Заключение - Neuroscience.ru

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
БИОФИЗИКИ
На правах рукописи
СЕМЬЯНОВ Алексей Васильевич
ОСОБЕННОСТИ ГАМКЕРГИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ И ЕЕ МОДУЛЯЦИЯ
ГЕТЕРОРЕЦЕПТОРАМИ В ПОЛЕ СА1 ГИППОКАМПА
Специальность 03.00.13 – физиология
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты:
доктор биологических наук
О.В.Годухин
профессор D.M. Kullmann
ЛОНДОН – ПУЩИНО
2002
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ .......................................................................................................... 1
Сокращения и глоссарий .................................................................................................... 6
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................. 10
1
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 17
1.1 Торможение в гиппокампе .......................................................................................... 17
1.1.1 ГАМКергическая синаптическая передача ........................................................... 17
1.1.2 ГАМКергические рецепторы .................................................................................. 19
1.1.3 Разнообразие форм торможения ............................................................................ 26
1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения .................. 28
1.2 Взаимодействие между глутамат и ГАМКергической системами ...................... 34
1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия .................................................................. 35
1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии ........................................................... 38
1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе .......................................... 39
1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе ..................................................................... 41
1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза ................................................................. 45
1.3.1 Исследования эпилептогенеза ................................................................................ 45
1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности .............................................. 48
1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе ...................................................... 51
1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе .............................................................. 52
1.4 Постановка цели и задач исследования ................................................................... 55
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................................................. 57
2.1 Срезы гиппокампа ........................................................................................................ 57
2.1.1 Приготовление и растворы ..................................................................................... 57
2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы ............................ 58
2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии ............................... 60
1
2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов .......................................................... 63
2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с
одиночных нейронов .......................................................................................................... 65
2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы .............................................................. 65
2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных ................................................... 69
2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала ..... 70
2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации ............................ 73
2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch ................................................................ 75
2.5.1 Приготовление outside-out patch ............................................................................. 75
2.5.2 Система быстрой аппликации веществ ................................................................. 75
2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа
токов, полученных с outside-out пейчей ......................................................................... 78
2.6 Модели эпилептогенеза in vivo ................................................................................... 80
2.6.1 Электрический киндлинг ........................................................................................ 80
2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг ........... 82
2.7 Использованные вещества .......................................................................................... 83
2.8 Статистический анализ ............................................................................................... 85
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ................................. 86
3.1 Нетипичные фармакологические свойства ГАМКергических рецепторов в
гиппокампальных интернейронах .................................................................................. 86
3.1.1 Различная чувствительность ионотропных ГАМКергических рецепторов к
пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках ............................................... 86
3.1.2 Ионные каналы ионотропных ГАМКергических рецепторов в интернейронах и
пирамидных клетках имеют различную проводимость ................................................ 88
3.1.3 Ионотропные ГАМКергические рецепторы как в интернейронах, так и
пирамидных клетках чувствительны к агонисту ГАМКС рецепторов ........................ 90
3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует ГАМКергические токи, вызываемые
аппликацией CACA (50 М) ............................................................................................ 95
2
3.1.5 ТПСТ в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 М пикротоксина,
обладают повышенной чувствительностью к антагонисту ГАМКС рецепторов ........ 97
3.1.6 Токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами, в присутствии
100 М пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/HCO3- ионой
проводимости .................................................................................................................... 98
3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов ГАМКА рецепторов на устойчивые к
пикротоксину токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами .................. 102
3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов ГАМКА и ГАМКС рецепторов на
устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами
........................................................................................................................................... 106
3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными
фармакологическими свойствами ................................................................................. 109
3.1.10 Нетипичные ГАМКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов
(ГАМКА и ГАМКС) ......................................................................................................... 113
3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных ГАМКергических
рецепторов в интернейронах ......................................................................................... 115
3.1.12
Заключение ...................................................................................................... 117
3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет ГАМКергического
тонического торможения ................................................................................................. 119
3.2.1 Базовый тонический ГАМКергический ток специфичен для интернейронов, но
не пирамидных клеток.................................................................................................... 119
3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК ведет к возникновению
тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах ............... 123
3.2.3 Температурная зависимость тонического ГАМКергического тока и фазических
спонтанных ТПСТ........................................................................................................... 126
3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе ........................... 129
3.2.5 Заключение ............................................................................................................. 133
3.3 Модуляция ГАМКергической передачи в гиппокампе метаботропными
рецепторами ....................................................................................................................... 135
3.3.1 L-AP4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в
интернейронах ................................................................................................................. 135
3
демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях
коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках СА1. ............... 139
3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает ТПСТ ............................... 139
3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию ТПСТ ........................ 141
3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на
гетеросинаптическую депрессию .................................................................................. 143
3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую
депрессию по двум различным механизмам ................................................................ 147
3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных ТПСТ
........................................................................................................................................... 149
3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии ТПСТ при активации mGluR
группы III ......................................................................................................................... 152
3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости
нейрональной сети поля СА1 ........................................................................................ 153
3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными ГАМКB
рецепторами .................................................................................................................... 159
3.3.10 Заключение ........................................................................................................... 161
3.4 Каинатные рецепторы модулируют ГАМКергическое торможение в
гиппокампальных интернейронах ................................................................................ 162
3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных ТПСТ в интернейронах
........................................................................................................................................... 162
3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов
действия в интернейронах.............................................................................................. 164
3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия .................. 168
3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы............ 171
3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными
рецепторами, для ГАМКергической передачи ............................................................ 173
3.4.6 Каинат усиливает вызванные ТПСТ в интернейронах ...................................... 177
3.4.7 Каинат приводит к увеличению ГАМКергического тонического тока ............ 182
3.4.8 Последствия усиления ГАМКергической передачи в интернейронах,
вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети ...... 185
3.4.9 Заключение ............................................................................................................. 188
4
3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы
противоположное действие на ГАМКергическую передачу? .................................. 189
3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе ............................... 192
3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают
долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле СА1
гиппокампа ...................................................................................................................... 192
3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле СА1 гиппокампа не зависит от активности
нейронов поля СА3 ......................................................................................................... 194
3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле СА1 в ответ на кратковременные
увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo . 195
3.6.4 Является ли пачечная активность в поле СА1 гиппокампа эпилептиформной?
........................................................................................................................................... 200
3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля СА1 генерировать пачечные разряды
сопровождается повышением возбудимости этих клеток .......................................... 202
3.6.6 Роль NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов в повышение
возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов ........................ 206
3.6.7 Заключение ............................................................................................................. 209
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 211
Клеткоспецифичность ГАМКергического торможения в гиппокампе ..................... 213
Клеткоспецифичность модуляции ГАМКергического торможения в гиппокампе . 214
Возбудимость и торможение в эпилептогенезе ........................................................... 216
ВЫВОДЫ.............................................................................................................. 221
СПИСОК РИСУНКОВ ........................................................................................... 224
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 227
5
Сокращения и глоссарий
ТД – ток действия. Ток, регистрируемый при генерации потенциала действия в режиме
фиксации потенциала.
ПД – потенциал действия
ТПСТ – тормозный постсинаптический ток, регистрируется при активации тормозных
постсинаптических рецепторов (в данной работе ГАМКергических
рецепторов) в режиме фиксации потенциала.
ГАМК – гамма-аминомаслянная кислота (ГАМКергические рецепторы- рецепторы,
эндогенным агонистом которых является ГАМК. Это основные тормозные
рецепторы в ЦНС.
NMDA – N-метил-D-аспартат (NMDA рецепторы – глутаматергические рецепторы,
связанные, как правило, с Ca2+ приводимостью, при физиологических
условиях в большинстве случаев канал этих рецепторов блокирован Mg2+)
ток компенсации – ток, который подает усилитель на клеточную мембрану в режиме
whole cell с целью фиксации необходимого потенциала. Изменения в токе
компенсации отражают медленные изменения в потенциале мембраны,
например, изменения тонической проводимости. Блокада ионотропных
рецепторов и каналов, как привило, приводит к снижению тока компенсации.
Устойчивый рост тока компенсации в течение эксперимента может отражать
ухудшение состояния клетки и ее гибель (падение потенциала покоя требует
большего тока для фиксации потенциала).
whole cell (англ. целая клетка) – в данном контексте означает проведение записей с
целой клетки с использованием метода пейч-кламп.
ЦНС - центральная нервная система
6
входное сопротивление – сопротивление, основным компонентом которого является
сопротивление клеточной мембраны. В данной работе входное сопротивление
измерялось в ходе каждого эксперимента в режиме фиксации потенциала по
форме тока вызываемого кратковременным гиперполяризующим сдвигом
потенциала.
mGluR (от англ. metabotropic glutamate receptors) – метаботропные рецепторы
глутамата. Делятся на три группы I, II и III. Каждая группа включает в себя
также несколько классов рецепторов.
AMPA – α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолепропионат, агонист
AMPA/каинатных рецепторов глутамата. AMPA рецепторы – ионотропный
подтип глутаматергических рецепторов, опосредующий основную часть
возбуждающей глутаматергической синаптической передачи.
uptake (от англ. поглощение) – термин, определяющий обратный захват
нейропередатчика, высвободившегося при синаптическом событии. Как
правило, он осуществляется благодаря глиальным и нейрональным
транспортерам и предотвращает чрезмерное повышение внеклеточной
концентрации нейропередатчиков.
РТХ – пикротоксин, антагонист ионотропных ГАМКергических рецепторов.
ВПСТ - возбуждающий постсинаптический ток, регистрируется при активации
возбуждающих постсинаптических рецепторов (в данной работе
глутаматергических рецепторов) в режиме фиксации потенциала.
с.о.с – стандартная ошибка среднего, статистический параметр (см. Материалы и
методы)
7
спилловер (от англ. spillover – растекание, в данном случае, нейропередатчика) –
термин, определяющий тип диффузной нейропередачи, когда
нейропередатчик способен покидать синаптическую щель и активировать
внесинаптические рецепторы или рецепторы в соседних синапсах.
ВПСП – возбуждающий постсинаптический потенциал (см. также ВПСТ; пВПСТ –
полевой ВПСТ, потенциал, регистрируемый внеклеточным электродом с
целой популяции синапсов)
популяционный спайк (ПС) – суммарный ответ, получаемый при регистрации
внеклеточным электродом в случае, когда несколько клеток одновременно
генерируют потенциал действия. Амплитуда популяционного спайка
отражает число, амплитуду и синхронизацию одиночных ПД и служит мерой
возбудимости и синхронизации нейронов.
потенциал волокон (пВ) – потенциал, регистрируемый внеклеточным электродом
при активации группы пресинаптических волокон и возникающий в ответ на
электрическую стимуляцию. Представляет собой суммацию потенциалов
действия волокон, а его амплитуда, следовательно, отражает число
одиночных потенциалов действия на данную силу стимула и возбудимость
стимулируемых аксонов.
LTP (от англ. long term potentiation) – долговременная потенциация синаптической
передачи. Термином, как правило, определяется состояние повышения
эффективности глутаматергической синаптической передачи в результате
предшествующей высокой активности данного синапса.
ПДС – пароксизмальный деполяризационный сдвиг. Резкий деполяризующий сдвиг
мембранного потенциала нейрона, который приводит к генерации пачечного
8
разряда. Считается одним из механизмов формирования эпилептиформной
активности.
окклюзия – термин, который в данной работе использован для обозначения факта, что
развитие одного электрофизиологического состояния препятствует развитию
другого. В частности, развитие пачечной активности при эпилептогенезе в
моделях in vivo не позволяло развиваться дополнительным спайкам в модели
пачечной активности in vitro. Наличие окклюзии указывает на возможное
сходство механизмов развития двух процессов.
9
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Соотношение тормозной и возбуждающей систем нейропередачи в центральной
нервной системе закладывает основу для обработки и сохранения информации мозгом.
Нарушение этого баланса приводит к развитию ряда нейродегенеративных
заболеваний, в частности эпилепсии. Не смотря на длительную историю изучения
тормозных и возбуждающих нейронов, синаптической передачи между этими
клетками и механизмов ее модуляции, достигнуто сравнительно немного в
направлении излечения патологических состояний мозга.
Использование современных методов, технологий и достижений фармакологии
позволило, тем не менее, сделать определенный успех в данной проблематике. В
частности, описаны основные типы рецепторов глутамата и ГАМК, главных
возбуждающего и тормозного медиаторов головного мозга (Barnard et al. 1998; Chen et
al. 2001). Идентифицированы основные возбуждающие и тормозные пути
синаптической передачи. При этом, казалось бы, логичная синаптическая модель
построения мозга оказалась недостаточной, для того чтобы реалистично описать
функционирование системы в целом.
Таким образом, задачей современной науки стала детализация и уточнение
функциональных изменений в синаптической передаче и возбудимости нервных
клеток. Для этого проводятся исследования субъединичного состава рецепторов и
поиск специфических активных веществ (блокаторов, активаторов, аллостерических
модуляторов этих рецепторов); биохимических каскадов, запускаемых активацией
рецепторов; особенностей высвобождения, поглощения и
синаптического/внесинаптического действия нейропередатчиков; интеграции и
взаимодействия различных систем нейропередатчиков. Так было показано, что
10
ГАМКергические рецепторы, являясь пентомерами, имеют различную субъединичную
(субъединиц насчитывается, по современным данным, 18 классов) комбинацию в
зависимости от типа и локализации нейрона. Логично предположить, что подобная
гетерогенность рецепторов определяет высокую клеточную и синаптическую
специфичность ГАМКергического торможения в мозге при использовании одного и
того же эндогенного агониста (ГАМК). На практике это означает, что эффективность
торможения будет зависеть не только от числа тормозных терминалей на клетке и не
только от их способности эффективно высвобождать медиатор, но и от того, как
постсинаптическая клетка на него будет реагировать.
С другой стороны, современные иммуноцитохимические и
электрофизиологические исследования показали, что расположение рецепторов
различных нейропередатчиков и эффект их активации не ограничивается лишь
локальным постсинаптическим участком (Isaacson 2000; Soltesz and Nusser 2001; Vizi
and Kiss 1998). Внесинаптические рецепторы могут находиться на соме, дендритах и,
даже, аксоне клетки. Роль этих рецепторов привлекает значительное внимание и
остается до конца не изученной. Предполагается, что внесинаптические рецепторы
являются своего рода “детекторами” внеклеточной концентрации медиаторов и
специфически балансируют возбудимость клеток. Например, при эпилептиформной
активности или нарушении обратного захвата медиаторов концентрация глутамата и
ГАМК возрастает в межклеточном пространстве (Kullmann 1999). В этом случае,
клетки содержащие внесинаптические возбуждающие и/или тормозные рецепторы
будут менять свою возбудимость в соответствии с этим увеличением. Такие
изменения, в зависимости от их интенсивности и типа клетки, на которую они
воздействуют (это может быть тормозный интернейрон или возбуждающий нейрон),
будут иметь эпилептогенный или, наоборот, антиэпилептогенный эффект.
11
Одной из структур мозга, обладающей повышенной чувствительностью к
эпилептогенезу, является гиппокамп, клеточная организация которого довольно
хорошо изучена (Freund and Buzsaki 1996; Vizi and Kiss 1998). Тем не менее, остается
до конца не ясным, какие механизмы вовлекаются на уровне разных типов клеток в
эпилептиформную активность. До последнего времени бытовал упрошенный взгляд на
соотношение тормозной и возбуждающей передачи в этой структуре. Основные
возбуждающие связи были представлены глутаматергическими гранулярными
клетками зубчатой фасции и пирамидными клетками полей СА1-СА3 и субикулюма.
Тормозная система представлялась ГАМКергическими интернейронами, диффузно
расположенными в ткани и имеющими моносинаптические контакты с
возбуждающими клетками. Такая схема не могла объяснить полностью все эффекты на
клеточном уровне, которые возникали при эпилепсии. Представление о сложности
синаптических связей в сети интернейронов, когда торможению подвергаются не
только возбуждающие клетки, но и сами интернейроны, позволило расширить наши
представления об обработке сигнала и патогенезе в гиппокампе. Принимая во
внимание, всевозможные внесинаптические события и клеточную специфичность
рецепторов нейропередатчиков, открылось целое направление исследований, которое
может привести к более глубокому пониманию процессов обработки информации в
мозге и разработке специфически действующих лекарственных препаратов,
высокоэффективных при том или ином нейродегенеративном заболевании. Этому
направлению исследований и посвящена представленная диссертационная работа.
Научная новизна
1. В представленной работе, впервые, показано наличие в гиппокампе
ГАМКергических рецепторов с характерной для ГАМКС фармакологией. Прежде
считалось, что эти рецепторы находятся в основном в ретине.
12
2. В интернейронах гиппокампа описан ГАМКергический ток, опосредованный
рецепторами, которые не могут быть отнесены ни одному из известных типов
ГАМКергических рецепторов. Их фармакологический профиль совмещает в себе
свойства как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов. Эти рецепторы
клеткоспецифичены и не обнаружены в пирамидных нейронах.
3. Впервые показано, что в гиппокампальных интернейронах, но не пирамидных
клетках, при обычных условиях помимо фазического торможения
(ГАМКергических ТПСТ) существует пикротоксин-чувствительный тонический
ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами.
4. Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к возникновению
тонического тока как в интернейронах, так и в пирамидных клетках. Этот ток
отличается по фармакологическим свойствам от базового тонического тока в
интернейронах.
5. Впервые представлено электрофизиологическое доказательство наличия
глутаматергических метаботропных рецепторов в тормозных ГАМКергических
синапсах интернейронов, но не пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Эти
рецепторы (относящиеся к группе III) активируются спилловером глутамата с
соседних глутаматергических синапсов и снижают вероятность выброса ГАМК.
6. Представлено доказательство того, что метаботропные ГАМКB рецепторы,
находящиеся на тормозных терминалях интернейронов могут активироваться за
счет спилловера ГАМК с соседних терминалей.
7. Впервые показано наличие каинатных рецепторов в аксонах интернейронов
гиппокампа. Активация этих рецепторов за счет спилловера глутамата с
возбуждающих терминалей снижает порог генерации потенциалов действия в
аксонах интернейронов.
13
8. Блокада NMDA рецепторов, модулирующих глутаматергическую передачу,
снижает, но не достаточна, чтобы подавить пачечную активность в срезах
гиппокампа.
9. Блокада L-типа потенциал-зависимых кальциевых каналов (изменяющих
возбудимость клеток и модулирующих ГАМКергическую передачу) полностью
подавляет пачечную активность.
Научно-практическая значимость исследования
1. Данные, полученные в данной работе, дают более глубокое понимание структуры
взаимосвязей между различными формами ионотропных ГАМКергических
рецепторов и создают предпосылку для внесения изменений в их классификацию.
2. Клеточная специфичность распределения ГАМКергических рецепторов,
тонического торможения, модулирующих влияний метаботропных и каинатных
рецепторов на тормозную передачу создает возможность создания ряда препаратов
(или их комбинаций) селективно влияющих как на возбудимость нейрональной
сети в целом, так и отдельных синаптических путей. Это может быть использовано,
в частности, для создания препаратов с выраженным антиэпилептическим
действием и отсутствием побочных эффектов.
3. Разработанная модель пачечной активности in vitro может быть применена как для
исследования фундаментальных основ формирования ритмов, так и иссследования
эпилептиформной активности.
4. Результаты представленной работы вошли в курс лекций читаемых студентам
медицинского факультета University College London (Лондон, Великобритания) и в
курсы повышения квалификации врачей и научных сотрудников National Hospital
of Neurology (Лондон, Великобритания).
14
5. Результаты представленной работы подготовлены для главы Synaptic Function
учебника по Нейробиологии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. Традиционная классификация разделяет ионотропные ГАМКергические рецепторы
на два типа ГАМКА и ГАМКС. В представленной работе в интернейронах
гиппокампа нами обнаружена форма ГАМКергического рецептора, совмещающего
свойства как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов.
2. Отсутствие диапазона пластических изменений, характерных для
глутаматергических синапсов, в ГАМКергических синапсах компенсируется
разнообразием и синаптической специфичностью рецепторов этого медиатора.
Нами показано, что фармакологические свойства ГАМКергических рецепторов
различны в интернейронах и пирамидных клетках.
3. В гиппокампе помимо фазического торможения (ТПСТ), опосредованного
ГАМКергическими рецепторами, существует ГАМКергическое тоническое
торможение. При базовых условиях это торможение наблюдается только в
интернейронах. При повышении внеклеточной концентрации ГАМКергический
тонический ток регистрируется как в интернейронах, так и пирамидных клетках.
Причем, тоническая проводимость, связанная с повышением внеклеточной
концентрации ГАМК, фармакологически отличается от тонической проводимости
при базовых условиях в интернейронах.
4. Глутаматергические метаботропные рецепторы группы III располагаются в
пресинаптическом звене тормозных ГАМКергических синапсов на интернейронах,
но не на пирамидных клетках. Активация этих рецепторов за счет спилловера
глутамата с возбуждающих синапсов снижает выброс ГАМК.
15
5. Глутаматергические каинатные рецепторы располагаются на аксонах
интернейронов и при активации за счет спилловера глутамата с возбуждающих
синапсов снижают порог генерации потенциалов действия в этих аксонах.
6. Са2+ ток, опосредованный NMDA рецепторами, регулирующими
глутаматергическую передачу, влияет, но не является необходимым для развития
пачечной активности в поле СА1 срезов гиппокампа. Пачечная активность в
использованной модели зависит от Са2+ тока, опосредованного L-типом потенциалзависимых кальциевых каналов, изменяющих возбудимость клеток и
модулирующих ГАМКергическую передачу.
16
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Торможение в гиппокампе
По причине того, что гиппокамп играет центральную роль в формировании памяти,
а также в ряде форм эпилептогенеза, большое внимание уделяется механизмам
регулирующим возбудимость этой структуры. Существует несколько особенностей
возбуждающей глутаматергической нейропередачи, которые могут объяснить
повышенную чувствительность гиппокампа к инициации и/или распространению
судорожной активности. Например, это наличие как минимум двух форм
долговременной потенциации и существование взаимных возбуждающих связей
между пирамидными нейронами в поле СА3. Помимо глутаматергической системы,
важную роль в возбудимости гиппокампа играет тормозная ГАМКергическая система,
представленная интернейронам. Не смотря на то, что эти клетки, традиционно
рассматриваются, как тормоз в распространении возбуждения, они могут также иметь
дезингибирующее действие, если иннервируют другие интернейроны. Кроме того, сеть
взаимосвязанных интернейронов играет ключевую роль в синхронизации активности
пирамидных клеток (Cobb et al. 1995; Whittington et al. 1995). Этот феномен может
быть как механизмом генерации нормальных ритмов, так и принимать участие в
патологических популяционных разрядах в гиппокампе.
1.1.1 ГАМКергическая синаптическая передача
ГАМК (γ-аминомасляная кислота), основной тормозный нейропередатчик в ЦНС,
синтезируется при декарбоксилировании глутамата. Существует две изоформы
декарбоксилазы (GAD67 и GAD65). GAD67 распространена по всей цитоплазме, а
GAD65 в основном находится в пресинаптических терминалях ГАМКергических
интернейронов. Экспрессия этого фермента меняется в зависимости от активности
17
нейрона, указывая на то, что он играет определенную роль в регуляции
ГАМКергической передачи (Soghomonian and Martin 1998). Молекулы
нейропередатчика в пресинаптическом участке переносятся из цитоплазмы в везикулы
с помощью специальных транспортеров, которые используют протонный градиент,
создаваемый везикулярными АТФазами. Интересно отметить, что механизмы
везикулярного захвата возбуждающего медиатора (глутамата) и тормозного (ГАМК)
принципиально различны. Анионы глутамата непосредственно движутся в везикулы
по градиенту, сформированному высокой концентрацией H+ в везикулах. В случае
ГАМК, по протонному градиенту движутся сначала анионы Cl-, которые затем
обмениваются на анионы ГАМК (Fykse and Fonnum 1996). Белок, участвующий в
поглощении глутамата везикулами, был недавно обнаружен (Bellocchio et al. 2000;
Takamori et al. 2000), тогда как белок, опосредующий обмен Cl- на ГАМК-, остается
неизвестным. Известно только, что захват ГАМК в везикулы происходит при
вспомогательной роли фермента VGAT1, который также участвует везикулярном
транспорте глицина. Тем не менее, этот фермент не является абсолютно необходимым
для упаковки ГАМК в везикулы, поскольку отсутствует в ряде ГАМКергических
терминалей (Chaudhry et al. 1998).
После того как ГАМК высвобождается в синаптическую щель, начинается ее
захват электрогенными транспортерами. В настоящее время известно три таких
транспортера: GAT1, GAT2 и GAT3 (Schousboe 2000). Эти транспортеры расположены
как в астроцитах, так и в самих нейронах. Поскольку транспорт является
электрогенным, анион аминокислоты переносится вместе с двумя катионами Na+ (и,
видимо, одним анионом Cl-) (Cammack et al. 1994; Kavanaugh et al. 1992). Различные
типы транспортеров обладают клеткоспецифичной локализацией. Например, GAT1
практически отсутствует в нейронах, в отличие от GAT3.
18
1.1.2 ГАМКергические рецепторы
ГАМК действует на две основные группы рецепторов - ионотропные
ГАМКА/ГАМКС (Рис.1.1) и метаботропные ГАМКВ рецепторы (Bormann 2000a). В
настоящее время правомерность деления ионотропных рецепторов на два типа А и С
активно дискутируется. В данном обзоре литературы для сохранения объективности
рассмотрение типов ГАМКергических рецепторов проводится в алфавитном порядке
“ABC”.
а
бензодиазепины
ГАМК, CACA, изокувазин
бикукуллин, TPMPA
б
бензодиазепины ГАМК, CACA, изокувазин
бикукуллин, TPMPA
барбитураты
барбитураты
-
-
Cl
Cl
пикротоксин
ГАМКA
пикротоксин
ГАМКC
Рис. 1.1 Фармакологические характеристики ионотропных ГАМКергических
рецепторов
а, Схема ГАМКА рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК, изогувазин;
конкурентный антагонист бикукуллин, действующий на сайт связывания агонистов.
Показаны сайты аллостерических модуляторов: бензодиазепинов и барбитуратов.
Неконкурентный антагонист пикротоксин действует на участок внутри канала ГАМКА
рецепторов. б, схема ГАМКС рецептора, на которой показаны агонисты: ГАМК,
CACA; конкурентный антагонист TPMPA, действующий на сайт связывания
агонистов. Сайты аллостерических модуляторов отсутствуют. Пикротоксин также
является неконкурентным антагонистом ГАМКС рецепторов, хотя и менее
эффективным, чем ГАМКА.
19
ГАМКА
ГАМКА рецепторы у млекопитающих состоят из, как минимум, 16 субъединиц,
которые сгруппированы в семь классов: α, β, γ, δ, ε, π и σ (Costa 1998; Mehta and Ticku
1999). Комбинации этих субъединиц дают множество изоформ рецепторов. Причем
композиция субъединиц определяет специфичность эффектов аллостерических
модуляторов ГАМКА рецепторов, таких как нейростероиды, цинк, бензодиазепины и
барбитураты (Mehta and Ticku 1999). Композиция субъединиц также определяет
кинетику активации рецепторов и может оказывать влияние на их десенситизацию
(Bianchi et al. 2001). Интересно, что наличие тех или иных субъединиц в
ГАМКергическом рецепторе зависит и от его локализации. Так, например, α2
субъединица находится исключительно в сомато-дендритных синапсах, но не в
тормозных синапсах на начальном сегменте аксона (Nusser et al. 1996). Наконец,
композиция субъединиц ГАМКА рецепторов может меняться в нейронах во время
эпилептогенеза и эти изменения отражаются в фармакодинамике лекарственных
препаратов (Brooks-Kayal et al. 1998).
Из 16 субъединиц ГАМКА рецепторов только 10 экспрессируются в достаточном
количестве гиппокампе (Sperk et al. 1997). Этого вполне хватает, чтобы создать
значительную гетерогенность ГАМКергических рецепторов в различных участках
данной структуры. Считается, что типичные гиппокампальные рецепторы содержат
одну-две α субъединицы и одну-две β. Поскольку рецептор состоит из 5 субъединиц,
то в дополнение к ним присоединяются одна-две либо γ, либо δ субъединицы
(предполагается, что вместе γ и δ субъединицы не входят в состав одного рецептора).
Наличие γ субъединицы влияет на разные параметры ГАМКергического рецептора. В
частности, γ субъединица взаимодействует с гефирином, цитоскелетным белком,
играющим важную роль в "заякоривании" ГАМКергических рецепторов в
20
синаптической щели (Essrich et al. 1998). ГАМКергические рецепторы, содержащие δ
субъединицу, преимущественно располагаются вне синапса. Значение синаптических
и внесинаптических рецепторов ГАМК будет обсуждено далее (см. раздел 1.1.4
Механизмы и функциональное значение тонического торможения).
В синаптическом ответе ГАМКА рецепторы определяют быстрый компонент тока.
Канал ГАМКА рецептора проницаем для ионов хлора и, в некоторой степени, для
бикарбоната. Поэтому эффект активации данных рецепторов будет зависеть от
электрохимического градиента для вышеуказанных ионов на постсинаптической
мембране (Macdonald and Olsen 1994). В нервной системе взрослых животных
внеклеточная концентрация ионов хлора выше внутриклеточной, что приводит к более
негативному потенциалу реверсии для хлорного тока, чем потенциал покоя клеток.
Таким образом, активация ГАМКА рецепторов приводит к входу ионов Сl- в нейрон и к
гиперполяризации клетки. Необходимый градиент ионов хлора поддерживается
калий/хлор котранспортером KCC2 (Rivera et al. 1999), который начинает выкачивать
Сl- наружу после синаптического события. Отсутствие данного транспортера в
незрелых гиппокампальных нейронах определяет относительно высокую
внутриклеточную концентрацию ионов хлора, что ведет к более позитивному
потенциалу реверсии для этого аниона, чем потенциал покоя клеток. В этом случае,
активация ГАМКА рецепторов приводит к деполяризации нейронов (Ben-Ari et al.
1994; Ganguly et al. 2001; Rivera et al. 1999). Однако, и во взрослом мозге, в котором
ГАМКА рецепторы являются гиперполяризующими, продолжительная активация
ГАМКергических терминалей может привести к длительному деполяризующему
потенциалу (Jackson et al. 1999a). Этот потенциал частично опосредуется
внеклеточным накоплением калия, высвобожденного при активации KCC2 (Smirnov et
al. 1999).
21
Аллостерические модуляторы ГАМКА рецепторов
В ГАМКА рецепторе (Рис.1.1) существует целый ряд модуляторных сайтов,
отличных от сайта связывания агониста. Вещества, воздействующие на данные сайты,
повышают или, наоборот, снижают эффективность активации ГАМКА рецепторов
агонистом (Johnston 1996). Одним из таких сайтов аллостерических модуляторов
является бензодиазепиновый сайт. Этот сайт представляет собой мишень для ряда
препаратов, используемых в клинической практике: антиконвульсантов, седативных и
гипнотических средств. Активация бензодиазепинового сайта ведет к увеличению
аффинности к агонисту у определенной группы, но не всех, ГАМКА рецепторов. Было
показано, что токи, опосредованные низкоаффинными ГАМКергическими
рецепторами, в гиппокампе усиливаются бензодиазепинами в гораздо большей
степени, чем опосредованные высокоаффинными рецепторами (Schonrock and
Bormann 1993). Различия ГАМКергических рецепторов по их чувствительности к
бензодиазепинам, могут быть объяснены также различным составом входящих в них
субъединиц. Это подтверждается тем, что диазепам приводит к увеличению величины
ГАМКергического тока лишь при наличии γ2 субъединицы в ГАМКА рецепторах
(Pritchett et al. 1989). Другим сайтом, аллостерической модуляции ГАМКА рецепторов
является сайт барбитуратов (Рис. 1.1). ГАМКА рецепторы, чувствительные к
барбитуратам более широко распространены в мозге, чем чувствительные к
бензодиазепинам (Johnston 1996). В отличие от бензодиазепинов, увеличивающих
аффинность ГАМКергического рецептора к агонисту, барбитураты увеличивают время
открытого состояния и проводимость каналов ГАМКергического рецептора (Eghbali et
al. 2000). Барбитураты также, как и бензодиазепины, используются в качестве
антиэпилептических и седативных веществ. Сверхдозы пентобарбитала применяются
для эфтаназии.
22
Кроме бензодиазепинов и барбитуратов специфичным модулирующим действием
на ГАМКА рецепторы обладают нейростероиды и цинк (Mehta and Ticku 1999).
ГАМКВ
Метаботропные ГАМКВ рецепторы представляют собой гетеродимеры (Mohler and
Fritschy 1999), состоящие из двух субъединиц: GBR1 и GBR2 (Jones et al. 1998). Эти две
субъединицы возникают благодаря альтернативному сплайсингу (Kuner et al. 1999).
Определено, что ГАМКВ рецепторы находятся как пре-, так и постсинаптически
(Couve et al. 2000; Mott and Lewis 1994). Тем не менее, достаточно мало известно об их
субклеточном распространении (Fritschy et al. 1999). Другими словами, не вполне
понятно, группируются ли, например, постсинаптические ГАМКВ рецепторы в
синаптической щели напротив места выброса ГАМК или расположены на удалении от
синапса. Постсинаптическим эффектом активации данных рецепторов является
длительная гиперполяризация, следующая за быстрым ионотропным компонентом
ГАМКергической передачи. В своем недавнем исследовании Scanziani (Scanziani
2000) приводит аргументы в пользу того, что ГАМКВ рецепторы расположены далеко
от места выброса медиатора и активируются ГАМК, покидающей синаптическую
щель (спилловер ГАМК). При этом он считает, что для достижения достаточной для
активации данных рецепторов внеклеточной концентрации ГАМК необходима
одновременная активация нескольких ГАМКергических синапсов.
Не до конца понятно субклеточное распределение и пресинаптических ГАМКВ
рецепторов. Не ясно расположены ли эти рецепторы в перисинаптической области или
они далеко от активной зоны. Пресинаптический эффект ГАМКВ рецепторов
заключается в том, что они снижают как высвобождение ГАМК в тормозных синапсах,
так и высвобождение глутамата в возбуждающих (Mott and Lewis 1994).
23
ГАМКВ рецепторы связаны с тримерным G-белком (Hill et al. 1984). Одним из
эффектов их активации является ингибирование аденилатциклазы (Nishikawa et al.
1997). Кроме того, данные рецепторы прямо связаны через G-белок с N и P/Q типами
потенциал зависимых кальциевых каналов, которые участвуют в синаптическом
высвобождении нейропередатчиков (Anwyl 1991; Mintz and Bean 1993). Таким
образом, пресинаптические ГАМКВ рецепторы снижают высвобождение
нейропередатчиков уменьшая пресинаптический вход кальция. Наконец, на
постсинаптическом участке ГАМКВ рецепторы запускают каскад реакций, который
ведет к открыванию G-белок связанных К+ каналов (GIRK – G protein-gated inward
rectifying K+ channels) (Andrade et al. 1986; Misgeld et al. 1995). Благодаря активации
этих каналов и возникает медленный ТПСТ, длящийся сотни миллисекунд (Scanziani
2000). По этой причине его легко отличить от ТПСТ, опосредованного ГАМКА
рецепторами. Медленный ТПСТ, опосредованный ГАМКВ рецепторами, будет
характеризоваться длительной кинетикой и потенциалом реверсии отличным от ECl-.
ГАМКС
ГАМКС рецепторы могли бы считаться филогенетически самым старым типом
ионотропных ГАМКергических рецепторов (Bormann and Feigenspan 1995). Этот тип
объединяет гомомерные рецепторы, состоящие только из ρ-субъединиц, которые в
свою очередь делятся на 3 класса: ρ1, ρ2 и ρ3 (Zhang et al. 2001). Данные субъединицы в
наибольшем колличестве сосредоточены в ретине позвоночных, хотя обнаружены и в
других структурах ЦНС, в частности, гиппокампе (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999;
Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al. 1998). Считается, что ρ-субъединицы не образуют
гетеромерных рецепторов с другими субъединицами (Hackam et al. 1998; Koulen et al.
1998). Тем не менее, недавно и была продемонстрирована возможность создания
гетеромера из ρ и γ2 субъединиц в ооцитах Xenopus (Qian and Ripps 1999).
24
Поскольку композиция субъединиц играет ключевую роль в фармакологических
свойствах ГАМКергических рецепторов, ГАМКС рецепторы имеют отличный от
ГАМКА рецепторов фармакологический профиль. Они не чувствительны к
бикукуллину, аллостерическим модуляторам и специфическим агонистам ГАМК А
рецепторов. С другой стороны, существуют специфические агонисты и антагонисты
этих рецепторов, неактивные для ГАМКА (основные различия типов рецепторов
представлены на Рис.1.1) (Bormann 2000a). Тем не менее, комитет IUPHAR не
рекомендовал вводить ГАМКС рецепторы в классификацию как отдельный тип
(Barnard et al. 1998). Он предложил считать эти рецепторы специфическим классом ρсодержащих ГАМКА рецепторов. Основные аргументы обходили тот факт, что эти
рецепторы имеют отличную фармакологию, структуру, функцию и клеточную
локализацию. Вместо этого они делали акцент на том, что выделение ГАМКС
рецепторов как отдельного типа создает возможность для дальнейшего расширения
классификации и разрушения удобной системы ГАМКА/ГАМКВ
(ионотропные/метаботропные рецепторы). Поступило, например, предложение ввести
новый ГАМКD тип рецепторов. В эмбриональной ткани цыплят были обнаружены
ГАМКергические рецепторы, которые не были чувствительны к антагонистам ни
ГАМКА, ни ГАМКВ рецепторов, но активировались агонистами и ГАМКА, и ГАМКВ
(Momose-Sato et al. 1997). Поступило также предложение “ГАМКD” рецептора с
отличной ионной селективностью канала (Perkins and Wong 1996).
Надо отметить, что идея объединения ионотропных ГАМКергических рецепторов в
один тип нашла как своих сторонников, так и своих противников (Bormann 2000a;
Zhang et al. 2001). Таким образом, современная классификация ГАМКергических
рецепторов еще не окончательно сформирована и требует дополнительных
25
экспериментальных исследований, направленных на поиск сходств и различий между
ГАМКА и ГАМКС рецепторами.
В заключение можно заметить, что если принять простое деление
ГАМКергических рецепторов на ионотропные и метаботропные – ГАМКА/ГАМКВ,
различные комбинации субъединиц ионотропных ГАМКергических рецепторов
позволяют существовать целому ряду фармакологически и функционально различных
типов торможения. Исходя из этого, одной из задач данной диссертационной работы
было определение фармакологического и биофизического профиля гиппокампальных
ГАМКергических рецепторов. Мы решили исследовать особенности ГАМКергических
рецепторов, принимающих участие в торможении между двумя интернейронами и
интернейроном и пирамидной клеткой, и оценить какую это может играть
функциональную роль.
1.1.3 Разнообразие форм торможения
Формы ГАМКергического торможения довольно разнообразны и могут быть
охарактеризованы по ряду признаков. Во-первых, принципиальным моментом
является то, на которую клетку (возбуждающую или тормозную) оказывается
торможение (Freund and Buzsaki 1996; Freund and Gulyas 1997). Если торможению
подвергается ГАМКергический интернейрон, то конечным результатом этого может
быть повышение возбудимости нейрональной сети. Если торможению подвергается
возбуждающая пирамидная клетка, то это приведет к снижению возбудимости. Кроме
того, как показали недавние исследования, от типа постсинаптической клетки зависят
и модулирующие воздействия на пресинаптическую терминаль (Scanziani et al. 1998).
Во-вторых, важен участок постсинаптической клетки, на котором находятся
ГАМКергические синапсы. Основываясь на морфологических и функциональных
свойствах, можно выделить два основных класса ГАМКергических нейронов. Первый
26
это интернейроны, иннервирующие дендриты. Они контролируют “входы”
принципиальных клеток и распространение кальциевых токов от дендрита к соме.
Второй класс это интернейроны, селективно иннервирующие сому постсинаптической
клетки. Они контролируют генерацию потенциалов действия и, таким образом,
“выходы” принципиальной клетки (Miles et al. 1996).
В-третьих, интернейроны делятся по типу кальциевого тока, который участвует в
высвобождении ГАМК в их терминалях. Так интернейроны в гиппокампальном
str.radiatum связаны с N-типом кальциевах каналов, тогда как интернейроны str.lucidum
и str.orience с P-типом (Poncer et al. 1997).
Наконец, в дополнение к традиционной квантовой синаптической передаче, была
описана тоническая форма ГАМКергического торможения. Небольшой, но
статистически значимый ГАМКергический тонический ток был обнаружен в мозжечке
(Brickley et al. 1996; Wall and Usowicz 1997), коре (Salin and Prince 1996), таламусе (Liu
et al. 1995) и культуре гиппокампальных нейронов (Bai et al. 2001; Otis et al. 1991).
Вышеописанные типы торможения определенным образом вовлекаются и в
процессы эилептогенеза. В эпилептических моделях на животных в первую очередь
гибнут только некоторые классы интернейронов (Bernard et al. 2000), происходит
снижение дендритного, но не соматического торможения (Cossart et al. 2001a).
Аппликация каината, известного хемоконвульсанта, повышает эффективность
ГАМКергического торможения в интернейронах (Cossart et al. 2001b), но снижает в
пирамидных клетках (Fisher and Alger 1984; Rodriguez-Moreno et al. 1997).
Не смотря на обнаружение и классификацию различных типов ГАМКергического
торможения в ЦНС, изучение их физиологического и патологического значения
остается предметом интенсивных исследований. Большинство работ сфокусировано на
механизмах торможения принципиальных возбуждающих нейронов (McBain and
27
Fisahn 2001; Paulsen and Moser 1998). Однако, тормозные связи между интернейронами
также могут оказывать значительное влияние на общую возбудимость нейрональной
сети.
1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического
торможения
Механизмы
Фазическое торможение нейронов определяется дискретным выбросом высоких
концентраций ГАМК в синапсах. В этом случае ГАМК действует на
постсинаптические ГАМКергические рецепторы (Рис. 1.2). Тоническое торможение
связанно с постоянной активацией ГАМКергических рецепторов. Механизмы
тонического ГАМКергического торможения еще недостаточно хорошо изучены (Bai et
al. 2001).
Существует три гипотезы о механизме тонического торможения в гиппокампе. По
одной из них постоянная составляющая ГАМКергического тока представляет собой
суммацию спонтанных ТПСТ (ТПСТ, возникающих в ответ на спонтанный выброс
ГАМК) (Salin and Prince 1996; Soltesz et al. 1995). Однако, Bai с соавторами показали,
различие фармакологических свойств спонтанных ТПСТ и тонического
ГАМКергического тока в культуре гиппокампальных нейронов (Bai et al. 2001). В их
экспериментах бикукуллин и пикротоксин одинаково эффективно блокировали как
спонтанные постсинаптические ГАМКергические токи, так и тоническое
ГАМКергическое торможение. Это указывает на ГАМКергическую природу
тонической проводимости. При этом аппликация SR95531, специфического
антагониста ГАМКА рецепторов, блокировала только спонтанные синаптические токи
и не оказывала влияния на тонический ток.
28
ГАМК
GAT
GAT
GAT
ГАМКВ
ГАМКВ
GAT
внесинаптические
ГАМКА рецепторы
синаптические
ГАМКА рецепторы
GAT
внесинаптические
ГАМКА рецепторы
Рис. 1.2 Рецепторы и транспортеры ГАМК в фазическом и тоническом
торможении
Синаптически высвобождаемая ГАМК активирует ионотропные рецепторы
находящиеся постсинаптически в районе активной зоны. Кроме того, ГАМК может
покидать синаптическую щель и активировать внесинаптические ионотропные
рецепторы, а также пре- и постсинаптические ГАМКВ рецепторы. Процесс диффузии
ГАМК во внесинаптическом пространстве ограничен наличием транспортеров ГАМК
(GAT1, GAT2, GAT3), расположенных на мембране пре- и постсинаптических
нейронов и глиальных клеток. Считается, что быстрые ТПСТ опосредованы
ионотропными ГАМКергическими рецепторами, расположенными в синапсе напротив
активной зоны. По одной из гипотез медленное тоническое торможение опосредуется
внесинаптическими ионотропными ГАМКергическими рецепторами.
Основываясь на вышеуказанном фармакологическом различии фазических и
тонических токов, вторая гипотеза предполагает, что тонический ГАМКергический
ток может возникать за счет диффузии ГАМК во внесинаптическое пространство
(spillover; Рис.1.2) при последующей активации внесинаптических рецепторов,
которые отличны от синаптических (Brickley et al. 1996; Rossi and Hamann 1998).
29
Помимо молекул ГАМК покидающих синаптическую щель, определенную роль в
повышении внеклеточной концентрации ГАМК и, таким образом, в тоническом
торможении может играть обратная работа ГАМК-транспортеров (Gaspary et al. 1998),
высвобождение ГАМК астроцитами (Liu et al. 2000) и снижение активности ГАМКтрансаминазы (Overstreet and Westbrook 2001). Измеренная с помощью микродиализа
внеклеточная концентрация ГАМК (0,8-2,9 μМ) в нормальном мозге достаточно
высока, чтобы активировать внесинаптические ГАМКА рецепторовы (Lerma et al.
1986).
Наконец, третья гипотеза о происхождении ГАМКергического тонического тока
заключается в том, что он возникает при спонтанном (без участия нейротрансмиттера)
открывании каналов ГАМКергических рецепторов (Birnir et al. 2000a; Birnir et al.
2000b; Neelands et al. 1999). Если открывание канала ГАМКергического рецептора
действительно может происходить без участия агониста, то конкурентные антагонисты
ГАМК (например, SR95531) не будут оказывать влияния на тонический ток. При этом
важным условием будет то, что связывание таких антагонистов должно предотвращать
только связывание ГАМК, но не влиять на работу канала. Использование блокаторов
канала ГАМКергических рецепторов, таких как пикротоксин, будет приводить к
подавлению тонического тока. Кроме того, повышение внеклеточной концентрации
ГАМК не должно повышать тоническое торможение в этом случае. Однако, было
показано увеличению тонического торможения, опосредованного ГАМКА
рецепторами, при увеличении внеклеточной концентрации ГАМК (Overstreet and
Westbrook 2001). Тем не менее, эти данные не исключают возможности наличия двух
компонент тонического тока: зависящей от внеклеточной концентрации ГАМК и
независящей, опосредованной спонтанным открыванием ГАМКергических каналов.
30
Функциональное значение
Как указывалось выше, функция внесинаптических ГАМКергических рецепторов,
по всей видимости, заключается в детектировании внеклеточной концентрации ГАМК
и поддержании соответствующего уровня тонического торможения. Роль тонического
тока заключается в создании определенного потенциала на мембране и регуляции
возбудимости клетки. Например, в гранулярных клетках мозжечка аппликация
бикукуллина, селективного антагониста ГАМКА рецепторов, приводит к повышению
возбудимости клеток (Brickley et al. 1996). Это выражается в снижении порога
генерации потенциалов действия в ответ на деполяризующий сдвиг потенциала в
режиме фиксации тока. Было также показано, что тоническое торможение модулирует
паттерн разрядов и синаптическую интеграцию в тормозных нейронах мозжечка
(Hausser and Clark 1997). В нормальных условиях в клетках Пуркинье и интернейронах
мозжечка наблюдается нерегулярный паттерн потенциалов действия. При
блокировании тонического тока антагонистами ГАМКА рецепторов он превращается в
регулярный. Таким образом, одна из электрофизиологических классификаций клеток
по регулярности паттерна потенциалов действия (Cauli et al. 2000), может быть
частично объяснена наличием или отсутствием в них тонического торможения
(Granata 2001).
Другой функцией тонического торможения, вероятно, является шунтирование
фазических пре- и постсинаптических токов (ТПСТ, ВПСТ, потенциалов действия)
(Cattaert and El Manira 1999; Jackson et al. 1999b). Шунтирование быстых токов
происходит из-за того, что тоническая проводимость меняет сопротивление мембраны
за счет открывания каналов ГАМКергических рецепторов. Повышение электрической
проводимости мембраны снижает амплитуду потенциала действия, достигающего
31
пресинаптического участка аксона, уменьшая тем самым вход Ca2+ и вероятность
выброса медиатора (Pan 2001; Shields et al. 2000).
Тоническое открывание каналов внеклеточных ГАМКергических рецепторов не
только определяет электрический потенциал на мембране, но и приводит к
постоянному хлорному току. Во взрослом мозге, как указывалось выше, входящий в
клетку хлорный ток, сбалансирован работой калий/хлор котранспортеров (Ganguly et
al. 2001; Hubner et al. 2001). Однако, увеличения или уменьшения тонической
проводимости будут менять величину хлорного тока и, как результат, калиевого тока
хлорных транспортеров. В этой ситуации можно ожидать изменения ионных
градиентов как калия, так и хлора на мембране и, следовательно, потенциалов
реверсии калиевых ВПСТ и хлорных ТПСТ. Доказательством этому может служить то,
что при длительной стимуляции ГАМКергических терминалей, ГАМКергические
ТПСТ в нейронах взрослого мозга превращаются из гиперполяризующих в
деполяризующие (Ben-Ari et al. 1994; Ganguly et al. 2001; Rivera et al. 1999).
Субъединичная композиция ГАМКергических рецепторов, опосредующих
тоническое торможение
Для того чтобы рецептор мог активироваться за счет внесинаптической ГАМК, он
должен обладать сравнительно высокой аффинностью к агонисту и располагаться вне
синапса (Rossi and Hamann 1998). Рецепторы, содержащие 2 субъединицу,
сконцентрированы внутри синапсов в силу их взаимодействия с гиферином (Nusser et
al. 1998b).Эти рецепторы обладают достаточной аффинностью, чтобы принимать
участие в генерации ТПСТ, но, возможно, не для того чтобы активироваться при
базовой внеклеточной концентрации ГАМК. ГАМКергические рецепторы,
содержащие  субъединицу, не связаны с геферином и находятся вне синапса. Кроме
того, наличие этой субъединицы делает рецепторы высокоаффинными к ГАМК и
32
недесенситизирующимися при длительном воздействии агониста. Такие рецепторы
являются идеальным кандидатом, на роль рецепторов, опосредующих тоническое
торможение.
Было обнаружено, что рецепторы, содержащие  субъединицу в мозжечке, всегда
содержат и 6 (Nusser et al. 1998b). Для того чтобы оценить роль тонического
торможения в этой структуре были созданы мыши, у которых отсутствовала 6
субъединица (Brickley et al. 2001). Таким образом, мыши были лишены
внесинаптических рецепторов. Тем не менее, значительных отклонений в поведении и
выживаемости данных животных замечено не было. Скорее всего, потеря 6
субъединицы не оказвает влияния на тоническое торможение в других структурах
мозга и его общая возбудимость меняется незначительно. Кроме того, у мышеймутантов был обнаружен компенсаторный механизм, выражавшийся в повышенной
экспрессии постоянно активного калиевого канала TASK-1 (Duprat et al. 1997). Этот
канал тонически подавлял клеточную возбудимость так же, как и ГАМКергическое
тоническое торможение.
По всей видимости, определенный прогресс в исследовании роли тонического
торможения в мозге может быть сделан при изучении генетически модифицированных
животных, у которых отсутствует  субъединица. Кроме того, важным шагом в этом
направлении было бы создание специфических блокаторов ГАМКергических
рецепторов, содержащих эту субъединицу.
Таким образом, механизм тонического торможения, равно как и его
функциональное значение требуют дополнительных исследований. Поэтому,
следующей задачей данной диссертационной работы было выяснение механизма и
функции ГАМКергического тонического торможения в гиппокампе и оценка его
взаимодействия фазическими токами.
33
1.2 Взаимодействие между глутамат и ГАМКергической системами
Не смотря на интенсивные усилия исследователей, направленные на понимание
механизмов взаимосвязи глутаматергической и ГАМКергической нейропередач,
степень взаимодействия между этими системами остается плохо изученной.
Большинство работ, изучающих взаимодействие данных нейротрансмиттерных
систем, сфокусировано на синаптическом возбуждении интернейронов пирамидными
клетками через AMPA рецепторы или синаптическом торможении пирамидных клеток
интернейронами через ГАМКА рецепторы. Роль других подтипов ГАМК- и
глутаматергических рецепторов, в частности высокоаффинных, остается менее
изученной. Эти подтипы включают в себя, в частности, метаботропные рецепторы:
метаботропные рецепторы глутамата (mGluR I, II и III) и ГАМКВ. Оба данных типа
рецепторов активируются более низкими концентрациями глутамата и ГАМК, чем
основные ионотропные рецепторы AMPA и ГАМКА, соответственно (Jones et al. 1998;
Pin and Duvoisin 1995). Кроме того, некоторые типы ионотропных рецепторов имеют
высокие аффинности к эндогенному агонисту. NMDA рецепторы связывают глутамат
в намного более низких концентрациях, чем AMPA рецепторы (Patneau and Mayer
1990). Не смотря на то, что существуют различия в свойствах рекомбинантных
каинатных рецепторов и рецепторов in situ, эти рецепторы также активируются
сравнительно низкими концентрациями глутамата (Schmitz et al. 2000). Наконец,
некоторые подтипы ГАМКА рецепторов, находящиеся во внесинаптической мембране,
способны отвечать на низкие концентрации ГАМК (Mehta and Ticku 1999).
К настоящему времени накоплено достаточно доказательств того, что ГАМК и
глутамат могут покидать синаптическую щель и участвовать в диффузной
нейропередаче, опосредованной высокоаффинными рецепторами (Kullmann 2000),
Возникает вопрос, могут ли данные типы диффузных взаимодействий играть роль в
34
передаче информации между различными классами нейронов (например, между
возбуждающей пирамидной клеткой и тормозным интернейроном)? Другими словами,
может ли ГАМК модулировать глутаматергическую передачу и, наоборот, глутамат
ГАМКергическую?
