Автореферат - Институт цитологии и генетики СО РАН
advertisement
На правах рукописи ПАВЛОВА ГАЛИНА ВАЛЕРИЕВНА Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами 03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Научные консультанты: член- корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Корочкин Леонид Иванович академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев Георгий Павлович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Викторович доктор медицинских наук, профессор Попова Нина Константиновна доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна Ведущая организация: Учреждение Российской Институт молекулярной В.А.Энгельгардта РАН академии биологии наук им. Защита диссертации состоится «___»_________2009 года на утреннем заседании Диссертационного совета Д-003.011.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, Россия, пр.ак.Лаврентьева,10, тел/факс: (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « » Ученый секретарь Диссертационного совета, Доктор биологических наук ____ 2009 года Груздев А.Д. Актуальность темы Известно, что нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера и др., а также ишемический инсульт и ему подобные травматические нарушения мозговых тканей - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте. Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект. Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении. Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации. Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина. В глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга. Это может привести к его полному отмиранию уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю. Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глиомезодермальной капсулы (Корочкин, 2000). Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии. В разрабатываемых конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов. В состав этих конструкций не должны входить вирусные элементы. Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии. Этому и посвящена настоящая работа. Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является: поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемости трансплантата. Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях. 1 Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярногенетический анализ полученных линий. 2. Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы. 3. Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации. 4. Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца. 5. Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 в клетках млекопитающих в качестве управляющего элемента трансгенов. 6. Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярногенетический анализ полученных линий. 7. Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы. Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца. Положения, выносимые на защиту: 1. Нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку клеток млекопитающих нейрального происхождения при их совместном культивировании. 2. Смешанная ксенотрансплантация эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы стимулирует дифференцировку клеток крысы в нейральном направлении трансплантируемых клеток на границе трансплантат – мозг реципиента. 3. Ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат – ткани мозга реципиента. 4. Обнаружена позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях. 5. Обнаружено, что трансдуцированный промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 активизируется в клетках млекопитающих при температуре 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки. 6. Обнаружено, что трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижают образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс. 7. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у эмбриональных спинальных ганглиев и у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf . Научная новизна и практическая ценность работы Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные 2 практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны. Данная работа поможет перевести клиническое применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу. В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов. Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и трансплантаций полученного материала в мозг. 1. Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы. Экспрессия чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих. При этом данные клетки –носители не склонны к делению. В результате был разработан метод трансплантации смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового шока. 2. Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом 3. Предложен новый невирусный промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Возможность использования невирусных регулируемых структур позволяет включать активность чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения. 4. Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена. Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно. Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического белка. Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение. Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, а также открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии. Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток. Апробация работы Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004г, . ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005. 3 Публикации По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя 284 источника. Работа иллюстрирована 102 рисунками и 6 таблицами. Результаты исследований и их обсуждение 1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену человека. Ранее было показано, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы переживают и дифференцируются после трансплантации в мозг развивающихся амфибий (Корочкин,1991). В связи с этим возникла идея использования ксенотрансплантатов для продукции нейротрофических факторов, способствующих переживанию и развитию трансплантированной нервной ткани. Для исследования были использованы три нейротрофических гена gdnf, bdnf и ngf , физиологическое действие которых на нервную ткань основательно исследовано. Поскольку длительное инъецирование фактора в область повреждения чрезвычайно травматично для ткани мозга, работа была направлена на создание генно-инженерными методами клеток, способных экспрессировать нейротрофический фактор. Трансплантаты, содержащие такие клетки, пригодны для длительного экзогенного выделения фактора в области повреждения мозга. Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 может автоматически активироваться в условиях температуры тела млекопитающих, обеспечивая тем самым постоянно высокий уровень синтеза продукта, кодируемого геном, «поставленным» в генноинженерной конструкции под этим промотором. Надлежало выяснить, будут ли активироваться и функционировать нейротрофические гены млекопитающих в клетках и тканях дрозофилы. Для этого были получены три генно-инженерные конструкции на основе вектора CaSper (рис.1,2,3), содержащие соответственно один из исследуемых нейротрофических генов млекопитающих (gdnf, bdnf, ngf). В каждой конструкции нейротрофические гены были поставлены под промотор гена белка теплового шока дрозофилы, благодаря которому активируется транскрипция этих генов при температуре 370С (температура теплового шока насекомых). Данные конструкции были инъецированы в эмбрионы дрозофилы линии Df(1)w67c23(2), которая содержала ген white, обуславливающий фенотип «белые глаза» у взрослых мух. Конструкции же содержали ген mini-white, который позволяет идентифицировать трансформантов в поколении F1. 4 А Б В Рис 1 . А -Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген gdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. GDNF - ген фактора роста нервов; hsp70 prom. - промотор гена белка теплового шока Hsp70;. mini white - ген, ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух. Б - Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген ngf мыши под промотором гена белка теплового шока Hsp70. NGF - ген фактора роста нервов. В - Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген bdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. BDNF - ген фактора роста нервов. Из трансформантов поколения F1 были выведены гомозиготные линии. В результате мы получили три линии: C3- содержащая в гомозиготе ген человека gdnf, G8- содержащая ген ngf мыши и G7- содержащая ген bdnf человека. Каждая из этих линий была скрещена с ранее полученной линией, несущей ген бактериальной галактозидазы lacZ и мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной нейроэктодермы в нейральном направлении. Полученные линии C3-1M, G8-1M и G7-1M содержали lacZ и Delta, а также гены млекопитающих gdnf, ngf, bdnf соответственно. Полученные линии были проанализированы молекулярными методами. Методом блот-гибридизации по Саузерну были подтверждены вставки в геном дрозофилы. Контроль экспессии встроенных генов был осуществлен методом блот-гибридизации по Нозерну. В опыте была выявлена индуцированная экспрессия мРНК. Мы не наблюдали экспрессии мРНК нейротрофических факторов млекопитающих без воздействия стрессовой температуры (370 С). Известно, однако, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 “подтекает” и при более низких температурах и в ряде гибридизаций мы иногда наблюдали слабый сигнал. Аналогичный анализ на экспрессию мРНК был проделан и для конечных линий G7-1M,G8-1M и C3-1M. Перечисленные выше линии были исследованы на предмет активации гена при воздействии хит-шоковой температуры и без данного воздействия. Результаты блот-гибридизации по Нозерну для линий G7-1M,G8-1M и C3-1M показаны на рисунках 4, 5 и 6. 