2.Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ).
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА г.СЕМЕЙ Документ СМК 3 УМКД УМКД 042-18-9.1.62/03-2014 уровня УМКД Учебно-методические Редакция №2 материалы по от 11.09.2014г дисциплине «Основы взамен редакции биотехнологии» №1 от 18.09.2013 г. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ «Основы биотехнологии» для специальности «5В070100» - «Биотехнология» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Семей 2014 Содержание 1 2 3 4 Глосарий Лекции Практические занятия Самостоятельная работа студента 2 3 25 30 Лекция № 1 Предмет биотехнологии, задачи, методы и перспективы развития 1.Предмет биотехнологии. 2. Методы и перспективы развития. 3. Этапы развития биотехнологии Основой, обеспечивающей благоприятную ситуацию для бурного развития биотехнологии, явились революционизирующие открытия и разработки: • доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации в биологических системах (имеются в виду индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции); • расшифровка универсального для всех живых организмов генетического кода; • раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе жизни одного поколения организмов; • совершенствование существовавших и разработка новых технологий культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных; • как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание (возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной инженерии, с помощью которых искусственно создаются новые высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в промышленных масштабах. Абсолютно новым направлением является так называемая инженерная энзимология, возникшая вследствие развития современных методов изучения структуры и синтеза белков-ферментов и выяснения механизмов функционирования и регуляции активности этих соединений (важных элементов клетки). Достижения в этой области позволяют направленно модифицировать белки различной сложности и специфичности функционирования, разрабатывать создание мощных катализаторов промышленно ценных реакций с помощью высоко стабилизированных иммобилизованных ферментов. Термин «биотехнология» был введен в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология – это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». Приведенная на рис. 1 схема иллюстрирует биотехнологический процесс. Рис. 1. Основные этапы биотехнологического процесса. Термин был введен Карлом Эреки и относился к крупномасштабному получению свинины (конечный продукт) с использованием дешевой сахарной свеклы (сырье) в качестве корма для свиней (биотрансформация) Однако этот термин в те годы не получил широкого распространения. Только в 1961 г. к нему вновь вернулись после того как шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного (Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на (Биотехнология и биоинженерия). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов». Понятие биотехнология может быть представлено многими определениями: • использование биологических объектов, систем или процессов для производства необходимых продуктов или для нужд сервисной индустрии; • комплексное применение биохимических, микробиологических и инженерных знаний с целью промышленного использования потенциальных возможностей микроорганизмов, культур клеток и отдельных их компонентов или систем; • технологическое использование биологических явлений для воспроизводства и получения (изготовления) различных типов полезных продуктов; • приложение научных и инженерных принципов для обработки материалов биологическими агентами с целью получения необходимых продуктов или создания сервисных технологий. Биотехнология на самом деле не что иное, как название, данное набору технических приемов (подходов) и процессов, основанных на использовании для этих целей биологических объектов. Термин биотехнология включает составляющие «биос», «техне», «логос» греческого происхождения (от греч. «биос» – жизнь, «техне» – искусство, мастерство, умение и «логос» – понятие, учение). Таким образом, как это явствует из приведенных определений, биотехнология по существу сводится к использованию микроорганизмов, животных и растительных клеток или же их ферментов для синтеза, разрушения или трансформации (превращения) различных материалов с целью получения полезных продуктов для различных нужд человека. Биотехнологические направления имеют своей целью создание и практическое внедрение (т. е. практическое использование): • новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний; • биологических средств защиты сельскохозяйственных растений от возбудителей заболеваний и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений и животных; новых сортов растений, устойчивых к разного рода неблагоприятным воздействиям (факторам внешней среды); новых пород животных с полезными свойствами (трансгенные животные); • ценных кормовых добавок для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, витаминов, ферментов, способствующих повышению усвояемости кормов, и т. п.); • новых биоинженерных методов для получения высокоэффективных препаратов различного назначения, используемых в сельском хозяйстве и ветеринарии; • новых технологий создания и получения хозяйственно ценных продуктов для пищевой, химической и микробиологической промышленности; • эффективных технологий переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека (например, биогаза, удобрений, топлива для автомобилей и т. п.). Биотехнология – междисциплинарная область научно-технического прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технических знаний и призванная к созданию новых биотехнологических процессов, которые в большинстве случаев будут осуществляться при низких температурах, требовать небольшого (меньшего) количества энергии и будут базироваться преимущественно на дешевых субстратах, используемых в качестве первичного сырья. Однако следует отдавать себе отчет в том, что биотехнология не является чем-то новым, ранее не известным, а представляет собой развитие и расширение набора технологических приемов, корни которых появились тысячи лет тому назад. Биотехнология включает многие традиционные процессы, давно известные и давно используемые человеком. Это пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть даже без достаточных знаний о них) и все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков и он продолжался примерно до конца XIX в. Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822-1895) заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях (пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии, в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были разработаны стерильные процессы производства путем ферментации ацетона, глицерина. Интенсивно изучаются основные группы микроорганизмов - возбудителей процессов брожения, исследуются биохимические особенности данных процессов. После открытия Александром Флемингом пенициллина разрабатываются процессы и аппараты для глубинного культивирования продуцентов, что резко удешевило производство данного антибиотика, и он стал доступным для широкого использования в клинической практике во время второй мировой войны. После войны быстрыми темпами развивались процессы ферментации для производства антибиотиков, стероидных гормонов, а в 1961 г. возник журнал «Биотехнология и биоинженерия» и снова термин «биотехнология» стал применяться для обозначения процессов, которые относили к области промышленной микробиологии. Однако термин «биотехнология» в большей степени стал ассоциироваться с новым этапом развития этой науки, начало которому положено в 1973 г., когда Стэнли Коэн и Герберт Бойер получили рекомбинантные плазмиды и произвели трансформацию ими клеток E.coli. В течение четырех лет после открытия рекомбинантных ДНК-технологий появились штаммы бактерий, продуцирующие инсулин и человеческий гормон роста. Это привело к притоку инвестиций в новые компании. В настоящее время в США только микробная (основанная на культивировании генетически модифицированных микроорганизмов) биотехнология представлена 1300 компаниями, насчитывающими 153 000 служащих, с годовым доходом 19,6 млрд долл. и с продажами 13,4 млрд долл. В Канаде 282 компании с годовым доходом 1,1 млрд долл., В Японии с годовым доходом 10,0 млрд долл., в Европе 1178 компаний (45 000 служащих) с годовым доходом 3,7 млрд долл. Основные продукты, получаемые с помощью микроорганизмов и рекомбинантных ДНК-технологий – животные пептиды, такие как гормоны, факторы роста, ферменты, антитела и биологические модификаторы иммунного ответа. По приблизительной оценке, общемировая рыночная стоимость растениеводческой продукции, полученной на основании ДНК-технологий, достигнет к 2010 г. 30–40 млрд. долларов. Мировой рынок биотехнологической продукции составляет ежегодно около 150 млрд. долл. Во многих странах мира приняты национальные программы по биотехнологии. Так, например, в США ежегодные затраты на биотехнологию составляют 2-3 млрд. долл. В Германии на 2001 год выделено около 2 млрд. марок на новую программу по биотехнологии. В табл. 1 приведены основные факты, характеризующие развитие биотехнологии. Биотехнология применяет методы, заимствованные из химии, микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, химической технологии и компьютерной техники с целью создания новых разработок, развития и оптимального использования процессов, в которых каталитические реакции играют фундаментальную и незаменимую роль. Ни для кого уже не является секретом, что ископаемое топливо (хотя и добываемое в настоящее время с большим избытком), а также другие не восполняемые ресурсы, в один прекрасный день станут крайне ограниченными. И совершенно естественно, что данное обстоятельство уже сейчас заставляет искать новые, более дешевые и лучше сохраняемые источники энергии и питания, которые могли бы восполняться биотехнологическим путем. В этой ситуации страны с климатом, позволяющим ежегодно производить большие количества биомассы, будут находиться в более выгодных условиях по сравнению со странами с менее благоприятными климатическими условиями. В частности, тропические области земного шара в этом отношении имеют существенное преимущество над другими регионами. Следующим фактором, способствующим росту интереса к биотехнологии, является современный мировой спад в химических и инженерных направлениях, обусловленный частичным истощением источников энергии. В силу этого биотехнология рассматривается в качестве одного из важнейших средств рестимуляции (обновления) экономики на основе новых методов, новой технологии и новых сырьевых материалов. Существенным моментом первого компонента биотехнологии является селекция и улучшение объекта с помощью различных генетических методов, а в последнее время с использованием высокоэффективных приемов молекулярной биологии, которые, как уже упоминалось, способны обеспечить конструирование организмов с новыми биохимическими возможностями. Второй компонент биотехнологии связан с изготовлением систем, обеспечивающих оптимальное функционирование организмов-продуцентов или чистых ферментов. Сюда относятся специальные знания о химии процессов, а также сведения об инженерном обеспечении конструирования и изготовления этих систем. Наконец, третий компонент представляет собой довольно сложную и дорогую процедуру биотехнологического процесса - выделение и очистку целевого продукта. Этот компонент существенно увеличивает стоимость всего процесса и может составлять до 70% стоимости готового коммерческого препарата. Многоэтапность биотехнологических процессов определяет необходимость привлечения к их осуществлению специалистов самого различного профиля: генетиков и молекулярных биологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов и клеточных физиологов, инженеров-технологов, конструкторов биотехнологического оборудования и т. п. Лекция № 2 Подготовка и стерилизация питательных сред для биотехнологических производств. 1. Характеристика и выбор сырья для производства. 2. Стерилизация питательной среды и ее виды. 3. Подготовка воздуха для биотехнологических производств В статьях расходов на производство продуктов микробного синтеза одно из первых мест занимает сырье. При производстве 1*109 ЕД пенициллина, например, необходимо израсходовать примерно 6,5 кг углеводсодержащего сырья. Для проведения ферментационных процессов, наряду с очень дорогим пищевым сырьем, таким как мука кукурузная, соевая, пшеничная, крахмал, пищевой сахар, глюкоза, лактоза, растительные масла, применяют и значительно более дешевые, являющиеся отходами пищевой промышленности - гидрол, меласса, зеленая патока, молочная сыворотка, кукурузный экстракт, рыбно-костная мука, гидролизаты кукурузных кочерыжек, соломы, подсолнечной мезги, а также специально получаемые продукты - гидролизаты древесины и торфа, парафины нефти, метан, этанол и др. Выбор сырья определяется обычно двумя основными факторами: 1.Особенностями культивирования того или иного продуцента. Например, дрожжи прекрасно растут на питательной среде содержащей один основной компонент (углевод, углеводород, спирт) и минимальное количество ростовых факторов (витамины, микроэлементы). Культуры растительных и животных клеток, некоторые микроорганизмы требуют наличия в питательной среде десятков, а иногда и сотен компонентов, часто весьма экзотических (экстракты из эмбрионов животных, компоненты кровяной плазмы и т.д.). 2. Потребительской стоимостью и себестоимостью целевого продукта. Если речь идет о ценном лекарственном препарате со стоимостью в десятки долларов за грамм и выше, остро необходимом, то стоимость сырья не имеет решающего значения. Если речь идет о крупнотоннажном производстве дешевых продуктов (этанол, глицерин, органические кислоты, витамины и др.), то стоимость сырья играет зачастую решающую роль в рентабельность того или иного производства. Так в начале 50-ых годов ХХ века во всех странах были закрыты предприятия по микробиологическому производству глицерина, ацетона и бутанола т.к. они не смогли конкурировать с производством аналогичных продуктов из нефтяного сырья химическим путем. Единственной страной, где эти производства функционировали до конца 80-ых годов ХХ века была ЮАР, которая имела высокоразвитое сельское хозяйство, но не имела собственных месторождений нефти и не могла покупать нефть на мировом рынке из-за режима санкций, которые были наложены на нее по решению ООН. Растительная биомасса представляет собой достаточно хорошо утилизируемые источники углерода для биотехнологических целей. На основе этих источников основано давно существующее производство алкоголя из зерна и крахмалсодержащих корнеплодов. Растительные источники могут рассматриваться как практически неистощимые. Первичная продукция фотосинтеза (рост растений за счет использования солнечной энергии) на земле обеспечивает 2×1011 т вещества (биомассы) в год в пересчете на сухой вес! Наибольшая доля биомассы (около 44 %) образуется в виде древесины. Вызывает удивление факт, что продукция сельского хозяйства составляет лишь 6 % первичной продукции за счет фотосинтеза, хотя именно из этого количества получается основная часть пищи для людей и животных, а также многие необходимые материалы (например, для текстильной и бумажной промышленности). Наиболее подходящим и доступным, чтобы служить питательным субстратом для биотехнологических процессов, является сырье, используемое в производстве сахара – сахарная свекла и сахарный тростник. Однако в настоящее время в мире традиционное использование сахара постепенно снижается, и он заменяется более эффективными подсластителями. Складывающаяся ситуация на мировом сахарном рынке будет способствовать поискам его нового применения, так как многие страны тропических областей испытают существенные экономические трудности, если исчезнет сахарный рынок. Уже сейчас сахарный тростник используется в качестве субстрата для бразильской «топливной» программы (производство этанола как горючего для двигателей внутреннего сгорания и в первую очередь для автомобилей, поскольку они меньше загрязняют атмосферу). Бразильский пример быстро убеждает многие другие страны в перспективности такой новой технологии. Существенную значимость представляют крахмалосодержащие сельскохозяйственные продукты, включающие различные злаки, такие, как кукуруза, рис, пшеница, картофель, различные корнеплоды, сладкий картофель и маниока. Некоторым недостатком крахмала является то, что до использования в качестве питательного субстрата он обычно должен быть разрушен до моносахаридов или олигосахаридов путем ферментативного или химического гидролиза. Тем не менее, в настоящее время с определенным успехом разрабатываются перспективные биотехнологические процессы, основанные на использовании данного полисахарида. Половину сухой растительной биомассы как сельскохозяйственного, так и «лесного» происхождения составляет один из самых распространенных биополимеров – полисахарид целлюлоза, являющийся ценным источником энергии и углерода. Почти не вызывает ни у кого сомнения, что целлюлоза должна рассматриваться в качестве основного питательного сырья для биотехнологических процессов. Однако необходимым условием подготовки данного материала к использованию в качестве биотехнологического сырья является ее гидролиз до простых водорастворимых сахаров (глюкозы, целлобиозы). Как ни странно, но это до сих пор представляет довольно трудную задачу. Дело в том, что сама чистая целлюлоза может быть довольно легко разрушена путем химического или ферментативного гидролиза до растворимых сахаров, которые затем легко подвергаются ферментации (сбраживанию) микроорганизмами с образованием этанола, бутанола, ацетона, одноклеточного белка (SCP), метана и многих других продуктов. За год в процессе фотосинтеза на Земле образуется 22 миллиарда тонн целлюлозы, или 24 тонны на человека. Таким образом, целлюлоза может служить неисчерпаемым источником технической глюкозы. Однако практически во всех растениях целлюлоза находится в виде комплекса с гемицеллюлозой и лигнином, что и обеспечивает твердость древесины. Если гемицеллюлоза, состоящая в основном из моносахарида ксилозы с примесью арабинозы и глюкоуроновой кислоты легко подвергается гидролизу и то же может служить источником моносахаридов (отходы целлюлозно-бумажной промышленности), то лигнин, представляющий собой биополимер нерегулярного, трудно определяемого состава, состоящий из молекул многоосновных фенолов с неорганическими включениями, практически не подвержен гидролизу в тех же условиях. Смолообразные продукты, содержащие лигнин и продукты его частичного разложения, загрязняют аппаратуру, забивают трубопроводы, обволакивая частицы целлюлозы тормозят их гидролиз, отравляют растворы моносахаридов. Проблемой очистки от лигнина и его переработки ученые разных стран занимаются уже более ста лет, однако проблема по-прежнему далека от решения. Поэтому растворы моносахаридов, получаемые гидролизом целлюлозосодержащего растительного сырья, даже после сложной, многоступенчатой очистки используют обычно для получения непищевых, технических продуктов (этиловый спирт”гидролизный”“гидрашка”, кормовые дрожжи, органические кислоты). Другим доступным источником углерода и энергии являются некоторые компоненты нефти и газа. Наилучшим субстратом из компонентов нефти являются налканы или парафины (особенно жидкие) с числом углеродных атомов от 10 до 20.. Их могут утилизировать большинство бактерий и дрожжи. Эти соединения являются компонентами фракции дизельного топлива (солярки), получаемой при перегонке нефти. Поскольку н-алканы имеют высокую температуру замерзания, то их присутствие в дизтопливе нежелательно, и для получения топлива высокого качества проводят процесс депарафинизации. Одним из направлений утилизации получаемых н-парафинов может быть использование их в качестве субстрата для микробиологических производств. В 60-80-е годы в странах Запада и в СССР были построены крупнотоннажные производства кормовых дрожжей (белково-витаминных концентратов – БВК). В частности такое производство было организовано на базе Кстовского нефтеперегонного завода. Однако резкое повышение цен на нефть и экологическая опасность (дрожжевой белок оказался сильным аллергеном для человека), привело к повсеместному закрытию этих производств. Имеются производства лимонной и кетоглутаровой кислоты на базе н-алканов. Другими перспективными источниками углеводородсодержащего сырья могут служить синтетический этанол, получаемый каталитической гидратацией этилена (категорически запрещен для использования в пищевых продуктах и лекарствах), синтетический метанол, а так же природный газ, очищенный от органических соединений серы (сульфидов, меркаптанов). Однако и нефть, и газ должны рано или поздно истощится. Поэтому биотехнологии ориентируются на возобновляемые источники сырья. Помимо растительной биомассы другим неисчерпаемым источником дешевого сырья для биотехнологических производств могут служить различные отходы сельского хозяйства (отруби, шелуха семян, жмыхи, кочерыжки, кукурузные початки и др.), пищевой промышленности (меласса-маточник после кристаллизации упаренного раствора сахара, молочная сыворотка), целлюлозно-бумажного производства (варочные щелока, получаемые при термической обработке древесины слабыми растворами сернистой и серной кислот). Даже некоторые отходы одних биотехнологических производств могут служить прекрасным сырьем для других. Так спиртовая барда, остающаяся после отгонки спирта из бражки используется для микробиологического производства некоторых витаминов (В12). Приготовление питательных сред для ферментационных процессов обычно рассматривается как мало интересная часть общей задачи, но фактически оно является краеугольным камнем, обеспечивающим успех всех последующих этапов. Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта. Поэтому рассмотрим основные моменты, связанные с этим процессом. Жидкие компоненты питательных сред (кукурузный экстракт, патоку, мелассу, гидрол, растительные масла, рыбий жир) доставляют на производство в железнодорожных цистернах и хранят в специальных сборниках на складах заводов и транспортируют по коммуникациям с помощью вакуума, сжатого воздуха или перекачивают насосами. Дозировку жидких компонентов осуществляют по массе или по объему в соответствии с прописью среды и контрольными показателями каждой партии этого нестандартного вида сырья. Сыпучие компоненты сред из транспортной тары забирают или в специальные бункеры или хранят на складах в исходной упаковке. Для транспортировки сыпучих компонентов используют ленточные и винтовые конвейеры, элеваторы, пневматический транспорт. Жидкие питательные среды приготовляют в аппаратах-смесителях с мешалкой, куда загружают отдельные компоненты в определенной последо-вательности, установленной по регламенту. Приготовление сложных комплексных сред, в состав которых, кроме минеральных компонентов и сахаров, входит мука, крахмал, кукурузный экстракт, проводят в нескольких смесителях. Кукурузный экстракт обычно кипятят с мелом для нейтрализации содержащихся в нем аминокислот и органических кислот. Муку, крахмал предварительно заваривают и тщательно перемешивают, чтобы не допустить образования крупных комков, которые могут быть причиной нестерильных операций, поэтому реакторы должны быть снабжены барботерами для подачи пара. Часто для снижения вязкости питательной среды, содержащей достаточно большую концентрацию кукурузной муки или крахмала проводят их частичный гидролиз амилолитическим ферментом - оризином (продуцент - Aspergillus oryzae) с последующей его инактивавацией нагреванием. В связи с тем, что в большинстве своем питательные среды имеют жидкую и твердую фазы, возникает необходимость тонкого измельчения твердых компонентов отрубей, муки грубого помола, рыбно-костной муки, соевого жмыха. В этих целях с большой эффективностью используют роторно-пульсационный аппарат, через который пропускают суспензию компонента перед завариванием или после него. Благодаря этой процедуре не только избавляются от комков, образовавшихся при заваривании, но и повышают степень использования сырья, равно как и получают возможность применять отдельные виды сырья (например, среды рыбно-костной мукой, плохо поддающиеся стерилизации из-за большого количества рыбьих глаз). Растворы сахаров, нуждающиеся в более щадящих режимах стерилизации, рекомендуют готовить и стерилизовать отдельно, смешивая с основной средой только в ферментаторе. Некоторые виды сырья, например, соевая мука, вызывают повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенообразования при стерилизации в такие среды добавляют жир в качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает (устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стерилизовать отдельно. Для этого, как правило, предварительно готовят водно-масляную или водно-жировую эмульсию с хозяйственным мылом, повышающим ее стойкость. Качество используемой воды зависит от назначения питательной среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже - водопроводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезаменителей используют только апирогенную воду (бидистиллят). Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление из них микробов - контаминантов или разрушение (гибель) последних. Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. Клетки микроорганизмов, а так же их споры более чувствительны к тепловому воздействию, чем большинство химических веществ, используемых в питательных средах. На практике главная цель стерилизации - достижение стерильности, при сохранении качества питательной среды. Длительность экспозиции, или время выдержки - это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы, но сохраняется качество питательной среды.. Тепловую стерилизацию сред (по способу ее проведения) подразделяют на периодическую и непрерывную. При периодическом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды протекают последовательно во времени в одном аппарате. Это может быть ферментер, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагревают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Сам процесс нагрева осуществляют либо путем прямого введения (инжекции) струи перегретого пара с температурой до 1300С в питательную среду, либо подачей пара в тепловую рубашку аппарата. Метод отличается простотой и надежностью, однако имеет и свои недостатки. 1. В частности, ухудшается качество питательной среды из-за длительного воздействия высокой температуры, при этом происходит карамелизация сахаров (образование ангидридов сахаров), деструкция витаминов; излишне длительный нагрев приводит не только к разрушению питательных веществ, но и к образованию в среде потенциальных ингибиторов процесса ферментации, таких как аминосахара. 2. Второй недостаток связан с тем, что повышенный расход пара происходит периодически, что обусловливает неравномерность работы котельной. 3. Если процесс стерилизации питательной среды осуществляется непосредственно в ферментере, то значительно увеличивается время простоя аппарата. 4. Получение большого количества пара является весьма затратным процессом. Одним из способов уменьшения затрат могла бы быть частичная регенерация тепла, выделяющегося при остывании простерилизованной питательной среды. Это тепло можно использовать для получения горячей воды и использовать для бытовых и технологических нужд. Однако в периодическом режиме это сделать сложно и неудобно. 5. Последний, пятый, недостаток касается трудности автоматизации процесса периодической стерилизации по сравнению с непрерывным. При непрерывном способе стерилизации каждый элементарный процесс нагрев, выдержка, охлаждение осуществляется в специально предназначенных для этого апаратах: нагревателе, выдерживателе, теплообменнике, которые составляют систему аппаратов для непрерывной стерилизации - установку непрерывной стерилизации (УНС). Непрерывная стерилизация имеет следующие преимущества по сравнению с периодической: 1) при непрерывном методе стерилизации каждый элементарный объем среды (бесконечно малый объем, содержащий спору) находится при более высокой температуре более короткое время; 2) благодаря более высоким температурам стерилизации и короткой экспозиции (выдерживании) деструкция компонентов питательной cpеды минимальна; 3) процесс стерилизации всего объема питательной сред растянут во времени, этим обеспечивается более равномерная загрузка котельной; 4) процесс легко контролируем и управляем; 5) отработанное тепло выделяется постоянно и равномерно, что обеспечивает возможность его использования для получения горячей воды. Непрерывное нагревание среды может быть осуществлено без прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике, который встроен в стерилизатор или стоит перед ним. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым введением (инжектированием) перегретого пара (100-1400С), полученного в паровых контактных нагревателях. Для стерилизации небольших объемов растворов используют фильтрование через специальные фильтры-мембраны, задерживающие бактериальные клетки, а иногда и вирусы. Обычно этот способ используют для стерилизации растворов веществ, неустойчивых к нагреванию, а так же конечных продуктов (например лекарственных веществ белковой природы). Твердые сыпучие среды, используемые для поверхностного способа культивирования, стерилизуют паром, иногда инфракрасными и γ-лучами. Стерилизация твердых питательных сред водяным паром сопровождается, как правило, комкованием частиц среды. Поскольку компоненты твердых питательных сред (жмыхи, шелуха семян, опилки) обладают низким коэффициентом теплопроводности, то комкование препятствует нормальному течению процесса стерилизации, особенно в глубине комков. Для достижения необходимого эффекта обычно используют перегретый (острый) пар (до 140 0 С), однако это не обеспечивает абсолютной стерильности Однако он вполне достаточен для проведения многих процессов, таких как получение ферментов или органических кислот. Подготовка воздуха для биотехнологических производств Одной из важных задач биотехнологии является получение большого количества стерильного воздуха. В наибольших масштабах стерильный воздух применяется в процессах культивирования для аэрации. Его также используют для вентиляции участков цехов так называемой стерильной зоны, где в асептических условиях проводят, например, последние стадии очистки и фасовки готового продукта. В атмосферном воздухе, наряду с инертными газами, азотом, кислородом, диоксидом углерода, содержатся пары воды и мелкодисперсные частицы. В состав дисперсных частиц, наряду с частицами пыли, копоти, входят клетки и споры микроорганизмов как в свободном, так и в сорбированном на пылевых частицах виде. Температура и влажность наружного воздуха, количество в нем пылинок и микроорганизмов непостоянны и зависят от времен года (микроорганизмов летом в 10 раз больше, чем зимой), погодных условий - наибольшее количество пыли и, соответствено микроорганизмов приходится на сухую ветреную погоду, географического расположения предприятия, высоты забора воздуха т. д. Особенно много микробов у поверхности земли, с высотой концентрация их убывает и становится постоянной на уровне около 30 м над землей. Очистку воздуха можно осуществить принципиально разными методами, основаными либо на уничтожении микроорганизмов, либо на удалении их. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха, является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах и технологических помещениях . Отечественным и зарубежным опытом показано, что технически и экономически оправданным в промышленности является способ очистки больших количеств воздуха на фильтрах с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степе чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузионному механизмам осаждения. В общих чертах механизм инерционного осаждения основан на том, что когда воздушный начинает обтекать нить волокна на своем пути, взвешенные в этом потоке частицы движутся по инерции, отклоняются от потока воздуха и осаждаются на волокне. Эффект инерционного осаждения высок на сравнительно грубых волокнах для относительно крупных частиц и высоких скоростей воздуха. Малые частицы способны к броуновскому движению. Движущиеся вблизи волокна частицы диффундируют в случайных направлениях и могут задерживаться на поверхности волокон. Этот эффект осаждения увеличивается с уменьшением диаметра частицы, диаметра волокна и скорости воздуха. Если очищенный воздух используют в процессе поверхностного культивирования то он должен быть дополнительно кондиционирован до необходимой температуры и влажности. Лекция №3 Подготовка и наработка продуцента для биотехнологических производств. 1. Получение накопительных культур. 2. Подготовка продуцентов. 3. Характеристика некоторых видов микроорганизмов. 4.Популяционная устойчивость биологических объектов 1. Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим его сущность, является клетка. Именно в ней синтезируется целевой продукт. По образному выражению Ю. А. Овчинникова (1985), клетка представляет собой миниатюрный химический завод, работающий с колоссальной производительностью, с предельной согласованностью и по заданной программе. В ней ежеминутно синтезируются сотни сложнейших соединений, включая гигантские биополимеры, в первую очередь белки. Основа современного биотехнологического производства — микробиологический синтез, т. е. синтез различных веществ с помощью микроорганизмов. Независимо от природы объекта, начальным этапом биотехнологической разработки является получение чистых культур клеток и тканей (рис. 1). К микроорганизмам относятся все прокариоты — бактерии,, актиномицеты, риккетсии и часть эукариот — дрожжи, нитчатые грибы, простейшие и водоросли. Их общее свойство — малые размеры, вследствие чего они видимы лишь в микроскоп. В настоящее время известно более 100 тыс. различных видов микроорганизмов. При столь большом разнообразии микроорганизмов как провести правильный подбор именно тех форм, продукция которых нас интересует? Для решения подобных задач проводится выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест, где обитание того или иного продуцента наиболее вероятно. Применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам таким местом может быть почва возле бензоколонок, винные дрожжи обильно встречаются на винограде, анаэробные целлюлозоразлагающие и метанобразующие микроорганизмы в больших количествах обитают в рубце жвачных животных. Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального состава. Эти среды называют элективными: в них путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития интересующего нас продуцента. К этим факторам относятся источники энергии, углерода, азота, значения рН, температура, осмотическое давление и т. д. Для накопления продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроорганизмов — среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов — среды, содержащие белки или липиды. Так получают накопительные культуры микроорганизмов. Следующий этап — выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента, состоящие из популяций клеток одного вида. Существует и другой путь подбора микроорганизмов — из имеющихся коллекций микроорганизмов. При этом руководствуются опытом, накопленным в результате изучения физиологии и биохимии различных групп микроорганизмов: продуцентов антибиотиков чаще всего находят среди актиномицетов, внеклеточное выделение гидролитических ферментов характерно для грамположительных бактерий, типичные продуценты этанола — дрожжи и т. д. Способность синтезировать целевой продукт является главным критерием при отборе продуцентов. Однако микробиологическая промышленность предъявляет к продуцентам ряд других требований, важных с точки зрения технологии производства. Микроорганизмы должны: 1) обладать высокой скоростью роста; 2) использовать для жизнедеятельности дешевые непищевые субстраты; 3) быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой. Все это позволяет значительно снизить затраты на производство целевого продукта. 2. Для любого микробиологического производства всегда необходима исходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому, обычно, предприятие один раз в 2-3 месяца получает чистую культуру в количестве 3 пробирок из специальной лаборатории профильной фирмы или НИИ, либо в условиях собственной заводской лаборатории организует ее хранение и контроль микробиологической чистоты используемого штамма. При этом обычно одну пробирку с исходным продуцентом используют на размножение исходного штамма, вторую используют для организации микробиологического контроля за исходным штаммом-продуцентом, третью оставляют в резерве. Объем пробирки и количество клеток микроорганизма в ней ничтожно мало по сравнению с объемом ферментера и поэтому прямой пересев культуры потребует очень длительного времени, пока не будет достигнута необходимая плотность культуры во всем аппарате. С целью сокращения времени на запуск процесса в производственных условиях наработку необходимого количества биомассы осуществляют, как правило, в несколько стадий (не более 4-х) в специальных аппаратах. Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты). Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины-окончания Log-фазы, что позволяет сильно сократить время адаптации клеток (Lag-фазу) при переносе их на питательную среду в производственный ферментер. По своей конструкции и технологической оснастке инокулятор для аэробных микроорганизмов аналогичен основному ферментеру и снабжен системами аэрирования, перемешивания, термостатирования. В инокуляторах, как и в промышленных ферментерах целесообразно поддерживать незначительное избыточное давление воздуха, когда случайные утечки будут происходить только в направлении из системы, а не наоборот, что значительно облегчает поддержание асептических условий. 3.Существуют так называемые олиготрофные микроорганизмы, растущие крайне медленно. Особый интерес как объекты биотехнологических разработок представляют фото синтезирующие микроорганизмы. Они используют в своей жизнедеятельности энергию света, синтезируют разнообразные вещества клеток в результате восстановления углекислоты, сопряженного с окислением воды (цианобактерии и эукариоты), способны к усвоению атмосферного азота (прокариоты), т.е. обходятся самыми дешевыми источниками энергии, углерода, восстановительных эквивалентов и азота. Преимущества фотосинтетиков очевидны перед традиционными в настоящее время объектами биотехнологии — микроорганизмами, энергетические и конструктивные потребности которых обеспечиваются органическими соединениями. Фототрофные микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и различных биопрепаратов. Выгодным объектом для биотехнологии являются термофильные микроорганизмы. Они оптимально растут при высоких температурах (60—80°С, отдельные представители до 110°С и выше, в подводных выбросах сверхгорячих вод на больших океанических глубинах найдены микроорганизмы, способные развиваться под. давлением при температурах до 300°С), что затрудняет развитие посторонней микрофлоры. Среди термофилов обнаружены ценные продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Применение термофилов позволяет снизить затраты на стерилизацию промышленного оборудования^ Кроме того, скорость роста и метаболическая активность у этих организмов в 1,5—2 раза выше, чем у мезофилов (температурный оптимум развития составляет 20—45°С). Ферменты, синтезируемые термофилами, в частности протеазы Thermus caldophilus имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, детергентов, органических растворителей и другим неблагоприятным условиям. В то же время они малоактивны при нормальных температурах. Так, активность протеазы Thermus caldophilus при 20°С почти в 100 раз ниже^ чем при 75°С. Это свойство имеет прикладное значение, например, в пищевой промышленности. И наконец, еще одно преимущество термофилов связано с затратами на охлаждение биореакторов. Поскольку реактор для культивирования термофильных микроорганизмов действует при температурах, значительно превышающих температуру окружающей среды, высокий перепад температур способствует быстрой теплоотдаче. Это позволяет применять биореакторы без громоздких теплообменных устройств и тем самым упростить их конструкцию, облегчая аэрацию, перемешивание и пеногашение. Выделение и подбор объекта — важный этап биотехнологического процесса. Однако путем простого подбора не удается получить высокоактивных продуцентов, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции. С их помощью получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз. 4 Поддержание биообъекта в рабочем состоянии, сохранение его ценных свойств является важной биотехнологической проблемой. Биореактор населен, как правило, огромной популяцией культивируемых микроорганизмов или клеток растений, животных. Численность этой популяции составляет 10'° и более клеток, что в миллионы раз превышает население земного шара. В этих условиях существенную роль играют процессы, основанные на маловероятных генетических событиях. Так, спонтанные мутации, происходящие с низкой частотой (1 мутация на 106—108 клеток), могут привести к быстрому накоплению в биореакторе мутантных форм, особенно в том случае, если такие формы характеризуются большей скоростью роста и повышенной жизнеспособностью по сравнению с исходными формами. Процесс постепенного вытеснения менее приспособленных форм более приспособленными в клеточной популяции носит название автоселекции, т. е. это процесс, протекающий без участия селекционера и часто вопреки его планам. У бактерий показательным примером служит фазовая диссоциация, представляющая собой частый (1 событие на 10 — 103 клеток) взаимопереход трех форм (К, 5 и М). Эти формы различаются по структуре клеточной стенки и капсулы, а также по многим физиолого-биохимическим свойствам и в том числе по способности к синтезу биологически активных веществ. Аналогичные проблемы возникают при культивировании клеток животных и растений вне организма. Изменения признаков клеток в процессе их культивирования, повидимому, обусловлены резкой сменой условий их жизни при переносе из многоклеточного организма в сосуд с питательной средой. Спонтанные процессы мутирования и автоселекции, протекающие в больших клеточных популяциях, могут иметь положительное значение: 1) в производственных процессах, целью которых является получение биомассы; автоселекция ведет к доминированию наиболее жизнеспособных и, как правило, наиболее продуктивных форм; 2) если исследователь сознательно стремится к получению форм, отличающихся от исходного штамма, для последующей селекционной работы. Эти процессы приобретают отрицательное значение, если они связаны с утратой или ослаблением биотехнологически ценных свойств. Обычно получаемые методами генетической и клеточной инженерии штаммы относятся к числу наиболее неустойчивых. Проблема сохранения ценных штаммов-продуцентов приобретает первоочередное значение в двух ситуациях: при их длительном хранении и при переносе этих штаммов из лабораторных культиваторов в промышленные биореакторы (масштабный переход или масштабирование). Традиционные методы поддержания культур микроорганизмов сводятся к их выращиванию на богатых питательных средах с частыми пересевами. При этом создаются благоприятные условия для мутирования и автоселекции, что часто ведет к потере штаммов-продуцентов. Эти методы остаются единственно возможными, если не разработаны более совершенные способы хранения. Накопление в популяции нежелательных мутантов может быть предотвращено, если за каждым пересевом следует скрининг с проверкой функциональной активности клеточных клонов, сохраняющих исходные свойства. К такому пути сохранения ценных свойств клеток прибегают при клонировании гибридом. Длительное хранение клеток без утраты ценных свойств возможно, если резко затормозить все протекающие в них жизненные процессы, в том числе и генетические перестройки. При этом культура переводится в состояние, близкое к обратимой остановке жизни — анабиозу, и существующие методы хранения различаются по степени приближения к этому состоянию. 1. Лиофильное высушивание клеток (обезвоживание под вакуумом после замораживания при температуре —40 Ч-----60°С и ниже). Этот метод хорошо зарекомендовал себя, например, в отношении продуцентов антибиотиков, сохраняющих активность в течение многих лет. Однако лиофилизацию переносят далеко не все биообъекты. Находясь в лиофилизованном состоянии, менее жизнестойкие клетки отмирают, популяция обогащается более жизнеспособными. В этой связи для поддержания активности того -или иного штамма-продуцента необходимо создавать селективные условия, в которых он оказывается более жизнеспособным, чем возникающие при хранении мутанты. 2. Высушивание на воздухе в стерильной почве, песке, на активированном угле, на семенах некоторых растений, на дисках агар-агара, на бумаге, шерстяных нитках и других носителях Этот метод сравнительно прост в обращении, но он в недостаточной степени задерживает происходящие в популяции нежелательные генетические изменения. В последние годы применяют высушивание под вакуумом из жидкого состояния (Ь-высушивание). Некоторые виды микроорганизмов, в том числе плохо переносящие лиофилизацию, сохраняются после такой обработки в жизнеспособном состоянии. Большинство биообъектов, однако, не переносит высушивания и погибает . 3. Сохранение спор (метод пригоден для спорообразующих бактерий). 4. Криоконсервация — глубокое замораживание клеток с их последующим хранением в жидком азоте (—19°С) или его парах (—150°С). Таким путем можно сохранять в течение неопределенно долгого времени объекты, не выдерживающие другие методы хранения,— цианобактерии, пурпурные и зеленые бактерии, мицелиальные грибы, актиномицеты, простейшие, водоросли, культуры растительных и животных клеток, гибридомы, генноин-женерные мутанты . Создаются коллекции ценных организмов в глубоко замороженном состоянии — крио-банки. Криоконсервация практически полностью (если исключить влияние космической ионизирующей радиации) предотвращает «порчу» генного фонда популяций клеток, реализуя наиболее полно состояние анабиоза. 