На правах рукописи ИЛЯСКИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
advertisement
На правах рукописи ИЛЯСКИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО ОБМЕНА КЛЕТКИ ТРАНСПОРТНОГО ЭПИТЕЛИЯ 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2013 Работа выполнена в секторе молекулярной физиологии клетки лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, Россия. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Соленов Евгений Иванович Официальные оппоненты: Меркулова Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией регуляции экспрессии генов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Романюха Алексей Алексеевич, доктор физико-математических наук, профессор, ведущий научный сотрудник, заместитель директора, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт вычислительной математики РАН, г. Москва Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования СанктПетербургский государственный политехнический университет, г. Санкт-Петербург Защита диссертации состоится «___» ____________ 2013 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т./ф. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан «___» _____________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Нарушения водно-солевого баланса являются распространенными патологическими состояниями, сопутствующими многим заболеваниям (Avner, 1995; Pfennig, Slovis, 2012). Примерами таких нарушений являются гипертензия (Navar, 2010), отеки (Sterns, Silver, 2006; Hoorn, Zietse, 2013), задержка в выведении воды из организма при застойной сердечной недостаточности, гипонатриемия у пациентов с синдромом нарушенного антидиуреза при раковых заболеваниях, потеря воды при лечении маниакальнодепрессивного синдрома солями лития и многие другие (Bagshaw et al., 2009). Принимая во внимание значение водно-электролитного гомеостаза для жизнедеятельности организма, важность изучения механизмов его поддержания не вызывает сомнений. Водно-солевой баланс организма определяется процессами транспорта воды и осмолитов на клеточном уровне. Поддержание водно-солевого баланса обеспечивается клетками транспортного эпителия, в частности главными клетками собирательных трубок наружного мозгового вещества (OMCD) почки. Главные клетки собирательных трубок ответственны за реабсорбцию воды, Na+ и секрецию K+ (Breyer, Ando 1994), поэтому транспорт ионов и воды через мембрану данного типа клеток достигает значительных величин. Кроме того, осмотическое давление канальцевой жидкости, контактирующей с клетками, изменяется в широких пределах. Наиболее опасна для клеток гипотоническая среда, поскольку в результате возрастания объема клетки может произойти нарушение целостности плазматической мембраны. Очевидно, что для функционирования в таких условиях главные клетки собирательных трубок наружного мозгового вещества почки должны обладать эффективным механизмом регуляции осмотического гомеостаза. В регуляции баланса электролитов и, соответственно, клеточного объема участвуют характерные для каждого типа клеток каналы и транспортеры основных ионных осмолитов, находящиеся в плазматической мембране (Hebert et al., 2005). Так, проницаемость главных клеток собирательных трубок для воды обусловлена наличием в мембране водных каналов, формируемых аквапоринами (Nielsen et al., 2002). Ионная проницаемость мембраны главных клеток обеспечивается широким спектром ионных каналов и транспортеров (Legato et al., 2003). Для исследования физиологических характеристик клетки, относящихся к трансмембранному и трансцеллюлярному транспорту воды и осмолитов, разработан ряд электрофизиологических методов (Ogden, Stanfield, 1994; Molleman, 2002). Однако методы электрофизиологии не позволяют проводить изучение интактных клеток. Кроме того, практическая реализация данных подходов представляет значительную сложность. В качестве альтернативы были разработаны флуоресцентные методы, позволяющие производить измерение характеристик клетки (объема, внутриклеточной концентрации осмолитов, pH), не нарушая её целостности в условиях близких к условиям in vivo (Chifflet, Hernández, 2007) . Полученные экспериментальные данные нуждаются в средствах обработки и анализа. В этой связи широкое распространение получили методы математического моделирования, которые позволяют проводить анализ экспериментальных данных и рассчитывать физиологические характеристики клетки, недоступные для прямого экспериментального измерения. В частности, математические модели мембранного транспорта необходимы для получения 1 количественных оценок интенсивности транспорта электролитов и воды. Ввиду множественности параллельных путей переноса ионов через клеточную мембрану определение вклада каждого из них в общий трансмембранный поток осмолитов требует моделирования функционирования системы в целом. Разработанные на сегодняшний день модели трансмембранного транспорта главных клеток собирательных трубок почки (Weinstein, 1997; 1999; 2001; 2003) не предназначены для обработки и анализа экспериментальных данных. Поэтому существует необходимость создания модели мембранного транспорта, описывающей динамику клеточного объема и основных ионных осмолитов, которая может применяться в качестве инструмента для исследования физиологических характеристик реальных клеток. Разработка экспериментально-теоретического подхода к исследованию характеристик трансмембранного транспорта в главных клетках собирательных трубок наружного мозгового вещества (OMCD) почки является актуальной проблемой. Остается не исследованным на количественном уровне вклад различных механизмов транспорта (каналов и транспортеров) в общий трансмембранный поток ионов. Не ясны все аспекты механизма адаптации данных клеток к переносу различных количеств ионов натрия и калия. Необходимы исследования адаптивных процессов, обеспечивающих сохранение жизнеспособности клетки при действии гипотонической среды. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось экспериментально-теоретическое исследование водно-электролитного обмена главных клеток OMCD. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи: 1. Создать математическую модель мембранного транспорта главной клетки OMCD, с помощью которой возможно проводить анализ экспериментальных данных по динамике клеточного объема и внутриклеточных концентраций осмолитов. 2. С помощью созданной модели мембранного транспорта определить физиологические характеристики переноса веществ через плазматическую мембрану главных клеток OMCD. 3. Использовать созданную модель мембранного транспорта для оценки влияния повышенного потребления NaCl на проницаемость мембраны главных клеток OMCD для ионов натрия и калия. 4. Использовать созданную модель мембранного транспорта для определения водной проницаемости мембраны и эффективности механизма регуляторного снижения объема (RVD) при действии на главные клетки OMCD гипотонической среды. Научная новизна работы. Впервые был создан экспериментальнотеоретический подход к исследованию водно-электролитного баланса главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки. Принцип подхода заключался в сочетании экспериментальных методов исследования внутриклеточной концентрации ионов натрия и объема клетки и математического моделирования процессов трансмембранного транспорта. Получены количественные оценки проницаемости мембраны главных клеток OMCD для ионов Na+, K+ и Cl- и интенсивности трансмембранных ионных потоков. Установлено, что поток ионов через котранспортеры KCC (K+Cl-) и NKCC (Na+K+2Cl-) в главных клетках собирательных трубок незначителен по сравнению с 2 ионными потоками через каналы и Na/K-насос. Показано, что повышенное потребление NaCl вызывает трехкратное снижение проницаемости мембраны главных клеток OMCD для ионов Na+ и K+. Одновременное пропорциональное изменение проницаемости мембраны для ионов приводит к изменению величины трансцеллюлярного ионного потока, при этом значения объема клетки, внутриклеточных концентраций ионов и мембранного потенциала остаются без изменения. Впервые получена динамика относительного объема главных клеток OMCD при действии гипотонической среды с высоким временным разрешением. Впервые показано, что гипотонический шок вызывает десятикратное снижение водной проницаемости мембраны главных клеток OMCD. Установлено, что главные клетки OMCD обладают эффективным механизмом регуляторного снижения объема (RVD) в ответ на действие гипотонической среды, главную роль в котором могут играть потоки ионов калия и органических анионов из клетки. Практическая ценность работы. Полученные данные дополняют существующие представления о механизмах поддержания водно-электролитного гомеостаза как главных клеток эпителия собирательных трубок почки, так и организма в целом. Созданный экспериментально-теоретический подход к определению физиологических характеристик клетки, измерение которых в экспериментах затруднено или невозможно, существенно расширяет возможности исследования процессов транспорта воды и осмолитов через мембрану клетки. Благодаря возможности включения в модель дополнительных путей трансмембранного транспорта, созданная математическая модель может быть адаптирована для изучения клеток, отличных от главных клеток OMCD. Дальнейшее развитие созданного экспериментально-теоретического подхода к исследованию клетки позволит повысить эффективность разработки новых стратегий коррекции патологий водно-электролитного обмена. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Разработанная математическая модель транспорта ионов и воды через плазматическую мембрану главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки позволяет определять значения проницаемости мембраны для ионов Na+, K+, Cl- и воды по экспериментально полученным внутриклеточным концентрациям ионов натрия, хлора и динамике клеточного объема. 2. Хроническая солевая нагрузка вызывает более чем трехкратное снижение проницаемости плазматической мембраны главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки крыс для ионов Na+ и K+ без изменения внутриклеточных концентраций ионных осмолитов и разности электрических потенциалов на плазматической мембране. 3. Механизм адаптации главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки крыс к действию гипотонической среды заключается в быстром снижении водной проницаемости плазматической мембраны и быстром регуляторном снижении клеточного объема за счет выхода из клетки ионов калия и органических анионов. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 4 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных изданий. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, 2009), Международной конференции 3 «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), на VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2009), на XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010), на VII международной конференции BGRS (Новосибирск, 2010), на I международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010), на 55 ежегодном съезде Биофизического общества (Балтимор, США, 2011), на международной конференции, посвященная 100-летию А.