НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КОСМИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТА «ЦИТОМЕХАНАРИУМ» 1 Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса С момента возникновения жизни на Земле все живые организмы развивались под влиянием силы тяжести. Эволюционно сформировался целый ряд разнообразных решений проблемы удержания собственного веса организмом в гравитационном поле Земли (Dubinin, Vaulina, 1976; Ross, 1984; Tairbekov et al., 1997; Volkmann, Baluska, 2006). В целом, механические напряжения, возникающие под действием силы тяжести на организм, возрастают с увеличением массы, хотя для организмов, естественной средой обитания которых является вода, действие силы тяжести в некоторой степени компенсируется силой Архимеда (Herranz et al., 2012). При этом довольно сложно оценить влияние силы тяжести на развитие живых организмов в условиях действия земной гравитации. Несмотря на большое количество объективных причин, осложняющих проведение биологических исследований в космосе, за последние пятьдесят лет накоплен довольно большой объем знаний о реакции живых организмов на измененные условия среды обитания (Claassen, Spooner, 1994). Величина действующей на объект силы тяжести зависит от массы объекта, однако, ее величина воспринималось даже специализированных оказывается одиночной достаточной, клеткой, высокоплотных причем органелл, чтобы в ее изменение отсутствие которые в встречаются ней в растительных клетках (Albrecht-Buehler, 1990; Mesland, 1992). В результате изменения величины силы тяжести меняются различные клеточные процессы и структуры, такие как пролиферация, организация цитоскелета, сигнальные пути, особенно те, в которых участвуют G-белки (Claassen, Spooner, 1994; Cogoli, CogoliGreuter, 1997). Подобные изменения показаны для клеток жгутиковых и реснитчатых простейших (Hemmersbach et al., 1999), лимфоцитов, моноцитов и макрофагов (Cogoli et al., 1993; Cogoli, 1993; Chapes et al., 1994; Schmitt et al., 1996; Cogoli-Greuter et al., 1996; Lewis et al., 1998, 2001), клеток эпидермоидной карциномы (de Groot et al., 1990, 1991), клеток костной ткани (Bikle et al., 1994; Van Loon et al., 1995; Vico et al., 1998, Burger, Klein-Nulend, 1998), мышечных и нервных клеток (Gruener, Hoeger, 1990; Gruener et al.,1994), клеток линии Drosophila Schneider S-1 (Schatten et al., 2001). Аналогичные результаты получены и при моделировании эффектов микрогравитации на Земле (Walther et al., 1998; Clejan et al., 2001; Uva et al., 2002; Grimm et al., 2002). Однако, несмотря на определяющую роль этих процессов (в частности, внутриклеточной сигнализации многоклеточного организма, и организации большинство цитоскелета) экспериментальных на развитие результатов, полученных при исследовании морфогенеза различных видов, в том числе полностью проходившего в условиях микрогравитации, свидетельствуют о том, что эти изменения, по-видимому, скомпенсированы, как у низших, так и у высших организмов. Подобные данные были получены на нематодах, морских ежах, дрозофилах, рыбах, земноводных (Marco et al., 1996). У Xenopus laevis были показаны морфологические изменения, в частности, утолщение бластоцели, позволяющие предположить изменения в клеточной пролиферации, во время раннего развития в условиях микрогравитации (Souza et al., 1995). Аналогичные результаты были получены и при использовании другого вида земноводных, Pleurodeles Waltl, где были обнаружены структурные изменения на стадии дробления и нейруляции (Husson et al., 1998). Тем не менее, большинство эмбрионов нормально завершало дифференцировку и морфогенез, то есть указанные изменения были совместимы с дальнейшими стадиями развития (Souza et al., 1995; Husson et al., 1998; Duprat et al., 1998). Соответственно, можно полагать, что в раннем развитии имеет место «запас» пластичности сигнальных путей, контролирующих структурную организацию и клеточное деление, позволяющая скомпенсировать возникающие на первых стадиях изменения, приводя к формированию нормального зародыша (Li, Noll, 1994; Cooke et al., 1997; Tautz, 2000). 2 До сих пор остается совершенно неясным, каким образом осуществляется регуляция этих «нормализующих» систем, что является одним из фундаментальных вопросов современной биологии развития. Кроме того, решение подобного вопроса могло бы помочь в поиске путей предотвращения негативных эффектов пребывания в условиях невесомости зрелых организмов, поскольку неоднократно подчеркивалось сходство физиологических изменений и процессов адаптации к микрогравитации, наблюдающихся у космонавтов, с возрастными изменениями у людей (Wang, 1999; Burger, Klein-Nulend, 1999). Поэтому представляется весьма актуальным исследование различных аспектов развития, и в первую очередь, раннего развития, многоклеточного организма. Подобный подход предъявляет большое количество требований к объекту исследования, например, короткий цикл развития, нетребовательность к условиям содержания и т.