Document 125463

УДК: 636.22/.28:612.42
Касиева Г.К.
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КИШЕЧНОАССОЦИИРОВАННОЙ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ У КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА
БОДО МАЛДЫН ИЧЕГИЛЕРИ МЕНЕН БАЙЛАНЫШКАН
ЛИМФОИДДИК ТКАНДЫ ИММУНОГИСТОХИМИЯЛЫК ИЗИЛДӨӨ
IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES OF BOVINE GUT-ASSOCIATED
LIMPHOID TISSUE
АННОТАЦИЯ
Проведенными иммуногистохимическими исследованиями показано, что Polyclonal
Rabbit Anti-Human T cell, CD 3 антисыворотку можно использовать для выявления Тлимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human B-Lymphocyte Antigen (BLA. 36)
антисыворотку – для выявления В- лимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human
Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387 антисыворотку – для выявления макрофагов, а
Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen антисыворотку (Clone PC10) –
для выявления пролиферирующих клеток в парафиновых срезах кишечника крупного
рогатого скота при формалиновой фиксации.
КЫСКАЧА МАЗМУНУ
Жүргүзүлгөн иммуногистохимиялык изилдөөлөрдүн негизинде бодо малдын
формалинде фиксацияланган ичегисинин парафинде катырылган кесиндилеринде
Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3 антисывороткасын Т лимфоциттерди аныктоо,
Monoclonal Mouse Anti-Human B-Lymphocyte Antigen (BLA. 36) антисывороткасын В
лимфоциттерди аныктоо, Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone
MAC 387 антисывороткасын макрофагдарды табуу жана Monoclonal Mouse AntiProliferating Cell Nuclear Antigen антисывороткасын (Clone PC10) клеткалардын
пролиферациясын аныктоо үчүн колдонуусу көрсөтүлгөн.
ABSTRACT
Immunohistochemical studies have shown that Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3
antiserum can be used to identify T cells, Monoclonal Mouse Anti-Human B-Lymphocyte
Antigen (BLA. 36) antiserum - to identify B cells, Monoclonal Mouse Anti -Human Myeloid /
Histocyte Antigen, Clone MAC antiserum 387 - for the detection of macrophages and
Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen antibody (Clone PC10) - to identify
proliferating cells in formalin-fixed paraffin-embedded sections of the intestines of cattle.
Кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань (КАЛТ) является частью слизистоассоциированной лимфоидной ткани (САЛТ) и местом входа для антигенов и
инфекционных агентов в организм.
Исследованию морфологии КАЛТ крупного рогатого скота был посвящен ряд
научных работ дальнего и ближнего зарубежья:
КАЛТ встречается у крупного рогатого скота, это Пейеровы бляшки в тощей и
подвздошной кишках, солитарные фолликулы в толстой кишке. Она также встречается в
виде небольших бляшек в прямой кишке, вдоль анального кольца, а также как
обособленные лимфоидные узелки в тонкой и толстой кишках [1].
КАЛТ в разных частях кишечника имеет схожую типичную структуру САЛТ , но
существуют региональные различия [2]. Пейеровы бляшки в тощей кишке имеют
небольшие грушевидные лимфоидные фолликулы и большие интерфолликулярные зоны
и домены. Пейеровы бляшки в подвздошной кишке в виде длинных овальных
лимфоидных фолликулов с небольшими интерфолликулярными зонами и доменами. С
увеличением возраста животного, лимфоидные фолликулы с эпителиальными криптами
встречаются в Пейеровых бляшках подвздошной кишки [3].
Субпопуляции лимфоцитов не отличаются в Пейеровых бляшках тощей и
подвздошной кишок у плода [4]. У новорожденных телят начинают отмечаться различия.
В Пейеровых бляшках тошей кишки и лимфогландулярном комплексе отмечается
экспрессия IgG- и IgA – мРНК, и в лимфоидных фолликулах много Т- лимфоцитов (
преимущественно CD4 + ). В лимфоидных фолликулах и межфолликулярных зонах
Пейеровых бляшек подвздошной кишки меньше CD4 + и CD8 + Т-лимфоцитов [5,6,7]..
Зародышевые центры развиваются только в Пейеровых бляшках тощей кишки и
лимфоидной ткани толстой кишки, но не в Пейеровых бляшках подвздошной кишки [4].
