного стоматита следует расценивать значительных как скриннинговую контингенов лиц. Всем методику больным при обследовании кандидозом показано исследование иммунного статуса и проведение ИФА исследования на антитела к ВИЧ и гепатитам В и С. 2. Рекомендации по лечению Для выбора кандидоза, препарата включающей с целью комбинированной химиотерапии использование фунгицидных иммуномодулирующих препаратов, рекомендуется чувствительности грибов чувствительности к к фунгицидным флуконазолу проводить средствам. (дифлюкан, и определение При выявлении флюкостат) препарат используется в дозе 100-150 мг (в зависимости от формы) 1 раз в сутки перорально в течение 1 недели. При выявлении чувствительности к итраконазолу (орунгал) препарат используется в дозе 200 мг 1 раз в сутки ежедневно в течение 1 недели. При выделении C. Кrusei, устойчивой к азоловым производным рекомендуется применять нистатин по 500 000 ЕД 2 раза в сутки в течение 1 недели. В качестве иммуномодулирующего препарата лечения кандидоза в составе комплексного следует применять ликопид по 10 мг утром натощак в 23 течение 10 дней 2-3 курсами с интервалом в 1 месяц (независимо от назначения фунгицидных средств). После проведённого лечения кандидоза (через 3-4 недели) необходимо контрольное культуральное или ПЦР-исследование для подтверждения эрадикации возбудителя. Печатные работы автора, опубликованные по теме диссертации: 1. Царев В.Н., Носик А.С., Сударикова С.А. (Суркова), Мезенцева Н.А. Принципы современной клинико-лабораторной диагностики инвазивной кандидозной инфекции // Журнал «Стоматолог» 2010. №3. - С.46-52. 2. Сударикова С.А. (Суркова), Царёв В.Н. Особенности клинико- лабораторной диагностики инвазивной кандидозной инфекции слизистой оболочки полости рта и пародонта // Журнал «Dental Forum» 2011. №3. С.126-127. 3. Царев В.Н., Носик А.С., Сударикова С.А. (Суркова), Ушаков Р.В. Новые диагностические подходы к выявлению инвазивной кандидозной инфекции слизистой оболочки полости рта и пародонта // Журнал «Стоматолог» - 2011. - №4 - С. 14-20. 4. Царёв В.Н., Суркова С.А. (Сударикова), Давыдова М.М. Особенности диагностики инвазивной кандидозной инфекции слизистой оболочки полости рта и тканей пародонта // Журнал «Медицинский алфавит. Стоматология». – 2012. - №6. – С.24-33. 5. Суркова С.А. (Сударикова). Особенности клинико-лабораторной диагностики инвазивной кандидозной инфекции слизистой оболочки полости рта // Журнал «Dental Forum» - 2012. - №3. - С.94-95. 24