п. Одним из классических объектов биологии развития является плодовая мушка Drosophila. Дрозофила – относительно небольшой устойчивый организм, довольно часто использовавшийся в космических исследованиях в прошлом. Жизненный цикл дрозофилы занимает около двух недель при комнатной температуре, что позволяет получить большое количество поколений за сравнительно небольшой срок (например, за год можно получить до двадцати поколений). Кроме того, можно выращивать сравнительно большое количество мух в относительно небольших камерах. Поскольку дрозофила является высшим организмом, генетика и различные аспекты развития которого хорошо изучены, то именно этот объект является одним из главных претендентов на всестороннее изучение его морфофункционального состояния в условиях микрогравитации с целью установления механизма взаимосвязи между изменениями на клеточном уровне и их последующей компенсацией или адаптацией к ним. Раннее развитие дрозофилы в условиях микрогравитации С тех пор, как Pflueger в 1884 году и Schultze в 1900 году предположили, что у эмбрионов лягушки гравитация может играть определенную роль в начальных процессах сегрегации зиготической цитоплазмы (Marco et al., 2003), многие эмбриологи-экспериментаторы пытались проверить эту гипотезу, используя, 3 например, увеличение внешнего механического воздействия на эмбриональную цитоплазму путем центрифугирования (Brown, Schubiger. 1977) или других экспериментальных подходы, как, например, иммобилизация эмбрионов в фиксированном положении против вектора силы тяжести (Kochav, Eyal-Giladi, 1971; Cooke, 1986). Однако до сих пор этот вопрос окончательно не решен. Практически, в условиях космического полета, достаточно сложно проверить гипотезу о влиянии гравитации на ранее развитие, что связано с особенностями оогенеза (Taylor et al., 1986). Одна яйцеклетка соединяет три поколения, поэтому совершенно необходимо получать третье и четвертое поколение в условиях микрогравитации, чтобы понять роль силы тяжести в формировании эмбриона. Поэтому дрозофила, с ее очень коротким жизненным циклом, является удачным объектом для подобного рода исследований. Дрозофила являлась одним из первых организмов, которых использовали для определения вклада силы тяжести, в том числе ее эпигенетической роли, в раннее развитие эмбрионов (Miquel, Souza, 1991). Результаты ранних экспериментов в космосе (Parfyonov et al., 1979), показали, что развитие дрозофилы в космосе протекает нормально, хотя количественные характеристики в исследованиях подобного рода были труднополучаемы. При полетах кораблей «Восток-3» и «Восток-4» космонавты проводили скрещивание виргинных самок дрозофилы с самцами уже после выхода аппарата на орбиту. Было показано, что копуляция, откладка яиц, эмбриогенез и личиночное развитие дрозофилы в условиях невесомости могут происходить нормально (Parfenov G.P, 1964). В ходе опытов по определению частоты доминантных летальных мутаций в гаметах самцов дрозофилы после космического полета было показано, что индуцированный процент доминантных леталей был положительным и небольшим во всех сериях опытов. Кроме того, отсутствовала корреляция между величиной эффекта и продолжительностью полета, а эффект в незрелых половых клетках (сперматидах и сперматоцитах) был более выражен, нежели в зрелых сперматозоидах (Parfenov G.P, 1961, 1964, 1967). Однако, проведенными теми же авторами дополнительные исследования привели их к выводу, что наблюдавшиеся 4 эффекты были вызваны понижением фертильности самцов в результате действия неспецифических факторов космического полета (Parfenov G.P, 1965). Частоту возникновения рецессивных летальных мутаций определяли, используя высоко- и низкомутабильные линии дрозофилы после полетов различной длительности, однако лишь в некоторых случаях отмечали ее увеличения, при этом стабильного эффекта не наблюдалось (Glembotsky Ya.L. et al., 1961, 1962, 1963, 1970). Далее, результаты, полученные в ходе последнего успешного полета Challenger Shuttle, продемонстрировали, в начале что ноября оогенез и 1985 года эмбриональное в течение развитие 7 дней, дрозофилы изменяются в отсутствие силы тяжести (Vernos et al., 1989). На борту Шаттла находились двести сорок самок и девяносто самцов дикого типа Oregon R. Объектами исследования стали эмбрионы, зачатые во время космического полета, без и при 1g-центрифугировании и насекомые синхронного наземного контроля. Отличий в исследуемых параметрах между эмбрионами синхронного наземного контроля и теми, которые были получены в условиях космического полета при 1gцентрифугировании показано не было. В то же время, для группы, находившейся в космическом полете без экспозиции на центрифуге, отмечались увеличение производства яйцеклеток и их размера, значительное уменьшение количества личинок, вылупившихся из эмбриональной кутикулы в условиях микрогравитации, морфологические изменения в головном и грудном отделах имаго. Более того, по крайней мере, 25% живых эмбрионов, полученных в космосе, не развились во взрослых особей. Авторы полагали, что полученные ими результаты свидетельствуют о роли силы тяжести в распределении и/или локализации материнских компонентов, участвующих в спецификации у эмбриона переднезадней оси (Vernos et al., 1989). Однако позднее, эксперименты, проведенные этой же группой авторов (Marco et al., 1996) и выполненные с оборудованием, позволяющем улучшить оксигенацию образцов, показали, что развитие дрозофилы в условиях микрогравитации количественно и качественно проходит нормально, по крайней мере, если исследовать развившихся личинок и взрослых особей дрозофилы. В 5 ходе детального анализа полученных результатов не было обнаружено подтверждений ранее полученным данным о снижении числа нормально развитых мух в условиях микрогравитации. Однако, следует отметить, что в более поздних экспериментах 1g-центрифугирование в условиях космического полета не проводилось, что вызывает определенные трудности при сравнении и интерпретации результатов. Старение Продолжительность жизни видов, скорее всего, является эволюционнообусловленным параметром (Rose, 1991), однако, до сих пор неясно, насколько она подвержена генетическим и/или эпигенетическим изменениям. Учитывая, что