А. Ляпунова «Современные проблемы математики, информатики и биоинформатики», (Новосибирск, 2011), на III съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011), на VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на 57 ежегодном съезде Биофизического общества (Филадельфия, США, 2013). Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, библиографического списка и 1 приложения. Работа изложена на 117 листах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 284 источника. Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно. Экспериментальная установка для проведения флуориметрического анализа главных клеток собирательных трубок почки была создана совместно с д.б.н. Соленовым Е.И. Создание математической модели мембранного транспорта и её реализация в виде компьютерной программы на языке C++ осуществлялась в сотрудничестве с к.ф.-м.н. Карповым Д.И., к.ф.-м.н. Медведевым Д.А. и д.ф.-м.н. Ершовым А.П. (ИГиЛ СО РАН). Основные результаты, представленные в публикациях, были получены автором. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальные животные В экспериментах использовались 60-ти дневные крысы линии Вистар обоих полов. Все животные содержались в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН. Для стандартизации состояния животных и повышения водной проницаемости эпителия собирательных трубок в экспериментах по изучению реакции регуляторного снижения объема (RVD) в гипотонической среде крыс приводили в состояние антидиуреза. С этой целью животных лишали доступа к воде и обеспечивали их сухим кормом в течение 36 часов (гипогидратированные животные). В экспериментах по оценке влияния повышенного потребления NaCl (хронической солевой нагрузки) на ионную проницаемость мембраны клеток собирательных трубок исследовали две группы животных. Первая группа (контрольная) получала стандартный корм и питьевую воду, животные второй группы («высокосолевая» группа) вместо питьевой воды в течение 5 дней получали физиологический раствор (0.9% NaCl). Протоколы работы с животными одобрены комиссией по биоэтике СО РАН. Общее число исследованных животных составило 156. 4 Получение фрагментов собирательных трубок (OMCD) Крыс наркотизировали пентабарбиталом (50 мг/кг веса тела), декапитировали и извлекали почки. Извлеченные почки помещали в буферный фосфатный солевой раствор PBS (рН 7.4), декапсулировали и декортицировали. Наружное мозговое вещество диспергировали, пропуская через инъекционную иглу с внутренним диаметром 1.9 мм в низкокальциевом PBS (0.05 мМ CaCl2). Полученную суспензию фильтровали через капрон, переносили в культуральную среду L-15 Leibovitz (Sigma, Германия) c 10 мМ HEPES и в дальнейшем использовали как препарат фрагментов почечных канальцев (OMCD). Все процедуры выполняли на льду. Растворы В качестве изотонического раствора использовали фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с осмоляльностью 280 мОсмоль/кгH2O. Гипотонический раствор PBS (140 мОсмоль/кгH2O) создавали разведением в два раза изотонического раствора дистиллированной водой. Диспергирование мозгового вещества почки проводили в PBS со сниженной до 50 мкМ концентрацией ионов кальция. В экспериментах c изотоническим замещением ионов Na+ использовался N-метил-D-глюкамин (NMDG) (ICN Biomedicals, США). Для создания бесхлоридного раствора Cl- замещали глюконат-ионом (ICN Biomedicals, США). Установка и основные этапы флуориметрического анализа Экспериментальная установка представляет собой проточную камеру и собрана на базе флуоресцентного микроскопа ЛОМО-Р8. Характеристики проточной камеры обеспечивали быструю смену омывающего раствора с характерным временем менее 200 мс. Температуру омывающих растворов поддерживали на уровне 36.8 0.2oC. В экспериментах фрагменты канальцев в 100 мкл культуральной среды L-15 Leibovitz наносили на покровное стекло, покрытое полилизином, и помещали в проточную камеру микроскопа. Затем производилась загрузка клеток флуоресцентным красителем. Эмитируемый свет регистрировали с помощью фотоприемника на основе ФЭУ-71, оборудованного полевой диафрагмой для измерения интенсивности флуоресценции в интересующей области фрагмента канальца. Измерения производили с помощью цифрового осциллографа Актаком АСК-3102 с записью данных на компьютер. Измерение объема клетки Для изучения изменений объема клетки применяли метод, основанный на эффекте гашения флуоресцентного красителя Calcein белками цитоплазмы (Solenov et al., 2004). Флуоресценция Calcein калибровалась путем одновременного измерения интенсивности флюоресценции и высоты эпителия собирательной трубки при воздействии среды с различной осмоляльностью (150, 300, 400 и 600 мОсмоль/кгH2O) с помощью микроскопа Zeiss Observer Z1 (Zeiss, Германия), оборудованного CCD камерой AxioCam HSm (Zeiss, Германия, частота регистрации 10 кадров в секунду). На основании 3D изображений клеток OMCD, полученных с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 780 (Zeiss, Германия), сделано заключение о том, что объем клетки пропорционален высоте клетки, возведенной в третью степень: V/V0 = (H/H0)3, а величиной осмотически неактивного объема главных клеток OMCD можно пренебречь. 