1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
Важность гетеросинаптических взаимодействий, опосредованных аминокислотами,
впервые была прямо продемонстрирована на примере того, что ГАМК,
высвобождаемая терминалями интернейронов, может подавлять глутаматергическую
нейропередачу между коллатералями Шаффера и пирамидными нейронами в поле
СА1 гиппокампа (Isaacson et al. 1993). В этом случае ГАМК активирует
пресинаптические ГАМКB рецепторы, находящиеся в глутаматергических терминалях.
Не смотря на то, что физиологическая роль этого феномена пока еще не достаточно
изучена, можно предположить, что он выступает в роли гомеостатического регулятора
возбудимости. Значительное повышение глутаматергического возбуждения в
гиппокампе приводит к высокой активности интернейронов, посредством
расположенных на них возбуждающих синапсов. Такая активация интернейронов
способна привести к высвобождению ГАМК не только на постсинаптические
рецепторы внутри тормозных синапсов, но и к ее диффузии во внесинаптическое
пространство. Этот феномен называется спилловером нейропередатчика (spillover –
вытекание). ГАМК, покидая синаптическую щель, достигает ГАМКB рецепторов на
глутаматергических терминалях и снижает возбуждающую передачу между
принципиальными клетками. Это может представлять собой важный
антиэпилептогенный механизм, нарушение которого ведет к потере контроля над
возбудимостью в нейрональной сети.
35
Возникает вопрос, а существует ли регуляция тормозной передачи внеклеточным
глутаматом? Возможна ли ситуация симметричная феномену описанному для ГАМКB
рецепторов, когда спилловер глутамата во внеклеточное пространство воздействует на
ГАМКергическую нейропередачу?
Прежде чем обсуждать возможность воздействия спилловера глутамата на
ГАМКергическую нейропередачу, необходимо представить доказательства того, что
глутамат на самом деле может покидать синаптическую щель и активировать
удаленные рецепторы. На самом деле, этот вопрос хорошо изложен в ряде ранее
опубликованных обзоров (Kullmann 2000; Kullmann and Asztely 1998; Rusakov and
Kullmann 1998).
Существует несколько доказательств спилловера глутамата. Во-первых, многие
рецепторы глутамата расположены сравнительно далеко от места высвобождения
нейромедиатора. Например, метаботропные рецепторы группы II находятся на
претерминальной мембране мшистых волокон (Lujan et al. 1996; Yokoi et al. 1996).
Во-вторых, от астроцитов можно отвести ток, опосредованный электрогенным
захватом (uptake) глутамата (Bergles et al. 1999). В этих клетках экспрессируется
большинство глутаматных транспортеров. Таким образом, стимуляция
глутаматергических аксонов и вывсобождение глутамата вызывает в них ток,
опосредованный транспортерами глутамата. Кинетика этого тока, по сравнению с
эффектом кратковременной аппликации глутамата на фрагмент астроцитарной
мембраны (membrane patch), указывает на то, что глутамат может находиться во
внеклеточном пространстве в течение значительного времени (Bergles et al. 1997;
Bergles and Jahr 1997).
36
В-третьих, в синапсах мшистых волокон были показаны гетеросинаптические
взаимодействия, опосредованные глутаматными рецепторами (метаботропными
группы III и каинатными) (Min et al. 1998; Vogt and Nicoll 1999).
Наконец, компьютерное моделирование высвобождения, диффузии и связывания
глутамата на рецепторах и транспортерах, основанное на реальных анатомических и
физиологических данных, показало, что глутамат может диффундировать за пределы
синаптической щели и активировать NMDA рецепторы в радиусе 0,5 m от места его
высвобождения (Rusakov and Kullmann 1998).
Не смотря на то, что вышеизложенные доказательства свидетельствуют в пользу
диффузного действия глутамата, они не лишены недостатков. Эти данные
преимущественно были получены в in vitro экспериментах, в частности, на срезах
гиппокампа (в ограниченном препарате с поверхностно поврежденной структурой) и
при субфизиологических температурах (которые могут снижать скорость захвата
глутамата глией и нейронами из внеклеточного пространства). В физиологических
условиях захват (uptake) глутамата крайне эффективен. Предполагая, что каждый
синапс высвободает по одной везикуле, ориентировочное количество молекул
транспортеров в пространстве гиппокампального нейропиля будет в 3-5 раз выше
числа молекул глутамата, способных оказаться в том же объеме (Lehre and Danbolt
1998). Даже поверхностоно поврежденные срезы гиппокампа на макроскопическом
уровне представляют собой эффективную “губку” для глутамата. Добавление в
суперфузионный раствор 100 M этой аминокислоты, как правило, не приводит к
изменению мембранного потенциала нейронов в глубине среза. Это связано с тем, что
глутамат поглощается астроцитами до того, как он достигнет нейрональных
рецепторов. Однако, на микроскопическом уровне астроциты содержат транспортеры,
которые распределены по их мембране случайным образом, а не напротив
37
глутаматергических синапсов. При этом почти половина возбуждающих синапсов в
нейропиле СА1 не имеют контакта с астроцитами. Таким образом, молекулы
глутамата высвобождаемые этими терминалями могут диффундировать на большие
расстояния до того, как будут захвачены (Ventura and Harris 1999).
1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
Для доказательства того, что спилловер глутамата может модулировать
ГАМКергическую передачу должны выполняться два следующих критерия:
Во-первых, необходимо показать наличие глутаматергических рецепторов на
ГАМКергических терминалях или аксонах. Чтобы удовлетворить этому критерию
могут быть использованы два подхода. Прежде всего, нужно получить данные
высокоразрешающей иммуноцитохимии, демонстрирующие наличие глутаматных
рецепторов в тормозных терминалях. Кроме этого, экзогенные агонисты глутамата
должны изменять эффективность ГАМКергической передачи в
электрофизиологических экспериментах. Однако, электрофизиологический метод не
может считаться достаточно надежным. Существует много химических агентов,
которые изменяют синаптическую передачу, но это лишь косвенно указывает на
наличие гетерорецепторов, поскольку эффекты этих веществ могут быть не прямыми.
Например, если аппликация глутамата вызывает высвобождение какого-то другого
нейромодулятора, действующего на ГАМКергическую передачу, то это может
ошибочно интерпретироваться как прямой эффект глутамата.
Во-вторых, необходимо показать, что синаптически высвобождаемый глутамат
может создавать тот же самый эффект на ГАМКергическую передачу, как и
аппликация экзогенного агониста. Экспериментально это достигается путем
высокочастотной стимуляции глутаматергических волокон при последующем
измерении амплитуды ГАМКергических ТПСТ. Однако, сложность заключается в
38
том, что для достижения необходимого повышения внеклеточного глутамата, нужно
внеклеточно стимулировать популяцию из многих аксонов. Некоторые из этих аксонов
могут высвобождать другие нейромедиаторы. Для разрешения этой проблемы
необходимо показать, что антагонисты глутаматергических рецепторов способны
блокировать модуляцию ГАМКергической передачи при высокочастотной
электрической стимуляции волокон. Другим доказательством глутаматергической
природы гетеросинаптической модуляции может служить эффект фармакологического
подавления захвата (uptake) глутамата. В случае, если гетеросинаптическая модуляция
ГАМКергической передачи, вызванная высокочастотной стимуляции возбуждающих
терминалей, происходит благодаря синаптически высвобождаемому глутамату, она
будет услиливаться при блокаде uptake этого нейропередатчика.
1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
Метаботропные рецепторы глутамата состоят из семи трансмембранных доменов и
связаны с G-белками, которые опосредуют большинство из эффектов активации этих
рецепторов. Сами рецепторы состоят из двух субъединиц, одна из которых связывает
глутамат (Kunishima et al. 2000). Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluR)
делятся на 3 группы, хотя и обнаружено 8 различных генов, которые их кодируют
(Ozawa et al. 1998; Pin and Duvoisin 1995).
Рецепторы группы I (mGluR1 и mGluR5) обычно расположены на
постсинаптических мембранах вокруг синаптической щели (Baude et al. 1993). Они
связаны через G-белок с фосфолипазой С. Таким образом, их активация приводит к
увеличению инозитолтрифосфата и диацилглицерола. В некоторых случаях активация
mGluR группы I приводит к эффектам, которые не связанны с G-белком. Это
указывает на то, что данные рецепторы могут быть связаны также и с другими
каскадами вторичных посредников (Heuss et al. 1999).
39
Метаботропные глутаматергические рецепторы групп II (mGluR2 и mGluR3) и III
(mGluR4, mGluR6, mGluR7 и mGluR8) расположены пресинаптически. Так, в мшистых
волокнах mGluR2 расположены на мембранах аксонов, хотя и далеко от места
высвобождения глутамата. Это указывает на то, что для их активации требуется
диффузия глутамата от места его высвобождения (Yokoi et al. 1996). Рецепторы
группы III обнаружены внутри синапсов: близко к активной зоне или даже внутри ее
(Shigemoto et al. 1997; Shigemoto et al. 1996). Обе группы рецепторов через G-белки
снижают активность аденилатциклазы. Одним из принципиальных различий между
двумя группами рецепторов является их чувствительность к фармакологическим
препаратам. Например, L-AP4 является селективным агонистом метаботропных
рецепторов группы III, но не группы II.
Особый интерес в качестве потенциального участника гетеросинаптических
взаимодействий в гиппокампе привлекают mGluR группы III. Во-первых, это связано с
их близостью к месту выброса медиатора. Во-вторых, есть иммуноцитохимические
данные о том, что эти рецепторы могут находиться пресинаптически как в
возбуждающих, так и в тормозных терминалях (Shigemoto et al. 1997). Как указывалось
выше, группа III метаботропных рецепторов состоит из рецепторов классов 4, 6, 7, 8
(Pin and Duvoisin 1995). mGluR 6 и 8 не были обнаружены в поле CA1 гиппокампа
(Shigemoto et al. 1996). При этом была продемонстрирована иммунореактивность для
mGluR 4 и 7(Shigemoto et al. 1997).
Кроме того, было показано, что присутствие метаботропных рецепторов на
пресинаптической терминали зависит от типа постсинаптического нейрона. Рецепторы
группы III в поле СА1 обнаруживаются только на глутамат- и ГАМКергических
терминалях, оканчивающихся на интернейроне, но не на пирамидной клетке
(Shigemoto et al. 1996). До настоящего времени наибольшее внимание уделялось
40
глутаматергическим синапсам, поскольку mGluR рассматиривались в качестве
ауторецепторов. Аппликация селективного агониста рецепторов группы III (L-AP4)
приводила к депрессии ВПСТ в интернейронах, но не в пирамидных клетках (Scanziani
et al. 1998).
Если экстраполировать данные о модуляции метаботропными рецепторами
глутаматергической передачи в интернейронах, можно предположить, что они будут
также клеткоспецифично модулировать и ГАМКергические токи.
В качестве следующей задачи представленной работы было поставлено
исследование роли пресинаптических метаботропных рецепторов глутамата в
модуляции тормозной ГАМКергической передачи между двумя интернейронами и
интернейроном и пирамидной клеткой. Мы также решили проверить может ли
диффузия глутамата с возбуждающих синапсов активировать эти рецепторы,
находящиеся в ГАМКергических синапсах.
1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
Глутаматергические каинатные рецепторы во многом похожи на AMPA рецепторы
(Lerma et al. 1997; Lerma et al. 2001). Они также как AMPA рецепторы
гетеромультимерны и построены из пяти различных субъединиц: GluR5, GluR6, GluR7,
KA1 и КA2. Однако, не все из этих субъединиц равноценны. Так, например, рецепторы
состоящие только из KA1 и КA2 не функциональны. Биофизические свойства
рекомбинантных каинатных рецепторов похожи на свойства AMPA рецепторов: они
быстро активируются и десенситизируются, имеют сходные проводимость одиночного
канала и проницаемость для Ca2+ (Bowie and Mayer 1995).
Давно было известно, что каинат и домоат, агонисты каинатных рецепторов, одни
из наиболее сильных среди известных хемоконвульсантов (Zaczek and Coyle 1982).
Однако, физиологическая роль каинатных рецепторов стала исследоваться совсем
41
недавно. Это было связано с тем, что отсутствовали селективные антагонисты
каинатных и AMPA рецепторов. Все вещества действовали на оба типа рецепторов
одновременно. Интенсивные исследования начались с синтезом селективных
антагонистов, которые блокировали AMPA рецепторы при значительно более низких
концентрациях, чем каинатные (например, 2,3-бензодиазепины, такие как GYKI53655)
(Bleakman et al. 1996). С использованием этих веществ было показано, что каинатные
рецепторы опосредуют медленные ВПСТ в синапсах мшистых волокон (Castillo et al.
1997; Vignes and Collingridge 1997) и в некоторых (но не во всех) гиппокампальных
интернейронах (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998). Пресинаптически эти
рецепторы приводят к деполяризации мшистых волокон (Kamiya and Ozawa 2000;
Schmitz et al. 2000) и усиливают нейропередачу (Schmitz et al. 2001). Есть
свидетельства, что они необходимы для NMDA рецептор-независимой
долговременной потенциации (LTP) в гигантских синапсах мшистых волокон на
пирамидных нейронах СА3 (Bortolotto et al. 1999). Показано, что данные каинатные
рецепторы, расположенные на мшистых волокнах исключительно чувствительны к
агонисту. Гетеросинаптическая деполяризация мшистых волокон была получена в
ответ на высвобождение глутамата со сравнительно удаленных сайтов (Schmitz et al.
2000).
Тем не менее, остается много неясного в связи с ролью каинатных рецепторов в
мозге. Например, почему каинатные ВПСТ имеют столь медленную кинетику, а
каинатные рецепторы на мшистых волокнах так чувствительны к спилловеру
глутамата? Каинатные рецепторы в нейрональной культуре и рекомбинантные
каинатные рецепторы при активации кратковременными аппликациями глутамата
показывали кинетику токов, сходную с токами, опосредованными AMPA рецепторами.
Это означает, что они должны обладать относительно низкой аффинностью и быстрой
42
десенситизацией (Lerma et al. 1993). Для объяснения этого было предложено несколько
гипотез. Прежде всего, синаптические каинатные рецепторы могут быть отличны от
внесинаптических или по составу субъединиц, или по взаимодействию с
внутриклеточными белками, или по сайт-специфичному фосфорилированию (Garcia et
al. 1998). Другим объяснением может быть то, что глутамат должен диффундировать
на значительное расстояние, чтобы достигнуть каинатных рецепторов, расположеных
относительно далеко от места экзоцитоза. Наконец, возможно, что какое-то вещество,
модулирующее каинатные рецепторы, высвобождается вместе с глутаматом.
Не смотря на то, что синаптические токи, опосредованные каинатными
рецепторами, показаны в гиппокампе, они имеют небольшую амплитуду и требуют,
как правило, высокочастотной стимуляции, чтобы быть замеченными (Castillo et al.
1997; Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998; Vignes and Collingridge 1997). Это ставит
под сомнение роль каинатных рецепторов в синаптической передаче.
Кроме роли каинатных рецепторов в синаптической передаче, существуют неясные
моменты, связаные с действием каината на гетерорецепторы на ГАМКергических
аксонах и терминалях. Существует достаточно данных о том, что агонисты каинатных
рецепторов подавляют ГАМКергическое торможение в пирамидных клетках (Fisher
and Alger 1984; Rodriguez-Moreno et al. 1997). Однако, остается не ясным в какой
степени это может быть объяснено прямым эффектом активации каинатных
рецепторов на высвобождение медиатора (Rodriguez-Moreno and Lerma 1998;
Rodriguez-Moreno et al. 2000). Известно, что каинат деполяризует интернейроны, и они
начинают спонтанно разряжаться (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998). Такие
разряды интернейронов приводят к повышению внеклеточной концентрации ГАМК,
которая уже вторично приводит к снижению эффективности ГАМКергического
торможения (Frerking et al. 1999). Было предложено два механизма, которые
43
объясняют эффект аккомуляции этого нейропередатчика на синаптическую передачу.
Во-первых, активация пресинаптических ГАМКВ рецепторов на терминалях может
приводить к снижению высвобождения медиатора. Во-вторых, может происходить
постсинаптическое шунтирование ТПСТ в результате тонической активации ГАМКА
рецепторов.
Поэтому следующей задачей представленной диссертационной работы было
исследование роли каинатных рецепторов в изменении возбудимости аксонов
тормозных интернейронов в поле СА1 гиппокампа. Кроме того, мы решили проверить,
может ли диффузия глутамата с возбуждающих синапсов активировать эти рецепторы.
44
1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
Эпилепсия широко распространенное заболевание. Им страдают около 0,5 %
человеческой популяции (Sander and Shorvon 1996). Исследования этого заболевания
имеют длительную историю. Еще в 1881 году Gowers писал об эпилепсии: “Abnormal
discharges are due to potentiation of excitatory mechanisms or due to failure of intrinsic
cerebral inhibitory systems” (Патологические разряды возникают благодаря
потенциации возбуждающих механизмов или из-за нарушения внутримозговых
тормозных систем). С тех пор эта парадигма не претерпела значительных изменений.
1.3.1 Исследования эпилептогенеза
В настоящее время, исследования событий, происходящих в эпилептическом мозге,
проводятся в большом числе лабораторий по всему миру. За последние годы был
достигнут определенный прогресс в этом направлении. Показаны изменения в
клеточном составе (в частности гибель клеток – (Bernard et al. 2000)), составе
рецепторов (Schwarzer et al. 1997), возбудимости мембран (Ketelaars et al. 2001) и
синаптической пластичности (Kullmann et al. 2000) при эпилептогенезе. Однако,
трудно представить, что все эти события должны произойти одновременно, чтобы мозг
стал эпилептическим. В данном случае, необходимо четко разделить причину и
следствия заболевания. К сожалению, до настоящего времени причина, инициирующая
эпилептогенез, не вполне ясна.
В лабораторных условиях разработан целый ряд экспериментальных моделей in
vivo и in vitro. Для создания судорожной активности у животных или
электрографической эпилептиформной активности в срезах мозга используются
фармакологические препараты (агонисты, антагонисты, модуляторы) повышающие
возбудимость или снижающие торможение нейрональной сети (Schwartzkroin 1986).
45
Этот подход дает свои результаты, зачастую определяемые типом воздействия.
Однако, значимость их для понимания механизмов заболевания сомнительна.
В качестве эпилептогенных воздействий рассматриваются изменения ионного
состава внеклеточной среды. К эпилептиформной пачечной активности приводит
повышение внеклеточной концентрации калия, которое оказывает деполяризующий
эффект на клетки (McBain 1994; McBain 1995). Электрографическая судорожная
активность возникает также при снижении концентрации магния, которое приводит к
активации кальциевого тока в нейроны (Tancredi et al. 1988).
Вероятно, одной из самых удачных экспериментальных моделей in vivo является
киндлинг (“раскачка”) (Goddard et al. 1969). Его идея заключается в периодической
высокочастотной стимуляции чувствительных к эпилептогенезу областей мозга (в
частности, гиппокампа) подпороговыми для развития судорог стимулами (Lothman and
Williamson 1994; McNamara et al. 1985). Эпизоды стимуляции следуют с интервалом (в
зависимости от протокола) от нескольких часов до суток. При этом с каждой
последующей стимуляцией мозг становится более чувствительным к развитию
судорожной активности. После окончания эпизодов стимуляции состояние
повышенной чувствительности к судорожной активности длится месяцами.
Преимущество этого подхода заключается в том, что более физиологичная, чем
фармакологические воздействия, электрическая стимуляция приводит к
долговременным изменениям в мозге. Эти изменения можно изучать в течение
длительного времени после отмены эпилептогенного стимула, что позволяет получить
данные не только о событиях, происходящих при судорожной активности, но и
механизмах их поддержания.
Наконец, разработан ряд генетических моделей эпилептогенеза. Получены
животные, обладающие склонностью к судорожной активности. Одной из таких
46
моделей являются крысы, впадающие в судороги при предъявлении звукового стимула
(Garcia-Cairasco et al. 1996). В России на базе крыс линии Вистар были выведены
животные обладающие судорожной реакцией на звуковые стимулы (линия
Крушинского-Молодкиной) (Батуев и др., 1997). Тем не менее, в клинической
практике не было описано аудиогенной эпилепсии у человека, что несколько
ограничивает использование данных полученных в этих моделях (Dr. A. Wurz, personal
communucation).
Интенсивная работа ведется при клинических исследованиях эпилепсии на
человеке. Для этого проводят электрические энцефалографические и компьютерные
томографические исследования. Для исследований in vitro используются срезы левого
или правого гиппокампа, полученные в результате его хирургического удаления. Такая
операция является в настоящее время рутинной в случае парциальной эпилепсии левой
или правой височной доли (Isokawa et al. 1993; Schroder et al. 2000; Schwartzkroin 1986;
Tursky et al. 1976). Однако, сложность in vitro исследований на ткани человека
заключается в фактическом отсутствии контроля (здоровой ткани для сравнения).
Другим подходом исследований на человеке является генетический анализ ДНК,
полученной из крови. Исследования ДНК пациентов с эпилепсией указывает на
наличие у них мутаций в субъединицах калиевых (Spauschus et al. 1999) и кальциевых,
в частности, P/Q типа (Jouvenceau et al. 2001) каналов. Эти каналы, находящиеся в
большинстве клеток мозга, играют важную роль в возбудимости нейрональной сети и
кальциевом гомеостазе. Функциональные нарушения в данных каналах в силу их
широкой распространенности способны произвести изменения во всех системах мозга
и сдвинуть баланс в сторону его гипервозбудимости.
47
1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
Для развития полноценной эпилептиформной активности в мозге должны
выполняться три основных критерия.
Во-первых, принципиальные клетки должны разряжаться пачками потенциалов
действия. Причинами такой активности могут быть различные по своей природе
события. Например, потенциация глутаматергической синаптической передачи (Cain
1989; McEachern and Shaw 1996), изменения в активности постсинаптических
кальциевых каналов (Coulter et al. 1989; Faas et al. 1996; Speckmann et al. 1993;
Vreugdenhil and Wadman 1992), изменения в тоническом торможении клеток (Hausser
and Clark 1997) (Рис. 1.3а). Однако, сама по себе способность разряжаться пачками
потенциалов действия не является эпилептиформным событием, поскольку изменение
паттерна активности нейронов, является принципиальным событием в обработке
информации мозгом (D'Angelo et al. 2001; Twery et al. 1992).
Вторым критерием развития эпилептиформной активности является синхронизация
пачечных разрядов в группе возбуждающих клеток. Данное событие, само по себе,
имеет место в нормальном мозге, например, при генерации ритмов в его структурах
(Suzuki and Smith 1988). Синхронизация активности нейронов может происходить
благодаря организации связей между ними. Одна ситуация возникает при наличии
взаимных синаптических связей между возбуждающими клетками (Bains et al. 1999;
Debanne et al. 1995; Sohal et al. 2000) (Рис. 1.3б1). В этом случае генерация пачечного
разряда в одной клетке приводит к возникновению синаптического
деполяризационного сдвига в группе клеток и генерации в них синхронного пачечного
разряда. Синхронизировать разряды нейронов может также наличие электрического
взаимодействия (несинаптического типа) между их мембранами (Galarreta and Hestrin
1999) (Рис. 1.3б2). Еще одним интересным механизмом синхронизации является
48
а
возбуждающие
синапсы
глутаматергические
афференты
LTP (+)
ПДС (+)
ПГП (-)
ИН
ПК
тормозные
синапсы
ПиВТ (-)
б1
глутаматергический
афферент
б2
б3
+
_ +
+
_ +
ПК1
возбуждающие
синапсы
ПК2
ПК3
электр.
контакты
3
2 ПК1
ПК2
возбуждающие
синапсы
ПК3
ПК1
ИН
тормозные
синапсы
Рис. 1.3 Эпилептогенные и антиэпилептогенные факторы. Механизмы
синхронизации активности в группах нейронов
а, Пирамидный нейрон (ПК) генерирует пачечные разряды при формировании в нем
Ca2+-опосредованных пароксизмальных деполяризационных сдвигов (ПДС) или
потенциации возбуждающей глутаматергической передачи (LTP). Механизмами
подавления пачечной активности являются послеспайковая гиперполяризация (ПГП) и
прямое и возвратное торможение (ПиВТ). Эпилептогенные механизмы указаны
красными стрелками, антиэпилептогенные – синими.
б, Механизмы синхронизации активности в группе принципиальных нейронов
б1 – механизм синхронизации пачечных разрядов посредством возвратных
коллатералей: возбуждающая пирамидная клетка (ПК1) образует синаптические связи
с другими возбуждающими нейронами (ПК2, ПК3). При генерации пачки разрядов в
ПК1, одновременно возбуждаются ПК2 и ПК3. б2 - механизм синхронизации пачечных
разрядов посредством электрических контактов: возбуждающая пирамидная клетка
(ПК1) образует электрические контакты (эфапсы) с другой клеткой (ПК2), та в свою
очередь с третьей (ПК3). Развитие пачечного разряда в ПК1, приводит к изменению
потенциала мембраны так же и в ПК2,3. б3 – ГАМКергический интернейрон (ИН)
образует тормозные синапсы на нескольких пирамидных нейронах (ПК1, ПК2, ПК3) и
одновременно их тормозит. После окончания тормозного события, происходит
одновременный разряд в возбуждающих клетках, ребаунд возбуждение.
49
синхронизация активности возбуждающих клеток за счет тормозных интернейронов
(Huguenard 1998). В областях мозга, где наличие взаимных синаптических связей
между возбуждающими нейронами не четко выражено тормозные интернейроны,
иннервирующие одновременно целые популяции клеток, могут оказывать
синхронизирующее влияние. При активации такого интернейрона тормозятся
одновременно многие клетки (Рис. 1.3б3). Когда, тормозное синаптическое событие
заканчивается, существует вероятность одновременного синхронного разряда, по
крайней мере, в нескольких из них. Этот феномен называется ребаунд (rebound)
возбуждение. Таким образом, при эпилептогенезе возбуждающие нейроны генерируют
пачки потенциалов действия, и эта активность синхронизирована в целой популяции
клеток.
Однако, эпилепсия это системный феномен, вовлекающий различные структуры и
функции мозга. Поэтому, третьим критерием эпилептогенеза является
распространения эпилептиформной активности в мозге. В нормальной ситуации,
такого распространения не должно происходить, поскольку система возбуждающих,
тормозных и модулирующих связей эффективно регулирует возбудимость. Однако,
если принять то, что причиной эпилептогенеза, являются мутации ионных каналов, в
этом случае распространение эпилептиформной активности может быть значительно
облегчено. Наличие замкнутых цепочек синаптических переключений, как, например в
лимбической системе (гиппокамп - миндалина - кора), позволяет циркулировать
эпилептиформной активности и устойчиво существовать в течение длительного
времени (Olivier 1991).
Исходя из вышесказанного, одной из задач исследований эпилептогенеза в
лабораторных условиях является поиск адекватной модели, в которой можно было бы
исследовать генерацию, синхронизацию и распространение эпилептиформной
50
пачечной активности. Это особенно трудно сделать in vitro, в частности на срезах
мозга. В таких препаратах не представляется возможным полноценно исследовать
распространение эпилептиформной активности в мозге. Кроме того, структура
межнейрональных связей не всегда полностью сохраняется, что оказывает влияние как
на баланс торможения и возбуждения, так и на возможность синхронизации групп
клеток. С другой стороны, диапазон методов доступных in vitro (пейч-кламп,
сканирующая конфокальная микроскопия, ПЦР с одной клетки и др.) делает
разработку такой модели крайне привлекательной.
1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
Эпилептиформная активность связана с повышенной возбудимостью
принципиальных клеток. Поскольку в нормальном мозге существует определенный
уровень тормозных и возбуждающих влияний, баланс между ними определяет
возбудимость нейронов. Таким образом, можно разделить механизмы, приводящие к к
эпилептогенезу, на повышающие возбуждение и снижающие торможение.
Одним из механизмов, повышающих эффективность возбуждающей
глутаматергической передачи, является ее долговременная потенциация (LTP).
Интересно, что эпилептиформная активность, возникающая при киндлинге, имеет ряд
сходных механизмов с NMDA рецептор зависимой LTP (Cain 1989; McEachern and
Shaw 1996). Это подтверждается тем, что вещества, блокирующие NMDA рецепторы,
замедляют процесс развития судорожной активности при киндлинге, хотя и не играют
роли, если эпилептиформная активность уже выражена (Behr et al. 2001; Borowicz et al.
2001). Эти данные говорят о том, что LTP может принимать участие в развитии
эпилептиформной активности, хотя не является критическим фактором. В пользу этого
свидетельствует и то, что антагонисты NMDA рецепторов в концентрациях,
полностью подавляющих LTP, лишь замедляют киндлинг (Gilbert and Mack 1990;
51
Leung 1994). С другой стороны, показано, что при киндлинге происходят изменения в
мРНК, кодирующей NMDA рецепторы (Kamphuis et al. 1995; Pratt et al. 1993). Кроме
эффекта на мРНК, киндлинг приводит к долговременным посттрансляционным
модификациям каналов NMDA рецепторов. При этом увеличивается среднее временя
открытого состояния канала и снижается блокирующий эффект магния (Kohr et al.
1993).
Помимо изменений в свойствах NMDA рецепторов, накопление внеклеточного
глутамата может играть роль в эпилептогенезе. Например, у грызунов, у которых
отсутствует ген, кодирующий глиальный транспортер глутамата – GLT1, наблюдаются
летальные спонтанные судороги (Tanaka et al. 1997).
В основе генерации эпилептиформных пачечных разрядов может лежать резкая
деполяризация нейрона в форме пароксизмального деполяризационного сдвига (ПДС).
Предполагается, что этот сдвиг потенциала клетки может формироваться в результате
суммации ВПСП (Jefferys 1990). В качестве доказательства приводятся сходство форм
и величин деполяризации при ПДС и ВПСП.
1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
ГАМКергические механизмы претерпевают значительные изменения при
эпилептогенезе. Известно, что при некоторых генетических формах
предрасположенности к судорожной активности наблюдается снижение
эффективности ГАМКергического торможения (Faingold et al. 1994; Jobe and Laird
1981; Веретенников с соавт. 1996). В экспериментальных моделях эпилептогегеза
происходят изменения субъединичного состава ГАМКергических рецепторов (BrooksKayal et al. 1998; Schwarzer et al. 1997), эффективности высвобождения и обратного
захвата ГАМК (Treiman 2001). Однако, вопрос о том, повышается или снижается
ГАМКергическое торможение при эпилептогенезе остается спорным (Mody 1998).
52
Общий принцип сводится приблизительно к следующему: острые, длительные
судороги приводят к снижению торможения, тогда как в хронических моделях
происходит его увеличение. В хронических моделях увеличивается число
ГАМКергических рецепторов в синапсах (Nusser et al. 1998a) и число самих синапсов
(Prince and Jacobs 1998). В некоторых случаях наблюдается увеличение
пресинаптического высвобождения ГАМК (Chen et al. 1999).
Как указывалось выше, тормозные интернейроны могут принимать участие в
синхронизации эпилептиформной активности за счет ребаунд эффекта в группе
возбуждающих клеток, которые они одновременно иннервируют. В гиппокампе и
других структурах коры тормозные интернейроны имеют сильноразветвленные связи
со многими пирамидными нейронами, которые, в свою очередь, возбуждают эти
интернейроны посредством возвратных коллатералей аксонов (Mody et al. 1994).
Таким образом, организуется система с положительной обратной связью, способная
поддерживать эпилептиформную активность.
Однако, если роль синаптической формы торможения в эпилептогенезе активно
обсуждается, то роль тонического изучена слабо. Можно предположить, что при
повышенной активности нейронов внеклеточная концентрация ГАМК повышается за
счет синаптического возбуждения интернейронов и высвобождения ими этого
нейропередатчика. Повышение внеклеточной концентрации тормозного
нейропередатчика снижает общую возбудимость нейрональной сети за счет
тонического торможения. Эти события представляют собой внутренний защитный
механизм против эпилептогенеза. Возможность данной схемы подтверждается тем, что
антиэпилептический препарат – тиагабин, увеличивает внеклеточную концентрацию
ГАМК, блокируя ее обратный захват (uptake) (Morimoto et al. 1997).
53
Таким образом, при эпилептогенезе наблюдаются существенные изменения как в
возбуждающей глутаматергической, так и тормозной ГАМКергической системах
нейропередачи. Важную роль в изменении эффективности глутаматергической
нейропередачи и в эпилептогенезе играет NMDA подтип глутаматергических
рецепторов. Недавно было продемонстрировано, что активация L-типа Ca2+ каналов
может приводить к пластическим изменениям в ГАМКергических синапсах (Jensen and
Mody 2001). Другие данные указывают, что сами изменения в кальциевой
проводимости играют ключевую роль в эпилептогенезе (Chaisewikul et al. 2001; Pal et
al. 2001; Tashiro et al. 2002). Наконец, были продемонстрированы мутации в
кальциевых каналах при клинических случаях эпилепсии (Burgess and Noebels 2000;
Chioza et al. 2001; Jouvenceau et al. 2001).
Исходя из вышеизложенного, следующей задачей представленной
диссертационной работы была оценка роли NMDA рецептор зависимого (связанного с
модуляцией эффективности возбуждающей глутаматергической передачи) и
зависимого от L-типа кальциевых каналов (связанного с модуляцией эффективности
тормозной ГАМКергической передачи и возбудимостью внесинаптической мембраны
нейронов) входов Ca2+ для генерации пачечной активности в гиппокампе.
54
1.4 Постановка цели и задач исследования
Целью данной диссертационной работы являлось выяснение механизмов
ГАМКергического торможения в сети гиппокампальных нейронов и описание
модулирующих влияний на него со стороны глутаматергических гетерорецепторов в
приложении к нормальному функционированию гиппокампа и эпилептогенезу.
Для достижения цели данной работы были поставлены следующие задачи:
1. Определить фармакологический и биофизический профиль ГАМКергических
рецепторов, принимающих участие в торможении в интернейронах и пирамидных
клетках поля СА1 гиппокампа. Оценить какую это может играть функциональную
роль.
2. Провести сравнительный анализ механизмов тонического и фазического
ГАМКергического торможения в интернейронах и пирамидных клетках поля СА1
гиппокампа. Оценить роль этих типов торможения в общей возбудимости
нейрональной сети.
3. Провести сравнительный анализ роли пресинаптических глутаматергических
метаботропных рецепторов группы III в модуляции тормозной ГАМКергической
передачи в интернейронах и пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа.
Проверить может ли диффузия глутамата с возбуждающих синапсов активировать
эти рецепторы. Оценить какую роль может играть эта модуляция в общей
возбудимости нейрональной сети.
4. Исследовать роль глутаматергических каинатных рецепторов в изменении
возбудимости аксонов ГАМКергических интернейронов поля СА1 гиппокампа.
Проверить может ли диффузия глутамата с возбуждающих синапсов активировать
эти рецепторы. Оценить какую роль могут играть эти аксональные каинатные
рецепторы в общей возбудимости нейрональной сети.
55
5. Оценить роль NMDA рецептор зависимого (связанного с модуляцией
эффективности возбуждающей глутаматергической передачи) и зависимого от Lтипа кальциевых каналов (связанного с модуляцией эффективности тормозной
ГАМКергической передачи и возбудимостью внесинаптической мембраны
нейронов) входов Ca2+ в развитии пачечной активности в поле СА1 гиппокампа.
56
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Срезы гиппокампа
2.1.1 Приготовление и растворы
В работе были использованы поперечные срезы гиппокампа толщиной 350 м,
полученные из морских свинок или крыс возрастом 3-5 недель. Животные были
умерщвлены путем цервикальной дислокации с последующей декапитацией. Сразу
после извлечения мозг охлаждался, и все дальнейшие операции по его
препарированию проводились при охлаждении. Гиппокамп выделялся в среднем в
течение 5-10 минут после декапитации. Затем он помещался в камеру вибротома Leika
VT1000S (Германия), которая была заполнена специально сформулированным
раствором, ослабляющим пагубные последствия от резки тканей и находящимся при
температуре близкой к 0 oC. Этот раствор содержал (в мМ): хлорид холина 110;
аскорбат 1,3; пируват 2,4; KCl 2,5; NaH2PO4 1,25; MgSO4 7; CaCl2 0,5; NaH2CO3 25;
глюкоза 25 и насыщался карбогеном 95% O2 / 5% CO2 (pH 7,4; осмолярность
295 мОсм). Угол резки, частота вибрации и скорость режущей подачи лезвия
побирались таким образом, чтобы максимально сохранить клеточную структуру
области, с клеток которой велись регистрации. Перед началом записи срезам давался
восстановительный период в течение 2-х часов. После приготовления срезы
сохранялись на интерфейсной камере при комнатной температуре, а затем
переносились в суперфузионную камеру рабочей установки. Инкубационный и
суперфузионный раствор Рингера был идентичен и содержал (в мМ): NaCl 119; KCl
2,5; MgSO4 1,3; CaCl 2,5; NaHCO3 26,2; NaH2PO4 1; глюкоза 11 и насыщался
карбогеном (pH 7,4; осмолярность 295 мОсм).
57
2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
Схема рабочей установки представлена на рисунке 2.1. Для подачи в рабочую
камеру суперфузионного раствора, находящегося в процессе постоянного насыщения
карбогеном, использовался перистальтический насос Masterflex L/S модели 7518-00
фирмы Cole Parmer (США) с силиконовыми трубками Masterflex L/S 14. Отток
раствора производился в 5-и литровую колбу, в которой поддерживалось
отрицательное давление с помощью вакуума централизованной системы института.
Срезы удерживались и стабилизировались в рабочей камере с помощью
самодельного устройства, изготовленного из расплющенной подковообразной
платиновой проволочки с натянутыми на нее тонкими капроновыми нитями.
Большинство экспериментов было проведено при комнатной температуре, за
исключением тех, которые указаны в тексте. В случае проведения экспериментов при
повышенной температуре, последняя поддерживалась с помощью стандартного
устройства Пелтье, установленного в рабочей камере, и термоконтроллера
Temperaturcontroller III фирмы Luigs & Neumann (Германия). В этих экспериментах
рабочий раствор предварительно гарбогенизировался при той же температуре, которая
поддерживалась в рабочей камере. Это предотвращало появление пузырьков газа при
нагреве холодного раствора.
Рабочая камера с прозрачным дном для прохождения света от источника
микроскопа была смонтирована на подвижном столике Luigs & Neumann.
Для установки стимулирующих и регистрирующих электродов использовались
манипуляторы Mini 25/Combi 25, оснащенные пультом программирования и
дистанционного управления, фирмы Luigs & Neumann. Перемещения оптической оси
микроскопа и фокусировка на объекте также осуществлялись с помощью системы
моторизации и дистанционного управления Luigs & Neumann.
58
1. камера “Hamamatsu”
а
2. термоконтроллер
3. усилитель “Axoclamp-2B”
4. электроизолирующий каркас
5. усилитель “Axopatch-1D”
6. манипулятор “L&N”
7. монитор “Pansonic”
8. суперфузионная камера
9. компьютер
10. перестальтический насос
11. пульт управления
б
4
toC
2
3
1
5
6
8
9
7
карбоген
стим.2
стим.1
6
10
11
ваккуум
Рис. 2.1 Рабочая установка для проведения исследований на срезах гиппокампа и
схема взаимодействия ее частей
а, Фотография установки, на которой проводились записи электрической активности в
срезах гиппокампа. Она состоит из 3-х основных частей. Первая часть это системы,
непосредственно контактирующие со срезом (микроскоп, манипуляторы, головки
усилителей, изолированные стимуляторы, термоэлементы и термодатчики) – они
электрически и механически изолированы. Вторая - оборудование для обработки
информации (усилители, термоконтроллер, монитор, компьютер и дистанционное
управление манипуляторами). Эти компоненты расположены вне изолирующей
камеры и смонтированы в специальной арматуре. Третья – система жизнеобеспечения
среза (камера, система подачи раствора с перистальтическим насосом и система оттока
раствора под действием вакуума). б, Схема взаимодействия частей установки.
Стрелками показано направления передачи сигнала (раствора). Нумерация одинакова
для а и б.
59
Для предотвращения нежелательных вибраций и электрических помех микроскоп с
рабочей камерой и манипуляторы были помещены в экранированный каркас,
расположенный на столе с воздушной подушкой (Spindler & Hoyer, США). Давление в
воздушной подушке поддерживалось с помощью баллона N2.
Электрическая стимуляция производилась через моно- и биполярные электроды из
нержавеющей стали фирмы FHC (США) или стеклянные микроэлектроды, в
зависимости от задачи, с помощью двух изолированных стимуляторов фирмы
Digitimer LTD (Великобритания) модели DS2, установленных внутри экранированного
каркаса.
2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
Для морфологического анализа и поиска определенного типа клеток использовался
микроскоп с системой проходящего через объект света (Axioskop FS, Zeiss, Германия),
оснащенный оптикой с дифференционным интерференционным контрастом (DIC) в
инфракрасном свете (IR-DIC). Свет от источника, галогеновой лампы фирмы Philips
(Германия) марки 250-429, отцентровывался и фокусировался перед началом каждого
эксперимента. Проверка и, при необходимости, настройка системы дифференционного
интерференционного контраста проводилась приблизительно раз в 2 месяца. Для
наведения на область среза гиппокампа использовался объектив 10X, затем он
переключался на водно-иммерсионный объектив 40X. При использовании последнего
объектива устанавливались стимулирующий(ие) и регистрирующий электроды. Для
большего увеличения изображения на мониторе использовалась приставка к
видеокамере с набором линз 1X, 2X, 4X. Все операции проводились при наблюдении
сигнала от микроскопа, отводимого видеокамерой Hamamatsu (Япония), на экране
монитора Panasonic WV-5410 (Япония). Для создания иллюстраций использовался
60
t
dia
ra
le
ida
ram
py
.
str
СА1
СА3
.
str
а
um
ЗФ
б
в
Рис. 2.2 Область СА1 гиппокампа и типы клеток, с которых производилась
запись
а, Схема среза гиппокампа с указанием областей (СА1, СА3 и ЗФ – зубчатая фасция).
Рамкой показана область гиппокампа, с которой обычно проводились записи.
Цифровая фотография получена с помощью камеры Hamamatsu (Япония). На ней
обозначены слои поля СА1 гиппокампа – str. radiatum и str. pyramidale. Шкала 40 µм. б,
фотографии типичных интернейронов str. radiatum, с которых производились записи.
Шкала 20 µм. в, Фотографии пирамидных нейронов str. pyramidale. Шкала 20 µм.
61
видео-цифровой преобразователь IMAQ PCI-1408 (National Instruments, США).
Характерные фотографии препарата и отдельных типов клеток показаны на рисунке
2.2.
В представленной диссертационной работе использовались два типа клеток:
интернейроны str.radiatum и пирамидные клетки str.pyramidale поля СА1. Из
исследования исключались крупные интернейроны имеющие пирамидную форму,
поскольку они могли оказаться пирамидными клетками, смещенными из str.pyramidale.
При использованной оптической системе интернейроны можно было подразделить на
би-, три- и мультиполярные по системе отходящих дендритов. Пирамидные клетки
идентифицировались по их расположению в поле str.pyramidale и характерной
вытянутой пирамидной форме. Помимо морфологических параметров для
идентификации клеток использовались электрические параметры, такие как входное
сопротивление клеток (более низкое в интернейронах), мембранный потенциал и
характеристики спонтанных потенциалов действия. Потенциал покоя мембраны был
выше в пирамидных клетках (60-70 мВ), чем в интернейронах (55-65 мВ). Интересно,
что самый высокий потенциал покоя наблюдался в астроцитах (около 80 мВ). Это и
отсутствие спонтанной и вызванной синаптической активности позволяло отличать их
от мелких интернейронов.
Записи не производились с клеток, в которых четко обозначалось ядро или
содержимое цитоплазмы выглядело гранулированным, что могло быть признаками
некроза или апоптоза. Как правило, в таких клетках не удается получить
конфигурацию whole cell, но даже если она получается, записи электрической
активности не стабильны, мембранный потенциал крайне низок, а регистрации не
превышают 20 минут (тогда как в нормальных условиях составляют 2-3 часа).
62
2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
При всей своей неспецифичности метод регистрации потенциалов от целых групп
нейронов (популяционный спайк) или синапсов (полевой ВПСП) является важным
подходом для изучения процессов, которые вовлекают в свое развитие синхронизацию
ответов клеток, таких как нормальная ритмическая и эпилептиформная активности.
Внеклеточные регистрирующие электроды заполнялись раствором Рингера и
устанавливались в поле str.radiatum для регистрации полевых возбуждающих
постсинаптических потенциалов (пВПСП) и/или в str.pyramidale для регистрации
популяционных спайков (ПС) (Рис. 2.3а,б). Амплитуда пВПСП достигала 1,5 мВ, а ПС
– 3 мВ.
Для описания возбудимости глутаматергических терминалей, эффективности
глутаматергической синаптической передачи и возбудимости внесинаптической
мембраны пирамидных клеток был использован метод построения "передаточных
функций" (transfer functions или input-output relationships) в широком диапазоне
интенсивностей стимулов. В соответствии с исследуемым участком передачи сигнала
строились зависимости амплитуды потенциала волокон (пВ, мВ) от силы
тестирующего стимула (А), наклона пВПСП (мВ/мс) от амплитуды потенциала
волокон (мВ) и амплитуды популяционного спайка (мВ) от наклона пВПСП (мВ/мс).
Для исследования особенностей развития пачечной активности (Рис. 2.3в) в поле
СА1 гиппокампа использовались кратковременные периодические повышения
внеклеточной концентрации калия (20 мМ). Они приводили к генерации пачечных
популяционных спайков в str.pyramidale в ответ на одиночный электрический стимул.
Для оценки пачечной активности исследовалась динамика изменения числа
популяционных спайков после окончания калиевых эпизодов.
63
а
б
рег2
стим. эл.
пВПСП
рег1
рег1
пВ
рег2

A
0.5 мВ
ПС
в1
5 мс
в2
0.5 мВ
5 мс
Рис. 2.3 Регистрация полевых потенциалов из идентифицированных областей
гиппокампа и оценка развития пачечной активности
а, Расположение стимулирующего (стим. эл.) и внеклеточных регистрирующих (рег1
и рег2) электродов в поле СА1 среза гиппокампа. Стимулирующий электрод был
расположен в str.radiatum и активировал как возбуждающие, так и тормозные аксоны.
рег1 – регистрирующий электрод, расположенный в str.radiatum. С его помощью
записывается суммарный потенциал, возникающий при активации группы
возбуждающих синапсов (пВПСП) и потенциал пресинаптических волокон (пВ) в
ответ на электрическую стимуляцию. рег2 – регистрирующий электрод,
расположенный в str.pyramidale. С его помощью записывается синхронный разряд
пирамидных нейронов, популяционный спайк (ПС).
б, Типичные формы ответов, получаемые при регистрации с помощью рег1 и рег2.
Наклон пВПСП измерялся как тангенс угла α (мВ/мс). А - амплитуда ПС. Амплитуду
пВ получали таким же образом, как и амплитуду ПС.
в, Генерация пачечного разряда в str.pyramidale в ответ на одиночный стимул. При
базовых условиях дополнительные спайки возникали только при высоких
интенсивностях электрической стимуляции (в1). После эпизодов повышения калия
(20 µМ; 3 эпизода с интервалом 10 минут) при той же самой амплитуде стимула
генерировалась более выраженная пачечная активность (в2). Оригинальные записи до
и через 1 час после окончания калиевого воздействия.
64
2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации
потенциала (тока) с одиночных нейронов
2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
Стимулирующие электроды
В большинстве случаев в данных экспериментах для электрической стимуляции
использовались монополярные и биполярные электроды из нержавеющей стали
компании Frederic Haer & Co (США). Однако, в экспериментах, где требовалась точная
установка и перемещения электрода для поиска оптимальной позиции использовался
стеклянный микроэлектрод, заполненный раствором Рингера. Это делалось, например,
при регистрации антидромного тока действия в интернейронах. В этом случае
необходимо было найти область, куда распространялся аксон этих клеток.
Для получения моносинаптических ТПСТ и/или ВПСТ в интернейронах или
пирамидных клетках электрод устанавливался в str.radiatum поля СА1 (Рис. 2.4а). Для
активации независимых наборов волокон два стимулирующих электрода
устанавливались в str.radiatum по разные стороны от клетки, с которой велась запись.
Длительность стимула была 20 с. Амплитуда стимула подбиралась в соответствии с
задачей эксперимента. При регистрации ТПСТ или ВПСТ, она устанавливалась таким
образом, чтобы синаптический ток был приблизительно 600 пА. Для регистрации
антидромных токов действия в интернейронах, стеклянный стимулирующий электрод
устанавливался в str.orience. Затем, позиция этого электрода и сила стимула менялись
таким образом, чтобы получить ток действия при стимуляции аксона клетки, по
возможности, без сопровождающего синаптического тока от стимуляции соседних
терминалей.
65
Для оценки одиночных моносинаптических токов интервал между стимулами был
не меньше 10 секунд. Для оценки коэффициента парной стимуляции использовались
два стимула с интервалом 50 мс. Частотно-зависимая модуляция ТПСТ исследовалась
при частоте 5 Гц. В экспериментах с гетеросинаптической депрессией дистальный
электрод использовался для высокочастотной стимуляции глутаматергических
коллатералей (5 стимулов 50/100 Гц) с целью высвобождения глутамата. Тестовый
стимул подавался на проксимальный электрод и следовал с интервалом 50 или 100 мс
после стимуляции коллатералей. Это делалось для оценки модулирующего влияния
спилловера глутамата на амплитуду ТПСТ (в случае исследования mGluR группы III)
или вероятность возникновения антидромного тока действия (в случае исследования
аксональных каинатных рецепторов).
Регистрирующие электроды
Записи производились в режиме whole-cell с интернейронов (Рис. 2.2 и 2.4а) и
пирамидных клеток (Рис. 2.2) поля СА1. Регистрирующие электроды вытягивались из
капилляров стекла GC150F-7.5 (Harvard Apparatus LTD, Великобритания) с помощью
программируемого вытягивающего устройства фирмы Sutter Instruments (USA) модель
P-87. Сопротивление электродов было 4-5 МΩ.
Растворы для заполнения пейч-кламповских электродов
В зависимости от задачи использовались растворы с различным содержанием
ионов хлора, что позволяло изменять потенциал реверсии для токов, опосредованных
ГАМКергическими рецепторами. Кроме того, в ряде растворов использовался QX314,
внутриклеточный блокатор Na+ каналов, использование которого позволяло
избавиться от спонтанных потенциалов действия в клетке. В случае исследования
клеточных разрядов, QX314 в раствор не добавлялся.
Основные растворы были следующие:
66
б
а
Усилитель
Стим.элек
тр
CA
1
CA3
в1
в2
в3
-70 мВ
-75 мВ
50 пА
1с
200 пА
50 мс
50 пА
50 мс
50 пА
10 мс
Рис. 2.4 Схема регистрации синаптических токов на примере интернейрона поля
СА1 гиппокампа
а, Расположение стимулирующего и регистрирующего электродов в str.radiatum поля
СА1 среза гиппокампа. б, Вид отдельного интернейрона с установленным на нем пейчкламповским электродом. в, Токи, регистрируемые в интернейронах в режиме
фиксации потенциала с использованием внутриклеточного раствора на базе CsCl. в1 –
синаптический ток, вызванный электрической стимуляцией и усредненный по 5
последовательным записям; в2 – пример записи спонтанных синаптических токов с
вставкой, увеличивающей отдельный участок записи; в3 - усредненный по 5
последовательным записям ток в ответ на прямоугольный сдвиг потенциала с -60 до
-65 мВ, использовавшийся для оценки сопротивления мембраны клеток и
стабильности регистраций.
1. Раствор на основе CsCl использовался для исследования ТПСТ и ВПСТ, которые
изолировались фармакологически (с использованием антагонистов). Это связано с
тем, что высокая концентрация ионов хлора внутри клетки приводит к изменению
потенциала реверсии для тормозных ГАМКергических токов, и они становятся
67
негативно направленными, как и возбуждающие. Данный раствор содержал (в мМ):
CsCl 120; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl2 0,2; MgАТФ 2; ГТФ 0,3 и QX314Br
(pH 7,2; осмолярность 290 мОсм) и приготавливался в объеме 50 мл, после чего
помещался 500 µл эппендорфы и замораживался.
2. Раствор на основе глюконата цезия использовался для разделения ТПСТ и ВПСТ
без использования антагонистов. Этот раствор не менял значительно потенциал
реверсии для хлора в клетках. В этом случае в режиме фиксации потенциала при
-60 мВ ТПСТ и ВПСТ были разнонаправлены. Использование этого раствора и
раствора с высоким содержанием хлора позволило также исследовать участие
хлорной проводимости в синаптическом токе, сравнивая экспериментально
полученные потенциалы реверсии синаптических токов с их значениями,
предсказанными по уравнению Нернста. Этот содержал (в мМ): цезия глюконат
102,5; CsCl 17,5; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl2 0,2; MgАТФ 2; ГТФ 0,3 и
QX314Br (pH 7,2; осмолярность 290 мОсм). Раствор приготавливался и хранился
таким же образом, как и раствор на основе CsCl.
3. Раствор на основе KCl использовался для исследования порога и паттерна
ренерации потенциалов и токов действия в режиме фиксации тока и потенциала,
соответственно. В связи с этим в раствор не добавлялся QX314. Исследовались как
спонтанные, так и вызванные разряды клеток. В режиме фиксации тока потенциалы
действия вызывались с помощью деплояризующего сдвига потенциала. В режиме
фиксации потенциала генерация потенциалов действия регистрировалась в виде
токов действия. Токи действия могли быть получены при антидромной стимуляции
аксона или при деполяризующем потенциале фиксации. Раствор на основе KCl
содержал (в мМ): KCl 145; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl2 0,2; MgАТФ 2; ГТФ
68
0,3 (pH 7,2; осмолярность 290 мОсм). Раствор приготавливался и хранился также
как и два предыдущих.