некоторые аспекты физиологической адаптации взрослых организмов к микрогравитации можно сравнить с возрастными изменениями (Wang, 1999; Burger, Klein-Nulend, 1999; Vernikos, Schneider, 2010), то насекомые, организм которых в основном состоит из постмитотических клеток с относительно короткой продолжительностью жизни, представляют собой группу организмов, которые оптимально подходят для изучения некоторых особенностей возрастных изменений организма (Marco et al., 2003). Давно была выдвинута идея, что усиленный метаболизм (так называемая rateofliving теория), увеличивает скорость старения, которая впоследствии была уточнена (Miquel, Fleming, 1984) связав явление старения с увеличением митохондриальной функции, вследствие увеличения уровня метаболизма (Sohal, Weindruch, 1996; Wallace, 1999). В экспериментах с дрозофилой было показано, что свободные радикалы, появляющиеся в результате обмена веществ, могут быть связаны с процессом старения. Так, при оверэкспрессия медь-цинковой супероксиддисмутазы и каталазы, участвующих в элиминации свободных радикалов, окислительных продуктов метаболизма митохондрий, привела к замедлению процесса старения (Orr, Sohal, 1994). Некоторые авторы связывают возрастное снижение функции митохондрий у дрозофилы не с изменением в количестве и/или качестве митохондриальной ДНК, а, скорее, со значительным снижением уровня 6 содержания мРНК, кодирующей митохондриальные компоненты (Calleja et al., 1993; Schwarze et al., 1998 a,b), то есть с регуляцией транскрипции. Внешние воздействия окружающей среды, например, изменение температуры созревания, изменяют продолжительность жизни дрозофил (Miquel et al., 1976; Rose, 1991) на фоне изменения интенсивности клеточного дыхания (Miquel et al., 1976). Воздействие на Musca Domestica, обычную домашнюю муху, в различных внешних условиях, в том числе при изменении уровня физической активности, также приводило к изменению скорости старения (Agarwal, Sohal, 1994). Воздействие микрогравитации на имаго самцов дрозофилы также влияет на процесс старения. После воздействия невесомости, длительностью от 1 до 3 недель, на молодых зрелых особей было показано уменьшение продолжительности их жизни после возвращения из космоса, по сравнению с наземным контролем (Marco et al., 1992). Поскольку наземный контроль был синхронным, то есть температура и оксигенация были аналогичны таковым в условиях космического полета, то авторы предположили, что к изменению продолжительности жизни могло привести увеличение физической активности в полете, приводящее к интенсификации процесса клеточного дыхания (Miquel et al., 1980; Agarwal, Sohal, 1994; Marco et al., 2003). Для подтверждения своего предположения группой Marco et al. Был проведен эксперимент на борту Шаттла (IML-2), где в течение 14,5-суточного полета проводилась видеорегистрация двигательной активности 300 молодых самцов дрозофилы. Авторы показали заметное увеличение двигательной активности мух в космосе, и по возвращению у самцов обнаружили соответствующий возрастной ответ, как с точки зрения физиологических аспектов жизнеспособности (спаривания и негативного гравитаксиса), так и при анализе кривых продолжительности жизни (life-span curves) (Bengurıґa et al., 1996). Участие митохондриального метаболизма в этом эффекте также подтверждалось снижением содержания митохондриальной 16S рибосомальной РНК у мух в условиях микрогравитации, в сравнении с земным контролем (Marco et al., 2003). Тем не менее, остается неясным, почему происходит увеличение двигательной активности у молодых самцов дрозофилы 7 в условиях невесомости. В экспериментах на Земле было показано, что дрозофилы избегают отрицательного гравитаксиса (Miquel et al., 1976). Marco et al. (2003) полагают, что результаты эксперимента на борту IML-2 могут быть связаны с возрастом самцов. Молодые имаго имели более незрелую поведенческую реакцию и, следовательно, они более остро реагировали на отсутствие нормального направления действия силы тяжести, что могло послужить причиной непрерывного поиска «области с более высокой гравитацией» (Marco et al., 2003). Такое предположение косвенно подтверждается ранее опубликованными результатами, свидетельствующими о том, что у зрелых взрослых особей мух (возрастом две недели и больше), подверженных воздействию микрогравитации, не было ускорения процесса старения, в сравнении с более молодыми особями (Miquel, Souza, 1991). Молекулярно-генетические исследования В настоящее время полностью расшифрованы и доступны в Flybase геномы более двенадцати видов дрозофилы (Drysdale, 2008), что предоставляет возможность для применения принципиально иных методов исследования реакции этих насекомых на измененные внешние условия. В частности, с развитием молекулярно-генетических экспериментальных методов стало возможным скрининговое исследование транскриптома дрозофилы. Первые шаги в этом направлении были сделаны Arbeitman et al. (2002), которые исследовали дифференциальную экспрессию одной трети генома во время развития Drosophila. Авторы получили данные об уровне экспрессии генов в различные периоды развития дрозофилы, и идентифицировали новые гены, вовлеченные в широкий спектр процессов, в том числе в структурирование раннего эмбриона и процесс старения у взрослых особей (Arbeitman et al., 2002). Представлен ряд публикаций, в которых такой подход применен для выявления глобальных изменений экспрессии генов в космосе (Hammond et al., 1999; Lewis et al., 1998, 2001) или в моделируемых условиях космического полета на Земле (Khaoustov et al., 2001). Полногеномное транскрипционное профилирование