5 Оценка активности котранспортеров KCC и NKCC Оценку активности систем котранспорта в главных клетках OMCD осуществляли путем определения влияния блокаторов котранспортеров на стационарный объем клетки в изотонической среде. Ингибирование котранспортера KCC проводили с помощью DIOA (10-4 M в изотоническом PBS) (Sigma, Германия), а котранспортера NKCC – с помощью буметанида (10-5 М в изотоническом PBS) (Sigma, Германия). Измерение внутриклеточной концентрации ионов натрия Концентрация ионов натрия в главных клетках OMCD определялась с помощью флуоресцентного красителя Sodium Green (Invitrogen, США). Калибровка флуоресцентного сигнала осуществлялась путем воздействия на клетки фосфатного солевого буфера PBS с различной концентрацией Na+ (135 мМ, 70 мМ или 10 мМ) в присутствии 10-4 М Na+ ионофора Nystatin (AppliChem, Германия), который позволял контролировать внутриклеточную концентрацию натрия. Статистика Для оценки достоверности различий применяли t-критерий Стьюдента. Различия признавались достоверными при p<0.05. Все величины выражены как М SE. Динамика относительного объема клетки и внутриклеточной концентрации натрия представлена в виде усредненных графиков с указанием стандартной ошибки (М SE). Вычислительные методы Работа проводилась на высокопроизводительном кластере НКС-30Т с суммарной пиковой производительностью 30 ТФлопс (Сибирский суперкомпьютерный центр, ИВМиМГ СО РАН). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Разработка экспериментально-теоретического подхода к исследованию водно-электролитного обмена главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки Математическая модель мембранного транспорта главной клетки OMCD Разработанная в настоящей работе математическая модель транспорта веществ через мембрану главных клеток OMCD представляет собой систему обыкновенных дифференциальных уравнений (1) – (5), которая описывает изменение внутриклеточных количеств ионов Na+, K+, Cl– и органических анионов (nNa, nK, nCl, nX) и объема клетки V за счет трансмембранных потоков ионов и воды через ионные и водные каналы, котранспортеры KCC и NKCC и Na/K-насос: dn Na A 3J pump J Na J NKCC , dt dnK A2 J pump J K J KCC J NKCC , dt dnCl A( J Cl J KCC 2 J NKCC ), dt dn X AJ X , dt 6 (1) (2) (3) (4) dV n n K nCl n X AVW PW Na П e . dt V (5) где A – площадь поверхности клетки (см2); JNa, JK, JCl, JX - потоки Na+, K+, Cl– и органических анионов через ионные каналы (моль/см2×с); – 3Jpump – поток ионов Na+ и 2Jpump – поток ионов K+, обусловленные работой Na+/K+-насоса (моль/см2×с); JKCC и JNKCC – потоки ионов через K+Cl- (KCC) и Na+K+2Cl- (NKCC) котранспортеры, соответственно (моль/см2×с); VW - молярный объем воды (18 см3/моль); PW – осмотическая водная проницаемость мембраны (см/с); Пе – общая внеклеточная концентрация осмолитов (моль/см3). Моделируемые пути трансмембранного транспорта выбраны в соответствии с экспериментальными данными экспрессии каналов и транспортеров в мембранах клеток собирательных трубок почки (Frindt, Palmer, 1987; Frindt, Palmer, 1989; Duc et al., 1994; Muto, 2001; Jentsch, 2005; Najjar et al., 2005; Pisitkun et al., 2006; Chou et al., 2008; Uawithya et al., 2008). Каждый из механизмов транспорта описывался с помощью известных физических принципов моделирования потоков веществ через мембрану клетки. Потоки осмолитов через ионные каналы описывались диффузионными уравнениями Фика и Планка с учетом преобразования Гольдмана-Ходжкина-Каца (Goldman, 1943; Hodgkin, Katz, 1949). Величины электродиффузионных потоков ионов Na+, K+, Cl- и органических анионов определялись ионными трансмембранными электрохимическими градиентами и зависели от значений параметров проницаемости мембраны PNa, PK, PCl и PX (см/с). Поток органических анионов JX учитывался только при моделировании реакции регуляторного снижения объема, во всех остальных случаях JX=0 (PX=0). Трансмембранный электрический потенциал вычислялся по текущему полному внутриклеточному заряду с использованием значения удельной электрической ёмкости мембраны (Fraser, Huang, 2004). Поток, обусловленный работой Na+/K+-насоса (Jpump), рассчитывался с помощью модели Na/K-насоса, как описано в работе (Chapman et al., 1983; Hernandez, 2000), и зависел от значения параметра Npump, описывающего плотность Na/K-насоса в мембране (моль/см2). Потоки Na+ и K+ через Na/K-насос равны –3Jpump и 2Jpump, соответственно. Трансмембранные потоки через котранспортеры определялись только трансмембранными концентрационными градиентами ионов и не зависели от значения трансмембранного потенциала (Lauf, Adragna, 2000). Данные потоки были пропорциональны параметрам проницаемости QKCC (см4/моль×с) и QNKCC (см10/моль3×с). Реакция регуляторного снижения объема клетки в гипотонической среде моделировалась путем повышения параметров проницаемости мембраны для ионов K+, Cl- и органических анионов в зависимости от объема клетки: PK=PK0×f1(V/V0); PCl=PCl0×f1(V/V0); PX=f2(V/V0), где V0 – начальное значение объема клетки в изотонической среде. Исследование активности котранспортеров NKCC и KCC в главных клетках OMCD Экспериментальные данные указывают на экспрессию котранспортеров NKCC1 и KCC1 преимущественно в клетках собирательных трубок внутреннего мозгового вещества (IMCD) (Chou et al., 2008). Для оценки активности систем котранспорта в главных клетках OMCD использовали блокаторы котранспортеров 7 -5 10 in [Cl [Cl ] ]in и определяли их влияние на стационарный объем клетки в изотонической среде. Ингибирование котранспортера KCC с помощью DIOA (10-4 M) приводило к ~1% увеличению клеточного объема (1.013±0.004, n=5). Блокатор