Различие в осмолярности между внеклеточным и внутриклеточным растворами
приблизительно в 5-10 мОсм, приводило к более стабильной регистрации. Это было
необходимо для исследования тонического ГАМКергического торможения, которое
оценивалось по изменению тока компенсации в режиме фиксации потенциала.
2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
Заполненный соответствующим раствором пейч-кламповский электрод при
поданном на него небольшом позитивном давлении вводился под объектив
микроскопа, расположенный над заранее морфологически идентифицированной
клеткой. При этом сопротивление электрода измерялась по ступеньке негативного
сдвига потенциала, которая регистрировалась как ток прямоугольной формы. При
приближении к клетке величина этого стока снижалась, что указывало на повышение
сопротивления. В этот момент позитивное давление в электроде снималось и
заменялось небольшим негативным, что приводило к формированию плотного
контакта кончика электрода и внеклеточной мембраны клетки (cell attached mode). При
этом ступенька тока практически полностью исчезала, что свидетельствовало о
дальнейшем повышении сопротивления и формировании гигаомного контакта
(гигасила). Затем использовались кратковременные и частые негативные увеличения
давления в электроде, для того чтобы прорвать клеточную мембрану под ним. Когда
это происходило, снова появлялся ток в ответ на прямоугольный сдвиг потенциала
(Рис. 2.4в3). Этот ток отражал сопротивление электрода, цитоплазмы и мембраны
клетки (входное сопротивление – input resistance). В таком режиме (whole cell mode) и
проводились дальнейшие исследования. Электрическая стимуляция приводила к
регистрации постсинаптических токов (Рис. 2.4 в1) или потенциалов в режиме
69
фиксации потенциала или тока, соответственно. Кроме того, регистрировались ответы
и на спонтанный выброс медиатора – спонтанные тормозные (ТПСТ) или
возбуждающие (ВПСТ) постсинаптические токи (Рис. 2.4 в2). Они, как правило, были
значительно меньше по амплитуде вызванных токов и являлись свидетельством
здорового состояния ткани.
Если использовался метод фиксации потенциала, то клетка поддерживалась при
различных потенциалах в зависимости от задачи (см. главу 3. Результаты
исследований и их обсуждение), однако, в большинстве экспериментов при -60 мВ. В
этом случае, если собственный потенциал клетки (при использованных внеклеточном
и внутриклеточном растворах) был равен -60 мВ, то усилитель не подавал никакого
тока для фиксации этого потенциала. Как только потенциал клетки изменялся, то
усилитель его компенсировал с помощью соответствующего тока (ток компенсации).
Изменения тока компенсации были использованы для исследования медленных
процессов в клетке, таких как тоническое ГАМКергическое торможение.
В работе были использованы усилители Axoclamp 2B и Axopatch 1D (Axon
Instruments, Union City, Калифорния, США). Записываемый сигнал фильтровался на
частоте 1 кГц, затем оцифровывался при частоте 2 кГц и сохранялся в персональном
компьютере. Для записи данных использовались программы, созданные в системе Lab
View 5.0.
2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации
потенциала
Данные, полученные в ходе экспериментов и сохраненные на жестком диске,
предварительно анализировались с использованием программ, написанных в Lab
View 5.0, а также с помощью программы KPLAnalyser (автор Dr.Knit-Pitter Lehre).
70
Предварительный анализ
Предварительный анализ включал в себя оценку четырех основных параметров.
Во-первых, измерялась амплитуда вызванных синаптических токов (Рис. 2.4 в1),
константа их затухания (τзатухания исходя из моноэкспоненциальной аппроксимации
затухания тока) и площадь под пиком (имеющая смысл переносимого заряда). Вовторых, идентифицировались спонтанные синаптические токи, для которых получали
частоту, среднюю амплитуду и τзатухания для каждой отдельной регистрации (Рис. 2.4
в2). Затем рассчитывался средний ток, переносимый спонтанными ТПСТ в каждой
регистрации (частота спонтанных ТПСТ умноженная на заряд, переносимый средним
ТПСТ). В случае, если задачей ставилось изучение спонтанных ТПСТ, ВПСТ или
токов действия, длительность каждой регистрации была не меньше 5 секунд. Это
позволяло помимо средних величин для каждой регистрации оценить паттерн
спонтанной активности (регулярность-нерегулярность, генерация пачечных ответов).
В-третьих, анализировалась величина тока компенсации, которая является суммарным
показателем проводимости мембраны клетки и качества регистрации (контакта
электрода с мембраной, целостности клетки). При стабильных условиях записи, ток
компенсации был использован для оценки тонического ГАМКергического
торможения. В-четвертых, оценивалось входное сопротивление клетки по анализу тока
в ответ на прямоугольный гиперполяризующий сдвиг потенциала (20 мс; -5 мВ),
который давался в промежутках между стимуляцией (Рис. 2.4 в3).
Последующий анализ
Полученные в нескольких экспериментах данные усреднялись и были представлены
как среднее ± стандартная ошибка среднего (С.О.С.). Для усреднения данных,
полученных в различных клетках, ответы нормировались к их среднему значению при
базовых условиях (до экспериментального воздействия) в каждом эксперименте.
71
Для построения ток-потенциал (I-V) зависимостей потенциал мембраны
фиксировался на -80, -60, -40, -20, 0, 20, 40, 60 и 80 мВ. Амплитуда ответов
нормировалась в каждом эксперименте к току, возникающему при потенциале 80 мВ.
Для оценки участия пресинаптических механизмов в эффекте экспериментального
воздействия оценивался коэффициент парной стимуляции. Известно, что если нанести
два стимула пресинаптических терминалей с коротким интервалом амплитуда второго
ТПСТ (ВПСТ) будет отличаться от амплитуды первого. Если она меньше амплитуды
первого ответа, то такой феномен называется парной депрессией, если больше, то
парной фасилитацией. Эти феномены, при записи с одной клетки в режиме фиксации
потенциала, частично связывают с изменением эффективности выброса медиатора
пресинаптичесими терминалями. В данной работе мы использовали измерение
коэффициента парной стимуляции с интервалом между стимулами 50 мс для ТПСТ в
гиппокампальных интернейронах. Это проводилось для исследования пре- или
постсинаптической природы модуляции высвобождения ГАМК каинатными и
метаботропными рецепторами глутамата группы III.
Другим методом оценки пре- или постсинаптической природы эффекта является
анализ коэффициента вариации (CV) ТПСТ. Было показано, что статистический
параметр 1/CV2 меняется с квантовым составом (Edwards et al. 1989) и может быть
грубой оценкой высвобождения медиатора в гиппокампальных синапсах (Manabe et al.
1993). Таким образом, если снижение амплитуды ТПСТ сопровождается
пропорциональным снижением данного статистического параметра, то это будет
указывать на наличие пресинаптического механизма. Рассчеты производились по
__________2
2
_________
1
ТПСТ
2
ТПСТ

формуле:
,
где
- квадрат средней амплитуды ТПСТ,  ТПСТ
2
2
2
CV
 ТПСТ   шум
2
дисперсия ТПСТ,  шум
- дисперсия шума (записи перед электрическим стимулом).
72
Средняя амплитуда ТПСТ находилась по 20 последовательным парным стимуляциям
при базовых условиях и по 20 при аппликации экспериментального вещества.
Для оценки фармакологических свойств ГАМКергических рецепторов в данной
работе строились доза-эффект зависимости подавления ТПСТ пикротоксином. Для
этого концентрация вещества во внеклеточном растворе последовательно
увеличивалась, при этом измерялась амплитуда ТПСТ. Затем строилась зависимость
амплитуды, нормированной к средней амплитуде до добавления пикротоксина, от
концентрации пикротоксина (в полулогарифмических координатах). Эта зависимость
аппроксимировалась соотношением Хилла: ТПСТ 
1
, где ТПСТ –
1  ([ PTX ] / IC 50 ) H
амплитуда ТПСТ, [PTX] – концентрация пикротоксина, H – коэффициент Хилла, IC50 –
концентрация пикротоксина, при которой амплитуда ТПСТ равняется половине от
базовой.
2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
Метод ионтофореза использовался для локальной аппликации агониста, чтобы
исследовать фармакологические свойства рецепторов и при этом исключить влияние
пресинаптического звена синаптической передачи. Для ионтофореза растворы
агонистов (ГАМК 200 мМ; CACA 200 мМ и изогувазин 200 мМ) приготавливались на
основе раствора Рингера, после чего pH корректировался до 7.4. Растворы хранились
замороженными. Перед началом каждого эксперимента таким раствором заполнялась
ионтофоретическая пипетка (аналогичная пейч-кламповскому электроду),
сопротивление которой было 5 МΩ. Затем ионтофоретический электрод
устанавливался поблизости от регистрируемой клетки в районе ее дендритов (Рис. 2.5).
Ток в пипетку подавался c помощью усилителя Axoclamp 2B (Axon Instruments,
73
б
а
рег. эл
ионт. эл
Рис. 2.5 Схема регистрации ионтофоретических токов на примере интернейрона
поля СА1 гиппокампа
а, Расположение регистрирующего (рег. эл) и ионтофоретического (ионт. эл)
электродов в str.radiatum поля СА1 среза гиппокампа. Ионтофоретический электрод
располагался по возможности ближе к клетке, чтобы аппликация агониста могла
достигнуть рецепторов на ее проксимальных дендритах. б, Фотография, показывающая
регистрирующий электрод, расположенный на интернейроне str.radiatum поля СА1
среза гиппокампа, и с ним рядом ионтофоретический электрод (покрашен в голубой
цвет).
Union City, Калифорния). Ток удержания агониста был -100 нА, ток инъекции 150250 нА. Длительность аппликации 0,1-1 секунда. Для избежания десенситизации
ГАМКергических рецепторов между аппликациями давался интервал не меньше 30
секунд. Поскольку инъекция агониста сопряжена с подачей электрического тока, есть
вероятность, что этот ток будет стимулировать пресинаптические аксоны и приводить
к синаптическому выбросу медиатора. Для избежания этого все эксперименты с
ионтофоретической аппликацией проводились в присутствии тетродотоксина
(блокатора Na+ каналов). Токи на ионтофоретическую аппликацию регистрировались и
анализировались также, как и синаптические токи, вызванные электрической
стимуляцией терминалей.
74
2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
2.5.1 Приготовление outside-out patch
Для этого метода использовались электроды с более высоким сопротивлением (810 МΩ), чем для whole-cell (4-5 МΩ). Внеклеточный раствор и раствор в электроде
были такими же, как и в режиме whole-cell. После образования гигасила и прорыва
мембраны, клетки стабилизировались в течение 1-2 минут в режиме фиксации
потенциала на –60 мВ (Рис. 2.6а). Для получения мембранных пейчей использовались
только клетки, в которых наблюдалась стабильная спонтанная активность. Затем
электрод отрывался от клетки, при этом наблюдалось изменение формы тока на
гиперполяризующий сдвиг потенциала -5 мВ (рис. 2.6в). Кроме того, ток компенсации
становился близким к нулю, что указывало на плотный контакт пейча и кончика
электрода. Все это означало образование outside-out (внешняя сторона наружу) пейча
на кончике электрода. Если этого не происходило, то такие препараты не
использовались. С одной клетки удавалось получать по 5-6 пейчей. Поскольку
внешняя сторона мембраны в этих препаратах оказывалась направленной наружу, то
аппликация агонистов ионотропных рецепторов вызывала в них открытие каналов и,
соответственно, ток. Длительность записи с одного пейча составляла в среднем 20-30
минут.
2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
Быстрые концентрационные изменения концентрации агониста на внешней стороне
пейча производились с помощью так называемой “пипетки быстрой аппликации”
(Colquhoun et al. 1992). Эта пипетка изготавливалась из Θ-капилляров, содержащих
внутреннюю перегородку. Внешний диаметр был 1,5 мм; толщина стенок
75
а3
усилитель
а2
базов
агонист
а1
б
элект род с outside-out пейч ем
базовый раствор
граница раздела растворов
раствор агониста
двухк амерная пипетка
в2
в3
в1
открытый конец
гигасил
режим whole-cell
outside-out пейч
Рис. 2.6 Схема регистрации токов с outside-out пейча с использованием системы
быстрой аппликации
а, Экспериментальная последовательность получения токов с outside-out пейча при
быстрой аппликации агониста (1 мс). Сначала клетка идентифицировалась по
морфологическим признакам, и пейч-кламповский электрод позиционировался над ней
(а1). Затем между электродом и клеткой образовывался контакт с высоким
сопротивлением (гигасил), после чего мембрана под электродом прорывалась – whole
cell mode (а2). После этого электрод отрывался от клетки с участком мембраны,
который образовывал outside-out пейч. Этот пейч устанавливался в поток раствора
(контрольного/отмывающего), исходящий их одной камеры двухкамерной пипетки
(а3). В другой камере находился раствор агониста (ГАМК, 1 мМ). Эта пипетка была
смонтирована на двух пьезокристаллах, меняющих изгиб в зависимости от
подаваемого на них тока. При подаче короткого импульса пипетка смещалась,
направляя раствор агониста на пейч, затем возвращалась обратно. б, Фотография
двухкамерной пипетки с размещенном в потоке раствора электродом с outside-out
пейчем под микроскопом (калибровка – 40 мс). Для дополнительного контроля всех
стадий приготовления outside-out пейча использовался мониторинг тока,
регистрируемого в режиме фиксации потенциала в ответ на 20 мс сдвиг потенциала на
-5 мВ. Стадиям а1, а2 и а3 соответствуют изменения формы тока в1, в2 и в3.
76
0,2 мм; внутренней перегородки 0,15 мм. Пипетки вытягивались на программируемом
вытягивающем устройстве фирмы Sutter Instruments (USA) модель P-87. Диаметр
кончика был 230-250 μм. С обратной стороны в отсеки капилляра вводились тонкие
нейлоновые трубочки, которые присоединялись к гравитационной системе подачи
растворов. Пипетка приклеивалась к пластинке, состоящей из двух пьезокристаллов,
которые при подачи на них электрического тока изгибались. Таким образом,
достигалась возможность смещать кончик пипетки в пространстве очень быстро и на
различные интервалы времени. В один отсек пипетки подавался контрольный раствор,
в другой раствор агониста (Рис. 2.6).
Outside-out пейч, полученный с нейрона, вводился в контрольный раствор рядом с
границей раствора, содержащего агонист. Пьезокристалл, перемещающий
двухканальную пипетку, присоединялся к стандартному электрическому стимулятору.
При этом величина стимула соответствовала амплитуде смещения границы растворов,
а длительность стимула – длительности смещения. Первый параметр не имел значения
для формы или величины тока. Ток в пейче определялся концентрацией агониста,
длительностью аппликации (1 мс), числом и свойствами каналов и рецепторов.
Растворы
Для быстрой аппликации использовались растворы, отличные от нормального
раствора Рингера. Это было связано с тем, что они не карбогенизировались (чтобы
избежать образования пузырьков) и формулировались для стабилизации пейча.
Контрольный раствор на основе HEPES содержал (в мМ): NaCl (140), CaCl2 (2), KCl
(1.5), MgCl2 (1), HEPES (10) (pH доводилась до 7.2, осмолярность до 295 мОсм).
Раствор агониста (ГАМК 1 мМ) делался на основе контрольного раствора в который,
кроме ГАМК добавлялось дополнительно 10 мМ NaCl (pH доводилась до 7.2,
осмолярность до 295 мОсм). Из-за разницы ионных концентраций при аппликации
77
раствора агониста на открытый кончик электрода в нем возникал ток. Рост и затухание
этого тока, определялись скоростью обмена растворов на кончике электрода. Это
использовалось для рассчета 10-90 % времени обмена между контрольным и
раствором агониста на пейче. Время обмена измерялось в конце каждого
эксперимента, после того как разрывался пейч. Оно составляло в среднем 0,2 мс, что
является удовлетворительным для использованной длительности аппликации (1 мс).
Токи, регистрируемые с outside-out пейчей, полученных с интернейронов и
пирамидных клеток, использовались для сравнительного анализа биофизических
свойств ГАМКергических рецепторов.
2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием
анализа токов, полученных с outside-out пейчей
Нестационарный дисперсионный анализ токов с outside-out пейчей в ответ на
быструю аппликацию ГАМК производился, как было описано ранее (Jonas et al. 1993;
Perrais and Ropert 1999; Sigworth 1980). Регистрировались как минимум 30
последовательных ответов со стабильной амплитудой (Рис. 2.7). Затем рассчитывался
средний ток и дисперсия для каждой точки. Связь между этими параметрами основана
на следующих соотношениях:
I(t)=NP(t)i, (1)
где I(t) – средний ток в данный момент времени, N – число каналов открытое при
пиковой амплитуде тока, P(t) – вероятность открытого состояния канала в данный
момент времени, i – средний ток одиночного канала
σ2ток- σ2шум=NP(t)(1-P(t))i2, (2)
значения параметров те же что и в (1), σ2ток- дисперсия тока, вызванного
аппликацией ГАМК, в данной временной точке, σ2шум – дисперсия базового тока до
78
средняя
амплитуда тока (пA)
б
a
50 пA
10 мс
350
300
250
200
150
100
50
0
0 20 40 60 80 100120140
время (мин)
г
в
400
(пA2)
25
0
2 тока
отклонение от
среднего (пА)
50
300
200
100
-25
0
-50
0
20
40
60
0 20 40 60 80 100120140
80
время (мин)
время (мс)
д
350
2
тока (пA2)
300
250
200
150
100
50
0
0
50 100 150 200 250 300 350
средняя
амплитуда тока (пА)
Рис. 2.7 Использование метода нестационарного дисперсионного анализа для
определения биофизических параметров ГАМКергических рецепторов
а, Для анализа использовались данные с пейчей, в которых амплитуда ответов на
быструю аппликацию была сравнительно стабильной (не наблюдалось тенденции к ее
увеличению или уменьшению с течением времени). Ответы оцифровывались с
частотой 10 кГц. Полученные токи усреднялись (б) и затем путем вычитания среднего
определялась динамика отклонений индивидуальных ответов от среднего (в) После
этого рассчитывалась дисперсия для каждой точки ответа, из которой вычиталась
дисперсия шума (тока до аппликации агониста; г). Получив эти данные, мы строили
зависимость дисперсии от средней амплитуды тока для каждой временной точки (д).
Эта зависимость аппроксимировалась по методу наименьших квадратов с
использованием уравнения σ2ток- σ2шум = iI-I2/NP, где σ2ток – дисперсия
ГАМКергического тока, σ2шум – дисперсия базового тока перед стимуляцией I –
средняя амплитуда тока. При этом мы получали параметры: i – средний ток
одиночного канала и NP число каналов в пейче.
79
аппликации (вариабельность этого тока связана со спонтанным открываниемзакрыванием каналов).
Из (1) и (2) получается соотношение σ2ток- σ2шум=iI-I2/N, которое связывает
амплитуду тока амплитуду тока с дисперсией. Таким образом, зависимость дисперсии
от тока аппроксимировалась параболической кривой, полученной по данному
уравнению. Из этой аппроксимации мы получали параметры i и N. После чего
рассчитывалась максимальная вероятность открытого состояния канала (Pотк) по
уравнению: Pотк=1-(σ2пик- σ2шум)/iIпик, где Iпик и σ2пик – максимальная амплитуда тока и
дисперсия в этой точке, соответственно.
2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
2.6.1 Электрический киндлинг
Операционная техника
Опыты проводились на 9 крысах-самцах Вистар массой 270-350 граммов. В ходе
предварительной операции 5 животным под нембуталовым наркозом (50 мг/кг, в/б)
стереотаксически вживлялись 2 электрода в левый гиппокамп: рострально
(монополярный электрод; AP=-1,8; ML= 1,5; DV=3,2) и каудально (парный электрод;
AP=-3,6; ML=-3; DV=4). Для электрической стимуляции гиппокампа использовался
ростральный электрод и один из электродов каудальной пары. Для регистрации
послеразрядов (ПР) пирамидных нейронов использовался другой электрод каудальной
пары. Индифферентный электрод (для регистрации) находился в назальных частях
черепа.
Стимуляция
Внутримозговая электрическая стимуляция животных начиналась через неделю
после операции. Был использован протокол (rapid alternate kindling), предложенный
80
ранее Лотманом и Вильямсоном (Lothman and Williamson 1994). Электрической
стимуляции подвергались 5 животных. Другие 4 служили в качестве контроля. Частота
стимуляции была 50 Гц, длительность 10 секунд. Для стимуляции использовались
прямоугольные импульсы тока длительностью 0,2 мсек. и интенсивностью,
вызывающей электрические послеразряды (группу популяционных спайков
длительностью не менее 10 секунд после окончания стимуляции). Обычно
интенсивность тока варьировала в пределах 250-400 μА. В день давалось 12 таких
стимулов с интервалом 30 минут. Эти стимулы давались через 1 сутки в течение 8
суток (всего 48 стимулов).
Критерием выработки определенной стадии киндлинга являлась длительность
послеразрядов и поведенческие проявления, оцениваемые по шкале Рэйсина (Racine
1972):
1 стадия – "отряхивание мокрой собаки", жевание, подергивание лицевых мышц;
2 стадия – качание головой, судорожные подергивания мышц туловища;
3 стадия – клонус передних конечностей;
4 стадия - клонус передних конечностей и поднимание на задние лапы;
5 стадия - клонус передних конечностей, поднимание на задние лапы и потеря
равновесия.
Срезы гиппокампа между ростральным и каудальным электродами выделялись
через 24 часа после того, как животные достигали 4-5 стадий киндлинга
(соответствующие электрографические и поведенческие реакции на 3
последовательных стимуляции).
81
2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный
киндлинг
В работе были использованы крысы линии Крушинского-Молодкиной (КМ),
генетически предрасположенных к аудиогенной судорожной активности. Они были
разделены на две группы. Первая группа это крысы, не подвергавшиеся звуковому
воздействию (n=10). Вторая - крысы, которым давались периодические
кратковременные (до 90 сек.) предъявления звукового стимула (1 раз в день) в течение
40 дней (аудиогенный киндлинг) (n=4).
В опытах с хронической звуковой стимуляцией использовались самцы крыс линии
КМ массой 200-250 граммов, которые содержались в условиях вивария при
постоянных температурных условиях и продолжительности светового периода 12
часов. Предварительно, животные тестировались по продолжительности и
интенсивности аудиогенной судорожной реакции в ответ на действие звука (115 дБ,
12-16 кГц, 90 сек.) по 4-х бальной шкале (Батуев и др., 1997).
1 балл - двигательное возбуждение, бег, прыжки
2 балла - двигательное возбуждение заканчивается внезапным ступорозным
состоянием с падением животного на брюшко.
3 балла – 2 балла + падение животного на бок с резкими клоническими судорогами.
4 балла – 3 балла + тоническое напряжение всей мускулатуры и временная
остановка дыхания.
Хроническая стимуляция, проводимая в течение 21 дня звуковыми стимулами
интенсивностью 75 дБ до начала двигательного возбуждения (но не более 90 секунд),
приводила к постепенному увеличению продолжительности и интенсивности
аудиогенной судорожной реакции от реакции в 2,5 ± 0,4 бала с латентным периодом
5-7 сек. к реакции в 3,5 ± 0,6 балла с латентным периодом 2-5 сек., включающей
82
миоклонические гиперкинезы. Дальнейшее продолжение ежедневной стимуляции до
40 дней усиливало выраженность этих реакций. Использование более длительной
стимуляции не приводило к дальнейшим изменениям. Поэтому через 40 дней звуковые
стимулы прекращались. Полученное состояние сохранялось, по крайней мере, в
течение одной недели без предъявления звука. После этого животных декапитировали
и выделяли срезы гиппокампа для последующего анализа.
2.7 Использованные вещества
Вещества для приготовления рабочих растворов были приобретены в фирме Sigma
(Dorset, Великобритания), специфические агонисты, антагонисты и модуляторы
рецепторов в Tocris Cookson LTD (Bristol, Великобритания), QX314Br в TCS
Biologycals (Buckinghamshire, Великобритания), тетродотоксин в Latoxan (Valence,
Франция). Рабочий раствор Рингера и раствор для резки срезов готовился на основе
бидистиллированной или деионизованной воды перед каждым экспериментом из
маточного раствора, содержащего все компоненты кроме глюкозы и CaCl2, которые
добавлялись в последнюю очередь. Агонисты и антагонисты готовились в объеме
необходимом для проведения нескольких экспериментов и замораживались в
эппендорфах. В качестве растворителя использовалась деионизированная вода, DMSO
или эквимолярная концентрация NaOH (NaOH э.м.). В качестве маточного раствора
пентобарбитала использовался раствор, применяемый при эфтаназии (60 мг/мл).
Раствор тетродотоксина готовился при введении с помощью шприца в запаянный
флакон растворителя (слабого раствора уксусной кислоты) в необходимом объеме.
Использованные в работе вещества и их концентрации приведены в таблице 2.1
83
Таблица 2.1 Использованные вещества
Вещество
Эффект
Концентр.
Раствори-
Мол.
тель
масса
Примечание
(-)-бикукуллина
метобромид
Антагонист ГАМКА
рецепторов
10 μМ
вода
471.31
Возможны эффекты
не только на ГАМК
рецепторы
CACA
Агонист ГАМКС
рецепторов
200 мM
вода
101.11
Ионтофорез (агонист
растворялся в физ.
растворе)
CGP 52432
ГАМКB антагонист
5 μМ
вода
420
CNQX
Антагонист
каинатных и AMPA
рецепторов
50 μМ
вода
307.64
Дегидрокаинат
(DHK)
Блокатор uptake
глутамата
200 μМ
NaOH э.м.
DL-APV
Антагонист NMDA
рецепторов
50 μМ
NaOH э.м.
197
ГАМК
Агонист ГАМК
рецепторов
200 мМ
вода
103.12
GYKI 53655
Антагонист AMPA
рецепторов
50 μМ
DMSO
361.4
Изокувазина
гидрохлорид
Специфический
агонист ГАМКА
рецепторов
100 мМ
вода
163.6
Ионтофорез (агонист
растворялся в физ.
растворе)
каинат
Агонист каинатных
и AMPA
рецепторов
250 нМ,
1 μМ
NaOH э.м.
235.75
Может влиять на
uptake гутамата
L-AP4*H2O
Агонист mGluRIII
50 μМ
NaOH э.м.
201
Антагонист
mGluRIII
100 μМ
NaOH э.м.
240
NBQX*H2O
Антагонист
каинатных и AMPA
рецепторов
25 μМ
вода
398
Пентобарбитал
Модулятор ГАМК
рецепторов
100 μМ
готовый
раствор
226.3
Разведение готового
растворя для
инъекций 60 мг/мл
Пикротоксин (PTX)
Антагонист ГАМК
рецепторов
0,1 - 1000 μМ
DMSO
602.6
Смесь 1:1
пикротоксинина и
пикротина
SCH 50911
Антагонист ГАМКB
20 μМ
вода
175.01
SKF 89976A
Блокатор uptake
ГАМК
25 μМ
вода
371.9
SR 95531
(габазин)
Специфический
Антагонист ГАМКА
10 μМ
вода
368.23
TACA
Агонист
ионотропных ГАМК
рецепторов
2,5 – 15 μМ
вода
101.11
THA
Блокатор uptake
глутамата
300 μМ
NaOH э.м.
TPMPA
Антагонист ГАМКС
рецепторов
200 μМ
вода
161.14
При высоких конц.
блокирует и ГАМКА
Тетродотоксин
(TTX)
Блокатор Na+каналов
2 μМ
раствор
ацетата
319.28
Крайне токсичен
MSOP*21/
4
H2O
Может дествовать на
NMDA рецепторы
Ионтофорез (агонист
растворялся в физ.
растворе)
Основной эффект на
GAT1 - транспортер
84
2.8 Статистический анализ
Экспериментальные данные каждой серии (n≥4) были усреднены и представлены в
виде средняя ± стандартная ошибка средней. Достоверность различий данных
оценивалась с использованием парного или непарного t-теста и однофакторного
дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считались достоверными при P<0,05.
Аппроксимирующие кривые на графиках рассчитывались по методу наименьших
квадратов.
85
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Нетипичные фармакологические свойства ГАМКергических
рецепторов в гиппокампальных интернейронах
3.1.1 Различная чувствительность ионотропных ГАМКергических
рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных
клетках
Добавление неконкурентного антагониста ионотропных ГАМКергических
рецепторов, пикротоксина (PTX), приводило к подавлению ТПСТ как в интернейронах
str.radiatum, так и в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа (Рис.3.1.1 а,б).
Однако, чувствительность ТПСТ, регистрируемых в двух популяциях клеток, к этому
веществу значительно отличалась. Так использование 100 μМ пикротоксина
(концентрация традиционно используемая для подавления ГАМКА рецептор
опосредованных ТПСТ) практически полностью подавляло ТПСТ в пирамидных
клетках, тогда как в интернейронах все еще регистрировался значительный ток (16
± 5 % от базовых значений ТПСТ; p<0,01; n=7). Интересно, что аппроксимация по
уравнению Хилла кривых концентрация PTX -ингибирование ТПСТ приводила к
получению одинакового коэффициента Хилла для обоих типов клеток (0,9), но
разному IC50 (9 μМ для пирамидных клеток и 26 μМ для интернейронов; Рис.3.1.1в).
Пикротоксин представляет собой рацемическую смесь пикротина и более
активного пикротоксинина, который, как предполагается, блокирует ионный канал
ГАМКергических рецепторов (Gurley et al. 1995; Newland and Cull-Candy 1992). Хотя
известно, что эффект пикротоксина может зависеть от активности рецепторов, нам не
удалось обнаружить, что остаточный ТПСТ в интернейронах снижался со временем в
присутствии 100 μМ пикротоксина. Таким образом, различная чувствительность ТПСТ
86
[PTX] 0 0.5 1 5 10 50 100 500
ИН
б
[PTX]
0 0.5 1 5 10 50 100 500
ПК
200 пA
100 мс
в
амплитуда ТПСТ (норм)
а
интернейрон (7)
пирам. клетка (6)
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.1
1
10
100
1000
[пикротоксин], µM
Рис. 3.1.1 ТПСТ в интернейронах менее чувствительны к пикротоксину, чем в
пирамидных клетках
а, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона в присутствии D-APV
(50 μM), NBQX (20 μM), CGP52432 (5 M), каждая усреднена по 10 последовательным
ТПСТ. Пикротоксин подавлял ТПСТ концентрационно-зависимым образом. Однако,
при концентрации пикротоксина 100 µМ все еще наблюдался значительный ток. б,
оригинальные записи полученные с одной пирамидной клетки, каждая усреднена по 10
последовательным ТПСТ. Пикротоксин, как и в интернейронах, подавлял ТПСТ в
пирамидных клетках концентрационно-зависимым образом. Причем, аппликация
100 µМ пикротоксина полностью подавляла ТПСТ. в, Зависимости характеризующие
доза-эффект пикротоксина на амплитуду ТПСТ в интернейронах ( ; n=7) и
пирамидных нейронах ( ; n=6), построенные в полулогарифмических координатах.
ТПСТ нормированы к амплитуде базового ТПСТ (в отсутствии пикротоксина). Линии
аппроксимации показывают теоретические кривые, полученные по уравнению Хилла.
Коэффициент Хила был одинаковым для обоих типов клеток (0,9), тогда как IC50 была
9 µМ для интернейронов и 26 µМ для пирамидных клеток. Разбросы указывают
величину ±С.О.С.
в интернейронах и пирамидных нейронах к этому веществу не отражает различную
занятость рецепторов эндогенным агонистом (Hajos et al. 2000). С другой стороны,
этот результат может быть объяснен какими-то различиями в постсинаптических
рецепторах. Таких различий может быть предложено несколько. Во-первых, если
ГАМКергические рецепторы гомогенны в обоих типах клеток, то они могут состоять
из различных субъединиц (Sperk et al. 1997; Thomson et al. 2000). Во вторых,
87
рецепторы могут быть гетерогенны и, в этом случае, разница в чувствительности
ТПСТ в этих типах клеток может объясняться разной пропорцией ГАМКергических
рецепторов, слабо чувствительных к пикротоксину. И в третьих, при наличии
одинаковых рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках их активация может
регулироваться разными внутриклеточными механизмами. Для ответа на этот вопрос
мы провели разностороннее исследование биофизических и фармакологических
свойств ГАМКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках.
3.1.2 Ионные каналы ионотропных ГАМКергических рецепторов в
интернейронах и пирамидных клетках имеют различную
проводимость
Мы исследовали свойства ГАМКергических рецепторов в изолированных outsideout пейчах, полученных с интернейронов и пирамидных нейронов. ГАМК (1 мМ)
подавалась на пейчи с использованием системы быстрой аппликации (см. Материалы и
методы раздел 2.5). Длительность каждой аппликации была 1 мс, что приблизительно
соответствует концентрации нейропередатчика и длительности событий в
гиппокампальных синапсах (Clements et al. 1992; Nusser et al. 2001). При
использовании данного метода нам удавалось получить ГАМКергические токи с
пейчей, амплитуда которых находилась в интервале от 50 до 300 пА. Такая
вариабельность объясняется, по всей видимости, различным числом рецепторов в том
участке мембраны, который служил для приготовления препарата. Мы не обнаружили
значительных различий между интернейронами и пирамидными клетками в константе
затухания полученных токов (Рис. 3.1.2; Таблица 3.1.1). Для оценки средней
вероятности открытого состояния канала (Pотк) и проводимости одиночного канала
ГАМКергических рецепторов мы воспользовались методом нестационарного
88
a1
б1
интернейрон
пирамидный нейрон
100 пA
20 мс
20 пA
20 мс
a2
дисперсия,
2
(пA2)
80
б2
350
300
60
250
200
40
150
100
20
50
0
0
0
20
40
60
0
80
50 100 150 200 250 300 350
средний ток, I (пA)
Рис. 3.1.2 Ионотропные ГАМКергические рецепторы в пирамидных клетках
обладают более высокой средней проводимостью одиночного канала, чем в
интернейронах
Токи, регистрируемые в ответ на быструю аппликацию ГАМК (1 мМ; 1 мс) на outsideout пейчи полученные с одного интернейрона (а1) и пирамидной клетки (б1). Тонкие
линии показывают индивидуальные ответы, полученные в результате 20
последовательных аппликаций ГАМК, а жирные результат их усреднения. Под
оригинальными токами показаны зависимости дисперсии тока (σ) от его амплитуды
для интернейрона (а2) и пирамидной клетки (б2) полученные с тех же пейчей, что и
ответы (а1 и б1). Линии аппроксимации получены по уравнению σ2=iI-I2/NP (см.
Материалы и методы). Статистические данные, полученные в результате
использования нестационарного дисперсионного анализа, обобщены в таблице 3.1.1
Таблица 3.1.1 Биофизические свойства ГАМКергических рецепторов
i(ГАМК), пA
S, пС
Pотк
τзатух, мс
Интернейрон
1,44 ± 0,12
22,3 ± 1,9
0,51 ± 0,11
34 ± 4
(n)
7
7
7
7
Пирам. нейрон
2,1 ± 0,2
32,5 ± 2,3
0,47 ± 0,12
31 ± 3
(n)
5
5
5
5
p (t-тест)
*0,01
*0,01
0,85
0,61
где, i – средний ток одиночного канала, S – средняя проводимость одиночного канала,
Pотк – максимальная вероятность открытого состояния канала, τзатух – константа
затухания токов.
89
дисперсионного анализа (см. Материалы и методы раздел 2.5). При этом мы не
обнаружили существенного различия в Pотк. Однако, проводимость одиночного канала
была значительно ниже в пейчах, полученных с интернейронов, по сравнению с
пейчами, полученными с пирамидных клеток. Эти данные указывают на различный
субъединичный состав ГАМКергических рецепторов (или различную пропорцию
субъединиц) в интернейронах и пирамидных нейронах.
3.1.3 Ионотропные ГАМКергические рецепторы как в интернейронах,
так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту ГАМКС
рецепторов
Известно, что чувствительность к пикротоксину ГАМКергических рецепторов
определяется наличием боковых цепочек аминокислот в сегменте M2, покрывающих
внутреннюю часть канала, в частности, треонина разных субъединиц, находящегося в
R6 положении (Xu and Akabas 1996; Zhang et al. 1995a; Zhang et al. 1995b; Zhorov and
Bregestovski 2000). Среди субъединиц ГАМКергических рецепторов грызунов только
ρ2 имеют отличную аминокислоту в этом участке, что делает гомомерные и
гетеромерные ρ2-содержащие рецепторы относительно нечувствительными к
пикротоксину (Greka et al. 1998; Zhang et al. 1995a). При этом, близкородственная ρ1
субъединица содержит треонин в R6 положении и гомомерные рецепторы
чувствительны к пикротоксину (Zhang et al. 2001). Возможно, в нашем исследовании
сниженная чувствительность к пикротоксину связана с наличием в интернейрональном
ГАМКергическом токе компонента, связанного с рецепторами содержащими ρ2
субъединицу. В таком случае, пикротоксин нечувствительные токи должны
фармакологически отличаться от пикротоксин чувствительных. Это связано с тем, что
ρ-содержащие рецепторы (ГАМКС) имеют ряд отличий по отношению к агонистам,
90
антагонистам и аллостерическим модуляторам классических ГАМКА рецепторов.
Показано, что ГАМКС рецепторы принимают участие в ГАМКергической передаче в
ретине, спинном мозге и superior colliculus (Bormann 2000b; Zhang et al. 2001).
Известно, что нативные ГАМКC рецепторы в ретине также обладают сниженной
чувствительностью к пикротоксину и низкой проводимостью одиночных каналов в
сравнении с ГАМКА рецепторами (Feigenspan et al. 1993). Однако, до настоящего
времени не было показано роли ГАМКС рецепторов в гиппокампе, не смотря на
иммуноцитохимические данные, указывающие на наличие в нем РНК, кодирубщей ρсубъединицы (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999; Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al.
1998).
В последнее время стали появляться доказательства того, что, по крайней мере,
рекомбинантные ρ-субъединицы могут образовывать функциональные
ГАМКергические рецепторы с γ2 субъединицами (Pan et al. 2000; Qian and Ripps 1999).
Эти данные указывают на теоретическую возможность определенных отклонений
ГАМКергических токов в гиппокампе от фармакологического профиля токов,
опосредованных классическими ГАМКА рецепторами. Иммуноцитохимические
исследования также показали, что плотность γ2 субъединиц намного выше в
интернейронах поля CA1, чем в пирамидных клетках (Sperk et al. 1997). Вместе взятые,
эти данные указывают на то, что низкая чувствительность к пикротоксину в
интернейронах, может объясняться комбинацией субъединиц ГАМКергических
рецепторов, отличной от комбинации в классических ГАМКА рецепторах.
Приняв во внимание сходство параметров ГАМКергических рецепторов
интернейронов и ГАМКС рецепторов (низкая чувствительность к пикротоксину и
низкая проводимость одиночного канала), мы решили проверить на них эффект
фармакологических агентов, специфичных для ГАМКС рецепторов. Мы провели
91
a
0
-40
Iкомп, пА
Iкомп, пA
-20
-60
-80
-100
-120
0
5
10
*
б
CACA
15
20
160
140
120
100
80
60
40
20
0
ИН
PC
ПК
Время (мин)
Рис. 3.1.3 Генерализованная аппликация САСА (50 µМ) вызывает большие по
амплитуде токи в пирамидных клетках, чем в интернейронах
а, Аппликация CACA (50 µМ), специфического агониста ГАМКС рецепторов,
производит увеличение тока компенсации в режиме фиксации потенциала как в
интернейронах ( ), так и в пирамидных клетках ( ). Причем величина этого тока
значительно выше в пирамидных клетках (ПК) - 153 ± 26 пА (n=5), чем в
интернейронах (ИН) 55 ± 13 пА (n=4), p=0,02, t-тест (б).
аппликацию специфического агониста ГАМКС рецепторов, цис-аминокротоновой
кислоты (CACA). Это вещество активирует рекомбинантные ГАМКС рецепторы с Kd =
74 μМ и приблизительно в 130 раз менее эффективно для активации ГАМКА
рецепторов (Kusama et al. 1993). Необычным оказалось то, что аппликация низкой
концентрации CACA (50 μМ, без пикротоксина) приводила к возникновению
значительных по амплитуде токов как в интернейронах, так и пирамидных клетках
(Рис. 3.1.3а). Неожиданным оказалось то, что величина тока была даже выше в
пирамидных клетках, чем в интернейронах (55 ± 13 пА; n=4 в интернейронах; 153 ± 26
пА; n=5 в пирамидных клетках; p=0,02 t-тест между двумя типами клеток; Рис. 3.1.3б).
Эти результаты указывают на наличие ГАМКC-подобных рецепторов в обоих типах
клеток и даже на более высокое их содержание в пирамидных нейронах. Однако, мы
не стали сразу делать заключение о том, что полученный ток вызван ГАМКС
92
рецепторами. Существует предположение, что CACA может содержать небольшие
количества (до 0,1 %) своего трансэнантиомера ТАСА (транс-аминокротоновой
кислоты) – рацемическая смесь (Johnston 1996). TACA – более мощный агонист
ГАМКА рецепторов, чем CACA (Kusama et al. 1993). Возможно, что ток, который
возникает при аппликации CACA, на самом деле, происходит от активации ГАМКА
рецепторов, опосредованной примесью ТАСА. Чтобы проверить это, мы
апплицировали различные концентрации TACA. Низкая концентрация ТАСА (50 нМ),
соответствующая ее содержанию 0,1 % в CACA (50 µМ) не вызвала никакого тока.
Нам удалось получить сравнительно небольшой ток (24  15 % от тока вызываемого
аппликацией 50 М CACA; n=5; p=0,03; Рис. 3.1.4а) только при концентрации TACA
2,5 М, что соответствует 5 % от использованной концентрации CACA. Даже при
аппликации TACA в концентрации 15 М (33,3 % от САСА) нам не удалось получить
тока, достигающего по величине ток, полученный при аппликации CACA (72  11 %
от CACA тока; n=5; p=0,03).
Таким образом, CACA вызывает значительный по величине ток в концентрации
<1 % от Kd для ГАМКА рецепторов (9.7 мМ) (Kusama et al. 1993) и этот эффект не
связан с содержанием в этом веществе TACA, более мощного агониста ГАМКА
рецепторов.
Другое возможное объяснение возникновения тока при аппликации CACA может
быть связано с ее непрямым действием на ГАМКА рецепторы. Было показано, что
CACA вызывает высвобождение H3-ГАМК в срезах мозга при концентрации
приблизительно в 10 выше, чем EC50 для ГАМКС рецепторов (Chebib and Johnston
1997). Этот эффект был связан с ее влиянием на GAT3 (транспортер ГАМК) и исчезал
при аппликации 100 М -аланина, блокатора данного транспортера.
93
a1
a2
1
0
*
0.8
Iкомп, норм
Iкомп, пA
-5
-10
-15
-20
0.6
*
0.4
0.2
-25
-30
0
0
5
10
15
C50 T2.5 T15
Время (мин)
б1
б2
CACA 50
1
0
0.8
Iкомп,норм
Iкомп, пA
-10
-20
-30
-40
-50
0.6
0.4
0.2
-60
0
0
5
10
15
кон.
ала
Время (мин)
Рис. 3.1.4 Ток, вызываемый аппликацией CACA, связан с прямой активацией
ионотропных ГАМКергических рецепторов
а, Аппликации TACA 2,5 µМ ( ) и 15 µM ( ) производили меньшие по амплитуде
токи, чем CACA 50 µМ ( ). а1, Эффект аппликаций ТАСА и САСА на ток
компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток компенсации до аппликации
агонистов был приравнен к нулю (пунктирная линия) a2, Данные, усредненные по
нескольким клеткам. Ток, полученный при аппликации 2,5 µМ (Т2.5; 5% от
концентрации CACA) составлял 24 ± 15 % (n=5), при аппликации 15 µМ (Т15; 33% от
концентрации CACA) – 72 ± 11 % (n=5) от тока вызываемого CACA 50 µМ (С50). Эти
данные выступают против гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA
(селективного агониста ГАМКС рецепторов) связан с содержанием в веществе
небольших концентраций (<0,1 %) стереоэнантиомера TACA, более эффективного
агониста ГАМКА рецепторов. б, Аппликация CACA 50 µМ в присутствии β-аланина
100 µМ (блокатора GAT3 – транспортера ГАМК) вызывала ток ( ), который не
значительно отличался от CACA-тока при базовых условиях ( ). б1, Эффект
аппликаций на ток компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток
компенсации до добавления β-аланина был приравнен к нулю (верхняя пунктирная
линия). β-аланин сам по себе увеличивал ток компенсации (нижняя пунктирная линия).
б2, Усредненный по нескольким клеткам (n=5) СACA-опосредованный ток,
полученный в присутствии 100 µМ β-аланина (β-ала) составил 98 ± 11 % от тока
вызываемого CACA при базовых условиях (кон.). Эти данные выступают против
гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA связан с гетерообменом
CACA/ГАМК при участии ГАМК транспортера GAT3.
94
Чтобы исключить непрямое действие САСА через ГАМК транспортер, мы провели
ее аппликацию в присутствии 100 М -аланина. -аланин сам по себе приводил к
возникновению входящего тока (Рис. 3.1.4б). Возникновение этого тока может
объясняться как блокадой обратного захвата (uptake) ГАМК, так и прямым
агонистическим действием -аланина на глициновые рецепторы. В этих условиях
аппликация CACA (50 М) также приводила к возникновению тока, незначительно
отличающегося от тока без -аланина (98  11 % - ток в присутствии -аланина от тока
без него; n=5; p=0,8). Таким образом, аппликация CACA активировала
ГАМКергические рецепторы прямо, а не через накопление ГАМК, влияя на
транспортер GAT3. Этот результат указывает на наличие как в интернейронах, так и
пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа тока, чувствительного к агонистам ГАМКС
рецепторов.
Таким образом, нами впервые была продемонстрирована фармакологическая
активность агониста ГАМКС рецепторов в гиппокампе. Однако, в этих экспериментах
нам не удалось объяснить различную чувствительность интернейронов и пирамидных
клеток к пикротоксину. Для ответа на этот вопрос, мы решили проверить, каким
образом ГАМКергические токи в интернейронах и пирамидных клетках будут
модулироваться аллостерическими модуляторами ГАМКА рецепторов.
3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует ГАМКергические токи,
вызываемые аппликацией CACA (50 М)
ГАМКС рецепторы не чувствительны к аллостерическим модуляторам ГАМКА
рецепторов, включая барбитураты (Barnard et al. 1998; Bormann 2000b; Johnston 1996;
Zhang et al. 2001). Если ток, возникающий при аппликации САСА (50 µМ),
опосредован ГАМКС рецепторами, то он не должен быть чувствителен к
95
a
б
интернейрон
CACA 50
CACA 50
контр
пент 10
0
-50
0
-50
пент 100
-100
-100
-150
-150
-200
-200
0
5
10
15
5
10
15
Время (мин)
Время (мин)
в
*
3
Iкомп(CACA), норм
0
Iкомп, пA
Iкомп, пA
пирамидный нейрон
2.5
интернейрон
пирам. нейрон
2
1.5
1
0.5
0
контр
пент 10
пент 100
Рис. 3.1.5 Пентобарбитал потенцирует ток, вызываемый аппликацией CACA в
интернейронах, но не в пирамидных клетках
Аппликация CACA проводилась при базовых условиях (контр., ), при добавлении
10 μМ (пент 10, ) и 100 μМ пентобарбитала (пент 100, ). Добавление пентобарбитала
в суперфузионный раствор приводило к концентрационно-зависимому сдвигу тока
компенсации как в интернейронах (а, данные с одной клетки), так и в пирамидных
клетках (б, данные с одной клетки). Причем, ток в ответ на аппликацию CACA
(агониста ГАМКС рецепторов) усиливался в интернейронах и оставался неизменным в
пирамидных клетках при добавлении пентобарбитала (аллостерического модулятора
ГАМКА рецепторов). в, Гистограмма, показывающая усредненный эффект
пентобарбитала на ток вызываемый CACA: в интернейронах в присутствии 10 μМ
пентобарбитала ток достигал 120  15 %; n=4; p=0,12 от тока при базовых условиях, а
присутствии 100 μМ пентобарбитала 296  38 %; n=4; p=0,008, тогда как в пирамидных
нейронах эти значения были 96  4 %; n=4; p=0,39 и 122  41 %; n=4; p=0,62. Эти
результаты указывают на наличие в пирамидных нейронах ГАМК рецепторов,
фармакологически сходных с ГАМКС, тогда как в интернейронах фармакологический
профиль рецепторов, активируемых CACA, не может быть отнесен ни к одному из
известных типов рецепторов. *: p<0,05
96
пентобарбиталу. Когда мы провели аппликацию CACA в присутствии пентобарбитала
(10 и 100 М), мы не обнаружили в пирамидных клетках изменений в величине САСАтока, по сравнению с током в отсутствие пентобарбитала (96  4 % - ток в присутствии
10 М пентобарбитала от тока в его отсутствие; n=4; p=0,39 и 122  41 % в
присутствии 100 М пентобарбитала; n=4; p=0,62; Рис. 3.1.5б,в). Учитывая, что
пентобарбитал значительно потенцирует ГАМКергические ТПСТ в пирамидных
клетках, можно сделать заключение о наличии в них отдельных популяций ГАМКА и
ГАМКС-подобных рецепторов.
Неожиданно, токи, вызываемые аппликацией CACA в интернейронах, значительно
усиливались в присутствии пентобарбитала (120  15 %; n=4; p=0,12 и 296  38 %; n=4;
p=0,008 при добавлении 10 и 100 М пентобарбитала, соответственно; Рис. 3.1.5а,в).
Таким образом, ГАМКергические рецепторы в интернейронах, которые активируются
САСА, также модулируются пентобарбиталом. Таких фармакологических свойств
ГАМКергических рецепторов никогда прежде показано не было. Чтобы исключить
возможность ошибки, мы решили провести более детальное изучение особенностей
данных токов с использованием других специфических агонистов и антагонистов
ГАМКА и ГАМКС рецепторов.
3.1.5 ТПСТ в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 М
пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к
антагонисту ГАМКС рецепторов
Помимо использования специфического агониста ГАМКС рецепторов для
разделения ГАМКА и ГАМКС, можно воспользоваться селективными антагонистами
данных рецепторов.
97
В представленной работе мы использовали (1,2,5,6-тетрогидропиридин-4ил)метилфосфоновую кислоту (TPMPA) в качестве антагониста ГАМКС рецепторов
(Ragozzino et al. 1996). Мы исследовали эффект 200 М TPMPA на амплитуду
синаптических ТПСТ в интернейронах и пирамидных клетках. Аппликация этого
антагониста производила относительно небольшое снижение ТПСТ вызванных как в
интернейронах, так и в пирамидных клетках (68  8 %; n=7 и 60  2 %; n=5 от базовых
значений в интернейронах и пирамидных клетках, соответственно; p=0,28 t-тест между
типами клеток Рис.3.1.6). Поскольку пикротоксин (100 М) не полностью блокировал
ТПСТ в интернейронах (Рис.3.1.1), мы решили проверить имеет ли остаточный ТПСТ
отличную чувствительность к ТPMPA. Оказалось, что TPMPA в присутствии
пикротоксина подавляет остаточный ТПСТ в значительно большей степени, чем ТПСТ
до добавления пикротоксина (20  6 %; n=4; от базовых значений ТПСТ в присутствии
пикротоксина; p=0,03 t-тест между эффектами TPMPA на ТПСТ с пикротоксином и без
него; Рис.3.1.6).
Этот результат указывает на то, что популяция рецепторов в интернейронах,
которая обладает сниженной чувствительностью к пикротоксину, обладает более
высокой чувствительностью к TPMPA. Такой фармакологический профиль данных
рецепторов указывает на их сходство с ГАМКС рецепторами (McGillem et al. 2000;
Zhang et al. 1995b).
3.1.6 Токи, опосредованные ГАМКергическими рецепторами, в
присутствии 100 М пикротоксина возникают за счет
характерной Cl-/HCO3- ионой проводимости
Исходя из полученных данных, можно заключить, что пикротоксин (100 М)
изолирует в интернейронах популяцию ионотропных ГАМКергических рецепторов с
98
200 пA
50 мс
ампл. ТПСТ, норм
б
a3
a2
a1
50 пA
20 мс
200 пA
50 мс
1
*
0.8
0.6
0.4
0.2
0
ПК
ИН
ИН пикр
[TPMPA], 200 µM
Рис. 3.1.6 ТПСТ в интернейронах, изолированные аппликацией 100 μМ
пикротоксина, более чувствительны к TPMPA
Мы исследовали чувствительность ТПСТ в интернейронах (а1) и пирамидных клетках
(а2) к TPMPA (антагонисту ГАМКС рецепторов). Было показано, что TPMPA 200 μМ
подавляет ТПСТ в отсутствии пикротоксина в обоих типах клеток лишь в небольшой
степени, тогда как ТПСТ, оставшийся в интернейронах после добавления 100 μМ
пикротоксина, подавляется значительно (а3). Оригинальные записи ТПСТ (усреднены
по 10 последовательным ответам) полученные с одного интернейрона и одной
пирамидной клетки. б, Гистограмма, демонстрирующая усредненные данные
полученные с нескольких клеток. TPMPA (200 μМ) подавлял ТПСТ в пирамидных
нейронах (ПК) до 60  2 % (n=5) от базовых значений, в интернейронах в отсутствие
пикротоксина (ИН) до 68  8 % (n=7) и в присутствии 100 μМ пикротоксина (ИН пикр)
до 20  6 % (n=4).
*: p=0,03
99
нетипичными фармакологическими свойствами. По этой причине дальнейшую часть
исследования мы провели в присутствии 100 М пикротоксина. Для того чтобы
проверить соответствует ли ионный состав ТПСТ в присутствии пикротоксина току,
опосредуемому ионотропными ГАМКергическими рецепторами мы построили
зависимости регистрируемого тока от потенциала фиксации (I-V зависимости).
