Штамм Bacillus subtilis 11 В

Штамм Bacillus subtilis 11 В
Штамм бактерий сенной палочки Bacillus subtilis 11 В выделен из
здорового растения пшеницы в Уфимском районе Башкирии.
Идентификацию штамма проводили по « Определителю бактерий Берджи»
М. Мир, 1997.
Штамм Bacillus subtilis 11 В депонирован под номером ВКМ В- 2218Д
во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН 19.08.1999 г.
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ
ШТАММА
И
БИОХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА
Культура штамма характеризуется следующими свойствами: B.
subtilis ВКМ В-2218 Д - грамположительные аэробные спорообразующие
палочки, продуцирующие каталазу. На мясо-пептонном агаре (МПА),
сусло-агаре дают обильный рост. На МПА- образует серовато-белые
мелкоморщинистые колонии с волнистыми краями, слегка врастающими в
агар, вязкой консистенции. Рост в жидкой среде сопровождается
помутнением среды, образованием пленки серовато-белого цвета и осадка.
Через 18 часов роста в мазках культуры обнаруживаются прямые
палочковидные клетки, размером 2-3 х 0,6 мкм, расположенные одиночно,
попарно или цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры
овальные, размер 0,9х0,6 мкм, расположены в клетке центрально или
эксцентрично.
Культура ферментирует глюкозу, сахарозу, маннит и мальтозу. Дает
положительную
реакцию
Фогес-Проскауэра,
гидролизует крахмал,
желатину, не гидролизует мочевину, утилизирует цитрат натрия с глюкозой,
не использует пропионат и малонат натрия, не расщепляет тирозин. Не
растет в анаэробных условиях. Продуцирует каталазу, протеазу, амилазу. Не
образует лецитиназу, уреазу и липазу.
Редуцирует нитраты, не образует газ на среде с нитратами в
анаэробных условиях. Не образует индол и сероводород.
БЕЗОПАСНОСТЬ ШТАММА
Культура штамма Bacillus subtilis 11 В проверена на безвредность
(вирулентность, токсичность и токсигенность).
Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при температуре 37 С. Выросшую
биомассу смывали 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и готовили
бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ в мл.
Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (161) г
двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по
одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты исследований
представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Изучение вирулентности штамма Bacillus subtilis 11 В
Кол-во
ВводиСпособ
КратКол-во
Кол-во
животмая доза введе-ния ность
заболев- павших
9
ных
в (х10
введения ших
мышей
опыте
кл.мл)
(раз)
мышей
(штук)
(штук)
(штук)
Внутрибрюшинно
10
0,5
1
0
0
10
1,0
1
0
0
Перорально
10
1,0
5
0
0
10
3,0
5
0
0
10
5,0
5
0
0
Как следует из проведенных исследований культура штамма
subtilis 11 В не вирулентна.
Кол-во
выживших
мышей
10
10
10
10
10
Bacillus
С целью
более полного изучения безопасности штамма при
пероральном введении, были испытаны высокие дозы штамма при разовом
пероральном введении мышам (таблица 2).
Таблица 2
Изучение безопасности штамма B. subtilis 11 В при разовом
пероральном введении.
Вводимая
доза,
млрд.кл/мл
Количество
животных (штук)
Средняя масса животных, г
Было
выжило
До
введения
Через
сутки
1
5
10
10
15,40,3
15,60,3
16,90,3
2
10
10
10
15,70,2
15,90,3
17,00,2
3
20
10
10
16,00,2
16,00,2
17,20,2
N
1 Через
суток
5
Установлено, что разовое введение per os высоких доз штамма - (1020)х109 кл/мл не приводит к снижению веса животных на первые сутки после
введения и в последующие дни вес животных увеличивается.
Для исследования токсичности (табл. 3) штамм выращивали на
мясопептонном агаре в течение 24 часов при 37 С, смывали 0,9 %-ным
раствором хлорида натрия, готовили суспензию, содержащие от 1,0 до 5,0
млрд клеток в 1 мл, которые затем инактивировали прогреванием при 100 С
в течение 1 часа. Суспензии вводили способами, описанными при изучении
вирулентности.