показывает, что снижение уровня силы тяжести во время метаморфоза дрозофилы во время эксперимента на Международной космической станции (МКС) приводит к изменениям в профиле 8 экспрессии генов: наблюдается большое количество генов, экспрессирующихся отлично от наземного контроля. Однако, процедуры подготовки к космическому полету и неоптимальные условия окружающей среды на борту МКС, могут оказывать на мух дополнительное стрессирующее воздействие, что может явно повлиять на экспрессию генов. В то же время модельные эксперименты, проводимые на земле с использованием машины случайного позиционирования (RPM) (van Loon, 2007) относительно направления вектора силы тяжести при оптимальных условиях внешней среды, позволяют выявить более тонкие эффекты воздействия на экспрессию генов. Тем не менее, при повторе наземных экспериментов в условиях, воспроизводящих стресс, обусловленный процедурами подготовки и проведения космического полета, дифференциальная экспрессия 79% генов, обнаруженная в эксперименте на МКС, воспроизводится в эксперименте с RPM. Генно-онтологический анализ показывает, что продукты этих дифференциально-экспрессирующихся генов участвуют в дыхании, процессах развития и морфогенеза, в формировании реакции на стресс (Herranz et al., 2010). Другой способ моделирования эффектов микрогравитации на Земле состоит в использовании диамагнитной левитации (Coleman, 2007; Dijkstra et al., 2011; Guevorkian, Valles, 2006; Valles et al., 1997). Диамагнитный материал, состоящий из воды и биологической ткани, отталкивается от магнитных полей. В отверстии мощного электромагнита или сверхпроводящего соленоида, отталкивающей диамагнитной силы может быть достаточно, чтобы сбалансировать вес воды таким образом, чтобы она парила (Beaugnon, Tournier, 1991; Berry, Geim, 1997; Hill, Eaves, 2008). В этом отношении, действие диамагнитной силы можно сравнить с действием центробежной, которая уравновешивает силу тяжести, действующую на объект на орбите Земли или другой планеты (Herranz et al., 2012). Большинство мягких биологических тканей может левитировать в тех же условиях, так как вода является основным компонентом ткани по массе, а большая часть оставшегося материала имеет магнитную восприимчивость и плотность, близкую к воде (Schenck, 1992). Используя этот метод, были изучены изменения в поведении левитирующих дрозофил в сверхпроводящем магните, аналогичные тем, которые 9 отмечались в условиях реальной невесомости (Hill, 2012). Кроме того, с помощью сверхпроводящего магнита можно моделировать и условия гипрегравитации. Herranz et al. (2012) исследовали влияние 22-дневных левитации (0g) и имитации гипергравитации (2g) на дрозофилу. В условиях 0g была обнаружена значительная задержка в развитии дрозофил из эмбриона до взрослой особи, по сравнению с контролем. Анализ на микрочипах показал изменения в полногеномной экспрессии имаго, которые развились из личинок как под действием диамагнитной левитации, так и в условиях моделированной гипергравитации, в частности, в экспрессии генов, отвечающих за стресс, иммунитет и температурную регуляцию (например, были обнаружены изменения экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока). Однако, авторы показали, что сильное магнитное поле (16,5 Тесла) само по себе оказывает значительное влияние на экспрессию этих генов независимо от эффектов, связанных с магнитноиндуцированной левитацией и гипергравитацией. Позднее те же авторы (Herranz et al., 2013), изучая метаморфоз дрозофилы (3-4 дневные эксперименты) в условиях измененной силы тяжести с помощью различных устройств, моделирующих эффекты микрогравитации на Земле, продемонстрировали, что реакция дрозофил на измененные гравитационные условия является различной, в зависимости от условий окружающей среды (исследовали, в том числе, влияние пониженной температуры до 12 0С и гипоксии) и типа используемых моделей. Хотя при использовании различных технических устройств эффект оказывался на разные гены, с помощью компьютерных методов анализа генома («gene expression dynamics inspector» (GEDI) self-organizing maps) было показано, что эти гены принадлежат к одной онтологической группе, по крайней мере к одному большому мультигенному семейству, продукты которого участвуют в формировании поведенческих реакций, реакции на стресс, а также в органогенезе. 10 2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства полета на МКС. В настоящее время до сих пор остаются неясными пути механотрансдукции в клетке, в том числе далек от ответа вопрос о том, что же является первичным рецептором и каким образом клетка способна различать увеличение и уменьшение на нее нагрузки, в частности - гравитационной. Ранее нами был получен целый ряд данных, позволяющих предположить роль актин-связывающих белков подмембранного цитоскелета в первичной механорецепции клетками скелетных мышц и миокарда. Однако в земных условиях исключить прямое действие на организм силы тяжести не удается. Поэтому наиболее эффективным инструментом для изучения влияния невесомости на живые организмы остается реальный космический полет. Представленные в доступной нам литературе результаты исследования различных аспектов жизнедеятельности плодовой мушки дрозофилы в условиях реальной и моделируемой микрогравитации позволяют говорить о том, что данный объект является весьма интересным и перспективным для последующего изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе адаптационного ответа на экстремальные условия внешней среды. Короткий жизненный цикл, нетребовательность к техническому устройству систем жизнеобеспечения