Использование I-V зависимостей позволило нам определить потенциал реверсии
ТПСТ (Рис. 3.1.7а). Традиционно ГАМКергический ТПСТ рассматривается как ток,
состоящий из анионов Cl- и HCO3-. Мы рассчитали ECl-/HCO3- по уравнению Нернста,
исходя из содержания этих ионов во внеклеточном и внутриклеточном растворах. При
использовании внутриклеточного раствора с высоким содержанием ионов хлора (см.
Материалы и методы: внутриклеточный раствор на основе CsCl) ТПСТ меняли
направление при –0,2  5 мВ (n=6), что соответствует ECl-/HCO3- (-1,15 мВ) (Рис. 3.1.7а1).
При использовании внутриклеточного раствора с низким содержанием ионов хлора
(см. Материалы и методы: внутриклеточный раствор на основе Cs глюконата)
потенциал реверсии ТПСТ смещался в соответствии с изменением концентрации
данных ионов в область более негативных значений (Рис. 3.1.7а2). Ионтофорез ГАМК
(100 мМ) и CACA (100 мМ) также вызывал токи с потенциалом реверсии
соответствующим рассчетному ECl-/HCO3- (Рис. 3.1.7 б,в). Кроме этого, характер I-V
зависимостей ионтофоретических токов напоминал I-V кривую, полученную для
ТПСТ при использовании идентичного внутриклеточного раствора. Этот факт
свидетельствует в пользу того, что синаптические и ионтофоретические токи
опосредованы одинаковыми ионами и, вероятно, одинаковыми рецепторами. Это
наблюдение, позволяет в дальнейшем рассматривать данные, полученные по ТПСТ и
по ионтофоретическим токам вместе, для описания свойств одних и тех же
рецепторов.
100
a1
a2
ПСТ, норм
1
1
0.5
0.5
20 пA
20 мс
Vфикс,мВ
-80
-40
20 пA
20 мс
ПСТ, норм
40
80
Vфикс, мВ
-80
-40
40
-0.5
-0.5
-1
-1
б
в
1
ионтофорез ГАМК 200 мM
1
ПСТ, пА
80
ПСТ, норм
ионтофорез CACA 200 мM
0.5
0.5
Vфикс, мВ
Vфикс, мВ
-80
-80
100 пA
2с
-40
40
-0.5
80
-40
40
80
-0.5
50 пA
1с
-1
-1
Рис. 3.1.7 ТПСТ и токи в ответ на ионтофорез ГАМК и CACA в присутствии
пикротоксина в интернейронах опосредованы Cl-/HCO3а, ТПСТ в интернейронах полученные в присутствии D-APV (50 μM), NBQX (20 μM),
CGP52432 (5 M) и пикротоксина (100 µМ) при различных потенциалах фиксации с
использованием внутриклеточного раствора с высоким (а1, n=6) и низким (а2, n=4)
содержанием ионов хлора. Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона
для каждого раствора, показаны слева от ток-потенциал (I-V) зависимостей. Данные
для I-V зависимостей усреднены по нескольким клеткам, в которых ТПСТ
нормировались к ТПСТ при потенциале фиксации 80 мВ. Теоретически полученное по
уравнению Нернста значение ECl-HCO3- обозначено на графиках крестиком. Потенциал
реверсии, полученный в данных экспериментах, был близок к расчетному потенциалу
тока, опосредованного Cl-/HCO3-, и изменялся в соответствии с содержанием ионов
хлора во внутриклеточном растворе. Токи в ответ на ионтофоретическую аппликацию
200 мМ ГАМК (б, n=4) и 200 мМ CACA (в, n=4) в тех же экспериментальных условиях
при использовании внутриклеточного раствора с высоким содержанием ионов хлора в
интернейронах при различных потенциалах фиксации изменялись сходным образом с
ТПСТ, а их потенциал реверсии соответствовал Cl-/HCO3- току. Таким образом,
данные результаты свидетельствуют в пользу того, что как синаптически
высвобождаемая ГАМК, так и ионтофоретические апплицированные агонисты (ГАМК
и CACA) активирует одни и те же устойчивые к пикротоксину ГАМКергические
рецепторы, обладающие Cl-/HCO3- проводимостью. Разбросы указывают С.О.С.
101
3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов ГАМК А рецепторов на
устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные
ГАМКергическими рецепторами
В предыдущем разделе мы показали, что ток, вызываемый в интернейронах
генерализованной аппликацией CACA, чувствителен к пентобарбиталу. Мы решили
проверить, каким образом аллостерические модуляторы ГАМКА рецепторов, такие как
барбитураты и бензодиазепины, будут влиять на изолированные пикротоксином ТПСТ
и ионтофоретические токи, вызываемые ГАМК и CACA. Если устойчивые к
пикротоксину токи опосредованы ГАМКС рецепторами, то они не будут
чувствительны к этим модуляторам.
Все три тока были потенцированы при добавлении 100 М пентобарбитала: ТПСТ
до 478  76 % (n=4; p=0,015; Рис. 3.1.8а); ионтофоретический ГАМК ток до 220  14 %
(n=4; p=0,004; Рис. 3.1.8б) и ионтофоретический CACA ток до 288  28 % (n=5;
p=0,003; Рис. 3.1.8в). Эффект пентобарбитала на ТПСТ также состоял в увеличении
константы затухания токов (затухания: 500 ± 67 % от базовых значений; n=4; p=0,009;
Рис. 3.1.8а2), что указывает на увеличение времени открытого состояния каналов
ГАМКергических рецепторов (Macdonald and Kelly 1994).
Когда мы провели исследование чувствительности ТПСТ и ионтофоретических
токов к бензодиазепинам, выяснилось, что золпидем (0,2 М) производит
сравнительно небольшой эффект на амплитуду ТПСТ, устойчивого к пикротоксину, по
сравнению с эффектом на амплитуду ТПСТ без пикротоксина (ТПСТ при аппликации
золпидема был 108  12 % от базовых значений в присутствии пикротоксина и
158  8 % без пикротоксина; p=0,002; Рис. 3.1.9). Эти данные указывают на то, что
остаточный ТПСТ (в присутствии пикротоксина) относительно нечувствителен к
102
100 пA
50 мс
ампл. ТПСТ, норм
a3
ампл ТПСТ. норм
a2
a1
пент
1
0.5
контр
0.1
0
10
20
Время (мс)
пент
5
4
3
2
1
0
10
20
30
40
20
30
40
б
ионт. ГАМК ток, норм
200 пA
5с
пент
2.5
2
1.5
1
0.5
0
10
в
50 пA
5с
ионт. CACA ток, норм
пент
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
10
20
30
40
Время (мин)
Рис. 3.1.8 Пентобарбитал (100 µМ) приводит к увеличению ТПСТ и
ионтофоретических ГАМК и CACA токов в присутствии пикротоксина
(100 µМ)
(см. подписи на следующей странице)
103
а, Эффект пентобарбитала (аллостерического модулятора ГАМКА рецепторов, 100 µМ)
на ТПСТ записанные в присутствии D-APV (50 μM), NBQX (20 μM), CGP52432 (5 M)
и пикротоксина (100 µМ). а1, Оригинальные записи (усреднение по 10
последовательным регистрациям), полученные с одного интернейрона в ответ на
синаптическую стимуляцию до (жирная линия) и во время (тонкая линия) аппликации
пентобарбитала. а2, Пентобарбитал увеличивает константу затухания ТПСТ (данные
получены по тем же токам что и на а1). Нормированные по амплитуде ТПСТ фазы
затухания тока показаны до (контр) и во время (пент) добавления пентобарбитала в
полулогарифмических координатах. Зависимости тока в фазе затухания от времени
были моноэкспоненциально аппроксимированы: τзатух(пент)=500 ± 67 % от
τзатух(контр); n=4; p=0,009 а3, Амплитуда ТПСТ (среднее ± С.О.С) была нормирована к
средней амплитуде ТПСТ перед добавлением пентобарбитала. Пентобарбитал
значительно увеличивал амплитуду ТПСТ (478 ± 76 % от базовых значений ТПСТ в
присутствии пикротоксина; n=4; p=0,015), так же как и амплитуду токов на ионтофорез
200 мМ ГАМК (220 ± 14 % от базовых значений ГАМК тока в присутствии
пикротоксина; n=4; p=0,004; б) и 200 мМ CACA (288 ± 28 % от базовых значений
CACA тока в присутствии пикротоксина; n=5; p=0,003; в). Ионтофоретические токи
были получены в присутствии тех же агонистов и нормированы таким же образом, что
и ТПСТ. Оригинальные записи (каждая усреднена по 10 последовательным
регистрациям), представленные над графиками, получены до, во время и после
добавления пентобарбитала (пент, 100 µМ) с одного интернейрона при ионтофорезе
ГАМК и с одного при ионтофорезе CACA. Разбросы указывают С.О.С.
бензодиазепинам, что является характерной чертой ГАМКС рецепторов. С другой
стороны, известно, что ГАМКА рецепторы, в которых отсутствует α1 субъединица,
также менее чувствительны к бензодиазепинам (Thomson et al. 2000). Таким образом,
низкая чувствительность к золпидему может быть объяснена отсутствием данной
субъединицы в ГАМКергических рецепторах, слабо чувствительных к пикротоксину.
Еще одним объяснением может быть зависимость эффекта золпидема от занятости
рецепторов агонистом. Чем выше занятость ГАМКергического рецептора
синаптически высвобождаемой ГАМК, тем эффект золпидема меньше (Hajos et al.
2000; Perrais and Ropert 1999). Можно предположить, что ток, изолированный
аппликацией пикротоксина, опосредован рецепторами с более высокой средней
занятостью агонистом, чем средняя занятость чувствительных к пикротоксину
ГАМКергических рецепторов, опосредующих ТПСТ. Это различие в занятости
рецепторов агонистом может быть объяснено их локализацией на разном расстоянии
104
100 пA
50 мс
ампл. ТПСТ, норм
базовый ТПСТ
a
1
злпм
0.5
контр
0.1
0
10
20
30
Время (мин)
б
ТПСТ в пикротоксине
ампл ТПСТ, норм
50 пA
50 мс
1
злпм
0.5
контр
0.1
0
20
Время (мин)
2
*
2
ампл ТПСТ, норм
в
затух, норм
10
1.5
1
0.5
0
*
1.5
1
0.5
0
базов
пикр
базов
пикр
Рис. 3.1.9 ТПСТ в интернейронах, изолированные аппликацией 100 μМ
пикротоксина, менее чувствительны к золпидему
Мы исследовали эффект золпидема (аллостерического модулятора ГАМКА
рецепторов, 200 нМ) на ТПСТ в отсутствие пикротоксина (D-APV (50 μM), NBQX
(20 μM) и CGP52432 (5 M) были добавлены) и в присутствии 100 µМ этого
антагониста. а, Оригинальные записи (каждая среднее 10 последовательных
регистраций), полученные с одного интернейрона в ответ на синаптическую
стимуляцию до (жирная линия) и во время (тонкая линия) аппликации золпидема без
пикротоксина. Золпидем вызывал значительное увеличение, как амплитуды, так и
константы затухания (τзатух) этих ТПСТ. Нормированные фазы затухания в
полулогарифмических координатах до (контр) и во время (злпм) аппликации
золпидема показаны справа от оригинальных записей, из которых они получены.
Зависимости тока в фазе затухания от времени были моноэкспоненциально
аппроксимированы. б, Оригинальные записи (каждая среднее 10 последовательных
регистраций) в ответ на синаптическую стимуляцию до (жирная линия) и во время
105
(тонкая линия) аппликации золпидема в присутствии тех же антагонистов как в а и,
дополнительно, пикротоксина (100 µМ). ТПСТ, изолированный аппликацией 100 μМ
пикротоксина, подвергался эффекту золпидема в меньшей степени, чем базовый. Было
показано меньшее увеличение константы затухания тока и отсутствие значительных
изменений в амплитуде ТПСТ. в, Данные полученные в нескольких клетках обобщены
в виде гистограмм изменения констант затухания и амплитуд базового (базов) и
изолированного добавлением пикротоксина (пикр) ТПСТ при аппликации золпидема
нормированных к средним значениям токов перед этой аппликацией.
от места высвобождения медиатора или локализацией в разных синапсах, где исходно
наблюдается большая или меньшая занятость рецепторов. Таким образом, данные по
эффекту золпидема не могут служить доказательством участия ρ-субъединиц в
регистрируемых токах, хотя они четко указывают на гетерогенность популяции
ионотропных ГАМКергических рецепторов в интернейронах.
3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов ГАМКА и ГАМКС
рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи,
опосредованные ГАМКергическими рецепторами
Для подтверждения того, что ионотропные ГАМКергические рецепторы в
интернейронах str.radiatum поля CA1 срезов гиппокампа обладают свойствами как
ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов, мы решили проверить эффект специфических
антагонистов этих двух типов рецепторов на ТПСТ и ионтофоретически вызываемые
токи в присутствии пикротоксина (100 μМ). В качестве антагониста ГАМКА
рецепторов был выбран бикукуллин (10 μМ), а в качестве антагониста ГАМКС
рецепторов - TPMPA (200 μМ). Если эти токи гетерогенны, то компонент,
опосредуемый ГАМКС рецепторами, будет подавляться TPMPA, но будет
нечувствительным к бикукуллину. Компонент, опосредованный ГАМКА рецепторами,
должен подавляться бикукуллином, но быть нечувствительным к TPMPA. На рисунке
106
a1
a2
50 пA
20 мс
ТПСТ (пA)
200
TPMPA
120
150
80
100
40
50
0
0
ионт ГАМК ток (пА)
б1
10
20
30
40
10
б2
20
200
200
150
150
50
100
100
50
50
0
40
50
40
50
бикукул
0
10
20
30
40
10
в2
20
100
80
60
40
20
0
TPMPA
10
г1
160.0
бикукул
100
80
60
40
20
0
20
30
40
10
20
30
г2
50 пA
3с
50 пA
3с
бикукул
160.0
TPMPA
120.0
120.0
80.0
80.0
40.0
40.0
0.0
0.0
10
д
30
40 пA
2с
20
30
Время (мин)
100
е
ТПСТ
ГАМК
CACA
изокув азин
80
60
40
20
0
TPMPA
10
40
бикукуллин
ток при бикукуллине (% от контр)
ионт. CACA ток (пА)
40
100 пA
5с
TPMPA
40 пA
2с
ионт изокувазин ток (пА)
30
100 пA
5с
в1
ток (% от контроля)
50 пA
20 мс
бикукул
20
30
40
Время (мин)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10 20 30 40 50 60
ток при TPMPA (% от контр)
Рис. 3.1.10 ТПСТ и ионтофоретические ГАМК-, CACA- и изогувазин -токи в
интернейронах, в присутствии 100 μМ пикротоксина, подавляются как
антагонистом ГАМКС рецепторов TPMPA, так и ГАМКА – бикукуллином
(см. подписи на следующей странице)
107
Мы сравнили эффекты специфических антагонистов ГАМКС и ГАМКА рецепторов:
TPMPA (200 µМ; буквы с индексом 1) и бикукуллина (10 µМ; буквы с индексом 2),
соответственно. ТПСТ (а1, а2), ионтофоретические токи в ответ на аппликацию ГАМК
(б1, б2), CACA (в1, в2) и изогувазин (г1, г2), полученные в присутствии пикротоксина
100 µМ, подавлялись в значительной степени обоими антагонистами. Данные
показаны для одного интернейрона в каждом случае. Оригинальные токи (в каждом
случае усреднение по 10 последовательным регистрациям) расположены над
графиками динамики ответов и показывают ток до, во время и после добавления
антагониста. д, Усредненные ответы, полученные по нескольким клеткам
(статистические данные представлены в таблице 3.1.2). е, Относительная степень
подавления ответов TPMPA и бикукуллином была сходной для всех четырех типов
токов и могла быть линейно аппроксимирована.
3.1.10а,д показано, что ТПСТ в интернейронах, регистрируемые в присутствии
пикротоксина, подавляются в значительной степени обоими антагонистами (23 ± 7 %
от базовых значений; n=5; p=0,01 при аппликации TPMPA и 3 ± 3 %; n=4; p=0,002 при
аппликации бикукуллина). Столь значительное подавление синаптических токов
обоими антагонистами указывает на то, что они не могут состоять частично из ГАМКА
и ГАМКС компонентов. Этот результат свидетельствует в пользу существования одной
популяции рецепторов, обладающей свойствами обоих типов рецепторов. В
подтверждение этому, токи, полученные в ответ на ионтофорез ГАМК или САСА,
также в значительной степени подавлялись обоими антагонистами и (для ГАМК:
54 ± 3 % от базовых значений; n=4; p=0,02 при аппликации TPMPA и 15 ± 4 %; n=7;
p=0,008 при аппликации бикукуллина; Рис. 3.1.10б,д; для САСА: 32 ± 4 % от базовых
значений; n=4; p=0,015 при аппликации TPMPA; 8 ± 1 %; n=4; p=0,0007 при
аппликации бикукуллина; Рис. 3.1.10в,д). Однако, ГАМК является эндогенным
агонистом как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов. Для подтверждения
фармакологического профиля ГАМКА рецепторов, мы использовали для ионтофореза
специфический агонист этих рецепторов – изогувазин (100 мМ) (Kusama et al. 1993;
Woodward et al. 1993). Ток, вызываемый изогувазином, также подавлялся как TPMPA,
108
Таблица 3.1.2 Эффект TPMPA и бикукуллина на ГАМКергические токи в
интернейронах в присутствии пикротоксина (% от контроля)
ТПСТ
ГАМК ионт.
CACA ионт.
изогувазин ионт.
TPMPA, %
23 ± 7
54 ± 3
32 ± 4
45 ± 8
(n)
4
4
4
5
бикукуллин, % (n)
3±3
5
15 ± 4
7
8 ± 0.5
4
12 ± 2
5
отношение
6.96
3.67
4.23
3.78
так и бикукуллином (45 ± 8 % от базовых значений; n=5; p=0,02 при аппликации
TPMPA и 12 ± 2 %; n=5; p=0,017 при аппликации бикукуллина; Рис. 3.1.10г,д).
Относительная степень подавления всех вышеописанных токов (соотношение
эффектов TPMPA/бикукуллин) была сходной (Рис. 3.1.10е и Таблица 3.1.2), что
говорит о сходстве их природы. Таким образом, полученные данные указывают на
наличие в интернейронах поля СА1 гиппокампа одной популяции ионотропных
ГАМКергических рецепторов, но обладающей свойствами двух различных типов.
3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие
нетипичными фармакологическими свойствами
Обобщая данные проведенных экспериментов можно сказать следующее.
Аппликация высокой концентрации пикротоксина (100 μМ) не достаточна, чтобы
полностью подавить ГАМКергические токи в интернейронах. В пирамидных клетках
эта концентрация пикротоксина полностью блокировала ТПСТ. Пикротоксиннечувствительный ток в интернейронах мог быть получен как при синаптической
стимуляции (ТПСТ), так при генерализованной аппликации или ионтофорезе
различных антагонистов, специфично используемых для активации или ГАМКА, или
ГАМКС рецепторов. Использование антагонистов ГАМКА и ГАМКС рецепторов не
показало фармакологического различия между этими токами.
109
Рис. 3.1.11 Фармакологический профиль ионотропных ГАМКергических
рецепторов, опосредующих пикротоксин-нечувствительные ТПСТ в
интернейронах str.radiatum поля СА1 гиппокампа
Схема, иллюстрирующая три различных типа ГАМКергических рецепторов в
гиппокампе в зависимости от их фармакологических свойств. ГАМКергические
рецепторы в интернейронах str.radiatum поля СА1 гиппокампа, наличие которых
показано в данной работе (показаны красным цветом, ГАМКА/С), совмещают в себе
свойства как ГАМКА (показаны синим), так и ГАМКС (показаны зеленым) рецепторов.
Кроме того, они обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину, в отличие
от классических ГАМКА рецепторов и большинства рецепторов группы ГАМКС.
Средняя проводимость одиночного канала ГАМКергических рецепторов в
интернейронах меньше средней проводимости в пирамидных нейронах. Вероятное
объяснение этому заключается в том, что в интернейронах экспрессируется необычная
популяция пикротоксин-нечувствительных рецепторов с низкой проводимостью
одиночного канала и с фармакологическими свойствами характерными для обоих
типов (ГАМКА и ГАМКС) рецепторов (Рис. 3.1.11).
110
Однако, прежде чем сделать это заключение мы рассматривали и другие гипотезы.
Мы рассматривали вероятности того, что в интернейронах могут быть ГАМКА,
ГАМКС или смесь этих типов рецепторов. Однако, эти объяснения оказались
неудовлетворительными по следующим причинам:
1. Результаты нельзя объяснить существованием типичных ГАМКА рецепторов, так
как пикротоксин не подавлял ни ТПСТ, ни токи в ответ на ионтофорез ГАМК,
CACA или изогувазина, а все известные типы ГАМКА рецепторов крайне
чувствительны к пикротоксину (Macdonald and Kelly 1994; Newland and Cull-Candy
1992). Полученные данные также противоречат предположению о том, что
типичные ГАМКА рецепторы участвуют в токе в ответ на ионтофорез изогувазина,
специфического агониста этих рецепторов. Считается, что блокада ГАМКА токов
пикротоксином должна быть активность-зависимой, но мы не наблюдали
тенденции снижения остаточного ТПСТ в течение длительных экспериментов. В
дополнение ко всему, активация одних только ГАМКА рецепторов не способна
объяснить возникновение тока в ответ на аппликацию 50 μМ CACA.
2. Результаты нельзя также объяснить только наличием типичных ГАМКС
рецепторов. Антагонист этих рецепторов TPMPA в сравнительно высокой
концентрации (200 μМ) не подавлял полностью ни пикротоксин нечувствительные
ТПСТ, ни ток на ионтофоретическую аппликацию CACA. При этом концентрация
TPMPA была приблизительно в 100 раз выше, чем IC50 для ГАМКС рецепторов
(Ragozzino et al. 1996).
3. Наконец, результаты нельзя объяснить смесью ГАМКА и ГАМКС рецепторов. Ток
вызываемый при аппликации или ионтофорезе CACA потенцировался
пентобарбиталом, который не действует на типичные ГАМКС рецепторы (Barnard
et al. 1998; Bormann 2000b; Johnston 1996).
111
Другие данные также указывают на наличие специфического типа ионотропных
ГАМКергических рецепторов в интернейронах. TPMPA, антагонист ГАМКС
рецепторов, значительно снижал пикротоксин нечувствительные токи в ответ на
ионтофорез изогувазина, агониста ГАМКА рецепторов. И наоборот, бикукуллин,
антагонист ГАМКА рецепторов, подавлял ответы на ионтофорез CACA, агониста
ГАМКС рецепторов. К сожалению, эти результаты, взятые по отдельности не
достаточно доказательны по следующим причинам. Не смотря на то, что изогувазин
был описан, как мощный и селективный агонист ГАМКА рецепторов (Barnard et al.
1998), он может быть и частичным агонистом ГАМКС рецепторов с Kd ~ 120 μМ
(Chebib et al. 1998). Поскольку концентрация изогувазина, достигаемая при
ионтофорезе, неизвестна, мы не можем исключить активацию ГАМКС рецепторов.
Кроме того, концентрация TPMPA была приблизительно 63 % от IC50 для
рекомбинантных или нативных ГАМКА рецепторов (~ 320 μМ) (Jones et al. 2001;
Ragozzino et al. 1996). Таким образом, эффект TPMPA на ток вызываемый
ионтофорезом изогувазина сам по себе может быть объяснен недостаточной
селективностью агониста, антагониста или обоих вместе. Похожая ситуация
наблюдается и с ионтофорезом CACA. Если при ионтофорезе достигается очень
высокая концентрация агониста, он может активировать ГАМКА рецепторы, которые
не полностью блокированы пикротоксином, что послужит объяснением эффекта на
них бикукуллина. Тем не менее, если соотнести эффективность бикукуллина с
эффективностью TPMPA, то обнаруживается, что у токов, вызванных изогувазином и
у токов, вызванных ионтофорезом CACA, это соотношение примерно одинаково. Это
говорит о том, что специфические антагонисты ГАМКА и ГАМКС рецепторов
одинаково эффективны в подавлении токов вызываемых специфическими агонистами
ГАМКА и ГАМКС рецепторов. Отсутствие специфичности антагонистов
112
распространяется также на ТПСТ и токи, вызываемые ионтофорезом ГАМК. Они
показывают сходную относительную чувствительность к TPMPA/бикукуллину, как и
ответы на изогувазин или CACA.
Данные результаты указывают на наличие в гиппокампальных интернейронах
ГАМКергических рецепторов с новым фармакологическим профилем (Рис. 3.1.11),
которые обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину, нечувствительны к
золпидему и активируются ГАМК, CACA и изогувазином. В них наблюдается сходная
чувствительность к бикукуллину и пентобарбиталу, как в ГАМКА рецепторах. При
этом они, хотя и частично, чувствительны к TPMPA, как ГАМКС рецепторы.
В целом, ионотропные ГАМКергические рецепторы в интернейронах не
гомогенны. В отсутствие пикротоксина они менее чувствительны к TPMPA и,
наоборот, более чувствительны к золпидему. Очевидным объяснением данному
феномену является наличие в интернейронах как описанного в данной работе подтипа
ионотропных ГАМК рецепторов, так и класических ГАМКА рецепторов.
3.1.10 Нетипичные ГАМКергические рецепторы и традиционные
типы рецепторов (ГАМКА и ГАМКС)
В отличие от интернейронов, ГАМКергические ТПСТ в пирамидных нейронах
практически полностью блокируются при аппликации 100 μМ пикротоксина. Однако,
аппликация 50 μМ CACA также вызывает значительный ток в этих клетках. Данный
ток, не чувствителен к пентобарбиталу. Эти данные указывают на наличие обычных
ГАМКС рецепторов в пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Наличие
ГАМКергических рецепторов с необычными фармакологическим свойствами в мозге
было показано и раньше. Токи, фармакологически сходные с токами,
опосредованными ГАМКС рецепторами, были продемонстрированы в пирамидных
нейронах развивающегося гиппокампа (Cherubini et al. 1998; Martina et al. 1995; Strata
113
and Cherubini 1994). В этих клетках бикукуллин не полностью подавлял
ГАМКергические ТПСТ. Это указывает на наличие рецепторов, обладающих
некоторыми свойствами ГАМКС. В другом случае, ГАМКергические рецепторы с
нетипичными фармакологическими свойствами были найдены в пирамидных нейронах
миндалины (Delaney and Sah 1999; Delaney and Sah 2001). Однако, эти рецепторы
отличаются от тех, что описаны в данной работе: они нечувствительны к бикукуллину
и барбитуратам, а блокируются TPMPA и 1,4-бензодиазепинами. Delaney и Sah (1999,
2001) охарактеризовали эти рецепторы как "ГАМКС-подобные".
Мы не исключаем существования в гиппокампе ГАМКергических рецепторов
имеющих фармакологический профиль ГАМКС рецепторов. В наших экспериментах
низкая концентрация CACA вызывала значительный ток в пирамидных нейронах,
который был нечувствителен к пентобарбиталу. Важно заметить, что величина этого,
CACA-опосредованного тока, была выше в пирамидных клетках, чем в интернейронах.
Этот результат указывает на то, что в пирамидных клетках существует популяция
ГАМКергических рецепторов, более напоминающих типичные ГАМКС рецепторы и,
по этой причине, более чувствительных к специфическому агонисту, чем нетипичные
рецепторы описанные в интернейронах.
Описание в представленной работе ГАМКергических рецепторов с нетипичными
фармакологическими свойствами, общими для ГАМКА и ГАМКС, является связующим
звеном между филогенетически различными типами рецепторов. Это является
предпосылкой для пересмотра или уточнения классификации ГАМКергических
рецепторов. Однако, для того чтобы это сделать, необходимо точно определить
субъединичный состав фармакологически охарактеризованного рецептора и найти его
специфические агонисты и антагонисты.
114
3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных
ГАМКергических рецепторов в интернейронах
На чем может быть основано наличие нетипичных фармакологических свойств
ГАМКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах? Для того чтобы
ответить на этот вопрос необходимо выяснить состав субъединиц ГАМКергических
рецепторов, обладающих сниженной чувствительностью к пикротоксину.
Данные о том, что средняя проводимость одиночного канала ГАМКергических
рецепторов в интернейронах ниже, чем в пирамидных клетках (~22 пС и ~33 пС),
указывают на наличие различий в аминокислотной последовательности хотя бы в
одном М2 домене, находящемся внутри канала. Хотя размер поры канала ГАМКА и
ГАМКС рецепторов считается одинаковым, проводимость одиночного канала ГАМКС
рецепторов значительно ниже (~1-5 пС и ~30 пС) (Feigenspan and Bormann 1994;
Wotring et al. 1999; Zhang et al. 2001). Полученная в наших экспериментах средняя
проводимость одиночного канала ионотропных ГАМКергических рецепторов в
интернейронах ниже, чем ГАМКА рецепторов, но выше, чем ГАМКС. К сожалению,
рассчитанная нами проводимость представляет собой средневзвешенную величину для
гетерогенной популяции рецепторов. Поскольку, пикротоксин был намного более
эффективен в экспериментах с мембранными пейчами в конфигурации outside-out, мы
не смогли зарегистрировать никакого тока даже при низких его концентрациях (1 µМ).
Таким образом, нам не удалось проверить, связан ли нетипичный ГАМКергический
ток с более низкой проводимостью одиночных каналов, характерной для ГАМКС
рецепторов.
Чувствительность к пикротоксину рецепторов, состоящих из -субъединиц, у крыс
определяется двумя аминокислотными остатками в положении 310 и 314 (Wang et al.
1995; Zhang et al. 2001; Zhang et al. 1995a). Например, наличие пролина в позиции 310
115
снижает чувствительность гомомерных 1-содержащих ГАМКергических рецепторов к
этому антагонисту. В дополнение ко всему, пикротоксин является для таких
рецепторов смешанным (отчасти конкурентным, отчасти неконкурентным)
антагонистом, тогда как для классических ГАМКА рецепторов это только
неконкурентный антагонист. Что касается аминокислотного остатка в положении 314,
то в 1 и 2 человека и 1 грызунов им является треонин. Однако, в 2 крысы и мыши
это основание метионин, что делает 2-содержащие рецепторы грызунов крайне
нечувствительными к пикротоксину (Greka et al. 1998). Хотя, 2-субъединица морской
свинки не была секвенирована, на основании филогенетической гомологии грызунов,
можно предположить, что 2-содержащие рецепторы этого животного будут также
слабо чувствительны к пикротоксину.
Можно предположить, что  субъединицы в ассоциации субъединицами ГАМКА
рецептора (например, α, β и γ) определяют нетипичные фармакологические свойства
ионотропных ГАМКергических рецепторов в интернейронах. Однако, возможность
существования таких комбинаций субъединиц в ГАМКергических рецепторах до
настоящего времени не известна (Enz 2001). Тем не менее, была показана возможность
образования рецепторов из комбинации  и 2 субъединиц в ооцитах (Pan et al. 2000;
Qian and Ripps 1999), но другие комбинации продемонстрированы не были. Однако,
даже ситуация нахождения двух 2 субъединиц по краям , дает возможность
присоединения других субъединиц, характерных для ГАМКА (например,  и/или ), со
стороны 2.
Нужно отметить, что РНК -субъединиц широко распостранена в ЦНС и
обнаружена даже в тех областях мозга (включая гиппокамп), в которых, как
предполагалось, отсутствуют ГАМКС рецепторы (Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al.
1998). В данной работе мы показали, что ГАМКергические токи в пирамидных
116
нейронах поля СА1 фармакологически сходны с токами, опосредованными ГАМКС
рецепторами. Тем не менее, осталось не ясным, существуют ли ГАМКС рецепторы в
интернейронах в чистом виде, отличном от нетипичной формы ГАМКергических
рецепторов, описанной в данной работе. Ответ на этот вопрос требует проведения
дополнительных фармакологических и иммуноцитохимических исследований,
которые выходили за рамки стоящей перед нами задачи. В любом случае, если
промежуточная (ГАМКА/ГАМКС) форма ионотропных ГАМКергических рецепторов
существует, оценка сравнительного вклада различных типов ГАМКергических
рецепторов в синаптические токи является затруднительной. Это связано с тем, что,
используя имеющиеся фармакологические вещества, нетипичные рецепторы будут
приписываться то к ГАМКА, то к ГАМКС. Возможным выходом из данной ситуации
является разработка специфических антагонистов этих рецепторов. Сходные
трудности могут возникнуть и при попытке иммуноцитохимической идентификации
нетипичных рецепторов, если не буду разработаны специфичные или
высокоразрешающие методы.
3.1.12 Заключение
Таким образом, в данном разделе работы было показано:
1.
ГАМКергические ТПСТ в интернейронах менее чувствительны к пикротоксину, а
ГАМКергические рецепторы обладают более низкой средней проводимостью
одиночного канала, чем в пирамидных клетках.
2.
CACA, агонист ГАМКС рецепторов, вызывает ток как в интернейронах, так и
пирамидных клетках. В пирамидных нейронах ток, вызываемый CACA,
нечувствителен к пентобарбиталу, что характерно для классических ГАМКС
рецепторов. В интернейронах пентобарбитал значительно усиливает этот ток, что
указывает на наличие в них нетипичных ГАМКергических рецепторов.
117
3.
Аппликация 100 μМ пикротоксина фармакологически изолирует популяцию
ГАМКергических рецепторов в интернейронах, которая обладает
фармакологическим свойствами (чувствительность к агонистам, антагонистам и
аллостерическим модуляторам) как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов. Эти
рецепторы обладают Cl-/HCO3- проводимостью, характерной для ионотропных
типичных ГАМКергических рецепторов.
Таким образом, нам удалось показать наличие в интернейронах str.radiatum, но не
пирамидных клетках поля CA1 гиппокампа, ГАМКергических рецепторов,
фармакологически отличных от всех на настоящее время известных рецепторов. Они
сочетают в себе свойства как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов, при этом обладают
сниженной чувствительностью к пикротоксину.
Различие в фармакологических свойствах ГАМКергических рецепторов в
интернейронах и пирамидных клетках предоставляет возможность поиска веществ,
специфически воздействующих на ту или иную популяцию клеток в гиппокампе.
Селективное изменение торможения тормозных или возбуждающих нейронов может
быть использовано для изменения возбудимости всей структуры в целом и лежать в
основе разработки антиэпилептических препаратов.
118
3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет
ГАМКергического тонического торможения
Тоническое торможение представляет собой форму фонового торможения за счет
постоянной активации внесинаптических ГАМКергических рецепторов (Soltesz and
Nusser 2001). ГАМКергическое тоническое торможение является важным механизмом
регуляции возбудимости нейрональной сети. В представленной работе мы исследовали
механизмы этого феномена в интернейронах и пирамидных клетках гиппокампа.
3.2.1 Базовый тонический ГАМКергический ток специфичен для
интернейронов, но не пирамидных клеток
Мы произвели записи токов в режиме фиксации потенциала с интернейронов
str.radiatum и пирамидных клеток поля СА1. Ток, опосредованный ионотропными
ГАМКергическими рецепторами, был фармакологически изолирован при блокаде
AMPA/каинатных, NMDA, ГАМКВ и метаботропных группы III рецепторов. Для этого
в раствор Рингера были добавлены NBQX (50 µМ), DL-2-амино-5-фосфоновалерат
(APV, 100 µМ), CGP52432 (5 µМ) и α-метилсерин-О-фосфат (MSOP, 100 µМ),
соответственно. Тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими
рецепторами, регистрировался как часть тока компенсации, которая подавлялась
высокой концентрацией пикротоксина (100 µМ). Аппликация пикротоксина в этой
концентрации подавляла спонтанные ГАМКергические ТПСТ (сТПСТ) как в
интернейронах, так и в пирамидных клетках. Однако, снижение тока компенсации при
этом наблюдалось только в интернейронах, но не пирамидных клетках (69 ± 10 % от
базовых значений; n=5; p=0,04 в интернейронах и 103 ± 3 % от базовых значений; n=4;
119
контроль
пикротоксин
100 M
ИН
100 пA
0.5 с
ПК
100 пA
0.5 с
б
Iкомп % от контр.
а
120
100
80
60
40
*
20
0
ИН
ПК
Рис. 3.2.1 Пикротоксин подавляет сТПСТ как в интернейронах, так и
пирамидных клетках
а, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (ИН) и одной
пирамидной клетки (ПК) до и после аппликации 100 µМ пикротоксина. Пикротоксин
полностью подавлял спонтанные ТПСТ как в интернейронах, так и пирамидных
клетках. Снижение тока компенсации при аппликации этого вещества происходило
только в интернейронах. б, Усредненные данные по эффекту 100 µМ пикротоксина,
полученные в нескольких экспериментах. Данные нормированы к величине тока
компенсации до аппликации пикротоксина в каждой отдельной клетке. Пикротоксин
снижал ток компенсации в интернейронах (ИН) до 69 ± 10 % (n=5; p=0.04) от базовых
значений (пунктирная линия), но не вызывал значительного его изменения в
пирамидных клетках (103 ± 3 %; n=4; p=0,28; ПК). *: p<0,05
p=0,28 в пирамидных клетках; рис. 3.2.1).
Существует предположение, что в основе ГАМКергического тонического тока
лежит суммация сТПСТ (Salin and Prince 1996; Soltesz et al. 1995). В этом случае
тонический ток и сТПСТ должны быть одинаково чувствительны к антагонистам
ионотропных ГАМКергических рецепторов. Использованная концентрация
пикротоксина не выявила различий между этими двумя формами торможения. Эти
данные указывают, что именно суммация сТПСТ в интернейронах может определять
наличие тонического тока. Однако, в таком случае становится не понятно, почему
основные характеристики спонтанной активности в интернейронах и пирамидных
120
клетках одинаковы, а тонического тока в пирамидных нейронах нет (Рис 3.2.1). Для
ответа на этот вопрос мы решили проверить, не будет ли наблюдаться различий в
чувствительности тонического тока и сТПСТ к более низким концентрациям
пикротоксина. Для этого мы исследовали как последовательное увеличение
концентрации пикротоксина в растворе будет влиять на общий ток, переносимый
сТПСТ (ОТ-сТПСТ, средний заряд переносимый единичным сТПСТ умноженный на
частоту сТПСТ), и на ГАМКергический тонический ток (считая его абсолютную
величину равной той части тока компенсации, которая подавлялась при добавлении
100 µМ пикротоксина) (Рис. 3.2.2а). Оказалось, что тонический ГАМКергический ток
более чувствителен к низким концентрациям пикротоксина, чем общий ток сТПСТ
(IC50(Iтон)=2 µМ и IC50 (ОТ-сТПСТ)=12 µМ; Рис. 3.2.2б).
Ранее было показано, что SR95531 (габазин), специфический антагонист ГАМКА
рецепторов, может селективно подавлять фазические ТПСТ, не влияя на
ГАМКергический тонический ток, в диссоциированной культуре гиппокампальных
нейронов (Bai et al. 2001). Однако в диссоциированной культуре трудно определить,
какая клетка является интернейроном, а какая пирамидным нейроном. Мы проверили
какой эффект SR95531 будет оказывать на тонический ток в интернейронах. Низкая
концентрация этого антагониста (0.5 µМ) подавляла сТПСТ, но не приводила к
изменениям в токе компенсации ни в интернейронах, ни пирамидных клетках (Рис.
3.2.3). Ток компенсации в присутствии габазина был 110 ± 7 % от тока до его
аппликации (n=6; p=0,09) в интернейронах и 94 ± 6 % (n=4; p=0,34) в пирамидных
клетках. Эти данные указывают на возможность использования низких концентраций
пикротоксина как более специфического блокатора тонического ГАМКергического
тока, а SR95531 как селективного блокатора сТПСТ (фазических токов).
121
[PTX], M
5
10 50 100 500
-65
-85
ОТсТПСТ, пA
б
0 0.5 1
-45
Iкомп, пA
a
0
-1
-2
-3
1.2
Iтон(ГАМК)
ОТ-сТПСТ
Ток, норм
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.1
1
10
100
1000
[PTX], µM
Рис.3.2.2 Тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими
рецепторами, и фазические токи (сТПСТ) в интернейронах обладают разной
чувствительностью к пикротоксину
а, Пикротоксин (PTX) в зависимости от концентрации снижал как ток компенсации,
так и общий ток, переносимый спонтанными ТПСТ (ОТ-сТПСТ). Зависимости токов
получены с одного интернейрона. Точечная линия показывает средний ток
компенсации в присутствии 100 µМ пикротоксина на верхней панели и нуль тока ОТсТПСТ на нижней. Низкие концентрации антагониста более эффективно подавляли
ионотропные ГАМКергические рецепторы, опосредующие тонический ток, чем
рецепторы, опосредующие спонтанные ТПСТ. б, Кривые концентрация-эффект,
полученные для действия пикротоксина на ГАМКергический тонический ток (часть
тока компенсации, которая подавлялась аппликацией 100 µМ пикротоксина) и общий
ток, переносимый спонтанными ТПСТ, в интернейронах (n=7) str.radiatum поля СА1
гиппокампа. Тонический ток и ОТ-сТПСТ нормировались к их средним значениям до
аппликации пикротоксина. Кривые были аппроксимированы по уравнению Хилла
(метод наименьших квадратов). Оптимальные коэффициенты Хилла были сходными
0,91 и 0,94 для тонического тока (Iтон) и для ОТ-сТПСТ, соответственно. При этом IC50
для тонического тока был 2 µМ, а для ОТ-сТПСТ 12 µМ.
122
контроль
0.5 M SR95531
ИН
50 пA
0.5 с
ПК
50 пA
0.5 с
б
Iкомп % от контр.
a
120
100
80
60
40
20
0
ИН
ПК
Рис. 3.2.3 Низкая концентрация SR95531 (0,5 µМ) селективно блокировала
спонтанные ТПСТ, но не оказывала значительного эффекта на ток
компенсации
а, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (ИН) и одной
пирамидной клетки (ПК) до и после аппликации 0,5 µМ SR95531. Аппликация низкой
концентрации SR95531 подавляла спонтанные ТПСТ, но не оказывала значительного
эффекта на ток компенсации ни в интернейронах, ни в пирамидных клетках. б,
Усредненные данные, полученные с нескольких клеток. Ток компенсации был
нормирован к его среднему значению до аппликации 0,5 µМ SR95531 в каждой клетке.
Ток компенсации в присутствии SR95531 в интернейронах был 110 ± 7 % (n=6; p=0,09)
от базовых значений (пунктирная линия) и 94 ± 6 % (n=4; p=0.34) в пирамидных
клетках.
3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК ведет к
возникновению тонического тока в пирамидных клетках и
повышению в интернейронах
Предыдущие эксперименты были проведены в условиях, когда внеклеточная
концентрация ГАМК поддерживалась на относительно низком уровне за счет ее
обратного захвата (uptake). Однако, в определенных условиях, в частности при
эпилептогенезе, внеклеточная концентрация ГАМК может значительно повышаться
(Cleton et al. 2000). Исходя из этого, мы проверили, будет ли изменяться
ГАМКергический тонический ток в интернейронах при повышении внеклеточной
123
концентрации ГАМК. Если этот тонический ток специфичен только для
интернейронов, то повышение внеклеточной ГАМК при блокировании ее обратного
захвата должно снижать возбудимость этих клеток и, как следствие, приводить к
снижению торможения пирамидных клеток.
Для подавления uptake ГАМК мы использовали NO711 (20 µМ), специфический
блокатор транспортеров этого нейропередатчика. Аппликация этого вещества вызвала
значительное увеличение тока компенсации как в интернейронах, так и в пирамидных
клетках (Рис. 3.2.4). Этот неожиданный результат можно объяснить по-разному. Вопервых, возможно, что ионотропные ГАМКергические рецепторы в интернейронах
обладают более высокой аффинностью к ГАМК, чем ионотропные ГАМКергические
рецепторы в пирамидных клетках. Во-вторых, возможно, существует два типа
ионотропных ГАМКергических рецепторов, опосредующих тонический ток. Одни
находятся только в интернейронах и активны при нормальных условиях, другие есть
как в интернейронах, так и в пирамидных клетках и активируются при повышении
внеклеточной ГАМК.
Для ответа на этот вопрос мы проверили эффект 0,5 µМ SR95531 и 100 µМ
пикротоксина на увеличение тока компенсации, вызванное NO711. SR95531
полностью подавлял увеличение тока компенсации в интернейронах, связанное с
блокадой транспортеров ГАМК (Рис. 3.2.4а). Последующая аппликация пикротоксина
приводила к дальнейшему снижению тока компенсации до уровня сравнимого с
эффектом пикротоксина в отсутствие NO711. В пирамидных клетках последовательная
аппликация 0,5 µМ SR95531 и 100 µМ пикротоксина также подавляла тонический ток
вызванный NO711. Однако, снижения тока компенсации ниже его базового уровня не
происходило (Рис. 3.2.4б).
124
интернейрон
a
б пирамидная клетка
PTX
Iкомп, норм
NO711
PTX
SR95531
NO711
1.4
1.4
1.0
1.0
0.6
0.6
0.2
0.2
0
5
10 15 20 25
0
5
SR95531
10 15 20 25
Время (мин)
Рис. 3.2.4 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к
тоническому току и в интернейронах, и в пирамидных клетках
NO711 блокатор обратного захвата (uptake) ГАМК вызывает увеличение тока
компенсации как в интернейронах (121 ± 6 % от тока регистрируемого до аппликации
NO711; n=5; p=0,03; а), так и в пирамидных клетках (141 ± 7 %; n=4; p=0,01; б). а,
Увеличение тока компенсации, вызываемое NO711, в интернейронах полностью
подавляется аппликацией 0,5 µМ SR95531 (96 ± 7 % от тока до NO711; n=5; p=0,64 – tтест между током до NO711 и током в присутствии NO711 и SR95531). Последующее
добавление 100 µМ пикротоксина приводит к дальнейшему снижению тока
компенсации (71 ± 8 % от тока регистрируемого до аппликации NO711; n=5; p=0,02). б,
Последовательная аппликация SR95531 и пикротоксина подавляет повышение тока
компенсации в пирамидных клетках, вызванное NO711, (ток компенсации в
присутствии обоих антагонистов был 90 ± 10 % от тока регистрируемого до
аппликации NO711; n=4; p=0,32 - t-тест между током до NO711 и током в присутствии
NO711, SR95531 и пикротоксина).
Полученные данные свидетельствуют в пользу наличия двух форм
ГАМКергической тонической проводимости в интернейронах str.radiatum поля СА1
гиппокампа. Одна, характерная также для пирамидных клеток, появляется при
повышении внеклеточной концентрации ГАМК. Другая, независимая от повышения
внеклеточной концентрации агониста, обнаруживается только в интернейронах.
Возможно, что базовый тонический ток в интернейронах опосредован
ГАМКергическими рецепторами, которые максимально активированы при нормальной
концентрации ГАМК. С другой стороны, можно предположить, что ионные каналы
125
этих рецепторов могут спонтанно открываться вне зависимости от связывания
агониста (Birnir et al. 2000b).
3.2.3 Температурная зависимость тонического ГАМКергического
тока и фазических спонтанных ТПСТ
Вышеприведенные данные были получены при комнатной температуре, когда
оборот транспортеров, принимающих участие в обратном захвате медиаторов, снижен
(Hertz et al. 1998; Vizi 1998). Таким образом, увеличение температуры может снизить
внеклеточную концентрацию ГАМК за счет более эффективного uptake. Если
тонический ток опосредован спонтанным (не зависящим от внеклеточной
концентрации агониста) открытием каналов ГАМК рецепторов, то повышение
температуры не должно его снижать. С другой стороны, увеличение температуры
может увеличить синаптическое высвобождение ГАМК и, не смотря на усиление
uptake ГАМК, привести к повышению внеклеточной концентрации агониста.
Мы последовательно увеличили температуру в рабочей камере, в которой
находился препарат, с 23 оС до 38 оС с шагом 0.5 оС/мин. Увеличение температуры не
вызвало снижения в токе компенсации в интернейронах, а наоборот привело к его
увеличению (Рис. 3.2.5а1). Одним из объяснений этому феномену может быть то, что
повышение температуры ведет к увеличению внеклеточной концентрации ГАМК.
Доказательством этому может служить то, что при физиологической температуре
частота спонтанных ТПСТ (а, следовательно, высвобождение ГАМК) повышалась как
в интернейронах, так и в пирамидных клетках (Рис 3.2.5а2,б2). Другие факты
выступают против гипотезы накопления ГАМК. Во-первых, увеличение внеклеточной
концентрации ГАМК должно вызывать увеличение тока компенсации как в
интернейронах, так и пирамидных клетках, сходное с тем, что наблюдалось при
аппликации NO711 (Рис. 3.2.4). Однако, увеличения тока компенсации в пирамидных
126
Iкомп, норм
б1 пирамидная клетка
интернейрон
a1
1.4
1.4
1.0
1
0.6
0.6
0.2
0.2
20
25
30
35
40
25
30
35
40
б2
a2
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
2
сТПСТ, норм
20
1.5
1
частота
амплитуда
затух
0.5
0
20
25
30
35
40
20
25
30
35
40
Температура ( oC)
б3
a3
Iкомп, норм
1.2
1.0
0.8
1.2
*
0.6
0.4
0.2
0.0
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
SR95531 PTX
SR95531 PTX
Рис. 3.2.5 Эффект повышения температуры на фазические сТПСТ и тонический
ток в гиппокампальных нейронах
(подпись к рисунку на следующей странице)
127
Увеличение температуры приводит к увеличению тока компенсации в интернейронах
(ток компенсации при 38оС был 151 ± 13 % от тока, регистрируемого при комнатной
температуре (23оС); n=4; p=0,03; а1), но не в пирамидных клетках (б1). На графиках
представлен усредненный ток компенсации, который был нормирован к среднему току
при комнатной температуре (23оС) в каждой клетке. Линии аппроксимации
показывают линейную регрессию.
Температурные зависимости частоты, амплитуды и константы затухания (τзатух)
спонтанных ТПСТ были получены для интернейронов (n=4; а2) и пирамидных клеток
(n=4; б2), соответственно. Параметры сТПСТ были нормированы к их средним
значениям при комнатной температуре (23оС) в каждой клетке. Прямые линии
показывают линейную регрессию.
Аппликация 0,5 µМ SR95531 не оказывала значительного эффекта на ток компенсации
регистрируемый в интернейронах (102 ± 10 %; n=4; p=0,86; а3) и пирамидных клетках
(94 ± 5 %; n=4; p=0,44; б3) при физиологической температуре (38оС). Последующее
добавление пикротоксина (100 µМ) вызывало снижение тока компенсации в
интернейронах (81 ± 2 %; n=4; p=0,003; а3), но не пирамидных клетках (94 ± 4 %; n=4;
p=0,24; б3). Данные были нормированы к среднему току компенсации до аппликации
0,5 µМ SR95531 в каждой клетке.
клетках при повышении температуры показано не было (Рис. 3.2.5б1). Во-вторых,
аппликация SR95531 (0,5 µМ) должна блокировать тоническую проводимость,
возникающую благодаря аккумуляции ГАМК (Рис. 3.2.4). Однако, аппликация 0,5 µМ
SR95531 не приводила к статистически значимым изменениям в токе компенсации ни
в интернейронах, ни в пирамидных клетках при температуре 38 оС (Рис. 3.2.5а3,б3), хотя
и полностью подавляла спонтанные ТПСТ в этих клетках. Последующее добавление в
среду пикротоксина (100 µМ) производило, по аналогии с комнатной температурой,
снижение тока компенсации в интернейронах, но не в пирамидных клетках (Рис.
3.2.5а3,б3).
Одно из возможных объяснений температурной зависимости тонического тока
состоит в том, что тоническое торможение в интернейронах опосредовано спонтанным
открыванием каналов ионотропных ГАМКергических рецепторов и увеличение
температуры увеличивает частоту этих открываний или проводимость канала. Однако,
нами не было показано увеличения амплитуды спонтанных ТПСТ, что могло бы
128
служить доказательством увеличения проводимости каналов (Рис. 3.2.5а2,б2). Тем не
менее, кинетика спонтанных ТПСТ менялась в зависимости от температуры. При
высокой температуре константа времени затухания (τзатух) спонтанных ТПСТ
становилась меньше как в интернейронах, так и в пирамидных клетках (Рис. 3.2.5а2,б2).
Этот феномен может быть связан как со скоростью удаления агониста из
синаптической щели (более высокий uptake, более быстрая диффузия синаптически
высвобожденной ГАМК за пределы синапса), так и со скоростью открываниязакрывания каналов ионотропных ГАМКергических рецепторов. Таким образом,
возникает вопрос, действительно ли спонтанное открытие каналов ионотропных
ГАМКергических рецепторов в интернейронах, по крайней мере, частично, может
объяснять происхождение тонического тока. Однако, против роли спонтанного
открывания каналов ГАМКергических рецепторов в тоническом токе выступает то,
что пикротоксин, хотя и снижал ток компенсации при физиологической температуре,
но не подавлял полностью тепературного эффекта. Если предположить, что
ГАМКергические рецепторы не изменяют чувствительность к данному агонисту с
повышением температуры, то можно заключить, что повышение тока компенсации не
является ГАМКергическим.
Важным результатом экспериментов, описанных в данном разделе, можно считать
подтверждение факта, что ГАМКергический тонический ток не является артефактом
пониженной температуры, а существует при 38оС.
3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
Существуют данные о том, что внеклеточная концентрация ГАМК повышается при
эпилептогенезе (Cleton et al. 2000). Такое повышение внесинаптической концентрации
агониста может приводить к увеличению тонической ГАМКергической проводимости
как в интернейронах, так и в пирамидных клетках.