5. Комбинированные методы хранения. В некоторых случаях наибольшая сохранность ценных свойств достигается с применением комбинации нескольких методов хранения. Так, частичное высушивание клеток способствует сохранению их жизнеспособности и биохимической активности при последующей лиофилизации или низкотемпературном хранении. Лекция № 4 Основы технологии микробиологических производств. Поверхностное культивирование 1. Поверхностное культивирование. 2. Способы поверхностного культивирования 1.Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов: 1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способ выра-щивания продуцента), 2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента). Культивирование микроорганизмов на твердых питательных средах поверхностное культивирование) приблизительно можно представить в виде следующей последовательности технологических операций. Предварительно простерилизованный и измельченный твердый питательный субстрат засевается выращенной в отделении «чистой культуры» заводской лаборатории культурой соответствующего микроорганизма. Далее среду с посевным материалом направляют в раздаточное устройство где с помощью механических дозаторов осуществляется загрузка кювет (лотков) для выращивания. Перед загрузкой кюветы тщательно моют и стерилизуют острым паром. Загруженные кюветы помещают в специальные растительные камеры, где для нормального роста культур микроорганизмов поддерживаются соответствующие условия. В качестве субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, как правило, нестандартное сырье различные отходы пищевой промышленности. Среди них наиболее часто используют пшеничные отруби, свекловичный жом, проросшие ячменные зерна (солод), шелуха от некоторых сельско- хозяйственных культур (риса, гречихи, подсолнуха). В качестве разрыхлителя субстрата часто используют древесные опилки. Все эти виды субстратов отличает низкое содержание азотсодержащих веществ, поэтому в качестве добавок к ним добавляют такие азотсодержащие соли, как сульфат аммония и различные добавки микроэлементов и ростовых факторов. Перед использованием готовый субстрат подвергают тщательной стерилизации, чтобы обеспечить максимально возможное подавление посторонней микрофлоры. Микробиологический контроль при этом обычно ведут по наличию спор бактерий, так как именно они наиболее устойчивы к различным методам стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С). Однако это часто приводит к комкованию среды, что резко ухудшает процесс стерилизации таких комков на всю глубину, и кроме того, этот процесс является весьма длительным, энерго- и материалоемким. Поэтому на ряде производств в последнее время стали использовать для стерилизации принципиально другие методы, например уничтожение микроорганизмов γ- или рентгеновскими лучами. Выращенный в отделении «чистой» культуры посевной материал перед засевом подвергают микробиологическому и биохимическому контролю на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие его паспортным технологическим данным. Посевной материал считается пригодным для засева основных аппаратов, если он обеспечивает при нормальной длительности культивирования на производственной среде необходимое по паспорту накопление целевого продукта или нужную ферментативную активность. Поскольку практически все продуценты культивируемые поверх- ностным способом являются аэробами, то им для дыхания необходим интенсивный подвод воздуха. Очистка используемого воздуха и его стерилизация осуществляется с использованием волокнистых фильтрах. Перед растительными камерами всегда устанавливают кондиционеры для поддержания необходимой температуры и влажности. В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его достигает значительной величины. Поэтому практически любая технологическая схема подготовки и циркуляции воздушного потока предусматривает его рецикл, в котором участвует до 90% воздуха. При этом циркулирующий воздух проходит через воздухоохладитель, а часть отработанного воздуха очищается на фильтрах от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу. Проблема регулирования теплообмена в процессе культивирования имеет не менее важное значение, чем обеспечение подвода воздуха. В ходе своего роста большинство культур выделяют значительное количество тепла. В то же время известно, что уже при температуре 38-40 С наступает угнетение вегетативного развития многих культур, а при 43-45 С может происходить полная инактивация их ферментных систем. Проблема усложняется тем, что выделение тепла в течение всего периода культивирования происходит неравномерно. В начале культивирования выделение тепла обычно в 10-20 раз больше чем в конце процесса. Поэтому необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла. Решение проблемы теплообмена существенно упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования происходит и потребление кислорода (воздуха), при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения. В конце культивирования потребление кислорода становится минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла. В процессе культивирования наблюдается непрерывное снижение влаги в твердом субстрате. В начале процесса влажность питательной среды достигает 5860%, к моменту окончания процесса эта величина может снизиться до уровня 30%. Это отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и как следствие на выходе целевого продукта. Поэтому для производственных условий важно в течении всего времени культивирования поддерживать величину влагосодержания на уровне не ниже 55-50%, что достигается предварительным увлажнением (кондиционированием) воздуха, подаваемого в растительные камеры.. 2.Способы поверхностного культивирования В современном производстве используются, в основном, три способа поверхностного культивирования микроорганизмов: кюветный способ выращивания, касетный способ выращивания и выращивание методом объемной аэрации. Кюветный способ является наиболее распространенным, особенно в малотоннажных производствах. Лотки-кюветы после загрузки субстрата, засеянного соответствующей культурой микроорганизма, помещаются на стелажи в специальные растительные камеры в которых поддерживаются все необходимые для культивирования условия. Такой процесс является малопроизводительным и весьма трудоемким, поскольку большинство технологических операций по загрузке и выгрузке выполняются вручную. С целью интенсификации процессов кюветного выращивания разрабатываются конструкции растительных камер в которых кюветы по басконечной конвеерной ленте движутся через различные зоны раститель-ной камеры, в которых поддерживаются условия (теплообмен, воздухообмен, влажность и др.) соответствующие тем или иным стадиям роста микро-организма. После прохождения камеры кюветы проходят отделения сушки, съема готовой культуры, мойки, стерилизации и снова подаются на загрузку. Касетный способ выращивания продуцента осуществляется в специальных растительных камерах, имеющих форму параллелепипеда. Камера разделена на 23 секции-касеты перфорированными перегородками с двойными стенками, между которыми подается стерильный воздух. В пространство между перегородками загружают сверху засеянную питатель-ную среду. Днище касеты состоит из двух жалюзийных пластин. Стерильный воздух подводится к каждой из секций с помощью коллектора. По окончании процесса культивирования камеру разгружают путем открытия жалюзийных пластин днища камеры. Полнота разгрузки камеры обеспечивается путем установки ее на специальный вибростол. Касетный способ выращивания позволяет вдвое увеличить толщину слоя субстрата, по сравнению с кюветным, благодаря двустороннему обдуву его потоком воздуха, что ведет к повышению эффективности процесса поверхностного культивирования. Процесс культивирования методом объемной аэрации проводят в специальных колонных аппаратах, разделенных по высоте на секции перфорированными пластинами, укрепленными на поворотных осях. Воздух с помощью коллектора подают под каждую секцию аппарата, а выделяющееся в ходе ферментации тепло отводят охлаждающей водой, подаваемой в наружную рубашку аппарата. Питательная среда дополни-тельно перемешивается и распределяется по тарелкам с помощью установленных по центру аппарата на общем валу перемешивающих устройств. Загрузка аппарата осуществляется сверху, а выгрузка через днище. При этом перегрузка среды с тарелки на тарелку и выгрузка осуществляется в результате поворота сегментных частей тарелок на угол 90 в автоматическом режиме. 1. 2. 3. 4. 5. Лекция № 5 Основы технологии микробиологических производств. Глубинное культивирование. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования. Периодический способ культивирования. Непрерывный способ культивирования. Полунепрерывный способ культивирования Турбидостатический и хемостатический режимы непрерывного культивирования. По сравнению с рассмотренным нами ранее поверхностным способом культивирования микроорганизмов глубинный способ культивирования имеет ряд существенных преимуществ: при его использовании возможно менять состав питательной среды в широком интервале значений концентраций различных компонентов, добиваясь при этом максимального выхода целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудования, в технологическом процессе значительно сокращается доля ручного труда (транспортировка питательной среды, загрузка и разгрузка аппарата) он требует меньших затрат на организацию процесса автоматизации различных стадий, предлагает более простую последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового продукта. Рассмотрим принципиальную технологическую схему глубинного культивирования микроорганизмов на рис.1. Рис.1 Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов. 1 - смеситель питательной среды; 2 - колонка для непрерывной стерили зации потока питательной среды; 3 - теплообменник - выдерживатель; 4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (или посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки воздуха; 7 - ферментер; 8,9 - насосы; масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12 головной фильтр для очистки воздуха. Для любого биотехнологического процесса существует множество вариантов организации производства на промышленном уровне. Однако все процессы можно разделить на две большие группы - периодические и непрерывные. 2. При периодическом способе производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, часто уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития: 1) Lag-фазу, или фазу задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментера; 2) фазу ускорения – когда адаптация закончилась и клетки начинают интенсивно делиться 3) Log-фазу, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции; 4) фазу замедленного роста, связанную с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма; 5) Const- фазу или стационарную фазу, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих; 6) фазу отмирания, характеризующуюся прогрессирующей гибелью клеток. Синтез первичных метаболитов наиболее интенсивно идет с середины Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов. Периодически ферментер опорожняют, моют, стерилизуют, целевой продукт отправляют на очистку, и начинают новый цикл. Системы, функционирующие в таких условиях, характеризуются как batchсистемы (замкнутые системы). Большинство современных биотехнологических систем функционируют как batch-процессы, при которых однажды оптимизированные условия обеспечивают максимальное накопление целевого (требуемого) продукта. 3.При непрерывном способе подача равных объемов сырья (питательных веществ) и отвод культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт осуществляется одновременно. Такие ферментационные системы характеризуются как открытые. Через некоторое время после начала процесса в таком ферментере устанавливается динамическое равновесие между процессами размножения клеток с одной стороны и процессами отмирания и вымывания живых клеток их аппарата с другой. В результате концентрация клеток устанавливается на определенном уровне, задаваемом технологическим режимом (скоростью протока, количеством питательных веществ, температурой). Теоретически такая сonst-фаза, при неизменных параметрах процесса культивирования может поддерживаться бесконечно долго. Ферментер, работающий в таком режиме, значительно более прост в управлении, по сравнению с аналогичным, работающим в периодическом режиме. Это обусловлено тем, что при постоянстве концентрации клеток продуцента постоянными являются и все их потребности (питательные вещества, воздух) и параметры процесса (тепловыделение, уровень рН, выделение целевого продукта). Принцип непрерывного проточного культивирования похож на непрерывные процессы в химической технологии и подобно им может реализовываться по двум основным схемам: 1. процесс идеального (полного) вытеснения; 2. процесс идеального (полного) смешения; Реактор для выращивания микроорганизмов в процессе полного вытеснения в общем виде представляет собой трубу, расположенную вертикально или горизонтально. При этом в один конец медленно втекает среда и посевной материал (микроорганизмы), а из другого конца вытекает культуральная жидкость. При этом из-за примерно одинаковой скорости движения и отсутствия завихрений перемешивания слоев жидкости в реакторе не происходит (ламинарный режим). Уменьшение концентрации питательных веществ и накопление продуктов биосинтеза, а так - же клеточной биомассы происходит в таком реакторе не только во времени, но и в пространстве (от начала реактора к концу). В таком режиме обычно проводят анаэробное культивирование. Процесс полного вытеснения применяется в крупнотоннажных производствах в тех случаях, когда желательно избежать потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости (производство пива). В процессе полного смешения рост культур микроорганизмов происходит в реакторе-ферментере при интенсивном перемешивании культуральной среды с помощью мешалок (турбулентный режим). При этом в любой точке ферментера все параметры среды должны быть примерно одинаковы. Изменение всех параметров культивирования происходит только во времени. Этот метод культивирования, называемый еще гомогенно-непрерывным, наиболее широко применяется в аэробных процессах, как периодических, так и непрерывных. Выбор между периодическим и непрерывными способами зависит прежде всего от экономических причин, а так же от специфичности условий производства тех или иных веществ. Непрерывные процессы, как правило, лучше приспособлены для крупномасштабного производства, из-за постоянства концентрации клеток в них легче поддерживать во времени параметры процесса (температуру, рН, уровень аэрирования), однако до настоящего времени большая часть микробиологических продуктов производится периодическим способом. Причинами этого в основном являются малотоннажность и широкий ассортимент производимых продуктов, а также особенности культивирования тех или иных их продуцентов, что не позволяет унифицировать как ферментеры, так и их технологическую оснастку. Все это вместе часто делает экономически невыгодным внедрение непрерывных технологий. Однако в таких областях, как крупномасштабное производство растворителей, промышленных ферментов, кормового белка и кормовых добавок (аминокислот, витаминов и др.), биологической очистке сточных вод, непрерывные способы прочно заняли главенствующее положение. 4.В последнее время все чаще начинают использовать методы, занимающие промежуточное положение между непрерывным и периодическим культивированием (полунепрерывное культивирование): 1.периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют небольшие объемы питательных веществ либо порциями, либо непрерывно «по каплям». 2. полунепрерывный отъемно-доливной метод, когда в течении всего процесса периодического культивирования часть одержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество свежей питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное «омолаживание» (обновление) культуры и в 2-3 раза задерживает (отдаляет) ее переход в фазу отмирания. Недостаток состоит в том, что доливы осуществляют питательной средой полного состава, что неприемлемо для синтеза вторичных метаболитов. 3.Этого недостатка лишен метод полунепрерывной регулируемой ферментации. Суть этого метода состоит в том, что в определен время, начиная с логарифмической фазы размножения, по специально разработанной программе, в культуральную жидкость, добавляют отдельные компоненты питательной среды (сначала раствор сахаров, потом аммония сульфат и другие микроэлементы, а так же те или иные вещества предшественники), поддерживая их концентрацию на постоянном благоприятном уровне - вначале для роста массы клеток, а затем - для синтеза целевого продукта (вторичного метаболита). Периодически из ферментатора отбирают пробы культуральной жидкости и определяют концентрацию сначала клеток, а потом и целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как она достигает максимума. Этим способом удается не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент, но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном итоге - продуктивность процесса, то есть увеличить выход конечного продукта в расчете на потребленный субстрат. 4. Если целевой продукт является эндометаболитом, т.е. находится внутри клетки, то для получения более плотной клеточной культуры проводят периодическое культивирование в режиме диализа. При этом питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану и через нее же отводится часть культуральной жидкости без клеток. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Этот метод не нужно путать с непрерывным проточным культивированием. Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей питательной средой. В зависимости от того, на каком принципе основано поддержание постоянства концентрации клеток различают турбидостатический и хемостатический режимы непрерывного культивирования. При турбидостатическом режиме культивирования постояннство концентрации клеток обеспечивается управляемым изменением скорости протока жидкости через аппарат за счет подачи больших или меньших объемов питательной среды. Наиболее распространенным методом определения концентрации клеток в культуральной жидкости является измерение светорассеивания (мутности) выходящего из ферментера потока с помощью прибора-нефелометра, измеряющего мутность жидкости по величине светорассеяния. Сам прибор посредством электрической схемы связан с насосом для подачи питательной среды или вентилем (краном), регулирующим эту подачу. Повышение концентрации клеток в культуральной жидкости, приводит к увеличению светорассеяния, что автоматически вызывает увеличение объема подаваемой в аппарат свежей питательной среды, и что, в свою очередь, приводит к вымыванию избыточных клеток. Наоборот, при уменьшении светорассеяния (снижении концентрации клеток) скорость протока жидкости через аппарат уменьшается и соответственно уменьшается процесс их вымывания из ферментера. Недостатком турбидостатического режима является то, что в этом режиме невозможно достигнуть полного усвоения питательных веществ и при выделении целевого продукта они могут безвозвратно теряться или загрязнять его, усложняя процесс очистки. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу и искажения его показаний. Однако имеются и определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения его от заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм. При хемостатическом режиме поддержание постоянства концентрации культуры продуцента осуществляется за счет регулирования не выходящего, а входящего потока. Сущность регулирования состоит в том, что концентрацию основного питательного вещества (или одного из основных), поступающего в реактор устанавливают на определенном уровне, который ограничивает (лимитирует) степень размножения микроорганизмов, поддерживая тем самым культуру микроорганизма в определенной нужной концентрации. Такой метод регулирования называется хемостатическим, а реактор - хемостатом. Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малой скоростью протока жидкости и низкой концентрацией питательных веществ, что облегчает саморегулировку системы. Недостатком хемостатического метода регулирования является то, что в этом случае обычно не удается получить продукты в достаточно высокой концентрации и добиться полной утилизации питательных веществ. Особенно неэффективными являются такие реакторы при получении различных вторичных метаболитов, таких как антибиотики. Это связано с тем, что процесс получения вторичных метаболитов состоит из двух стадий, и оптимальные условия для той или другой стадии могу существенно различаться между собой. Одноступенчатый хемостат в лучшем случае может обеспечить только компромис между разными условиями, оптимальными для этих двух условий. Условия, более благоприятные для каждой стадии жизненного цикла можно создать при использовании двух- или более ступенчатого хемостата. Однако такой установкой весьма сложно управлять и она требует больших капиталовложений. В настоящее время одноступенчатый и многоступенчатые хемостаты нашли применение в основном в различных процессах утилизации отходов и очистки сточных вод. Еще одним недостатком непрерывного метода является то, что в таких аппаратах невозможно или очень трудно и неудобно использовать неразмножающиеся клетки, споры или чистые ферменты. Вымываемые из ферментера клетки или ферменты практически невозможно регенерировать (отделить, промыть, вернуть в аппарат) без потери активности и с сохранением асептики. Аналогичные проблемы имеют место и при периодическом культивировании. Это является весьма невыгодным с экономической точки зрения, учитывая высокую стоимость чистых ферментных препаратов и штаммов микроорганизмов, а так же сложность подготовки и запуска процесса. Эффективным способом решения этой проблемы является использование так называемых иммобилизованных биокатализаторов (клеток или ферментов). Процесс иммобилизации заключается в (закреплении) молекул фермента или целых живых клеток на (или в) специальных носителях или насадках значительно большего (на много порядков) размера. При этом биокатализатор из фактически гомогенного становится гетерогенным. Существует целый ряд методов иммобилизации, основанных на механическом, физико-химическом и химическом закреплении ферментов и клеток на носителях природного или искусственного происхождения. После окончания процесса такой катализатор легко отделить фильтрованием от культуральной жидкости, очистить, а иногда даже регенерировать. Такие катализаторы обычно имеют большой срок действия, по сравнению с неиммобилизованными, удобны в обращении, но имеют гораздо более высокую стоимость и требуют использования специально сконструированных для их использования ферментеров, что препятствует их широкому использованию. 1. 2. 3. 4. Лекция №6 Основное оборудование биотехнологических производств. Классификация ферментеров Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ). Ферментеры с подводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ). Ферментеры с подводом энергии жидкой и газовыми фазами (ФЖГ). Биотехнологические процессы принципиально отличаются от процессов химического синтеза. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными фазами, например перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую, из культуральной среды внутрь клетки) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами) и как следствие на конструктивные особенности оборудования. Поэтому современные биореакторы должны обладать следующими системами: эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания; обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов системы (аэрирование в первую очередь); теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры внутри реактора и ее контролируемые изменения; пеногашения; стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры; контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов. Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной целью обеспечение оптимальных условий для проведения процесса. Однако чем больше размер аппарата, объем жидкости в нем, тем сильнее проявляется в нем неидеальность перемешивания, тепловая и диффузионная неравномерность, неравномерность распределения подводимой извне энергии, что все вместе взятое создает резко различающиеся условия жизнеобеспечения клеток в различных частях аппарата. Естественное желание конструкторов пойти на различные улучшения, и как следствие, обычно, на усложнение аппаратуры, вызвало к жизни появление множества самых различных конструкций. 1.Классификация ферментеров В зависимости от осуществляемых в них процессов, ферментеры могут быть разделены на следующие группы: 1. аэробные, анаэробные; 2. периодические, непрерывные; 3. стерилизуемые, не стерилизуемые; 4. целевой продукт в клетках, вне клеток; 5. глубинные на растворимых и не растворимых субстратах; 6. близкие к идеальному перемешиванию, идеальному вытеснению. Однако перечисленные группы процессов не равноценны по влиянию на конструкции ферментеров и определить их конструктивные особенности по данной классификации практически невозможно. В то же время на практике часто одни и те же ферментеры по этой классификации используют для проведения разных процессов. Наиболее универсальна и чаще всего применяется на практике классификация ферментеров по способу ввода энергии в аппарат (по способу осуществления процессов аэрирования и перемешивания): 1.- с газовай фазой; 2.- с жидкой фазой; 3.- с газовой и жидкой фазой (комбинированные). Для аэробных процессов аэрирование и перемешивание является, безусловно, важнейшей процедурой. Поскольку транспорт кислорода через клеточные мембраны осуществляется по диффузионному механизму, то это предполагает наличие более высокой концентрации кислорода в культуральной жидкости (вне клетки). Сложность достижения необходимого уровня аэрирования (насыщения культуральной жидкости кислородом) заключается в низкой растворимости кислорода в воде. При этом многие компоненты культуральной среды дополнительно снижают растворимость кислорода. Все это не позволяет использовать клеточные культуры с высокой плотностью (концентрацией), что в свою очередь снижает выход целевого продукта с единицы объема аппарата. 2.Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ). Общим признаком этих аппаратов является ввод энергии газовой фазой, которая является ее носителем и за счет которой осуществляется процесс перемешивания. Эта группа ферментеров характеризуется, прежде всего, простотой конструктивного исполнения и высокой эксплуатационной надежностью в связи с отсутствием движущихся узлов и деталей. В простейшем виде такой ферментер представляет собой сосуд в который через барботер подводится воздух или какая ни будь специальная газовая газовая смесь. Пузырьки, выходящие из барботера осуществляют процессы аэрирования, перемешивания и термостатирования в культуральной жидкости. Для улучшения процессов массо- и теплообмена используют различные конструктивные решения, направленные на прежде всего на более равномерное и быстрое распределение пузырьков воздуха по всему объему аппарата. Среди конструкций таких ферментеров наиболее распространены барботажные, барботажно-газлифтные, тарельчатые колонные, насадочные колонные и ряд других. Подвод или отвод (по необходимости) тепла в таких аппаратах осуществляется встроенными внутри аппарата теплообменниками различной конструкции. 3.Ферментеры с подводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ). Обычно энергия в аппаратах этой группы передается жидкой фазе с помощью насоса. При этом подаваемая в ферментер жидкость вводится в аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор и т.д.). Различают в общем случае три типа конструкций таких аппаратов: а) ферментеры эжекционные (ФЖЭ); б) ферментеры струйные (ФЖС). в) ферментеры с самовсасывающими мешалками (ФЖСМ); В ферментерах эжекционного типа, работающих в режиме рециркуляции, подаваемая в ферментер культуральная жидкость проходит под давлением через специальное устройство называемое эжектором (инжектором), в котором происходит ее интенсивное перемешивание с воздухом и насыщение кислородом. Далее образовавшаяся газо-воздушная струя под большим давлением вводится в ферментер с боку, перемешивая содержимое и распределяя пузырьки воздуха по всему объему аппарата. Недостатком аппаратов является необходимость применения специальных насосов для перекачивания газосодержащих культуральных жидкостей. Струйные ферментеры конструктивно разделяются на два типа: с “затопленной” и “падающей” струей. В первом случае струя газо-жидкостной смеси вводится в культуральную жидкость сверху через погруженную в нее трубу, во втором - подается в нее под давлением с определенной высоты. Образование газожидкостной смеси, как и в случае эжекционных ферментеров, осуществляется при помощи эжектора, находящегося во внешнем циркуляционном контуре. Недостатки струйных ферментеров аналогичны недостаткам эжекционных. В отличие от эжекционных и струйных, ферментеры с самовсасывающими мешалками являются довольно простыми аппаратами, так как не требуют специальных воздуходувных машин для подачи воздуха в аппарат. Поступление воздуха осуществляется за счет разрешения, возникающего за задней кромкой лопасти мешалки при ее движении в жидкости. В лопастях такой мешалки воздушные каналы, которые через полый вал соединяются с воздуховодом. Такие аппараты широко применялись в СССР при микробиологическом производстве кормового белка. К недостаткам этой схемы можно отнести трудность оптимизации и управления всей совокупностью массообменных и гидродинамических процессов в таком ферментере. 4.Ферментеры с подводом энергии жидкой и газовыми фазами (ФЖГ). Основным конструктивным элементом таких аппаратов является перемешивающее устройство, обеспечивающее высокую интенсивность растворения кислорода и высокую степень диспергирования газа, нераство-римых субстратов и гомогенизации среды. К этой группе аппаратов относятся такие ферментеры, у которых энергия к жидкой фазе подводится одновременно перемешивающим устройством и насосом или только насосом. Энергия с газовой фазой при этом вводится обычным способом (через барботер). Соответственно различают и два типа таких аппаратов. а) Ферментеры с перемешивающими устройствами (ФЖГМ). Перемешивающее устройство таких ферментеров выполняется в виде вала с установленными на нем одной или несколькими мешалками. Под нижней мешалкой у днища обычно расположен газораспределитель (барботер), который может быть как вращающимся, так и неподвижным. Внутри аппарата размещаются теплообменники. б) Ферментеры комбинированные (ФЖКХ). В аппаратах такого типа перемешивание осуществляется насосом или одновременно мешалкой и насосом. Воздух в аппарат при этом подается через барботер. Лекция № 7 Особенности конструирования и работы ферментационного оборудования 1.Стерилизация ферментера и сохранение асептики. 2.Термостатирование 3.Пеногашение 1.Стерилизация ферментера и сохранение асептики. Важнейшим условием успешного протекания любого биотехнологи- ческого процесса является поддержание стерильности среды в ферментере и во всей ферментационной установке в целом. Всю совокупность операций по подготовке оборудования и коммуникаций с целью создания в них асептических условий можно разделить на два важнейших процесса: стерилизация внутренних полостей и герметизация всех элементов и узлов. Первый процесс проводится в подготовительный период перед запуском оборудования (в ходе процесса ферментации осуществляются лишь профилактические мероприятия по стерилизации отдельных узлов вспомогательного оборудования). Второй процесс осуществляется и при подготовке, и при эксплуатации оборудования. Наиболее распространенный метод стерилизации аппаратов и трубо- проводов тепловая обработка перегретым выше 1000С насыщенным водяным паром. Этот метод надежнее, экономичнее и удобнее в производственных условиях, чем обработка химическими средствами. При стерилизации важнейшим условием ее эффективности является возможность создания во всех точках внутренних полостей необходимой температуры и поддержания ее в течение заданного времени. В производственных условиях выполнение этого требования связано со значительными трудностями ввиду наличия в ферментере многочисленных тупиковых полостей, областей и зон в которые затруднен доступ пара (“слабые точки”). Наиболее трудно стерилизуемыми местами в аппаратах являются участки расположения теплообменников, барботеров, штуцера (места ввода трубопроводов, датчиков КИП), загрузочные люки, а в разводках трубопроводов - тупиковые места, которые образуются на ответвлениях и в местах присоединения к аппаратам. Расчетным путем показано, что для достижения равной степени стерилизации в перечисленных «слабых» точках и в основном обьеме аппарата продолжительность выдержки различается примерно в 100 раз, если принять температуру пара в них 100 С. Наличие большого количества “слабых точек” обусловлено тем, что конструкционные решения большинства узлов промышленного ферментера часто заимствуются из химической технологии и поэтому они не соответствуют требованиям стерилизации. Наиболее действенной мерой повышения эффективности стерилизации оборудования и коммуникаций является разработка оборудования с наименьшим числом таких «слабых» точек или принудительная подача пара в эти зоны через дополнительные термические затворы, специально встроенные в те участки ферментера, где наблюдается максимальная концентрация таких«слабых» точек. Так же такими термическими затворами должны быть снабжены и все трубопроводные линии аппаратов. Химические методы стерилизации, несмотря на свою эффективность, применяются редко. Это связано с тем, что после окончания стерилизации необходимо удалить стерилизующий агент, а это достаточно трудно сделать и может привести к повторной контаминации. Наиболее удобно использование газообразных или легколетучих веществ (этиленоксид, β-пропиолактон), которые легко удалить продувая систему стерильным воздухом. Второй процесс определяющий конструктивные особенности аппара-туры, ее герметизация. Она решает две задачи - защиту внутреннего объема от посторонней микрофлоры и защиту окружающей среды от продуктов биосинтеза. Проблема обеспечения герметичности обусловлена рядом причин: пара- метры проведения разных стадий технологического процесса резко различаются (например термическая стерилизация (1000С и выше) и культивирование (25-450С), сильная вибрация при работе перемешивающих устройств, перепад температуры в различных зонах установки, все это приводит к возникновению трещин и щелей в конструкциях и узлах аппаратуры. Большинство случаев дегерметизации приходится на запорную арматуру, в которой наиболее опасные места - уплотнение седло-клапан и уплотнение штока, на фланцевые соединения, уплотнение валов и мешалок и места ввода датчиков КИП. Одним из важных направлений повышения эффективности герметизации является переход на сварные соединения вместо фланцевых (соединение отдельных узлов за счет болтов), на сильфонные или мембранные вентили вместо обычных, на создание торцевых уплотнений для валов перемешивающих устройств с контролируемой герметичностью. Для снижения риска попадания извне посторонней микрофлоры внутри ферментера создают небольшое избыточное давление. В зависимости от требований предъявляемых к чистоте продукции (лекарственные, пищевые продукты) проводят работы по дезинфекции рабочих мест и целых производственных участков, очистке воздуха рабочих зон. 2.Термостатирование Обеспечение оптимальной температуры процесса культивирования является одной из самых сложных и ответственных технических проблем. На практике теплоотвод связан с большими капиталовложениями и необходимостью строительства сложных систем оборотного водоснабжения, теплообменных устройств в ферментерах, а иногда и дополнительных холодильных установок. Затраты на теплоотвод соизмеримы с затратами на обеспечение клеток кислородом (аэрирование, перемешивание) и поэтому они могут быть решающими при выборе конструкции ферментера. Проблема обусловлена следующими причинами: а) низким коэффициентом теплопередачи (малой теплопроводностью) клеточной стенки, и как следствие малоинтенсивной теплоотдачей со стороны микробной суспензии, а также с образованием отложений клеток на внешней стороне охлаждающих элементов. Малый коэффициент теплопередачи объясняется так же практически ламинарным обтеканиием вязкой микробной суспензией поверхности охлаждающих элементов; б) небольшой величиной движущей силы теплопереноса, т.е. перепада температур между охлаждающей водой (в летнее время 26-28 С) и микробной суспензией (обычно 32-34 С); в) необходимость отводить не только тепло, выделяющееся при жизнедеятельности микроорганизмов, но и все тепло, которое выделяется при работе перемешивающих устройств за счет трения слоев жидкости друг о друга и о стенки и внутренние узлы аппарата; В зависимости от тепловой нагрузки для отвода тепла используют поверхность корпуса аппарата (тепловые рубашки) или встроенные внутрь аппарата теплообменники змеевикового типа. Наилучшим решением проблемы является использование выносных теплообменников (кожухотрубных, пластинчатых), располагаемых на внешних циркуляционных трубах, если такие имеются. При использовании встроенных теплообменников очень важно правильно выбрать место их размещения, чтобы можно было обеспечить интенсивный циркуляционный поток жидкости. Всегда необходимо помнить, что встроенные теплообменники повышают вероятность инфицирования ферментеров (дополнительные “слабые” точки), ухудшают гидродинамический режим, уменьшают полезный объем, усложняют их промывку, стерилизацию и ремонт. 3.Пеногашение Большинство микробиологических процессов сопровождается интенсив-ным выделением различных газов (CO2, H2, CH4 и др.), что часто приводит к обильному пенообразованию. Это является крайне нежелательным процесс-сом, так как чрезмерное вспенивание в ферментере ограничивает полезную емкость аппарата, нередко является причиной заражения среды посторонней микрофлорой, приводит к потерям культуральной жидкости, уходящей с пеной из аппарата. В большинстве случаев пеногашение осуществляют с помощью добавления химических пеногасителей - поверхностно-активных веществ природного и химического происхождения. Однако в последнее время все больше внимания обращается на механические пеногасители, использование которых исключает или резко сокращает введение химических пеногасителей, которые иногда бывают токсичными для микроорганизмов-продуцентов или являются ингибиторами ферментов. Все механические пеногасители разделяются на два типа - роторные и циклонные. Принцип действия механических пеногасителей заключается в разрушении пузырьков воздуха или их дроблении при контакте с рабочим органом. Применяются как встроенные в аппарат, так и выносные механические пеногасители. В случае роторных пеногасителей рабочим органом является обычно вращающийся диск с лопастями, выступами, прорезями либо пакет кони-ческих сепарационных тарелок. Довольно широко используются пеногасители циклонного типа. Поступающая из аппарата воздушно-пенная струя двигается по винтовому каналу в верхней части циклона и после попадания в полую нижнию часть его закручивается как в вихре. В результате жидкость собирается в центе вихря и падает вниз, удаляясь через нижний патрубок, а воздух уходит через верх. Наилучший эффект в этом случае достигается обычно при их совместном использовании с химическими пеногасителями. Лекция № 8 Контроль и управление процессами культивирования Контроль и управление процессами культивирования. Основное искусство технолога при проведении управляемого культивирования состоит в умении создать наиболее «комфортные» условия для растущей культуры. Для этого необходимо прежде всего знать, каковы они - эти условия, или иными словами: а) состояние процесса в пределах бесконечно малого промежутка времени; б) реакцию микроорганизмов на любые изменения подвергаемых измерению и контролируемых параметров процесса. Однако непосредственно изучить состояние (“самочувствие”) клеток в промышленном аппарате не представляется возможным. Поэтому физиологическое состояние культуры продуцента оценивается обычно косвенно по различным кинетическим параметрам: скорости роста, потребления кислорода и различных субстратов, выделению углекислого газа и других продуктов метаболизма (в том числе и целевых), скорости закисления или защелачивания (по значению рН), тепловыделению и т.д. Основными управляющими воздействиями для поддержания и корректировки режима культивирования являются режим аэрации и перемешивания, подача теплоносителя, регулировка величины рН, поддержание уровня пены, скорость дозирования субстрата. Одной из основных проблем промышленной биотехнологии является отсутствие специализированных датчиков, поскольку общепромышленная номенклатура приборов и средств автоматизации, зачастую, не соответствует асептическим условиям процессов, не выдерживает многократной термической стерилизации, не может работать в сложных по составу ферментационных средах, включающих биомассу, пузыри воздуха, жировые компоненты, жидкие эмульсии и твердые частицы. Дозирование субстратов. Как уже отмечалось насосы, трубопроводы и запорная арматура- сплошная “слабая” точка. В условиях асептических производств лучшими дозирующими насосами являются перистальтические или мембранные в которых рабочий орган взаимодействует с жидкостью через непроницаемую мембрану. Возможно дозирование и без насосов, с помощью дозировочных бачков. При этом давление в линиях должно на 1,5-2 атм превышать давление в ферментере. Концентрация водородных ионов. Измерение рН без особых проблем осуществляют с помощью стеклянных электродов сравнения, которые хорошо выдерживают паровую стерилизацию. Иногда используют выносные системы с циркуляцией через них жидкости из ферментера. Концентрация растворенных газов. Наибольшее распространение полу-чили амперометрические датчики. Они выдерживают 20-кратную стерили-зацию, не теряя чувствительности. Однако перед началом процесса ферментации они нуждаются в градуировке. Наиболее широко такие датчики используются на определение количества растворенного кислорода. Концентрация CO2 в выхлопных газах. Этот параметр обычно измеряется по теплопроводности газов при помощи катарометра. Иногда пользуются инфракрасными анализаторами. Температура. При биосинтезе температура может изменяться по определенной программе, обеспечивающей максимальный выход продукта. Температуру можно контролировать ртутными термометрами, термопарами или металлическими термометрами сопротивления. Давление. Для измерения этого параметра используют относительно простые диафрагмовые манометры, способные работать в условиях стерильности. Результирующий пневматический сигнал может быть реализован непосредственно на исполнительном устройстве или преобразован в электронный. Давление в ферментере обычно регулируется простым клапаном обратного давления. В случае аварийного выключения компрессора, сопровождающегося падением избыточного давления в ферментере, необходимо загерметизировать аппарат для защиты от внешней посторонней микрофлоры. Для этого манометр в ферментере соединяется в единую схему с заслонками на линии ввода и вывода газа и в случае падения давления ниже допустимого эти заслонки автоматически закрываются. Скорость подачи газа и жидкости. Предпочтение обычно отдается расходомерам переменного сечения - ротаметрам и диафрагмам. Положе-ние поплавка в ротаметре трансформируется в электрический сигнал, который передается на регулятор, управляющий вентилем на трубопроводе. Уровень жидкости в ферментере. Интенсивное перемешивание и пенообразование не позволяют применять обычные методы измерения уровня, распространенные в химической технологии (смотровые окна, мерные трубки и тд.). В ферментерах и биореакторах целесообразно применять весовой тип уровнемера, в котором датчики, фиксирующие массу аппарата, передают свой сигнал на прибор, отградуированный в единицах уровня. Лекция № 8 МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ 1. Постановка задачи масштабирования 2. Подход к масштабированию на основе концентрации растворенного кислорода 3. Проблемы масштабирования ферментационных процессов Изучение процессов ферментации в лабораторных условиях происходит сначала в колбах, затем в ферментерах лабораторного масштаба объемом 1 — 10 л, далее происходит испытание в опытных установках объемом 50, 100, 1000 л и более. Объемы промышленных установок зависят от вида продукта и от потребности в нем. Обычно речь идет уже о десятках кубометров — 10, 20, 50, 60, 100, отдельные аппараты имеют объемы свыше 1000 м3 (для получения кормовых дрожжей). Обычно в аппаратах разного масштаба используют одинаковые микроорганизмы и одинаковый состав питательных сред. Можно было бы ожидать, что в пересчете на единицу объема — литр, кубометр, миллилитр — количество получаемого продукта (биомассы или продуктов метаболизма) будет одинаковым или почти одинаковым в аппаратах разного масштаба. Действительность, однако, не оправдывает таких прогнозов. Наоборот, очень часто в аппаратах разного масштаба и конструкции результаты процесса различаются, иногда в несколько раз. В связи с этим в производственной практике возникает проблема масштабирования. Масштабирование — это воспроизведение результатов, полученных на оборудовании одного размера (или одной конструкции), при проведении того же процесса в аппаратах другого (обычно большего) размера или другой конструкции. 