экспериментов на борту спутников или МКС, а также полностью секвенированный геном дают возможность проведения широкого спектра скрининговых исследований. Методики полногеномного секвенирования транскриптома (NG- секвенирование), а также полного протеомного анализа на основе массспектрометрии позволяют в будущем рассчитывать на выявление механизмов регуляции развития и формирования адаптационного паттерна как на уровне клеточных структур, включающих регуляцию на уровне транскрипции и трансляции, так и на уровне целого организма. В связи с вышеизложенным целью предлагаемого эксперимента является поиск кандидатов на роль белков-мишеней, являющихся потенциальными 11 механосенсорами, клеток Drosophila melanogaster, находившихся в условиях космического полета. Для достижения этой цели будет проведен анализ полного протеома (с использованием масс-спектрометрии) и полного транскриптома (с использованием NG-секвенирования) полученных после космического полета имаго и личинок Drosophila melanogaster. Полученные после такого скрининга данные будут верифицированы с использованием вестерн-блоттинга и полимеразной цепной реакции. В рамках научных исследований Drosophila melanogaster после космического полета предполагается решить следующие задачи: - скрининговое полногеномное секвенирование транскриптома (NGS) для оценки изменений уровня экспрессии всех генов на разных стадиях развития Drosophila melanogaster после действия факторов космического полета; - скрининговый анализ полного протеома (методом масс-спектрометрии) для оценки изменений белкового состава на разных стадиях развития Drosophila melanogaster после действия факторов космического полета; - прицельное исследование белков и кодирующих их генов (содержание методом вестерн-блоттинга и уровень экспрессии соответствующих генов методом ПЦР в реальном времени), обеспечивающих структурную организацию цитоскелета, как мишеней действия невесомости у имаго Drosophila melanogaster после действия факторов космического полета. 3 Описание космического эксперимента Каждый эксперимент проводится в три этапа. - Подготовка биообъектов Объекты исследования (имаго или личинки Drosophila melanogaster) будут размещены в 4 пластиковых пробирках объемом 50 мл в укладке ББ-МКС. Крышки пробирок будут иметь отверстия для обеспечения пассивной оксигенации за счёт воздушной среды РС МКС. Отверстия в крышках пробирок будут закрыты фильтром для препятствования проникновения биоматериала в объём РС МКС. 12 В пробирках будет находиться твёрдая стандартная (для разведения дрозофилы) питательная среда следующего состава: вода – 1000 мл, агар-агар – 6 г, сахарный песок – 40 г, манная крупа - 40 г, пекарские дрожжи – 25 г, пропионовая кислота – 8 г. В зависимости от длительности сеанса КЭ объем среды варьирует: при экспонировании от 0 до 15 суток объем загружаемой среды составляет 10 мл, от 16 до 60 суток – объем среды составляет 30 мл. В зависимости от длительности сеанса КЭ происходит загрузка биообъектов: - при длительности полета от 0 до 15 суток за 96 – 72 часа до старта спутника пять пар личинок 3 стадии развития Drosophila melanogaster, будут помещены в пробирки; - при длительности полета от 16 до 60 суток за 96 – 48 часов до старта КА пять пар имаго Drosophila melanogaster, возрастом 2 дня, будут помещены в пробирки; Далее пробирки будут загружены в укладку ББ-МКС. Все процедуры будут проводиться при комнатной температуре (23 – 25 0С). - Экспонирование биообъектов на РС МКС Укладка ББ-МКС размещается на РС МКС следующим образом: - при длительности полета от 0 до 30 суток – в пространстве РС МКС при температуре 21 – 26 0С; - при длительности полета от 30 до 60 суток – в пространстве РС МКС при температуре 16 – 20 0С; Фиксацию биоматериала после приземления спускаемого аппарата проводят на месте посадки. Синхронный наземный контроль будет проводиться аналогично работам на ТК. Процедуры подготовки и загрузки биообъектов при проведении синхронного наземного контроля будут аналогичны таковым, проведенным на ТК. 13 4 Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными отечественными и зарубежными исследованиями Научный эксперимент «ЦИТОМЕХАНАРИУМ» на борту РС МКС является новым шагом в развитии космической биологии. Впервые, благодаря новым методам послеполетного анализа биологического материала, предоставляется возможность получить данные о сочетанном воздействии факторов космического полета на развитие многоклеточного организма. Аналогов подобному эксперименту в доступной нам литературе найти не удалось. 5 Ожидаемые научные результаты и их предполагаемое использование В результате выполнения эксперимента «ЦИТОМЕХАНАРИУМ» в ходе космического полёта ожидается получение новых научных данных: а) о механизмах регуляции экспрессии полного генома на разных стадиях развития многоклеточного организма; б) о механизмах регуляция паттерна транскриптома на разных стадиях развития многоклеточного организма; в) о структурных изменениях цитоскелета. Учитывая, что многие подобные механизмы у насекомых и млекопитающих на клеточном уровне имеют большое сходство, можно полагать, что результаты таких исследований будут полезны не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения, в частности, при разработке подходов для протекции различных систем организма человека в условиях невесомости. 6 Обоснование технической возможности создания НА с заданными характеристиками В КЭ используется укладка ББ-МКС, доставляемая на борт РС МКС. Технических средств, привлекаемых или создаваемых для обеспечения внешних по отношению к РС МКС условий эксперимента, не требуется. 