NKCC буметанид (10-5 М) не оказывал влияния на стационарный объем клеток (n=5). На основании результатов экспериментов можно считать, что вклад котранспортеров в общий трансмембранный поток ионов в главных клетках OMCD в изотонических условиях незначителен. Поэтому в модели мембранного транспорта главной клетки OMCD данными потоками можно было пренебречь (QKCC=QNKCC=0, следовательно JKCC=JNKCC=0). Определение проницаемости мембраны и интенсивности трансмембранного транспорта для главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почек (OMCD) крыс На основании исследования стационарных состояний модельной системы создан метод расчета значений проницаемости мембраны и интенсивности потоков осмолитов через плазматическую мембрану клетки по известным значениям внутриклеточной концентрации ионов натрия [Na+]in и хлора [Сl–]in. Был определён диапазон значений отношений параметров проницаемости PNa/PK и Npump/PK, для которых возможно установление стационарного состояния системы. В пределах данной области численно была рассчитана таблица взаимно однозначного соответствия между точками пространства параметров (PNa/PK, Npump/PK) и точками пространства характеристик стационарного состояния системы ([Na+]in, [Сl–]in). В качестве примера на Рис. 1 показано соответствие между точками, выбранными произвольным образом. 3.0x10 -5 2.0x10 -5 1.0x10 -5 -5 2.0x10 -5 ++ 3.0x10 -5 4.0x10 -5 [Na] ]in [Na in pump K NNpump/P/PK 1.0x10 -6 10 -7 10 0.1 0.2 PNa PK P //P Na K 0.3 Рис. 1. Пространство параметров (PNa/PK, Npump/PK) и пространство характеристик ([Na+]in, [Сl–]in) стационарных состояний модели. Пары точек, соединенные линиями, взаимно однозначно соответствуют друг другу. 8 Экспериментальные измерения показали, что в условиях наших экспериментов концентрация ионов натрия в главных клетках OMCD равнялась [Na+]in=36.3±3.3 мМ (n=7). Измерение содержания ионов хлора в клетке [Cl-]in проводилось косвенным образом по снижению относительного клеточного объема в бесхлоридной среде. Значение относительного объема клетки в бесхлоридной среде стабилизировалось на уровне 0.77±0.03 (n=10) (Рис. 3). Учитывая, что осмотически активный объем клеток OMCD близок к 100%, концентрацию ионов Cl- в клетке можно оценить в 32.2±4.0 мМ. В таблице взаимно однозначного соответствия между параметрами проницаемости и характеристиками стационарного состояния было выбрано стационарное состояние системы, которое наилучшим образом соответствовало экспериментально полученным данным, а именно [Na+]in=37.6 мМ и [Cl-]in=31.2 мМ. Данному стационарному состоянию системы соответствовали значения отношений проницаемостей: PNa/PK=0.27; Npump/PK=2.7×10-7 моль/см×с. Определение абсолютных значений проницаемости мембраны для ионов натрия и калия (PNa, PK, и Npump) осуществлялось на основе экспериментально полученной динамики концентрации ионов натрия в клетках при переходе из среды с низкой концентрацией натрия (10 мМ) в среду с высокой концентрацией натрия (изотонический PBS) и моделирования воздействия гипонатриевой среды на клетку (Рис. 2). Определялось значение коэффициента пропорциональности k в следующих выражениях: PNa=kPNak=1, PK=kPKk=1, Npump=kNpumpk=1, где PNak=1=2.7×10-7 см/с, PK k=1=1.0×10-6 см/с и Npump k=1=2.7×10-13 моль/см2. PBS + (10 мМ Na ) 45 PBS 40 + [Na ]in, мМ 35 30 25 k=3 k=5 k = 10 k = 16 20 15 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, секунды Рис. 2. Динамика внутриклеточной концентрации натрия в клетках OMCD при переходе из среды с низкой концентрацией ионов натрия (10 мМ) в изотонический PBS (усредненная запись, n=7). Определение абсолютных значений PNa, PK и Npump для клеток OMCD. Штриховыми линиями показаны результаты моделирования динамики внутриклеточной концентрации натрия в ответ на повышение внеклеточной концентрации натрия при различных значениях параметра k. Сплошной линией показан результат моделирования при значении параметра k, который наилучшим образом соответствует результатам эксперимента. 9 Результаты моделирования сравнивались с экспериментальными данными для нахождения величины коэффициента k, при которой достигалось наилучшее соответствие между расчетной и экспериментально измеренной динамикой внутриклеточной концентрации ионов натрия. Была получена оценка k=10 (Рис. 2), которая использовалась для расчета абсолютных значений проницаемостей мембраны: PNa=2.7×10-6 см/с; PK=1.0×10-5 см/с; Npump=2.7×10-12 моль/см2. Этим значениям параметров соответствовали трансмембранные ионные потоки ионов JNa = 6.6×10-10 моль/см2×с, JK = – 4.4×10-10 моль/см2×с, Jpump = 2.2×10-10 моль/см2×с. Значение проницаемости мембраны для хлора (PCl) оценивали по скорости снижения объема при действии на клетку бесхлоридной среды в эксперименте и модели. По наилучшему совпадению расчетных и экспериментальных профилей относительного объема клетки определили значение PCl = 3.0×10-6 см/с (Рис. 3). Относительный объем V/V0 бесхлоридный PBS PBS 1.05 -6 PCl = 1.0 x 10 см/с -6 PCl = 2.0 x 10 см/с -6 PCl = 3.0 x 10 см/с -5 PCl = 1.0 x 10 см/с -5 PCl = 5.0 x 10 см/с - 23% 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Время, секунды Рис. 3. Динамика относительного объема клеток OMCD при действии бесхлоридной среды (n=10). Амплитуда снижения объема позволяет оценить концентрацию ионов хлора в клетках, а скорость снижения объема – проницаемость мембраны для ионов хлора PCl. Штриховыми линиями показаны результаты моделирования динамики относительного объема клеток