2. Подход к масштабированию на основе концентрации растворенного кислорода Основные предпосылки. Поскольку ход процесса определяется микроорганизмами, различия в ходе ферментации в аппаратах разного масштаба и конструкции следует искать в микроокружении микробных клеток. Концентрации питательных веществ, продуктов метаболизма, температура и рН вряд ли зависят от масштаба. Более естественным выглядит предположение о различии в концентрациях растворенного кислорода С. Аэробные микроорганизмы не могут развиваться в отсутствие кислорода. Однако растворимость кислорода воздуха в воде очень невелика — 7 мг/л при 20 °С. Если жидкость (или среду) полностью насытить кислородом воздуха, а затем прекратить аэрацию, то многие промышленные культуры микроорганизмов «съедают» этот запас за 5—10 с. Поэтому требуется непрерывная подача воздуха в аппарат. Надо заметить, что растворимость кислорода зависит еще и от давления воздуха, а вернее, от парциального давления кислорода в . газовой фазе. Если, например, повысить давление воздуха в 2 раза, то и концентрация растворенного кислорода при насыщении жидкости воздухом также повысится в 2 раза. Если вместо воздуха для насыщения среды использовать чистый кислород, то концентрация растворенного кислорода возрастет почти в 5 раз — пропорционально парциальному давлению кислорода в воздухе и газообразном кислороде: (100 %) / (21 %) = 4,8. Этот показатель — концентрацию растворенного кислорода — можно измерять с помощью специального датчика растворенного кислорода. Это очень важный прибор для процессов ферментации, хотя в обычных системах контроля и автоматизации химических производств он используется довольно редко. Профили изменения концентрации растворенного кислорода во времени. Концентрации растворенного кислорода, которые мы указывали ранее, — это концентрации в равновесном состоянии, при насыщении. В реальном процессе происходит непрерывное потребление растворенного кислорода из жидкости и одновременно его непрерывное растворение — массопередача из пузырей воздуха. Надо иметь в виду важную особенность микробиологических процессов. Микроорганизмы не способны потреблять кислород напрямую из газовых пузырей. Они потребляют лишь растворенный кислород, т. е. кислород переходит в клетку микроорганизма через две ступени: массопередача из газа в жидкость и затем потребление уже растворенного кислорода из жидкости. Чтобы повлиять на концентрацию растворенного кислорода в жидкости, необходимо изменить либо скорость продувания воздуха через аппарат, либо частоту вращения мешалки в аппарате; либо давление в нем. Можно, конечно, меняя скорость подачи воздуха и частоту вращения мешалки, поддерживать профиль во времени, например, в большом аппарате таким же, как в малом. Связь концентрации растворенного кислорода с условиями массо-передачи. Если мы имеем два разных аппарата, в которые загружена одна и та же культуральная жидкость, имеющая одну и ту же скорость потребления кислорода на единицу объема, то концентрация растворенного кислорода в таких аппаратах зависит только от коэффициента массопередачи KLa. Отсюда вытекает способ масштабирования — по величине KLa. Если обеспечить равенство значений KLa в сравниваемых аппаратах, то можно ожидать, что при этом автоматически обеспечивается и равенство профилей концентраций растворенного кислорода во времени. Профили растворенного кислорода при различных значениях KLa (которые можно задать разной частотой вращения мешалки, разными ее размерами и конструкцией, разной скоростью аэрации) должны различаться. Концентрация растворенного диоксида углерода. В некоторых процессах ферментации на результат процесса влияет не только кислород, но и растворенный диоксид углерода. Теоретически необходимой скорости массопередачи кислорода Qo2 можно достичь, сильно увеличив перемешивание и подняв давление в аппарате. При этом можно значительно уменьшить расход воздуха. Так иногда поступают, чтобы уменьшить пенообразование, которое сильно зависит от расхода подаваемого воздуха. В этом случае, однако, сильно возрастет концентрация СО2 в выходящем газе, а с ней и концентрация растворенного диоксида углерода, который может ингибировать процесс. Для некоторых процессов известны критические значения концентрации СО2 в газе и в жидкости, выше которых наблюдается ингибирование процесса ферментации. Для таких процессов при масштабировании необходимо учитывать ограничение по концентрации СО2. Механическое воздействие мешалки на клетки. Усилия сдвига, действующие у краев мешалки, отбойников, могут механически воздействовать на клетки микроорганизмов, вызывая их разрушение. Различные клетки по-разному реагируют на одно и то же воздействие. Бактерии, имеющие небольшие размеры (0,5 ... 1 мкм), практически нечувствительны к механическим воздействиям. Более чувствительны мицелиальные микроорганизмы и в особенности растительные и животные клетки, для которых перемешивание должно быть особенно мягким. Экспериментально оценить механическое воздействие перемешивающих устройств разного типа на микробные клетки довольно трудно. На практике обычно проводят экспозицию исследуемой культуры клеток в течение определенного времени в изучаемом аппарате, затем отбирают пробу жидкости и осуществляют прямой рассев ее на агаризованные среды, где определяют содержание живых клеток по сравнению с контролем. Более быстрым способом является определение изменения оптической плотности жидкости при длине волны 260 нм за время перемешивания в аппарате . Это изменение показывает степень выхода в раствор содержимого клетки. Такой способ, однако, трудно применить в аппарате большого размера. 3.Проблемы масштабирования ферментационных процессов Технология любого производственного процесса отрабатывается поэтапно: в лабораторных, пилотных (опытно-промышленных) и промышленных установках. Чаще встречаются аппараты с объемами ферменторной камеры: 0,5–100 л (лабораторные), 100-5000 л (пилотные) и 5000–1000000 л и более (промышленные). На каждом этапе увеличения масштаба ферментации (процесса) – масштабном переходе (масштабировании биотехнологического процесса) – решаются конкретные задачи отработки (налаживания) производства и его оптимизации. Лабораторные ферментеры по устройству и форме напоминают промышленные и подразделяются на те же типы. Правда, в лабораторных условиях наиболее часто применяются аппараты с механическим перемешиванием. По принципу теплообмена и стерилизации они делятся на две категории. К первой относятся лишенные собственных систем теплообмена и стерилизации. Такие аппараты, по сути дела, представляют собой камеры для культивирования, помещаемые в водяные бани и стерилизуемые в автоклавах. Аппараты второй категории снабжены системами теплообмена и стерилизации, принципиально не отличающимися от таковых промышленных установок. С помощью лабораторных биореакторов решаются следующие задачи: 1) кинетические – определение скорости роста клеток, эффективность утилизации субстратов и образования целевого продукта; 2) некоторые массообменные – расчет коэффициентов массопередачи, скорость поступления в среду О2 и других газов, скорость освобождения от газообразных продуктов, образующихся при культивировании продуцентов (в первую очередь СО2); 3) определение коэффициентов реакций, связывающих утилизируемые субстраты и О 2 с получаемыми целевым и побочными продуктами. Пилотные установки используют для поиска (отсюда и название) наиболее целесообразных технологий и в общих чертах моделирования промышленного процесса. Поэтому на данном этапе стараются применять тот тип аппарата, который предполагается использовать в промышленном масштабе. Иными словами, отрабатываются все аспекты производства, вплоть до штатных вопросов. При масштабных переходах следует постоянно иметь в виду, что даже при соблюдении одинаковых условий (среда, тип аппарата, температура и рН, скорость перемешивания) уровень и скорость синтеза целевого продукта могут существенно различаться - ситуация, очень четко прослеженная еще в 1940–1950 гг. при организации крупномасштабных производств антибиотиков. Вследствие сказанного при переходе от лабораторных к пилотным, а затем от пилотных к промышленным установкам, приходится наряду с объемом изменятьи конструкцию, и подбирать режимы работы аппаратов. Лекция № 9 Отделение биомассы от культуральной жидкости. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Основные понятия Отстаивание и осаждение Центрифугирование и сепарация Фильтрация Флотация Для отделения взвешенных биологических частиц от культуральной жидкости используются различные физико-химические свойства: плотность частиц; размер частиц; поверхностные свойства частиц. При разделении суспензий по плотности частиц используют следующие методы: 1) седиментация (отстаивание) — для крупных частиц размером от 2,3 мкм до 1 мм, по плотности отличающихся от окружающего раствора; 2) гидроциклонирование — от 5 до 700 мкм; 3) центрифугирование — от 400 до 900 нм; 4) ультрацентрифугирование — от 10 нм до 1 мкм. По размеру частиц методы разделения биологических суспензий могут быть следующими: 1) фильтрация через тканевые фильтры — для частиц размером от 10 мкм до 1 мм; 2) микрофильтрация — для частиц размером от 200 нм до 10 мкм; 3) ультрафильтрация, позволяющая отделять частицы размером от 10 нм до 5 мкм. Для сведения: размеры микроорганизмов следующие: вирусы — чуть больше 10 нм, бактерии — 0,3—1,0 мкм (т. е. 300—1000 нм), дрожжи — 3—5 мкм, мицелий грибов и эритроциты — до 10 мкм. Мицелиальные грибы имеют размеры микроколоний до 1 мм, что упрощает их отделение от жидкости. Есть также нерастворимые компоненты среды (мука, дробина в спиртовом производ-стве). Гранулы биокатализаторов имеют размеры около 1 мм (что-бы их легче было отделять). Макромолекулы имеют размеры частиц в диапазоне 10—120 нм, микрочастицы — от 120 нм до 10 мкм, тонкие взвеси — от 10 до 100 мкм и грубые взвеси — от 100 мкм до 1 мм. Поверхностные свойства частиц используются в процессе флотации. За основу в этом методе принимается не размер, а способность клеток удерживаться пузырьками воздуха; ориентировочный диапазон размеров флотируемых частиц варьирует от 1 до 200 мкм. Конкретный выбор того или иного метода зависит от опытной проверки, так как не всегда точно известны свойства отделяемых частиц и их поведение в условиях использования тех или иных методов разделения. Основные характеристики методов разделения суспензий под-робно рассматриваются в курсе «Процессы и аппараты химичес-кой технологии». Здесь же даны особенности их использования в биотехнологических процессах. 2. ОТСТАИВАНИЕ И ОСАЖДЕНИЕ Этот метод наиболее часто используют в процессах очистки стоков — отстаивание активного ила. Используется он также для отделения животных и растительных клеток, мицелиальных грибов и пивных дрожжей. Для успешного проведения процесса отстаивания не обязательно сами микроорганизмы должны быть крупными: они могут концентрироваться на хлопьях, агломератах. Часто процесс отстаивания комбинируется с предварительной коагуляцией или флокуляцией. В обоих случаях к суспензии добавляется реагент (соли алюминия или железа при коагуляции и полиэлектролиты при флокуляции). Прикрепленные к длинным молекулам коагулянтов или флокулянтов несколько клеток создают основу агломерата, который в результате имеет больший вес и меньшую подвижность, что приводит к седиментации осадка (рис. 13.1). Недостатками метода являются: большая продолжительность процесса (порядка нескольких часов) и не очень хорошее разделе-ние (в осадке концентрация биомассы не превышает 1—3 %). Скорость отстаивания зависит от размеров и плотности хлопьев, а также от их поверхностных свойств. Применительно к осаждению осадка сточных вод — активного ила — используют иловый индекс, характеризующий содержание биомассы активного ила в осаждаемом слое за 30 мин отстаивания. Но биологический осадок не является монодисперсным (частицы, а точнее агломераты, имеют разный размер). В результате высота слоя осадка изменяется со временем не по прямой ли-нии, а по кривой, причем скорость осаждения снижается во времени (рис. 13.2). Еще чаще клетки с какого-то момента перестают осаждаться. Это связано с тем, что мелкие клетки имеют поверхностные свой-ства, удерживающие их от осаждения. Многие мелкие клетки не осаждаются вовсе. 3. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ И СЕПАРАЦИЯ Для преодоления отмеченных ранее трудностей осаждения скорость осаждения клеток усиливают, помещая суспензию в поле центробежных сил. Центрифуги и сепараторы, которые это поле создают, часто называют осадительными. На частицу в центробежном поле действует центробежная сила Ғп: Итак, чем больше скорость вращения центрифуги и ее радиус и чем больше разность плотностей жидкости и частицы, тем быстрее происходит осаждение. Вязкость жидкости снижает скорость осаждения. Разные типы центрифуг оценивают по так называемому фактору разделения ФР, показывающему, во сколько раз ускорение центробежного поля больше ускорения свободного падения Рассмотрим теперь конструкцию наиболее распространенного в биотехнологии тарельчатого сепаратора (рис. 13.3). Этот сепаратор изобрел шведский ученый Густав де Лаваль в 1896 г. Сепараторы выпускает известная в биотехнологической промышленности фирма, которая так и называется — «Альфа Ла-валь». Сепаратор имеет полый вал, неподвижный корпус с размещенным в нем пакетом вращающихся с валом конических тарелок, находящихся одна над другой так, что образуется коническое пространство. Жидкость входит по полому валу под нижней тарелкой и доходит до внешнего цилиндрического края корпуса. Далее она движется между коническими тарелками к центробежному коллектору, из которого осуществляется выход жидкости. В процессе этого движения частицы биомассы отбрасываются по направлению от центра вращения и сползают по коническим поверхностям тарелок к боковой стенке корпуса, создавая в ко-нечном счете возле нее слой сгущенной биомассы. В корпусе расположены сопла, из которых под большим давлением происходит выгрузка сгущенной биомассы. Существуют различные модификации подобных сепараторов, в том числе с ручной, а также механизированной циклической и непрерывной выгрузкой осадка. В целом такая конструкция увеличивает время пребывания частиц в сепараторе и тем самым его производительность. Преимущества центробежных сепараторов: высокая производительность; хорошая степень концентрирования (до 10—15); достигается концентрация биомассы 5—15 % по сухой массе; возможность повышения скорости сепарирования предвари-тельной обработкой жидкости флокулянтами. Недостатки: сложность оборудования; энергоемкость процесса (хотя по сравнению с выпаркой затра-ты энергии все же меньше). I 4. ФИЛЬТРАЦИЯ Филътрация — это задержание взвешенных частиц сетчатой (тканёвой) или пористой перегородкой. Движущей силой является раз ность давлений. вызывающая протекание жидкости (рис. 13.4). При обычной фильтрации задерживаются частицы, величина которых больше размеров пор. Такая фильтрация называется «ситовой», и используется она при малом количестве взвешенных частиц, для осветления жидкости. Через какое-то время вся поверхность «сита» закрывается микроорганизмами, и фильтрация прекращается. Обычно же при фильтрации микроорганизмов используют фильтры, размер пор которых больше размера микроорганизмов. В этом случае фильтрация происходит через слой осадка (рис. 13.5). Сначала клетки микроорганизмов могут «проскакивать» через поры ткани. Затем на поверхности образуется слой осадка, и фактически фильтрование идет через него. По мере фильтрации все время возрастает толщина слоя осадка. В ходе фильтрования возрастает объем жидкости, прошедшей через фильтр, скорость фильтрации падает. Из уравнения видно, что скорость фильтрации можно увеличить путем повышения перепада давления. Однако для биологических суспензий это не так. Дело в том, что рыхлая структура слоя осадка даже при незначительном превышении оптимального перепада давления нарушается и образуется плотная «лепешка», плохо пропускающая жидкость. Такие системы называются системами со сжимаемым осадком. Важно удержаться от соблазна поднять давление: кратковременное повышение производительности фильтра, достигнутое благодаря увеличению разности давлений, обычно сопровождается последующим катастрофическим падением производительности. Для улучшения скорости фильтрации в биотехнологии часто используют фильтровалъные порошки для организации ф и л ь т рования через намывной слой порошка (рис. 13.6). Частицы порошка (кизельгур, перлит, диатомит) имеют размеры больше клеток микроорганизмов, но после «намывки» создают объемный слой с системой пор. Суспензия, проходя через этот слой, оставляет биомассу микроорганизмов на частицах порошка. Коэффициент сопротивления осадка при этом снижается в десятки раз, что позволяет фильтровать труднофильтруемые жидкости. Барабанные вакуум-фильтры. В них непрерывно осуществляется снятие внешнего тонкого намывного слоя с осевшим осадком, что постоянно обновляет фильтровальную поверхность. Лучше всего для работы с намывным слоем подходит барабанный вакуум-фильтр, в котором непрерывно проходят последовательные операции фильтрации, подсушки, промывки и отделения осадка, а также регенерации ткани и намывного слоя осадка. Каки при отстаивании, обработка жидкости перед фильтрацией повышает скорость фильтрации. В биотехнологии используют следуюшие способы обработки: тепловая коагуляция (нагрев жидкости с частичной инактивацией целевого продукта); кислая коагуляция (подкисление жидкости, что так же часто неблагоприятно влияет на целевой продукт и вызывает его потери); реагентная коагуляция (солями железа, алюминия); флокуляция (полиэлектролитами); добавление наполнителей (порошков, образующих зерна, или ионов, образующих нерастворимые осадки с веществами, раство-ренными в суспензии). Назовем преимущества и недостатки фильтрации через намывной слой порошка по сравнению с отстаиванием или сепарацией. Преимущества. С помощью фильтрации получают более обезвоженные осадки (20— 40 % по сухой массе), чем при отстаивании или сепарации. Недостатки. Проблематично использовать фильтрацию с намывным слоем, если целевым продуктом является сама биомасса или внутриклеточные продукты из нее. Даже если целевой продукт находится в фильтрате, возникает проблема утилизации за-грязненного биомассой порошка. Скармливать животным перлит, диатомит нежелательно. Регенерировать порошки отжигом био-массы в печах можно, но это энергоемко и при этом часто нарушаются фильтровальные свойства порошков. Если использовать более мягкие порошки (отруби, древесную муку), то осадок с био-массой можно использовать как корм. Однако эти порошки имеют худшие фильтровальные свойства. Осветляющие фильтры. Эта модификация служит для отделения твердой фазы (мути) от суспензий, содержащих малое количество твердых частиц. Но и это малое количество в готовом продукте или полупродукте иметь нежелательно. Мы ранее уже говорили о ситовых фильтрах (размеры пор меньше размеров твердых частиц). Вот такие фильтры здесь чаще всего и применяются — другие не работают: слишком долго приходится ждать, когда твердые частицы образуют слой осадка. Обычно используют пластинчатые фильтры: микрофильтрационные, если размеры частиц 0,1-10 мкм, ультрафильтрационные, если размеры частиц 10—100 нм. Мы уже упомиңали о недостатках обычного способа ситовой фильтрации, при которой направление потока жидкости перпендикулярно фильтровальной перегородке (или совпадает с направлением фильтрации) (см. рис. 13.4). В этом случае довольно быстро происходит забивание пор перегородки твердыми частицами осадка, и скорость фильтрации сначала уменьшается, а затем фильтрация и вовсе прекращается. Регенерация забитых мембран довольно сложна. Этих недостатков лишены фильтры, в которых направление потока жидкости параллельно фильтровальной перегородке (перпендикулярно направлению фильтрации) (рис. 13.7). В этом случае значительно снижается опасность забивания пор фильтровальной перегородки. ,-Г Скорость потока жидкости в первом варианте равна скорости фильтрации. Во втором же варианте скорость потока суспензии значительно больше скорости потока фильтрата. Технически это требует создания контура циркуляцш суспензш. Такой прием позволяет повышать концентрацию микроорганизмов до 10 % и при этом продолжать микрофильтрацию. Конструкции и материалы, из которых изготовлены подобного рода фильтры, могут быть различными, но для промышленности наиболее привлекательны метамокерамические. Они регенерируются обратным потоком фильтрата (подачей давления в обратном направлении к перегородке) и позволяют проводить тепловую стерилизацию. 5. ФЛОТАЦИЯ Флотация — это выделение клеток микроорганизмов из культуральной жидкости за счет адгезии (прилипания) микроорганизмов к поднимающимся в жидкости пузырькам воздуха и затем сбора пены и ее конденсации (коалесценции). Обычно чем меньше пу-зыри, тем медленнее они поднимаются и тем больше время пребывания^их в жидкости и вероятность захвата клеток микроорганизмов. На рис. 13.8 представлен один из вариантов конструкции флотатора. Флотатор представляет собой две коаксиально расположенные цилиндрические обечайки, кольцевой канал между которыми заполняется флотируемой суспензией. В этот канал снизу подается через специальный диспертатор сжатый воздух, при этом образуется большое количество мелких пузырей. Пузыри всплывают, захватывая по пути клетки микроорганизмов. Далее пена переваливается через край внутреннего цилиндра и отстаивается в кольцевом зазоре внешнего. При этом пузыри разрушаются. Флотат — обогащенная по биомассе жидкость. Измерения показали, что для хорошо флотирующихся клеток концентрация клеток в пене в 5—7 раз превышает их концентраию в исходной суспензии. Для оценки производительности флотатора важно знать время отстоя пены, а оно зависит от множества физико-химических факторов. При этом в обедненной жидкости после ее отвода из аппарата остается 5—8 % общего количества биомассы микроорга-низмов, что является потерями. Во время отстоя пены происходит ее осушение: жидкость по стенкам пузырьков стекает вниз, а биомасса остается в осушенной пене. Размеры клеток флотируемой жидкости — до 10 мкм. Для облегчения флотации в суспензию добавляют флотореаген-ты — длинноцепочечные жирные кислоты и амины. Для обычной флотации размеры пузырей составляют 100 мкм и выше. Такая флотация называется пневматической, или барботажной. Важной модификацией процесса флотации является напорная флотация. Сущность ее состоит в том, что жидкость сначала насыщается газом (обычно воздухом) под давлением (до 5 атм), после чего происходит резкий сброс давления. В результате появляются мелкие пузырьки воздуха, которые и оказывают флотационное действие. При этом размеры пузырьков меньше — около 40 мкм, что облегчает флотацию. Размеры пузырьков получаются различными, если использо-вать для насыщения углекислый газ или смесь углекислого газа с воздухом. За счет более высокой растворимости углекислоты насыщение происходит быстрее, а сами пузырьки больше по размеру. Большие пузырьки полезны, когда необходимо «поднимать» относительно крупные частицы, такие, как хлопья активного ила. Не всегда удобно при напорной флотации насыщать газом саму суспензию. В установках очистки стоков, например, используют вспомогательную флотационную жидкость (воду, или это может быть очищенный от твердых частиц возвратный поток). Эта вспомогательная жидкость насыщается под давлением газом, а затем вводится под слой очищаемой жидкости. Растворенный газ пере-ходит в пузырьки, которые и выполняют флотационные задачи. Электрофлотация — модификация процесса флотации, в кото-ром пузырьки создаются за счет электролиза. Образующиеся пузырьки водорода или кислорода имеют размер до 30 мкм, а пена обогащается флотируемой биомассой в 15—20 раз больше по сравнению с исходной суспензией. Недостатком такой системы является возможность вредного воздействия электрического тока на клетки микроорганизмов. Вопросы для повторения 1. Назовите границы использования различных методов разделения суспензий по размеру частиц. 2. В чем состоят особенности методов отстаивания для отделения биомассы микроорганизмов? 