129
Гиппокамп является важной структурой, играющей роль в парциальной эпилепсии
височной доли (von Oertzen et al. 2002). В настоящее время механизмы инициации,
поддержания и распространения эпилептиформной активности в этой структуре мозга
не до конца ясны. Тоническое торможение, связанное с ростом внеклеточной
концентрации ГАМК в эпилептическом гиппокампе, может подавлять возбудимость
пирамидных клеток и снижать их способность генерировать потенциалы действия. С
другой стороны, оно может снижать активность интернейронов, которые образуют
тормозные ГАМКергические синапсы на возбуждающих клетках. Таким образом,
тоническое торможение может обладать как эпилептогенным, так и
антиэпилептогенным эффектом.
В целом, роль тонического торможения в эпилептогенезе остается не достаточно
ясной. В частности, некоторые формы ГАМКА рецептор опосредованной тонической
проводимости могут не играть принципиальной роли в эпилепсии. Подобная ситуация
описана на мышах, у которых отсутствовала α6 субъединица ГАМКА рецепторов
(Brickley et al. 2001). Считается, что ГАМКА рецепторы, содержащие α6 и δ
субъединицы находятся вне синаптической щели в гранулярных клетках мозжечка
(Nusser et al. 1998b). Они обладают более высокой аффинностью к ГАМК и не
десенситизируются. Было показано, что тонический ток в мозжечке связан с данным
типом рецепторов (Brickley et al. 2001). Неожиданным оказалось то, что мыши, у
которых отсутствовала α6 субъединица ГАМКА рецепторов, не были склонны к
судорогам (Jones et al. 1997). Одной из причин этому может быть то, что
ГАМКергическое тоническое торможение в гранулярных клетках мозжечка
компенсировалось у мышей-мутантов повышенной калиевой проводимостью,
опосредованной TASK-1 каналами (Brickley et al. 2001). Другим возможным
объяснением отсутствия судорог у нокаутных мышей является то, что α6 субъединица
130
ГАМКА рецепторов отсутствует в областях мозга, чувствительных к эпилептогенезу.
Например, она не экспрессируется в достаточном количестве в гиппокампе (Sperk et al.
1997).
В данной работе мы показали наличие двух форм ГАМКергического тонического
торможения в гиппокампе. Одна существует при нормальных условиях в
интернейронах, но не пирамидных клетках. При блокаде uptake ГАМК появляется
другая форма постоянного ГАМКергического тока как в интернейронах, так и в
пирамидных клетках. Возможно, что вторая форма тонического тока опосредована
низкоаффинными ионотропными ГАМКергическими рецепторами, которые
активируются, когда внеклеточная концентрация ГАМК достигает определенного
уровня (например, при эпилептогенезе). Таким образом, возникая в пирамидных
клетках, эта форма торможения может представлять собой антиэпилептический
механизм. Важно отметить, что новый антиэпилептический препарат – тиагабин
селективно блокирует GAT1, транспортер ГАМК (Dalby 2000). Блокада транспортера
снижает uptake ГАМК и ведет к увеличению внеклеточной концентрации эндогенного
агониста. Однако, накопление внеклеточной ГАМК может увеличивать и тоническое
торможение в интернейронах, что будет в свою очередь снижать торможение
пирамидных клеток (Рис. 3.2.6а). Таким образом, действие тиагабина на тоническое
торможение в интернейронах может снижать терапевтический эффект этого вещества.
С этой точки зрения, преимущество имеет использование антагонистов ионотропных
ГАМКергических рецепторов, которые участвуют в тоническом торможении
интернейронов. В этом случае, повышение возбудимости тормозных клеток будет
увеличивать торможение возбуждающих.
Для проверки этой гипотезы, мы воспользовались тем, что пикротоксин является
более эффективным блокатором тонической проводимости в интернейронах, чем
131
блокада uptake
ГАМК
пачечная
активность
возбуждающая
терминаль
ИН
ПК
селективный блокатор
тонического торможения
б2
1.4
сТПСТ част, норм
сТПСТ ампл., норм.
б1
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
ИН
ПК
1.4
1.2
*
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
ИН
ПК
Рис. 3.2.6 Селективные антагонисты ионотропных ГАМКергических рецепторов
могут обладать антиэпилептическим действием
а, Схематическая иллюстрация эффектов блокаторов обратного захвата (uptake) ГАМК
и специфического блокатора ГАМКергических рецепторов, опосредующих
тонический ток в интернейронах. Блокаторы uptake обладают как анти- (голубая
стрелка), так и проэпилептическим (красная стрелка) эффектами, увеличивая
тоническое торможение в пирамидных клетках (ПК) и в интернейронах (ИН),
соответственно. Антагонисты рецепторов, опосредующих тоническое торможение в
интернейронах, оказывают только антиэпилептическое действие.
б, Снижение ГАМКергического тонического торможения в интернейронах
увеличивает ГАМКергическую синаптическую передачу в пирамидных клетках.
Низкая концентрация пикротоксина (1 µМ) значительно снижала тоническое
торможение в интернейронах (см. Рис. 3.2.2),оказывая незначительный эффект на
амплитуду спонтанных ТПСТ как в интернейронах, так и в пирамидных клетках
(амплитуда сТПСТ в присутствии 1 µМ пикротоксина была 91 ± 5 % от ее значения до
аппликации антагониста; n=7; p=0,09 и 94 ± 7 %; n=4; p=0,48 в интернейронах и
пирамидных клетках, соответственно; б1). б2, Аппликация 1 µМ пикротоксина
132
незначительно снижала частоту сТПСТ в интернейронах (возможно, небольшие
сТПСТ не были обнаружены, поскольку пикротоксин снизил их амплитуду до уровня
шума) и значительно повышала частоту сТПСТ в пирамидных клетках (значение также
может быть недооцененным). Частота спонтанных ТПСТ в присутствии 1 µМ
пикротоксина была 92 ± 7 % по сравнению с частотой до аппликации антагониста в
интернейронах (n=7; p=0,27) и 120 ± 10 % в пирамидных клетках (n=4; p=0,04).
*: p<0,05
спонтанных ТПСТ. Мы апплицировали низкую концентрацию пикротоксина (1 µМ),
которая значительно подавляла тонический ток в интернейронах (Рис 3.2.2), но не
была достаточной, чтобы подавить спонтанные ТПСТ (Рис. 3.2.6б). Оказалось, что
использование данной концентрации антагониста приводит к повышению частоты
спонтанных ТПСТ в пирамидных клетках (Рис. 3.2.6б). Таким образом, блокада
тонического тока в интернейронах, ведет к повышению торможения пирамидных
клеток. К сожалению, пикротоксин имеет небольшой интервал между IC50 для
ГАМКергического тонического тока и IC50 для сТПСТ, что не позволило нам
использовать его в более высоких концентрациях. Таким образом, нахождение
препарата, специфически подавляющего тоническое торможение интернейронов,
может быть важным шагом в поиске терапевтических антиэпилептогенных средств.
3.2.5 Заключение
Таким образом, в данном разделе работы было показано:
1.В интернейронах str.radiatum, но не пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа, при
нормальных условиях помимо фазического торможения (ГАМКергических ТПСТ)
существует пикротоксин-чувствительный ГАМКергический тонический ток.
2. Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК при блокаде ее обратного захвата
приводит к возникновению тонического тока как в интернейронах, так и в
пирамидных клетках.
133
3. ГАМКергический тонический ток в интернейронах при нормальных условиях
фармакологически отличается от ГАМКергического тонического тока, связанного с
повышением внеклеточной концентрации ГАМК.
4. Повышение температуры приводит к увеличению частоты спонтанных ТПСТ
(фазических токов). При этом сохраняется клеточная специфичность тонической
проводимости для интернейронов, но не пирамидных клеток.
Результаты, полученные в данном разделе работы, являются первым детальным
описанием тонического торможения в различных нейронах гиппокампа. Показана
клеточная специфичность (интернейрон/пирамидная клетка) и фармакологическое
различие типов тонического тока. Эти данные могут быть использованы для
селективного изменения возбудимости определенных групп клеток и поиска
эффективных антиэпилептических препаратов.
134
3.3 Модуляция ГАМКергической передачи в гиппокампе
метаботропными рецепторами
Мы произвели регистрацию синаптических токов в интернейронах str.radiatum и
пирамидных клетках поля СА1 с помощью пейчкламповских электродов (whole-cell
patch pipettes). Приблизительно 25% интернейронов были биполярными клетками,
остальные три- и мультиполярными. Мы не обнаружили принципиальных различий в
ответах этих типов интернейронов на аппликацию L-AP4 (агонист метаботропных
рецепторов группы III) или электрическую стимуляцию пресинаптических
терминалей. По этой причине полученные данные были объединены вместе.
3.3.1 L-AP4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические
токи в интернейронах
Моносинаптические ТПСТ регистрировались при комнатной температуре в ответ на
внеклеточную стимуляцию в stratum radiatum в присутствии высоких концентраций
антагониста NMDA рецепторов (APV, 50 М) и антагониста AMPA/каинатных
рецепторов (NBQX, 10 М). Аппликация L-AP4 (агонист метаботропных рецепторов
группы III, 50 М) производила обратимое снижение ТПСТ до 47  12 %
(среднее  стандартная ошибка среднего) от контрольных значений (Рис. 3.3.1а;
p=0,01; n=5). Неожиданным оказалось то, что эта депрессия была практически
идентичной по величине снижению ВПСТ в ответ на аппликацию L-AP4. ВПСТ
регистрировались в отдельной группе экспериментов, в которых мы не добавляли
NBQX, а заменили его пикротоксином (100 М) и бикукуллином (10 µМ), чтобы
блокировать ГАМКА рецепторы (Рис. 3.3.1б). В этом случае L-AP4 подавило ВПСТ до
53  11 % от контроля (p=0,01, n=5).
135
150 пA
100 мс
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
1.0
0.5
0.0
0.0
0.5
1.0
амплитуда ТПСТ
0
10
20
30
40
б
50
150 пA
50 мс
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
г
150 пA
100 мс
1.2
ТПСТ 2/ТПСТ 1
амплитуда ВПСТ
в
1/CV2
амплитуда ТПСТ
а
*
*
1.0
0.8
0.6
0.4
0
10
20
30
Время (мин)
40
50
конт L-AP4 отмыв
Рис. 3.3.1 L-AP4, агонист метаботропных рецепторов группы III, подавляет
моносинаптические ТПСТ и ВПСТ в интернейронах в равной степени
а, Амплитуда ТПСТ (среднее ± С.О.С.), нормированная к средней амплитуде до
аппликации L-AP4 (50 μМ) (n=5). Оригинальные записи над графиком получены до, во
время и после аппликации L-AP4 с одного нейрона (усреднение по 30
последовательным регистрациям). б, Амплитуда ВПСТ, полученная таким же образом
в отдельных сериях экспериментов (n=5). в, Депрессия ТПСТ сопровождалась
снижением статистического параметра 1/CV2, что указывает на снижение квантового
содержимого (quantal content). Статистический параметр 1/CV2 был нормирован к
базовым значениям в каждой клетке и усреднен во всех экспериментах. Затем был
построен график отношения этого параметра к средней амплитуде ТПСТ,
нормированной таким же образом. Диагональная линия показывает траэкторию
изменений ожидаемую из распределения Пуассона при снижении квантового
параметра высвобождения m. г, Депрессия, вызываемая L-AP4, сопровождается
обратимым изменением коэффициэнта парной депресии, что указывает на
пресинаптический сайт действия этого агониста. Оригинальные записи над граффиком
получены усреднением 10 последовательных регистраций в одной эксперименте.
Жирные линии наложившиеся друг на друга контроль и отмывка, тонкая линия –
ТПСТ при аппликации L-AP4. Записи справа теже, что на левой панели, но
нормированные к амплитуде первого ТПСТ, чтобы оценить снижение парной
депресии. *: p<0,05.
136
Снижение средней амплитуды ТПСТ сопровождалось снижением статистического
параметра 1/CV2 (эквивалентного среднее арифметическое2/дисперсия), который
изменяется с изменением квантового состава выброса медиатора (Edwards et al. 1989)
Было доказано, что его использование позволяет грубо оценить выброс медиатора в
гиппокампальных синапсах (Manabe et al. 1993). Полученное изменение 1/CV2 в наших
экспериментах было пропорционально изменению средней амплитуды (Рис. 3.3.1в).
Это свидетельствует в пользу того, что эффект L-AP4 может быть связан с
пресинаптическим снижением вероятности выброса нейропередатчика. Для получения
дополнительных доказательств пресинаптического эфекта активации метаботропных
рецепторов группы III, мы проверили, какой эффект L-AP4 оказывает на коэффициент
парной депрессии ТПСТ. Для этого мы использовали два стимула с интервалом 50 мс.
В подтверждение данных, полученных с использованием параметра 1/CV2,
коэффициент парной депресии также менялся при аппликации L-AP4 (Рис. 3.3.1г).
Таким образом, мы показали, что ГАМКергические терминали содержат
метаботропные рецепторы глутамата, активация которых пресинаптически модулирует
выброс ГАМК.
В противоположность значительной депрессии ТПСТ и ВПСТ, регистрируемых в
интернейронах, моносинаптические ТПСТ в пирамидных нейронах снижались только
до 83  6 % от контроля (Рис. 3.3.2а; p=0,01; n=7). Это снижение было достоверно
меньше, чем наблюдаемое в интернейронах (p<0,04; непарный t тест). Кроме того, мы
не обнаружили эффекта L-AP4 на полевые ВПСП, записываемые в присутствии
пикротоксина и APV в str.radiatum (Рис. 3.3.2б). Это указывает на то, что и
возбуждающая синаптическая передача в пирамидных клетках не чувствительна к
активации метаботропных рецепторов группы III. Эти данные согласуются с
результатами предыдущих исследований (Scanziani et al. 1998; Shigemoto et al. 1996),
137
а
амплитуда ТПСТ
100 пА
100 мс
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
5
10
15
20
25
наклон пВПСП
б
0,2 мВ
20 мс
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
10
20
30
40
Время (мин)
50
Рис. 3.3.2 L-AP4 сравнительно неэффективно в снижении ВПСТ и ТПСТ в
пирамидных нейронах
а, Нормированная к базовым значениям амплитуда ТПСТ, зарегистрированых в
пирамидных нейронах поля СА1, (n=7). Аппликация L-AP4 (50 μМ) приводила к
небольшой, но статистически значимой их депрессии. Оргигинальные записи
получены до, во время и после аппликации L-AP4 с одного нейрона. б, Наклон
полевых ВПСП, полученных в str.radiatum поля СА1 (n=7). Аппликация L-AP4 не
приводила к статистически значимому эффекту. Оригинальные записи полученны в
одном эксперименте.
138
демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях
коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках СА1.
3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает ТПСТ
Различная чувствительность ГАМКергической передачи к L-AP4 в интернейронах и
пирамидных нейронах указывает на то, что повышение внеклеточной концентрации
глутамата, эндогенного агониста, может избирательно подавлять торможение в
интернейронах. Скорее всего, эта ситуация может возникать в условиях
метаболического стресса, когда захват глутамата (uptake) подавлен или обращен
(reuptake). Возникает вопрос, а может ли снижение торможения интернейронов
происходить при электрической стимуляции возбуждающих терминалей, которая
приводит к выбросу глутамата? Кроме того, будет ли действие синаптически
высвобожденного глутамата опосредовано через те же рецепторы, на которые влияет
L-AP4?
На рисунке 3.3.3а показаны ТПСТ, полученные в ответ на серию из 5 стимулов с
частотой 5 Гц. Наблюдается прогрессивное снижение амплитуды второго, третьего и
т.д ТПСТ относительно амплитуды ТПСТ, полученного в ответ на первый стимул.
Очевидно, что серия стимулов активировала не только ГАМКергические
интернейроны, а так же глутаматергические афференты. По этой причине часть
частотно-зависимой депрессии может возникать из-за активации пресинаптических
метаботропных рецепторов группы III, расположенных на терминалях интернейронов,
синаптически высвобождаемым глутаматом. В этом случае, частотно-зависимое
снижение ТПСТ должно уменьшаться, если блокировать эти метаботропные
рецепторы (von Gersdorff et al. 1997). Чтобы проверить эту гипотезу мы добавили в
раствор Рингера MSOP (100 M), специфический антагонист mGluR группы III. Это
вещество не оказало значительного эффекта на амплитуду первого ТПСТ, что говорит
139
а
100 пA
200 мс
ТПСТ5/ТПСТ1
б
1.0
0.8
0.6
0.4
MSOP
0.2
0.0
0
10
20
30
Время (мин)
Рис. 3.3.3 Депрессия ТПСТ, вызываемая серией низкочастотных стимулов,
чувствительна к MSOP (100 μМ)
а, Оригинальные записи, полученные в одной интернейроне в ответ на серию из 5
стимулов при частоте 5 Гц. Жирная линия – контрольные значения. В присутствии
MSOP (100 μМ) первый ТПСТ в серии оставался неизменным, а последующие
увеличивались (тонкая линия), указывая на то, что часть частотно-зависимой депресии
опосредована глутаматными метаботропными рецепторами группы III. ТПСТ
усреднены по 10 последовательным регистрациям. б, Усредненные результаты по 7
клеткам. Тонкие горизонталные линии на графике показывают средние значения
отношений 5-го к 1-му ТПСТ до и во время аппликации MSOP. Результаты получены в
присутствии APV (50 μМ) и NBQX (10 μМ).
140
об отсутствии тонической активации метаботропных рецепторов. Однако,
соотношение амплитуды пятого ТПСТ к амплитуде первого (ТПСТ5/ТПСТ1)
значительно увеличилось с 0,60  0,01 до 0,78  0,08 (p<0,05; n=7; Рис. 3.3.3б).
Сходные изменения были обнаружены и для второго, третьего и четвертого ТПСТ,
отнесенных к первому.
3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию ТПСТ
Эффект MSOP на частотно-зависимую депрессию свидетельствует в пользу того,
что метаботропные рецепторы группы III выступают в роли детекторов спилловера
глутамата от возбуждающих терминалей. Для получения более весомых доказательств
верности этой гипотезы, мы провели дополнительные эксперименты по оценке
гетеросинаптической депрессии моносинаптических ТПСТ. Мы использовали
модифицированный протокол, который был ранее применен Мин-Ян Мином с
соавторами (Min et al., 1999). Суть его заключалась в следующем. Один
("проксимальный") стимулирующий электрод устанавливался в непосредственной
близости от интернейрона для того, что бы вызывать моносинаптический тестовый
ТПСТ. Другой ("дистальный") электрод устанавливался так далеко от интернейрона,
как это было возможно, в str.radiatum поля СА1 и использовался для высокочастотной
стимуляции коллатералей Шаффера. Активация моносинаптически связанных
интернейронов дистальным электродом, таким образом, сводилась к минимуму.
Полисинаптическая активация интернейронов исключалась добавлением антагонистов
ионотропных глутаматнергических рецепторов. На рисунке 3.3.4а показан эффект
высокочастотной стимуляции (5 стимулов, 50 Гц) возбуждающих терминалей на
амплитуду тестового ТПСТ в интернейронах. При этом была обнаружена небольшая,
но статистически достоверная гетеросинаптическая депрессия. Амплитуда тестового
141
усилитель
контроль
а
тест
б
ТПСТ тест/ТПСТ контроль
прокс. эл.
дист. эл.
1.0
0.9
MSOP
CGP
0.8
0
10
20
30
40
Время (мин)
Рис. 3.3.4 Гетеросинаптическая депрессия ТПСТ, опосредованная ГАМК B и
метаботропными рецепторами группы III
а, Расположение стимулирующих и регистрирующего электродов показано на левой
панели рисунка. ТПСТ вызывался с помощью проксимального стимулирующего
электрода. Этот ТПСТ регистрировался попеременно либо сам по себе (контрольный
ТПСТ), либо после серии стимулов (5 стимулов 50 Гц) коллатералей Шаффера,
производимых дистальным электродом (тестовый ТПСТ). Оригинальные записи
получены с одного нейрона при усреднении 5 последовательных регистраций.
Тестовый ТПСТ (жирная линия) был меньше, чем контрольный ТПСТ (тонкая линия).
По причине того, что ионотропные рецепторы глутамата были блокированы,
дистальная стимуляция не вызывала заметного синаптического тока. б, Амплитуда
тестового ТПСТ (после стимуляции коллатералей), отнесенная к амплитуде
контрольного. Аппликация CGP35548 (500 М, CGP), антагониста ГАМКB рецепторов,
снижала депрессию тестового ТПСТ. Последующее добавление MSOP, антагониста
метаботропных глутаматных рецепторов группы III, обратимо подавляло остаточную
депрессию. На графике представлены данные, усредненные по 10 нейронам.
142
ТПСТ (после стимуляции глутаматергических терминалей) была 86  1 % от
контрольного ТПСТ (p<0,01; n=10).
Для оценки роли метаботропных рецепторов группы III, мы исследовали
фармакологические свойства полученной гетеросинаптической депрессии. Поскольку
известно, что в гиппокампе и мозжечке высвобождение ГАМК может оказывать
внесинаптические эффекты (Dittman and Regehr 1997; Isaacson 2000; Isaacson et al.
1993), мы добавили антагонист ГАМКБ рецепторов CGP35348 (500 M). Это вещество
приводило к достоверному уменьшению гетеросинаптической депрессии (Рис. 3.3.4б).
Отношение тестового ТПСТ к контрольному становилось 91  2 % (p<0,05 по
сравнению с депрессией до CGP35348). Таким образом, ГАМКB рецепторы играют
роль в гетеросинаптической депрессии ТПСТ. Затем, в присутствии CGP35348, мы
добавили MSOP (100 M). Это полностью и обратимо подавило остаточную
депрессию (99  1 % отношение тестового ТПСТ к контрольному; p=0,007 по
сравнению с депрессией до добавления MSOP). Таким образом, большая часть
полученной гетеросинаптической депрессии определялась активацией метаботропных
глутаматергических рецепторов группы III.
3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата
влияет на гетеросинаптическую депрессию
Если гетеросинаптическая депрессия определяется спилловером глутамата с
соседних терминалей то обратный захват этого эндогенного агониста будет являться
для нее лимитирующим фактором (Asztely et al. 1997). Мы решили проверить,
приведет ли подавление транспорта глутамата с помощью дегидрокаината (200 M) к
увеличению гетеросинаптической депрессии. Мы выбрали дегидрокаинат для этой
цели потому, что, в отличие от большинства других блокаторов обратного захвата, он
143
не переносится переносчиками и не приводит, таким образом, к гетерообмену с
глутаматом (Arriza et al. 1994). Использование других блокаторов обратного захвата
могло бы привести к резкому увеличению внеклеточной концентрации глутамата и
подавлению гетеросинаптической депрессии.
Дальнейшие эксперименты мы провели в постоянном присутствие CGP35348, чтобы
избежать вовлечения ГАМКB рецепторов в развитие гетеросинаптической депрессии.
На рисунке 3.3.5а показано, что блокада обратного захвата глутамата увеличивает
гетеросинаптическую депрессию. Отношение тестового ТПСТ к контрольному ТПСТ с
91  1 % до 85  1 % (p<0,002; n=10). Последующее добавление MSOP (100 µМ), как и
ожидалось, подавляло гетеросинаптическую депрессию (101  4 %
ТПСТтест/ТПСТконтроль; p<0,002 по сравнению с депрессией до MSOP; n=10). Этот
результат является дополнительным доказательством того, что спилловер глутамата с
возбуждающих терминалей модулирует ГАМКергическую передачу между
интернейронами.
Поскольку предыдущие эксперименты были проведены при комнатной
температуре, мы повторили их при более высокой, чтобы проверить будет ли
существовать гетеросинаптическая депрессия при условиях, близких к
физиологическим. Однако, когда мы повысили температуру до 32 оС нам не удалось
получить гетеросинаптическую депрессию (99  6 % ТПСТтест/ТПСТконтроль; n=8; Рис.
3.3.5б) при идентичном протоколе стимуляции и в присутствии антагониста ГАМКB
рецепторов. Этот результат может быть обяснен тем, что повышение температуры
усиливает обратный захват глутамата и снижает спилловер этого эндогенного агониста
(Asztely et al. 1997). Чтобы проверить эту гипотезу, мы повторили эксперименты при
повышенной температуре в присутствии дегидрокаината (200 М). В этих условиях
144
ТПСТ тест/ТПСТ контр
а
1.1
1.0
0.9
0.8
MSOP
0.7
DHK
0.6
0
10
20
30
40
50
Время (мин)
ТПСТ тест/ТПСТ контр
б
в
50 Гц
100 Гц
+ DHK
+ MSOP
1.1
100 пA
50 мс
*
1.0
0.9
0.8
0.7
50Гц
DHK
100Гц MSOP
Рис. 3.3.5 Увеличение гетеросинаптической депрессии, опосредованной mGluR
группы III, при блокаде обратного захвата глутамата
(подписи к рисунку на следующей странице)
145
а, Амплитуда тестового ТПСТ, нормированная к амплитуде контрольного в
присутствии CGP35548 (антагониста ГАМКB рецепторов). Дегидрокаинат (200 М,
DHK), блокатор обратного захвата глутамата, приводил к увеличению
гетеросинаптической депрессии ТПСТ. Это увеличение обратимо подавлялось
MSOP (100 М). Данные представленные на графике усреднены по 10 клеткам. б, При
температуре 32 оС использование того же протокола стимуляции коллатералей
Шаффера (5 стимулов, 50 Гц) как при комнатной температуре не приводило к
гетеросинаптической депрессии. Однако, блокада обратного захвата глутамата с
помощью дегидрокаината восстанавливала депрессию (n=8). в, Гетеросинаптическая
депрессия также возникала при 32 оС если частота стимуляции коллатералей
увеличивалась до 100 Гц, а интервал после стимуляции сокращался со 100 до 50 мс.
MSOP и в этом случае подавлял гетеросинаптическую депрессию (n=4). *: p<0,007.
Оригинальные записи представленные для б и в показывают тестовый ТПСТ (жирная
линия) и контрольный (тонкая).
нам снова удалось получить гетеросинаптическую депрессию ТПСТ в интернейронах,
которая была сравнима по величине с депрессией, наблюдаемой при комнатной
температуре (85  7 %; p<0,04). Хотя эти данные и подтверждают предположение о
том, что активный транспорт глутамата ограничивает межсинаптический спилловер,
они так же ставят под сомнение существование гетеросинаптической депрессии in
vivo. В отдельной серии экспериментов, проведенной при температуре 32 оС в
присутствии антагониста ГАМКВ рецепторов, мы повторили эксперименты со
стимуляцией коллатералей Шаффера, но использовали более высокую частоту
стимуляции (100 Гц вместо 50 Гц) и более короткую задержку пред тестовым ТПСТ
(50 мс вместо 100 мс). В этих условиях нам удалось получить гетеросинаптическую
депрессию (92  2 % ТПСТтест/ТПСТконтроль; p<0,02; n=4; Рис. 3.3.5в), которая
полностью подавлялась MSOP (101  1 % ТПСТтест/ТПСТконтроль; p<0,007 по сравнению
с депрессией до MSOP; n=4; Рис. 3.3.5в). Таким образом, высокая частота стимуляции
глутаматергических коллатералей и короткая задержка до тестового ТПСТ позволяют
развиваться гетеросинаптической депрессии и при более высоких температурах. Это
всязано с тем, что при интенсивной стимуляции высвобождается большая
146
концентрация глутамата, которая достигает пресинаптических mGluR группы III, не
смотря на активный обратный захват.
3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют
гетеросинаптическую депрессию по двум различным
механизмам
В предыдущих экспериментах нам удалось показать, что величина
гетеросинаптической депресии ТПСТ, опосредованной mGluR группы III зависит от
задержки возникновения тестового ТПСТ после активации глутаматергических
терминалей. Таким образом, использованный интервал в 100 мс может отражать лишь
одну из точек динамики депрессии. Поскольку снижение тестового ТПСТ зависит от
активации глутаматергических метаботропных рецепторов, то его длительность
должна определяться активацией G-белок зависимых биохимических каскадов внутри
клетки. Исходя из этого, мы решили проверить какой будет величина
гетеросинаптической депрессии на разных интервалах времени после высвобождения
глутамата и насколько долго существует эта депрессия. Для этого мы систематически
изменяли интервал между высокочастотной стимуляцией возбуждающих терминалей и
тестовым ТПСТ (Рис. 3.3.6а).
Было показано, что гетеросинаптическая депрессия имеет две фазы развития (Рис.
3.3.6б). Обе фазы подавляются при аппликации MSOP (Рис. 3.3.6в), что указывает на
участие в них глутаматергических метаботропных рецепторов группы III. Первая фаза
регистрировалась на 100 мс после высокочастотной стимуляции и длилась
приблизительно 500 мс. Таким образом, это была сравнительно кратковременная
депрессия, чтобы быть связанной с G-белок зависимыми механизмами, такими как
147
а
дист. эл
прокс. зл.
в
1
0.9
0.9
0
1
2
Интервал (с)
3
4
MSOP
0.8
0.8
2с
отмыв
1.0
100 мс
MSOP
к1/к2
контр
1.1
отмыв
1.1
контр
тест
ТПСТ контр/ТПСТ тест
контр
б
Рис. 3.3.6 Двухфазная динамика гетеросинаптической депрессии, опосредованной
метаботропными рецепторами группы III
а, Экспериментальный протокол для исследования динамики гетеросинаптической
депрессии. Интервал между серией стимулов коллатералей Шаффера (дист.эл. –
красные штрихи) и тестовым стимулом (прокс. эл.) систематически варьировался.
Контрольный ТПСТ регистрировался также перед каждой стимуляцией
глутаматергических коллатералей. б, Динамика гетеросинаптической депрессии ТПСТ
после выброса глутамата при стимуляции возбуждающих терминалей (в присутствии
антагониста ГАМКB рецепторов CGP35548). Наличие двух фаз депрессии указывает на
вовлечение различных механизмов. г, Аппликация MSOP (100 µМ) подавляла
гетеросинаптическую депрессию при 100 мс и 2 с – принципиальных точках первой и
второй фазы депрессии, указывая на то, что обе фазы зависят от активации mGluR
группы III.
изменение концентрации цАМФ (Yatani and Brown 1989). Вероятно в данном случае
метаботропные рецепторы активируют цАМФ независимые сигнальные пути (Koulen
et al. 1999; Schoppa and Westbrook 1997). mGluR группы III находятся внутри синапса в
перисинаптической мембране, следовательно, они оптимально расположены для
модуляции выброса нейропередатчика с минимальной задержкой. Вероятно, первая
148
фаза гетеросинаптической депресии ТПСТ представляет собой быстрое снижение
выброса ГАМК при повышении внеклеточного глутамата. За первой фазой следовала
вторая, более длительная фаза депрессии, которая заканчивалась приблизительно к 3,5
секундам. По всей видимости, она отражает активацию цАМФ зависимых
биохимических каскадов в клетке.
3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту
спонтанных ТПСТ
При исследовании эффекта аппликации L-AP4 на амплитуду вызванных ТПСТ (Рис.
3.3.1а) мы обнаружили также снижение частоты спонтанных ТПСТ (74  9 % от
базовой частоты, p<0,03; отмывка 85  7 %). Эти данные являются дополнительным
свидетельством в пользу того, что mGluR группы III модулируют ГАМКергическую
передачу в интернейронах. Однако, в этих экспериментах глутаматергические
ионотропные рецепторы были блокированы, что не позволяет сделать заключения
каким будет суммарный эффект активации mGluR группы III на возбудимость
интернейронов.
Для ответа на этот вопрос мы исследовали эффект апликации L-AP4 в условиях,
когда ни ГАМКергические, ни глутаматергические рецепторы не были блокированы. В
качестве внутриклеточного раствора в этих экспериментах был использован раствор с
низкой концентрацией ионов хлора (см. Материалы и методы: раствор основанный на
Cs-глюконате). При этом, потенциалы реверсии ГАМКергических и
глутаматергических токов были различными и мы могли разделить их без
использования антагонистов. Мы поддерживали интернейроны в режиме фиксации
потенциала на потенциале реверсии для токов ГАМКА рецепторов (–60 мВ) или на
потенциале реверсии для токов AMPA рецепторов (0 мВ). На рисунке 3.3.7а показано,
149
что синаптические токи, полученные при обоих потенциалах фиксации, одинаково
снижаются при аппликации L-AP4, что соответствует данным на фармакологически
изолированных ТПСТ и ВПСТ (Рис. 3.3.1). Добавление NBQX (10 М) почти
полностью подавляло синаптические ответы при –60 мВ, но не приводило к
значительному эффекту на синаптические токи при 0 мВ. Этот ток, мог быть подавлен
пикротоксином (100 М) и бикукуллином (10 µМ). Таким образом, нам удалось
одновременно исследовать эффект активации метаботропных рецепторов на
ГАМКергические ТПСТ и глутаматергические ВПСТ, не подавляя ни один из них
фармакологически.
В тех же самых нейронах мы исследовали частоту и амплитуду спонтанных
синаптических токов при разных потенциалах фиксации. При базовых условиях
частота глутаматергических спонтанных ВПСТ составляла всего лишь 35  7 % от
частоты ГАМКергических спонтанных ТПСТ (Рис. 3.3.7б). L-AP4 (50 М) снижал
частоту сТПСТ, но оказывал незначительный эффект на частоту сВПСТ (Рис. 3.3.7б).
Кроме того, L-AP4 значительно снижал среднюю амплитуду ГАМКергических сТПСТ
(87  3 % от базовых значений; p<0,01; отмывка до 91  5 % от базовых значений) при
этом оказывал лишь незначительный эффект на амплитуду глутаматергических
сВПСТ (94  7 %; p=0,5; отмывка 104  9 % от базовых значений). Эти результаты
указывают на то, что пресинаптические метаботропные рецепторы группы III снижают
спонтанные ГАМКергические токи в интернейронах. Другой вариант представления
эффекта аппликации L-AP4 на спонтанные токи показан на рисунке 6в. Частоты
сВПСТ и сТПСТ были нормированы к базовой частоте сТПСТ, а затем построена
зависимость отношения частот сТПСТ и сВПСТ до и во время аппликации L-AP4. LAP4 сдвигало это отношение из области доминирования тормозных токов к границе
баланса сТПСТ/сВПСТ, за которой следует область доминирования возбуждающих
150
NBQX
пикротоксин
L-AP4
а
0 мВ
-60 мВ
200 пА
200 мс
амплитуда ПСТ (норм)
1.0
0.8
* *
0.6
0 мВ
-60 мВ
0.4
0.2
0.0
контроль
контроль
L-AP4
L-AP4
отмывка
в
0 мВ
-60 мВ
1.0
част сТПСТ (норм)
1.0
20 пА
200 мс
**
пикрот
отмывка
б
частота сТПСТ нормированная
к базовым значеним при 0 мВ
NBQX
0.8
0.6
0.4
0.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.0
контроль
L-AP4
отмывка
част ВПСТ (норм)
Рис. 3.3.7 L-AP4 снижает частоту спонтанных ТПСТ, но не ВПСТ в
интернейронах
(подписи к рисунку на следующей странице)
151
а, Вызванные постсинаптические токи (ПСТ), записываемые при потенциалах
фиксации 0 мВ и –60 мВ, соответствующих потенциалам реверсии токов,
опосредованных ГАМКА и AMPA рецепторами, соответственно. Над графиком
показан использованный протокол изменения потенциала фиксации и оригинальные
записи с одного интернейрона (каждая усреднение по 30 последовательным
регистрациям). На графике приведены амплитуды ПСТ (среднее  С.О.С.)
нормированные к средней амплитуде до добавления L-AP4 (n=7). ПСТ, записанные
при –60 мВ, блокировались NBQX (10 М), что свидетельствует том, что они
опосредованы AMPA/каинатными рецепторами. ПСТ, записанные при 0 мВ, не
подавлялись NBQX, но блокировались пикротоксином (100 М), что свидетельствует
о том, что они опосредованы ГАМКергическими рецепторами. б, Частота спонтанных
ПСТ (среднее  С.О.С.), записанных при 0 и –60 мВ в тех же самых клетках. Частоты
сПСТ были нормированы к частоте сТПСТ при 0 мВ до аппликации L-AP4. в, График
зависимости средней частоты спонтанных ТПСТ от средней частоты спонтанных
ВПСТ, нормированных к базовой частоте сТПСТ. Белый кружок – контроль, черный –
аппликация L-AP4. L-AP4 сдвигает соотношение сТПСТ/сВПСТ в сторону повышения
возбудимости. пунктирная линия – линия баланса сТПСТ/сВПСТ.
Все данные получены в присутствии APV.*: p<0,05.
токов. Другими словами, активация глутаматергических метаботропных рецепторов
группы III делает интернейроны str.radiatum поля СА1 гиппокампа более
возбудимыми.
3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии ТПСТ при
активации mGluR группы III
Основными результатами данного исследования являются, во-первых, данные о
том, что глутаматные метаботропные рецепторы группы III модулируют
ГАМКергическую передачу между интернейронами, во-вторых, то что синаптически
высвобождаемый глутамат воспроизводит эффект экзогенной аппликации L-AP4,
агониста данных рецепторов. Таким образом, пресинаптические mGluR группы III
модулируют нейропередачу между интернейронами в зависимости от внеклеточной
концентрации глутамата в гиппокампе.
Группа III метаботропных рецепторов глутамата снижает активность
аденилатциклазы и включает в себя следующие подтипы рецепторов: mGluR4,
152
mGluR6, mGluR7 и mGluR8 (Pin and Duvoisin 1995). Из всех этих подтипов mGluR7
обладают наиболее низкой аффинностью к L-AP4 (EC50>100 М) (Okamoto et al. 1994;
Wu et al. 1998). Таким образом, маловероятно, что mGluR7 опосредуют эффект
аппликации L-AP4 (50 µМ) в наших экспериментах. mGluR6 не обнаружены в
гиппокампе, а mGluR8 находятся в основном в зубчатой фасции (Shigemoto et al. 1997).
Таким образом, вероятным кандидатом на роль гетерорецепторов, модулирующих
ГАМКергическую передачу в интернейронах поля СА1, явлются mGluR4 (Bradley et al.
1996; Shigemoto et al. 1997).
Гетеросинаптическая депрессия, описанная в данных экспериментах, состояла из
двух фаз: кратковременной по сравнению событиями, связанными с изменением
концентрации цАМФ (Yatani and Brown 1989) и более длительной. Объяснением этому
могут служить данные о том, что метаботропные рецепторы сначала активируют
цАМФ независимые сигнальные пути, а затем биохимические каскады, связанные с
состемой этого вторичного посредника (Koulen et al. 1999; Schoppa and Westbrook
1997). Двойное действие метаботропных рецепторов уже известно. Так было показано,
что глутаматергические метаботропные рецепторы группы II подавляют, с одной
стороны, вход Ca2+, а с другой, прямо снижают высвобождение медиатора (Kamiya and
Ozawa 1999).
3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей
возбудимости нейрональной сети поля СА1
Предположение о том, что метаботропные рецепторы глутамата модулируют
тормозную нейропередачу в зависимости от внеклеточной концентрации глутамата, не
является новым. Ранее было показано наличие метаботропных рецепторов групп II и
III в тормозных терминалях по эффекту агонистов этих рецепторов на
ГАМКергическую передачу (Bradley et al. 1996; Gereau and Conn 1995; Hayashi et al.
153
1993; Ohishi et al. 1994; Salt and Eaton 1995; Shigemoto et al. 1997; Tanabe et al. 1993;
Vetter et al. 1999; Wan and Cahusac 1995). Было показано, что MSOP увеличивает
частоту спонтанных ТПСТ в культуре гипоталамических нейронов, что указывает на
тоническую активацию mGluR группы III, которая снижает ГАМКергическую
нейропередачу (van den Pol et al. 1998). Несомненно, эти данные схожи с теми, что
получены в данном исследовании. Однако, клеточная специфичность
гетеросинаптической депрессии для тормозных терминалей интернейронов, но не
пирамидных клеток, продемонстрирована нами впервые. Кроме того, данная работа
является первым свидетельством того, что синаптически высвобождаемый глутамат
способен за счет дифузии активировать метаботропные рецепторы на
ГАМКергических терминалях.
Обнаружение того, что гетеросинаптическая депрессия моносинаптических ТПСТ
усиливается при блокаде захвата глутамата, указывает на то, что спилловер глутамата
от возбуждающих терминалей может подавлять нейропередачу между
интернейронами (Рис. 3.3.8). Таким образом, метаботропные рецепторы группы III
"детектируют" изменения во внеклеточной концентрации глутамата. Когда
концентрация этого эндогенного агониста увеличивается, торможение интернейронов
снижается. Из-за того, что ГАМКергические ТПСТ в пирамидных клетках менее
чувствительны к L-AP4, конечным эффектом активации mGluR группы III может быть
увеличение торможения глутаматергических нейронов. Это может представлять собой
гомеостатический механизм снижения возбудимости областей мозга, где наблюдается
повышение внеклеточной концентрации глутамата за счет интенсивных разрядов
возбуждающих клеток, например, при иктальных разрядах. Нарушение данного
механизма может стать причиной инициации и/или распространении фокальной
судорожной активности. В подтверждение этому предположению выступает то,
154
Дист. эл
Прокс. эл
Усилитель
Рис. 3.3.8 Схема активации пресинаптических mGluR группы III за счет
спилловера глутамата
Спилловер глутамата (голубое облако) исходит от возбуждающих афферентов
(розовые) и активирует пресинаптические метаботропные рецепторы (красные) и на
возбуждающих, и на тормозных синапсах интернейронов (зеленые). На данной схеме
синапс источник глутамата и синапсы-детекторы показаны на одном нейроне, но они
могут быть также и на различных. Кроме того, на рисунке показано расположение
стимулирующих и регистрирующего электродов, использованное в наших
экспериментах для демонстрации гетеросинаптической депрессии. Конечным
результатом активации глутаматных метаботропных рецепторов может быть
повышение торможения пирамидных клеток (желтые), как результат снижения
торможения интернейронов.
что было показано увеличение внеклеточной концентрации глутамата у пациентов с
эпилепсией височной доли непосредственно перед электрографическими
судорожными разрядами (During and Spencer 1993). Кроме того, нейроны у пациентов
с эпилепсией височной доли и животных после киндлинга менее чувствительны к
агонистам mGluR группы III (Dietrich et al. 1999; Klapstein et al. 1999). Наконец, сами
агонисты глутаматных метаботропных рецепторов группы III обладают
155
антиэпилептической активностью (Abdul-Ghani et al. 1997; Chapman et al. 1999; Ghauri
et al. 1996; Tizzano et al. 1995a; Tizzano et al. 1995b).
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют в пользу того, что
глутаматергические метаботропные рецепторы группы III, расположенные на
ГАМКергических терминалях, играют важную роль в предотвращении судорожной
активности. Однако, из-за того, что работы была проведена на срезах in vitro,
изменения возбудимости нейрональной сети могут быть предсказаны только
приблизительно. Пирамидные нейроны в срезе гиппокампа генерируют спонтанные
потенциалы действия значительно реже, чем разряжаются интернейроны. Таким
образом, тормозная передача доминирует над возбуждающей. In vivo ситуация может
быть совершенно другая и возбуждающие афференты будут разряжаться более часто.
Мы не можем исключить возможности, что в такой ситуации метаботропные
рецепторы будут оказывать существенный эффект на спонтанные ВПСТ в
интернейронах. Кроме того, технически достаточно сложно проверить, будет ли
возбуждающая глутаматергическая нейропередача сходным образом с
ГАМКергической модулироваться за счет спилловера синаптически высвобождаемого
глутамата. Это связано с тем, что высокочастотная стимуляция коллатералей Шаффера
серией стимулов в отсутствии NBQX приводит к генерации высокоамплитудных
моносинаптических ВПСТ, которые затрудняют измерение амплитуды тестового
ВПСТ после короткого интервала. Мы можем только соотнести чувствительность
возбуждающей и тормозной нейропередач к активации mGluR группы III при
аппликации L-AP4. Хотя вызванные ВПСТ и ТПСТ в интернейронах были одинаково
чувствительны к L-AP4 (Рис. 3.3.7а), спонтанные ВПСТ были менее чувствительны,
чем спонтанные ТПСТ (Рис. 3.3.7б). Это различие может объясняться двойственным
эффектом активации mGluR группы III. В одном случае они могут увеличивать, а в
156
другом снижать вход Ca2+ в клетку (Wu and Saggau 1997). Это может происходить если
большая фракция спонтанных ТПСТ, чем спонтанных ВПСТ, является потенциал
действия зависимой.
Гетеросинаптическая депрессия ТПСТ, полученная при стимуляции
глутаматергических терминалей, была сравнительно небольшой по сравнению с
эффектом аппликации L-AP4. Это свидетельствует в пользу того, что эффект
достигаемый за счет диффузии глутамата относительно невелик. Однако, небольшая
величина депрессии может быть также объяснена экспериментальными условиями,
при которых дистальный электрод располагался на достаточно большом расстоянии от
регистрируемого интернейрона. Это делалось, чтобы минимизировать активацию
ГАМКергических терминалей на этой клетке и уменьшить эффект ГАМКергической
модуляции ТПСТ. Такой подход приводил к тому, что при дистальной стимуляции
активировалось лишь небольшое число глутаматергических терминалей из числа тех,
которые приводили к выбросу глутамата рядом с ГАМКергическими синапсами
записываемого интернейрона.
Повышение температуры снижало гетеросинаптическую депрессию ТПСТ
благодаря увеличению захвата глутамата (Asztely et al. 1997). Однако, эта депрессия
могла быть восстановлена увеличением частоты стимуляции коллатералей, причем в
пределах частот разрядов наблюдаемых in vivo. По всей вероятности, во время
эпилептиформных разрядов достигается даже более высокая концентрация
внеклеточного глутамата. Эти данные указывают на физиологическую значимость
модуляции тормозной передачи метаботропными рецепторами группы III и, возможно,
вовлечение этого феномена в гомеостатические механизмы.
Еще одним эффектом модуляции нейропередачи между интернейронами может
быть парадоксальное изменение проведения сигнала в сети пирамидных клеток
157
поскольку ГАМКергическое торможение играет центральную роль в синхронизации
спонтанных разрядов (Cobb et al. 1995; Whittington et al. 1995). По причине того, что
пространственно-временной паттерн разрядов может быть важен для генерации
эпилептиформной активности, снижение торможения между интернейронами
способно ослабить механизм, вовлекаемый в гиперсинхронизацию. В подтверждение
этому было показано, что метаботропные глутаматергические рецепторы вовлекаются
в генерацию осцилляций интернейронов (Whittington et al. 1995).
Из проведенных экспериментов осталось не ясным, какие терминали высвобождают
глутамат, активирующий mGluR группы III в ГАМКергических синапсах. Это могут
быть как возбуждающие терминали, оканчивающиеся на тех же самых интернейронах
(Рис. 3.3.8), так и терминали, образующие синаптические контакты с соседними
клетками. В случае шипиковых синапсов пирамидных нейронов расстояние между
соседними терминалями оценивается, приблизительно, в 0,5 м (Rusakov and Kullmann
1998), причем эти синапсы принадлежат, как правило, различным дендритам и даже
различным нейронам (Sorra and Harris 1993). Такое короткое расстояние делает
возможным спилловер глутамата между соседними синапсами (Rusakov and Kullmann
1998), даже принимая во внимание наличие астроцитарных транспортеров на пути
диффузии этого нейротрансмиттера от синапса к синапсу (Lehre and Danbolt 1998;
Ventura and Harris 1999). К сожалению, среднее расстояние между ГАМКергическим
синапсом на интернейроне и ближайшим к нему глутаматергическим синапсом
систематически не было исследовано. Этот параметр является крайне важным для
рассчета вероятности того, что спилловер глутамата будет активировать mGluR
группы III на ГАМКергических терминалях.
158
3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная
метаботропными ГАМКB рецепторами
В данной работе нами также было впервые показано вовлечение в
гетеросинаптическую депрессию ТПСТ метаботропных ГАМКB рецепторов,
активируемых за счет диффузии ГАМК. Ранее было продемонстрировано участие этих
рецепторов в гетеросинаптической модуляции возбуждающей глутаматергической
передачи в пирамидных нейронах (Isaacson 2000; Isaacson et al. 1993). Таким образом,
ГАМК может диффундировать от тормозных ГАМКергических синапсов к другим
тормозным или возбуждающим терминалям. Интересно, что наших экспериментах
относительный вклад ГАМКB и mGluR группы III рецепторов в гетеросинаптическую
депрессию ТПСТ в интернейронах был приблизительно одинаков. Однако, мы не
ставили отдельной задачей оценку вклада ГАМКB рецепторов в гетеросинаптическую
депрессию и не можем сделать сравнительного анализа важности глутаматергической
и ГАМКергической модуляции тормозной передачи.
Более высокая аффинность к ГАМК метаботропных ГАМКB рецепторов по
сравнению с ионотропными ГАМКА рецепторами (Jones et al. 1998; Sodickson and Bean
1996) является зеркальным отражением более высокой аффинности к глутамату
глутаматергических метаботропных рецепторов (включая mGluR4) по сравнению с
ионотропными AMPA рецепторами (Pin and Duvoisin 1995). Такая симметрия
позволяет предположить, что высокоаффинные рецепторы обоих аминокислотных
нейропередатчиков в дополнение к классической синаптической передаче вовлекаются
в диффузный тип взаимодействий между соседними синапсами. При этом,
низкоаффинные рецепторы глутамата и ГАМК, по всей видимости, играют более
важную роль в генерации ВПСТ и ТПСТ, соответственно.
159
На основании опубликованных нами данных и данных ряда других лабораторий по
модуляции ГАМКергической передачи метаботропными рецепторами группы III и
модуляции глутаматергической передачи ГАМКB рецепторами J. Isaacson предложил
симметричную схему взаимного влияния тормозной и возбуждающей систем мозга
друг на друга посредством диффузионных процессов (Isaacson 2000). Адаптированный
вариант этой схемы представлен на рисунке 3.3.9.
Рис. 3.3.9 Схема взаимодействия метаботропных рецепторов-детекторов
внеклеточной концентрации ГАМК (ГАМКB) и глутамата (mGluR)
Оба типа рецепторов снижают выброс нейропередатчика и могут приводить к
гетеросинаптической депрессии. Пресинаптические ГАМКB рецепторы могут снижать
выброс глутамата при высокой активности тормозных ГАМКергических синапсов, а
пресинаптические mGluR наоборот снижать выброс ГАМК при повышении
внеклеточного глутамата (схема адаптирована по (Isaacson 2000)
160
3.3.10 Заключение
Таким образом, в данном разделе работы было показано:
1. Активация пресинаптических метаботропных рецепторов группы III приводит к
снижению вероятности выброса медиатора в ГАМКергических и
глутаматергических синапсах, расположенных на гиппокампальных
интернейронах, но не пирамидных клетках.
2. Метаботропные рецепторы группы III, расположенные на тормозных
терминалях, активируются за счет спилловера глутамата с соседних
возбуждающих синапсов. Этот процесс лимитируется обратным захватом
глутамата и усиливается при увеличении возбудимости нейрональной сети.
3. Активация mGluR группы III снижает как амплитуду вызванных ТПСТ, так и
частоту спонтанных ТПСТ в интернейронах.
4. Аналогично спилловеру глутамата, активирующему mGluR группы III,
происходит спилловер ГАМК, активирующий ГАМКB рецепторы на тормозных
ГАМКергических терминалях. Этот процесс также ведет к гетеросинаптической
депрессии.
Результаты, полученные в данном разделе работы, являются важным
свидетельством в пользу внесинаптического взаимодействия между возбуждающей
(глутаматергической) и тормозной (ГАМКергической) системами в ЦНС. Эти данные
проливают свет на диффузионный механизм гомеостатического регулирования
возбудимости нейрональной сети гиппокампа и подводит теоретическую базу под
антиэпилептический эффект веществ, влияющих на метаботропные рецепторы.
161
3.4 Каинатные рецепторы модулируют ГАМКергическое торможение
в гиппокампальных интернейронах
3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных ТПСТ в
интернейронах
Аппликация каината вызывает значительное увеличение в частоте потенциалов
действия зависимых спонтанных ТПСТ в пирамидных нейронах гиппокампа (Cossart et
al. 1998; Frerking et al. 1998; Frerking et al. 1999). В данном разделе диссертационной
работы мы проверили, не возникает ли подобный феномен в интернейронах. Мы
блокировали AMPA, NMDA, ГАМКB и метаботропные рецепторы (mGluR) группы III
с использованием GYKI53655 (50 μМ), DL-2-амино-5-фосфоновалерата (APV,
100 μМ), CGP52432 (5 μМ) и α-метилсерин-О-фосфата (MSOP, 100 μМ),
соответственно. В этих условиях при использовании внутриклеточного раствора с
высоким содержанием ионов хлора регистрировались негативно направленные
спонтанные и вызванные токи в интернейронах str.radiatum (Рис. 3.4.1). Они
полностью подавлялись добавлением 100 μМ пикротоксина и 10 μМ бикукуллина, что
указывает на ГАМКергическую природу этих ответов (ТПСТ). Аппликация низкой
концентрации каината (250 нМ) приводила к обратимому увеличению частоты
спонтанных ТПСТ (219 ± 21 % от базовых значений; n=5; p=0,0045, парный t-тест; Рис.
3.4.1а). При использовании 1 μМ каината, частота спонтанных ТПСТ увеличивалась до
394 ± 72 % от контроля (n=5; p=0,015), затем медленно возвращалась к базовой частоте
(Рис. 3.4.1б). Мы решили проверить, зависит ли эффект аппликации каината от
генерации спонтанных потенциалов действия в пресинаптических интернейронах.