У взрослых коров, Пейеровые бляшки подвздошной кишки исчезают, а лимфоидные
фолликулы и интерфолликулярные зоны увеличиваются в Пейеровых бляшках тощей
кишки и в лимфогландулярном комплексе.
Saw Po Po и др. (2005) проводили исследования с целью описания гистологических
и электронно-микроскопических особенностей Пейеровых бляшек тощей и подвздошной
кишок у трех месячных телят. Гистологически Пейеровые бляшки тощей кишки
характеризовались наличием грушевидных лимфоидных фолликулов с большим доменом
и интерфолликулярной зоной. Пейеровые бляшки подвздошной кишки состояли из
овального мешкообразного фолликула с плохо развитой интерфолликулярной зоной и
незаметными доменами. Фолликуло-ассоциированный эпителий
представлен
энтероцитами и интраэпителиальными лимфоцитами, но в них отсутствуют бокаловидные
клетки и специализированные мембранозные клетки (M клетки). В Пейеровых бляшках
тощей кишки содержится больше интраэпителиальных лимфоцитов, чем в Пейеровых
бляшках подвздошной кишки. Количество интраэпителиальных лимфоцитов значительно
больше в ворсинках, чем в криптах [8].
Видякина М. А. (2003) исследовала пренатальное и постнатальное развитие
кишечно- кишечноассоциированной лимфоидной ткани по длине тонкой и толстой кишок:
сначала - в тощей и прямой кишках, а затем в двенадцатиперстной, подвздошной и
ободочной. Первые лимфоциты в собственной пластинке тонкой и толстой кишок
обнаруживались в виде диффузных скоплений у 90-дневных плодов. На 120-й день
эмбрионального развития сгруппированные лимфоидные узелки определялись в
подслизистой основе стенки тощей кишки, на 137 - 155 день - в стенке
двенадцатиперстной. На 180 день полосовидной формы лимфоидные бляшки
обнаруживались в каудальной части тощей и на всем протяжении подвздошной кишок. А
одиночные лимфоидные узелки также встречались в стенке кишечника к 180 дню в
собственной пластинке. К концу пренатального онтогенеза в подслизистой основе стенки
толстой кишки они формировали лимфоидные кольца и лимфоидные поля. У
новорожденных телят кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань представлена:
одиночными и сгруппированными лимфоидными узелками. С антимезентериальной
стороны стенки дистального отдела тощей кишки и на всем протяжении подвздошной
кишки две трети периметра трубки занимает полосовидной формы лимфоидная бляшка,
достигающая к 18-месячному возрасту в длину 4,0 метра, шириной 5,0 см. Лимфоидные
узелки формируют подвздошнослепокишечное, ободочное и прямокишечное лимфоидные
кольца. Был исследован клеточный состав и соотношение Т- и В- лимфоцитов в
лимфоидных узелках и лимфогландулярных комплексах [9].
По данным И.А. Бякова (2007) лимфоидная ткань переднего отдела
пищеварительной системы у новорожденных телят представлена: одиночными овальными
лимфоидными узелками. В герминативных центрах узелков соотношение В-лимфоцитов
к Т-клеткам составляло 7:1, а в зоне купола их соотношение было равным. В
эпителиальном пласте над куполом лимфоидных узелков отмечались Т- и В-лимфоциты,
макрофаги, зрелые плазмоциты, тучные клетки, базофилы и моноциты.
Максимальное развитие и иммунологическое созревание лимфоидной ткани небной
миндалины завершались к 18 месяцам, а язычной и глоточной - к 12-месячному возрасту.
Плотность одиночных лимфоидных узелков в стенке пищевода достигает максимума к 18
месяцам. Интенсивное развитие лимфоидной ткани в составе рубцово-сеткового кольца
наблюдается в возрасте новорожденности и 18 месяцев; сетко-книжкового и книжкосычужного в 14-дневном и 9-месячном возрасте. В пилорической части стенки сычуга,
количество лимфоидной ткани достигает размеров
максимально 1см в период
новорожденности, затем постепенно снижается к 6-ти месяцам, после чего вновь
увеличивается к 12-18 месячному возрасту [10].