3. Что такое иловый индекс? 4. Чем отличается коагуляция от флокуляции? 5. Какую роль играют процессы коагуляции и флокуляции при отделении биомассы микроорганизмов от культуральной жидкости? 6. Как определяется сепарируемость культуральных жидкостей? 7. Какова движущая сила процессов сепарирования и цеитрифугирования биомассы микроорганизмов? 8. По какому показателю сравнивают между собой сепараторы и центрифуги? 9. Поясните различие между ситовым и объемным принципами фильтрации суспензий. 10. В чем суть фильтрации с намывным слоем фильтровального порошка? 11. Какие материалы используются в биотехнологии в качестве фильтроваль-ных порошков? 12. Осветляющие фильтры — в чем их отличие? 13. Микрофильтрация: что обеспечивает возможность высоких скоростей фильтрации при достаточно концентрированных суспензиях? 14. Каковы недостатки микрофильтрации биомассы микроорганизмов по сравнению с тканевой фильтрацией? 15. На чем основана флотация микроорганизмов? 16. Что дает использование различных методов флотации — пневматической, напорной, электрофлотации? 17. В чем смысл использования специальной флотирующей жидкости при ңа-порной флотации? Лекция № 10 ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ 1. 2. 3. 4. Основные понятия. Классификация методов дезинтеграции. Механические методы. Немеханические методы. В случаях, когда целевой продукт локализован в клетках микроорганизмов и самопроизвольно не переходит в жидкость, приходится применять специальную операцию разрушения клеток, в результате чего их содержимое оказывается в водной фазе, откуда его можно выделять практически теми же методами, что и другие, внеклеточные, продукты метаболизма. 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ Дезинтеграция клеток — это не стерилизация. При дезинтеграции важно не просто сделать клетки нежизнеспособными (например, путем нагрева), но главное нарушить оболочку клеток, чтобы внутриклеточное содержимое (цитоплазма) могло выделиться в окружающую клетку жидкость или могло быть выделено из нее через ослабленную клеточную стенку. Нежелательны дальнейшие измельчения полученного дезинтеграта. Именно «однократность» процесса разрушения клетки отличает дезинтеграцию от измельчения обычных материалов. И все же в терминах процессов и аппаратов химической технологии процесс дезинтеграции более всего близок к процессу измельчения материалов. Трудности по сравнению с традиционными объектами химической технологии заключаются в следующем: микробные клетки весьма малы; они имеют плотность, близкую к плотности окружающего раствора; клеточные стенки построены из природных биополимеров, достаточно эластичных и прочных. Различия в составе клеточных стенок. Клеточные стенки различных видов микроорганизмов отличаются по толщине, составу и свойствам. Рассмотрим эти различия. Грамположителъные бактерии. Стенки достаточно толстые (15—20 нм), содержат 40—90% пептидо-гликанов ( т. е. полимеров с аминокислотными и глюкозными составляющими цепи), а остальное — полисахариды и тейхоевые кислоты. Грамотрицателъные бактерии. Клетки содержат гораздо более тонкий пептидогликановый слой (до 2 нм), но зато имеют внешнюю мембрану. Дрожжи имеют стенки клетки толщиной около 70 нм (чем клетка старше, тем толще). Они построены в основном из полисахаридов (глюканов и маннанов). Грибы. В большинстве грибов стенки клетки состоят главным образом из полисахаридов — глюкана, хитина, а также гликопротеина. Животные клетки имеют очень тонкие стенки (одна цитоплазматическая мембрана). Чувствительность клеток к внешним механическим воздействиям. По чувствительности к внешним механическим воздействиям клетки разной природы располагаются в таком ряду (в порядке понижения чувствительности): животные клетки -» грамотрицательные бациллы и кокки -> грамположительные бациллы —> дрожжи -» грамположительные кокки -> споры —> мицелий грибов. 2. Классификация методов дезинтеграции клеток. В общей форме классификация представлена на рис. 14.1. Все методы состоят из двух больших групп: механические (физические) и немеханические методы. Механические методы делятся на две подгруппы в зависимости от фазы, в которой происходит процесс дезинтеграции: твердофазные и жидкофазные. Твердофазные методы подобны методам измельчения твердых тел любого происхождения (размол, экструзия). Понятно, что биомасса клеток перед началом такого процесса должна быть переведена в замороженное состояние. Немеханические методы включают в себя сушку, которая резко изменяет структуру клеток и их оболочек, и лизис различной природы (под воздействием физических, химических и ферментативных факторов). 3. МЕХАНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Механические жидкофазные методы. В этих методах биомассу используют в виде суспензии, хотя это уже не просто культураль-ная жидкость, а достаточно хорошо сгущенная суспензия (с концентрацией биомассы 4—30 %). Рассматривая проблемы масштабного перехода, мы упоминали о механическом воздействии на клетки. Указывались даже пределы окружной скорости мешалки, которые не нужно превышать, чтобы клетки не повреждались (8 м/с). Может быть, достаточно просто превысить эту скорость, да еще специально сделать мешалки с острыми краями, чтобы достичь нужного эффекта? Что-то в этом роде используется для измельчения и гомогенизации растительных и животных тканей — гомогенизаторы. Однако эффективность таких устройств по отношению к клеткам не столь радикальна. Для бактерий размером 0,5—1 мкм никакие острые края мешалок не будут достаточно остры, разве что для нежных клеток животного происхождения. Наиболее распространены в этом классе баллистические дезинтеграторы, напоминающие по своей конструкции шаровые мельницы. Эти дезинтеграторы имеют камеру с вращающимся ротором (или просто вращающуюся камеру). Камера заполняется специальными мелющими телами — стеклянными или полимерными шариками — и обрабатываемой суспензией микроорганизмов. Размеры шариков порядка 0,3—0,5 мм (установлено, что эти размеры являются оптимальными). Далее обеспечивается вращение ротора и воздействие мелющих тел на клетки путем истирания, раздавливания. Чем выше скорость вращения барабана (а скорости здесь достигают 2000 об/мин и более), тем больше эффективность дезинтеграции. Эффективность оценивается по величине R — отношению концентрации разрушенных клеток к исходной концентрации клеток, загруженных в дезинтегратор. Концентрация микроорганизмов в суспензии не влияет на качество дезинтеграции в довольно широких пределах (40—200 г/л). Недостатки баллистических дезинтеграторов: сложность устройства; большая энергоемкость; низкая производительность; разогревание суспензии, которое приводит к порче тех компонентов клетки, ради которых и проводится их дезинтеграция. Для преодоления последнего из перечисленных недостатков используют охлаждение, вплоть до охлаждения сжиженным СО2, но и это не очень помогает. Воздействие на клетки перепада давления. В таких дезинтеграторах клетки могут находиться либо во взвешенном состоянии в жидкости (тогда она пропускается через сопло), либо в замороженном состоянии (тогда их продавливают через узкую щель методом экструзии). В первом случае действуют два эффекта: кавитационный с образованием срезающих турбулентных пульсаций и декомпрессионный, в результате которого при резком сбросе давления клетка как бы взрывается изнутри. Во втором случае влияют именно механические воздействия кристаллов льда на стенки клетки. В жидкостном варианте давление создается плунжерным насосом или прессом. Величина давления варьируется от 10 до 210 МПа, чаще - 50-55 МПа. Недостатки этого способа: необходимость высоких давлений; низкая производительность (отверстие мало!); плохая работа на мицелиальных микроорганизмах (они забивают отверстие даже при столь высоких перепадах давления). Те же недостатки характерны и для экструзии. Здесь давления достигают 550 МПа __ Ультразвуковая дезинтеграция. Применяются частоты озвучивания суспензии 15-25 кГц. Здесь также происходит нагрев суспензии I Для больших масштабов метод мало применим, так как отсутствуют мощные генераторы ультразвука, к тому же в толстых слоях жидкости происходит гашение звука. В табл. 14.1 представлена сравнительная чувствительность отдельных видов клеток к разрушению различными механическими методами. Показатель эффективности дезинтеграции R колеблется в широких пределах — от 10—20 % до 90—95 % и даже до 100 % с различными, конечно, затратами. Энергетические затраты составляют для баллистических дезинтеграторов 0,3—1 Дж/мг биомассы и для нагнетательных дезинтеграторов 0,5—1 Дж/мг биомассы (это очень большие затраты). 4. НЕМЕХАНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Сушка — наиболее простой метод, который резко изменяет структуру клеточной оболочки. После сушки, в результате которой клетки не остаются живыми и теряют внутриклеточную влагу, в оболочке клетки появляется много «трещин». Ресуспендирование высушенных клеток в водной фазе позволяет выделить внутриклеточные компоненты. Недостатком метода является то, что при горячей сушке денатурируются ферменты и инактивируются многие биологически активные вещества. Лизис, т. е. разрушение, «разъединение» клеточной оболочки, кажется наиболее привлекательным для решения задач выделения внутриклеточных продуктов. Методы лизиса можно подразделить на физические, химические и ферментативные в зависимости от характера воздействий, вызывающих лизис клеточной оболочки. Физические методы лизиса включают в себя метод осмотического шока и метод попеременного замораживания — оттаивания. Осмотический шок. По этому методу в суспензии сначала создается высокое осмотическое давление (например, с помощью 1 М глицеринового или 1 М сахарозного раствора). Затем производится резкое разбавление суспензии водой. При этом клетки разрушаются под действием высокого внутриклеточного осмотического давления. Подобным же образом действуют растворы солей. Есть, например, такие микроорганизмы — галофилы, которые культивируются на высококонцентрированных солевых средах. По окончании процесса культивирования разбавление культу-ральной жидкости водой почти сразу приводит к лизису клеток. Это используется в технологии — не требуется специальных ухищрений по дезинтеграции клеток. Замораживание—оттаивание. Известно, что замораживание используется в противоположных целях -— для длительного хранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии. Но при этом и замораживание, и оттаивание проводят в специальном программированном режиме, препятствующем повреждению клеток. При дезинтеграции, наоборот, используют режимы, способствующие повреждениям клеточных оболочек. Недостатками метода являются большая длительность и энергоемкость и к тому же невысокая степень дезинтеграции. Это не позволяет широко использовать данный метод в промышленном масштабе. Химические способы лизиса предусматривают воздействия на клетку химических реагентов различной природы, которые приводят к деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизмов. Обработка суспензии микроорганизмов такими реагентами, как щелочь, кислота, мочевина, аммиак, бутанол, толуол, пероксид водорода, детергенты, повышает проницаемость клеточных стенок, благодаря чему биополимеры выводятся из клеток в раствор. Для усиления действия возможно использование упомянутых реагентов в комплексе с повышением температуры, резким изменением величины рН. Некоторые антибиотики, ингибирующие рост клеток микроорганизмов, оказывают литическое воздействие на клетки. Среди реагентов упоминают также глицерин, олеиновую кислоту, способствующие быстрому лизису клеток. Эти способы имеют важный недостаток. Химические реагенты могут вступать в реакцию с извлекаемыми из клетки биополимерами и к тому же остаются в лизированной суспензии, откуда их потом трудно выделять. Ферментативные способы лизиса. Использование биологических агентов для ферментативного лизиса клеточных оболочек является одним из наиболее перспективных методов. Среди этих методов различают: автолиз — разрушение клеточных стенок собственными клеточными ферментами, ферментолиз — добавление протеаз, гликаназ и других ферментов в раствор, добавление пенициллина как вещества, препятствующего синтезу материала клеточной стенки, и фаголизис — разрушение клеток под воздействием фагов. Автолиз. Для разложения клеточных стенок собственными протеолитическими ферментами клетки необходимо сначала осуществить шоковое воздействие или величиной рН (обычно закислением), или температурой, или затравочной дозой таких реагентов, как толуол, хлороформ, этилацетат, олеиновая кислота. Далее процесс автолиза протекает при температуре, свойственной данному виду микроорганизмов. Например, автолиз дрожжей происходит при 45—50 С. Надо отметить," что это довольно длительный процесс (12—24 ч). Ферментолиз. Недостатки автолиза привели к использованию интродуцируемых в суспензию внеклеточных ферментов, вызывающих лизис клеточной стенки. Исходя из рассмотренного ранее состава клеток, такими ферментами могут быть протеазы, гликаназы, манназы и иногда лизоцим, представляющий собой комплекс различных ферментов. Для этих целей эффективно применение иммобилизованных ферментов, которые можно использовать многократно. Получаемые при автолизе и ферментолизе растворы часто содержат легкоусвояемые вещества (белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и др.). Поэтому автолизаты и ферментолизаты — не просто полупродукт для выделения внутриклеточных составляющих, но также могут быть хорошим кормовым продуктом. Он особенно подходит для молодняка рыб и животных, которые еще не приспособились своими ферментами переваривать клеточные оболочки и разрушать их. Клеточные оболочки, также являющиеся продуктом процесса дезинтеграции, могут быть отделены от раствора, высушены, после чего их вполне можно использовать как хороший сорбент для вредных примесей в пищевых продуктах или как тот же корм для животных. Добавление пенициллина. Биохимическая основа действия пенициллина на микробные клетки — это торможение синтеза нового материала клеточной стенки. В результате стенка истончается за счет собственного всегда идущего автолиза и становится проницаемой для внутриклеточных биополимеров. Фаголизис. Известно «вирусное заболевание» микробных культур, вызываемое фагом. Его отличительным свойством является как раз лизис микробных клеток, т. е. вроде бы то, что нам нужно при дезинтеграции. Теоретически такую возможность себе можно представить. Однако последствия заражения фагом производственных ферментеров настолько велики, что в практике такая возможность выглядит примерно как способ устранения головной боли с помощью гильотины. Несмотря на большое разнообразие рассмотренных методов, следует признать, что в промышленных условиях наиболее перспективно применение методов лизиса — с использованием либо мягких химических реагентов, либо ферментативных. Другие методы имеют лишь вспомогательное значение для опытов в лаборатории. Вопросы для повторения .1. Каково основное назначение дезинтеграции клеток микроорганизмов? Поясните отличие дезинтеграции от стерилизации и измельчения. 2. Каковы особенности клеточных стенок бактерий, дрожжей, грибов, живот-ных и растительных клеток? 3. Назовите виды клеток в порядке возрастания чувствительности к механическим воздействиям. 4. Что такое баллистическая дезинтеграция? Назовите ее достоинства и недостатки. 5. Что такое декомпрессионная дезинтеграция? Назовите движущую силу это-го процесса. 6. Что является причиной разрушения клеток при экструзионной дезинтеграции? 7. Как влияют концентрация клеток и давление на эффективность баллистической дезинтеграции? 8. Чем отличаются ферментативные методы дезинтеграции от автолиза? 9. Каковы затраты энергии на механическую дезинтеграцию клеток микроор-ганизмов? 10. За счет каких факторов происходит дезинтеграция клеток при их замораживании и последующем оттаивании? 11. Какие методы дезинтеграции наиболее эффективны в крупномасштабном промышленном производстве? Лекция № 11 Экстракционные методы выделения продуктов метаболизма. 1. Традиционные методы экстрагирования продуктов из биомассы 2. Экстрагирование «суперкритическими» жидкостями 3. Жидкофазная центробежная экстракция Экстракционные методы вьщеления продуктов, используемые в биотехнологии, подразделяются на две основные группы: методы экстрагирования, когда целевой продукт извлекается жидкостью (экстрагентом) из твердой фазы (рафината) — чаще всего биомассы микроорганизмов, и методы жидкостной двухфазной экстракции, в которой продукт, растворенный в жидкой фазе (рафинате), извлекается друтой жидкостью (экстрагентом) — обычно это органичесюий растворитель. В обоих случаях фаза, из которой выделяется продукт, называется рафинат, жидкая фаза, служащая агентом процесса экстракции, называется экстрагент, эта же фаза после перехода в нее растворенного вещества называется экстракт. Твердую фазу (рафинат) после извлечения из нее растворенного вещества называют шрот. 1. ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ИЗ БИОМАССЫ Экстрагирование из биомассы клеток. Некоторые из продуктов метаболизма можно выделить из биомассы без разрушения кле-точных стенок (липиды, некоторые ферменты). В большинстве же случаев используют сначала рассмотренные ранее способы дезин-теграции клеток и экстрагированию лодвергают дезинтеграт — разрушенные клетки или их оболочки. Экстрагирование применяется для извлечения ферментов из қультур грибов, выращенных твердофазной ферментацией, микробного жира или липидов из биомассы дрожжей, антибиотиков и полипептидов, локализован-ных на клетках микроорганизмов, при выделении внутриклеточ-ных биополимеров типа белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т. д. Всегда за экстрагированием следует стадия отделения твердой фазы, в результате чего извлекаемое вещество переводится в жидкую фазу — экстракт, из которого в дальнейшем и выделяют продукт. В качестве экстрагентов в зависимости от вида извлекаемого вещества используются: вода, водные растворы кислот или щелочей, органические растворители — спирты, ацетон, нефрас (смесь легких углеводородов). Существует несколько способов осуществления экстрагирования: экстрагирование с перемешиванием, экстрагирование в неподвижном слое, экстрагирование одно- и многоступенчатое, прямоточное и противоточное. Экстрагирование с перемешиванием является наиболее простым способом экстрагирования. В аппарат с мешалкой загружается твердая фаза (биомасса после сгущения или отделения на фильт-ре) и жидкая фаза (экстрагент). Процесс далее протекает при перемешивании. Концентрация растворенного вещества в биомассе после однократного экстрагирования существенно меньше, чем перед ним. Эта величина тем меньше, чем больше коэффициент распределения ужт и чем больше соотношение объемов жидкости и твердой фазы Уж / Ут. Кстати, отсюда же видно, что на конечную величину концентрации не влияет коэффициент массоотдачи Ку, он лишь ускоряет или замедляет процесс экстрагирования, но итоговый результат одинаковый. Чтобы повысить концентрацию вещества в экстракте, стараются не слишком увеличивать отношение Үж к Қ, Лучше сначала отделить твердую фазу от экстракта и провести повторно экстрагирование свежим растворителем. Так можно делать несколько раз, а затем объединить экстракты. Это будет лучше для полноты извлечения, чем сразу однократно добавить весь объем экстрагента. В этом заключается смысл многоступенчатого, или многократного, экстрагирования. Еще лучше использовать противоточное экстрагирование: свежую биомассу с наиболее высокой концентрацией извлекаемого вещества соединяют с экстрактом, полученным после двух-трех операций экстрагирования, а биомассу после 2-го или 3-го экстрагирования — со все более чистым экстрагентом (рис. 15.3). На схеме не отмечено, но предполагается, что после каждой стадии происходит разделение жидкой и твердой фаз. Экстрагирование в неподвижном слое используется в том случае, когда биомасса уже предварительно высушена. Она загружается в колонны или патроны (диффузоры), через которые проходит жидкий экстрагент. Обычно используют батарею из 20 или более последовательно соединенных диффузоров (рис. 15.4). По мере исчерпания веществ в диффузорах производят пере-ключение патронов и их перезагрузку, Свежий патрон (по биомассе) является последним по ходу потока экстрагента. Происходит как бы ступенчатое движение биомассы (без ее отделения от жидкости, как в экстрагировании с перемешиванием). Организация межфазной поверхности. Массоотдача локализованного в биомассе вещества от порошка биомассы к жидкости в аппарате — не самый лучший способ экстрагирования. При этом образуются агломераты биомассы, в результате чего не все клетки оказываются доступными для экстрагента. Кроме того, для повы-шения коэффициента массоотдачи важно повысить относитель-ную скорость движения биомассы и жидкой фазы. Для улучшения структуры межфазной поверхности часто из биомассы формируют специальной формы гранулы, называемые «лепесток». Так поступают при экстракции липидов (жиров) из микробной биомассы, Для этого сначала просто гранулируют био-массу, получая сферические гранулы. Затем эти гранулы пропус-кают через вальцы, получая сплющенные лепешки толщиной 0,2—0,3 мм — «лепестки». Далее уже эти «лепестки» загружают в аппарат для экстрагирования, и при этом обеспечивается более эффективная массоотдача. 2. ЭКСТРАГИРОВАНИЕ «СУПЕРКРИТИЧЕСКИМИ» ЖИДКОСТЯМИ При выделении липидов и всякого рода неустойчивых, лабильных соединений, проводя экстрагирование, следует учитывать дальнейшие операции выделения. Поэтому часто используют лег-кокипящие соединёния — спирт, нефрас, гексан, ацетон, которые в дальнеңшем удаляют путем выпаривания. Но для выпаривания этих соединений требуются относительно высокие температуры, которые могут повлиять на качество выделяемых биопродуктов. При этом также необходимы затраты энергии на испарение экстрагентов и их последующую конден-сацию. Кажется очевидным, что для решения этих проблем следовало бы брать в качестве растворителей жидкости, имеющие более низкую температуру кипения. Одной из таких жидкостей является диоксид углерода. Правда, при атмосферном давлении температура его кипения довольно низка (ниже —50 °С). Но с повышением давления температура повышается: при давлении 7,3 МПа, например, температура кипения составляет +31 °С. Обычно плотности газа и жидкости резко различаются. Например, при +10 °С плотность жидкости С02 составляет 0,86 г/см\ а газа — 0,14 г/см3. При 20 °С — соответственно 0,77 и 0,19 г/см3, а при 30 °С — 0,59 и 0,35. А вот при 31,1 °С и давлении 7,3 МПа плотность жидкости и газа становится равной. Если и температу-ра, и давление выше своих критических значений, вещество обла-дает свойствами, промежуточными между жидкостью и газом. Эта фаза — фаза «суперкритической» жидкости. Путем повышения давления газ при любой температуре до критической точки А (31,1 °С) можно превратить в жидкость. И наоборот, газ при любом давлении ниже критического (7,3 МПа) можно превратить в жидкость путем снижения температуры. Физические и диффузионные свойства «суперкритических» жидкостей находятся в диапазоңе между значениями соответствующих свойств газов и истинных жидкостей и обычно весьма бла-гоприятны для их применения в качестве экстрагентов. В частности, очень низка их вязкость, что снижает затраты на перекачивание. Кроме того, при работе на границе области критических значений температуры и давления можно путем небольших температурных воздействий переводить «суперкритические» жидкости в газы и обратно в жидкости. Существуют и другие вещества, имеющие критические температуры в областях, близких к нормальной температуре (табл. 15.1). Таким образом, процесс выделения продукта проводится при обынной температуре и не требует выпарки для разделения продукта и растворителя-экстрагента. «Суперкритические» жидкости являются неполярными растворителями и лучше растворяют неполярные вещества. Ионизированные вещества в «суперкритических» жидкостях практически нерастворимы. Хорошо растворяются: углеводороды и растворимые в жирах органические соединения — парафины, многие эфиры, лактоны и глицериды; многие лекарства, кофеин, никотин, стероиды и алка-лоиды, вкусовые и ароматические компоненты. Интересно, что выделение может быть даже из водных растворов Общая оценка процесса экстрагирования «суперкритическими жидкостями» такова. Преимущества: высокая энергетическая эффективность; низкие температуры; нетоксичные и недорогие растворители (экстрагенты); низкая вязкость, высокая диффузионная способность; силой растворителя можно управлять. Недостатки'. необходимо оборудование высокого давления; относительно низкая сила растворителя; плохие растворители для полярных соединений; недостаточно данных для надежного проектирования (все нуж-но проверять экспериментально). 