5 Рис 4. Молекулярный анализ трансгенных линий мух С3-1М, содержащих в геноме ген GDNF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 (C3) Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену gdnf 1– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока; 2– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока; 3– РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль); 1 2 3 4 Рис 5. Молекулярный анализ трансгенных линий мух G8-1М, содержащих в геноме ген NGF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену ngf 1– РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) без теплового шока (контроль); 2– РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль); 3– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока; 4– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока; Рис 6. Молекулярный анализ трансгенных линий мух G7-1М, содержащих в геноме ген BDNF под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70 Нозерн-блот гибридизация с зондами ДНК к гену bdnf 1– РНК, из эмбрионов мух линии Df (1) w67c23(2) после теплового шока (контроль); 2– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии после теплового шока; 3– РНК, из эмбрионов мух трансгенной линии без теплового шока; В данном эксперименте не было обнаружено гибридизации с РНК клеток контрольной линии (контролем служила исходная линия, а также трансгенная линия без тепловой обработки). В опыте мы наблюдали индуцированную эскпрессию мРНК при воздействии на эмбрионы шоковой температурой (370С). Для эмбрионов линии G8-1M, содержащей ген ngf, был проведен анализ синтез белка с помощью иммуноблотинга. На эмбрионы воздействовали температурой теплового шока. В результате иммуноблотинга был обнаружен соответствующий белковый продукт (рис. 7). Рис 7. Вестерн-блот анализ. Результаты прямого иммуноблотинга с антителами к белку NGF контроль - исходная линия, подвергнутая тепловому шоку NGF - трансгенная линия мух, содержащая в геноме ngf под контролем промотора гена белка теплового шока hsp70, подвергнутая нагреванию до 37оС Таким образом, гены исследуемых нейротрофических факторов млекопитающих успешно экспрессируются в клетках дрозофилы. Определение локализации экспрессии мРНК трансфицированных генов gdnf, bdnf и ngf в тканях объекта и ее активности под данным промотором было проведено методом гибридизации in situ на целых эмбрионах. После воздействия теплового шока на эмбрионы трансгенной линии С3-1М была обнаружена транскрипция человеческого gdnf на всех стадиях 6 эмбрионального развития данной линии, как у гетерозигот Dl/+, так и у гомозиготных Dl/Dl особей. На стадии синцитиальной и клеточной бластодермы реакция была умеренно положительной, равномерно распределенной по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная экспрессия гена gdnf была отмечена по парасегментам, в результате чего формировался характерный тигровый рисунок окраски. С развитием нейральных элементов областью преимущественной локализации мРНК гена gdnf явилась центральная нервная система эмбрионов. Соответствующие транскрипты были выявлены как в головном, так и в торакальных ганглиях (рис. 8). У исходной линии реакции гибридизации in situ обнаружено не было. а б Рис 8. Экспрессия гена gdnf в эмбрионах трансгенных мух D.melanogaster. Whole-mount – гибридизация с использованием в качестве зонда ДНК гена gdnf человека. а,б, Эмбрион линии трансгенных мух в разных положениях. Масштаб 0,1 мм После воздействия теплового шока на эмбрионы линии G8-1M была обнаружена мРНК введенного гена ngf на всех стадиях эмбрионального развития, а также у личинок. Как и в случае с геном gdnf, на стадии синцитиальной и клеточной бластодермы наблюдали умеренную реакцию, равномерно распределенную по всей поверхности эмбриона. По мере сегментации повышенная экспрессия генов наблюдалась в парасегментах, что давало характерный тигровый рисунок. С развитием нейральных элементов у эмбрионов линии G8-1M (ngf) была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия. При анализе экспрессии bdnf в линии G7-1M (метод гибридизации in situ на целых эмбрионах) окраска наблюдалась практически во всех областях эмбриона (рисунок не представлен). У исходной линии реакции гибридизации in situ с ДНК ngf и bdnf не наблюдалась. 2. Влияние экспрессии нейротрофического фактора млекопитающих на трансгенные клетки Создание линий-носителей нейротрофических факторов для ксенотрансплантации в мозг млекопитающих и кокультивации с эмбриональными клетками поставило следующие вопросы: 1. каким образом будет влиять нейротрофический фактор на сами трансгенные клетки, 2. будут ли клетки выживать в условиях пригодных для клеток млекопитающих при температуре теплового шока и продуцировать трансгенный белок. Для изучения влияния гена ngf человека на фенотип трансгенных клеток была получена культура клеток эмбриона линии G8-1M. В культуре клеток дрозофилы, трансфицированной геном ngf была обнаружена атипичность. Было замечено большое количество игловидных клеток, не встречавшихся в контрольных культурах не содержащих трансген. Наблюдались также сильно 7 распластанные клетки, по форме напоминающие листок полиэтилена, прилипший к поверхности культуральной чашки. В трансгенной культуре не обнаружены наблюдаемые в контрольной культуре сетеподобные образования, которые, по всей видимости, имеют отношение к выработке хитина. Данное отличие говорит о том, в культуре, экспрессирующей нейротрофический фактор млекопитающих, подавляется дифференцировка клеток в иных направлениях, кроме нейрального. Особенности данной культуры, по-видимому, объясняются тем, что даже без теплового воздействия на клетки наблюдается подтекание промотора гена белка теплового шока дрозофилы, вследствие чего наблюдается слабое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные клетки. Значительно более ощутимое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные культуральные клетки наблюдали после повышения температуры до уровня теплового шока 370С. Наблюдалось большое количество клеток с длинными отростками (более 50%), похожими на отростки нервных клеток насекомых (рис.9). Рис 9. Культура клеток дрозофилы, несущих ген ngf, после температурного воздействия 370С Рис 10. Органоподобные структуры в культуре клеток дрозофилы, несущих ген ngf, после температурного воздействия 370С Клетки в модифицированной культуре теряли способность делиться. После обработки температурой теплового шока контрольной культуры клеток дрозофилы появление такого типа клеток не наблюдалось (или около 5%). Также в исследуемой культуре трансгенных клеток были обнаружены характерные округлые клеточные скопления. Тела клеток располагались по краям, в то время как отростки занимали внутреннюю часть скопления. Такая структура напоминает строение нервного ганглия беспозвоночных, Таким образом, температурное воздействие, активирующее ген ngf, не только стимулирует дифференцировку клеток дрозофилы в нейральном направлении, но и провоцирует образование органотипических структур, сходных с эмбриональным головным мозгом дрозофилы (рис 10). При длительном (6 дней) культивировании клеток трансгенной линии дрозофилы при температуре 37оС были обнаружены нервные клетки аномальной величины (5%), в контроле такого размера нервные клетки не наблюдались. Было установлено, что экспрессия нейротрофического фактора влияет на природу трансгенной клетки и стимулирует ее дифференцировку в нейральном направлении. 3. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации. Фактор роста нервов является фактором, выделяемым из клеток в межклеточную среду, поэтому клетки, экспрессирующие этот фактор могут 8 оказывать нейротрофное воздействие на окружающие клетки в культуре и, после трансплантации, на клетки тканей реципиента. В экспериментах, проведенных совместно с Кафедрой отоларингологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) была исследована способность клеток дрозофилы, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять клетки органотипической культуры нервной ткани млекопитающих in vitro. С этой целью фрагменты нейроэктодермы эмбрионов селектированных нами линий дрозофил, содержащих трансгены нейротрофических факторов, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями крыс (11-й день эмбриогенеза), которые были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток, выходящие из спинального ганглия, появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру нейроэктодермы эмбриона трансгенной линии дрозофилы, содержащей ген человека, наблюдается бурный рост отростков нервных клеток спинального ганглия по направлению к ко-культивируемой ткани дрозофилы (рис.11). Этот процесс начинается уже спустя час после начала кокультивирования. Рис.11 Врастание отростков дифференцирующихся нервных клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы в эмбриональную нейроэктодерму линии дрозофил, в геном которой был введен ген gdnf человека. Флюоресцентная микроскопия. Масштаб 0,05 мм Еще более четкая картина была получена при ко-культивировании клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы с клетками линии дрозофилы, содержащей трансген, кодирующий белок BDNF человека. Эффект сказывался так же быстро, как и в предыдущем случае, но можно было отчетливее проследить путь нервных волокон от клеток эмбриональных спинальных ганглиев к нейроэктодерме или к фрагменту трансгенного эмбриона дрозофилы. Несколько менее отчетлив эффект клеток дрозофилы линии, несущей ген, кодирующий фактор роста нервов (NGF). В этом случае дифференцировка эмбриональных нейральных элементов спинального ганглия крысы начинается под влиянием нейроэктодермы дрозофилы так же рано, однако рост отростков нервных клеток не столь интенсивен, как в случае BDNF Поскольку положительный эффект наблюдался во всех случаях, можно было предположить, что он обусловлен неспецифическим эффектом ткани дрозофилы и не связан с явлением трансгеноза. Однако в контрольных экспериментах, когда ткань эмбриональных спинальных ганглиев (меченных красным белком) крысы кокультивировали с нейроэктодермой «нативных» линий дрозофилы без трансгена, эффекта не наблюдалось. Различия в эффекте клеток, несущих BDNF и NGF, возможно, связаны с тем, что первый стимулирует дифференцировку в первую очередь проприоцептивных нейронов, а второй - ноцицептивных. 9 Нельзя не отметить и то обстоятельство, что опыты по ко-культивированию продемонстрировали выраженное родство нервных тканей даже у столь отдаленных таксонов как насекомые и млекопитающие. Нейробласты дрозофилы мигрировали в эмбриональный спинальный ганглий крысы. На основании изложенных результатов можно сделать вывод, что экспрессия нейротрофического фактора млекопитающих не только влияет на дифференцировку трансгенных клеток дрозофилы, но и меняет свойства других клеток, находящихся в непосредственной близости от них. Известно, что при культивации эмбрионального спинального ганглия крысы, отростки появляются на третьи сутки и имеют звездчатую структуру. При добавлении в среду нейротрофических факторов, отростки образуются значительно быстрее, но также не имеют направленности. В данной работе была опробована новая модель стимуляции образования отростков эмбрионального спинального ганглия в определенном направлении по градиенту концентрации. Данная модель может быть использована для разработки терапевтических методов, стимулирующих направленный рост нервных волокон. В нашей лаборатории был проведен эксперимент, с целью изучить изменение в стимуляции при увеличении расстояния между спинальным ганглием и тканью дрозофилы, экспрессирующей нейротрофический фактор. Было обнаружено, что при увеличении расстояния между исследуемыми объектами уменьшается количество образующихся отростков, однако, стимуляция происходит даже на значительном расстоянии, что видно на рисунке 12. Риc.12 Ко-культивация спинального ганглия новорожденной крысы и нервной ткани эмбриона дрозофилы, экспрессирующей bdnf. Масштаб 50 микрометров 4. Влияние нейроэктодермы трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки при ксенотрансплантации. Возможность выделения трансгенных нейротрофических факторов из трансфицированных клеток в окружающую среду делает логичным эксперименты по выявлению влияния клеток трансгенных линий дрозофилы на окружающие клетки в условиях трансплантации в мозг млекопитающих. Для этой цели мы использовали трансгенные линии дрозофилы, в геном которых введен ген человека, кодирующий глия-производный нейротрофический фактор (GDNF). GDNF, член суперсемейства TGF-beta, известен своим трофическим влиянием на развивающиеся дофаминэргические нейроны. В то же время, GDNF оказывает трофическое влияние и на другие популяции нейронов мозга. Целью экспериментов было исследование приживления и развития ксенотрансплантатов нейральных закладок дрозофилы линии С3-1М(gdnf) при их котрансплантации с тканью неокортекса крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс и влияния клеток дрозофилы, экспрессирующих глияпроизводный 10 трофический фактор (GDNF), на приживление и рост контрансплантируемого аллотарнсплантанта. Было исследовано влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии С3-1М(gdnf) на аллотрансплантат мозга крыс при совместной трансплантации. Для этого было выделено две группы крыс. В затылочную кору мозга первой (контрольной) группы крыс трансплантировали неокортекс 15-ти дневных крысиных эмбрионов (Э-15). Животным второй группы в затылочную кору мозга вводили котрансплантат неокортикальной ткани Э-15 с нейральной закладкой дрозофилы С3-1М(gdnf). В качестве маркерного гена в клетках линии С3-1М(gdnf) содержался ген lacZ. Животных первой и второй групп фиксировали через 33 дня после операции. Во всех случаях в мозге крыс первой и второй группы были обнаружены трансплантированные ткани. Трансплантированные клетки дрозофилы во второй группе были легко идентифицируемы. Иммуногистохимическая реакция на lacZ, проведенная на срезах мозга, подтвердила наличие вставки. Методом гибридизации in situ на срезах было установлено, что белок GDNF синтезируется в эмбриональных, нервных клетках дрозофилы при их совместной трансплантации с неокортексом крысиных эмбрионов в мозг взрослых крыс. Нервные клетки дрозофилы при трансплантации в мозг не погибают, и образуют отростки. У первой (контрольной) группы животных трансплантаты были небольших размеров и имели нормальную плотность васкуляризации. Ткань трансплантатов состояла из компартментов нервных клеток, которые объединялись глиальными образованиями. Во второй (опытной) группе крыс ткань котрансплантатов была пронизана множеством сосудов, плотность которых была много выше (более, чем в 2 раза), чем в контроле. Выраженной иммунной реакции не наблюдалось. Котрансплантаты состояли из крупных участков, содержащих нейроны эмбрионального крысиного мозга, связанных глиальными мостами, среди которых располагались группы клеток нейральных закладок дрозофилы. Большинство клеток дрозофилы (5-6 мкм в диаметре), красящихся на lacZ, были вполне жизнеспособны, хотя часть проявляла признаки дегенерации. Клетки дрозофилы никогда не отделялись от остальных тканей глиальным барьером, а напротив, часто наблюдалось множественное образование отростков между нейронами эмбрионального крысиного мозга и клетками дрозофилы Иммуногистохимическое исследование срезов мозга крыс контрольной группы показало наличие четко выраженного глиального рубца на границе ксенотрансплантата. При исследовании второй – опытной - группы крыс было обнаружено отсутствие глиального рубца на границе ткани реципиента с трансплантатом (рис 13). Наличие клеток дрозофилы в ксенотрансплантате было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер lacZ, а экспрессия gdnf человека - гибридизацией in situ. Рис 13. Влияние ксенотрансплантата трансгенной (gdnf) эмбриональной нервной ткани дрозофилы на развитие гомотрансплантата в мозге взрослой крысы. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих. Морфологическое изучение показало, что в случаях котрансплантации наблюдается усиление роста трансплантированных 11 аллогенных неокортикальных тканей. Можно предполагать, что хорошее приживление и нормальный размер трансплантата может быть отражением нейропротективной функции GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть клеток, которые погибли бы в результате некроза или путем апоптоза. Котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающих трансплантат тканей. Вероято, GDNF может, способствовать усиленному росту сосудов. Наше исследование показало также, что ткани нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, видны тесные сплетения нервных отростков клеток дрозофилы и клеток крысы, свидетельствующие об отсутствии межвидового антагонизма. По морфологическим критериям, значительная часть клеток нейральных закладок дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение двух недель, с последующим уменьшением их количества в котрансплантате. Часть аллогенных клеток котрансплантата экспрессируют тирозингидроксилазу при всех исследованных сроках переживания экспериментальных животных - до 1 месяца. Известно, что в эмбриональной коре кошек (Sawada, 2000) и в коре эмбрионов и ранних постнатальных крыс (Chun, 1987) имеется популяция временно существующих дофаминэргических (DA) нейронов, которые отсутствуют у взрослых животных. При этом неизвестно, какие факторы влияют на специфику развития данной популяции кортикальных нейронов. Результаты настоящего исследования позволяют высказать предположение, что одним из факторов, ответственных за судьбу транзиторных DA в неокортексе может быть GDNF. В пользу этого свидетельствовало наличие большого числа DA нейронов в контрольных трансплантатах неокортекса и их отсутствие в котрансплантатах. Вероятно, GDNF в котрансплантатах оказывает регулирующее действие на ход дифференцировки этой популяции нейронов, ускоряя прохождение транзиторной фазы или вообще «снимая» ее. Во взрослой коре этот фактор не экспрессируется (Berger, 1985; Trupp, 1997), и поэтому DA нейроны длительно сохранялись в неокортикальных аллотрансплантатах у животных контрольной группы. Полученный нами препарат трансгенных клеток дрозофилы оказался обладающим выгодной комбинацией влияния нейротрофического фактора млекопитающих и факторов эмбриональных, нервных тканей дрозофилы на приживляемость трансплантатов. Эта комбинация препятствует образованию глиального рубца и улучшает приживляемость трансплантата. Именно блокада образования глиального рубца вокруг трансплантата, по всей вероятности, играет решающую роль в обеспечении лучшей его приживляемости. Очевидно, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, продуцирующие GDNF человека, блокируют пролиферацию глии и образование глиального рубца. Это влияет, в свою очередь, на приживаемость трансплантата. В отсутствие клеток дрозофилы, экспрессирующих GDNF, трансплантат окружается плотным глиальным рубцом, что создает условия, несовместимые с его выживанием. Выделяемый нейротрофический фактор положительно влияют на приживаемость котрансплантата, стимулируя образование связей между клетками. Количество эмбриональных, нервных клеток дрозофилы в трансплантате постепенно снижается с течением времени. Через один месяц после трансплантации обнаруживаются лишь единичные клетки дрозофилы в районе 12 введения. Вероятно, это связано с тем, что клетки дрозофилы не могут долго существовать при повышенной температуре (37оС). Непродолжительность переживания клеток дрозофилы после трансплантации их в ткани млекопитающих может иметь положительное значение для применения этих клеток в качестве носителя терапевтического фактора, так как при этом ограничивается длительность воздействия препарата и снижается вероятность неоплазии. 5. Влияние белка теплового шока Hsp70 дрозофилы на образование рубца при трансплантациях. Как изложено выше, эмбриональные, нервные клетки дрозофилы экспрессирующие нейротрофический фактор. При добавлении к аллотрансплантату эти клетки, блокируют образование рубцовой ткани на границе трансплантат ткань хозяина. Мы предположили, что в блокировании глиального рубца участвует не только трансгенный фактор, но белки, вырабатываемые непосредственно клетками дрозофилы. Поскольку при температуре тела млекопитающих клетки дрозофилы активно синтезируют белки теплового шока, имеющие важное адаптивное значение, мы предположили, что именно с этими белками связано торможение пролиферации глии и формирования рубцовой ткани. Для подтверждения данного предположения были проведены две серии экспериментов. В первой серии в затылочную область мозга взрослых крыс трансплантировали эмбриональные, нервные клетки Drosophila melanogaster трансгенной линии Oregon, меченой геном бактериальной галактозидазы lacZ. Во второй серии опытов для ксенотрансплантации использовали аналогичный материал, но от мутантной линии ts403, утратившей способность к синтезу главного белка теплового шока Hsp70. Через неделю мозг фиксировали в 4% формальдегиде. Срезы окрашивали на бактериальную галактизидазу (Х-гал) для идентификации клеток дрозофилы, иммуногистохимически на кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP) для выявления глиальных клеток и рубцовой ткани и на индуцируемый главный белок теплового шока для обнаружения соответствующего продукта - Hsp70. Ксенотрансплантаты были идентифицированы в обеих сериях по Х-гал реакции. и с помощью обычной гистологической окраски. Клетки ксенотрансплантата линии Oregon активно синтезируют белок теплового шока Hsp70, о чем свидетельствует интенсивная иммуногистохимическая реакция на данный белок Также наблюдалась экстраклеточная позитивная реакция на белок теплового шока дрозофилы, демонстрирующая его секрецию клетками дрозофилы в окружающие ткани. В этой серии опытов глиальный рубец вокруг ксенотрансплантата был значительно меньше, чем во второй серии экспериментов с мутантной линией ts403 иммуногистохимическая реакция ксенотрансплантата на Hsp70 белок была отрицательной. В то же время на границе ксенотрансплантат - ткань хозяина формировался четко выраженный глиальный рубец (рис. 14а, б). Рис. 14. Результаты гистологического исследования. а. Глиальный рубец не формируется на границе ксенотрансплантат клеток линии Oregon - ткань хозяина. Окраска на кислый 13 глиальный фибриллярный белок (GFAP). б. Формирование глиального рубца на границе ксенотрансплантат клеток мутанта ts403 дрозофилы-ткань хозяина. Окраска на GFAP. в. Клетки мутанта ts403 в ксенотрансплантате (стрелка). Окраска крезилвиолетом. Масштаб 10 микрометров Полученные результаты указывают на возможную роль белка теплового шока Hsp70 в снижении образования глиального рубца вокруг ксенотрансплантата. По всей вероятности этот процесс играет значимую роль в обеспечении лучшей приживаемости аллотрансплантата в том случае, если он пересаживается в комбинации с ксенотрансплантатом эмбриональных, нервных клеток дрозофилы. Известно, что белок Hsp70 способен вызывать деградацию и выведение из клетки измененных белков, а также “активировать” митохондрии и препятствовать апоптозу. В связи с этим его благоприятный эффект, выявленный в наших экспериментах, не является случайным. Таким образом, экспрессия белка Hsp70 в трансплантируемых клетках ведет к уменьшению посттравматического глиофибриллярного рубца. 6. Использование промоторно-регуляторной (п/р) области гена белка теплового шока дрозофилы (Hsp70), в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих. Широкое распространение при лечении различных заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток, которые обладают большим потенциалом к развитию в различных направлениях. Существенное значение при этом имеет разработка способов повышения их жизнеспособности и управления путями их специализации при операциях трансплантации. Для этого необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в направлении, нужном для успешного лечения. Нами предлагаются регуляторные элементы генома дрозофилы, которые имеют определенные преимущества перед ретровирусными элементами в силу большей безопасности для терапевтического применения. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, требующих использования метода трансплантации тканей. Результаты опытов, показали, что нейрогены, введенные в геном дрозофилы, будучи соединенными с п/р областью гена hsp70 дрозофилы активируются под влиянием теплового шока. Они автоматически активируются также в ксенотрансплантатах эмбриональной, нервной ткани дрозофилы в мозгу взрослой крысы. Этот факт говорит о возможности использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для трансформации нужным генетическим материалом клеток млекопитающих и человека, подлежащих трансплантации пациентам. Температура тела человека должна быть опознана промотором дрозофилы как хитшоковая и соответственно может обусловить активацию соединенного с ним гена. Для исследования функционирования этой п/р области в качестве управляющего элемента трансгенеза в клетках млекопитающих были созданы две конструкции. Одна, из них, содержала ген флюоресцентного белка Cyan находящийся под промотором CMV, другая содержала аналогичный ген под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы. Обе конструкции были приготовлены на основе вектора pcDNA 3,1+ . 14 В работе использовали эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши линии R1, полученные от доктора Наги (A.Nagy, Mount Sinai Hospital, Toronto, Canada). Эти клетки были выделены из бластоцист мышей линии (129/Sv~o 129/SvJ) F1, имеющих окраску агути. Трансфекцию ЭС клеток R1 осуществляли с помощью электропорации. Клетки R1, трансфицированные плазмидой pSV2neo, служили контролем. В результате получили две культуры одна из которых, должна была содержать Cyan-ген под промотором гена цитомегаловируса человека (PCMV), другая – аналогичный ген под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. С помощью Нозерн блот-гибридизационного анализа было показано, что в клетках первой культуры синтезируется мРНК для цветного белка и, следовательно, соответствующий трансген активируется. При исследовании трансформированных культур ЭСК на флюоресцентном микроскопе было обнаружено, что клетки, которые трансформированы геном CFP под промотором CMV, светятся голубым светом, что свидетельствует о синтезе белка в этих клетках (рис. 15б). Клетки, трансфицированные геном CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы в обычных условиях не светятся. Однако после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 42 оС в течение 30 минут трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение. В обычной ситуации, при температуре теплового шока фактор транскрипции теплового шока (Hsf) высвобождается из комплекса Hsf/Hsp90 млекопитающих или комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, образует тример и транспортируется в таком виде в ядро, где взаимодействует с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активирует промотор. В отсутствие предварительного нагревания клетки мыши, содержащие трансген CFP под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы, не могут синтезировать CFP, поскольку комплекс Hsf/Hsp90 мышей, в отличие от комплекса Hsf/Hsp83 дрозофилы, не реагирует на нормальную температуру тела млекопитающих. Воздействие температуры 42оС разрушает комплекс Hsf/Hsp90, и Hsf транспортируется в ядро. Полученные данные свидетельствует о том, что Hsf млекопитающих способен взаимодействовать с п/р областью гена hsp70 дрозофилы и активировать стоящий под ним трансген, но это происходит только после нагревания клеток до температуры теплового шока млекопитающих. Для решения задачи, поставленной в начале этой работы (т.е. включение промотора при температуре 37оС) нами была сделана конструкция, содержащая аналог гена hsp90 млекопитающих ген hsp83, необходимый для активации промотора hsp70 дрозофилы при температуре 37оС. Данная конструкция методом электропорации была введена в культуру, содержащую ранее введенный ген CFP под промотором hsp70 дрозофилы. В результате была получена культура, несущая ген белка теплового шока Hsp83 дрозофилы под CMV-промотором, и ген CFP под котролем п/р области гена hsp70 дрозофилы. Мы наблюдали активное свечение данной культуры при нормальной температуре культивации клеток млекопитающих, т.е. был достигнут тот эффект, которого мы добивались. 15 Рис 15. Флуоресценция эмбриональных стволовых клеток мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ), инъецированных полученными конструкциями. а-культура клеток под световым микроскопом, b-флюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором CMV, cфлюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70; инкубация при 370С, dфлюоресценция клеток, трансфицированных конструкцией, несущей ген CFP под промотором hsp70 инкубация при 420 С. Следовательно, регуляторная система дрозофилы, распознающая температуру теплового шока способна функционировать в клетках млекопитающих. Разработанная методика может быть использована для трансфекции стволовых и прогениторных клеток млекопитающих и человека генами нейротрофических факторов и другими генами, полезными для использования в клеточной терапии. Таким образом, была показана возможность создания системы, реагирующей на температуру тела млекопитающих включением нужных трансгенов, полезных при лечении некоторых заболеваний а значит и использования п/р области гена hsp70 дрозофилы для регуляции экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих. 7. Использование полученного вектора LP1, содержащего п/р область гена hsp70 дрозофилы и маркерный ген gfp, в культурах клеток и в целых организмах На основании данных результатов был получен вектор LP1 для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем нового регулируемого промотора и несущий ген флуоресцентного белка на N-конце для контроля вставки. Данный вектор обладает рядом преимуществ. Во-первых, он содержит промотор невирусной природы, что крайне выгодно при его возможном использовании в терапии. Во-вторых, экспрессию гена, находящегося под контролем данной последовательности, можно регулировать: Данный вектор методом липофекции был введен в линию клеток эмбриональной почки человека НЕК 293. Для исследования функционирования введенной конструкции трансфицированные клетки были обработаны температурой теплового шока 42°С. В клетках человека мы наблюдали экспрессию маркерного гена не через 2-3 часа, как наблюдается у насекомых, а через 24 часа . Свечение было активным и наблюдалось в течение двух суток. При дальнейшем изучении было обнаружено, что активация промотора начинается и при менее травматичной температуре - 39оС. Через сутки было проведено повторное воздействие на культуру высокой температурой. Через 24 часа мы вновь наблюдали свечение. Таким образом, был получен новый вектор для введения чужеродных генов в клетки млекопитающих под контролем регулируемого промотора. Данный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным. 16 Это свойство полученной конструкции представляет большой интерес для возможного применения в генно-клеточной терапии. Задержка экспрессии терапевтического трансгена дает время для предварительно прогретых клеток адаптироваться к условиям ткани реципиента и более эффективно наработать трансгенный белок. Нами были предприняты попытки введения полученной конструкции в клетки первичных культур клеток человека и животных различного происхождения. В экспериментах использовались различные методы введения конструкции в клетки, такие как липофекция, электропорация или инъекция в ооциты рыб, однако нелинейные клетки плохо принимают любые конструкции, медленно делятся и быстро уходят в дифференцировку. Мы попробовали, что произойдет, если ввести конструкцию в смеси с реактивом для липофекции непосредственно в неостриатум мозга взрослой мыши. Риc.16 Введение вектора LP1 непосредственно в мозг мыши. Масштаб 30 микрометров. В результате мы наблюдали внедрение конструкции с GFP в клетки мозга, локализованные в герминативной области – субвентрикулярной зоне боковых желудочков (рис16). Незначительное количество светящихся клеток, объясняется тем, что в мозгу взрослой мыши деление клеток происходит крайне редко. По всей видимости, конструкция встраивалась только при делении клеток. Таким образом, был обнаружен еще один способ введения конструкций в стромальные клетки, при этом маркироваться будут только те клетки, которые делились в момент инъекции конструкции в мозг. Данный метод имеет еще один положительный момент: Встраивание чужеродного гена происходит в собственные клетки реципиента, имеющие лучшие перспективы длительного переживания и интеграции в мозге, чем трансплантированные экзогенные клетки при алло- или ксено-трансплантации. 8. Получение конструкции для экспрессии ngf в клетках млекопитающих Необходимо попытаться заменить клетки дрозофилы на клетки более близкие человеку, а также проверить, как будет влиять гиперэкспрессия нейротрофического фактора на окружающие клетки при ко-культивации и позволят ли трансгенные клетки млекопитающих столь интенсивную экспрессию введенного гена. Для анализа влияния гиперэкспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации был использован ген ngf (фактор роста нервов) млекопитающих. Для этих целей нами была получена генно-инженерная конструкция LP19 на основе вектора EGFP-N1, в которой ген фактора роста нервов ngf стоит в одной рамке считывания с геном зеленого флуоресцентного белка gfp под цитомегаловирусным промотором человека (CMV). Контроль наличия вставки был осуществлен методом блот-гибридизации по Саузерну. Секвинирование участка полилинкера показало наличие последовательности гена фактора роста нервов млекопитающих. Для анализа активации гена ngf в клетках данная конструкция была трансфицирована в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ) методом электропорации. А также конструкция LP19 была 17 трансфицирована в клетки линии НЕК293 (линия эмбриональных клеток почки человека), методом липофекции. (Рис. 17) Наличие экспрессии ngf в линии ES и в НЕК293 проверяли с помощью метода блот-гибридизации по Нозерну (Рис. 18). Рис. 17 Конструкция LP19 в линии HEK 293. Свечение зеленого флуоресцентного белка в культуре клеток с LP19 (NGF-GFP). 1 2 3 4 5 Рис. 18 Блот-гибридизация по Нозерну конструкции LP19 в Hek 293 и ES (гибридизация на фрагмент NGF) 1- РНК из клеток линии ES, трансфицированных LP19 2- РНК из клеток линии ES, трансфицированных EGFP-N1 3- РНК из клеток линии ES 4- РНК из клеток линии HЕК293 5- РНК из клеток линии HЕК293, трансфицированных LP19 Результат нозерн-блот гибридизации для линий ES и HЕК293 оказался различным. У контрольных эмбриональных стволовых клеток мыши была обнаружена экспрессия собственного ngf. В то же время экспрессия этого фактора в трансгенной линии была гораздо более ярко выражена. Нозерн-блот гибридизация показала наличие в этих клетках двух мРНК различной подвижности. Одна из них соответствовала собственно хозяйской, тогда как другая была значительно тяжелее. Данный результат объясняется тем, что трансфицированные клетки кроме РНК нормального фактора содержат РНК химерного белка, в состав которого кроме фактора входит «зеленый хвост», который утяжеляет молекулу. Таким образом, трансгенные клетки содержат помимо собственного NGF также химерный белок NGF. Клетки линии НЕК293 не содержат собственного белка, тогда как трансгенная линия обладала белком ожидаемой подвижности. В результате для дальнейшего исследования была использована трансгенная линия НЕК293. Наличие имуноцитохимической окраска клеток полученной линии антителами к NGF свидетельствует о наличии белка NGF в трансфицированных клетках. (Рис. 19) Таким образом, была получена линия Нек293, продуцирующая трансгенный белок NGF. Рис. 19 Имуноцитохимическая окраска линии Hek 293/ LP3T.Окраска на антитела NGF , ядра клеток покрашены бисбензимидом 9. Изучение влияния гиперэкспрессии ngf при ко-культивации. В дальнейших экспериментах было исследовано влияние выделяемого трансфицированными клетками нейротрофического фактора на другие клетки, находящиеся в соседстве с трансгенными. 