Jones M. и др. (1993) в замороженных срезах лимфоидных тканей животных, в том
числе и крупного рогатого скота, выявили Т и В клетки используя кроссреактивные
антипептидные антисыворотки как anti-mb-1, anti-B29 для выявления В клеток , anti-CD3
и anti-CD5 для выявления Т клеток. Полученные результаты говорят, что использованные
антисыворотки дают межвидовую кросс реакцию, селективно выявляя зоны Т и В клеток
в лимфоидных тканях [11].
Ramos - Vara J.A. и др. (1994) исследовали реактивность поликлональной
человеческой CD 3 антисыворотки в лимфоидных тканях крупного рогатого скота
проводя эксперименты с другими жвачными животными, крысами и мышами.
Установлено, что данная поликлональная антисыворотка выявляет аналогичные
популяции лимфоидных клеток у исследованных животных. При этом специфичность
реакции была очень высокой. В периартериальных лимфоидных скоплениях (Т-зона)
селезенки масса лимфоцитов окрашена положительно. В лимфоидных фолликулах
встречаются единичные Т-лимфоциты, а в красной пульпе положительно окрашенное
количество лимфоцитов умеренное [12].
Collins Kelley L. и др. (1997) выявили Т- и В-лимфоциты в парафиновых срезах от
крупного рогатого скота и лощадей используя моноклональные антитела для В-лимфоцит
маркеров BLA.36, B29, mb-1 и Т-лимфоцит маркеров CD 3 и CD 5. Моноклональное
антитело BLA.36 реагировало с 80-90 % лимфоцитами в герминативном центре и
мантийной зоне лимфоидных фолликулов селезенки. Кроме этого, 90% лимфоцитов в
маргинальной зоне селезенки также были позитивны на BLA.36. Такие же результаты
получены и при применении моноклональных антител на B29, mb-1 маркеры, но в
герминативном центре лимфоидных фолликулов было мало позитивных клеток [13].
CD 3 и CD 5 также дали позитивную реакцию с 90% лимфоцитами в селезенке и в
лимфоидных фолликулах также встречались единичные позитивные лимфоциты. AntiCD3 антисыворотка дала положительную реакцию с 95% лимфоцитами в красной пульпе,
но anti-CD5 антисыворотка дала слабую реакцию с 5-10% лимфоцитами в красной пульпе.
Вышеуказанные морфологические исследования КАЛТ у крупного рогатого
скота показывают, что более детально исследованы анатомические и гистологические
данные КАЛТ у крупного рогатого скота в пренатальном и постнатальном развитии. С
90-годов
прошлого
столетия
ученые
развитых
стран
стали
применять
иммуногистохимические методы для идентификации иммунокомпетентных клеток
животных и их субпопуляции в лимфодных органах и тканях с применением различных
первичных поли- и моноклональных антител.
Цель настоящей работы заключается в демонстрации клеточного состава кишечноассоциированной лимфоидной ткани крупного рогатого скота с помощью
гистологических и иммуногистохимических методов.
Объекты и методы исследования
Работа выполнялась на кафедре ветеринарно-санитарной экспертизы, гистологии и
патологии факультета ветеринарной медицины Кыргызского национального аграрного
университета им. К.И. Скрябина и в лаборатории иммуногистохимии и гематологии
института ветеринарной патологии факультета ветеринарной медицины Гиссенского
Университета (Гиссен, Германия).
После забоя 12 голов крупного рогатого скота в возрасте от 1,5 до 7 лет в убойных
пунктах городов Ош и Бишкек все органы забитых животных были подвергнуты
детальному осмотру для исключения какой-либо патологии. При исследовании
лимфоидных органов в них отсутствовали макроскопические изменения.
Объектами исследования служили
кусочки кишечника, где локализована
кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань. Гистологическому исследованию
подвергнуты кусочки кишечника от всех 12 голов крупного рогатого скота, а
иммуногистохимическому исследованию кусочки кишечника от 3 голов.
Кусочки кишечника после детального осмотра были зафиксированы в 10%-ном
водном растворе нейтрального формалина. После фиксации дальнейшая гистологическая
процедура (обезвоживание и заключение в парафин кусочков) производилась обычных
лабораторных условиях (вручную) и в специальной машине в вакууме (автоматически).