Выснилось, что каинат в концентрации 1 μМ не оказывает влияния на потенциал
162
a1
б1
250 нM сТПСТ
в1
1µM сТПСТ
контр
контр
KA
KA
50 пA
0.5 с
50 пA
0.5 с
100 пA
0.5 с
отмыв
отмыв
a2
б2
250 нM
в2
1 µM
1 µM
част мТПСТ (норм)
част сТПСТ (норм)
4
3
2
1
0
б3
a3
в3
3
ампл мТПСТ (норм)
ампл сТПСТ (норм)
1 µM мТПСТ
2
1
0
0
10
20
30
0
10
20
30
40
0
50
10
20
30
40
Время (мин)
коммулятивное
распределение
г1
г2
г3
1.0
0.5
клетка 2
клетка 1
клетка 3
контроль
1 µM KA
отмывка
0.0
0
40
80 120 160
0
250 500 750 1000
0
100 200 300 400
амплитуда сТПСТ
Рис. 3.4.1 Каинат вызывает увеличение частоты и амплитуды спонтанных ТПСТ
(сТПСТ).
а, Каинат (250 нМ) увеличивал частоту и среднюю амплитуду сТПСТ. а1,
Оригинальные записи сделанные с одного нейрона: до (верхняя), во время (в середине)
и после (внизу) аппликации каината. а2, Частота сТПСТ нормированная к базовой
частоте (до воздействия). а3, Нормированная средняя амплитуда (n=5). б, 1 μМ каината
производил большее увеличение частоты (б2) и средней амплитуды сТПСТ (б3, n=5). в,
В присутствии тетродотоксина каинат не оказывал влияния ни на частоту (в2), ни на
амплитуду (в3) миниатюрных ТПСТ (мТПСТ; n=6). г, Коммулятивное распределение
амплитуд сТПСТ, полученных в трех различных интернейронах (г1, г2 и г3).
Аппликация каината (1 μМ) приводила к относительно избирательному увеличению
пропорции высокоамплитудных сТПСТ.
163
действия независимые миниатюрные ТПСТ, получаемые в присутствии 1 μМ
тетродотоксина (Рис. 3.4.1в).
Такая картина напоминает увеличение частоты потенциал действия зависимых
ТПСТ, показанное в пирамидных нейронах и указывает на значительное увеличение
частоты разрядов пресинаптических интернейронов. Средняя амплитуда спонтанных
ТПСТ в интернейронах также увеличивалась при аппликации каината (Рис. 3.4.1а,б).
Относительно селективное увеличение частоты высокоамплитудных токов (Рис. 3.4.1г)
указывает на то, что каинат приводит к генерации мультиквантовых (потенциал
действия зависимых) ТПСТ.
Хотя каинат и приводит к спонтанным разрядом интернейронов (Frerking et al.
1998; Frerking et al. 1999), механизм этого эффекта не до конца ясен. Данные о том, что
каинатные рецепторы могут частично опосредовать вызванные ВПСТ в
интернейронах, указывают на то, что соматодендритные рецепторы приводят к
разрядам интернейронов при аппликации каината (Cossart et al. 1998). Однако, в
мшистых волокнах показано, что каинат может непосредственно приводить к
деполяризации аксонов (Kamiya and Ozawa 2000; Schmitz et al. 2000). Если
аксональные каинатные рецепторы есть и в интернейронах, то потенциалы действия
могут генерироваться непосредственно в аксонах. Такие потенциалы действия будут
распространяться в обоих направлениях антероградно, приводя к выбросу ГАМК, и
ретроградно, вызывая пачечные потенциалы действия в соме этих клеток.
3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных
потенциалов действия в интернейронах
Мы проверили существование деполяризующих аксональных каинатных
рецепторов в интернейронах, проведя исследование влияния аппликации каината на
164
порог генерации антидромного потенциала действия. Для избежания
деполяризующего действия каината через соматодендритные рецепторы, мы
записывали интернейроны в режиме фиксации потенциала. В этом случае сома и
дендриты интернейронов находились при одном и том же потенциале (-60 мВ),
который поддерживался при аппликации каината за счет тока компенсации. Однако,
более тонкий аксон не мог быть фиксирован при данном потенциале и оставлася
электрически независимым. Антидромные потенциалы действия вызывались
монополярным стимулирующим электродом, расположенном в str.orience, и
регистрировались в соме в виде токов действия (ТД). В двух из семи нейронов нам не
удалось получить антидромных ТД. По всей видимости, аксон этих клеток был
поврежден при приготовлении препаратов или не распространялся в str.orience.
Прежде, чем исследовать эффект каината на снижение порога антидромных ТД, мы
проверили, можем ли мы разделить ТД вызываемые утечкой синаптического тока в
дендритах от антидромных. На рисунке 3.4.2а показано, что при неблокированных
AMPA, MNDA и ГАМКергических рецепторах, в ответ на электрическую стимуляцию
возникает синаптический ток, способный достичь достаточной амплитуды, чтобы
вызвать ТД утечки. Однако, этот ТД утечки имел более высокую латентность, по
сравнению с антидромным, и исчезал при блокаде AMPA, NMDA, ГАМКА, ГАМКB и
mGluR группы III рецепторов. Таким образом, не смотря на имеющиеся данные о том,
что каинатные рецепторы деполяризуют интернейроны благодаря ВПСП,
достигающим порога генерации ПД (Cossart et al. 1998), мы не обнаружили подобного
эффекта в данном исследовании. Действительно, блокировав AMPA, NMDA, ГАМКА,
ГАМКB и mGluR группы III рецепторы, мы не смогли зарегистрировать никакого
синаптического тока (каинатного ВПСТ) ни в одном из интернейронов.
165
a1
S tim u la to r
a2
1 nA
A m p lifie r
10 ms
C A1
a3
1 нA
10 мс
C A3
Антидромный ТД
б1
в1
250 нM
Антидромного ТД нет
г1
1 µM
K+ 5 мM
контр
аппл
2 нA
50 мс
отмыв
Вероятность ТД
б2
в2
250 нM
г2
1 µM
K+ 5 мM
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Ток компенсации (пА)
б3
в3
г3
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
-2.5
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
40
Время (мин)
Рис.3.4.2 Каинат снижает порог возникновения антидромных токов действия
(подпись на следующей странице)
166
а1, Стимуляция посредством монополярного электрода, установленного в str.orience
вызывает ТД в интернейронах str.radiatum. а2, Можно получить четыре типа ответов в
зависимости от позиции и интесивности стимуляции. Оригинальные записи,
полученные с одного интернейрона, слева на право: 1) за антидромным ТД возникает
постсинаптический ток (ПСТ) и вызваный им ТД; 2) за антидромным ТД возникает
только ПСТ; 3) только ПСТ без антидромного ТД; 4) ПСТи вызванный им ТД, но без
антидромного ТД. а3, После блокады AMPA, NMDA, ГАМКА, ГАМКB и mGluR
группы III возникал только антидромный ТД по принципу “все-или-ничего”. б, Каинат
(250 нМ, n=5) производил значительное увеличение вероятности возникновения
антидромных ТД. б1, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона,
демонстрируют вероятность возникновения антидромного ТД до, во время и после
аппликации каината. б2, Вероятность возникновения ТД, нормированная к базовой
вероятности. б3, Каинат производил небольшое увеличение в токе компенсации. в1-в3,
Эффект 1 μМ каината на вероятность возникновения ТД и на ток компенсации (n=4).
г1-г3, 5 мМ K+ не повышали вероятность ТД, не смотря на значительный эффект на ток
компенсации (n=4). Эти данные выступают против гипотезы о том, что каинат
увеличивает вероятность ТД за счет накопления внеклеточного K+.
Мы установили амплитуду антидромной электрической стимуляции таким
образом, чтобы она приводила к возникновению ТД в 30 % случаев. Эксперименты
были проведены в присутствии антагонистов AMPA, NMDA, ГАМКА, ГАМКB и
mGluR группы III рецепторов. Аппликация каината в концентрации 250 нМ
производила обратимое увеличение в вероятности генерации ТД до >90 % (Рис. 3.4.2б;
n=5; p=0.0008). Это указывает на то, что каинат снижает порог возникновения и/или
обегчает ретроградное распространение аксональных потенциалов действия.
Аппликация 1 μМ каината производила сходное, но более длительное повышение
верояности возникновения потенциалов действия на околопороговую стимуляцию
(Рис. 3.4.2в). Эффекты аппликации каината сопровождались увеличением тока
компенсации и снижением амплитуды ТД, указывая на увеличение проводимости
мембраны.
Полученные результаты можно объяснить прямой деполяризацией, возникающей
при активации каинатных рецепторов. Другое возможное объяснение заключается в
том, что каинатные рецепторы действуют не прямо, а вызывают высвобождение К+
167
соседними нейронами, которые деполяризованы через дендрито-сомоматические
каинатные рецепторы и постоянно разряжаются (Schmitz et al. 2000). Это повышение
калия вызывает аксональную деполяризацию в исследуемой нейроне и снижение
порога генерации в нем потенциалов действия. Чтобы проверить эту гипотезу, мы
увеличили внеклеточную концентрацию калия и исследовали эффект этого увеличения
на вероятность генерации ТД. Увеличение внеклеточного К+ с 2,5 мМ до 5 мМ не
изменяло вероятности ТД (Рис. 3.4.2г), при этом наблюдалось значительно большее
увеличение в токе компенсации, чем при использовании 250 нМ или 1 μМ каината.
Только, когда концентрация К+ была увеличена до 7,5 мМ, нам удалось
зарегистрировать увеличение вероятности генерации ТД в интернейронах. Эти
результаты указывают на то, что эффект каината не может быть опосредован
накоплением внеклеточного К+ (см. также Schmitz et al. 2000).
3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы
действия
Данные о том, что каинат прямо деполяризует аксоны, указывают на то, что
каинатные рецепторы присутствуют на аксональной мембране. Наличие аксональных
каинатных рецепторов было ранее показано в мшистых волоконах (Agrawal and Evans
1986; Kamiya and Ozawa 2000; Schmitz et al. 2000). Проводя эксперименты на
интернейронах str.radiatum поля СА1, мы заметли, что аппликация каината вызывает
также возникновение спонтанных ТД (сТД). Это наблюдение выступает против
гипотезы о том, что активация каинатных рецепторов действует в первую очередь на
сомато-дендритные рецепторы. В проведенных экспериментах сома и дендриты
поддерживались в режиме фиксации потенциала. Сомато-дендритная деполяризация
не приводила к достаточно высокому потенциалу утечки, поскольку необходимый
синаптический ток для генерации ТД утечки был значительно выше увеличения тока
168
компенсации при аппликации каината. Возникновение спонтанных ТД при
аппликации каината соответствует гипотезе о том, что дистальные участки аксонов
могут быть деполяризованы при активации каинатных рецепторов и генерировать
аксональные потенциалы действия.
Таким образом, если спонтанные потенциалы действия возникают в дистальном
аксоне, они не должны быть чувствительны к потенциалу, на котором фиксирована
соматическая мембрана. Однако, если вызываемые каинатом сТД отражают утечку
потенциала при сомато-дендритной деполяризации, то такие сТД могут быть
подавлены при гиперполяризации сомы. Для ответа на этот вопрос мы поддерживали
интернейроны в режиме фиксации потенциалов от -80 до -40 мВ и построили
зависимость частоты сТД от потенциала фиксации. В 7 из 12 нейронов спонтанные ТД
появлялись в отсутствие каината при деполяризующих потенциалах фиксации. Их
частота была пропорциональна потенциалу фиксации с порогом около -60 мВ
(Рис. 4.3.3а). Возникновение спонтанных ТД при деполяризующих потенциалах
фиксации можно объяснить тем, что потенциалы действия могут возникать на границе
фиксированного и нефиксированного проксимального аксона. Затем мы провели
аппликацию каината (1 μМ) и снова измерили частоту сТД при разных потенциалах
фиксации. Каинат обратимо увеличивал частоту сТД при всех потенциалах фиксации
(p<0,02 или p<0,05; n=7). Причем это увеличение не зависело от фиксирующего
потенциала. График зависимости частоты спонтанных ТД от потенциала фиксации
сдвигался равномерно в область более высоких частот (Рис. 4.3.3а). Основываясь на
том, что нам не удалось подавить сТД при гиперполяризации клеток, мы пришли к
заключению, что спонтанные ТД при аппликации каината возникают сравнительно
далеко от сомы, в дистальном аксоне.
169
a1
- 80 мВ
- 60 мВ
- 50 мВ
- 40 мВ
контроль
1 нA
1с
каинат (1 µM)
a2
1.5
1.0
0.5
0.0
-80
-70
-60
-50
-40
потенциал фикс. (мВ)
ток компенсации (норм)
ток компенсации (норм)
частота сТД (норм)
2.0
2
1
0
-1
-80
контроль
KA
отмыв
б
a3
-70
-60
-50
-40
потенциал фикс. (мВ)
2
1
0
-1
-80
-70
-60
-50
-40
потенциал фикс. (мВ)
Рис. 3.4.3 Активация аксональных каинатных рецепторов вызывает спонтанные
ТД, которые не зависят от соматического потенциала фиксации
а1, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона. При базовых условиях
частота спонтанных ТД увеличивалась при деполяризации выше -60 мВ. Аппликация
каината (1 µМ) вызывала независящее от потенциала фиксации увеличение частоты
спонтанных ТД (а2). Спонтанные ТД наблюдались даже при -80 мВ, указывая на то,
что они генерируются в электрически удаленном от сомы участке аксона (n=7).
Обратимое увеличение частоты ТД сопровождалось увеличением тока компенсации
(а3). б, В 5 интернейронах спонтанные ТД не удалось получить ни при одном
потенциале фиксации, независимо в присутствии каината или нет. Эти нейроны по
остальным своим свойствам ничем не отличались от каинат-чувствительных клеток, в
частности, были способны генерировать потенциалы действия в режиме фиксации
потенциала. В этих интернейронах каинат также не вызывал изменения тока
компенсации.
В тех же самых интернейронах аппликация каината приводила к увеличению тока
компенсации (Рис. 4.3.3а). Однако, в 5 из 12 интернейронах мы не получили
спонтанных ТД ни при каком потенциале фиксации ни до, ни во время аппликации
каината. В этих клетках каинат также не оказывал эффекта и на ток компенсации (Рис.
170
4.3.3б). По остальным параметрам данные клетки ничем не отличались от других
интернейронов. В частности в них регистрировались спонтанные синаптические токи в
отсутствие блокады ионотропных рецепторов. Кроме того, в них можно было
получить потенциалы действия в режиме фиксации тока в ответ на деполяризующий
сдвиг потенциала, что указывает на наличие в них интактных проксимальных Na+/K+
каналы. Возможным объяснением отсутствовия сТД в этих клетках может быть то, что
их аксон был поврежден или отрезан при приготовлении срезов. В данных
интернейронах нам не удалось зарегистрировать изменений в токе компенсации при
аппликации каината. Если это также связано с отсутствием аксона, то большинство
каинатных рецепторов в интернейронах должно быть сосредоточено на аксональной
мембране. Однако, существует и другое объяснение отсутствию эффекта каината на
интернейроны, неспособные спонтанно разряжаться при деполяризующих
потенциалах фиксации. Возможно, что в этих клетках аксон не поврежден, а не
способен к генерации спонтанных потенциалов действия и, в дополнение, эти
интернейроны не содержат каинатных рецепторов.
3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные
рецепторы
Полученные в предыдущих разделах результаты демонстрируют эффект
аппликации экзогенного агониста каинатных рецепторов. Однако, из них не ясно
может ли эндогенный глутамат, высвобождаемый синаптически, приводить к
активации аксональных каинатных рецепторов. Для ответа на этот вопрос мы
воспользовались протоколом аналогичным тому, который использовался для
исследования гетеросинаптической депрессии ТПСТ, опосредованной
метаботропными рецепторами. Мы стимулировали коллатерали Шаффера серией
стимулов (5 стимулов при частоте 5 Гц), которая должна была вызвать значительный
171
a1
a2
1
CA1
2
1
A m p lifie r
2
1
100 Гц
CA3
50 in
тестовый
стимул
б1
после тетанизации
контроль
1 нА
50 мс
в1
NBQX
1 нA
50 мс
вероятность ТД
б2
1
eiio?
контроль
**
в2
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
тест
тетаницация
NBQX
тест
тетанизация
Рис. 3.4.4 Синаптически высвобождаемый глутамат увеличивает возбудимость
аксонов через каинатные рецепторы
а, Экспериментальный протокол. Позиции стимулирующих и регистрирующего
электродов показаны на рисунке а1. Тестовый стимул, инициирующий антидромный
ТД (а2) подавался через электрод (1) либо сам по себе, либо после серии стимулов (5
стимулов при частоте 100 Гц) через дистальный электрод (2). б, Оригинальные записи,
полученные в одном интернейроне, показывают, что вероятность генерации ТД
увеличивается после высокочастотной стимуляции глутаматергических терминалей.
Это увеличение подавлялось при блокаде каинатных рецепторов с помощью NBQX
(100 μМ). в, Данные, усреденные по 7 интернейронам. **: p<0,01
172
выброс глутамата. Затем с интервалом 50 мс ты тестировали вероятность
возникновения антидромного ТД в ответ на стимуляцию аксона в str.orience (Рис
3.4.4а). Поскольку AMPA, NMDA, ГАМКА, ГАМКB и mGluR группы III рецепторы
были блокированы, мы предположили, что возможные эффекты высокочастотной
стимуляции возбуждающих терминалей будут опосредованы каинатными
рецепторами. В 7 интернейронах мы обнаружили значительное увеличение
вероятности возникновения антидромного ТД после стимуляции возбуждающих
терминалей (p<0,01 по сравнению с контрольными значениями), которое подавлялось
при аппликации NBQX, антагониста каинатных рецепторов (100 μМ; p=0,41 по
сравнению с контрольными значениями) (Рис. 3.4.4б,в).
Таким образом, мы показали, что активация аксональных каинатных рецепторов
может происходить благодаря синаптически высвобождаемому глутамату. Поскольку
не существует доказательств наличия аксо-аксональных синапсов в интернейронах
поля СА1 гиппокампа, то этот глутамат, по всей видимости, диффундирует от
удаленных возбуждающих синапсов и достигает каинатных рецепторов на
интернейронах.
3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой
каинатными рецепторами, для ГАМКергической передачи
В проделанных экспериментах с высокочастотной стимуляцией
глутаматергических терминалей нам не удалось показать, что синаптически
высвобождаемый глутамат способен вызывать спонтанные токи действия в
дистальных участках аксонов. Вероятно, это связано с ограничениями метода
исследования гетеросинаптической модуляции in vitro, описанными ранее. Однако,
если такой феномен имеет место in vivo, то он может представлять собой абсолютно
новый механизм интеграции возбуждающей передачи в гиппокампе. Другими
173
словами, если спонтанные потенциалы действия начинают возникать в аксонах
интернейронов, когда внеклеточная концентрация глутамата достигает определенного
уровня, то это может лежать в основе гомеостатического механизма, усиливающего
торможение в гиппокампе. Однако, эти интернейроны дожны иннервировать
пирамидные клетки, тогда как в данной работе мы продемонстрировали, что каинат
усиливает торможение и самих интернейронов. Тем не менее, действие каината на
спонтанные ТПСТ в пирамидных клетках довольно хорошо исследовано, значительное
увеличение в их частоте продемонстрировано несколькими различными
лабораториями. Эти данные могут быть объяснены возникновением спонтанных
потенциалов действия в дистальном аксоне интернейронов, иннервирующих
пирамидные клетки. Другим объяснением является то, что деполяризация в этих
клетках возникает за счет активации каинатных рецепторов в соматодендритном
компартменте и потенциал действия генерируется в аксонном холмике. Действие
каината на спонтанные ТПСТ в интернейронах было изучено гораздо меньше.
Незадолго, до публикации наших данных появилась работа Cossart с соавторами, в
которой был показан эффект каината на частоту потенциал действия независимых
миниатюрных ТПСТ в интернейронах (Cossart et al. 2001b). Это свидетельствует в
пользу того, что каинат может, при определенных условиях, влиять непосредственно
на высвобождение ГАМК. В наших экспериментах мы не обнаружили этого эффекта
на миниатюрные ТПСТ у морских свинок, хотя смогли его воспроизвести при
аппликации 1 М (но не 250 нМ) каината на срезах гиппокампа крыс (Рис. 3.4.5).
Вероятно, каинат, прежду всего, деполяризует аксоны, но эта деполяризация, при
достижении ей определенного уровня, может электротонически распространиться в
ГАМКергические терминали, приводя к “прямому” эффекту на высвобождение
нейротрансмиттера.
174
б1
а1
каинат 1 µM
частота мТПСТ
каинат 250 нМ
2.5
2.5
2
2
1.5
1.5
1
1
0.5
0.5
0
0
амплитуда мТПСТ
0
5
10
15
20
25
а2
2.5
5
2
2
1.5
1.5
1
1
0.5
0.5
10
15
20
25
30
15
20
25
30
б2
2.5
0
0
0
ток компенсации
0
30
5
10
15
20
25
-0.5
5
10
0
а3
0
0
30
б3
-0.5
-1
-1
-1.5
-1.5
-2
-2
-2.5
-2.5
-3
-3
0
5
10
15
20
Время (мин)
25
30
0
10
20
30
40
Время (мин)
Рис. 3.4.5 Аппликация 1 μМ, но не 250 нМ, каината повышает частоту
миниатюрных ТПСТ в интернейронах срезов гиппокампа крыс
а, Аппликация каината 250 нМ не вызывала значительных изменений ни в частоте (а1),
ни амплитуде (а2) миниатюрных ТПСТ (спонтанных ТПСТ, регистрируемых в
присутствии тетродотоксина) в интернейронах str.radiatum поля СА1 срезов
гиппокампа крыс, При этом не происходило изменений в и токе компенсации (а3). б,
Аппликация 1 μМ каината приводила к увеличению частоты (б1), но не амплитуды (б2)
миниатюрных ТПСТ, а также увеличению тока компенсации (б3).
175
Для того чтобы определить роль каинатных рецепторов в модуляции
ГАМКергической передачи между интернейронами мы исследовали действие каината
на спонтанные ТПСТ, многие из которых отражают генерацию спонтанных
потенциалов действия в пресинаптических нейронах. Каинат в концентрациях 250 нМ
или 1 М значительно увеличивал как частоту спонтанных ТПСТ, регистрируемых в
интернейронах, так и их амплитуду.
Существует несколько различных объяснений причинам, вызывающим увеличение
одновременно в частоте и амплитуде сТПСТ в интернейронах под действием каината.
Например, возможность существования специфической популяции пресинаптических
интернейронов, чувствительных к каинату. Другим обяснением может быть
облегчение распространения потенциалов действия в местах деления аксонов в
пресинаптических интернейронах. Не останавливаясь на неопределенности
механизмов, лежащих в основе этого феномена, важно отметить, что увеличение
амплитуды сТПСТ под действием каината характерно только для интернейронов и не
было показано для пирамидных клеток.
Таким образом, действие каината на нейроны гиппокампа обладает
клеткоспецифичностью, подобной той, которая наблюдается в действии агонистов
mGluR группы III. Мы показали, что деполяризация пресинаптических аксонов за счет
каинатных рецепторов может объяснять увеличение спонтанных ТПСТ. Однако,
почему каинат вызывает различные изменения этих токов в интернейронах и
пирамидных клетках осталось неясным. Возможно, что различие определяется
зависимостью распространения каинатных рецепторов по клеточной мембране в
различных пресинаптических интернейронах. Не исключено, что интернейроны, в
которых мы регистрировали ТПСТ, представляют собой гомогенную группу из всего
разнообразия интернейронов гиппокампа (Freund and Buzsaki 1996; Freund and Gulyas
176
1997). Таким образом, мы не можем сказать имеют ли эти интернейроны связи с
пирамидными клетками или же только с другими интернейронами. С другой стороны,
в предыдущих работах не удалось показать определенной корреляции между
морфологией интернейронов и действием на них каината (Cossart et al. 1998; Cossart et
al. 2001b), что свидетельствует против выборочной модуляции возбудимости нейронов
каинатными рецепторами.
3.4.6 Каинат усиливает вызванные ТПСТ в интернейронах
В предыдущих экспериментах мы показали, что каинат увеличивает возбудимость
аксонов интернейронов. Этот эффект должен приводить к тому, что вызванные ТПСТ
в постсинаптических клетках должны также увеличиваться. Для исследования
модуляции каинатными рецепторами вызванных ГАМКергических ТПСТ мы
блокировали AMPA, NMDA, ГАМКB и метаботропные рецепторы группы III
(mGluR III) с использованием GYKI53655 (50 μМ), DL-2-амино-5-фосфоновалерата
(APV, 100 μМ), CGP52432 (5 μМ) и α-метилсерин-O-фосфата (MSOP, 100 μМ),
соответственно. В этих условиях внеклеточная стимуляция вызывала синаптический
ток в интернейронах str.radiatum, который полностью подавлялся антагонистами
ГАМКА рецепторов бикукуллином (10 μМ) и пикротоксином (100 μМ) (рис. 3.4.6).
Эффект антагонистов тестировался в конце каждого эксперимента и указывает на то,
что весь регистрируемый ток был опосредован ионотропными ГАМК рецепторами, а
каинатные рецепторы не принимают в нем участия. Ток, опосредованный каинатными
рецепторами, не регистрировался даже при высокочастотной стимуляции (5 стимулов
при 100 Гц). Эти результаты отличаются от предыдущих публикаций о том, что
синаптические токи вызываемые в интернейронах срезов гиппокампа крыс часто (но
не всегда) содержат значительный компонент, опосредуемый каинатными
рецепторами (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998). Такое отличие можно объяснить
177
Стимулятор
GYKI 53655 (50 µM), APV (50 µM),
MSOP (100 µM), CGP 52432 (5 µM)
Усилитель
CA1
100 пA
100 мс
+ бикукуллин (10 µM)
CA3
Рис. 3.4.6 Фармакологическое выделение ТПСТ, опосредованных ионотропными
ГАМКергическими рецепторами
Стимуляция (Стимулятор) проводилась в str.radiatum поля СА1 с целью регистрации в
интернейронах (Усилитель) вызванного моносинаптического ГАМКергического
ТПСТ. Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (усреднение по 10
последовательным регистрациям) показаны на правой панели рисунка. Бикукуллин
(10 µМ) полностью подавлял ТПСТ, не смотря на то, что каинатные рецепторы не
были блокированы (ответ справа внизу), указывая на то, что каинатные рецепторы не
принимают участие в постсинаптическом токе.
видовыми различиями, которые могут отражаться в плотности каинатных рецепторов
и/или их близостью к месту выброса медиатора (см. для сравнения предыдущие
данные по модуляции каинатом миниатюрных ТПСТ в интернейронах крыс и морских
свинок).
На основании того, что каинатные рецепторы не вносили в наших
экспериментальных условиях значительного вклада в синаптические токи, мы
предположили, что действие каината не будет отражать прямой постсинаптический
эффект на рецепторы, опосредующие вызванные ответы. Кроме того, блокировав
ГАМКB и mGluR III, мы постарались избежать непрямого действия каината на
высвобождение медиатора за счет накопления внеклеточной ГАМК и глутамата, и
178
активации этими нейропередатчиками соответствующих типов метаботропных
рецепторов (Frerking et al. 1999).
Аппликация каината в концентрации 250 нМ производила небольшое и обратимое
увеличение амплитуды вызванных ТПСТ (127 ± 4 % от базовых значений, p=0,047;
n=5; рис. 3.4.7а). Увеличение ТПСТ было значительно больше когда апплицировался
1 μМ каината, причем этот эффект был более продолжительным, что может быть
объяснено как медленным отмыванием вещества, так и активацией каких-то
долговременных механизмов (рис. 3.4.7б). В этом случае, кратковременная депрессия
(75 ± 11 %, p=0.08, n=5) предшествовала увеличению ТПСТ и накладывалась на
раннюю фазу увеличения ответов. Эта депрессия совпадала со снижением входного
сопротивления клеток и константы затухания ТПСТ (τ затухания), полученной в
результате моноэкспоненциальной аппроксимации снижения амплитуды
синаптического тока после достижения им пика. Эти данные указывают на то, что
ТПСТ шунтируются в результате увеличения тонической ГАМКергической
проводимости. Феномен шунтирования токов за счет ГАМКергического тонического
тока при аппликации каината был ранее описан для пирамидных клеток и связывается
с активацией постсинаптических ГАМКА рецепторов (Frerking et al. 1999).
Основываясь на этих наблюдениях для избежания недооценки реальных амплитуд
ТПСТ, мы сконцентрировали свое внимание на более поздних стадиях эффекта 1 µМ
каината (>10 мин. от начала отмывки), когда амплитуда ТПСТ была максимально
высокой (166 ± 17 %; p=0,016; n=5).
Опосредованное каинатом увеличение амплитуды ТПСТ сопровождалось
незначительным изменением в соотношении амплитуд первого и второго ТПСТ в
ответ на парную стимуляцию с интервалом 50 мс (рис. 3.4.7в; p=0,48; n=5). Однако,
179
200 пA
100 мс
a1
амплитуда ТПСТ
250 нM
200 пА
100 мс
б1
1 µM
1.6
1.2
0.8
0.4
0.0
1.6
R входное
a2
б2
1.2
0.8
0.4
0.0
1.6
затухания
a3
б3
1.2
0.8
0.4
0.0
0
10
20
30
40
0
Время (мин)
в1
в2
30
1.6
0.6
1.2
0.4
40
50
60
70
80
0.5
1.0
1.5
2.0
2.0
0.8
0.8
0.4
0.2
50 мс
20
1/CV 2
КПС
1.0
10
0.0
0.0
контроль
каинат
амплитуда ТПСТ
Рис. 3.4.7 Аппликация каината увеличивает моносинаптические ТПСТ в
интернейронах
180
а, Аппликация 250 нМ каината приводила к небольшому, но достоверному
увеличению амплитуды ТПСТ (а1). Оригинальные записи (верхний ряд, усреднение по
10 последовательным записям) были получены до, во время и после аппликации
каината в одном интернейроне. Для усреднения использовались ТПСТ,
нормированные к базовым значениям, с 5 интернейронов. Аппликация 250 нМ каината
не производила значимого изменения ни во входном сопротивлении клеток (а2), ни в
коэффициенте затухания токов, полученном в результате моноэкспоненциальной
аппроксимации затухания ТПСТ, (а3, данные нормированные к базовым значениям). б,
Когда апплицировался 1 μМ каината небольшое кратковременное повышение
амплитуды ТПСТ предшествовало значительному снижению, за которым следовало
большое и длительное увеличение амплитуды ТПСТ (б1, n=5). Начальное снижение
амплитуды токов коррелировало со снижением входного сопротивления (б2) и
константы затухания токов (б3), указывая на эффект постсинаптического
шунтирования. Оригинальные записи, представленные в верхнем ряду, в 5, 15 и 35
минут эксперимента с 250 нМ каината и в 5, 15, 35 и 70 минут с 1 μМ каината. в,
Вызываемое каинатом увеличение ТПСТ сопровождалось незначительным
изменением в коэффициенте парной стимуляции (в1), указывая на отсутствие эффекта
каината на вероятность высвобождения медиатора. Вставка: записи, нормированные к
амплитуде первого ТПСТ, полученные с одного интернейрона, когда каинат произвел
увеличение первого ТПСТ до 166 %. Увеличение амплитуды ТПСТ сопровождалось
значительным увеличением вариабельности ответов (1/CV2, в2), указывая на
увеличение числа активных сайтов выброса медиатора.
вариабельность ответов, оцененная по статистическому параметру 1/CV2, который
меняется с квантовым содержанием (quantal content) (Edwards et al. 1989), значительно
и пропорционально увеличивалась со средней амплитудой ТПСТ (рис. 3.4.7в; p=0,048;
n=5). Эта ситуация (увеличение 1/CV2 при отсутствии изменений в коэффициенте
парной стимуляции) указывает на то, что увеличивается число сайтов высвобождения
медиатора, а средняя вероятность высвобождения в функциональных сайтах не
меняется. Такое происходит, например, когда увеличивается число пресинаптических
терминалей, генерирующих потенциал действия в присутствии каината на ту же силу
стимула.
181
3.4.7 Каинат приводит к увеличению ГАМКергического тонического
тока
В дополнение к модулирующему эффекту каината на амплитуду вызванных ТПСТ,
это вещество производило значительное увеличение в амплитуде тока компенсации.
Он увеличивался почти в 2 раза при использовании 250 нМ каината (176 ± 21 % от
базовых значений; n=5; p=0.023) и более чем в 3 раза в присутствии 1 μМ каината
(349 ± 72 %; n=5; p=0,015; рис. 3.4.8а). Разумеется, этот результат может отражать
прямую активацию каинатных рецепторов на интернейронах. С другой стороны,
каинат мог действовать непрямо, вызывая увеличение внеклеточной концентрации
ГАМК, которая приводит к тонической активации ГАМКА рецепторов (Frerking et al.
1999). Для ответа на этот вопрос, мы провели аппликацию каината в присутствии
пикротоксина (100 μМ). В этих условиях увеличение в токе компенсации было
значительно подавлено (157 ± 7 % от базовых значений, n=8; p=0,0001; рис. 3.4.8б).
Этот остаточный ток (в присутствии пикротоксина) наблюдался только в 8 клетках из
15, усреднение же по всем клеткам давало даже меньшее увеличение (128 ± 11 % от
базовых значений; n=15; p=0.024). Происхождение этого тока может быть связано как
с прямой активацией каинатных рецепторов, так и с тем, что использованная
концентрация пикротоксина не полностью блокировала определенную часть
ионотропных ГАМКергических рецепторов в ряде интернейронов (см. раздел 3.1.1).
Таким образом, аппликация каината активирует ГАМКергическую тоническую
проводимость в интернейронах. Именно эта проводимость, по всей видимости,
принимает участие в начальном снижении входного сопротивления клеток и
шунтировании ТПСТ (Frerking et al. 1999). Помимо этого, тоническая активация
ионотропных ГАМКергических рецепторов может вносить свой вклад в
182
ток компенсации
a
в
1 µM
0
0
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
0
б
20
40
60
KA & L-AP4
0
80
г
1 µM
0
0
-1
-1
20
40
60
80
1 µM
-2
-2
+ пикротоксин
-3
-4
-4
-5
-5
0
20
40
+ тетродотоксин
-3
60
80
0
10
20
30
40
время (мин)
Рис. 3.4.8 Аппликация каината увеличивает тонический ГАМКергический ток в
интернейронах
а, Аппликация каината (1 μМ) сопровождается значительным увеличением тока
компенсации. Ток компенсации, нормированный к базовым значениям, показан на
рисунке в сопровождении пунктирных линий, соответствующих ± СОС (n=5).
Аппликация каината производила значительно меньшее увеличение тока компенсации,
когда производилась в присутствии 100 μМ пикротоксина (б, n=4), указывая на то, что
основной эффект каината опосредован активацией ионотропных ГАМКергических
рецепторов. в, Когда каинат добавлялся в присутствии 50 μМ L-AP4, агонист mGluR
группы III (без пикротоксина), эффект на ток компенсации так же был ослаблен (n=5).
Это находится в соответствии с гипотезой о том, что каинат усиливает потенциал
действия зависимый выброс ГАМК. г, Блокада потенциалов действия с помощью 1 μМ
тетродотоксина почти полностью подавляла эффект каината на тока компенсации
(n=5), подтверждая необходимость потенциалов действия для вызываемого каинатом
высвобождения ГАМК.
десенситизацию постсинаптических рецепторов этого типа и приводить к окклюзии
токов в ответ на вызванное электрической стимуляцией синаптическое высвобождение
183
ГАМК. Источником накопления внеклеточной ГАМК при аппликации каината может
быть как увеличение спонтанного высвобождения ГАМК, так и ингибирование
поглощения ГАМК (uptake). Чтобы ответить на этот вопрос, мы повторили
аппликацию каината вместе с агонистом группы III метаботропных рецепторов - L(+)2-амино-4-фосфономаслянной кислотой (L-AP4, 50 μМ), которая снижает
высвобождение ГАМК терминалями интернейронов за счет активации метаботропных
рецепторов группы III, но не влияет на поглощение ГАМК. Аппликация каината
вместе с L-AP4 вызывала значительно меньшее увеличение тока компенсации
(175 ± 31 %; n=5; p=0,038; рис. 3.4.8в) по сравнению с эффектом одного только каината
(349 ± 72 %). Этот результат указывает на то, что ГАМКергический тонический ток
при аппликации каината возникает из-за усиления спонтанного высвобождения ГАМК.
Когда каинат добавлялся в присутствии 1 μМ тетродотоксина, который блокирует
потенциал действия зависимое высвобождение ГАМК, увеличение в токе компенсации
было подавлено в еще большей степени (119 ± 4 %; n=5; p=0,02; рис. 3.4.8г). Этот
результат указывает на то, что большая часть эффекта каината на ток компенсации
наблюдается из-за увеличения в потенциал действия зависимом высвобождении
ГАМК. С другой стороны, тетродотоксин подавил увеличение в токе компенсации в
большей степени, чем пикротоксин. Это указывает на то, что остаточный эффект
каината на ток компенсации в присутствии пикротоксина скорее связан с неполной
блокадой ГАМКергических рецепторов в интернейронах, чем с его прямым действием
на каинатные рецепторы.
184
3.4.8 Последствия усиления ГАМКергической передачи в
интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для
возбудимости нейрональной сети
Полученные результаты показывают, что каинат снижает порог генерации
потенциалов действия в интернейронах и вызывает увеличение тонического
ГАМКергического торможения. Эффект каината на ТПСТ в интернейронах отличен от
его эффекта на синаптические токи в других клетках гиппокампа. Каинат подавляет
нейропередачу в мшистых волокнах и тормозную синаптическую ГАМКергическую
передачу в пирамидных нейронах, тогда как увеличивает амплитуду ТПСТ в
интернейронах str.radiatum поля CA1 гиппокампа. Это увеличение может быть
объяснено снижением порога генерации потенциалов действия при деполяризации
аксонов, которое ведет к тому, что большее число пресинаптических нейронов будет
активироваться при электрической стимуляции. В подтверждение тому было показано,
что, в отличие от воздействий, меняющих вероятность высвобождения медиатора,
каинат не значительно изменял коэффициент парной стимуляции. Таким образом,
эффект каината на амплитуду ТПСТ в интернейронах поля СА1 срезов гиппокампа
связан с увеличением эффективности проведения сигнала по пресинаптическим
теминалям.
В отличие от предыдущих исследований (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998), мы
не смогли найти подтверждения участия каинатных рецепторов в постсинаптическом
токе. Вместо этого, результаты данной работы подтверждают гипотезу о роли
внесинаптических каинатных рецепторов в регуляции клеточной возбудимости.
Строго говоря, вопрос, где находятся каинатные рецепторы, требует применения
высокоразрешающих иммуноцитохимических методов, использование которых
затруднено тем, что пока не созданы адекватные антитела на каинатные рецепторы, в
185
частности на GluR5 и GluR6 субъединицы, которые находятся в интернейронах (Mulle
et al. 2000; Paternain et al. 2000).
Усилению вызванных ТПСТ при аппликации 1 μМ каината предшествует ранняя и
кратковременная депрессия ТПСТ, связанная с постсинаптическим шунтированием.
Аналогичный феномен, наблюдаемый в пирамидных нейронах, объясняется
значительным накоплением внеклеточной концентрации ГАМК, вызванным разрядами
интернейронов (Frerking et al. 1999). Обобщая полученные результаты, мы предлагаем
следующую последовательность событий. Каинат деполяризует интернейроны.
Деполяризация приводит к увеличению вероятности спонтанного и вызванного
высвобождения ГАМК. Затем внеклеточная концентрация ГАМК шунтирует
синаптические токи, активируя тоническую ГАМКергическую проводимость (так же
как и приводит к десенситизации ГАМКА рецепторов и активации ГАМКВ рецепторов,
если они не заблокированы фармакологически). По мере того, как эффект каината
снижается при его отмывке, феномен постсинаптического шунтирования ослабляется
и проявляется фасилитация фазической ГАМКергической передачи. Затем эта
фасилитация сохраняется довольно длительное время, что объясняется либо
долговременными механизмами, запускаемыми при активации каинатных рецепторов,
либо медленной кинетикой отмывания каината из среза.
Гипотеза о том, что каинат облегчает распространение потенциалов действия,
предполагает, что каинат также должен усиливать ТПСТ в пирамидных нейронах.
Однако, эффект каината на ТПСТ в этих клетках совершенно отличен от эффекта на
ТПСТ в интернейронах. В пирамидных нейронах каинат снижает амплитуду
вызванных ТПСТ. Остается неясным является ли это снижение полностью связанным
с накоплением внеклеточной ГАМК, которое приводит к повышению тонического
ГАМКергического тока (с последующим эффектом шунтирования) и к активации
186
ГАМКВ рецепторов (вызывающих пресинаптическую депрессию) (Frerking et al. 1999)
или отражает прямой эффект каината на экзоцитоз ГАМК (Rodriguez-Moreno and
Lerma 1998; Rodriguez-Moreno et al. 2000). Объяснение причин клеточной
специфичности эффекта каината, не входило в цели данной работы. Тем не менее,
могут быть предложены следующие варианты. Во-первых, механизмы подавления
нейропередачи могут быть более выраженными и более длительными в пирамидных
нейронах, скрывая увеличение потенциал действия зависимого высвобождения ГАМК.
Во-вторых, аксоны, иннервирующие две различные популяции нейронов, могут
различаться в плане распределения каинатных рецепторов и/или распространения
потенциалов действия. В-третьих, каинатные рецепторы могут модулировать
различные популяции интернейронов в различной степени. Однако, не было показано
четкой зависимости эффектов, опосредованных каинатными рецепторами, от
морфологии или расположения интернейронов (Cossart et al. 1998). Наконец, вчетвертых, возможна совершенно простая логическая схема. Каинат действительно
облегчает генерацию потенциалов действия во всех типах клеток. Однако,
интернейроны, иннервирующие пирамидные клетки (”ингибиторные”), тормозятся
другими интернейронами (”дезингибиторными”) (Gulyas et al. 1996). При общем росте
возбудимости интернейронов на фоне активации каинатных рецепторов наибольшее
тормозное влияние, вероятно, получают ”ингибиторные” интернейроны. Принимая во
внимание рост тонического ГАМКергического тока, активация каинатных рецепторов
в этих клетках может оказаться недостаточной для эффективного повышения их
возбудимости и увеличения торможения пирамидных клеток.
187
3.4.9 Заключение
Таким образом, в данном разделе работы было показано:
1. Активация аксональных каинатных рецепторов приводит к деполяризации и
снижению порога генерации аксональных потенциалов действия, также как и
возникновению спонтанных ПД в интернейронах.
2. Разряды интернейронов приводят к увеличению частоты и средней амплитуды
спонтанных ТПСТ, что объясняется увеличением в них пропорции
мультиквантовых потенциал действия зависимых токов.
3. Активация каинатных рецепторов при аппликации каината усиливает как
вызванные фазические ТПСТ, так и тонический ГАМКергический ток в
интернейронах str.radiatum поля СА1 гиппокампа. Однако, в силу собственного
взаимодействия между этими двумя типами торможения динамика этого усиления
различна.
Результаты данной работы создают теоретическую базу для объяснения
патологического (эпилептогенного) действия каината. Опосредованное каинатными
рецепторами усиление ГАМКергической передачи в интернейронах принимает
участие в подавлении ГАМКергического торможения пирамидных клеток. Как
следствие, этот феномен может играть важную роль в эффекте каината как
проконвульсанта и эксцитотоксина.
188
3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные
рецепторы противоположное действие на ГАМКергическую
передачу?
Исходя из представленных экспериментальных данных метаботропные рецепторы
группы III и каинатные рецепторы должны оказывать противоположное действие на
эффективность ГАМКергической передачи в интернейронах гиппокампального
str.radiatum. Таким образом, оба эффекта могут подавить друг друга при
физиологических условиях, когда ни один из классов рецепторов не блокирован
фармакологически. Однако, существуют небольшие, но, по видимому, очень важные
различия в механизмах модуляции ТПСТ этими двумя классами рецепторов, что
приводит к предположению о комплиментарности эффектов их активации. Действие
mGluR группы III объясняется прямым эффектом на высвобождение медиатора, что
соответствует их расположению рядом с местом выброса ГАМК на пресинаптической
терминали (Рис.3.5.1а). В соответствии с этим, было показано, что L-AP4 снижает
частоту миниатюрных ТПСТ в интернейронах (Cossart et al. 2001b). Основной эффект
каината это деполяризация аксонов интернейронов и облегчение возникновения в них
потенциалов действия. Метаботропные рецепторы группы III, вероятно, будут
подавлять как потенциал действия зависимое, так и потенциал действия независимое
высвобождение ГАМК в синапах между интернейронами. Каинатные рецепторы,
напротив, будут усиливать потенциал действия зависимы выброс ГАМК, но вероятно
окажут лишь незначительный эффект на потенциал действия независимый выброс
ГАМК. Таким образом, синхронная активация обоих типов рецепторов эндогенным
глутаматом может “контрастировать” потенциал действия зависимые ТПСТ (“сигнал”)
189
а
mGluR III
глутамат
КШ
ИН
ИН
ПН
каинатные рецепторы
б3
1
0
0
A
K
P4
/
LA
ко
н
м
от
K
A
ко
н
ы
в
м
от
P4
нт
р
LA
м
1
0
от
2
тр
2
1
ы
в
3
2
тр
3
ы
в
б2
3
ко
част сТПСТ (но рм )
б1
сТПСТ > 50 пA
сТПСТ < 50 пA
Рис. 3.5.1 Фильтрация потенциал действия зависимых ТПСТ при совместной
активации mGluR группы III и каинатных рецепторов
а, Схема активации синаптических метаботропных и аксональных каинатных
рецепторов за счет спилловера глутамата. Каинатные рецепторы деполяризуют аксоны
и облегчают проведение ПД, тогда как метаботропные снижают спонтанный выброс
ГАМК. ИН - интернейрон; ПН – пирамидный нейрон; КШ – коллатерали Шаффера. б,
Активация метаботропных рецепторов при аппликации L-AP4 (50 μМ) снижает
частоту как низкоамплитудных (74 ± 10 % от базовых значений; p=0,038; n=5), так и
мультиквантовых (53 ± 16 % от базовых значений; p=0,022; n=5) спонтанных ТПСТ
(б1). Активация каинатных рецепторов при аппликации каината производит
значительно большее пропорциональное увеличение в частоте мультиквантовых
(1104 ± 357 %; p=0,0078; n=6), чем низкоамплитудных (318 ± 52 %; p=0,0087; n=6)
ТПСТ (б2). б3, Совместная активация этих двух типов рецепторов при одновременной
аппликации каината и L-AP4 приводила к незначительным изменениям в частоте
низкоамплитудных ТПСТ (157 ± 23 %; p=0,07; n=5) но значительно увеличивала
мультиквантовые токи (612 ± 141 %; p=0,022; n=5).
190
по сравнению с потенциал действия независимыми миниатюрными ТПСТ,
обеспечивающих фоновое торможение (“шум”). Это предположение обращает больше
внимания к роли внесинаптических метаботропных и каинатных в обработке
информации передаваемой по сети ГАМКергических интернейронов, чем к общему
уровню возбудимости гиппокампа.
Не вполне очевидно как можно проверить гипотезу о том, что одновременная
активация обоих типов внесинаптических рецепторов увеличивает коэффициент
сигнал/шум ГАМКергической передачи в интернейронах за счет спилловера
глутамата. Тем не менее, эффект синхронной активации mGluR группы III и
каинатных рецепторов может быть исследован при совместной аппликации агонистов
обоих рецепторов. На рисунке 3.5.1б показан эффект аппликаций 50 М L-AP4, 1 М
каината и обоих вместе на частоту спонтанных ТПСТ регистрируемых в
интернейронах. Записи были получены в интернейронах str.radiatum поля СА1 в
присутствии антагонистов AMPA, NMDA и ГАМКB рецепторов. В соответствии с
предыдущими результатами, агонист mGluR группы III подавлял частоту спонтанных
ТПСТ, тогда как каинат производил противоположный эффект. Когда агонисты
добавлялись вместе, производимое каинатом усиление частоты доминировало над
эффектом L-AP4. Мы попробовали разделить потенциал действия зависимые
мультиквантовые ТПСТ (“сигнал”) и фоновые потенциал действия независимые ТПСТ
(“шум”), подразделив их на маленькие и большие токи (разграничив на амплитуде
50 пА). Совместная аппликация обоих агонистов производила большее увеличение в
больших, предположительно мультиквантовых, ТПСТ, по сравнению с маленькими в
соответствии с гипотезой о том, что эти два класса рецепторов не имеют прямо
противоположной роли в модуляции ГАМКергического торможения в гиппокампе.
191
3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации
калия создают долговременное снижение порога развития
пачечных разрядов в поле СА1 гиппокампа
Мы регистрировали полевые возбуждающие постсинаптические потенциалы
(пВПСП) в str.radiatum и популяционные спайки (ПС) в str.pyramidale поля СА1 срезов
гиппокампа крыс в ответ на внеклеточную стимуляцию с помощью биполярного
стимулирующего электрода, установленного в str.radiatum. В качестве воздействия
использовалось повышение внеклеточной концентрации калия до 20 мМ (30 секунд, 5
минут, 30 минут). Это воздействие было выбрано по двум причинам. Во-первых, было
показано, что при эпилептогенезе внеклеточная концентрация калия может
значительно повышаться (свыше 20 мМ) (Hablitz and Heinemann 1987; Heinemann et al.
1986; Swann et al. 1986). Во-вторых, при повышении внеклеточной концентрации калия
в срезах гиппокампа было показано развитие синхронных пачечных разрядов,
напоминающих эпилептические (McBain 1994; Rutecki et al. 1985; Stringer and Lothman
1988).
В наших экспериментах эффект повышения К+ выражался в генерации
множественных популяционных спайков в ответ на одиночный стимул (Рис. 3.6.1).
При возвращении внеклеточной концентрации калия к базовым значениям, эта
активность исчезала в течение последующих 20 минут. Таким образом,
использованная стимуляция не приводила к долговременным изменениям. Однако,
если считать время отмывки калия приблизительно равным времени диффузии калия
внутрь среза (несколько десятков секунд, судя по началу генерации множественных
192
Рис. 3.6.1 Эффекты кратковременных периодических повышений K+o на развитие
вызванной пачечной активности в поле СА1 срезов гиппокампа.
а, Оригинальные записи, полученные до воздействия (контроль), через час после
одного повышения K+o (1К+) и после трех (3К+). б, Динамика изменения числа
популяционных спайков в ответ на одиночную стимуляцию после 1-го (-♦-), 2-х (-■-) и
3-х (-▲-) периодических увеличений K+o. Пунктирная линия среднее значение числа
спайков при использованной стимуляции полученное во всех экспериментах. Данные
были нормированы к этому среднему в каждом эксперименте. За нуль времени
принята последняя регистрация перед воздействием, далее отсчет времени ведется от
окончания последнего эпизода повышения K+o. Разбросы не показаны для ясности
графика. * и ** - p<0,05 и p<0,01, соответственно.
разрядов с момента попадания К+- раствора в регистрационную камеру), то можно
заметить существенную разницу со временем исчезновения множественных спайков.
Похоже, что способность генерировать множественные разряды в поле СА1
сохранялась дольше, чем калий оказывал прямое действие. Использование двух 30секундных эпизодов повышения внеклеточной концентрации калия с интервалом 10
минут приводило уже к довольно длительной (до 40 мин) генерации вызванных
множественных спайков после окончания воздействия (Рис. 3.6.1б). Три эпизода с
193
теми же параметрами вызывали стойкое увеличение времени генерации вызванных
множественных спайков (свыше 2 часов; Рис. 3.6.1б) Увеличение числа эпизодов
повышения калия свыше трех, не приводило к дальнейшим изменениям.
Интересно, что прогрессирующее развитие множественных спайков при
повторении калиевых эпизодов и длительное поддержание такой активности после
окончания воздействия имело аналогию с развитием традиционного киндлинга in vivo.
При киндлинге in vivo судорожная активность достигается при повторяющихся
эпизодах электрической стимуляции областей мозга, чувствительных к эпилептогенезу
(Goddard et al. 1969). Причем используемые стимулы исходно ниже порога развития
судорог, но при каждом последующем эпизоде стимуляции порог генерации
судорожной активности прогрессивно снижается (Lothman and Williamson 1994;
McNamara et al. 1985). После окончания воздействия это снижение порога способно
сохраняться длительное время.
3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле СА1 гиппокампа не
зависит от активности нейронов поля СА3
В предыдущих экспериментах было продемонстрировано развитие множественных
спайков в пирамидных нейронах поля СА1, области неспособной самостоятельно
генерировать эпилептиформную активность (Mason 1993). Общепринято, что
источником эпилептиформных событий в СА1 является поле СА3 (McNamara 1994),
где показано наличие взаимных связей между возбуждающими клетками (Traub and
Dingledine 1990; Traub et al. 1994), позволяющих синхронизировать активность целой
группы нейронов. Таким образом, возникает вопрос, является ли генерация вызванных
множественных популяционных спайков в СА1 прямым влиянием повышения калия
на эти нейроны. Возможно, повышение внеклеточной концентрации калия вызывает
синхронизированные разряды в поле СА3, и они распространяются в СА1.
194
Для того чтобы оценить роль поля СА3 в эффекте калиевых эпизодов на
способность СА1 генерировать вызванные множественные спайки, была проведена
перерезка коллатералей Шаффера, связывающих поля СА3 и СА1. Три эпизода
повышения внеклеточной концентрации калия (20 мМ, 30 секунд, интервал между
эпизодами 10 минут) приводили к развитию вызванных множественных
популяционных спайков в поле СА1, изолированном от СА3. При этом не было
обнаружено статистически значимых различий ни в длительности этой активности, ни
в форме множественных спайков от данных параметров, полученных в экспериментах
без перерезки. Из этого можно заключить, что способность генерировать
множественные спайки в ответ на одиночный стимул возникает в СА1 независимо от
СА3.