18 Рис.20 Ко-культивация спинального ганглия крысы с трансгенной линией НЕК293, экспрессирующей ngf. Масштаб 100 микрометров. В этих экспериментах была исследована способность клеток линии НЕК293, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять на нервные клетки млекопитающих тканеспецифической культуры млекопитающих. С этой целью колонии селектированной нами трансгенной по ngf линии НЕК293, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями плода человека (11-я неделя эмбриогенеза). Трансгенные колонии НЕК293 были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру колоний клеток трансгенной линии, содержащей ген ngf мыши, наблюдается бурная реакция клеток спинального ганглия, выражающаяся в интенсивном росте отростков нервных клеток по направлению к колонии трансгенной линии (рис.20). Было обнаружено, что нейротрофичесий фактор, высвобождаясь в среду, стимулирует образование отростков ко-культивируемых нервных клеток. Таким образом, была получена еще одна модель стимуляции образования отростков эмбриональных, нервных клеток в определенном направлении. Она также представляет интерес в связи с частой необходимостью выращивания нервных отростков в заданном направлении. Не являясь чужеродными для тканей человека, клетки линии НЕК293 не исчезают со временем, поэтому данный метод целесообразно использовать, для постоянной экспресии терапевтического фактора. Таким образом, оба протокола имеют право на существование при различных целях. При нейродегенеративных заболеваниях может появиться необходимость, как в том, так и в другом подходе. В одних случаях нужно кратковременно стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, в других - восстановить продукцию недостающего белка. 10. Получение конструкции для экспрессии gdnf в клетках млекопитающих В изложенных выше экспериментах было показано позитивное влияние эмбриональных, нервных клеток дрозофилы, продуцирующих GDNF человека, на процессы посттравматического заживления в мозге млекопитающих. В дальнейших экспериментах мы исследовали влияние трансдукции гена этого фактора в линейные клетки человека на трансфицированные клетки и их окружение при кокультивации. Для данной работы была получена конструкция Lр14. Генно-инженерная конструкция для введения человеческого гена gdnf была синтезирована на основе вектора pEGFP-N1, содержащего CMV промотор и маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый) на N конце. В этот вектор был встроен человеческий ген gdnf. В результате была получена конструкция размером в 5,3 kb несущая гены gdnf и gfp под общим CMV промотором. Клетки НЕК293 были трансфицированы плазмидой Lр14, содержащей химерный ген gdnf/gfp и ген устойчивости к неомицину (neo). Для получения стабильно трансфицированных клеток проводили селекцию на среде содержащей 19 неомицин (500 мкг/мл). Наблюдалось активное флуоресцентное свечение зеленого белка в культурах. Анализ полученных культур проводили методом Саузерн-блот анализа. Для дальнейшей работы были отобраны клоны, полученные путем независимой трансформации, содержащие химерный ген gdnf/gfp по данным Саузерн-блот анализа и по активности свечения. Для проверки нормальной транскрипции РНК был проведен Нозерн-блот анализ. Анализ показал, что ген gdnf нормально работает в отобранных клонах, полученных после трансфекции плазмидой несущей gdnf и отобранных на G418.(рис. 21) К 3 4 5 Рис. 21 Нозерн-блот гибридизация с РНК из клеток линии эмбриональных почечных клеток человека (НЕК293), несущих химерный ген gdnf/gfp. К- контроль (исходные клетки). 3-5-выбранные варианты культур, содержащих конструкцию LP 14. Наличие нужной вставки в плазмиде LP14 было также подтверждено с помощью секвинирования. При сравнении полученной последовательности с последовательностями, имеющимися в базе GeneBank, было установлено, что вставка соответствует гену gdnf. Синтез химерного белка GDNF-EGFP клетками, трансфицированными Lр14, был подтвержден при помощи Вестерн-блот гибридизации (рис.22). MW, кДа Рис.22 Вестерн-блот гибридизация. 1 – лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных pEGFP-N1, 2 – лизат клеток линии НЕК293, трансфицированных Lр14. Цифрами отмечены молекулярные массы белков, входящих в состав маркера. Полоса, присутствующая на дорожке 1 рис.3.6, соответствует молекулярной массе 34,5 кДа, а полосы, представленные на дорожке 2 – молекулярным массам 34,5 и 58,4 кДа. Можно сделать вывод, что в клетках линии НЕК293 экспрессируется собственный GDNF, имеющий молекулярную массу 34,5 кДа, что согласуется с литературными данными (Lin, 1993). Однако крайне незначительное количество собственного белка можно приравнять к следовому. Полоса с массой 58,4 кДа соответствует химерному белку GDNF-EGFP, который экспрессируется с введенной конструкции Lр14. Также можно заключить, что концентрация химерного белка GDNF/GFP превышает концентрацию GDNF. 11. Исследование влияния гиперпродукции белка GDNF на трансгенные клетки Для изучения влияния гиперэкспрессии gdnf на клетки конструкция, содержащая химерный ген gdnf/gfp, была введена методом липофекции в культуру фетальных, нервных клеток мозга человека (культура любезно предоставлена исследовательской фирмой ИРИКТ). Наблюдалось активное образование отростков у нервных клеток, что говорит о стимуляции дифференцировки трансгенным белком GDNF в культуре (рис 23). Клетки, получившие химерный ген gdnf/gfp, 20 дифференцировались в нейральном направлении, при этом клетки теряли способность к делению. Рис.23 Фетальные нервные клетки мозга человека, содержащие химерный белок GDNF/GFP.Масштаб 50 микрометров Культура была проанализирована на нейрональные маркеры, маркеры стволовых нейральных клеток. Также была проведена окраска на белок GDNF и глиальный фибриллярный кислый белок . Было обнаружено, что GDNF влияет на дифференцировку трансгенных клеток в нейральном направлении. Данный результат выглядит достаточно привлекательным, если использовать регулируемый промотор при введении нейротрофического фактора. При трансплантации появится возможность активировать нейротрофический фактор непосредственно уже в мозгу и стимулировать дифференцировку клеток трансплантата, а возможно и клеток реципиента в нейральном направлении. Конструкция, содержащая gdnf, была введена в эмбриональные стволовые клетки мыши линии (129/Sv~o 129/SvJ). Для этого клетки трансфицировали Lр14 (опыт) и pЕGFP-N1 (контроль). Экспрессию EGFP и химерного белка GDNF-GFP детектировали через 48-72 часа по зеленому свечению клеток. При культивации в присутствии G418 (200 мкг/мл) были получены стабильно трансфицированные клетки. Для подтверждения экспрессии введенного гена gdnf клетками линии R1 использовали метод Нозерн – блот гибридизации. Получали эмбриоидные тела, при культивировании которых в отсутствии фидера и LIF наблюдали дифференцировку клеток. При окрашивании клеток на βIII-тубулин была заметна разница в окрашивании контрольных и опытных препаратов. И в контроле и в опыте наблюдали дифференцирующиеся клетки нейрального типа. Однако в контроле такие клетки единичны. В опытных клетках с введенным химерным геном gdnf/gfp, напротив, наблюдалось преобладание дифференцирующихся клеток с многочисленными короткими отростками и одним длинным отростком, повидимому, аксоном. Таким образом, в этих экспериментах отчетливо проявляется стимулирующее влияние трансгена на дифференцировку стволовых и прогениторных клеток мозга плода человека. Однако, данные типы клеточных культур не подходили для изучения влияния трансгенного GDNF на образования нервных отростков in vivo и in vitro, в связи с наличием собственного GDNF. Для дальнейших исследований были использованы клетки линии НЕК293, не показавшие значительного синтеза собственного белка. 12. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf при ко-культивации Рис. 24 Ко-культивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей gdnf. Масштаб50 микрометров 21 Были проведены эксперименты по проверке способности клеток трансгенной линии НЕК293, экспрессирующей нейротрофический фактор, стимулировать образование нейральных отростков в уже дифференцированной и предварительно поврежденной нервной структуре. Клетки трансгенной линии, продуцирующей нейротрофический фактор ко-культивировали с фрагментом зачатка спинного мозга эмбриона человека. В контрольных культурах нейральные отростки не появлялись. При добавлении в культуру клеток, экспрессирующих gdnf человека, наблюдается активное образование нервных отростков прорастающих по направлению к клеткам трансгенной линии (рис. 24). Этот процесс начинается уже в течение первых суток ко-культивирования. Таким образом, было обнаружено, что экспрессия нейротрофического фактора gdnf не только способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток, но и стимулирует образование нервных отростков у уже сформировавшихся, но травмированных нервных образований. Данный результат перспективен для клинического примененеия 13. Изучение влияния гиперэкспрессии gdnf на образование глиальной ткани при трансплантациях Для экспериментов на животных также была использована конструкция Lр14, содержащая ген химерного белка GDNF/GFP, экспрессия которого была подтверждена иммуногистохимически. Клетки трансплантировали взрослым (2 мес.) мышам линии СВА. В мозг животных подопытных групп вводили клетки, продуцирующие химерный белок GDNF/GFP, а животным контрольных групп – клетки, содержащие белок GFP. Анализ проводили через 6, 14 и 18 дней. Срезы окрашивали иммуногистохимически на маркеры рубцовой ткани GFAP, актин, фибронектин, коллаген типа IV. Наиболее ощутимые результаты наблюдались через 18 дней после трансплантации клеток. Во всех случаях на срезах переднего мозга были найдены клетки, содержащие GFP. Клетки располагались плотной группой в средней части полосатого тела.. Сколько-нибудь значительной миграции трансплантированных клеток из места введения не наблюдали. Были найдены лишь единичные клетки, расположенные в более чем 50 миркометрах от границы трансплантата. Во всех экспериментах наблюдали глиальную реакцию в ткани мозга реципиента, непосредственно примыкающей к области инъекции. Глиальная реакция представляла увеличение количества клеток, экспрессирующих GFAP а также увеличение экспрессии фибронектина и коллагена типа IV. У животных контрольных групп, в мозг которых были трансплантированы клетки, не содержащие трансгенного GDNF, глиоз существенно нарастал с течением времени. У животных опытных групп, получивших трансплантаты, содержащие трангенный GDNF, не наблюдали существенного нарастания глиальной реакции. Таким образом, в эксперименте (через 18 дней после трансплантации) глиальная реакция в контрольной группе намного превышала реакцию в опытной группе (рис. 25). Обнаружено, что при трансплантации в полосатое тело клеток линии НЕК293, экспрессирующих химерный белок GDNF/GFP, количество GFAPпозитивных астроцитов, участвующих в образовании глиального рубца, значительно меньше, чем при трансплантации клеток той же линии, экспрессирующих GFP. 22 контроль GFP Fn GFAP GFP+Fn+GFAP Опыт (GDNF) Рис.25 Трансплантация клеток НЕК 293, содержащих LP14g (GDNF/GFP), в полосатое тело мозга крысы (18 суток после трансплантации). Масштаб 50 микрометров. Также в опыте по сравнению с контролем образуется меньше ассоциированного с рубцом внеклеточного матрикса, выявляемого окраской на фибронектин, коллаген IV и актин. Полученные результаты свидетельствуют о возможности переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены (18 дней), Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками человека линии НЕК293 и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента. В данной работе было подтверждено нейропротективное действие белка GDNF. Выделяемый клетками трансгенный GDNF оказывает трофическое влияние на окружающую ткань. Это влияние может проявляться в уменьшении гибели клеток, обусловленной травмированием мозга сдавлением ткани от инъекции чужеродных клеток. Также было показано значительное уменьшение глиального рубца Результаты подтверждают перспективность применения клеток млекопитающих, продуцирующих GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии. Однако, совокупность результатов предыдущих экспериментов позволяет предположить что оптимальным вариантом для предотвращения образования глиального рубца при трансплантациях, является сочетание нейротрофических факторов и белка теплового шока. Обсуждение Открытие стволовых клеток в нервной ткани вызвало переоценку целого ряда представлений, особенно для восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовые нервные клетки идентифицируют по молекулярным маркерам, которые отражают стадии их развития:: это нестин - для стволовой клетки, виментин для клетки-предшественника, бета-III-тубулин - для нейробласта, GFAР - для клетки, развивающейся по глиальному пути и ряд других маркеров. Наличие таких 23 маркеров позволило выявить популяционную гетерогенность первичных культур фетальных нейральных клеток. Например, типичное процентное распределение специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых нервных клеток человека следующее: нестин - 43,1 %, виментин - 63,2 %, бета-тубулин - 70,1 %, GFAP - 3,2 %, NCAM - 12,0 %, CD34 - 1,3 %, CD45 - 0,5 %. Подобная гетерогенность в какой-то степени определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия - в частности, изменение соотношения клеток с различным потенциалом отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду. Например, повышенное содержание нестин-содержащих клеток будет способствовать повышению эффективности воздействия микроокружения на их дифференцировку. Одной из задач работы являлся поиск генетического способа управления дифференцировкой нейральных стволовых клеток в условиях их культивирования и трансплантации. Эта проблема важна в теоретическом плане, поскольку приближает нас к пониманию сущности клеточной дифференцировки. Кроме того, решение этой проблемы позволит получать популяции клеток, дифференцирующихся в нужном для клеточной терапии направлении. Существуют три способа воздействия на дифференцировку клеток: а) добавление кондиционной среды; б) добавление к культуральной среде факторов, активирующих дифференцировку; и в) трансфекция культивируемых клеток генами, которые кодируют факторы, индуцирующие дифференцировку. В случае нервной ткани этими факторами являются нейротрофические факторы. В данной работе изучается третий способ воздействия. Критическое значение для экспрессии трансфицированного гена имеет правильный выбор промотора. Желательно, чтобы он был регулируемым, например, мог бы активироваться при температуре тела человека или активироваться только при более высокой тепературе не выходящей за физиологические пределы. При создании наших базовых генетических конструкций в качестве управляющего элемента мы применили п/р область гена hsp70 дрозофилы. Нами были выяснены основные вопросы, касающиеся функционирования полученных нами конструкций, содержащих нейротрофические факторы под контролем упомянутой п/р области в клетках и тканях дрозофилы и млекопитающих, включая человека. При исследовании полученных нами трансгенных линий дрозофилы, содержащих гены нейротрофических факторов человека - NGF, GDNF и BDNF под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы было показано, что нейротрофические гены млекопитающих экспрессируются в тканях дрозофилы находясь под неродственным промотором. Как и предполагалось, экспрессия данных генов оказалась температурно-зависимой. Полученные трансгенные линии дрозофилы характеризуются высокой транскрипционной активностью человеческих генов gdnf, ngf и bdnf в условиях теплового шока – при 37оС. Наличие экспрессии чужеродных белков подтверждена гибридизацией in situ, методом иммуноблотинга. Действие этих белков на окружающие клетки и ткани исследованы при трансплантации клеток дрозофилы в мозг крыс и при кокультивации их с клетками и органотипическими культурами нервных тканей животных и человека. В этих экспериментах во фрагментах эмбриональной эктодермы трансгенных линий дрозофилы активировался синтез трансдуцированных нейротрофических факторов и маркерных белков, обусловленный температурным воздействием среды по сути хит-шоковым для тканей насекомых. Продуцируемые факторы оказывали нейротрофное воздействие на окружающие ткани млекопитающих. 24 В результате исследований по ко-культивации, была получена модель, в которой эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, будучи источниками синтеза нейротрофического фактора, стимулируют рост нейральных отростков у кокультивированных эмбриональных, нервных клеток в строго заданном направлении. Интересно, что волокна млекопитающих не просто росли, но и вступали в контакт с нейральными тканями такого отдаленного таксона как дрозофила. Разработанная экспериментальная модель может быть полезна для дальнейших исследований действия трансдуцированных белковых факторов и сигнальных молекул на ткани и клетки подопытных животных и человека. Одно из важнейших открытий в области транспланталогии, сделанное Л.И. Корочкиным, заключается в обнаружении выживаемости нервных клеток дрозофилы в нервных тканях амфибий и млекопитающих. Корочкин и Савельев с соавторами (1991) обнаружили, что нерные эмбриональные клетки дрозофилы образуют связи с клетками реципиента, т.е. встраиваются в нервную ткань хозяина. Причем, в тканях мозга амфибий данные клетки существовали длительное время, а в мозге млекопитающих исчезали в течение месяца, замещаясь нервными клетками хозяина. Такие характеристики ксенотрансплантата представляются нам крайне привлекательными для использования клеток дрозофилы в качестве носителей терапевтических трансгенов. Такие клеточные векторы позволят вносить необходимые гены в область поражения нервной системы с возможностью уменьшения уровня реактивного глиоза и последующим замещением нервных клеток дрозофилы на нервные клетки хозяина. На основе данной идеи в данной работе были построены эксперименты по ксенотрансплантации, с целью поиска решения проблемы восстановления нервных тканей млекопитающих. Опыты с ксенотрансплантацией в мозг крысы нейральной ткани эмбриона трансгенной дрозофилы линии С3-1М (gdnf) в смеси с нервной тканью эмбриона крысы показали, что экспрессирующийся в ткани мухи тарнсдуцированный фактор выделяется в окружающюю ткань и оказывает трофическое воздействие на ткань реципиентного мозга и котрансплантированные фетальные клетки крыс. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих. Морфологическое изучение показало, что в случаях такой ко-трансплантации наблюдается хорошая приживляемость трансплантата и резкое снижение гибели котрансплантированных фетальных клеток крыс. Хорошая выживаемость клеток трансплантата может быть отражением нейропротективной функции выделяемого тканью мухи GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы вследствие апоптоза. Помимо хорошей выживаемости котрансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающего трансплантат неокортекса крысы. Интересно отметить, что такой интенсивной васкуляризации не наблюдается в обычных аллотрансплантатах фетальной, нервной ткани в кору крыс. На этом основании можно предположить, что ангиогенный эффект обусловлен присутствием в трансплантате ксеногенной ткани дрозофилы. Усиленную васкуляризацию могут вызывать факторы, выделяемые ксеногенными клетками, в том числе возможно и трансдуцированный GDNF. Было показало, что ткани трансгенных нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, в 25 ряде случаев видны тесные межклеточные взаимодействия, свидетельствующие об отсутствии межвидового антогонизма, значительная часть клеток нейральных закладок трансгенной дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии и экспрессирует тирозингидроксилазу в течение всего времени эксперимента. По всей видимости, и другие белки дрозофилы также принимают активное участие в процессе приживления. Одним из таких белков является белок теплового шока HSP70 дрозофилы. Этот факт был подтвержден в экспериментах по ксенотрансплантации в мозг крыс эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии Oregon, меченой lacZ и эмбриональной, нервной ткани мутанта ts403, утратившего способность к синтезу HSP70. В этих экспериментах показано, что белок теплового шока Hsp70 снижает образование рубцовой ткани вокруг ксенотрансплантата эмбриональных, нервных клеток дрозофилы. Важно отметить, что раздельное действие белка теплового шока (в экспериментах с мутантами ts403) и нейротрофического фактора (в экспериментах с клетками трансфицированными HEK293) приводило лишь к ослаблению рубцевания, в то время как совместное действие GDNF и HSP70 (в экспериментах с трансгенными линиями мух) приводило к полной редукции рубца. Так как при трансплантации клетки дрозофилы попадают в среду поддерживающую температуру теплового шока для дрозофилы, то вероятно, что именно комбинация экспрессий нейротрофического фактора и активированного белка теплового шока дает столь положительную динамику приживления трансплантата и обуловленное этим подавление глиоза. Наши исследования показали, что присутствие трансгенных клеток дрозофилы в составе клеточного терапевтического препарата может оказывать протективное, трофическое и антиглиозное действие на трансплантируемые клетки и на клетки окружающие ткани мозга реципиента. Перспективность использования клеточных препаратов с добавлением трансгенных клеток дрозофилы обусловлена на наш взгляд сочетанием нескольких факторов, принципиально недоступным в чистых алло- или аутотрансплантатах. В настоящее время получение клеточных препаратов носителей трансгенных белков на основе клеток млекопитающих возможно только с использованием линейных клеток или при помощи вирусных конструкций. Применение и тех и других в клинике опасно. Аутологичные или аллогенные клеточные препараты в сочетании с клетками дрозофилы в качестве носителя трансгена не несут вирусных генетических конструкций. Клетки дрозофилы обеспечивают эффективную доставку и экспрессию терапевтического трансгена в сочетании с протективным белком теплового шока Hsp70, действие которого показано в нашей работе. Продолжительность этого действия, как и действия трансгена, ограничена продолжительностью жизни клеток дрозофилы в условиях тканей реципиента и составляет 1 месяц. Этого времени во многих случаях достаточно для действия факторов, выживания и интеграции котрансплантированных аутологичных или аллогенных клеток в ткань мозга реципиента и для возможного замещения дегенерировавших нейронов. Такой сценарий терапевтического воздействия может быть оптимален для лечения многих патологических процессов. Результаты исследования тканей линий дрозофилы содержащих гены нейротрофических факторов млекопитающих под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы показали целесообразность использования этого промотора для трансформации стволовых клеток человека, которые в дальнейшем