в ответ на действие бесхлоридной среды при различных значениях параметра проницаемости PCl. Сплошной линией показан результат моделирования при значении параметра PCl, который наилучшим образом соответствует результатам эксперимента. Таким образом, впервые был создан экспериментально-теоретический подход к исследованию водно-электролитного баланса главных клеток собирательных трубок наружного мозгового вещества почки. Полученные в настоящей работе оценки мембранной проницаемости и интенсивности трансмембранного транспорта электролитов в главных клетках OMCD хорошо согласуются с данными других авторов (El Mernissi, Doucet, 1984; Weinstein, 2000; Muto, 2001; Weinstein, 2001). Так, рассчитанная по модели плотность Na/K-насоса в мембране главных клеток OMCD (Npump) позволяет рассчитать число молекул фермента на клетку. Такая оценка (16,2 млн/клетка) хорошо соответствует экспериментально определенному числу сайтов связывания оубаина, меченого [3H], в различных отделах нефрона и собирательных трубках (10-50 млн/клетка в 10 зависимости от сегмента) (El Mernissi, Doucet, 1984). Кроме того, значения мембранной проницаемости для ионов натрия, калия и хлора, а также потоки ионов натрия и калия через каналы и Na/K-насос, полученные с помощью модели главных клеток собирательных трубок коркового вещества (CCD) (Weinstein, 2001), совпадают по порядку величины с оценками аналогичных клеточных параметров, полученных в настоящей работе для главных клеток наружного мозгового вещества (OMCD). 2. Применение экспериментально-теоретического подхода для исследования водно-электролитного баланса главных клеток OMCD почки Исследование влияния повышенного потребления NaCl с пищей на проницаемость мембраны и интенсивность трансмембранного транспорта в главных клетках OMCD Было проведено исследование механизмов поддержания водноэлектролитного баланса главных клеток эпителия собирательных трубок почки при повышении потребления NaCl животным (при хронической солевой нагрузке). Количественная оценка параметров проницаемости мембраны и интенсивности трансмембранного транспорта в главных клетках (OMCD) у «высокосолевой» группы крыс проводилась так же, как и для контрольных животных, а именно: 1) оценивалась активность NKCC и KCC котранспорта; 2) определялись отношения параметров проницаемости мембраны PNa/PK и Npump/PK; 3) по известным отношениям PNa/PK и Npump/PK определялись абсолютные значения проницаемости мембраны для ионов натрия и калия (PNa, PK, и Npump), а также проницаемость мембраны для ионов хлора PCl. В результате исследований было установлено, что у крыс из «высокосолевой» группы в главных клетках OMCD отсутствует активность котранспортеров NKCC и KCC в изотонических условиях. Проницаемость плазматической мембраны для ионов хлора PCl, отношения параметров проницаемости мембраны PNa/PK и Npump/PK, клеточный объем, внутриклеточные концентрации ионов и трансмембранная разность потенциалов не отличались от значений соответствующих характеристик для клеток из контрольной группы. Оценка абсолютных значений параметров проницаемости для ионов натрия и калия (PNa, PK, и Npump) показала, что проницаемости по натрию и калию в клетках из «высокосолевой» группы снижены более чем в 3 раза по сравнению с контрольными клетками. Были получены следующие количественные оценки: PNa=8.1×10-7 см/с; PK=3.0×10-6 см/с; Npump=8.1×10-13 моль/см2. Данным значениям параметров проницаемости мембраны соответствовали трансмембранные ионные потоки ионов JNa = 1.98×10-10 моль/см2×с, JK = – 1.32×10-10 моль/см2×с, Jpump = 6.60×10-11 моль/см2×с. Таким образом, было показано, что повышенное потребление NaCl животными вызывает снижение проницаемости мембраны и трансцеллюлярного потока не только ионов Na+, но и ионов K+. Выполненная работа позволила выявить возможный механизм адаптации главных клеток к переносу как малых, так и больших количеств ионов Na+ и K+, в основе которого может лежать изменение статуса ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и 11 изменение активности и содержания эпителиального натриевого канала ENaC и Na/K-АТФазы в плазматической мембране (Canessa, Schafer, 1992; Loffing et al., 2000; Bugaj et al., 2009; Schild, 2010; Mamenko et al., 2012; Sun et al., 2012). Исследование влияния гипотонической среды на параметры проницаемости мембраны и интенсивности трансмембранного транспорта в главных клетках (OMCD) крыс Для сохранения жизнеспособности и целостности в условиях гипоосмотической среды клетки обладают набором механизмов для регуляторного снижения объема (RVD). Исследование влияния гипотонической среды на параметры проницаемости мембраны и интенсивности трансмембранного транспорта в главных клетках (OMCD) крыс проводили с использованием созданной модели мембранного транспорта. С помощью модели проводился анализ экспериментальных результатов по динамике клеточного объема, чтобы оценить степень изменения водной и ионной проницаемости при действии на клетку среды с пониженным осмотическим давлением. Экспериментально было показано, что гипоосмотический шок сопровождался резким увеличением объема клеток, за которым следовало регуляторное снижение объема (RVD) (Рис. 4). Снижение объема в гипотонической среде обусловлено потерей клеткой части осмотически активных веществ, поэтому при возвращении в изотоническую среду после шока устанавливающийся равновесный объем составлял около 50% от исходного. 