3. ЖИДКОФАЗНАЯ ЦЕНТРОБЕЖНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ Жидкофазная экстракция наиболее часто используется в производствах антибиотиков, в том числе при производстве наиболее крупнотоннажного из них — пенициллина. Блок-схема технологии антибиотика, как много там стадий жидкофазной экстракции: сначала пенициллин из водной фазы переводят в органическую (бутилацетат), затем из органической фазы — опять в водную, затем опять в органическую и т. д. Антибиотик в неионизированной форме хорошо растворяется в некоторых органических растворителях (бутилацетате или амилацетате). Растворимость его в таких растворителях почти в 100 раз больше, чем в воде. Диссоциированный же анион не имеет столь хорошей растворимости в органической фазе. Основной характеристикой процесса экстракции «жидкость—жидкость» является коэффициент распределения Кр. Конечные значения равновесной концентрации продукта в рафинате и степени извлечения зависят от коэффициента распределения, соотношения объемов фаз и не зависят от коэффициента массоотдачи. Проводя экстракцию при рН 2,0, мы достигаем хорошего коэффициента распределения. Процесс экстракции должен осуществляться в такой последовательности: подкисление водного раствора пенициллина; добавление к нему экстрагента — органической фазы; диспергирование фазы для обеспечения наибольшей поверхности раздела фаз; интенсивное перемешивание для осуществления процесса собственно экстракции, причем время протекания процесса должно быть настолько малым, чтобы не успело проявиться разрушающее действие низких значений рН на водные растворы пенициллина; после завершения процесса экстракции — разделение (редиспергирование) водной и органической фаз. Все эти операции быстро можно провести, только если: процесс проводится в непрерывном режиме; в качестве аппарата используется центробежный экстрактор. Вот почему в биотехнологических процессах экстракция осуществляется в центробежных экстракторах, напоминающих по конструкции центробежные сепараторы. В них происходит эмульгирование фаз путем смесителя- инжектора, экстракция в центро-бежном поле и затем деэмульгирование органических фаз. Кроме того, в многоступенчатых центробежных экстракторах обеспечи-вается еще противоточное движение фаз, создающее равномерную по ходу потока движущую силу массоотдачи. Преимущества таких экстракторов — высокая производитель-ность и возможность работы с лабильными продуктами. Недостатки: высокие энергетические затраты, возможность проскока частично эмульгированного елоя («третьего слоя»), что увеличивает потери целевого продукта. Вопросы для повторения 1. Назовите термины, обозначающие основные материальные компоненты, участвующие в процессе экстрагирования, — жидкую и твердую фазу до и после процесса экстрагирования. 2. В чем различие между одноступенчатым и многоступенчатым процессами экстрагирования биомассы микроорганизмов? 3. Каковы способы организации противотока и увеличения средней движушей силы при экстрагировании биомассы микроорганизмов? 4. В чем заключается метод создания эффективной межфазной повсрхности при экстрагировании компонентов из биомассы микроорганизмов? 5. Что дает экстрагирование «суперкритическими» жидкостями? 6. Назовите вещества, используемые в качестве экстрагентов биомассы — «су-перкритических» жидкостей, и параметры их критических точек по температуре и давлению. 7. Какие вещества можно экстрагировать, используя «суиеркритические» жид-кости? 8. Расскажите об особенностях жидкофазной экстракции лабильных продуктов микробиологического синтеза. 9. Почему при экстракции пенициллина используют низкие значения рН? 10. Почему для экстракции пенициллина используют центробежные экстракторы? Лекция № 12 Сорбционные методы выделения продуктов биосинтеза 1. 2. 3. 4. 5. 6. Основные понятия Ионный обмен Адсорбция микропористыми сорбентами Хроматография Биосорбция Иммуносорбция Сорбционные методы представляют собой выделение растворенного в жидкой фазе компонента с помощью твердофазного сорбента. В какой-то мере этот процесс является по смыслу про-тивоположным экстрагированию, где, наоборот, полезный компо-нент локализован в твердой фазе, а в процессе экстракции перехо-дит в жидкую (экстрагент). При сорбции же растворенное веще-ство из раствора переводится в твердую фазу (сорбент), На этом, однако, сорбционный метод не заканчивается. Да-лее следует отделение твердой фазы от рафината — раствора, из которого извлечен растворенный компонент, и последующая десорбция этого компонента из сорбента в новую жидкость, отлича-ющуюся от исходного раствора какимито свойствами или просто более чистую, не содержащую посторонних примесей в исходном растворе. Эта вторая операция (десорбция) уже точно практически ничем не отличается от экстрагирования, разве что при экстрагировании твердой фазой является сама биомасса, а при десорбции — промежуточный рабочий агент, специально вносимый в жидкую фазу извне. Твердая фаза — «временное пристанище» растворенного вещества. Рассмотрим 4 различных модификации сорбционных методов: ионный обмен; адсорбция микропористыми сорбентами; хроматография; биосорбция. Во всех случаях мы будем подразумевать, что сорбционный метод включает в себя как собственно сорбцию, так и десорбцию, и рассматривать метод вьщеления как совокупность этих двух процессов. 2. ИОННЫЙ ОБМЕН Ионообменный метод основан на способности специальных сорбентов — ионообменных смол — сорбировать биологически активные вещества, имеющие ионную природу (т. е. являющиеся кислотой, основанием или солью), благодаря эквивалентному обмену между ионами вещества, находящегося в растводе, и ионами сорбента. Ионообменные смолы, или иониты, представляют собой синтетические высокомолекулярные органические вещества, практически нерастворимые в воде. Они содержат обменные ионы, один из ко-торых связан с твердым носителем и называется фиксированным, или анкерным ионом. С ним электростатически связан противоположно заряженный ион, называемый подвижным ионом, или противоионом. При введении ионита в жидкость он немного набухает, так как в его поры проникает вода. Но структура ионита построена не из линейных, а из пространственных трехмерных полимеров, что ограничивает способность к набуханию. Это связано с тем, что при полимеризации матрица вещества образует длинные продольные цепи, соединенные между собой поперечными мос-тиками — «химическими узлами» (рис. 16.1). Увеличение или уменьшение числа таких узлов влияет на размер микропор ионитов, а значит, и на их проницаемость. Набухшая структура ионита подобна пространственной сетке (губке), внутри которой передвигаются обменивающиеся ионы. Сам процесс ионного обмена имеет обратимый характер и протекает следующим образом: Тв.—Н+ + (растворениый ион) <-* Тв.—(растюренный ион)+ + Н+. (16.1) Ионит Ионит, сорбировавший растворенный ион Высвобождающийся противоион диффундирует далее через поры ионита в жидкость. Движение йонов растворенного вещества внутрь гранулы ионита и, наоборот, вывод противоионов в окружающую жидкость происходят за счет диффузии. Как и в любом массообменном процессе, в какой-то момент наступает равновесие между скоростями сорбции и десорбции Сорбция же обычно осуществляется до тех пор, пока вся обменная емкость ионита не будет заполнена. Кстати, в процессах ионообмена процесс десорбции имеет специфическое название элюция, а десорбирующая жидкость называется элюентом. Как на практике осуществляется процесс ионного обмена? Наиболее прост статический способ. В аппарат с мешалкой загружают ионит и обрабатываемый раствор. Затем при перемешивании ионит суспендируется и дается время, достаточное для установления равновесия. Далее раствор сливают или фильтруют (если гранулы ионита слишком мелкие). Раствор обычно направляют в канализацию (так как он обеднен по целевому продукту) или повторно используют на стадии ферментации. Ионит же возвращают в аппарат, заливают элюентом, т. е. водным раствором, часто с измененным значением рН или с добавлением противоиона (иона хлора). Происходит обратный процесс (десорбция, элюция) — противоион сорбируется в ионите, а сорбированное ранее вещество переходит в элюент. При этом продукт освобождается от примесей, которые не сорбируются и уходят с исходным раствором. Однократная сорбция—десорбция имеет недостаток: при этом сорбент не полностью поглощаетрастворенное вещество и не полностью переходит в элюент. Поэтому процесс иногда повторяют. Чаще же в промышленности используют динамический способ. В этом способе ионит загружается в аппарат и обрабатываемый раствор непрерывно протекает через слой ионита. Назвать этот процесс полностью непрерывным нельзя, так как ионит загружается и выгружается периодически, поэтому процесс нестационарный. Аппарат с загруженным ионитом называется ионитовым фильтром, или ионообменной колонной. Возможны два варианта таких «фильтров»: закрытый (напорный) и открытый (безнапорный). Закрытый фильтр (рис. 16.3) представляет собой колонну, заполненную гранулами ионита. Жидкость подается под напором сверху. У днища внутри аппарата устанавливается колпачковый фильтр с прорезями 0,2—0,3 мм, через которые проходит жидкость, но задерживаются гранулы ионита. Недостатком такой простой конструкции является неподвижность слоя ионитов, который сжат давлением нагнетаемой жидкости. Происходит слипание частиц ионита, образование каналов и застойных зон. В результате довольно большая часть ионита не участвует в процессе ионообмена, возможно также инфицирова-ние застойных участков посторонней микрофлорой. Открытый фильтр (рис. 16.4) — раствор подается в него снизу через специальный слой зернистого материала. Скорость потока в аппарате выбирается таким образом, чтобы слой ионита находился во взвешенном состоянии. Чтобы при этом не происходило выноса гранул ионита, верхняя часть колонны выполнена расширенной. В этой части колонны скорость потока снижается, что способствует оседанию гранул. Вывод отработанного раствора из колонны снабжен системой улавли-вания гранул ионита (за счет изменения направления потока). В обоих случаях после насыщения слоя ионита (определяемого по повышению концентрации растворенного вещества в отработанном растворе) раствор переключается на другую колонну, затем на третью, четвертую и т. д. Обычно существует батарея ионообменных колонн, работающих в различных режимах. На отключенной колонне сначала проводят вытеснение рабочего раствора обессоленной водой, затем промывают ионит раствором антисептика. Далее осуществляется процесс извлечения полезного вещества из сорбента — элюция. Элюат (чистый раствор, содержащий десорбированное вещество) поступает на дальнейшие стадии концентрирования. Элюция прекращается после снижения концентрации в выходном потоке до предель ного уровня. После элюции проводится процесс регенерации ионита. Для этого через слой ионита пропускают раствор противоиона, который сорбируется на ионите, занимая там свое «законное место». Поскольку в рассмотренной схеме слой ионита остается неподвижным, приходится иметь батареи аппаратов, постепенно переключая их на тот или иной режим работы. Обычно количество элюата меньше, чем количество исходного раствора, что позволяет наряду с очисткой вещества от примесей проводить частичное концентрирование раствора. Главное же в этом методе — это отделение продукта от примесей, «грязи». Способность ионообменных смол сорбировать имен-но целевой продукт называется селективностью. При помощи ионитов с очень высокой селективностью дела-лись попытки выделения растворенного компонента (например, антибиотиков) прямо из культуральной жидкости, содержащей биомассу микроорганизмов. Хотя при этом исключается стадия фильтрации, это не всегда хорошо — остатки сред и микроорганизмы забивают поры ионита, способствуют обрастанию его гранул. Ионообменным способом вьщеляют многие антибиотики, аминокислоты, ферменты. Несколько слов о самих ионообменных смолах. Есть много типов ионитов, имеющих размеры гранул от 300 мкм до 2 мм и более. При этом очень важен их равномерный дисперсный состав (чтобы не было уноса). Иногда делают смолы с непористым внутренним ядром, внешний слой смолы занимает лишь 30—50 мкм, что способствует более быстрой сорбции — десорбции. В качестве матриц в смолах используют: полистирол (поливинилбеизол); полиакрилат, полиметакрилат; полиамин; целлюлозу, декстран и др. В качестве функциональных групп применяются: карбоксильные; сульфоновые; первичные — четвертичные аминогруппы. Преимущества метода: простота аппаратурного оформления; многократное использование ионообменных смол; возможность полной механизации и автоматизации процесса; лротекание процесса в водных растворах, без использования вредных органических растворителей. Недостатки метода: нельзя использовать для извлечения неполярных веществ; селективность метода не всегда достаточна для разделения сме-си веществ; на-гіичие твердой фазы затрудняет возможность использования противотока для создания равномерной движущей силы процесса; довольно велико гидравлическое сопротивление колонн при малых размерах гранул ионита. Использование твердофазных ионитов связано с одним противоречием. С одной стороны, для быстрой сорбции следует снижать размер гранул. С другой стороны, это технологически неудобно: создается большое гидравлическое со-противление, увеличивается возможность уноса ионитов, затруд-няется отделение гранул от раствора. Часть этих недостатков исключается при использовании жидких ионообменников, представляющих собой амины или органические кислоты или алкилфосфаты с молекулярной массой 250—500. В этих случаях ионный обмен протекает быстро, а для его аппара-турного оформления используются аппараты для экстракции жидкость—жидкость. Собственно говоря, и сам процесс очень напоминает экстракцию, хотя в обмене участвуют ионы, а не молекулы. 3. АДСОРБЦИЯ МИКРОПОРИСТЫМИ СОРБЕНТАМИ Процесс адсорбции по существу ничем не отличается от ионного обмена, с той лишь разницей, что на микропористых сорбентах обычно сорбируются не ионы, а целиком молекулы, чаще неполярных веществ. Соответственно в качестве сорбентов выступа-ют не ионообменные смолы, а материалы без функциональных групп или микропористые адсорбционные смолы. Связывание субстанций на этих сорбентах происходит не по стехиометрическим соотношениям, как в ионитах, например, а под воздействием сил Ван-дер-Ваальса. Важнейшими характеристиками этих сорбентов являются: объем пор; удельная поверхность; средний диаметр пор; распределение пор по размерам. Наиболее типичным и первым из такого рода сорбентов является активный уголъ, Сейчас выпускаются полимерные сорбенты, которые по качеству превосходят активный уголь. Химический состав этих сорбентов: неполярные — стирол; полуполярные — акриловые эфиры; полярные — сульфоксиды, амиды. Физинеские свойства: внутренняя поверхность 20—800 м2Д (для сравнения: у актив-ного угля — около 60 м2/г); объем пор 0,5—1,2 мл/г; средний диаметр пор 5—130 нм (у активного угля — около 13 нм). Практически любое вещество, которое можно экстрагировать органическим растворителем, можно связать и специально подобранным сорбентом. Особенностъ адсорбентов — их емкость увеличивается при возрастании концентрации солей в среде (для ионообменников, наобо-рот, уменьшается). В остальном сорбция микропористыми сорбентами протекает аналогично ионному обмену (имеется изотерма адсорбции, дина-мика сорбции подчиняется тем же закономерностям, что и ион-ный обмен). Соответственно аппаратура и технологические схемы для этого процесса также аналогичны используемым для ионного обмена. 4. ХРОМАТОГРАФИЯ Сорбция в двух изложенных ранее модификациях — ионный обмен и адсорбция микропористыми сорбентами — предполагает высокую селективность сорбентов или отсутствие в обрабатываемом растворе веществ, имеющих близкие характеристики по се-лективности. Между тем в биологических растворах часто оказы-вается смесь близких по природе веществ, имеющих в то же время различную биологическую активность. Сорбенты при этом адсорбируют всю эту смесь, да и при десорбции в конечном счете все эти вещества выделяются вместе, хотя и очищенными от других загрязняющих веществ. Возникает задача разделения этих близких по природе веществ. Эту задачу выполняет процесс хроматографии. Хроматография известна больше в измерительной технике, где с ее помощью решают задачу количественного определения вещества, находящегося в сложной смеси близкихпо составу веществ (например, углеводороды нефти или углеводы в сложных природных смесях сахаров). Между тем в технологии на тех же принципах основан процесс, который бо-лее точно называют препаративная хроматография. По существу, это специфический способ десорбции сорбированной любым способом смеси веществ, чаще всего на микропористых сорбентах. Как уже было сказано, при обычной схеме десорбция не очень-то различает разные вещества близкого состава и молекулярной массы, которые при десорбции выделяются вместе. Хроматография позволяет это сделать. При хроматографии поток элюента, выходящий из слоя сорбента, не собирается весь в одну емкость, а фракционируется по времени пропускания элюента через колонку. Дело в том, что десорбция разных ло молекулярной массе или, точнее, разных по сродству к сорбенту веществ протекает с разной скоростью. Поэтому сначала в поток перейдут вещества с меньшей молекулярной массой и менее связаңные с сорбентом, а затем все более и более трудно десорбируемые. Если измерять концентрацию вещества в потоке элюента во времени, то можно наблюдать ряд пиков различной высоты, разделенных участками низкой концентрации (рис. 16.5). В измерительных приборах (хроматографах) высота и площадь пиков являются основой для определения концентрации вещества. В препаративной хроматографии поток элюента, собираемый за различные промежутки времени является основой для разделения смеси веществ на более однородные по составу растворы. Так можно разделять разные белки, разные аминокислоты или разные сахара. За основу разделения берется время выхода, отсюда и название метода («хромато» — время). Рассмотренный пример можно назвать адсорбционной хроматографией, он основан на поверхностном связывании растворенного компонента. Аналоогично этому существует ионообменная хроматография, где сначала связываются, а затем с разной скоростью десорбируются ионы растворенных компонентов. Интересной разновидностью хроматографии в биотехнологии является так называемая «аффинная хроматография». В ней для сорбции и десорбции используют биоспецифичное вещество, которое подходит к соответствующей вьщеляемой молекуле, как ключ к замку. Это могут быть ферменты или иммуносорбенты. Сначала практически полностью происходит связывание специфичного вещества, а потом путем изменения элюента оно выделяется с довольно четким фронтом. Так можно разделять и ферменты, если в качестве сорбента использовать закрепленный на носителе «лиганд» — вещество, подобное субстрату, на который фермент действует. Разное сродство ферментов к субстрату может являться основой для их разделения по скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса: Преимущества хроматографии: высокая селективность; возможность разделения веществ с близкими свойствами; мягкие условия проведения процесса. Недостатки: более низкая скорость десорбции, необходимая для улавлива-ния разных «пиков» выделения веществ; обычно более разбавленные растворы; более сложное аппаратурное оформление процесса 5. БИОСОРБЦИЯ Биосорбцией обычно называют такие процессы, в которых в качестве сорбента используются сами микроорганизмы, клетки или их компоненты. Наиболее известно применение биосорбентов для извлечения металлов из растворов. Микроорганизмы обладают биохимическими механизмами сорбции металлов, позволяющими достигать концентраций металлов, в тысячи и даже в миллионы раз ббльших по сравнению с их концентрацией в жидкости, из которой металл извлекается. Некоторые из таких сорбируемых металлов входят в состав ферментов и нужны клеткам. Поэтому сорбция железа, магния, цинка, меди, молибдена — нормальная физиологическая функция клеток. Но эти же пути связывания клетки используют и для совсем чужеродных металлов, таких, как серебро, ртуть, уран, которые клетке для нормального развития не нужны. Но клетка сорбирует эти металлы как бы «по привычке». Механизмы связывания металлов. Металлы могут связываться как растущими, так и нерастущими и даже мертвыми или разрушенными клетками. Сначала металл связывается поверхностью клетки, а затем медленно проникает внутрь. Бактерии связывают металлы лучше, чем дрожжи. Известно, например, накопление урана или свинца клетками бактерий рода Місгососсис. Кадмий, никель, кобальт, рубидий сорбируются клетками родов Васіllus и Езһегісһіа соіі. Клетки бактерий рода Рseudomonas использовали даже для извлечения урана из морской воды, где он содержится в очень низких концентрациях. Описано также выделение золота, серебра, других драгоценных металлов платиновой группы с помощью биосорбции. Общая схема биосорбции металлов. В раствор с металлами добавляется суспензия микроорганизмов. Происходит поверхностное связывание металлов, образование комплекса металл—микроорганизмы. Биомасса с сорбированным металлом отделяется от суспензии одним из методов разделения. Выделение металла осуществляется: либо десорбцией в мягких условиях, после чего освобожденная от металла биомасса вновь отделяется от раствора и может быть многократно использована в процессах биосорбции; либо деструктурированием биомассы путем добавления к ней крепкой кислоты, щелочи или даже в пирометаллургическом процессе. Такое жесткое обращение с биомассой возможно в случаях, когда ее получение дешево или сама она является отходом какого-либо производства. В некоторых технологиях в качестве биосорбента используют дезинтегрированные клетки микроорганизмов, часто высушенные. Они имеют более высокую удельную поверхность взаимодействия сорбента с жидкостью. 