могут быть 26 использованы в экспериментах по нейротрансплантации, а возможно и в нейрохирургических операциях. Также в нашей работе были получены конструкции, несущие гены нейротрофических факторов, для использования их непосредственно в клетках млекопитающих. Полученные нами генные конструкции, содержащие гены нейротрофических факторов, были трансдуцированы в клетки человека линии HEK293, в эмбриональные клетки мышей и в клетки фетального мозга человека. При исследовании полученных трансгенных клеточных препаратов было обнаружено, что ко-культивация эмбриональной, нервной ткани фрагмента зачатка спинного мозга, получившей повреждения, с клетками линии НЕК293, экспрессирующими NGF, стимулирует образование нервных отростков у поврежденной ткани. При ко-культивации клеток линии НЕК293, продуцирующих GDNF, со спинальным ганглием новорожденного крысенка наблюдалось активное образование нервных отростков клеток спинального ганглия в сторону трансгенных клеток уже в течение первых двух часов в отличие от контроля, где отростки образовывались через 2-3 суток и в разных направлениях. Также было показано, что при трансплантации эмбриональных НЕК293 клеток, трансфицированных генами gdnf в мозг крысы, присутствие GDNF снижает образование рубцовой ткани. В отличие от модели с клетками дрозофилы, клетки НЕК293, являясь клетками человека, в мозге млекопитающих находятся в более комфортных условиях. В результате мы не наблюдали исчезновения данных клеток с течением времени. Однако, в отличие от разрастания данной трансгенной культуры при культивации, при трансплантации трансплантат оставался нормальных размеров, что подтверждает известный факт отсутствия туморигенности у клеток линии НЕК293. Полученные результаты свидетельствуют о возможности длительного переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены. Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками линии НЕК293, которая была получена из клеток эмбриональной почки человека, и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента. Результаты подтверждают перспективность применения трансгенного GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии. Дальнейшее совершенствование техники невирусной трансдукции терапевтических генов в клетки млекопитающих позволят создавать эффективные клеточные препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний. При исследовании клеток млекопитающих, трансфицированных конструкциями с маркерными белками под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы было обнаружено, что п/р область способна активировать чужеродный ген в клетках млекопитающих. Данная п/р область выгодно отличается от ранее известных, так как обладает высокой активностью, не имеет вирусной природы и ее активность можно регулировать, двумя разными способами: температурным воздействием (39oC) и с помощью белка Hsp83. Полученный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным. Данные результаты являются новыми, так как ранее утверждалось, что исследуемый промотор в клетках млекопитающих активизируется при 42°С, 27 что крайне травматично для клеток, и снижает возможности использования данного промотора в практике (Glazenburg K et.al.1992, Roigas J. et.al.1997). Таким образом, получена модель для регулирования активности чужеродного гена в клетках млекопитающих. Также было обнаружено, что при введении голой ДНК вектора Lp1, несущего комплекс hsp70-GFP в мозг мыши, наблюдалась трансфекция клеток мозга причем активация вводимого гена gfp под контроле промотора hsp70 обнаруживалась при температуре тела млекопитающих (37оС). По всей видимости, в данном случае наблюдается воспалительный процесс, обсловленный травмированием инъекционной иглой, который и запускает активацию исследуемого промотора. Использование п/р области гена hsp70 дрозофилы в качестве элемента управления экспрессией терапевтического трансгена дает возможность регулировать экспрессию чужеродного гена в трансплантате. При этом можно стимулировать гиперэкспрессию, с последующим снижением продуцирования трансгенного фактора. Таким образом, нами были разработаны две клеточные системы экспрессии нейротрофических факторов для трансплантации трансгенных клеток или тканей в мозг млекопитающих. Для первой из них донорами факторов являются клетки дрозофилы. Эта система обладает рядом преимуществ, а именно: трансгенные клетки дрозофилы быстро образуют связи с клетками мозга реципиента; препятствуют образованию глиального рубца на границе тканей трансплантат – реципиент и короткий срок жизни трансгенных клеток (менее месяца). Данная система привлекательна для терапии заболеваний требующих локального и кратковременного действия нейротрофных факторов. Вторая клеточная система на основе трансгенных линий клеток человека способна снабжать поврежденный участок мозга млекопитающих нейротрофным фактором длительное время, поскольку эти клетки способны долго жить после трансплантации. При экспрессии клетками нейротрофического фактора было показано резкое снижение (но не полное отсутствие как для первой системы) глиоза. По-видимому, обладая ярко выраженными ксеногенными свойствами трансгенные эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, в отличие от клеток человека, не вызывают межклеточной реакции на границе двух тканей при трансплантации. Таким образом, обнаружено, что сочетание белка теплового шока и нейротрофического фактора блокирует образование глиального рубца, повышая при этом приживаемость трансплантата и его васкуляризацию. На основании полученных данных напрашиваются некоторые практические рекомендации для использования в нейрохирургической практике. Суть их заключается в предложении изыскать способы мобилизации белка Нsp70 и введения нейротрофических генов при нейротрансплантациях. Таких способов несколько: 1. можно добавлять белок Нsp70 и нейротрофический фактор к трансплантату перед операцией, 2. можно активировать синтез белка в трансплантате посредством предварительного прогревания трансплантата при температуре, вызывающей тепловой шок, и при этом добавлять нейротрофический фактор с трансплантацией, 3. можно трансформировать используемую для трансплантации культуру, введя в ее геном гены, кодирующие белок Нsp70 и нейротрофический фактор. 28 Выводы 1. Показана функциональная активность генов, кодирующих нейротрофические факторы человека (bdnf, gdnf) и мыши (ngf) в геноме дрозофилы. 2. Установлено, что нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку нервных клеток млекопитающих при их совместном культивировании на искусственных средах. При этом происходит направленное образование отростков у эмбриональных спинальных ганглиев, что является необходимым условием при трансплантации. 3. Разработан метод смешанных ксенотрансплантаций эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы и его регуляторной области. Обнаружено, что трансгенные клетки дрозофилы дифференцировались в нейральном направлении на границе трансплантат – мозг реципиента. При этом они формировали контакты с окружающими нервными клетками, усиливали васкуляризацию области трансплантата. 4. Продемонстрировано, что ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат – ткани мозга реципиента. 5. Показана позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях. Обнаружено, что оптимальной для блокирования образования глиального рубца при трансплантациях является комбинация белков теплового шока HSP70 и нейротрофических факторов. 6. Получена трансгенная культура клеток дрозофилы, экспрессирующая нейротрофический фактор NGF млекопитающих. Данная культура может быть использована в качестве донора чужеродного нейротрофического фактора при трансплантациях в мозг млекопитающих. 7. Показано, что промоторно-регуляторная область гена hsp70 дрозофилы запускается сигнальным каскадом млекопитающих. На основании этого был получен вектор Lp1 для трансфекции клеток млекопитающих, в котором трансгены регулируются повышением температуры до 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки. 8. Разработан метод введения чужеродных генов встроенных в плазмиду, непосредственно в мозг млекопитающих, путем инъецирования голой ДНК. Данный метод наименее травматичен для тканей мозга. 9. Для клеточной трансплантации в мозг млекопитающих разработан метод клеточной доставки генов, в котором в качестве донора нейротрофического фактора были использованы трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижающие образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс. 10. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf . 29 11. Для изучения действия нейротрофических факторов in vitro и in vivo разработаны два типа клеточно-органных моделей, которые позволяют обеспечить как временное, так и постоянное действие этих факторов. Публикации 1. Корочкин Л.И.,Сергеев П.В., Башкиров B.Н., Панин В.М., Габитова Л.Б., Мартинс К., Копанцева М.Р., Шостак Н.Г., Павлова Г.В., Барский В.Е., и др. Тканеспецифическая экспрессия гена estS у трансгенных дрозофил. ДАН (1995), т.340, с. 433-436. 2. Александрова М.А., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Башкиров В.Н., Модестова Е.А., Евгеньев М.Б., Сабурина И.И., Мерцалов И.Б., Венгрова С.П., Корочкин Л.И. Влияние чужеродного гена GDNF на развитие трансплантата и ксенотрансплантата в мозге крыс. Генетика (2000), т.36, с.1553-1560. 3. Павлова Г.В., Модестова Е.А., Венгрова С.Н., Ефанова А.А., Рыбцова Н.Н., Корочкин Л.И. Экспрессия человеческого гена gdnf в трансгенной линии Drosophila melanogaster. ДАН (2001), т. 376, с.694-696. 4. Корочкин Л.И., Александрова M.А., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Башкиров В.Н., Алексенко О.А., Евгеньев М.Б. Эффект белка теплового шока HSP70 на формирование глиального рубца при нейротрансплантации. ДАН (2001), т.383, №3, с.113-5. 5. Корочкин Л.И., Александрова M.А., Павлова Г.В., Башкиров В.Н., Ревищин А.В., Алексенко О.А., Евгеньев М.Б. Влияние семейства HSP70 белков при алло- и ксенотрансплантации в мозг крысы. Цитология (2001), т.40, с. 803-806. 6. Павлова Г.В., Ефанов А.А., Башкиров В.Н., Модестова Е.А., Мерцалов И.В., Корочкин Л.И. Экспрессия генов ngf и bdnf человека в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Цитология (2002); №44 (11), с.1104-8. 7. Корочкин Л.И., Александрова М.А., Башкиров В.Н., Трухачева А.А., Дзитоева С.Г., Павлова Г.В., Муркин Е.А., Евгеньев М.Б., Ревищин А.В., Модестова Е.А. Ксенотрансплантация эмбриональной нервной ткани нейромутанта Drosophila стимулирует развитие трансплантата в мозгу крысы в нейральном направлении и блокирует образование глиального рубца. Цитология (2002); №44 (12), с.1181-5 8. Pavlova G., Enblom A., Revishchin A., Sandelin M., Korochkin L., Kozlova E. The influence of donor Drosophila cells on survival of peripherally grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. Cell Transplantation (2003), V 12, p 705-715. 9. Павлова Г.В., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.А., Гривенников И.А., Муркин Е.В., Канайкина Н.В., Ревищин А.В., В.Н.Тарантул, Корочкин Л.И. Регуляция экспрессии белка BFP в эмбриональных клетках. Бюлл. Эксперим. Медицины. 2005, Т. 139. № 4. с. 514-516 10. Маркитанова Ю.В., Макарьев Е.О., Павлова Г.В., Зиновьева Р.Д., Миташев В.И. Локализация экспрессии гена Prox1 при регенерации хрусталика и сетчатки у тритонов. ДАН (2003); №391, с.361-4. 11.Павлова Г.В., Ревищин А.В.,Мирошникова О.А.,Муркин Е.В.,Харлампиева Д.