7 Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ Укладка ББ-МКС позволяет обеспечить безопасное содержание биообъектов на борту РС МКС, что не приводит к появлению рисков и дискомфорта для 14 экипажа. Биообъекты и среда для их питания не представляют опасности для здоровья членов экипажа. Обязанности экипажа в эксперименте «ЦИТОМЕХАНАРИУМ» заключаются в размещении укладки в РС МКС, ее открытии с целью обеспечения воздухообмена, и закрытии перед спуском на Землю, а также контроле температуры и уровня радиации в месте проведения КЭ. 8 Ожидаемый эффект от выполнения КЭ, методика его оценки При выполнении космического эксперимента будут получены новые научные данные возможных клеточных механосенсорах. Оценка значимости этих результатов может быть проведена путём сравнения с уже имеющейся научной информацией. Список цитируемой литературы 1. Agarwal S., Sohal R.S. (1994) DNA oxidative damage and life expectancy in houseflies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12332–12335. 2. Albrecht-Buehler G. (1990) In defense of ‘Nonmolecular’ Cell Biology. Int. Rev. Cytol. 120, 191–241. 3. Arbeitman M.N., Furlong E.E., Imam F., Johnson E., Null B.H., Baker B.S., Krasnow M.A., Scott M.P., Davis R.W., White K.P. (2002) Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science 297, 2270–2275. 4. Beaugnon E., Tournier R. (1991) Levitation of organic materials. Nature, 349:470. 5. Bengurira A., Grande E., de Juan E., Ugalde C., Miquel J., Garesse R., Marco R. (1996) Microgravity Effects on Drosophila melanogaster behavior and aging. Implications of the IML-2 Experiment. J. Biotechnol. 47, 191–202. 6. Berry M.V., Geim A.K. (1997) Of flying frogs and levitrons. Eur J Phys, 18:307313. 7. Bikle D.D., Harris J., Halloran B.P., Morey-Holton E. (1994) Altered skeletal pattern of gene expression in response to Space Flight: comparison to the response to hind limb elevation. Am. J. Physiol 267, 822–827. 8. Brown E.E., Schubiger G. (1977). Centrifugation of developing oocytes leading to embryonic defects. Dev Biol 55: 170-178. 15 9. Burger E.H., Klein-Nulend J. (1999) Mechanotransduction in bone-role of the lacuno-canalicular network. FASEB J, 13 Suppl. S101–12. 10. Calleja M., Pena P., Ugalde C., Ferreiro C., Marco R., Garesse R. (1993) Mitochondrial DNA remains intact during Drosophila aging but the levels of mitochondrial transcripts are significantly reduced. J Biol Chem 268, 18891–18897. 11. Chapes S.K., Morrison D.R., Guikema J.A., Lewis M.L., Spooner B.S. (1994) Production and action of cytokines in space. Adv Space Res 14(8), 5–8. 12. Claassen D.E., Spooner B.S. (1994) Impact of Altered Gravity on Aspects of Cell Biology. Int Rev Cytol 156, 301–373. 13. Clejan S., O’Connor K., Rosensweig N. (2001) Tri-dimensional prostate cell cultures in simulated microgravity and induced changes in lipid second messengers and signal transduction. J Cell Mol Med 5, 60–73. 14. Cogoli A. (1993) The effect of hypogravity and hypergravity on cells of the immune system. J Leukocyte Biol 54, 250–268. 15. Cogoli A., Bechler B., Cogoli-Greuter M., Criswell S.B., Joller H., Jollber P., Hunziger E., Mueller O. (1993) Mitogenic signal transduction in T-lymphocytes in microgravity. J Leukocyte Biol 53, 569–575. 16. Cogoli A., Cogoli-Greuter M. (1997) Activation and proliferation of lymphocytes and other mammalian cells in microgravity. Adv Space Biol Med 6, 33–79. 17. Cogoli-Greuter M., Meloni M.A., Sciola L., Spano A., Pippia P., Monaco G., Cogoli A. (1996) Movements and interactions of leukocytes in microgravity. J Biotechnol 47(2–3), 279–287. 18. Coleman C.B., Gonzalez-Villalobos R.A., Allen P.L., Johanson K., Guevorkian K., Valles J.M., Hammond T.G. (2007) Diamagnetic levitation changes growth, cell cycle, and gene expression of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng 98:854863. 19. Cooke J. (1986). Permanent distortion of positional system of Xenopus embryo by brief perturbation in gravity. Nature 319: 60-63. 20. Cooke J., Nowak M.A., Boerlijst M., Maynard-Smith J. (1997) Evolutionary origins and maintenance of redundant gene expression during metazoan development. Trends Genet 13(9): 360–364. 16 21. de Groot R.P., Rijken P.J., Boonstra J., Verkleij A.J., de Laat S.W., Kruijer, W. (1991) Nuclear responses to protein kinase C signal transduction are sensitive to gravity changes. Exp Cell Res 197, 87–90. 22. de Groot R.P., Rijken P.J., Den Hertog J., Boonstra J., Verkleij A.J., de Laat S.W., Kruijer W. (1990) Microgravity decreases c-fos induction and serum response element activity. J Cell Sci 97, 33–38. 23. Dijkstra CE, Larkin OJ, Anthony P, Davey MR, Eaves L, Rees CE, Hill RJ: Diamagnetic levitation enhances growth of liquid bacterial cultures by increasing oxygen availability. J R Soc Interface 2011, 8:334-344. 24. Drysdale R. (2008) FlyBase: a database for the Drosophila research community. Methods Mol Biol, 420:45-59. 25. Dubinin N., Vaulina E. (1976) The evolutionary role of gravity. Life Sci Space Res, 14:47-55. 26. Duprat A.M., Husson D., Gualandris-Parisot L. (1998) Does gravity influence the early stages of the development of the nervous system in an amphibian? Brain Res Rev 28(1–2), 19–24. 27. Glembotsky Ya.L. Genetic researches in space // Kosmicheskie issledovaniya. 1970. Vol. 8. P. 616–627. 