6. ИММУНОСОРБЦИЯ Рассмотренные методы биосорбции, относящиеся к металлам, не слишком специфичны. При выделении многих белков, наоборот, часто используют очень специфичные высокоселективные методы. Они основаны на связывании антител с определенным участком молекулы изучаемого белка. Такой метод позволяет «распознавать» в смеси белков только один из них, к которому вы-работано иммунной системой антитело. Вьщеленные из крови иммунизированных животных антитела (а среди них могут быть и очень специфичные моноклональные антитела, которые могут определить среди белков, например, белки родственников) иммобилизуются на каком-либо носителе и ста-новятся таким образом иммуносорбентами, используемыми для высокоселективного выделения веществ. На основе иммуносорбентов разрабатывают диагностикумы, которые позволяют не только распознавать различные инфекци-онные заболевания, в том числе и вирусные (например, СПИД), но также и наследственные заболевания, опухоли и многое другое. Вопросы для повторения 1. Назовите основные разновидности сорбционных методов выделения продуктов микробиологического синтеза. 2. Что такое изотерма Ленгмюра? 3. Что является движущей силой процесса ионного обмена? 4. По каким принципам выбирают размер гранул ионообменной смолы? 5. Чем отличаются ионообменные колонны в виде открытого и закрытого фильтров? 6. Назовите термины, используемые для участвуюших в процессе ионного об-мена вешеств на стадиях сорбции и десорбции. 7. Можно ли использовать ионообменное выделение продукта непосредствен-но из суспензии микроорганизмов? Укажите преимущества и недостатки такого процесса. 8. Чем отличаются жидкне ионообменники от жидкофазных экстрагентов? 9. Чем отличается адсорбция микропористыми сорбентами от ионного обмена? 10. Какая основная характеристика используется для оценки качества микропористых сорбентов? 11. Чем хроматография отличается от десорбции? 12. Какие существуют разновидности хроматографии? 13. Перечислите преимущества и недостатки хроматографии при выделении продуктов микробиологического синтеза. 14. Назовите основные механизмы биосорбции металлов. 15. Расскажите о разновидностях биосорбции металлов: с деструкцией и с ре-генерацией клеток микроорганизмов. 16. Расскажите об иммуносорбции: принцип действия, преимущества и недостатки. Лекция № 13 Мембранные методы в биотехнологии 1. Микрофильтрация 2. Диализ 3. Ультрафильтрация 4. Обратный осмос. Мембранные методы используют в биотехнологии для выделения, очистки и концентрирования продуктов. Все они внешне похожи на фильтрацию (поскольку схема процесса включает в себя полупроницаемую перегородку), но предназначены для разделе-ния частиц разного размера и несколько отличаются по движущей силе процесса и аппаратурному оформлению, Мы уже упоминали микрофилътрацию, основной задачей кото-рой является отделение микроорганизмов и взвешенных частиц. В процессах выделения и очистки продукта чаще используют мембранные методы другого типа: диализ, ультрафилътрация и обратный осмос, которые позволяют «фильтровать» уже не только твердую фазу, но и просто растворенные в жидкости молекулы, причем не обязательно очень большие по размеру. Улътрафилътрация проводится обычно при размерах частиц или молекул 10 нм — 10 мкм, обратный осмос и диализ — при размерах 0,5 нм — 0,5 мкм. 1. МИКРОФИЛЬТРАЦИЯ Микрофильтрация является наиболее близкой к обычной фильтрации системой, которую мы уже упоминали в разделе, связанном с отделением биомассы от культуральной жидкости. Размер пор микрофильтрационных мембран варьируется от 0,1 до З.мкм. Это позволяет задерживать бактерии, дрожжи, грибы и вы-сокомолекулярные вещества, такие, как жиры. Наиболее известно использование микрофильтрации как средства деконтаминации питательных сред, дозируемых подпиток, жидких пеногасителей и титрующих агентов для поддержа-ния величины рН. Это позволяет избежать теплового воздействия на стерилизуемые растворы. В связи с этим важно, чтобы сами микрофильтры могли стерилизоваться паром перед нача-лом операции и регенерироваться после длительной эксплуатации. Такими свойствами в наилучшей степени обладают металлокерамические трубчатые мембранные элементы, которые могут регенерироваться обратным током пара. Для ускорения процесса микрофильтрации часто повышают температуру, чтобы снизить вязкость жидкости. Микрофильтрация часто используется для стерилизации сред. В этом случае поры должны быть не более 0,2 мкм, чтобы исключить проскок микроорганизмов очень маленьких размеров. Такое использование микрофильтрации позволяет предотвратить потери ценных компонентов и образование нежелательных соединений во время тепловой стерилизации. Но при этом важно иметь возможность тепловой стерилизации самих микрофильтрационных элементов. Это трудно осуществить с полимерными мембранами, но при металлокерамических элементов (трубок) вполне возможно. использовании 2.ДИАЛИЗ В этом процессе (рис. 17.1) раствор, содержащий высокомоле-кулярные соединения, отделен полупроницаемой мембраной от камеры, содержащей чистый растворитель (обычно воду или вод-ные растворы солей). Содержащиеся в растворе низкомолекулярные вещества за счет диффузии через поры мембраны проходят в қамеру пермеата, через которую ңепрерывно протекает вода. Высокомолекулярные вещества остаются в растворе, и таким образом происходит их очистка от низкомолекулярных. Так, например, происходит обессоливание растворов ферментов или вакцин. Мембраны для диализа изготавливают из пергамента, целлофана и других материалов. Часто мембраны выполняют в виде трубок, имеющих сходство с оболочками колбасных изделий, причем изготавливают такие трубки те же фирмы, что и оболочки для колбас. Собственно говоря, первая по хронологии обо-лочка колбасы — стенка кишок животных — также выполняет функции диализа, пропуская в кровь лишь низкомолекулярные вещества, о^разующиеся в процессе ферментолиза пищи в организме. Новое поколение диализующих мембран представляет собой кассеты из большого количества микротрубок, заделываемых в так называемый модуль с общим входом и общим выходом. Преимуществами процесса диализа являются: работа в мягких условиях температуры и рН; отсутствие органических растворителей; возможность высокой степени очистки высокомолекулярных веществ от примесей низкомолекулярных соединений, солей и металлов. Недостатки: низкая скорость диализа, определяемая молекулярной диффу-зией, поскольку движущая сила в этих случаях — разность кон-центраций веществ, ее нечем повысить; возможность обрастания диализных мембран и забивания их пор. Некоторых недостатков диализа удается избежать за счет применения электродиализа, В этом случае, если задачей является обессоливание ферментов или других биополимеров, перпендикулярно мембранам и потоку диализуемого раствора накладывается электрическое поле, в результате чего анионы и катионы из раствора диффундируют через диализные мембраны к аноду и к катоду, а биополимеры остаются в растворе (рис. 17.2). В простейшем случае электродиализатор состоит из трех камер: для обрабатываемого раствора, для пермеата в зоне катода и для пермеата в зоне анода. Движущей силой в этом случае, как и в процессе диализа, явля-ется разңость концентраций ионов. Электрический ток лишь ус-коряет процесс диффузии. Мембраны при катоде и при аноде могут быть выполнены из разного материала, селективные для катионов и для анионов. 3. УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ В процессе ультрафильтрации используют селективные по-лупроницаемые мембраны, пропускающие низкомолекулярные и задерживающие высокомолекулярные соединения. Известно, что движущей силой процесса ультрафильтрации является пере- пад давления на мембране, как и при обычной фильтрации. При-менительно к ультрафильтрации высокомолекулярные соедине-ния — это те соединения, у которых молекулярная масса раство-ренного вещества превосходит молекулярную массу растворите-ля более чем в 500 раз. При ультрафильтрации происходит не разделение фаз, а пере-распределение растворенных в жидкости веществ. По существу здесь используется ситовой эффект. Полимерные мембраны, используемые при ультрафильтрации, обычно являются двухслойными. Основной фильтрующий слой имеет толщину менее 1 нм. Очевидно, такой слой не может быть механически прочным, и поэтому он дублируется со вторым сло-ем толщиной от 20 мкм до 2 мм, который к тому же имеет и значи-тельно больший размер пор. Выполнены оба слоя как единое це-лое, но мембрана является анизотропной. Давление должно быть приложено со стороны тонкого слоя, а не наоборот. Ясно, что для создания прочности мембраны дополнительно должна использоваться и более жесткая (металлическая или пласт-массовая) арматура: ведь перепад давления для процессов ультра-фильтрации достигает 0,3—-1 МПа. Обычный материал мембран — полиуретаны, сложные эфиры целлюлозы, полисульфон. В последнее время научились делать и металлокерамические (наиболее прочные) мембраны. Борьба с концентрационной поляризацией. Для этого кроме повышения скорости потока над мембраной используют следующие приемы: предварительная обработка раствора (создание подходящей температуры, рН, ионной силы); предварительная фильтрация через мембрану определенных растворов полймеров, создающих на поверхности мембраны слой, препятствующий осаждению растворенного вещества на поверх-ности мембраны; покрытие мембраны ферментом, способствующим разжиже-нию геля; создание на поверхности мембраны отрицательно заряженных ионогенных групп, предотвращающих осаждение белков; гидрофилизация мембраны полиэтиленгликолем; очистка, мембраны. Последний прием (очистка мембраны) осуществляется: легким обратным потоком жидкости (для больших потоков операция рискованна, так как может быть нарушена целостность мембраны); пузырями пены; биологическими детергентами (например, сывороткой); раствором щавелевой кислоты (для жирных стоков); раствором пероксида водорода (для белков); раогізором гипохлорита калия; добавлением в поток порошков, имеющих легкое абразивное действие на мембрану (тоже есть опасность «царапания» мембран, снижающего их долговечность), Конструктивное оформление ультрафильтрационных систем реализуется в следующих вариантах: трубчатые (с диаметром трубок 6—25 мм) могут развивать плотность упаковки (поверхяость фильтрования на единицу объе-ма) 60—200 м2/м3; плоскорамные — 60—300 м2/м3; рулонные — 300-— 800 м2/м3; с полыми волокнами (капилляры диаметром 20—100 мкм и тол-щиной стенки 10—50 мкм) — до 30 000 м2/м3; недостаток — труд-ность замены поврежденных волокон. Рассмотрим несколько примеров использования ультрафильтрационных установок при коадентрировании (рис. 17.7), диафильтрации (очистка от низкомолекулярных веществ) (рис. 17.8) и очистке от высокомолекулярных соединений (рис. 17.9). Схема, представленная на рис. 17.10, предусматривает двухсту-пенчатое разделение, по сути фракционирование сыворотки на три потока. Лекция № 14 Концентрирование продукта и обезвоживание продукта 1.Концентрирование продукта 2.Обезвоживание продукта За отделением продукта следует его концентрирование. Основные методы концентрирования — обратный осмос, ультрафильтрация, выпаривание. Если мембрана пропускает воду, задерживая растворенные в ней вещества, речь идет об осмосе. Прямой осмос — диффузия веществ через мембрану, разделяющую раствор и растворитель. Как правило, раствор помещают в мешок из полупроницаемого материала, и этот мешок погружают в сосуд с растворителем. Растворитель, поступающий извне, оказывает на мешок давление, называемое осмотическим. Если к раствору приложить внешнее давление, превышающее осмотическое, то растворитель вытекает через полупроницаемую мембрану против градиента концентрации растворенного вещества, т. е. происходит дальнейшее концентрирование раствора. Подобный процесс представляет собой обратный осмос, используемый как метод концентрирования продукта. Ультрафильтрация — отделение веществ с помощью мембранных фильтров. Некоторые марки фильтров предназначены для отделения лишь сравнительно крупных частиц: иммуноглобулинов, коллоидных агрегатов, вирусов. Мембраны с наиболее мелкими порами задерживают молекулы органических кислот. При умеренно высоком давлении (200—400 кПа), приложенном к жидкости, скорость ее протока через фильтр достаточно высока для быстрой и эффективной ультрафильтрации. Технология ультрафильтрации подкупает своей простотой, относительной экономичностью и мягким, щадящим обращением с продуктом. Здесь не требуется изменения рН, ионной силы раствора или перевода продукта в другую фазу. Этим объясняется перспективность ультрафильтрации для концентрирования таких малостабильных продуктов, как молочная и глутаминовая кислоты, некоторые антибиотики и ферменты (Н. Dellweg, 1983), витамин В!2 (В. Sikyta, 1984е). Метод выпаривания, наиболее древний и известный еще алхимикам, обладает очевидным недостатком: для удаления воды или иного растворителя раствор 88 необходимо нагревать. В производственных условиях чаще используют вакуумвыпарные аппараты, и температура выпаривания, соответственно и вред, причиняемый термолабильным веществам, могут быть снижены в зависимости от уровня снижения давления в выпарном аппарате по сравнению с атмосферным. Нагревающим агентом чаще всего служит водяной пар, хотя используют также обогрев жидким теплоносителем или электрообогрев. Пар характеризуется большой теплотой конденсации и облегчает регулировку процесса выпаривания. Выпарные аппараты бывают периодически и непрырывно действующие, с однократной и многократной циркуляцией кипящего раствора. Теплообмен между нагревающим агентом и выпариваемым раствором обеспечивается системой труб, змеевиков или паровой рубашкой. Необходимо добиваться равномерного обогрева раствора без локального перегрева. Перспективные методы выпаривания чувствительных к нагреванию веществ состоят в использовании дисковых и пленочных выпарных аппаратов, в которых испарение стимулируется в результате растекания жидкости тонким слоем по нагретой поверхности. Выпаривание может быть ограничено стадией получения густого сиропообразного раствора целевого продукта. В этом случае вся процедура называется упариванием, а полученный продукт относится к категории жидких. Исчерпывающее удаление влаги, оставшейся после упаривания, обратного осмоса, ультрафильтрации, ведет к получению «сухого продукта» и выделяется технологами в особую стадию — обезвоживание продукта (сушка). Обезвоживание продукта В распоряжении биотехнолога имеются различные методы сушки. Их выбор зависит от физико-химических свойств обезвоживаемого продукта, в частности, от вязкости раствора и от стабильности или жизнеспособности при повышенных температурах, если речь идет о живых объектах. Наиболее старым методом можно считать сушку на подносах. Для сушки термостабильных антибиотиков и аминокислот применяют модификацию метода — ленточную.сущку. Подносы в этом случае заменяют на ленточный конвейер, ленту постоянно подогревают. Перспективным методом является сушка в кшящеж-ХЛОе. Газообразный нагревательный агент (пар, воздух, СОг, дымовые или топочные газы) мощной струей врывается в сушильный аппарат снизу, и частицы обезвоживаемого продукта парят в газовом потоке. Принципиально аппарат совпадает с газофазным биореактором (см. гл. 2, § 5). Преимуществом метода является возможность регулирования в широких пределах продолжительности пребывания материала в аппарате, интенсивности массопередачи и теплообмена, возможность организовать непрерывный процесс при простой конструкции аппарата (В. А. Быков и др., 1985). Ограничение метода состоит в том, что материал не должен приставать к стенкам сушильного аппарата. Метод пригоден для сушки антибиотиков, аминокислот, крахмала, но не суспензий клеток (В. Sikyta, 1984е). Барабанные сушилки, в которых обезвоживают микробные суспензии, состоят из вращающихся подогреваемых барабанов, погруженных в сосуд с суспензией. Соприкасаясь с барабаном, суспензия обезвоживается и присыхает в виде пленки к его стенкам. Высохшую биомассу соскребают со стенок ножом. Особо чувствительные к нагреву материалы сушат в вакуум-89сушильных шкафах, при пониженном давлении и температуре. Проблемы с этим видом сушильных аппаратов связаны с трудностью их обслуживания в промышленных условиях и частым выходом аппаратов из строя. Распылительные сушилки превращают раствор или суспензию в пропускания, под давлением через форсунку, вращающийся диск и т. д. Дэрозоль подается в сушильную камеру, где его встречает нагретый газ — теплоноситель с температурой 110—150°С. Воздействие столь высокой температуры ограничивает использование метода для сушки термолабильных веществ и живых клеток. В производстве сухих силосных заквасок на основе молочнокислых бактерий выход жизнеспособных клеток после распылительной сушки не превышает 20—30% (Н. В. Бубнов и др., 1985). Разрабатываются низкотемпературные режимы сушки, для эффективного осуществления которых необходимо тщательно удалять влагу из газа-теплоносителя и обеспечить тонкодисперсное распыление исходной суспензии. Другой проблемой, присущей методу распылительной сушки, является налипание продукта на стенки сушильной камеры. Капли суспензии или раствора достигают стенок камеры раньше, чем успевают подсохнуть. Налипание влажных частиц на стенки вызывает нарушение стабильной работы всего сушильного аппарата. Предлагается понижать вязкость исходной суспензии (раствора), что достигается путем нагревания, уменьшения в ней содержания веществ и установки оптимального рН (Э. Г. Тутова и др., 1985). Каждый из этих способов понижения вязкости не лишен, однако, своих проблем. Например, повышение температуры вызывает угрозу инактивации целевого продукта. Полученный сухой продукт поступает на хранение после придания ему товарного вида. Возможен также вариант химической модификации продукта. Лекция № 15 Пути модификации продукта. Стабилизация продукта. Химическая модификация необходима в тех случаях, когда биотехнологический процесс сам по себе дает лишь «заготовку» целевого продукта. Так, антибиотик, продуцируемый микробной культурой, путем химических перестроек может быть превращен в различные медицинские препараты. Пенициллин G, образуемый Penicillium notatum, модифицируют с целью получения ампициллина, метициллина и других полусинтетических пенициллинов. В некоторых случаях достаточно, чтобы организм синтезировал определенную структуру, к которой химическим путем присоединяют необходимые заместители. Иногда биообъект участвует лишь на одном каком-либо этапе (или немногих этапах) в цепи химических процессов, ведущих к синтезу целевого продукта. Важный пример — придание продукту оптической асимметрии, что позволяет избежать трудоемких химических синтезов. Биообъект (скажем, дрожжи) избирательно потребляет один из изомеров (например, только L-ами- нокислоты), в среде остается его оптический антипод. Подобная технология известна со времен Луи Пастера. Биообъект в подобных случаях уподобляется одному из реактивов в наборе химика- органика, т. е. речь идет о микробной,, говоря шире, биотехнологической химии (Г. К- Скрябин, Л. А. Головлева, 1985). Модификация — необходимый этап в получении ряда ферментов, гормонов, препаратов медицинского назначения. Речь идет о перестройке соединений животного, растительного или микробного происхождения с 90целью придания им специфических свойств, необходимых человеку. У бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он становится идентичным человеческому гормону. Генно-инженерные белки часто наряду с нужными человеку несут балластные аминокислотные последовательности. Короткие пептиды (соматостатин и др.) обычно получают в составе химерных белков, включающих аминокислотную последовательность р-галактозидазы Е. coli или другого бактериального белка. Химическая модификация сводится в этом случае к отщеплению лишних аминокислотных последовательностей. Если продукт получают в виде мультимера (способ защиты от внутриклеточных протеаз), необходимо его последующее «нарезание» на функционально активные мономеры. Стабилизация продукта Мероприятия, направленные на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем, включают различные физико-химические воздействия на продукт. Так, сушка может значительно повысить устойчивость продукта к внешним воздействиям. Показано, что обезвоживание ряда ферментов наряду с некоторым снижением их активности ведет к повышению их стабильности, включая устойчивость к нагреванию. Панкреатическая липаза свиньи, сразу теряющая активность в водной среде при нагревании до 100°С, функционирует более двенадцати часов при той же температуре в смеси гептано- ла и трибутирина. Физические воздействия, используемые для консервации живых объектов, рассмотрены в гл. 1, § 6. К стабилизации различных продуктов, в том числе кормового микробного белка, ведет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных отрубей, кукурузной муки, которые сами обладают питательной ценностью (Е. Ю. Двойченкова, В. М. Кан- тере, 1985). Стабилизация ферментов достигается добавлением глицерина или углеводов, которые образуют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствуя тем самым спонтанной (при длительном хранении) или индуцированной нагреванием денатурации ферментов (A. Freeman, 1984). Стабильность ферментов возрастает также при добавлении неорганических ионов — Со2+, Mg2+, Na+ для пектиназы, формалина— 0,2%-ного раствора для глюкоамилазы, антибиотиков — низина для глюкоамилазы (Е. Ю. Двойченкова, В. М. Кантере, 1985). 97 В некоторых случаях стабилизация не исчерпывается физико- химическими средствами и представляет собой задачу особого биотехнологического процесса. Меланж, получаемый из яичных желтков, — ценный пищевой продукт, через несколько месяцев хранения темнеет, его органолептические свойства ухудшаются. Порча меланжа может быть предотвращена, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «выедающие» углеводы. Это приводит к значительному удлинению срока хранения меланжа. В то же время пропионовые бактерии повышают питательную ценность меланжа, обогащая его органическими кислотами и витамином В12 (Л. И. Воробьева, 1986). Цели стабилизации белковых продуктов преследуют методы белковой инженерии (см. гл. 1, § 3). Эти методы позволяют повысить стабильность продуктов при длительном хранении и их устойчивость к нагреванию. Важность повышения 91 термостабильности белков, особенно ферментов, находится в тесной связи с расширением области применения термофильных процессов в современной биотехнологии. Представляет интерес увеличение термостабильности лизоцима фага Т4 Е. coli. Путем генных манипуляций в положении 3 полипептидной цепи лизоцима заменен изолейцин на цистеин, так что образовалась новая дисульфидная связь с цистеином в положении 97. Это обусловило резкое повышение термостабильности лизоцима (В. Г. Дебабов, 1985). Принципиально новые возможности для стабилизации ферментов и целых клеток биообъекта открывает их иммобилизация. 92