Из парафиновых блоков готовились серийные срезы на санном микротоме толщиной 4-6
мкм и на микротоме новой модификации толщиной 2 мкм. Гистологические препараты
окрашивали гематоксилином и эозином для описания и анализа общей гистокартины
легких.
При иммуногистохимическом исследовании гистологических срезов были
использованы АВС ( avidin-biotin complex) метод для выявления В- лимфоцитов, РАР
(peroxidase-antiperoxidase complex) метод для выявления Т- лимфоцитов, макрофагов и
пролиферации клеток.
Для выявления Т-лимфоцитов использовали антисыворотку Polyclonal Rabbit AntiHuman T cell, CD 3. Code No. A. 0452, (PAP); В-лимфоцитов - антисыворотку Monoclonal
Mouse Anti-Human B-Lymphocyte Antigen (BLA. 36), (ABC); макрофагов – антисыворотку
Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387. Code Nr. M0747
(PAP); пролиферацию клеток - антисыворотку Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell
Nuclear Antigen, Clone PC10. Code-Nr. M 0879 (PAP).
При положительной реакции CD 3 положительные клетки (Т- лимфоциты), BLA.
36 положительные клетки (В- лимфоциты), клетки в состоянии пролиферации
окрашивались в коричневый цвет, MAC 387 положительные клетки (макрофаги) – в
темно-коричневый цвет.
Результаты собственных исследований
Определенной частью КАЛТ крупного рогатого скота, помимо лимфоидных
фолликулов различных размеров и форм, являются диффузно распространенные
лимфоидные клетки в стенке кишечника. Клеточный состав КАЛТ представлен
лимфоцитами, плазматическими клетками, макрофагами и гранулоцитами (Рис. 1).
а
б
Рис.1. Парафиновый срез стенки кишечника крупного рогатого скота. а. Наличие
лимфоидных фолликулов в стенке кишечника (указаны стрелками). Окраска
гематоксилином и эозином. Увел. х 100. б. Диффузное расположение лимфоцитов,
плазматических клеток, макрофагов и эозинофилов в собственной пластинке слизистой
оболочки (указано звездочками). Наличие интраэпителиальных лимфоцитов (указаны
стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. bar=25µm.
Иммуногистохимическими исследованиями установлены следующие результаты: в
слизистой оболочке кишечника выявлены Т-лимфоциты, которые были локализованы как
диффузно (Рис. 2 а), так и в виде скоплений (Рис. 2б). Также отмечается
интраэпителиальное расположение Т-лимфоцитов в эпителии кишечника (Рис. 2а, б).
а
б
Рис. 2. Парафиновый срез кишечника крупного рогатого скота. Иммуногистохимическое
выявление в КАЛТ
Т-лимфоцитов. РАР метод. а. Диффузное расположение Тлимфоцитов в слизистой оболочке кишечника. bar=100 µm. б. Очаговое скопление Тлимфоцитов в слизистой оболочке кишечника (указано белыми стрелками). а, б. Много
интраэпителиальных Т-лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника. bar=100 µm.
В слизистой оболочке кишечника обнаружены В- лимфоциты, которые как и Тлимфоциты, расположены диффузно (Рис.3а) и в виде скоплений (Рис. 3б).
а
б
Рис. 3. Парафиновый срез кишечника крупного рогатого скота. Иммуногистохимическое
выявление в КАЛТ В-лимфоцитов. АВС метод. а. Диффузное расположение Влимфоцитов в КАЛТ. bar=100 µm. б. Очаговое скопление В-лимфоцитов в КАЛТ (указаны
белыми стрелками). bar=100 µm.
Макрофаги в стенке кишечника располагаются диффузно (Рис.4). В слизистой
оболочке кишечника отмечается пролиферация эпителиальных и других клеток (Рис. 5).
Рис. 4. Парафиновый срез кишечника крупного рогатого скота. Иммуногистохимическое
выявление макрофагов. РАР метод. а. Диффузное расположение макрофагов в слизистой
оболочке кишечника.
Рис.5. Парафиновый срез кишечника крупного рогатого скота. Пролиферация клеток в
слизистой оболочке кишечника (окрашена коричневым цветом). РАР метод.