3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле СА1 в ответ на
кратковременные увеличения внеклеточной концентрации
калия в моделях эпилептогенеза in vivo
Из полученных данных осталось не ясно, является ли множественный разряд в
пирамидных клетках поля СА1 эпилептиформным. Как отмечалось ранее, пачечная
активность не всегда представляет собой патологический процесс, а может принимать
участие в генерации мозгом нормальных ритмов (D'Angelo et al. 2001; Twery et al.
1992). Чтобы ответить на этот вопрос, мы исследовали особенности развития пачечной
активности вызываемой повышением К+ в срезах гиппокампа крыс после
электрического и аудиогенного киндлинга in vivo.
Электрический киндлинг in vivo
Проводимая через сутки (в течение 8 суток) хроническая электрическая
стимуляция (частота стимуляции 50 Гц в течение 10 сек., 12 стимулов/день с
195
интервалом 30 мин.) гиппокампа in vivo приводила к прогрессирующему увеличению
длительности послеразрядов и соответствующему изменению паттерна двигательной
судорожной активности в соответствии с критериями Рэйсина (Рис. 3.6.2а1). 48 таких
стимуляций приводили к увеличению длительности послеразрядов свыше 30 сек. и
достижению животными 4-5 стадии киндлинга.
Для исследований брали срезы гиппокампа, полученные от крыс через одни сутки
после окончания киндлинговой стимуляции. Во всех срезах производилась перерезка
коллатералей Шаффера, для предотвращения влияния активности поля СА3 на эффект
эпизодов повышения внеклеточной концентрации калия в поле СА1. Внеклеточная
регистрация показала, что в str.pyramidale поля СА1 срезов, полученных от таких
животных, уже исходно в ответ на одиночный стимул возникает множественный
популяционный спайк (Рис. 3.6.2а2). Число разрядов в таком множественном спайке
было достоверно выше в срезах от киндлинговых крыс, чем в срезах полученных от
животных, не подвергавшихся киндлигу (2,7 ± 0,3 и 1,9 ± 0,6 у животных после
киндлинга и контрольных, соответственно; p=0,008; данные получены при силе
тестирующего стимула 620 μА). Этот факт указывает на то, что киндлинг in vivo
приводит к генерации пачечных разрядов в пирамидных нейронах поля СА1
гиппокампа в ответ на электрическую стимуляцию, подобно тому, как это происходит
при кратковременных эпизодах повышения внеклеточной концентрации калия. Если
эти феномены имеют сходные механизмы, то использование эпизодов повышения
калия не должно приводить к дальнейшему увеличению пачечных разрядов.
Три периодических эпизода повышения K+ не приводили к дальнейшему
достоверному увеличению числа разрядов в вызванном множественном спайке,
регистрируемом в str.pyramidale поля СА1 срезов гиппокампа киндлинговых крыс
(Рис. 3.6.2а3). Этот результат свидетельствует в пользу общности механизмов развития
196
б1
Крысы Вистар электрический киндлинг
50
4
40
3
30
2
20
1
10
0
0
0
Крысы Крушинского -Молодкиной
аудиогенный киндлинг
4
поведенч балл
5
Послеразряды, с
Балл по шкале Рейсина
а1
3.5
3
2.5
2
0
10 20 30 40 50 1д
601н70
10
контр.
крысы
киндлинг
крысы
б2
1н
50
контр.
КМ крысы
аудиокиндлинг
КМ крысы
1 час после
3-К + эпизода
1 час после
3-К + эпизода
б3
4
3.5
Число спайков
Число спайков
40
без
воздействия
без
воздействия
а3
30
Число стимулов
Число стимулов
а2
20
3
2.5
2
1.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
1
-20 0
20 40 60 80 100 120
Время(мин)
-20
0
20
40
60
80 100
Время (мин)
Рис. 3.6.2 Окклюзия пачечных разрядов, вызываемых повышениями К+, в
моделях эпилептогенеза in vitro
(подпись к рисунку на следующей странице)
197
а, Развитие пачечной активности в поле СА1 срезов гиппокампа, полученных от
животных после электрического киндлинга in vivo. а1, Хроническая электрическая
стимуляция гиппокампа in vivo приводила к прогрессивному развитию поведенческих
судорог и электрических послеразрядов. После окончания стимуляции достигнутый
уровень судорожной активности и длительности послеразрядов сохранялся как
минимум неделю (1д и 1н – данные через 1 день и через 1 неделю после окончания
стимуляции, соответственно). а2, Оригинальные записи, показывающие, что в
пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа животных после электрического
киндлинга развивается пачечная активность. Причем последующие эпизоды
повышения калия не приводили к ее усилению, что указывает, на окклюзию пачечной
активности при эпизодах повышения калия пачечной активностью при эпилептогенезе.
а3, Усредненные и нормированные к среднему числу спайков до воздействия данные
полученные в нескольких экспериментах. На графике показана динамика изменения
числа популяционных спайков в ответ на одиночную стимуляцию после 3-х
повышений K+o у животных без киндлинга (-□-) и после киндлинга (-■-). Точечная
линия – среднее значение числа спайков при использованной стимуляции до
повышений калия, полученное в экспериментах без киндлинга. Пунктирная линия
среднее значение числа спайков в экспериментах после киндлинга in vivo. Данные
были нормированы к среднему до эпизодов повышения калия в каждом эксперименте.
За нуль времени принята последняя регистрация перед воздействием, далее отсчет
времени ведется от окончания последнего эпизода повышения K+o.
б, Развитие пачечной активности в поле СА1 срезов гиппокампа, полученных от
крыс линии Крушинского-Молодкиной после аудиогенного киндлинга in vivo. б1,
Хроническое периодическое звуковое воздействие на животных in vivo приводило к
прогрессивному развитию поведенческих судорог. После его окончания достигнутый
уровень судорожной активности сохранялся как минимум неделю (1н – данные через 1
неделю после окончания звуковых воздействий). б2, Оригинальные записи,
показывающие, что в пирамидных нейронах поля СА1 срезов гиппокампа крыс линии
Крушинского-Молодкиной после аудиогенного киндлинга развивается пачечная
активность, которой не наблюдается у животных, не подвергавшихся звуковой
стимуляции. Причем последующие эпизоды повышения калия вызывают развитие
пачечных разрядов у животных контрольной группы, но не приводят к ее усилению
пачечных разрядов у животных после аудиогенного киндлинга. Этот результат
указывает, на наличие окклюзии пачечной активности при эпизодах повышения калия
пачечной активностью при аудиогенной судорожной активности. б3, Усредненные и
нормированные к среднему числу спайков до воздействия данные, полученные в
нескольких экспериментах. На графике показана динамика изменения числа
популяционных спайков в ответ на одиночную стимуляцию после 3-х повышений K+o
у животных без аудиогенного киндлинга (-○-) и после киндлинга (-●-). Точечная линия
– среднее значение числа спайков при использованной стимуляции до повышений
калия полученное в экспериментах без аудиогенного киндлинга. Пунктирная линия
среднее значение числа спайков в экспериментах после хронических звуковых
стимулов. Данные были нормированы к среднему до эпизодов повышения калия в
каждом эксперименте. За нуль времени принята последняя регистрация перед
воздействием, далее отсчет времени ведется от окончания последнего эпизода
повышения K+o.
198
пачечной активности в СА1 при использовании эпизодов повышения внеклеточной
концентрации калия и при киндлинге in vivo.
Электрический киндлинг in vivo представляет собой экспериментальную модель
эпилептогенеза, в которой судорожная активность возникает у исходно нормальных
животных в результате электрической стимуляции. Это ставит под сомнение сходство
его механизмов с механизмами эпилепсии, в которой значительную роль играют
генетические изменения.
Аудиогенная судорожная активность
Одна из наиболее распространенных генетических моделей судорожной
активности – аудиогенная. Аудиогенные судороги у генетически предрасположенных
к ним животных связаны с патологией в слуховых путях ствола мозга (Chakravarty and
Faingold 1997; Ribak et al. 1994). Однако, хроническая звуковая стимуляция может
приводить к распространению судорожных разрядов из ствола мозга в лимбические
структуры (Веретенников, 1996; N'Gouemo and Faingold 1997). В этом случае,
чувствительность нейронов поля СА1 к экспериментальным воздействиям может
измениться. Для изучения будут ли эти изменения носить характер сходный с
пачечной активностью, которую вызывают повышения внеклеточной концентрации
калия, мы использовали крыс линии Крушинского-Молодкиной, склонных к
аудиогенным судорогам.
Животные подвергались хронической звуковой стимуляции (см. Материалы и
методы). При этом наблюдались прогрессирующие изменения поведенческих реакций
в ответ на повторяющуюся звуковую стимуляцию: сокращение латентного периода
начала судорог, изменение структуры судорог и увеличение их тяжести (Рис.3.6.2б1).
Развившись, это состояние поддерживалось в течение длительного времени (не менее
199
одной недели в проверочном эксперименте). Этот паттерн развития аудиогенных
судорог получил в литературе название - аудиогенный киндлинг (Feng et al. 2001;
Garcia-Cairasco et al. 1996; Kiesmann et al. 1988). В качестве контроля использовались
крысы этой же линии, не подвергавшиеся хронической звуковой стимуляции.
Мы регистрировали вызванные популяционные спайки в str.pyramidale поля СА1
срезов гиппокампа полученных от крыс линии Крушинского-Молодкиной:
контрольных и киндлинговых. При этом у животных после киндлинга, в отличие от
контрольных, наблюдались ярко выраженные множественные спайки в ответ на
электрическую стимуляцию коллатералей Шаффера (число популяционных разрядов в
пачке: 3,8 ± 0,7 и 1,8 ± 0,4 у животных после аудиогенного киндлинга и контрольных,
соответственно, P=0,014; Рис.3.6.2б2). Затем, мы использовали три кратковременных
эпизода повышения внеклеточной концентрации калия (Рис.3.6.2б3). У контрольных
животных наблюдалось увеличение числа разрядов во множественном спайке, тогда
как у животных после киндлинга статистически значимых изменений не наблюдалось.
Этот результат свидетельствует в пользу сходства механизмов развития пачечной
активности в поле СА1 гиппокампа при аудиогенной судорожной активности in vivo и
при использовании эпизодов повышения внеклеточной концентрации калия in vitro.
3.6.4 Является ли пачечная активность в поле СА1 гиппокампа
эпилептиформной?
Эпилептиформная активность – это вид электрической активности нейрональной
сети, которая напоминает активность при эпилепсии. С этой точки зрения, развитие
множественных спайков в поле СА1 срезов гиппокампа в ответ на эпизоды повышения
внеклеточной концентрации калия было сходным с тем, что наблюдалось в срезах
гиппокампа от животных, у которых создавались судороги in vivo (электрический и
аудиогенный киндлинг). С другой стороны, эпилептиформная активность должна
200
удовлетворять трем основным критериям. Во-первых, принципиальные нейроны
должны разряжаться пачками спайков. Во-вторых, эта активность должна быть
синхронизирована. В-третьих, синхронизированная активность должна
распространяться в мозге. Как ни странно, всем трем критериям удовлетворяет и
генерация нормальных ритмов в ЦНС. Таким образом, нужно сделать уточнение, что
эпилептиформная активность – это патологическая ритмическая активность,
сопровождающаяся судорожной поведенческой реакцией. К сожалению, срезы
гиппокампа не является идеальным объектом для исследования распространения
эпилептиформной активности в другие структуры, и мы не можем с уверенностью
сказать, будут ли распространяться множественные разряды, вызываемые эпизодами
ритмические (эпилептиформные)
разряды
синхронизированные
разряды
СА1
способно к генерации
пачечной активности
коллатерали
Шаффера
СА3
способно к
синхронизированным
разрядам
Рис 3.6.3 Гипотетическая схема развития ритмической (эпилептиформной)
активности в гиппокампе
Пирамидные нейроны поля СА1 способны генерировать пачку разрядов на одиночный
разряд пресинаптической терминали. Синхронная активация терминалей пирамидных
нейронов поля СА3 (коллатералей Шаффера), образующих синапсы на дендритах
пирамидных клеток СА1, приводит с синхронизированной пачечной активности в
гиппокампе. Это может быть механизмом как для формирования нормальных ритмов
(например, тетта ритма), так эпилептогенеза.
201
повышения внеклеточной концентрации калия в поле СА1. Кроме того,
затруднительно ответить и на вопрос о синхронизации этой активности. В наших
экспериментах электрическая стимуляция глутаматергических афферентов сама по
себе являлась синхронизующим фактором. Но будут ли пирамидные нейроны
разряжаться синхронно в ее отсутствие? Нами не было замечено никаких форм
популяционных ответов в отсутствие стимуляции. Этот факт свидетельствует против
того, что пачечные разряды в СА1 могут быть синхронизованы за счет внутренних
механизмов. Однако, нужно принять во внимание, что ситуация в целом мозге может
значительно отличаться от данных полученных на срезах.
На основании вышеизложенного, возникает вопрос, как классифицировать
пачечную активность в поле СА1, характерную для моделей эпилептогенеза in vivo и
возникающую при повторяющихся эпизодах повышения внеклеточной концентрации
калия in vitro. Маловероятно, что данные пачечные разряды могут возникать
синхронно, а область быть очагом инициации эпилептогенеза. Хотя, можно
предположить, что СА1 играет роль “усилителя” синхронных разрядов, генерируемых
пирамидными нейронами поля СА3. Другими словами: система СА3-СА1 гиппокампа
способна быть источником ритмической, в частности эпилептиформной, активности
(Рис. 3.6.3).
3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля СА1 генерировать
пачечные разряды сопровождается повышением
возбудимости этих клеток
Полагая, что способность пирамидных нейронов поля СА1 отвечать
множественным спайком на одиночный стимул после эпизодов повышения
202
внеклеточной концентрации калия, является формой пластичности (возможно
патологической), мы решили исследовать механизмы этого феномена.
Мы разделили передачу сигнала в поле СА1 на три этапа: передача возбуждения по
пресинаптическим волокнам, синаптическая передача и генерация потенциала
действия в пирамидных нейронах.
Для оценки возбудимости пресинаптических волокон мы построили зависимости
амплитуды потенциала волокон (мВ) от силы тестирующего стимула (μА) (Рис 3.6.4а).
Периодические повышения внеклеточной концентрации калия не оказывали
значительного влияния на характер этих кривых. Этот результат указывает на то, что
коллатерали Шаффера не меняют своей возбудимости при данном воздействии.
Для оценки эффективности синаптической передачи мы построили зависимости
наклона пВПСП (мВ/мс) от амплитуды потенциала волокон (мВ). Эпизоды повышения
калия так же не оказывали существенного влияния на глутаматергическую
синаптическую передачу (Рис. 3.6.4б).
Для оценки возбудимости пирамидных нейронов мы построили зависимость
амплитуды популяционного спайка (мВ) от наклона пВПСП (мВ/мс). Обнаружилось,
что использование трех эпизодов повышения внеклеточной концентрации калия
приводит к долговременному (сходного со временем генерации множественных
спайков) сдвигу этой зависимости в область более высоких значений, то есть,
потенцирует передачу сигнала в этом участке (Рис. 3.6.4в). Амплитуда
популяционного спайка после воздействия была 248 ± 37 % от его амплитуды до
калиевых эпизодов (данные получены для наклона пВПСП = 0,5 мВ/мс через час после
воздействия; р=0,038).
203
б
0.6
0.4
0.2
0
0
100 200 300 400
стимул ( A)
в
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
4
3
ПС (мВ)
0.8
пВПСП (мВ/мс)
пВ (мВ)
a
2
1
0
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
пВ (мВ)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
пВПСП (мВ/мс)
Рис. 3.6.4 Развитие пачечной активности сопровождается увеличением
возбудимости пирамидных клеток
а, Зависимость амплитуды потенциала пресинаптических волокон (коллатералей
Шаффера; пВ) от амплитуды электрического стимула. Данные усреднены по
нескольким экспериментам (n=5). Периодические эпизоды повышения внеклеточной
концентрации калия (3 эпизода по 30 секунд с интервалом 10 минут, концентрация
20 мМ) не приводили к изменениям в возбудимости терминалей (-○- и -□- зависимости до и через час после воздействия, соответственно).
б, Зависимость наклона (мВ/мс) полевого ВПСП (глутаматергическая синаптическая
передача; пВПСП) от амплитуды потенциала пресинаптических волокон. Данные
усреднены по нескольким экспериментам (n=5). Периодические эпизоды повышения
внеклеточной концентрации калия (3 эпизода по 30 секунд с интервалом 10 минут,
концентрация 20 мМ) не приводили к изменениям в эффективности
глутаматергической синаптической передачи (-○- и -□- - зависимости до и через час
после воздействия, соответственно).
в, Зависимость амплитуды популяционного спайка, регистрируемого в str.pyramidale
(возбудимость пирамидных клеток; ПС) от наклона полевого ВПСП. Данные
усреднены по нескольким экспериментам (n=5). Периодические эпизоды повышения
внеклеточной концентрации калия (3 эпизода по 30 секунд с интервалом 10 минут,
концентрация 20 мМ) приводили к значительному повышению возбудимости
нейронов (-○- и -□- - зависимости до и через час после воздействия, соответственно).
Разбросы указывают ± с.о.с
Возникает вопрос, играет ли роль это увеличение возбудимости пирамидных
нейронов в их способности генерировать пачечный разряд? Возбудимость мембраны
определяется способностью генерировать потенциал действия на деполяризацию.
Другими словами, повышение возбудимости внесинаптической мембраны это
повышение вероятности генерации потенциала действия. Способность генерировать
пачечный разряд может определяется длительностью деполяризации при неизменной
204
вероятности генерации одиночного потенциала действия. Несомненно, повышение
возбудимости нейронов должно играть роль в добавлении дополнительных разрядов
на затухающей фазе деполяризации (Рис. 3.6.5). Поэтому следующей задачей
представленной работы был поиск возможных фармакологических способов
доказательства сходства или различия механизмов генерации вызванных
множественных спайков и потенциации амплитуды популяционного спайка.
Рис. 3.6.5 Механизмы формирования пачечной активности
а, Деполяризация, вызванная ВПСП, приводит к генерации потенциала действия в
нейронах (порог генерации обозначен пунктирной линией) б, ВПСТ увеличивается
благодаря синаптической потенциации или облегчению электротонического
проведения из дендритов в аксонный холмик. Возникает множественный разряд. в,
Порог генерации потенциалов действия снижается, что приводит к генерации
множественного разряда на ту же амплитуду ВПСТ. г, Множественный разряд
возникает при неизменном пороге и амплитуде деполяризации, более длительной по
времени.
205
3.6.6 Роль NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов в
повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации
пачечных разрядов
Мы исследовали какой эффект произведут три периодических эпизода повышения
калия в присутствии D,L-APV (50 μM, селективного антагониста NMDA рецепторов).
Добавление АPV в момент эпизодов повышения калия приводило к значительно
меньшему увеличению числа популяционных спайков в ответ на электрическую
стимуляцию в сравнении с контрольными экспериментами (эпизоды повышения калия
без APV) (Рис. 3.6.6а). Кроме того, в присутствии APV не происходило потенциации
передачи в звене пВПСП-популяционный спайк. Это результаты указывают на то, что
для инициации полноценной пачечной активности в поле СА1 гиппокампа требуется
повышение возбудимости клеток, в котором принимают участие NMDA рецепторы
глутамата. Тем не менее, добавление APV не полностью подавило развитие
множественных спайков. Эпизоды повышения калия приводили к небольшому, но
статистически значимому увеличению числа популяционных разрядов в ответ на
одиночный электрический стимул. Вероятным объяснением этому является то, что
развитие пачечного разряда определяется не только возбуждающими механизмами, но
и тормозными, а также механизмами независящими от синаптических событий. Так
калиевые эпизоды приводят к деполяризации, которая влияет не только на
возбуждающую синаптическую передачу, но также тормозную синаптическую
передачу и внесинаптическую мембрану нейронов. До последнего времени считалось,
что ГАМКергической передаче не свойственна пластичность. Однако, недавно было
показано наличие посттетанических пластических изменений в ГАМКергических
токах в гиппокампе (Jensen and Mody 2001; Walker et al. 2001). Причем, в зависимости
от того были блокированы потенциал зависимые кальциевые каналы L-типа,
206
тетанизация приводила либо к потенциации, либо к депрессии этих ответов (Jensen and
Mody 2001). С другой стороны, L-тип кальциевых каналов может принимать участие в
возбудимости внесинаптической мембраны пирамидных клеток. Поэтому, мы решили
проверить, будут ли развиваться множественные разряды в поле СА1 гиппокампа, если
блокировать этот тип кальциевых каналов во время эпизодов повышения калия.
Добавление нимодипина (10 μМ, относительно специфического блокатора L-типа
кальциевых каналов) при использовании трех периодических эпизодов повышения
калия полностью подавляло как развитие пачечных разрядов, так и увеличение
возбудимости пирамидных нейронов (Рис 3.6.6б). Таким образом, повышение
возбудимости пирамидных нейронов определяется активацией двух различных
кальциевых проводимостей. В одном случае это активация NMDA рецепторов,
играющих роль в пластичности глутаматергической передачи, в другом потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа, принимающих участие в пластичности
ГАМКергической синаптической передачи. Один их возможных механизмов
заключается в том, что активация NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов
приводит к повышению внутриклеточного Ca2+ в пирамидных клетках. Являясь
вторичным посредником, этот ион может запускать процессы фосфорилирования
белков регулирующих возбудимость. Кроме этого, блокада L-типа кальциевых каналов
может влиять на ГАМКергическое торможение, что в последствии отражается на
активности пирамидных нейронов. Возможно, по этой причине (регуляции
ГАМКергического торможения) L-тип кальциевых каналов играет более значимую
роль в генерации пачечной активности, которая может являться комбинацией
увеличения возбудимости пирамидных клеток и снижения их торможения. К
сожалению, по причине многообразия эффектов повышения внутриклеточной
207
Число спайков
a
3К +
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
-20
б
0
20
40
60
80
100 120
контроль
50 M APV
10 M нимодипин
2.5
ПС, мВ
3К +
2.0
1.5
1.0
-20
0
20
40
60
80
100 120
Время (мин)
Рис. 3.6.6 Роль NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов в развитии
пачечной активности и увеличении возбудимости пирамидных нейронов в
поле СА1 гиппокампа
а, Аппликация 50 µМ APV значительно снижала увеличение числа спайков,
регистрируемых в str.pyramidale поля СА1 срезов гиппокампа в ответ на одиночный
стимул в str.radiatum, возникающее в результате 3-х периодических повышений
внеклеточной концентрации калия (20 мМ, интервал 10 мин). Аппликация 10 µМ
нимодипина полностью подавляла это увеличение.
б, Аппликация как 50 µМ APV, так 10 µМ нимодипина полностью подавляла
увеличение амплитуды популяционных спайков, сопровождающее увеличение числа
спайков, регистрируемых в str.pyramidale поля СА1 срезов гиппокампа в ответ на
одиночный стимул в str.radiatum, при использовании 3-х периодических повышений
внеклеточной концентрации калия (20 мМ, интервал 10 мин).
Разбросы ± с.о.с
208
концентрации кальция в процессах генерации пачечной активности (Kohling et al.
2000), описать точную последовательность событий довольно трудно.
3.6.7 Заключение
Таким образом, в данном разделе работы было показано:
1. Периодические кратковременные эпизоды повышения внеклеточной концентрации
калия (20 µМ; 3 эпизода по 30 сек. с интервалом 10 мин.) приводят к
долговременной генерации множественных спайков в str.pyramidale поля СА1 в
ответ на одиночный электрический стимул. Развитие этой активности в СА1 не
зависит от событий происходящих в чувствительном к эпилептогезу поле СА3.
2. Полученные в СА1 множественные спайки не удовлетворяют всем критериям
эпилептиформной активности, а частности, не регистрируются в виде спонтанных
разрядов. Тем не менее, их наличие может быть частью событий в мозге,
облегчающих распространение эпилептиформной активности. Это подтверждается
наличием сходных по природе пачечных разрядов в поле СА1 срезов гиппокампа
полученных от животных после электрического и аудиогенного киндлингов in vivo.
3. Развитие множественных спайков в поле СА1 гиппокампа сопровождается
увеличением возбудимости пирамидных нейронов. Оба феномена зависят от
кальциевой проводимости. Блокада L-типа потенциал-зависимых кальциевых
каналов полностью подавлялет как развитие множественных спайков, так и
увеличение возбудимости пирамидных нейронов. Однако, роль NMDA рецепторов
является критической только для возбудимости нейронов, тогда как пачечная
активность зависит лишь частично от этого типа рецепторов.
Результаты, полученные в данном разделе работы, являются важным
свидетельством в пользу роли различных путей поступления кальция в клетку для
209
генерации пачечных разрядов нейронами поля СА1 гиппокампа. Развитие пачечной
активности в этом поле гиппокампа может быть важным механизмом в генерации
ритмической активности: как нормальной (например, тетта ритма), так и
патологической (например, эпилептиформной).
210
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В основе функционирования ЦНС лежат три основные системы – возбуждающая,
тормозная и модуляторная. Основным нейропередатчиком возбуждающей системы в
головном мозге является глутамат, а тормозной - ГАМК. Модуляторные эффекты
могут быть опосредованы различными системами (глутамат-, ГАМК-, моноамин-,
ацетилхолин-, пуринергической и др.) (Bouron 2001; Cherubini and Conti 2001; Khakh
and Henderson 2000; Vizi 2000). Взаимодействие между этими системами обеспечивает
основу для передачи, обработки и сохранения информации в мозге, а также генерации
его ритмов, которые являются своего рода тактовой частотой специфичной для его
областей (Boguszewicz et al. 1996; Vinogradova 2001). Нейропередатчики активируют
соответствующие им рецепторы двумя способами – направленным или синаптическим,
и диффузным (спилловер, volume transmission) (Agnati et al. 1995; Jansson et al. 2000;
Kullmann 2000; Kullmann and Asztely 1998). Синаптическая передача передает
информацию по узкому каналу цепочки синаптических переключений, тогда как
диффузная изменяет активность сразу целых групп клеток за счет их
внесинаптических рецепторов.
Синаптическая эффективность глутаматергической передачи может меняться. Этот
феномен носит название пластичности. Описаны как кратковременные, так и
долговременные виды пластичности (например, LTP) (Bliss and Lomo 1973; Holscher
1999; Huang 1998; Malenka 1994; Stanton 1996). Механизмы синаптической
пластичности разнообразны и включают активацию биохимических процессов в
клетке (в частности, опосредованных входом кальция) (Fukunaga et al. 1996; Lisman
and McIntyre 2001; Routtenberg 1985; Tokuda and Hatase 1998), перераспределение и
встраивание новых постсинаптических рецепторов (Isaac et al. 1999; Man et al. 2000),
изменение экспрессии определенных генов (Dragunow 1996; Walton et al. 1999) и т.д.
211
При этом считается, что ГАМКергические синапсы не столь пластичны, по сравнению
с глутаматергическими, хотя в них также обнаружены кратковременные пластические
изменения (Jensen and Mody 2001). Однако, разнообразие возможных форм
ионотропных ГАМКергических рецепторов указывает на более тонкую регуляцию
тормозных влияний. На настоящий момент только субъединиц ГАМКергических
рецепторов описано 18, а число возможных комбинаций в пентантамерной структуре
несоизмеримо больше (Costa 1998; Mehta and Ticku 1999). В представленной работе
нам удалось показать, что синаптические ионотропные ГАМКергические рецепторы в
гиппокампе гетерогенны. Интересно отметить, что в интернейронах str.radiatum поля
СА1 в генерации ТПСТ принимает участие, по всей видимости, несколько различных
типов рецепторов. При этом фармакологические свойства обнаруженного нами в этих
клетках типа ионотропных ГАМКергических рецепторов не являются характерными
ни для одного из ранее описанных. В чем же функциональное значение различных
рецепторов в одном и том же синапсе? Ответить на этот вопрос однозначно довольно
сложно. ГАМКергическая передача претерпевает значительные изменения в
эмбриональный и постэмбриональный периоды (Hevers and Luddens 2002; Shaw et al.
1991). Возможно, что часть ГАМКергических рецепторов присутствующих на этой
стадии сохраняется и во взрослом мозге. С другой стороны, состав ионотропных
ГАМКергических рецепторов может меняться при различных патологических
состояниях, в частности, при эпилепсии (Nusser et al. 1998a; Schwarzer et al. 1997).
Таким образом, можно предположить, что изменение пропорции функционально
различных рецепторов в тормозных синапсах представляет собой форму пластичности
(или защитного механизма).
212
Клеткоспецифичность ГАМКергического торможения в гиппокампе
В данной работе нам удалось показать, что распределение ГАМКергических
рецепторов в гиппокампе, структуре, связанной с кратковременной памятью и
вовлекаемой в некоторые формы эпилепсии, зависит от типа постсинаптической
клетки. В частности, фармакологические и биофизические свойства ионотропных
ГАМКергических рецепторов, принимающих участие в синаптической передаче,
различаются в интернейронах и пирамидных клетках. Неожиданным оказалось, что
чувствительность к пикротоксину ГАМКергической синаптической передачи в
интернейронах намного ниже, чем в пирамидных клетках. С практической точки
зрения, это значит, что традиционно используемая для блокады ТПСТ концентрация
данного антагониста может не полностью подавлять ГАМКергические токи в
интернейронах.
Другим клеткоспецифичным феноменом оказалась ГАМКергическая тоническая
проводимость в интернейронах str.radiatum поля СА1. Так, мы показали, что в этих
клетках при базовых условиях существует постоянный ГАМКергический ток, который
фармакологически отличен от ГАМКергических ТПСТ. Причем, в возбуждающих
пирамидных клетках этого тока обнаружено не было. Таким образом, в нормальном
мозге активность интернейронов несколько подавлена тонически. Сам по себе, этот
факт играет важную роль для понимания механизмов регуляции возбудимости
нейрональных сетей. При этом фармакологическая специфичность тонического
торможения в интернейронах является привлекательной как мишень для препаратов,
снижающих или увеличивающих возбудимость нейрональной сети (см. также раздел
3.2.4).
Нужно отметить, что повышение внеклеточной концентрации ГАМК, которое в
наших экспериментах было получено при блокировании обратного захвата (uptake)
213
медиатора, приводило к возникновению ГАМКергического тонического тока как в
интернейронах, так и в пирамидных клетках. Подобная ситуация с увеличением в
мозге ГАМК может наблюдаться при эпилептогенезе (Treiman 2001) и может служить
защитным механизмом, подавляя активность пирамидных клеток. Однако, данный тип
тонической проводимосте не специфичен только для пирамидных клеток. Повышение
тонического торможения интернейронов может оказывать проэпилептогенный эффект.
Клеткоспецифичность модуляции ГАМКергического торможения в
гиппокампе
Помимо клеткоспецифичности различных форм ГАМКергического торможения в
гиппокампе, в представленной работе была продемонстрирована клеткоспецифичность
модуляции ГАМКергической передачи глутаматергическими гетерорецепторами:
каинатными и метаботропными. Так было показано, что метаботропные рецепторы
группы III селективно подавляют выброс медиатора в тормозных ГАМКергических
терминалях, оканчивающихся на интернейронах str.radiatum поля СА1 гиппокампа, но
не в терминалях на возбуждающих пирамидных клетках. С другой стороны, было
показано, что аксональные каинатные рецепторы увеличивают возбудимость
пресинаптических терминалей, образующих синапсы на интернейронах. Тем не менее,
при кажущейся противоположности эффектов совместной активации данных
рецепторов, их действие может быть комплиментарным. Для объяснения этого
парадокса, мы предложили идею фильтра “сигнал-шум” (см. раздел 3.5). Смысл ее
заключается в том, что метаботропные рецепторы подавляют спонтанный выброс
ГАМК в синапсах расположенных на интернейронах, снижая фоновое торможение
(“шум”) этих клеток. Активация каинатных рецепторов, в данном случае, увеличивает
возбудимость терминалей и, соответственно, вероятность генерации в них
потенциалов действия (“сигнал”). Таким образом, значимая информация передается
214
эффективно в системе синаптических ГАМКергических связей между
интернейронами, тогда как их фоновое торможение снижено.
Помимо клеточной специфичности модуляции ГАМКергической передачи
глутаматергическим гетерорецепторами, важным результатом является сама
возможность несинаптического взаимодействия между возбуждающей и тормозной
системами. Полученные данные указывают на важную роль диффузной нейропередачи
(спилловера нейропередатчиков) для нормального функционирования мозга.
Возможно, принимая во внимание этот тип взаимодействий, удастся создать более
реалистичную модель обработки информации в ЦНС. Несомненно, внесинаптические
эффекты не ограничиваются только влиянием глутамата на ГАМКергическую
тормозную нейропередачу. Внеклеточная ГАМК также эффективна как модулятор.
Этот эндогенный агонист, действуя внесинаптически, принимает участие в тоническом
(постоянном) торможении клеток, может регулировать выброс медиатора, действуя
через метаботропные ГАМКВ рецепторы как в тормозных (см. раздел 3.3.9), так и в
возбуждающих синапсах (Isaacson 2000; Isaacson et al. 1993; Mott and Lewis 1994). По
аналогии с каинатными рецепторами, ионотропные аксональные ГАМКА рецепторы
регулируют возбудимость терминалей и вероятность возникновения в них
потенциалов действия (Stasheff et al. 1993). Нам также удалось получить данные о
снижении возбудимости коллатералей Шаффера при внеклеточной аппликации
муцимола (агониста ионотропных ГАМКергических рецепторов). Эти данные не были
представлены в данной диссертационной работе, поскольку выходили за пределы цели
и задач. Кроме того, за пределами представленной работы остались полученные нами
данные о холинергической модуляции ГАМКергической передачи в гиппокампальных
интернейронах, опосредованной никотиновыми рецепторами. Таким образом, помимо
представленных здесь данных, существует ряд свидетельств внесинаптических
215
эффектов связанных с другими системами нейропередачи. Исходя из этого, можно
заключить, что для нормальной работы мозга помимо синаптической нейропередачи
важную роль играют внесинаптические диффузные факторы. Причем, как
синаптическая система, так и внесинаптическая являются клеткоспецифичными.
Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
Особенности ГАМКергического фазического и тонического торможения и
механизмов его модуляции играют важную роль в балансе возбуждения и торможения
в мозге. Таким образом, патологические состояния мозга, связанные с нарушением
этого баланса (например, эпилептогенез) могут приводить к определенным
изменениям, как в торможении, так и его модуляции. Однако, определенную
сложность представляет выяснение причины и следствий эпилептогенеза. Другими
словами, приводит ли снижение торможения к эпилептогенезу или изменения в
торможении являются его следствием? Основываясь на данных, что у пациентов с
эпилепсией обнаружены мутации в кальциевых каналах, мы исследовали различные
пути поступления кальция в клетку для генерации пачечных разрядов в пирамидных
нейронах поля СА1 срезов гиппокампа. Для этого была использована оригинальная
модель периодических повышений внеклеточной концентрации калия (3 повышения
калия до 20 µМ с интервалом 10 минут). Такое воздействие приводило к
долговременной генерации множественных разрядов в ответ на одиночный стимул.
Причем инициация пачечной активности зависела от L-типа кальциевых каналов и
потенцировалась за счет активации NMDA рецепторов. Любопытно, что L-тип
кальциевых каналов вовлекается в увеличение возбудимости внесинаптической
мембраны пирамидных клеток (Magee and Johnston 1995) и изменение эффективности
ГАМКергической передачи (Jensen and Mody 2001). NMDA рецепторы являются
принципиально важными для потенциации глутаматергической синаптической
216
передачи (Grosshans et al. 2002; Villarreal et al. 2002). На основании полученных
данных, можно заключить, что для генерации пачечных разрядов в возбуждающих
клетках необходим комплекс факторов, вероятно, вовлекающих как тормозные, так и
возбуждающие процессы.
С другой стороны, если при эпилептиформной активности происходит сдвиг
баланса возбуждения-торможения в сторону возбуждения, то вещества селективно
увеличивающие ГАМКергическое торможение возбуждающих клеток могут служить
антиконвульсантами. Например, некоторые антиэпилептические препараты оказывают
влияние на метаботропные глутаматные рецепторы (Abdul-Ghani et al. 1997; Chapman
et al. 1999; Ghauri et al. 1996; Tizzano et al. 1995a; Tizzano et al. 1995b). Как мы показали
в данной работе, активация mGluR группы III приводит к снижению торможения в
гиппокампальных интернейронах, что в свою очередь приводит к повышению
торможения пирамидных клеток. Агонисты каинатных рецепторов являются мощными
конвульсантами (Ben-Ari and Cossart 2000; Bouilleret et al. 1999; Hellier et al. 1998).
Несомненно, активация каинатных рецепторов на возбуждающих нейронах прямо
увеличивает возбудимость нейрональной сети. При этом, как мы показали, в
интернейронах гиппокампа увеличивается ГАМКергическое торможение (как
фазическое, так и тоническое). Этот эффект будет снижать торможение пирамидных
клеток в дополнение к прямому эффекту на них экзогенного агониста.
Помимо про- и антиэпилептогенных эффектов модуляторов ГАМКергической
передачи прямое влияние на ГАМКергические рецепторы будет менять возбудимость
нейронов. Причем, важно не только каким фармакологическим профилем обладает
вещество (агонист, антагонист, аллостерический модулятор), но и на какой тип
нейронов он будет действовать. Общая схема возможных анти- и проэпилептических
217
218
ПК
синаптические
ГАМК рецепторы
NMDA рецепторы
ИН2
mGluR группы III
коллатерали
Шаффера
внесинаптические
ГАМК рецепторы
ИН1
каинатные
рецепторы
Рис. 4.1 Механизмы регуляции возбудимости нейрональной сети поля СА1 гиппокампа
(описание см. таблицу 4.1) ПК - пирамидная клетка; ИН1- ГАМКергический интернейрон,
оказывающий торможение на пирамидную клетку; ИН2 - ГАМКергический (”дезингибиторный”)
интернейрон, оказывающий торможение на другой интернейрон.
L-тип
Ca2+ каналов
Таблица 4.1 Механизмы регуляции возбудимости нейрональной сети поля СА1
гиппокампа
Тип
рецепторов/каналов
Особенности
Роль в эпилептогенезе
Синаптические
ионотропные ГАМК
рецепторы
Различны между
интернейронами и
пирамидными клетками по
субъединичному составу и
фармакологически
Фармакологическое различие
позволяет селективно повышать
торможение в пирамидных клетках
или снижать в интернейронах.
Может быть использовано в
качестве антиэпилептического
воздействия
Внесинаптические
ионотропные ГАМК
рецепторы
Принимают участие в
тоническом торможении,
которое при базовых условиях
наблюдается только в
интернейронах
Селективное подавление
тонического торможения в
интернейронах приводит к
увеличению фазического
торможения пирамидных клеток,
что может выступать в качестве
антиэпилептогенного эффекта.
Метаботропные
глутаматергические
рецепторы группы III
Селективно снижают выброс
ГАМК в синапсах
расположенных на
интернейронах, но не
пирамидных клетках.
Некоторые антиконвульсанты
влияют на mGluR группы III.
Снижение торможения
интернейронов может усиливать
торможение пирамидных клеток.
Каинатные рецепторы
Аксональные каинатные
рецепторы увеличивают
торможение интернейронов и
могут прямо увеличивать
возбудимость пирамидных
клеток.
Агонисты каинатных рецепторов
мощные хемоконвульсанты.
NMDA рецепторы
Играют ключевую роль в
потенциации синаптической
передачи и увеличении
возбудимости пирамидных
клеток. Частично принимают
участие в генерации пачечной
активности.
Блокада NMDA рецепторов может
оказывать антиэпилептогенный
эффект.
L-тип потенциал –
зависимых кальциевых
каналов
Принимают участие в
повышении возбудимости
внесинаптической мембраны
пирамидных клеток и в
изменении эффективности
ГАМКергической передачи.
Играют ключевую роль в
генерации пачечной
активности.
Блокада этих каналов может
оказывать антиэпилептогенный
эффект.
219
эффектов веществ влияющих на ГАМКергические механизмы, описанные в данной
диссертационной работе, представлена в таблице 4.1 (см также Рис. 4.1).
220
ВЫВОДЫ
1. а) ГАМКергические ТПСТ в интернейронах менее чувствительны к пикротоксину, а
ГАМКергические рецепторы обладают более низкой средней проводимостью
одиночного канала, чем в пирамидных клетках.
б) CACA, агонист ГАМКС рецепторов, вызывает ток как в интернейронах, так и
пирамидных клетках. В пирамидных нейронах ток, вызываемый CACA,
нечувствителен к пентобарбиталу, что характерно для классических ГАМКС
рецепторов. В интернейронах пентобарбитал значительно усиливает этот ток, что
указывает на наличие в них нетипичных ГАМКергических рецепторов.
в) Аппликация 100 μМ пикротоксина фармакологически изолирует популяцию
ГАМКергических рецепторов в интернейронах, которая обладает
фармакологическим свойствами (чувствительность к агонистам, антагонистам и
аллостерическим модуляторам) как ГАМКА, так и ГАМКС рецепторов. Эти
рецепторы обладают Cl-/HCO3- проводимостью, характерной для типичных
ионотропных ГАМКергических рецепторов.
2. а) В интернейронах str.radiatum, но не пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа,
при нормальных условиях помимо фазического торможения (ГАМКергических
ТПСТ) существует пикротоксин-чувствительный ГАМКергический тонический
ток.
б) Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК при блокаде ее обратного захвата
приводит к возникновению тонического тока как в интернейронах, так и в
пирамидных клетках.
в) ГАМКергический тонический ток в интернейронах при нормальных условиях
фармакологически отличается от ГАМКергического тонического тока,
связанного с повышением внеклеточной концентрации ГАМК.
221
г) Повышение температуры приводит к увеличению частоты спонтанных ТПСТ
(фазических токов). При этом сохраняется клеточная специфичность тонической
проводимости для интернейронов, но не пирамидных клеток.
3. а) Активация пресинаптических метаботропных рецепторов группы III приводит к
снижению вероятности выброса медиатора в ГАМКергических и
глутаматергических синапсах, расположенных на гиппокампальных
интернейронах, но не пирамидных клетках.
б) Метаботропные рецепторы группы III, расположенные на тормозных терминалях,
активируются за счет спилловера глутамата с соседних возбуждающих синапсов.
Этот процесс лимитируется обратным захватом глутамата и усиливается при
увеличении возбудимости нейрональной сети.
в) Активация mGluR группы III снижает как амплитуду вызванных ТПСТ, так и
частоту спонтанных ТПСТ в интернейронах.
г) Аналогично спилловеру глутамата, активирующему mGluR группы III,
происходит спилловер ГАМК, активирующий ГАМКB рецепторы на тормозных
ГАМКергических терминалях. Этот процесс также ведет к гетеросинаптической
депрессии.
4. а) Активация аксональных каинатных рецепторов приводит к деполяризации и
снижению порога генерации аксональных потенциалов действия, также как и
возникновению спонтанных ПД в интернейронах.
б) Разряды интернейронов приводят к увеличению частоты и средней амплитуды
спонтанных ТПСТ, что объясняется увеличением в них пропорции
мультиквантовых потенциал действия зависимых токов.
в) Активация каинатных рецепторов при аппликации каината усиливает как
вызванные фазические ТПСТ, так и тонический ГАМКергический ток в
222
интернейронах str.radiatum поля СА1 гиппокампа. Однако, в силу собственного
взаимодействия между этими двумя типами торможения динамика этого
усиления различна.
5. а) Периодические кратковременные эпизоды повышения внеклеточной
концентрации калия (20 µМ; 3 эпизода по 30 сек. с интервалом 10 мин.) приводят
к долговременной генерации множественных спайков в str.pyramidale поля СА1 в
ответ на одиночный электрический стимул. Развитие этой активности в СА1 не
зависит от событий происходящих в чувствительном к эпилептогезу поле СА3.
б) Полученные в СА1 множественные спайки не удовлетворяют всем критериям
эпилептиформной активности, а частности, не регистрируются в виде
спонтанных разрядов. Тем не менее, их наличие может быть частью событий в
мозге, облегчающих распространение эпилептиформной активности, что
подтверждается наличием сходных по природе пачечных разрядов в поле СА1
срезов гиппокампа полученных от животных после электрического и
аудиогенного киндлинга in vivo.
в) Развитие множественных спайков в поле СА1 гиппокампа сопровождается
увеличением возбудимости пирамидных нейронов. Оба феномена зависят от
кальциевой проводимости. Блокада L-типа потенциал-зависимых кальциевых
каналов полностью подавляла как развитие множественных спайков, так и
увеличением возбудимости пирамидных нейронов. Однако, роль NMDA
рецепторов была критической только для возбудимости нейронов, тогда как
пачечная активность зависела лишь частично от этого типа рецепторов.
223
СПИСОК РИСУНКОВ
Рис. 1.1 Фармакологические характеристики ионотропных ГАМКергических
рецепторов ..................................................................................................................... 19
Рис. 1.2 Рецепторы и транспортеры ГАМК в фазическом и тоническом торможении . 29
Рис. 1.3 Эпилептогенные и антиэпилептогенные факторы. Механизмы синхронизации
активности в группах нейронов................................................................................... 49
Рис. 2.1 Рабочая установка для проведения исследований на срезах гиппокампа и
схема взаимодействия ее частей .................................................................................. 59
Рис. 2.2 Область СА1 гиппокампа и типы клеток, с которых производилась запись .... 61
Рис. 2.3 Регистрация полевых потенциалов из идентифицированных областей
гиппокампа и оценка развития пачечной активности ............................................... 64
Рис. 2.5 Схема регистрации ионтофоретических токов на примере интернейрона поля
СА1 гиппокампа ............................................................................................................ 74
Рис. 2.6 Схема регистрации токов с outside-out пейча с использованием системы
быстрой аппликации ..................................................................................................... 76
Рис. 2.7 Использование метода нестационарного дисперсионного анализа для
определения биофизических параметров ГАМКергических рецепторов ............... 79
Рис. 3.1.1 ТПСТ в интернейронах менее чувствительны к пикротоксину, чем в
пирамидных клетках ..................................................................................................... 87
Рис. 3.1.2 Ионотропные ГАМКергические рецепторы в пирамидных клетках обладают
более высокой средней проводимостью одиночного канала, чем в интернейронах
......................................................................................................................................... 89
Рис. 3.1.3 Генерализованная аппликация САСА (50 µМ) вызывает большие по
амплитуде токи в пирамидных клетках, чем в интернейронах ................................ 92
Рис. 3.1.4 Ток, вызываемый аппликацией CACA, связан с прямой активацией
ионотропных ГАМКергических рецепторов ............................................................. 94
Рис. 3.1.5 Пентобарбитал потенцирует ток, вызываемый аппликацией CACA в
интернейронах, но не в пирамидных клетках ............................................................ 96
Рис. 3.1.6 ТПСТ в интернейронах, изолированные аппликацией 100 μМ пикротоксина,
более чувствительны к TPMPA ................................................................................... 99
Рис. 3.1.7 ТПСТ и токи в ответ на ионтофорез ГАМК и CACA в присутствии
пикротоксина в интернейронах опосредованы Cl-/HCO3- ..................................... 101
Рис. 3.1.8 Пентобарбитал (100 µМ) приводит к увеличению ТПСТ и
ионтофоретических ГАМК и CACA токов в присутствии пикротоксина (100 µМ)
....................................................................................................................................... 103
224
Рис. 3.1.9 ТПСТ в интернейронах, изолированные аппликацией 100 μМ пикротоксина,
менее чувствительны к золпидему ............................................................................ 105
Рис. 3.1.10 ТПСТ и ионтофоретические ГАМК-, CACA- и изогувазин -токи в
интернейронах, в присутствии 100 μМ пикротоксина, подавляются как
антагонистом ГАМКС рецепторов TPMPA, так и ГАМКА – бикукуллином ...... 107
Рис. 3.1.11 Фармакологический профиль ионотропных ГАМКергических рецепторов,
опосредующих пикротоксин-нечувствительные ТПСТ в интернейронах
str.radiatum поля СА1 гиппокампа............................................................................. 110
Рис. 3.2.1 Пикротоксин подавляет сТПСТ как в интернейронах, так и пирамидных
клетках ......................................................................................................................... 120
Рис.3.2.2 Тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими
рецепторами, и фазические токи (сТПСТ) в интернейронах обладают разной
чувствительностью к пикротоксину ......................................................................... 122
Рис. 3.2.3 Низкая концентрация SR95531 (0,5 µМ) селективно блокировала спонтанные
ТПСТ, но не оказывала значительного эффекта на ток компенсации................... 123
Рис. 3.2.4 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к тоническому
току и в интернейронах, и в пирамидных клетках .................................................. 125
Рис. 3.2.5 Эффект повышения температуры на фазические сТПСТ и тонический ток в
гиппокампальных нейронах ....................................................................................... 127
Рис. 3.2.6 Селективные антагонисты ионотропных ГАМКергических рецепторов могут
обладать антиэпилептическим действием ................................................................ 132
Рис. 3.3.1 L-AP4, агонист метаботропных рецепторов группы III, подавляет
моносинаптические ТПСТ и ВПСТ в интернейронах в равной степени .............. 136
Рис. 3.3.2 L-AP4 сравнительно неэффективно в снижении ВПСТ и ТПСТ в
пирамидных нейронах ................................................................................................ 138
Рис. 3.3.3 Депрессия ТПСТ, вызываемая серией низкочастотных стимулов,
чувствительна к MSOP (100 μМ)............................................................................... 140
Рис. 3.3.4 Гетеросинаптическая депрессия ТПСТ, опосредованная ГАМКB и
метаботропными рецепторами группы III ................................................................ 142
Рис. 3.3.5 Увеличение гетеросинаптической депрессии, опосредованной mGluR
группы III, при блокаде обратного захвата глутамата ............................................ 145
Рис. 3.3.6 Двухфазная динамика гетеросинаптической депрессии, опосредованной
метаботропными рецепторами группы III ................................................................ 148
Рис. 3.3.7 L-AP4 снижает частоту спонтанных ТПСТ, но не ВПСТ в интернейронах 151
Рис. 3.3.8 Схема активации пресинаптических mGluR группы III за счет спилловера
глутамата...................................................................................................................... 155
225
Рис. 3.3.9 Схема взаимодействия метаботропных рецепторов-детекторов внеклеточной
концентрации ГАМК (ГАМКB) и глутамата (mGluR) ............................................ 160
Рис. 3.4.1 Каинат вызывает увеличение частоты и амплитуды спонтанных ТПСТ
(сТПСТ). ....................................................................................................................... 163
Рис.3.4.2 Каинат снижает порог возникновения антидромных токов действия .......... 166
Рис. 3.4.3 Активация аксональных каинатных рецепторов вызывает спонтанные ТД,
которые не зависят от соматического потенциала фиксации................................. 170
Рис. 3.4.4 Синаптически высвобождаемый глутамат увеличивает возбудимость аксонов
через каинатные рецепторы ....................................................................................... 172
Рис. 3.4.5 Аппликация 1 μМ, но не 250 нМ, каината повышает частоту миниатюрных
ТПСТ в интернейронах срезов гиппокампа крыс .................................................... 175
Рис. 3.4.6 Фармакологическое выделение ТПСТ, опосредованных ионотропными
ГАМКергическими рецепторами .............................................................................. 178
Рис 3.6.3 Гипотетическая схема развития ритмической (эпилептиформной) активности
в гиппокампе ............................................................................................................... 201
Рис. 3.6.5 Механизмы формирования пачечной активности .......................................... 205
Рис. 3.6.6 Роль NMDA рецепторов и L-типа кальциевых каналов в развитии пачечной
активности и увеличении возбудимости пирамидных нейронов в поле СА1
гиппокампа .................................................................................................................. 208
Рис. 4.1 Механизмы регуляции возбудимости нейрональной сети поля СА1
гиппокампа .................................................................................................................212
226
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Батуев, А.С., Брагина, Т.А., Александров, А.С. и Рябинская, Е.А., (1997)
“Аудиогенная эпилепсия: морфофункциональный анализ.” Жур. высш. нервн.
деят, 47(2): 431-438.
2.
Веретенников, Н.А., Куликова, Д.А., Панин, В.М. и Корочкин, Л.И., (1996)
“Биологические аспекты эпилепсии: морфологические и молекулярные
исследования аудиогенной эпилепсии.” Успехи совр. биологии, 116(4): 407-417.
3.
Abdul-Ghani, A. S., Attwell, P. J., Singh Kent, N., Bradford, H. F., Croucher, M. J.,
and Jane, D. E. (1997). “Anti-epileptogenic and anticonvulsant activity of L-2-amino-4phosphonobutyrate, a presynaptic glutamate receptor agonist.” Brain Res, 755(2), 20212.
4.
Agnati, L. F., Zoli, M., Stromberg, I., and Fuxe, K. (1995). “Intercellular
communication in the brain: wiring versus volume transmission.” Neuroscience, 69(3),
711-26.
5.
Agrawal, S. G., and Evans, R. H. (1986). “The primary afferent depolarizing action of
kainate in the rat.” Br J Pharmacol, 87(2), 345-55.
6.
Andrade, R., Malenka, R. C., and Nicoll, R. A. (1986). “A G protein couples serotonin
and GABAB receptors to the same channels in hippocampus.” Science, 234(4781),
1261-5.
7.
Anwyl, R. (1991). “Modulation of vertebrate neuronal calcium channels by
transmitters.” Brain Res Brain Res Rev, 16(3), 265-81.
8.
Arriza, J. L., Fairman, W. A., Wadiche, J. I., Murdoch, G. H., Kavanaugh, M. P., and
Amara, S. G. (1994). “Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes
cloned from human motor cortex.” J Neurosci, 14(9), 5559-69.
9.
Asztely, F., Erdemli, G., and Kullmann, D. M. (1997). “Extrasynaptic glutamate
spillover in the hippocampus: dependence on temperature and the role of active
glutamate uptake.” Neuron, 18(2), 281-93.
10. Bai, D., Zhu, G., Pennefather, P., Jackson, M. F., MacDonald, J. F., and Orser, B. A.
(2001). “Distinct functional and pharmacological properties of tonic and quantal
inhibitory postsynaptic currents mediated by gamma-aminobutyric acid(A) receptors in
hippocampal neurons.” Mol Pharmacol, 59(4), 814-24.