280 мОсмоль/кгH2O 140 мОсмоль/кгH2O 280 мОсмоль/кгH2O Относительный объем V/V0 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0 5 10 15 20 25 30 Рис. 4. Изменение относительного объема V/V0 главных клеток собирательных трубок почки при воздействии гипотонического шока. Усредненная экспериментальная запись флуоресценции Calcein (n=6) с указанием стандартной ошибки (SE). Верхняя шкала отражает изменение осмоляльности омывающего раствора (мОсмоль/кгH2O). Время, секунды Модель позволила получить оценку изменения водной проницаемости мембраны клетки при действии гипотонической среды. Моделирование гипотонического шока производилось путем изменения параметров, описывающих состав внеклеточной среды. Параметр водной проницаемости Pw подбирался вручную для достижения максимального соответствия между экспериментально полученной и рассчитанной по модели динамикой объема клетки. Таким образом, были установлены следующие значения водной проницаемости: до воздействия гипотонического шока: Pw = 2.0×10-1 см/c; после воздействия гипотонического шока: Pw = 2.0×10-2 см/с. Снижение водной проницаемости мембраны клеток хорошо согласуется с ранее опубликованными данными об уменьшении 12 количества AQP2 в мембране клетки при действии гипотонической среды (Tamma, Procino et al. 2007). Реакция RVD осуществляется благодаря выходу из клетки осмолитов, по мнению многих авторов, K+, Сl- и ряда органических анионов (Lang et al., 1998; Strange, 2004; Hoffmann et al., 2009). В соответствии с этим реакция RVD моделировалась путем повышения параметров проницаемости мембраны для ионов K+, Cl- и органических анионов (PK, PCl и PX). В качестве сигнала к запуску процесса RVD выступало превышение относительного объема клетки над первоначальным уровнем в изотонической среде (V/V0>1.0). Моделирование реакции RVD позволило произвести количественную оценку вклада различных механизмов трансмембранного транспорта в общий поток осмолитов в процессе RVD. Было установлено, что потоки JK и JX могут играть главную роль в реакции RVD. Кроме того, моделирование показало, что эффективное снижение объема клетки в гипотонической среде возможно только в случае активации потока органических анионов из клетки (PX≠0) вместе с повышением проницаемости мембраны для неорганических анионов PK и PCl (Рис. 5). Этот вывод хорошо согласуется с данными об уменьшении содержания органических осмолитов, таких как таурин, глицерилфосфорилхолин, сорбитол, мио-инозитол и бетаин, в клетках IMCD в гипотонических условиях (Ruhfus et al., 1998; Grunewald, Kinne, 1999). 140 мМ 280 мМ Относительный объем V/V0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0 5 10 15 Рис. 5. Моделирование реакции RVD. Динамика относительного PK + PCl объема модельной клетки. PX Сплошная линия – RVD за счет PX + PK +PCl увеличения параметров PK, PCl и PX; штриховая линия – RVD за счет увеличения параметра PX; пунктирная линия – RVD за счет увеличения параметров PK и PCl. Верхняя шкала отражает изменение суммарной внеклеточной концентрации ионов (мМ). 30 280 мМ 2.0 20 25 Время, секунды 13 1. 2. 3. 4. 5. 6. ВЫВОДЫ Создана математическая модель мембранного транспорта главной клетки собирательной трубки почки, адаптированная для анализа экспериментальных данных по динамике клеточного объема и внутриклеточных концентраций осмолитов. Экспериментально показано, что в главных клетках OMCD вклад калийхлоридных и натрий-калий-двухлоридных котранспортеров в общий трансмембранный поток электролитов незначителен, поскольку влияние блокаторов котранспортеров на клеточный объем в изотонических условиях не превышает 1%. С помощью созданной модели мембранного транспорта главных клеток OMCD произведена количественная оценка проницаемостей плазматической мембраны для ионов натрия, калия и хлора, определяющих водноэлектролитный гомеостаз данных клеток. Показано, что хроническая солевая нагрузка приводит к более чем трехкратному снижению проницаемости плазматической мембраны главных клеток OMCD для ионов натрия и калия, не оказывая влияния на величину внутриклеточных концентраций ионов, стационарного объема клетки и трансмембранной разности электрических потенциалов. Математическое моделирование реакции главных клеток собирательных трубок почки на гипотонический шок позволило установить, что водная проницаемость плазматической мембраны данных клеток снижается на порядок в ответ на двукратное понижение осмотического давления среды. Установлено, что главные клетки OMCD обладают эффективным механизмом регуляции клеточного объема в среде с пониженным осмотическим давлением. Математическое моделирование реакции регуляторного снижения объема главных клеток OMCD показало, что потоки ионов калия и органических анионов из клетки играют главную роль в восстановлении клеточного объема после набухания в гипотонической среде. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Соленов Е.И., Батурина Г.С., Иляскин А.В., Каткова Л.Е., Иванова Л.Н. Регуляция объема клеток эпителия собирательных трубок почки крысы в гипотонической среде // Доклады Академии Наук. 2011. Т. 436, № 1, С. 13-15. 2. Соленов Е.И., Иляскин А.В., Батурина Г.С., Медведев Д.А., Ершов А.П., Карпов Д.И. Математическая модель регуляции клеточного объема в гипотонической среде // Доклады Академии Наук. 2011. Т. 437, № 3, С. 79-81. 3. Иляскин А.В., Батурина Г.С., Медведев Д.А., Ершов А.П., Соленов Е.И. Исследование реакции главных клеток собирательных трубок почки на гипотонический шок. Эксперимент и математическое моделирование // Биофизика. 