Для изучения токсигенности (табл. 4) штамм выращивали в течение
10 суток на мясо-пептонном бульоне при температуре 37 С. По истечении
срока культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в
течение 30 мин. Для введения мышам использовали надосадочную
жидкость. Контролем служила группа мышей, получавших стерильный
мясо-пептонный бульон.
Таблица 3.
Исследование токсичности штамма B. subtilis 11 В.
Кол-во
ВводиСпособ
животмая доза введе-ния
ных
в (х109
опыте
кл.мл)
(штук)
Внутрибрюшинно
10
1,0
10
2,0
10
3,0
Перорально
10
1,0
10
2,0
10
5,0
Кратность
введе-ния
(раз)
Кол-во
заболевш
их
мышей
(штук)
Кол-во
павших
мышей
(штук)
Кол-во
выживших
мышей
1
0
0
10
1
0
0
10
5
5
5
0
0
0
0
0
0
10
10
10
Таблица 4.
Исследования токсигенности штамма B. subtilis 11 В.
Кол-во
Вводи- Способ КратКол-во
Кол-во
Кол-во
животмая
введеность
заболевш павших
выживных
в доза, мл ния
введе-ния их
мышей
ших
опыте
(раз)
мышей
(штук)
мышей
(штук)
(штук)
1
2
3
4
5
6
7
Внутрибрюшинно
10
0,5
1
0
0
10
10
1,0
1
0
0
10
Перорально
10
1,0
5
0
0
10
10
2,0
5
0
0
10
10
3,0
5
0
0
10
Контроль - внутрибрюшинно
10
1,0
5
0
0
10
Контроль - перорально
10
3,0
5
0
0
10
Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после
окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все
животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы,
прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у
них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности
штамма.
ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 11 B В ОТНОШЕНИИ
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Для определения специфической активности штамма B. subtilis 11 В
исследовали антагонистическую активность в отношении тест культур
патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания растений (табл. 5),
человека и животных (табл. 6). Исследование осуществляли методом
отсроченного антагонизма. Для этого культуру штамма высевали петлей в
центре чашки Петри с агаризованной картофельно-глюкозной средой.
Посевы инкубировали в термостате при 37 С в течение 72 часов. Затем к
выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы
(500миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе).
Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37 С по величине
зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило
параллельное выращивание их на чашках с агаризованной картофельноглюкозной средой без культуры исследуемого штамма. Полученные данные
результатов испытания представлены в таблице 5,6.
Таблица 5
Спектр антагонистической активности штамма B. subtilis 11 В в
отношении фитопатогенных штаммов, вызывающих заболевания растений
N
Тест-культуры
Зоны
торможения
роста,мм
1
2
3
Грибов:
1
Fusarium avenaceum
18-20
2
Fusarium sporotrichiella
15-18
3
Fusarium oxysporum
15-20
4
Fusarium culmorum
12-15
5
Alternaria alternata
20-25
6
Alternaria brassicicola
15-20
7
Botrytis cinerea
15-16
8
Botrytis aclada F -81
15-20
9
Penicillium lividum
15-17
10 Emericellopsis glabra F 1312
18-20
11 Memnoniella echinata F-896
22-25
12 Thielaviopsis basicola F-972
18-20
13 Thielaviopsis basicola F-1927
20-22
Бактерии:
1
2
4
14 Erwinia carotovora
10-12
15
Xanthomonas malvaceae
12-15
Таблица 6
Спектр антагонистической активности штамма B. subtilis 11 В в отношении
патогенных штаммов, вызывающих заболевания человека и животных