Выводы
1.Гистологически КАЛТ крупного рогатого скота представлена лимфоидными
фолликулами различных размеров и форм, а также диффузным распространением
лимфоидных клеток в стенке слизистой оболочки кишечника.
2. Проведенными иммуногистохимическими исследованиями показано, что
Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3 антисыворотку можно использовать для
выявления Т-лимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human B-Lymphocyte Antigen (BLA. 36)
антисыворотку – для выявления В- лимфоцитов, Monoclonal Mouse Anti-Human
Myeloid/Histocyte Antigen, Clone MAC 387 антисыворотку – для выявления макрофагов, а
Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone PC10 – для выявления
пролиферирующих клеток в парафиновых срезах кишечника крупного рогатого скота при
формалиновой фиксации.
3.Полученные морфологические параметры КАЛТ крупного рогатого скота можно
применить как относительную норму при исследовании морфофункционального КАЛТ .
4.Вышеуказанные поли- и моноклональные антитела в дальнейшем можно
использовать при исследовании патологии КАЛТ при различных заболеваниях крупного
рогатого скота.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. LIEBLER-TENORIO E., PABST R.; MALT structure and function in farm аnimals. Vet.
Res, 2006.37. 257-280.
2. Landsverk T., Halleraker M., Aleksandersen M., McClure S., Hein W., Nicander L., The
intestinal habitat for organized lymphoid tissues in ruminants; comparative aspects of
structure, function and development, Vet. Immunol. Immunopathol. 28 (1991) 1–16.
3. Hebel R., Research on the occurrence of lymphatic intestinal crypts in the tunica
submucosa of the intestines of swine, cattle, sheep, dogs and cats, Anat. Anz. 109 (1960)
7–27.
4. Yasuda M., Fujino M., Nasu T., Murakami T., Histological studies on the ontogeny of
bovine gut-associated lymphoid tissue: appearance of T cells and development of IgG+
and IgA+ cells in lymphoid follicles, Dev. Comp. Immunol. 28 (2004) 357–369.
5. Liebler E.M., Küsters C., Pohlenz J.F., Experimental mucosal disease in cattle: changes
of lymphocyte subpopulations in Peyer’s patches and in lymphoid nodules of large
intestine, Vet. Immunol. Immunopathol. 48 (1995) 233–248.
6. Parsons K.R., Howard C.J., Jones B.V., Sopp P., Investigation of bovine gut associated
lymphoid tissue (GALT) using monoclonal anti- bodies against bovine lymphocytes, Vet.
Pathol. 26 (1989) 396–408.
7. Yang H., Parkhouse R.M., Phenotypic classification of porcine lymphocyte
subpopulations in blood and lymphoid tissues, Immunology 89 (1996) 76–83.
8. Saw Po Po, ABZ Zuki, M Zamri-Saad, A Rahman-Omar, AW Effendy. Morphological
Study of the Jejunal and Ileal Peyer's Patches of Three-month Old Calves. Journal of
Animal and Veterinary Advances 4 (6): 579-589, 2005.
9. Видякина М. А. Морфологические изменения лимфоидной ткани кишечника в
онтогенезе у крупного рогатого скота/ Автореф. дис…. канд. вет. наук. 16.00.02. –
Киров, 2003. – 20 с.
10. Бяков И. А. Морфогенез лимфоидной ткани ротоглотки, пищевода и желудка у
крупного рогатого скота/ Автореф. дис ... канд. вет. наук. 16.00.02. - Киров, 2007.20 с.
11. Jones M. et all. Detection of T and B cells in many animal species using cross-reactive
anti-peptide antibodies.// The Journal of immunology. , No.12, June 15,1993, Vol 150,
5429-5435.
12. Ramos-Vara J. A. et all. Reactivity of polyclonal human CD 3 antiserum in lymphoid
tissues of cattle, sheep, goats,rats and mice.// Am J Vet Res, Vol 55, No. 1,January 1994.
p. 63-66.
13. Collins Kelley L., Mahaffey E. A., Bounous D.I., Antczak D.F., Brooks R.L. Detection
of equine and bovine T- and B- lymphocytes in formalin-fixed paraffin-embedded
tissues. // Veterinary Immunology and Immunopathology 57. 1997. p. 187-200.