2011. Т. 56, №3, С. 550-560. 4. Иляскин А.В., Батурина Г.С., Каткова Л.Е., Соленов Е.И. Клатрин-зависимый эндоцитоз в механизме антидиуретического действия вазопрессина // Биологические мембраны. 2013. Т. 30, № 1, С. 3-13. 5. Иляскин А.В. Процессы трансмембранного переноса, протекающие при действии на клетку гипотонической среды // Материалы XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научнотехнический прогресс». Новосибирск, 11-15 апреля 2009. С. 26. 14 6. Соленов Е.И., Батурина Г.С., Иляскин А.В., Каткова Л.Е. Регуляция водной проницаемости главных клеток собирательных трубок почки в условиях гипоосмотического шока // Тезисы докладов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2-4 июня 2009. С. 496498. 7. Иляскин А.В., Батурина Г.С., Каткова Л.Е., Соленов Е.И. Исследование механизмов регуляции объема главных клеток эпителия собирательных трубок почки // Тезисы докладов Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2-4 июня 2009. С. 221-223. 8. Батурина Г.С., Иляскин А.В., Соленов Е.И. Регуляция водной проницаемости главных клеток собирательных трубок почки в условиях водного диуреза // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160летию со дня рождения И.П. Павлова. Санкт-Петербург, 29 сентября-2 октября 2009. С. 48-49. 9. Иляскин А.В., Батурина Г.С., Соленов Е.И. Исследование реакции клеток эпителия собирательных трубок почки на гипотонический шок // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160летию со дня рождения И.П. Павлова. Санкт-Петербург, 29 сентября-2 октября 2009. С. 178-179. 10. Иляскин А.В. Математическое моделирование регуляции клеточного объема при гипотоническом шоке // Материалы XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 10-14 апреля 2010. С. 9. 11. Baturina G.S., Katkova L.E., Ilyaskin A.V., Solenov E.I. Regulatory volume decrease. Role of water channels // The seventh international conference on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology. Novosibirsk, 2027 June 2010. P. 39. 12. Ilyaskin A.V., Medvedev D.A., Ershov A.P., Baturina G.S., Solenov E.I. Mathematical model of cell volume regulation in response to hypotonic shock // The seventh international conference on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology. Novosibirsk, 20-27 June 2010. P. 112. 13. Solenov E.I., Ershov A.P., Medvedev D.A., Karpov D.I., Ilyaskin A.V., Baturina G.S. Functional approach for modeling of cell volume regulation in hypotonic medium (RVD) // The seventh international conference on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology. Novosibirsk, 20-27 June 2010. P. 276. 14. Иляскин А.В., Батурина Г.С., Медведев Д.А., Ершов А.П., Карпов Д.И., Соленов Е.И. Экспериментально-теоретический подход к исследованию регуляции клеточного объема // Тезисы докладов I международной научнопрактической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Санкт-Петербург, 23-26 ноября 2010. С. 49-50. 15. Ilyaskin A.V., Baturina G.S., Solenov E.I., Ershov A.P., Medvedev D.A., Karpov D.I., Mathematical model of the regulatory cell volume decrease // Biophysical Journal. 2011. V. 100, №3 (supp.1), P. 132a-133a. 16. Иляскин А.В., Каткова Л.Е., Батурина Г.С., Медведев Д.А., Ершов А.П., Карпов Д.И., Соленов Е.И. Исследование транспорта Na+ через мембрану 15 клетки с помощью математического моделирования // Тезисы докладов международной конференции, посвященная 100-летию А.А. Ляпунова «Современные проблемы математики, информатики и биоинформатики». Новосибирск, 11-14 октября 2011. С. 54-55. 17. Батурина Г.С., Иляскин А.В., Каткова Л.Е., Соленов Е.И. Исследование механизмов регуляции объема клеток собирательных трубок почки при действии гипотонической среды // Научные труды докладов III съезда физиологов СНГ. Ялта, Украина, 1-6 октября 2011. С. 77. 18. Иляскин А.В., Карпов Д.И., Ершов А.П., Медведев Д.А., Соленов Е.И. Количественный анализ трансмембранных ионных потоков в главных клетках собирательных трубок почки // Материалы VII Сибирского съезда физиологов. Красноярск, 27-29 июня 2012. С. 202-203. 19. Иляскин А.В., Карпов Д.И., Ершов А.П., Медведев Д.А., Соленов Е.И. Применение математического моделирования для анализа экспериментальных данных по водно-электролитному обмену клетки // IV Съезд биофизиков России. Нижний Новгород, 20-26 августа 2012. C. 123. 20. Ilyaskin A.V., Karpov D.I., Medvedev D.A., Ershov A.P., Baturina G.S., Katkova L.E., Solenov E.I., Application of mathematical modeling for analysis of experimental data on cell water-electrolyte balance // Biophysical Journal. 2013. V. 104, №2 (supp.1), P. 287a. Благодарности. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам лаборатории физиологической генетики ИЦиГ СО РАН, сектора молекулярной физиологии клетки и лично научному руководителю Соленову Е.И. за помощь, оказанную на всех этапах выполенения работы. Автор благодарит Карпова Д.И., Медведева Д.А. и Ершова А.П., сотрудников Института гидродинамики им. Лаврентьева СО РАН, за помощь в создании математической модели. Кроме того, автор хотел бы поблагодарить Подколодного Н.Л. за помощь в предоставлении доступа к вычислительным мощностям СО РАН, Иванову Л.Н., Рубцова Н.Б. и Колчанова Н.А. за сотрудничество и всестороннюю помощь в подготовке диссертации, Лихошвая В.А. и Амстиславского С.Я. за ценные критические замечания и помощь в создании текста диссертации, а также Кондрину Л.П., Шумную Л.В. и Хлебодарову Т.М. за помощь в оформлении документов. 16