Д., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. Влияние чужеродного гена gdnf в ксенотрансплантатах на посттравматические процессы в мозге мышей. Молекулярная медицина (2006), №2, с. 44-48. 12. Андреева Л.Е., Хайдарова Н.В., Родригес-Бланко А.В., Канайкина Н.Н., Ревищин А.В., Тарантул В.З., Корочкин Л.И., Павлова Г.В. Экспрессия репортерных генов под контролем регуляторных элементов гена теплового шока дрозофилы в трансгенных эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis L. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия (2006), Т. 4 (6), с.39-44. 13.Охоботов Д.А.,Зарайский Е.И.,Павлова Г.В.,Камалов А.А.Иммунологические факторы бесплодия и антигены сперматозоидов. Медицинские науки. (2007), №4, стр. 31-42. 14. Поляков А.С., Корочкин Л.И., Павлова Г.В. Исследование экспрессии и анализ функции гена Sip1 в развитии коры головного мозга. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, (2007), Т. 2, №2, с. 40-44. 30 15. Бутовская П.Р.,Мартиросян И.А.,Баранов В.С,Егорова А.А,Киселев А.В.,Павлова Г.В.,Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами. Генетика (2007),Т. 43, №12, с. 1694–1699. 16. Павлова Г.В.,Охотин В.Е., Корочкин Л.И., Ревищин А.В. Геномная регуляция судьбы нейральных стволовых клеток млекопитающих. Генетика (2008), Т. 44, № 3, с. 293-299. 17. Revishchin A.V.,Korochkin L.I.,Okhotin V.E., and Pavlova G.V. Neural Stem Cells in the Mammalian Brain. International Review of Cytology, (2008), V. 265, p. 161-175. 18. Koles K.,Repnikova E.,Pavlova G.,Korochkin L.I.,Panin V.M. Sialylation in protostomes: a perspective from Drosophila genetics and biochemistry. Glycoconj J.(2008) Epub ahead of print. 19. E.Savvateeva-Popova, A.Popov., A.Grossman, E.Nikitina, A.Medvedeva, D.Molotko, N.Kamyshev, K.Pyatkov,O.Zatsepina, N.Schostak, E.Zelentsova,G.Pavlova,D.Panteleev, P.Riederer and M.Evgen`ev. Non-coding RNA as a trigger of neuropathologic disorder phenotypes in transgenic Drosophila. J. of Neural Transmission, (2008), Epub ahead of print. 20. Корочкин Л.И., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Полтавцева Р.А., Рыбалкина Е.Ю., Эрнст Л.К. (2007) Способ предифференцировки стромальных стволовых клеток костного мозга в тирозингидроксилаза-позитивные клетки. Заявка на патент №2007113908. 13.04.2007. 21. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ стимуляции регенерации нервной ткани млекопитающих. Заявка на патент №200701108. 20.06.2007 22.Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ предупреждения образования глиального рубца. Заявка на патент №200701109. 20.06.2007 23. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ активации регенерации нервной ткани млекопитающих. Заявка на патент №200701110. 20.06.2007 24. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ стимуляции регенерации нервной ткани. Заявка на патент №200701112. 20.06.2007 25. Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.Ю., Корочкин Л.И. (2007) Способ ускорения регенерации нервной ткани. Заяв. на патент №200701111. 20.06.2007 Главы в книгах 26. Korochkin LI., Alexandrova A, Pavlova G.et.al. Genetic Engineering Methods of the Regulation of Stem Cells Differentiation. Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p.121-136. 27.Korochkin L.I., Alexandrova A, Pavlova G.,et.al. Protein Hsp70 Blocks The Glial Scar Formation Around The Neurotransplant. Biotechnology and Medicine, Nova Science Publishers (2004), p. 137-141. 28. Shegelskaya E.A., Mikulinskii Y.E., Revishchin A.V., Pavlova G.V. and Korochkin L.I. Differentiation of Stem Cells in the Culture. In book: Genes, Gene Families, and Isozymes. Medimond, Berlin (2003), p.69-73. Тезисы конференций: 29. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzitoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgenev M., Modestova A., Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain: molecular genetic and embryological aspects. International Symposium on X-chromosome inactivation in mammals. Novosibirsk, 1999, p. 29. 30. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzytoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgeniev M., Grossman A. Xenotransplantation of Drosophila nerve cells into mammalian brain: molecular genetical and clinical aspects. 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, p.76. 31. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Dzytoeva S., Pavlova G., Trukhatcheva A., Evgeniev M., Grossman A. Embryonic nerve cells from Drosophila melanogaster stimulate 31 development of neural homografts in rat brain and blocked of glial scar formation. 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, р.704a. 32. Korochkin L.,Alexandrova M., Bashkirov V.,Dsitoeva S.,Pavlova G.,Trukhatcheva A, Evgeniev M. Xenotransplantation of Drosophila embryonic nerve cells into mammalian brain: molecular genetic and clinical aspects. 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology. Moscow-Puschino, 2000, р.68-69. 33. Korochkin L., Alexandrova M., Bashkirov V., Pavlova G., Trukhatchava A., Evgeniev M., Modestova E. Grosman A. Xenotransplantation of Drosophila embryonic cells into mammalian brain. Proc. of 2nd Internat. Conference on bioinformatics of genome regulation and structure. V.3, BGRS, Novosibirsk, 2000, р.2728-2729. 34. Корочкин Л.И., Александрова М.А., Башкиров В.Н., Дзитоева С.Г., Павлова Г.В., Трухачева А.П., Евгеньев М.Б. Ксенотрансплантации нервных клеток Drosophila melanogaster в мозг млекопитающих: Молекулярно-генетические и эмбриологические аспекты. Онтогенез, 2000, Т.31, №4, с. 293-294. 35.Pavlova G., Revischin, Miroschnikova O., Titova E., Murkin E., Enblom A., Sandelin M., Kozlova E., Korochkin L. The influence of donor age, nerve growth factor and cografting with Drosophila cells on survival of peripherically grafted embryonic or fetal rat dorsal root ganglia. Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine.Egypt,Hurgada,2004, p.121. 36. Pavlova G., Titova E., Bragina T., Mirochnikova O., Murkin E., Grivennikov I., Manuilova E., Narantul V., Revishchin A., Korochkin L.. Activation of foreign protein synthesis in stem cells. ELSO. Nice. 2004, p.178-181. 37.Mirochnikova O., Pavlova G., Murkin E., Titova E., Bragina T., Korochkin L. The synthesis of genetical constructs to transform the humam stem cells. Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine. Egypt, Hurgada, 2004, p.111. 38.Павлова Г.В., Мануилова Е.С., Гривенников И.А., Мирошникова О.А., Титова Е.А., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Модестова Е.А., Корочкин Л.И. Активация синтеза чужеродного белка в культуре клеток. Прогресс в биотехнологии и нейробиологии – интегративная медицина. Украина, Судак, июнь 2004 г., с.34 39. Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Модестова Е.А., Корочкин Л.И. Селекция линии дрозофилы, несущей ген красного белка. Прогресс в биотехнологии и нейробиологии–интегративная медицина. Украина, Судак, 2004 г., с.48. 40.Korochkin L.I.,Grivennikov I.A.,Manuilova E.S.,Tarantul V.N.,Revishchin A.V.,Titova E.V., Miroshnikova O.A., Bragina T.V., Murkin E.V., Kanaikina N.V., Pavlova G.V. Transformation stem cells culture by genes of human neurotrophic. J.of Biotechnology (2005), V.1, p.64. 41.Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Муркин Е.В., Канайкина Н.Н., Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Экспрессия чужеродных человеческих NGF и GDNF в трансгенных линиях Drosophila. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с. 78. 42.Титова Е.А.,Брагина О.В.,Мирошникова О.А.,Корочкин Л.И.,Павлова Г.В. Создание модельных генетических систем для изучения нейротрофических факторов и флуоресцентных белков. В кн:Системная биология и биоинженерия. М.,Макс Пресс,2005, с. 81. 43.Харлампиева Д.Д., Павлова Г.В., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансгенного нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с.82. 44.Павлова Г.В.,Корочкин Л.И.Новые подходы к регуляции дифференцировки стволовых клеток. В кн:Системная биология и биоинженерия. М.,Макс Пресс,2005,с.100-101. 45. Харлампиева Д.Д., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансфекции нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с. 123-124. 32 46.Корочкин Л.И., Гривенников И.А.,Мануилова Е.С., Тарантул В.З., Ревищин А.В., Титова Е.В., Муркин Е.В., Канайкина Н.А., Павлова Г.В. Трансформация стволовых клеток генами нейротрофических факторов В кн. Биотехн.: Состояние и перспективы развития. 2005. с. 64-66. 47. Муркин Е.В., Павлова Г.В., Титова Е.В., Гривенников И.А., Мануилова Е.С., Ревищин А.В., Тарантул В.С., Корочкин Л.И. Активация чужеродных белков в стволовых клетках. В кн: Системная биология и биоинженерия. М., Макс Пресс, 2005, с.149-150. 48. Павлова Г.В., Ревищин А.В., Зарайский Е.И., Титова Е.В., Рыбалкина Е.А., Брагина Т.А., Мирошникова О.В., Муркин Е.В., Пономарь С.Н., Канайкина Н.А., Корочкин Л.И. Индукция специфической дифференцировки в региональных стволовых клетках человека. Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ. Т.2, Сочи-Дагомыс, 2005, с. 126. 49. Титова Е.А., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Харлампиева Д.В., Брагина Т.В., Муркин Е.В., Канайкина Н.Н., Антонова Г.А.,Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Экспрессия чужеродных (человеческих) и нейротрофических генов NGF и GDNF в трансгенных линиях Drosophila. Материалы 6-ой Междунар. конф. Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, .81 50.Титова Е.А., Брагина Т.В., Мирошникова О.А., Корочкин Л.И., Павлова Г.В., Создание модельных генетических систем для изучения нейротрофических факторов и флуоресцентных белков. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.81-82. 51.Харлампиева Д.В., Павлова Г.В., Мирошникова О.А., Ревищин А.В., Рыбалкина Е.В., Корочкин Л.И. Влияние трансгенного нейротрофического фактора GDNF на дифференцировку стволовых клеток и посттравматические процессы в мозге млекопитающих. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.82-83. 52.Канайкина Н.Н., Павлова Г.В., Титова Е.А., Мирошникова О.А., Антонова Г.А., Харлампиева Д.В., Муркин Е.В., Гривенников И.А., Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л. Ревищин А.В.,Тарантул В.З., Корочкин Л.И. Активация чужеродных белков в стволовых клетках. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.95 53. Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Новые подходы к регуляции дифференцировки стволовых клеток. Материалы 6-ой Международной конференции Молекулярная генетика соматических клеток, 2005, с.100 -101 54. Павлова Г.В., Ревищин А.В., Корочкин Л.И. Разработка и испытание методов подготовки аутологичного материала для клеточной терапии при нейродегенеративных заболеваниях. 1-ая всерос. школа-конференция. Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 20. 55.Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин А.В., Павлова Г.В., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Деметилирование ДНК значительно усиливает индукцию нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани, вызванную нейротрофическим фактором BDNF и ретиноевой кислотой. 1-ая всероссийская школа-конференция: Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 44. 56. Тимошенко Т.В., Полетаева И.И., Перепелкина О.В., Сазонова А.С., Павлова Г.В., Ревищин А.В. Управление уровнем пролиферации клеток переднего мозга с помощью нейропептида семакс и ингибитора NO-синтазы. Первая всероссийская школаконференция: Аутологичные стволовые и прогениторные клетки. 2008, с. 55. 33