28. Glembotsky Ya.L., Abeleva E.A., Lapkin Yu.A., Parfenov G.P. Space factors influence on the frequency of appearance recessive flight mutations in Xchromosome of the Drosophila // Iskusstvennye sputniki Zemli / Moscow. Publ. AS USSR. 1961. Vol. 10. P. 61–68 29. Glembotsky Ya.L., Lapkin Yu.A., Parfenov G.P., Kamshilova E.M. Effect of space factors on the frequency of appearance recessive sex-linked flight mutations of the Drosophila // Kosmicheskie issledovaniya. 1963. Vol. 1. P. 326. 30. Glembotsky Ya.L., Parfenov G.P. Effect of space flight factors on some indicators of insects // Problemy kosmicheskoy biologii / Moscow. Publ. AS USSR. 1962. Vol. 2. P. 98–115. 31. Glembotsky Ya.L., Parfenov G.P., Lapkin Yu.A. Effect of space factors on the frequency of appearance recessive sex-linked flight mutations of the Drosophila // 17 Iskusstvennye sputniki Zemli / Moscow, Publ. AS USSR. 1963. Vol. 15. P. 113– 118. 32. Glembotsky Ya.L., Parfenov G.P., Lapkin Yu.A., Baranovskaya I.V. Recessive lethals in X-chromosome of the Drosophila and genetic protection at the spaceflight “Voskhod” // Kosmicheskie issledovaniya. 1967. Vol. 5. P 293–297. 33. Grimm D., Bauer J., Kossmehl P., Shakibaei M., Schoberger J., Pickenhahn H., Schulze-Tanzil G., Vetter R., Eilles C., Paul M., Cogoli A. (2002) Simulated microgravity alters differentiation and increases apoptosis in human follicular thyroid carcinoma cells. FASEB J 16, 604–606. 34. Gruener R., Hoeger G. (1990) Vector-free gravity disrupts synapse formation in cell culture. Am J Physiol 258, c489–c494. 35. Gruener R., Roberts R., Reitstetter R. (1994) Reduced receptor aggregation and altered cytoskeleton in cultured myocytes after space-flight. Biol Sci Space 8, 79– 93. 36. Guevorkian K., Valles J.M.Jr. (2006) Swimming Paramecium in magnetically simulated enhanced, reduced, and inverted gravity environments. Proc Natl Acad Sci USA, 103: 13051-13056. 37. Hammond T.G., Lewis F.C., Goodwin T.J., Linnehan R.M., Wolf D.A., Hire K. P., Campbell W.C., Benes E., O’Reilly K.C., Globus R.K., Kaysen J.H. (1999) Gene expression in space. Nat Med 5, 359. 38. Hemmersbach R., Volkmann D., Hader D.P. (1999) Graviorientation in protists and plants. J Plant Physiol 154(1), 1–15. 39. Herranz R, Larkin OJ, Dijkstra CE, Hill RJ, Anthony P, Davey MR, Eaves L, van Loon JJ, Medina FJ, Marco R. Microgravity simulation by diamagnetic levitation: effects of a strong gradient magnetic field on the transcriptional profile of Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 2012 Feb 1;13:52. doi: 10.1186/14712164-13-52. 40. Herranz R., Bengurira A., Lavan D.A., Lopez-Vidriero I., Gasset G., Medina F.J., van Loon J.J., Marco R. (2010) Spaceflight-related suboptimal conditions can accentuate the altered gravity response of Drosophila transcriptome. Molecular Ecology 19, 4255–4264. 18 41. Herranz R., Larkin O.J., Hill R.J., Lopez-Vidriero I., van Loon J.J., Medina F.J. (2013) Suboptimal evolutionary novel environments promote singular altered gravity responses of transcriptome during Drosophila metamorphosis. BMC Evol Biol 27;13:133. 42. Hill R.J., Eaves L. (2008) Nonaxisymmetric shapes of a magnetically levitated and spinning water droplet. Phys Rev Lett, 101:234-501. 43. Hill R.J., Larkin O., Dijkstra C., Manzano A.I., Juan Ed., Davey M., Anthony P., Eaves L., Medina F.J., Marco R., Herranz R. (2012) Effect of magnetically simulated zero-gravity and enhanced gravity on the walk of the common fruitfly. J R Soc Interface 9(72):1438-1449. 44. Husson D., Gualandris-Parisot L., Foulquier F., Grinfield S., Kan P., Duprat A.M. (1998) Differentiation in microgravity of neural and muscle cells of a vertebrate (amphibian). Adv Space Res 22(2):303-308. 45. Khaoustov V.I, Risin D., Pellis N.R., Yoffe B. (2001) Microarray analysis of genes differentially expressed in HepG2 cells cultured in simulated microgravity: preliminary report. In Vitro Cell Dev Biol Anim 37, 84–88. 46. Kochav S., Eyal-Giladi H. (1971) Bilateral symmetry in chick embryo determination by gravity. Science 171: 1027-1029. 47. Lewis M.L., Cubano L.A., Zhao B., Dinh H.K., Pabalan J.G., Piepmeier E.H., Bowman P.D. (2001) cDNA microarray reveals altered cytoskeletal gene expression in space-flown leukemic T lymphocytes (Jurkat). FASEB J 15, 1783–1785. 48. Lewis M.L., Reynolds J.L., Cubano L.A., Hatton J.P., Lawless B.D., Piepmeier E.H. (1998) Spaceflight alters microtubules and increases apoptosis in humanlymphocytes (Jurkat). FASEB J 12, 1007–1018. 49. Li X., Noll M. (1994) Evolution of distinct developmental functions of three Drosophila genes by the acquisition of different cis-regulatory regions. Nature 367, 83–87. 50. Marco R., Bengurira A., Sanchez J., de Juan E. (1996) Effects of the Space Environment on Drosophila melanogaster Development. Implications of the IML-2. Exp J Biotechnol 47, 179–190. 19 51. Marco R., Gonzalez-Jurado J., Calleja M., Garesse R., Maroto M., Ramirez E., de Juan E., Miquel J. (1992) Microgravity effects on Drosophila melanogaster development and aging: Comparative analysis of the results of the Fly Experiment in the Biokosmos 9 URSS biosatellite flight. Adv Space Res 12(1), 157–166. 52. Marco R., Husson D., Herranz R., Mateos J., Medina F.J. (2003) Drosophila melanogaster and the future of 'evo-devo' biology in space. Challenges and problems in the path of an eventual colonization project outside the earth. Adv Space Biol Med 9:41-81. 53. Mesland D.A.M. (1992) Mechanisms of Gravity Effects on Cells: Are there Gravity-Sensitive Windows. Adv Space Biol Med 2, 234–276. 54. Miquel J., Economos A.C., Fleming J., Johnson J.E.Jr. (1980) Mitochondrial role in cell aging. Exp Gerontol 15, 575–591. 55. Miquel J., Fleming J. (1984) A two-step hypothesis on the mechanism of in vitro cell aging: cell differentation followed by intrinsic mitochondrial mutagenesis. Exp Gerontol 19, 31–36. 