Тест – штаммы
1
Бактерии
Staphylococcus aureus (Никифоров)
Staphylococcus aureus (Филиппов)
St. aureus 66
Зона торможения роста, мм
2
St. aureus 67
20-22
St. aureus 81
18-20
Proteus vulgaris 177
Pr. vulgaris 12
15-20
14-16
P. vulgaris 48
12-15
Pr. vulgaris 41
12-15
Proteus mirabilis 237
Pr. mirabilis 40
18-20
15-20
Pr. mirabilis 36
15-18
Pr. mirabilis 35
15-20
Candida albicans
Escherihia coli 177
E. coli 154
25-30
12-15
12-15
E. coli 140
12-15
Streptococcus 324
10-15
Streptococcus 362
12-15
Salmonella paratyphi 269
12-15
S. paratyphi 15
15-20
S. группа С infantis 155
15-18
S. группа D enteriditis 25
15-18
Shigella flexneri II 1230
22-25
Shigella sonnei 2290
18-20
Shigella HK
20-22
Грибы
20-25
20-25
15-16
Trichophyton rubrum
15-18
Microsporum canis
12-15
Aspergillus flavus N 6
12-15
Penicillium notatum N 3
12-15
Epidermophyton floccosum N 2
12-15
Из данных таблиц следует, что штамм B. subtilis 11 В обладает
широким спектром антагонистической активности к патогенным бактериям и
грибам, вызывающих заболевания человека, животных и растений, что
создает возможность создания на его основе препаратов-пробиотиков,
способных лечить широкий круг заболеваний и использоваться в
медицинской, ветеринарной и сельскохозяйственной практике.
УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS 11B
К
АНТИБИОТИКАМ
Чувствительность штамма к антибиотикам определяли с помощью
стандартных дисков, пропитанных антибиотиками. В чашку Петри с МПА
наливали 1 мл клеточной суспензии препарата в 0,9 %-ном растворе натрия
хлорида и равномерно распределяли по поверхности агара. Избыток удаляли
пастеровской пипеткой. На поверхности засеянного агара пинцетом
раскладывали диски с антибиотиками, по 5 дисков на каждую чашку.
Чашки выдерживали в термостате при температуре (371) С в течение
(182) ч, после чего измеряли зоны задержки роста вокруг дисков, включая
диаметр самого диска.
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Антибиотикоустойчивость штаама В. subtilis 11 В .
Антибиотики
Зоны торможения роста, мм
Содержание бактерий в 1 мл культуры штаама
1х107 5х107 1х108 5х108
1х109 5х109
Ампициллин
0-6
0-6
0-6
0-6
0-6
0-6
Бензилпенициллин
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
Карбенициллин
0
0
0
0
0
0
Полимиксин
0
0
0
0
0
0
Стрептомицин
0-8
0-8
0-8
0-8
0-8
0-8
Рифампицин
10-16 10-16 10-16 10-16
10-16 10-16
Гентамицин
0-7
0-7
0-6
0-6
0-6
0-6
Клотримазол
10-12 10-12 10-12 10-12
10-12 10-12
Левомицитин
18-20 18-20 18-20 18-20
18-20 18-20
Тетрациклин
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
6-8
Мономицин
8-10
8-10
8-10
8-10
8-10
8-10
Гептомицин
10-15 10-15 10-15 10-15
10-15 10-15
Клотримазол
10-12 10-12 10-12 10-12
10-12 10-12
Неомицин
10-14 10-14 10-14 10-14
10-14 10-14
Цепарин
15-20 15-20 15-20 15-20
15-20 15-20
Канамицин
10-15 10-15 10-15 10-15
10-15 10-15
Новограмон
20-25 20-25 20-25 20-25
20-25 20-25
Бисенгиол
10-15 10-15 10-15 10-15
10-15 10-15
Тобрамицин
15-18 15-18 15-18 15-18
15-18 15-18
Из полученных данных следует, что препарат устойчив к действию
антибиотиков пенициллинового ряда (b-лактамным антибиотикам:
пенициллину, карбенициллину, ампициллину), полимиксину, а также
малочувствителен к стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Штамм
проявляет устойчивость к этим антибиотикам независимо от концентрации
бактерий.
16
17
18
19