56. Miquel J., Lundgren P.R., Bensch K.G., Atlan H. (1976) Effects of temperature on the life-span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mech Ageing Dev 5, 347–370. 57. Miquel J., Souza K, A. (1991) Gravity Effects on Reproduction, Development and Aging. Adv Space Biol Med 1, 104–154. 58. Orr W.C., Sohal R.S. (1994) Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science 263, 1128–1130. 59. Parfenov G.P. Appearance of crossing-over in Drosophila males influenced by vibration, acceleration and gamma-irradiation // Kosmicheskie issledovaniya. 1964. Vol. 2. P. 648–657. 60. Parfenov G.P. Appearance of dominant lethal mutations in Drosophila during space flight on the satellite // Iskusstvennye sputnik Zemli / Moscow. Publ. AS USSR. 1961. Vol. 10. P. 69–71. 61. Parfenov G.P. Appearance of dominant lethals in Drosophila influenced by vibration, acceleration and gamma-irradiation // Kosmicheskie issledovaniya. 1965. Vol. 3. P. 643–651. 20 62. Parfenov G.P. Development of organisms in a state of weightlessness // Kosnicheskie issledovaniya. 1964. Vol. 2. P. 330–335 63. Parfenov G.P. Genetic researches in space // Kosmicheskie issledovaniya. 1967. Vol. 5. P. 633–635. 64. Parfenov G.P. Reasons of the lethality in Drosophila germ cells after the spaceflights "Vostok-3" and "Vostok-4" // Kosmicheskie issledovaniya. 1964. Vol. 2. P. 335–342. 65. Parfyonov G.P., Platonova R.N., Tairbekov M.G., Zhvalikovskaya V.P., Mpzgovaya I.E., Rostopshina A.V., Rozov A.N. (1979). Biological experiments carried out aboard the biological satellite Cosmos- 936. Life Sciences and Space Research 17: 297-30 1. 66. Rose M.R. (1991) Evolutionary Biology of Aging. Oxford University Press, New York. 67. Ross M. (1984) The influence of gravity on structure and function of animals. Adv Space Res, 4:305-314. 68. Schatten H., Lewis M.L., Chakrabarti A. (2001) Spaceflight and clinorotation cause cytoskeleton and mitochondria changes and increases in apoptosis in cultured cells. Acta Astronaut 49, 399–418. 69. Schenck J.F. (1992) Health and physiological effects of human exposure to wholebody four-tesla magnetic fields during MRI. Ann N Y Acad Sci, 649:285-301. 70. Schmitt D.A., Hatton J.P., Emond C., Chaput D., Paris H., Levade T., Cazenave J.P., Schaffar L. (1996) The distribution of protein kinase C in human leukocytes is altered in Microgravity. FASEB J 10, 1627–1634. 71. Schwarze S.R., Weindruch R., Aiken J.M. (1998b) Oxidative stress and aging reduce COX I RNA and cytochrome oxidase activity in Drosophila. Free Radical Biol Med 25, 740–747. 72. Schwarze S.R., Weindruch R., Aiken, J.M. (1998a) Decreased mitochondrial RNA levels without accumulation of mitochondrial DNA deletions in aging Drosophila melanogaster. Mutat Res 382, 99–107. 73. Sohal R.S., Weindruch R. (1996) Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science 273(5271), 59–63. 21 74. Souza K.A., Black S.D., Wassersug R.J. (1995) Amphibian development in the virtual absence of gravity. Proc Natl Acad Sci 92, 1975–1978. 75. Tairbekov M.G., Klimovitskii V., Oganov V.S. (1997) The role of gravitational force in the evolution of living systems (the biomechanical and energy aspects). Izv Akad Nauk Ser Biol, 517-530. 76. Tautz D. (2000) A genetic uncertainty problem Trends. Genetics 16(11), 475–477. 77. Taylor M.V., Gusse M., Evan G.I., Dathan N., Mechali M. (1986) Xenopus myc proto-oncogene during development: expression as a stable maternal mRNA uncoupled from cell division. EMBO J 5: 3563-3570. 78. Uva B.M., Masini M.A., Sturla M., Prato P., Passalacqua M., Giuliani M., Tagliafierro G., Strollo F. (2002) Clinorotation-induced weightlessness influences the cytoskeleton of glial cells in culture. Brain Res 934, 132–139. 79. Valles J.M.Jr., Lin K., Denegre J.M., Mowry K.L. (1997) Stable magnetic field gradient levitation of Xenopus laevis: toward low-gravity simulation. Biophys J, 73:1130-1133. 80. van Loon J.J., Bervoets D.J., Burger E.H., Dieudonne S.C., Hagen J.W., Semeins C.M., Doulabi B.Z., Veldhuijzen J.P. (1995) Decreased mineralization and increased calcium release in isolated fetal mouse long bones under near weightlessness. J Bone Miner Res 10(4), 550–557. 81. van Loon J.J.W.A. (2007) Some history and use of the Random Positioning Machine, RPM, in gravity related research. Adv Space Res, 39:1161-1165. 82. Vernikos J., Schneider V.S. (2010) Space, gravity and the physiology of aging: parallel or convergent disciplines? A mini-review. Gerontology 56(2):157-166. 83. Vernos I., Gonzalez-Jurado J., Calleja M., Marco R. (1989) Microgravity effects on the oogenesis and development of embryos of Drosophila melanogaster laid in the Spaceshuttle during the Biorack experiment (ESA). Int J Dev Biol 33(2):213-26. 84. Vico L., Lafage-Proust M.H., Alexandre C. (1998) Effects of gravitational changes on the bone system in vitro and in vivo. Bone 22 (5 Suppl): 95S–100S. 85. Volkmann D., Baluska F. (2006) Gravity: one of the driving forces for evolution. Protoplasma, 229:143-148. 22 86. Wallace D.C. (1999) Mitochondrial diseases in man and mouse. Science 283, 1482– 1488. 87. Walther I., Pippia P., Meloni M.A., Turrini F., Mannu F., Cogoli A. (1998) Simulated microgravity inhibits the genetic expression of interleukin-2 and its receptor in mitogen-activated T lymphocytes. FEBS Lett 436, 115–118. 88. Wang E. (1999) Age-dependent atrophy and microgravity travel: what do they have in common? FASEB J 13(Supplement): S167–S174. 23