11. Bains, J. S., Longacher, J. M., and Staley, K. J. (1999). “Reciprocal interactions
between CA3 network activity and strength of recurrent collateral synapses.” Nat
Neurosci, 2(8), 720-6. java/Propub/neuro/nn0899_720.fulltext
java/Propub/neuro/nn0899_720.abstract.
12. Barnard, E. A., Skolnick, P., Olsen, R. W., Mohler, H., Sieghart, W., Biggio, G.,
Braestrup, C., Bateson, A. N., and Langer, S. Z. (1998). “International Union of
Pharmacology. XV. Subtypes of gamma-aminobutyric acidA receptors: classification
on the basis of subunit structure and receptor function.” Pharmacol Rev, 50(2), 291313.
227
13. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D., Mulvihill, E., McIlhinney, R. A., and Somogyi, P.
(1993). “The metabotropic glutamate receptor (mGluR1 alpha) is concentrated at
perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold
reaction.” Neuron, 11(4), 771-87.
14. Behr, J., Heinemann, U., and Mody, I. (2001). “Kindling induces transient NMDA
receptor-mediated facilitation of high- frequency input in the rat dentate gyrus.” J
Neurophysiol, 85(5), 2195-202.
15. Bellocchio, E. E., Reimer, R. J., Fremeau, R. T., Jr., and Edwards, R. H. (2000).
“Uptake of glutamate into synaptic vesicles by an inorganic phosphate transporter.”
Science, 289(5481), 957-60.
16. Ben-Ari, Y., and Cossart, R. (2000). “Kainate, a double agent that generates seizures:
two decades of progress.” Trends Neurosci, 23(11), 580-7.
17. Ben-Ari, Y., Tseeb, V., Raggozzino, D., Khazipov, R., and Gaiarsa, J. L. (1994).
“gamma-Aminobutyric acid (GABA): a fast excitatory transmitter which may regulate
the development of hippocampal neurones in early postnatal life.” Prog Brain Res, 102,
261-73.
18. Bergles, D. E., Diamond, J. S., and Jahr, C. E. (1999). “Clearance of glutamate inside
the synapse and beyond.” Curr Opin Neurobiol, 9(3), 293-8.
19. Bergles, D. E., Dzubay, J. A., and Jahr, C. E. (1997). “Glutamate transporter currents in
bergmann glial cells follow the time course of extrasynaptic glutamate.” Proc Natl
Acad Sci U S A, 94(26), 14821-5.
20. Bergles, D. E., and Jahr, C. E. (1997). “Synaptic activation of glutamate transporters in
hippocampal astrocytes.” Neuron, 19(6), 1297-308.
21. Bernard, C., Cossart, R., Hirsch, J. C., Esclapez, M., and Ben-Ari, Y. (2000). “What is
GABAergic inhibition? How is it modified in epilepsy?” Epilepsia, 41(Suppl 6), S90-5.
22. Bianchi, M. T., Haas, K. F., and Macdonald, R. L. (2001). “Structural determinants of
fast desensitization and desensitization- deactivation coupling in GABAa receptors.” J
Neurosci, 21(4), 1127-36.
23. Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., and Gage, P. W. (2000a). “Bicuculline,
pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat
hippocampal neurons.” Br J Pharmacol, 131(4), 695-704.
24. Birnir, B., Everitt, A. B., Lim, M. S., and Gage, P. W. (2000b). “Spontaneously
opening GABA(A) channels in CA1 pyramidal neurones of rat hippocampus.” J
Membr Biol, 174(1), 21-9.
25. Bleakman, D., Ballyk, B. A., Schoepp, D. D., Palmer, A. J., Bath, C. P., Sharpe, E. F.,
Woolley, M. L., Bufton, H. R., Kamboj, R. K., Tarnawa, I., and Lodge, D. (1996).
“Activity of 2,3-benzodiazepines at native rat and recombinant human glutamate
receptors in vitro: stereospecificity and selectivity profiles.” Neuropharmacology,
35(12), 1689-702.
228
26. Bliss, T. V., and Lomo, T. (1973). “Long-lasting potentiation of synaptic transmission
in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant
path.” J Physiol, 232(2), 331-56.
27. Boguszewicz, J., Skrajny, B., Kohli, J., and Roth, S. H. (1996). “Evidence that GABA,
serotonin, and norepinephrine are involved in the modulation of in vitro rhythmical
activity in rat hippocampal slices.” Can J Physiol Pharmacol, 74(12), 1322-6.
28. Bormann, J. (2000a). “The 'ABC' of GABA receptors.” Trends Pharmacol Sci, 21(1),
16-9. 1_00001413 1_00001413.
29. Bormann, J. (2000b). “The 'ABC' of GABA receptors.” Trends Pharmacol Sci, 21(1),
16-9.
30. Bormann, J., and Feigenspan, A. (1995). “GABAC receptors.” Trends Neurosci,
18(12), 515-9.
31. Borowicz, K. K., Kleinrok, Z., and Czuczwar, S. J. (2001). “Glutamate receptor
antagonists differentially affect the protective activity of conventional antiepileptics
against amygdala-kindled seizures in rats.” Eur Neuropsychopharmacol, 11(1), 61-8.
32. Bortolotto, Z. A., Clarke, V. R., Delany, C. M., Parry, M. C., Smolders, I., Vignes, M.,
Ho, K. H., Miu, P., Brinton, B. T., Fantaske, R., Ogden, A., Gates, M., Ornstein, P. L.,
Lodge, D., Bleakman, D., and Collingridge, G. L. (1999). “Kainate receptors are
involved in synaptic plasticity.” Nature, 402(6759), 297-301.
33. Bouilleret, V., Ridoux, V., Depaulis, A., Marescaux, C., Nehlig, A., and Le Gal La
Salle, G. (1999). “Recurrent seizures and hippocampal sclerosis following
intrahippocampal kainate injection in adult mice: electroencephalography,
histopathology and synaptic reorganization similar to mesial temporal lobe epilepsy.”
Neuroscience, 89(3), 717-29.
34. Bouron, A. (2001). “Modulation of spontaneous quantal release of neurotransmitters in
the hippocampus.” Prog Neurobiol, 63(6), 613-35.
35. Bowie, D., and Mayer, M. L. (1995). “Inward rectification of both AMPA and kainate
subtype glutamate receptors generated by polyamine-mediated ion channel block.”
Neuron, 15(2), 453-62.
36. Bradley, S. R., Levey, A. I., Hersch, S. M., and Conn, P. J. (1996).
“Immunocytochemical localization of group III metabotropic glutamate receptors in the
hippocampus with subtype-specific antibodies.” J Neurosci, 16(6), 2044-56.
37. Brickley, S. G., Cull-Candy, S. G., and Farrant, M. (1996). “Development of a tonic
form of synaptic inhibition in rat cerebellar granule cells resulting from persistent
activation of GABAA receptors.” J Physiol, 497(Pt 3), 753-9.
38. Brickley, S. G., Revilla, V., Cull-Candy, S. G., Wisden, W., and Farrant, M. (2001).
“Adaptive regulation of neuronal excitability by a voltage-independent potassium
conductance.” Nature, 409(6816), 88-92.
229
39. Brooks-Kayal, A. R., Shumate, M. D., Jin, H., Rikhter, T. Y., and Coulter, D. A.
(1998). “Selective changes in single cell GABA(A) receptor subunit expression and
function in temporal lobe epilepsy.” Nat Med, 4(10), 1166-72.
40. Burgess, D. L., and Noebels, J. L. (2000). “Calcium channel defects in models of
inherited generalized epilepsy.” Epilepsia, 41(8), 1074-5.
41. Cain, D. P. (1989). “Long-term potentiation and kindling: how similar are the
mechanisms?” Trends Neurosci, 12(1), 6-10.
42. Cammack, J. N., Rakhilin, S. V., and Schwartz, E. A. (1994). “A GABA transporter
operates asymmetrically and with variable stoichiometry.” Neuron, 13(4), 949-60.
43. Castillo, P. E., Malenka, R. C., and Nicoll, R. A. (1997). “Kainate receptors mediate a
slow postsynaptic current in hippocampal CA3 neurons.” Nature, 388(6638), 182-6.
44. Cattaert, D., and El Manira, A. (1999). “Shunting versus inactivation: analysis of
presynaptic inhibitory mechanisms in primary afferents of the crayfish.” J Neurosci,
19(14), 6079-89.
45. Cauli, B., Porter, J. T., Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Quenet, B., and Audinat,
E. (2000). “Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised
clustering.” Proc Natl Acad Sci U S A, 97(11), 6144-9.
46. Chaisewikul, R., Baillie, N., and Marson, A. G. (2001). “Calcium antagonists as an
add-on therapy for drug-resistant epilepsy (Cochrane Review).” Cochrane Database
Syst Rev, 4.
47. Chakravarty, D. N., and Faingold, C. L. (1997). “Aberrant neuronal responsiveness in
the genetically epilepsy-prone rat: acoustic responses and influences of the central
nucleus upon the external nucleus of inferior colliculus.” Brain Res, 761(2), 263-70.
48. Chapman, A. G., Nanan, K., Yip, P., and Meldrum, B. S. (1999). “Anticonvulsant
activity of a metabotropic glutamate receptor 8 preferential agonist, (R,S)-4phosphonophenylglycine.” Eur J Pharmacol, 383(1), 23-7.
49. Chaudhry, F. A., Reimer, R. J., Bellocchio, E. E., Danbolt, N. C., Osen, K. K.,
Edwards, R. H., and Storm-Mathisen, J. (1998). “The vesicular GABA transporter,
VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic
neurons.” J Neurosci, 18(23), 9733-50.
50. Chebib, M., and Johnston, G. A. (1997). “Stimulation of [3H] GABA and beta-[3H]
alanine release from rat brain slices by cis-4-aminocrotonic acid.” J Neurochem, 68(2),
786-94.
51. Chebib, M., Mewett, K. N., and Johnston, G. A. (1998). “GABA(C) receptor
antagonists differentiate between human rho1 and rho2 receptors expressed in Xenopus
oocytes.” Eur J Pharmacol, 357(2-3), 227-34.
52. Chen, K., Baram, T. Z., and Soltesz, I. (1999). “Febrile seizures in the developing brain
result in persistent modification of neuronal excitability in limbic circuits.” Nat Med,
5(8), 888-94. java/Propub/medicine/nm0899_888.fulltext.
230
53. Chen, Y. C., Kung, S. S., Chen, B. Y., Hung, C. C., Chen, C. C., Wang, T. Y., Wu, Y.
M., Lin, W. H., Tzeng, C. S., and Chow, W. Y. (2001). “Identifications, Classification,
and Evolution of the Vertebrate alpha- Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazole
Propionic Acid (AMPA) Receptor Subunit Genes.” J Mol Evol, 53(6), 690-702.
54. Cherubini, E., and Conti, F. (2001). “Generating diversity at GABAergic synapses.”
Trends Neurosci, 24(3), 155-62.
55. Cherubini, E., Martina, M., Sciancalepore, M., and Strata, F. (1998). “GABA excites
immature CA3 pyramidal cells through bicuculline-sensitive and -insensitive chloridedependent receptors.” Perspect Dev Neurobiol, 5(2-3), 289-304.
56. Chioza, B., Wilkie, H., Nashef, L., Blower, J., McCormick, D., Sham, P., Asherson, P.,
and Makoff, A. J. (2001). “Association between the alpha(1a) calcium channel gene
CACNA1A and idiopathic generalized epilepsy.” Neurology, 56(9), 1245-6.
57. Clements, J. D., Lester, R. A., Tong, G., Jahr, C. E., and Westbrook, G. L. (1992). “The
time course of glutamate in the synaptic cleft.” Science, 258(5087), 1498-501.
58. Cleton, A., Altorf, B. A., Voskuyl, R. A., and Danhof, M. (2000). “Effect of amygdala
kindling on the central nervous system effects of tiagabine: EEG effects versus brain
GABA levels.” Br J Pharmacol, 130(5), 1037-44.
59. Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., and Somogyi, P. (1995).
“Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic
interneurons.” Nature, 378(6552), 75-8.
60. Colquhoun, D., Jonas, P., and Sakmann, B. (1992). “Action of brief pulses of glutamate
on AMPA/kainate receptors in patches from different neurones of rat hippocampal
slices.” J Physiol, 458, 261-87.
61. Cossart, R., Dinocourt, C., Hirsch, J. C., Merchan-Perez, A., De Felipe, J., Ben-Ari, Y.,
Esclapez, M., and Bernard, C. (2001a). “Dendritic but not somatic GABAergic
inhibition is decreased in experimental epilepsy.” Nat Neurosci, 4(1), 52-62.
62. Cossart, R., Esclapez, M., Hirsch, J. C., Bernard, C., and Ben-Ari, Y. (1998). “GluR5
kainate receptor activation in interneurons increases tonic inhibition of pyramidal
cells.” Nat Neurosci, 1(6), 470-8.
63. Cossart, R., Tyzio, R., Dinocourt, C., Esclapez, M., Hirsch, J. C., Ben-Ari, Y., and
Bernard, C. (2001b). “Presynaptic kainate receptors that enhance the release of GABA
on CA1 hippocampal interneurons.” Neuron, 29(2), 497-508.
64. Costa, E. (1998). “From GABAA receptor diversity emerges a unified vision of
GABAergic inhibition.” Annu Rev Pharmacol Toxicol, 38, 321-50.
65. Coulter, D. A., Huguenard, J. R., and Prince, D. A. (1989). “Specific petit mal
anticonvulsants reduce calcium currents in thalamic neurons.” Neurosci Lett, 98(1), 748.
66. Couve, A., Moss, S. J., and Pangalos, M. N. (2000). “GABAB receptors: a new
paradigm in G protein signaling.” Mol Cell Neurosci, 16(4), 296-312.
231
67. Dalby, N. O. (2000). “GABA-level increasing and anticonvulsant effects of three
different GABA uptake inhibitors.” Neuropharmacology, 39(12), 2399-407.
68. D'Angelo, E., Nieus, T., Maffei, A., Armano, S., Rossi, P., Taglietti, V., Fontana, A.,
and Naldi, G. (2001). “Theta-frequency bursting and resonance in cerebellar granule
cells: experimental evidence and modeling of a slow k+-dependent mechanism.” J
Neurosci, 21(3), 759-70.
69. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., and Thompson, S. M. (1995).
“Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells
in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.” J Neurophysiol, 73(3), 128294.
70. Delaney, A. J., and Sah, P. (1999). “GABA receptors inhibited by benzodiazepines
mediate fast inhibitory transmission in the central amygdala.” J Neurosci, 19(22), 9698704.
71. Delaney, A. J., and Sah, P. (2001). “Pathway-specific targeting of GABA(A) receptor
subtypes to somatic and dendritic synapses in the central amygdala.” J Neurophysiol,
86(2), 717-23.
72. Dietrich, D., Kral, T., Clusmann, H., Friedl, M., and Schramm, J. (1999). “Reduced
function of L-AP4-sensitive metabotropic glutamate receptors in human epileptic
sclerotic hippocampus.” Eur J Neurosci, 11(3), 1109-13.
73. Dittman, J. S., and Regehr, W. G. (1997). “Mechanism and kinetics of heterosynaptic
depression at a cerebellar synapse.” J Neurosci, 17(23), 9048-59.
74. Dragunow, M. (1996). “A role for immediate-early transcription factors in learning and
memory.” Behav Genet, 26(3), 293-9.
75. Duprat, F., Lesage, F., Fink, M., Reyes, R., Heurteaux, C., and Lazdunski, M. (1997).
“TASK, a human background K+ channel to sense external pH variations near
physiological pH.” Embo J, 16(17), 5464-71.
76. During, M. J., and Spencer, D. D. (1993). “Extracellular hippocampal glutamate and
spontaneous seizure in the conscious human brain.” Lancet, 341(8861), 1607-10.
77. Edwards, F. R., Harrison, P. J., Jack, J. J., and Kullmann, D. M. (1989). “Reduction by
baclofen of monosynaptic EPSPs in lumbosacral motoneurones of the anaesthetized
cat.” J Physiol, 416, 539-56.
78. Eghbali, M., Gage, P. W., and Birnir, B. (2000). “Pentobarbital modulates gammaaminobutyric acid-activated single- channel conductance in rat cultured hippocampal
neurons.” Mol Pharmacol, 58(3), 463-9.
79. Enz, R., Brandstatter, J. H., Hartveit, E., Wassle, H., and Bormann, J. (1995).
“Expression of GABA receptor rho 1 and rho 2 subunits in the retina and brain of the
rat.” Eur J Neurosci, 7(7), 1495-501.
232
80. Enz, R., and Cutting, G. R. (1999). “GABAC receptor rho subunits are heterogeneously
expressed in the human CNS and form homo- and heterooligomers with distinct
physical properties.” Eur J Neurosci, 11(1), 41-50.
81. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., and Luscher, B. (1998).
“Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2
subunit and gephyrin.” Nat Neurosci, 1(7), 563-71.
82. Faas, G. C., Vreugdenhil, M., and Wadman, W. J. (1996). “Calcium currents in
pyramidal CA1 neurons in vitro after kindling epileptogenesis in the hippocampus of
the rat.” Neuroscience, 75(1), 57-67.
83. Faingold, C. L., Marcinczyk, M. J., Casebeer, D. J., Randall, M. E., Arneric, S. P., and
Browning, R. A. (1994). “GABA in the inferior colliculus plays a critical role in control
of audiogenic seizures.” Brain Res, 640(1-2), 40-7.
84. Feigenspan, A., and Bormann, J. (1994). “Differential pharmacology of GABAA and
GABAC receptors on rat retinal bipolar cells.” Eur J Pharmacol, 288(1), 97-104.
85. Feigenspan, A., Wassle, H., and Bormann, J. (1993). “Pharmacology of GABA
receptor Cl- channels in rat retinal bipolar cells.” Nature, 361(6408), 159-62.
86. Feng, H. J., Naritoku, D. K., Randall, M. E., and Faingold, C. L. (2001). “Modulation
of Audiogenically Kindled Seizures by gamma-Aminobutyric Acid-Related
Mechanisms in the Amygdala.” Exp Neurol, 172(2), 477-81.
87. Fisher, R. S., and Alger, B. E. (1984). “Electrophysiological mechanisms of kainic
acid-induced epileptiform activity in the rat hippocampal slice.” J Neurosci, 4(5), 131223.
88. Frerking, M., Malenka, R. C., and Nicoll, R. A. (1998). “Synaptic activation of kainate
receptors on hippocampal interneurons.” Nat Neurosci, 1(6), 479-86.
89. Frerking, M., Petersen, C. C., and Nicoll, R. A. (1999). “Mechanisms underlying
kainate receptor-mediated disinhibition in the hippocampus.” Proc Natl Acad Sci U S
A, 96(22), 12917-22.
90. Freund, T. F., and Buzsaki, G. (1996). “Interneurons of the hippocampus.”
Hippocampus, 6(4), 347-470.
91. Freund, T. F., and Gulyas, A. I. (1997). “Inhibitory control of GABAergic interneurons
in the hippocampus.” Can J Physiol Pharmacol, 75(5), 479-87.
92. Fritschy, J. M., Meskenaite, V., Weinmann, O., Honer, M., Benke, D., and Mohler, H.
(1999). “GABAB-receptor splice variants GB1a and GB1b in rat brain: developmental
regulation, cellular distribution and extrasynaptic localization.” Eur J Neurosci, 11(3),
761-8.
93. Fukunaga, K., Muller, D., and Miyamoto, E. (1996). “CaM kinase II in long-term
potentiation.” Neurochem Int, 28(4), 343-58.
233
94. Fykse, E. M., and Fonnum, F. (1996). “Amino acid neurotransmission: dynamics of
vesicular uptake.” Neurochem Res, 21(9), 1053-60.
95. Galarreta, M., and Hestrin, S. (1999). “A network of fast-spiking cells in the neocortex
connected by electrical synapses.” Nature, 402(6757), 72-5.
96. Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., and Poo, M. (2001). “GABA itself promotes
the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to
inhibition.” Cell, 105(4), 521-32.
97. Garcia, E. P., Mehta, S., Blair, L. A., Wells, D. G., Shang, J., Fukushima, T., Fallon, J.
R., Garner, C. C., and Marshall, J. (1998). “SAP90 binds and clusters kainate receptors
causing incomplete desensitization.” Neuron, 21(4), 727-39.
98. Garcia-Cairasco, N., Doretto, M. C., Ramalho, M. J., Antunes-Rodrigues, J., and
Nonaka, K. O. (1996). “Audiogenic and audiogenic-like seizures: locus of induction
and seizure severity determine postictal prolactin patterns.” Pharmacol Biochem Behav,
53(3), 503-10.
99. Gaspary, H. L., Wang, W., and Richerson, G. B. (1998). “Carrier-mediated GABA
release activates GABA receptors on hippocampal neurons.” J Neurophysiol, 80(1),
270-81.
100. Gereau, R. W. t., and Conn, P. J. (1995). “Multiple presynaptic metabotropic glutamate
receptors modulate excitatory and inhibitory synaptic transmission in hippocampal area
CA1.” J Neurosci, 15(10), 6879-89.
101. Ghauri, M., Chapman, A. G., and Meldrum, B. S. (1996). “Convulsant and
anticonvulsant actions of agonists and antagonists of group III mGluRs.” Neuroreport,
7(9), 1469-74.
102. Gilbert, M. E., and Mack, C. M. (1990). “The NMDA antagonist, MK-801, suppresses
long-term potentiation, kindling, and kindling-induced potentiation in the perforant path
of the unanesthetized rat.” Brain Res, 519(1-2), 89-96.
103. Goddard, G. V., McIntyre, D. C., and Leech, C. K. (1969). “A permanent change in
brain function resulting from daily electrical stimulation.” Exp Neurol, 25(3), 295-330.
104. Granata, A. R. (2001). “Effects of gamma-aminobutyric acid on putative sympathoexcitatory neurons in the rat rostral ventrolateral medulla in vitro. Intracellular study.”
Neurosci Lett, 300(1), 49-53.
105. Greka, A., Koolen, J. A., Lipton, S. A., and Zhang, D. (1998). “Cloning and
characterization of mouse GABA(C) receptor subunits.” Neuroreport, 9(2), 229-32.
106. Grosshans, D. R., Clayton, D. A., Coultrap, S. J., and Browning, M. D. (2002). “LTP
leads to rapid surface expression of NMDA but not AMPA receptors in adult rat CA1.”
Nat Neurosci, 5(1), 27-33.
107. Gulyas, A. I., Hajos, N., and Freund, T. F. (1996). “Interneurons containing calretinin
are specialized to control other interneurons in the rat hippocampus.” J Neurosci,
16(10), 3397-411.
234
108. Gurley, D., Amin, J., Ross, P. C., Weiss, D. S., and White, G. (1995). “Point mutations
in the M2 region of the alpha, beta, or gamma subunit of the GABAA channel that
abolish block by picrotoxin.” Receptors Channels, 3(1), 13-20.
109. Hablitz, J. J., and Heinemann, U. (1987). “Extracellular K+ and Ca2+ changes during
epileptiform discharges in the immature rat neocortex.” Brain Res, 433(2), 299-303.
110. Hackam, A. S., Wang, T. L., Guggino, W. B., and Cutting, G. R. (1998). “Sequences in
the amino termini of GABA rho and GABA(A) subunits specify their selective
interaction in vitro.” J Neurochem, 70(1), 40-6.
111. Hajos, N., Nusser, Z., Rancz, E. A., Freund, T. F., and Mody, I. (2000). “Cell type- and
synapse-specific variability in synaptic GABAA receptor occupancy.” Eur J Neurosci,
12(3), 810-8.
112. Hausser, M., and Clark, B. A. (1997). “Tonic synaptic inhibition modulates neuronal
output pattern and spatiotemporal synaptic integration.” Neuron, 19(3), 665-78.
113. Hayashi, Y., Momiyama, A., Takahashi, T., Ohishi, H., Ogawa-Meguro, R.,
Shigemoto, R., Mizuno, N., and Nakanishi, S. (1993). “Role of a metabotropic
glutamate receptor in synaptic modulation in the accessory olfactory bulb.” Nature,
366(6456), 687-90.
114. Heinemann, U., Konnerth, A., Pumain, R., and Wadman, W. J. (1986). “Extracellular
calcium and potassium concentration changes in chronic epileptic brain tissue.” Adv
Neurol, 44, 641-61.
115. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., and Dudek, F. E. (1998). “Recurrent
spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate:
assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy.” Epilepsy Res, 31(1), 73-84.
116. Hertz, L., Peng, L., and Lai, J. C. (1998). “Functional studies in cultured astrocytes.”
Methods, 16(3), 293-310.
117. Heuss, C., Scanziani, M., Gahwiler, B. H., and Gerber, U. (1999). “G-proteinindependent signaling mediated by metabotropic glutamate receptors.” Nat Neurosci,
2(12), 1070-7. java/Propub/neuro/nn1299_1070.fulltext
java/Propub/neuro/nn1299_1070.abstract.
118. Hevers, W., and Luddens, H. (2002). “Pharmacological heterogeneity of gammaaminobutyric acid receptors during development suggests distinct classes of rat
cerebellar granule cells in situ.” Neuropharmacology, 42(1), 34-47.
119. Hill, D. R., Bowery, N. G., and Hudson, A. L. (1984). “Inhibition of GABAB receptor
binding by guanyl nucleotides.” J Neurochem, 42(3), 652-7.
120. Holscher, C. (1999). “Synaptic plasticity and learning and memory: LTP and beyond.”
J Neurosci Res, 58(1), 62-75.
121. Huang, E. P. (1998). “Synaptic plasticity: going through phases with LTP.” Curr Biol,
8(10), R350-2.
235
122. Hubner, C. A., Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Meyer, T., Ballanyi, K., and Jentsch,
T. J. (2001). “Disruption of KCC2 reveals an essential role of K-Cl cotransport already
in early synaptic inhibition.” Neuron, 30(2), 515-24.
123. Huguenard, J. R. (1998). “Anatomical and physiological considerations in thalamic
rhythm generation.” J Sleep Res, 7(Suppl 1), 24-9.
124. Isaac, J. T., Nicoll, R. A., and Malenka, R. C. (1999). “Silent glutamatergic synapses in
the mammalian brain.” Can J Physiol Pharmacol, 77(9), 735-7.
125. Isaacson, J. S. (2000). “Spillover in the spotlight.” Curr Biol, 10(13), R475-7.
126. Isaacson, J. S., Solis, J. M., and Nicoll, R. A. (1993). “Local and diffuse synaptic
actions of GABA in the hippocampus.” Neuron, 10(2), 165-75.
127. Isokawa, M., Levesque, M. F., Babb, T. L., and Engel, J., Jr. (1993). “Single mossy
fiber axonal systems of human dentate granule cells studied in hippocampal slices from
patients with temporal lobe epilepsy.” J Neurosci, 13(4), 1511-22.
128. Jackson, M. F., Esplin, B., and Capek, R. (1999a). “Activity-dependent enhancement of
hyperpolarizing and depolarizing gamma-aminobutyric acid (GABA) synaptic
responses following inhibition of GABA uptake by tiagabine.” Epilepsy Res, 37(1), 2536.
129. Jackson, M. F., Esplin, B., and Capek, R. (1999b). “Inhibitory nature of tiagabineaugmented GABAA receptor-mediated depolarizing responses in hippocampal
pyramidal cells.” J Neurophysiol, 81(3), 1192-8.
130. Jansson, A., Lippoldt, A., Mazel, T., Bartfai, T., Ogren, S. O., Sykova, E., Agnati, L.
F., and Fuxe, K. (2000). “Long distance signalling in volume transmission. Focus on
clearance mechanisms.” Prog Brain Res, 125, 399-413.
131. Jefferys, J. G. (1990). “Basic mechanisms of focal epilepsies.” Exp Physiol, 75(2), 12762.
132. Jensen, K., and Mody, I. (2001). “L-type Ca2+ channel-mediated short-term plasticity
of GABAergic synapses.” Nat Neurosci, 4(10), 975-6.
133. Jobe, P. C., and Laird, H. E. (1981). “Neurotransmitter abnormalities as determinants of
seizure susceptibility and intensity in the genetic models of epilepsy.” Biochem
Pharmacol, 30(23), 3137-44.
134. Johnston, G. A. (1996). “GABAA receptor pharmacology.” Pharmacol Ther, 69(3),
173-98.
135. Jonas, P., Major, G., and Sakmann, B. (1993). “Quantal components of unitary EPSCs
at the mossy fibre synapse on CA3 pyramidal cells of rat hippocampus.” J Physiol, 472,
615-63.
136. Jones, A., Korpi, E. R., McKernan, R. M., Pelz, R., Nusser, Z., Makela, R., Mellor, J.
R., Pollard, S., Bahn, S., Stephenson, F. A., Randall, A. D., Sieghart, W., Somogyi, P.,
Smith, A. J., and Wisden, W. (1997). “Ligand-gated ion channel subunit partnerships:
236
GABAA receptor alpha6 subunit gene inactivation inhibits delta subunit expression.” J
Neurosci, 17(4), 1350-62.
137. Jones, K. A., Borowsky, B., Tamm, J. A., Craig, D. A., Durkin, M. M., Dai, M., Yao,
W. J., Johnson, M., Gunwaldsen, C., Huang, L. Y., Tang, C., Shen, Q., Salon, J. A.,
Morse, K., Laz, T., Smith, K. E., Nagarathnam, D., Noble, S. A., Branchek, T. A., and
Gerald, C. (1998). “GABA(B) receptors function as a heteromeric assembly of the
subunits GABA(B)R1 and GABA(B)R2.” Nature, 396(6712), 674-9.
138. Jones, M. V., Jonas, P., Sahara, Y., and Westbrook, G. L. (2001). “Microscopic kinetics
and energetics distinguish gaba(a) receptor agonists from antagonists.” Biophys J,
81(5), 2660-70.
139. Jouvenceau, A., Eunson, L. H., Spauschus, A., Ramesh, V., Zuberi, S. M., Kullmann,
D. M., and Hanna, M. G. (2001). “Human epilepsy associated with dysfunction of the
brain P/Q-type calcium channel.” Lancet, 358(9284), 801-7.
140. Kamiya, H., and Ozawa, S. (1999). “Dual mechanism for presynaptic modulation by
axonal metabotropic glutamate receptor at the mouse mossy fibre-CA3 synapse.” J
Physiol, 518(Pt 2), 497-506.
141. Kamiya, H., and Ozawa, S. (2000). “Kainate receptor-mediated presynaptic inhibition
at the mouse hippocampal mossy fibre synapse.” J Physiol, 523 Pt 3, 653-65.
142. Kamphuis, W., Hendriksen, H., Diegenbach, P. C., and Lopes da Silva, F. H. (1995).
“N-methyl-D-aspartate and kainate receptor gene expression in hippocampal pyramidal
and granular neurons in the kindling model of epileptogenesis.” Neuroscience, 67(3),
551-9.
143. Kavanaugh, M. P., Arriza, J. L., North, R. A., and Amara, S. G. (1992). “Electrogenic
uptake of gamma-aminobutyric acid by a cloned transporter expressed in Xenopus
oocytes.” J Biol Chem, 267(31), 22007-9.
144. Ketelaars, S. O., Gorter, J. A., van Vliet, E. A., Lopes da Silva, F. H., and Wadman, W.
J. (2001). “Sodium currents in isolated rat CA1 pyramidal and dentate granule neurones
in the post-status epilepticus model of epilepsy.” Neuroscience, 105(1), 109-20.
145. Khakh, B. S., and Henderson, G. (2000). “Modulation of fast synaptic transmission by
presynaptic ligand-gated cation channels.” J Auton Nerv Syst, 81(1-3), 110-21.
146. Kiesmann, M., Marescaux, C., Vergnes, M., Micheletti, G., Depaulis, A., and Warter, J.
M. (1988). “Audiogenic seizures in Wistar rats before and after repeated auditory
stimuli: clinical, pharmacological, and electroencephalographic studies.” J Neural
Transm, 72(3), 235-44.
147. Klapstein, G. J., Meldrum, B. S., and Mody, I. (1999). “Decreased sensitivity to Group
III mGluR agonists in the lateral perforant path following kindling.”
Neuropharmacology, 38(7), 927-33.
148. Kohling, R., Straub, H., and Speckmann, E. J. (2000). “Differential involvement of Ltype calcium channels in epileptogenesis of rat hippocampal slices during ontogenesis.”
Neurobiol Dis, 7(4), 471-82.
237
149. Kohr, G., De Koninck, Y., and Mody, I. (1993). “Properties of NMDA receptor
channels in neurons acutely isolated from epileptic (kindled) rats.” J Neurosci, 13(8),
3612-27.
150. Koulen, P., Brandstatter, J. H., Enz, R., Bormann, J., and Wassle, H. (1998). “Synaptic
clustering of GABA(C) receptor rho-subunits in the rat retina.” Eur J Neurosci, 10(1),
115-27.
151. Koulen, P., Kuhn, R., Wassle, H., and Brandstatter, J. H. (1999). “Modulation of the
intracellular calcium concentration in photoreceptor terminals by a presynaptic
metabotropic glutamate receptor.” Proc Natl Acad Sci U S A, 96(17), 9909-14.
152. Kullmann, D. M. (1999). “Synaptic and extrasynaptic roles of glutamate in the
mammalian hippocampus.” Acta Physiol Scand, 166(2), 79-83.
153. Kullmann, D. M. (2000). “Spillover and synaptic cross talk mediated by glutamate and
GABA in the mammalian brain.” Prog Brain Res, 125, 339-51.
154. Kullmann, D. M., and Asztely, F. (1998). “Extrasynaptic glutamate spillover in the
hippocampus: evidence and implications.” Trends Neurosci, 21(1), 8-14.
155. Kullmann, D. M., Asztely, F., and Walker, M. C. (2000). “The role of mammalian
ionotropic receptors in synaptic plasticity: LTP, LTD and epilepsy.” Cell Mol Life Sci,
57(11), 1551-61.
156. Kuner, R., Kohr, G., Grunewald, S., Eisenhardt, G., Bach, A., and Kornau, H. C.
(1999). “Role of heteromer formation in GABAB receptor function.” Science,
283(5398), 74-7.
157. Kunishima, N., Shimada, Y., Tsuji, Y., Sato, T., Yamamoto, M., Kumasaka, T.,
Nakanishi, S., Jingami, H., and Morikawa, K. (2000). “Structural basis of glutamate
recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor.” Nature, 407(6807), 971-7.
158. Kusama, T., Spivak, C. E., Whiting, P., Dawson, V. L., Schaeffer, J. C., and Uhl, G. R.
(1993). “Pharmacology of GABA rho 1 and GABA alpha/beta receptors expressed in
Xenopus oocytes and COS cells.” Br J Pharmacol, 109(1), 200-6.
159. Lehre, K. P., and Danbolt, N. C. (1998). “The number of glutamate transporter subtype
molecules at glutamatergic synapses: chemical and stereological quantification in
young adult rat brain.” J Neurosci, 18(21), 8751-7.
160. Lerma, J., Herranz, A. S., Herreras, O., Abraira, V., and Martin del Rio, R. (1986). “In
vivo determination of extracellular concentration of amino acids in the rat
hippocampus. A method based on brain dialysis and computerized analysis.” Brain Res,
384(1), 145-55.
161. Lerma, J., Morales, M., Vicente, M. A., and Herreras, O. (1997). “Glutamate receptors
of the kainate type and synaptic transmission.” Trends Neurosci, 20(1), 9-12.
162. Lerma, J., Paternain, A. V., Naranjo, J. R., and Mellstrom, B. (1993). “Functional
kainate-selective glutamate receptors in cultured hippocampal neurons.” Proc Natl
Acad Sci U S A, 90(24), 11688-92.
238
163. Lerma, J., Paternain, A. V., Rodriguez-Moreno, A., and Lopez-Garcia, J. C. (2001).
“Molecular physiology of kainate receptors.” Physiol Rev, 81(3), 971-98.
164. Leung, L. W. (1994). “Evaluation of the hypothesis that hippocampal interictal spikes
are caused by long-term potentiation.” Epilepsia, 35(4), 785-94.
165. Lisman, J. E., and McIntyre, C. C. (2001). “Synaptic plasticity: a molecular memory
switch.” Curr Biol, 11(19), R788-91.
166. Liu, Q. Y., Schaffner, A. E., Chang, Y. H., Maric, D., and Barker, J. L. (2000).
“Persistent activation of GABA(A) receptor/Cl(-) channels by astrocyte- derived
GABA in cultured embryonic rat hippocampal neurons.” J Neurophysiol, 84(3), 1392403.
167. Liu, Q. Y., Vautrin, J., Tang, K. M., and Barker, J. L. (1995). “Exogenous GABA
persistently opens Cl- channels in cultured embryonic rat thalamic neurons.” J Membr
Biol, 145(3), 279-84.
168. Lothman, E. W., and Williamson, J. M. (1994). “Closely spaced recurrent hippocampal
seizures elicit two types of heightened epileptogenesis: a rapidly developing, transient
kindling and a slowly developing, enduring kindling.” Brain Res, 649(1-2), 71-84.
169. Lujan, R., Nusser, Z., Roberts, J. D., Shigemoto, R., and Somogyi, P. (1996).
“Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mGluR1 and mGluR5 on
dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus.” Eur J Neurosci, 8(7), 1488-500.
170. Macdonald, R. L., and Kelly, K. M. (1994). “Mechanisms of action of currently
prescribed and newly developed antiepileptic drugs.” Epilepsia, 35(Suppl 4), S41-50.
171. Macdonald, R. L., and Olsen, R. W. (1994). “GABAA receptor channels.” Annu Rev
Neurosci, 17, 569-602.
172. Magee, J. C., and Johnston, D. (1995). “Synaptic activation of voltage-gated channels
in the dendrites of hippocampal pyramidal neurons.” Science, 268(5208), 301-4.
173. Malenka, R. C. (1994). “Synaptic plasticity in the hippocampus: LTP and LTD.” Cell,
78(4), 535-8.
174. Man, H. Y., Ju, W., Ahmadian, G., and Wang, Y. T. (2000). “Intracellular trafficking of
AMPA receptors in synaptic plasticity.” Cell Mol Life Sci, 57(11), 1526-34.
175. Manabe, T., Wyllie, D. J., Perkel, D. J., and Nicoll, R. A. (1993). “Modulation of
synaptic transmission and long-term potentiation: effects on paired pulse facilitation
and EPSC variance in the CA1 region of the hippocampus.” J Neurophysiol, 70(4),
1451-9.
176. Martina, M., Strata, F., and Cherubini, E. (1995). “Whole cell and single channel
properties of a new GABA receptor transiently expressed in the Hippocampus.” J
Neurophysiol, 73(2), 902-6.
177. Mason, A. (1993). “Electrophysiology and burst-firing of rat subicular pyramidal
neurons in vitro: a comparison with area CA1.” Brain Res, 600(1), 174-8.
239
178. McBain, C. J. (1994). “Hippocampal inhibitory neuron activity in the elevated
potassium model of epilepsy.” J Neurophysiol, 72(6), 2853-63.
179. McBain, C. J. (1995). “Hippocampal inhibitory neuron activity in the elevated
potassium model of epilepsy.” J Neurophysiol, 73(2), 2853-63.
180. McBain, C. J., and Fisahn, A. (2001). “Interneurons unbound.” Nat Rev Neurosci, 2(1),
11-23.
181. McEachern, J. C., and Shaw, C. A. (1996). “An alternative to the LTP orthodoxy: a
plasticity-pathology continuum model.” Brain Res Brain Res Rev, 22(1), 51-92.
182. McGillem, G. S., Rotolo, T. C., and Dacheux, R. F. (2000). “GABA responses of rod
bipolar cells in rabbit retinal slices.” Vis Neurosci, 17(3), 381-9.
183. McNamara, J. O. (1994). “Cellular and molecular basis of epilepsy.” J Neurosci, 14(6),
3413-25.
184. McNamara, J. O., Bonhaus, D. W., Shin, C., Crain, B. J., Gellman, R. L., and
Giacchino, J. L. (1985). “The kindling model of epilepsy: a critical review.” CRC Crit
Rev Clin Neurobiol, 1(4), 341-91.
185. Mehta, A. K., and Ticku, M. K. (1999). “An update on GABAA receptors.” Brain Res
Brain Res Rev, 29(2-3), 196-217.
bin/cas/tree/store/bresr/cas_sub/browse/browse.cgi?year=1999&volume=29&i ssue=23&aid=90246.
186. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., and Freund, T. F. (1996). “Differences
between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus.” Neuron, 16(4), 815-23.
187. Min, M. Y., Rusakov, D. A., and Kullmann, D. M. (1998). “Activation of AMPA,
kainate, and metabotropic receptors at hippocampal mossy fiber synapses: role of
glutamate diffusion.” Neuron, 21(3), 561-70.
188. Mintz, I. M., and Bean, B. P. (1993). “GABAB receptor inhibition of P-type Ca2+
channels in central neurons.” Neuron, 10(5), 889-98.
189. Misgeld, U., Bijak, M., and Jarolimek, W. (1995). “A physiological role for GABAB
receptors and the effects of baclofen in the mammalian central nervous system.” Prog
Neurobiol, 46(4), 423-62.
190. Mody, I. (1998). “Ion channels in epilepsy.” Int Rev Neurobiol, 42, 199-226.
191. Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., and Soltesz, I. (1994). “Bridging the cleft at
GABA synapses in the brain.” Trends Neurosci, 17(12), 517-25.
192. Mohler, H., and Fritschy, J. M. (1999). “GABAB receptors make it to the top--as
dimers.” Trends Pharmacol Sci, 20(3), 87-9. 3_00001323.
193. Momose-Sato, Y., Sato, K., Hirota, A., Sakai, T., Yang, X. S., and Kamino, K. (1997).
“Optical characterization of a novel GABA response in early embryonic chick
brainstem.” Neuroscience, 80(1), 203-19.
240
194. Morimoto, K., Sato, H., Yamamoto, Y., Watanabe, T., and Suwaki, H. (1997).
“Antiepileptic effects of tiagabine, a selective GABA uptake inhibitor, in the rat
kindling model of temporal lobe epilepsy.” Epilepsia, 38(9), 966-74.
195. Mott, D. D., and Lewis, D. V. (1994). “The pharmacology and function of central
GABAB receptors.” Int Rev Neurobiol, 36, 97-223.
196. Mulle, C., Sailer, A., Swanson, G. T., Brana, C., O'Gorman, S., Bettler, B., and
Heinemann, S. F. (2000). “Subunit composition of kainate receptors in hippocampal
interneurons.” Neuron, 28(2), 475-84.
197. Neelands, T. R., Fisher, J. L., Bianchi, M., and Macdonald, R. L. (1999). “Spontaneous
and gamma-aminobutyric acid (GABA)-activated GABA(A) receptor channels formed
by epsilon subunit-containing isoforms.” Mol Pharmacol, 55(1), 168-78.
198. Newland, C. F., and Cull-Candy, S. G. (1992). “On the mechanism of action of
picrotoxin on GABA receptor channels in dissociated sympathetic neurones of the rat.”
J Physiol, 447, 191-213.
199. N'Gouemo, P., and Faingold, C. L. (1997). “Audiogenic kindling increases neuronal
responses to acoustic stimuli in neurons of the medial geniculate body of the genetically
epilepsy-prone rat.” Brain Res, 761(2), 217-24.
200. Nishikawa, M., Hirouchi, M., and Kuriyama, K. (1997). “Functional coupling of Gi
subtype with GABAB receptor/adenylyl cyclase system: analysis using a reconstituted
system with purified GTP-binding protein from bovine cerebral cortex.” Neurochem
Int, 31(1), 21-5.
201. Nusser, Z., Hajos, N., Somogyi, P., and Mody, I. (1998a). “Increased number of
synaptic GABA(A) receptors underlies potentiation at hippocampal inhibitory
synapses.” Nature, 395(6698), 172-7.
202. Nusser, Z., Naylor, D., and Mody, I. (2001). “Synapse-specific contribution of the
variation of transmitter concentration to the decay of inhibitory postsynaptic currents.”
Biophys J, 80(3), 1251-61.
203. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., and Somogyi, P. (1996).
“Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A
receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.” Proc Natl Acad Sci U S A,
93(21), 11939-44.
204. Nusser, Z., Sieghart, W., and Somogyi, P. (1998b). “Segregation of different GABAA
receptors to synaptic and extrasynaptic membranes of cerebellar granule cells.” J
Neurosci, 18(5), 1693-703.
205. Ogurusu, T., Yanagi, K., Watanabe, M., Fukaya, M., and Shingai, R. (1999).
“Localization of GABA receptor rho 2 and rho 3 subunits in rat brain and functional
expression of homooligomeric rho 3 receptors and heterooligomeric rho 2 rho 3
receptors.” Receptors Channels, 6(6), 463-75.
241
206. Ohishi, H., Ogawa-Meguro, R., Shigemoto, R., Kaneko, T., Nakanishi, S., and Mizuno,
N. (1994). “Immunohistochemical localization of metabotropic glutamate receptors,
mGluR2 and mGluR3, in rat cerebellar cortex.” Neuron, 13(1), 55-66.
207. Okamoto, N., Hori, S., Akazawa, C., Hayashi, Y., Shigemoto, R., Mizuno, N., and
Nakanishi, S. (1994). “Molecular characterization of a new metabotropic glutamate
receptor mGluR7 coupled to inhibitory cyclic AMP signal transduction.” J Biol Chem,
269(2), 1231-6.
208. Olivier, A. (1991). “Relevance of removal of limbic structures in surgery for temporal
lobe epilepsy.” Can J Neurol Sci, 18(4 Suppl), 628-35.
209. Otis, T. S., Staley, K. J., and Mody, I. (1991). “Perpetual inhibitory activity in
mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release.” Brain Res, 545(12), 142-50.
210. Overstreet, L. S., and Westbrook, G. L. (2001). “Paradoxical reduction of synaptic
inhibition by vigabatrin.” J Neurophysiol, 86(2), 596-603.
211. Ozawa, S., Kamiya, H., and Tsuzuki, K. (1998). “Glutamate receptors in the
mammalian central nervous system.” Prog Neurobiol, 54(5), 581-618.
212. Pal, S., Sun, D., Limbrick, D., Rafiq, A., and DeLorenzo, R. J. (2001). “Epileptogenesis
induces long-term alterations in intracellular calcium release and sequestration
mechanisms in the hippocampal neuronal culture model of epilepsy.” Cell Calcium,
30(4), 285-96.
213. Pan, Z. H. (2001). “Voltage-activated Ca2+ channels and ionotropic GABA receptors
localized at axon terminals of mammalian retinal bipolar cells.” Vis Neurosci, 18(2),
279-88.
214. Pan, Z. H., Zhang, D., Zhang, X., and Lipton, S. A. (2000). “Evidence for coassembly
of mutant GABAC rho1 with GABAA gamma2S, glycine alpha1 and glycine alpha2
receptor subunits in vitro.” Eur J Neurosci, 12(9), 3137-45.
215. Paternain, A. V., Herrera, M. T., Nieto, M. A., and Lerma, J. (2000). “GluR5 and
GluR6 kainate receptor subunits coexist in hippocampal neurons and coassemble to
form functional receptors.” J Neurosci, 20(1), 196-205.
216. Patneau, D. K., and Mayer, M. L. (1990). “Structure-activity relationships for amino
acid transmitter candidates acting at N-methyl-D-aspartate and quisqualate receptors.” J
Neurosci, 10(7), 2385-99.
217. Paulsen, O., and Moser, E. I. (1998). “A model of hippocampal memory encoding and
retrieval: GABAergic control of synaptic plasticity.” Trends Neurosci, 21(7), 273-8.
218. Perkins, K. L., and Wong, R. K. (1996). “Ionic basis of the postsynaptic depolarizing
GABA response in hippocampal pyramidal cells.” J Neurophysiol, 76(6), 3886-94.
219. Perrais, D., and Ropert, N. (1999). “Effect of zolpidem on miniature IPSCs and
occupancy of postsynaptic GABAA receptors in central synapses.” J Neurosci, 19(2),
578-88.
242
220. Pin, J. P., and Duvoisin, R. (1995). “The metabotropic glutamate receptors: structure
and functions.” Neuropharmacology, 34(1), 1-26.
221. Poncer, J. C., McKinney, R. A., Gahwiler, B. H., and Thompson, S. M. (1997). “Either
N- or P-type calcium channels mediate GABA release at distinct hippocampal
inhibitory synapses.” Neuron, 18(3), 463-72.
222. Pratt, G. D., Kokaia, M., Bengzon, J., Kokaia, Z., Fritschy, J. M., Mohler, H., and
Lindvall, O. (1993). “Differential regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit
messenger RNAs in kindling-induced epileptogenesis.” Neuroscience, 57(2), 307-18.
223. Prince, D. A., and Jacobs, K. (1998). “Inhibitory function in two models of chronic
epileptogenesis.” Epilepsy Res, 32(1-2), 83-92.
224. Pritchett, D. B., Luddens, H., and Seeburg, P. H. (1989). “Type I and type II GABAAbenzodiazepine receptors produced in transfected cells.” Science, 245(4924), 1389-92.
225. Qian, H., and Ripps, H. (1999). “Response kinetics and pharmacological properties of
heteromeric receptors formed by coassembly of GABA rho- and gamma 2-subunits.”
Proc R Soc Lond B Biol Sci, 266(1436), 2419-25.
226. Racine, R. J. (1972). “Modification of seizure activity by electrical stimulation. II.
Motor seizure.” Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 32(3), 281-94.
227. Ragozzino, D., Woodward, R. M., Murata, Y., Eusebi, F., Overman, L. E., and Miledi,
R. (1996). “Design and in vitro pharmacology of a selective gamma-aminobutyric
acidC receptor antagonist.” Mol Pharmacol, 50(4), 1024-30.
228. Ribak, C. E., Khurana, V., and Lien, N. T. (1994). “The effect of midbrain collicular
knife cuts on audiogenic seizure severity in the genetically epilepsy-prone rat.” J
Hirnforsch, 35(2), 303-11.
229. Rivera, C., Voipio, J., Payne, J. A., Ruusuvuori, E., Lahtinen, H., Lamsa, K., Pirvola,
U., Saarma, M., and Kaila, K. (1999). “The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders
GABA hyperpolarizing during neuronal maturation.” Nature, 397(6716), 251-5.
230. Rodriguez-Moreno, A., Herreras, O., and Lerma, J. (1997). “Kainate receptors
presynaptically downregulate GABAergic inhibition in the rat hippocampus.” Neuron,
19(4), 893-901.
231. Rodriguez-Moreno, A., and Lerma, J. (1998). “Kainate receptor modulation of GABA
release involves a metabotropic function.” Neuron, 20(6), 1211-8.
232. Rodriguez-Moreno, A., Lopez-Garcia, J. C., and Lerma, J. (2000). “Two populations of
kainate receptors with separate signaling mechanisms in hippocampal interneurons.”
Proc Natl Acad Sci U S A, 97(3), 1293-8.
233. Rossi, D. J., and Hamann, M. (1998). “Spillover-mediated transmission at inhibitory
synapses promoted by high affinity alpha6 subunit GABA(A) receptors and glomerular
geometry.” Neuron, 20(4), 783-95.
243
234. Routtenberg, A. (1985). “Protein kinase C activation leading to protein F1
phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.”
Behav Neural Biol, 44(2), 186-200.
235. Rusakov, D. A., and Kullmann, D. M. (1998). “Extrasynaptic glutamate diffusion in the
hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.” J Neurosci,
18(9), 3158-70.
236. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., and Johnston, D. (1985). “Epileptiform activity induced
by changes in extracellular potassium in hippocampus.” J Neurophysiol, 54(5), 136374.
237. Salin, P. A., and Prince, D. A. (1996). “Spontaneous GABAA receptor-mediated
inhibitory currents in adult rat somatosensory cortex.” J Neurophysiol, 75(4), 1573-88.
238. Salt, T. E., and Eaton, S. A. (1995). “Distinct presynaptic metabotropic receptors for LAP4 and CCG1 on GABAergic terminals: pharmacological evidence using novel alphamethyl derivative mGluR antagonists, MAP4 and MCCG, in the rat thalamus in vivo.”
Neuroscience, 65(1), 5-13.
239. Sander, J. W., and Shorvon, S. D. (1996). “Epidemiology of the epilepsies.” J Neurol
Neurosurg Psychiatry, 61(5), 433-43.
240. Scanziani, M. (2000). “GABA spillover activates postsynaptic GABA(B) receptors to
control rhythmic hippocampal activity.” Neuron, 25(3), 673-81.
241. Scanziani, M., Gahwiler, B. H., and Charpak, S. (1998). “Target cell-specific
modulation of transmitter release at terminals from a single axon.” Proc Natl Acad Sci
U S A, 95(20), 12004-9.
242. Schmitz, D., Frerking, M., and Nicoll, R. A. (2000). “Synaptic activation of presynaptic
kainate receptors on hippocampal mossy fiber synapses.” Neuron, 27(2), 327-38.
243. Schmitz, D., Mellor, J., and Nicoll, R. A. (2001). “Presynaptic kainate receptor
mediation of frequency facilitation at hippocampal mossy fiber synapses.” Science,
291(5510), 1972-6.
244. Schonrock, B., and Bormann, J. (1993). “Functional heterogeneity of hippocampal
GABAA receptors.” Eur J Neurosci, 5(8), 1042-9.
245. Schoppa, N. E., and Westbrook, G. L. (1997). “Modulation of mEPSCs in olfactory
bulb mitral cells by metabotropic glutamate receptors.” J Neurophysiol, 78(3), 1468-75.
246. Schousboe, A. (2000). “Pharmacological and functional characterization of astrocytic
GABA transport: a short review.” Neurochem Res, 25(9-10), 1241-4.
247. Schroder, W., Hinterkeuser, S., Seifert, G., Schramm, J., Jabs, R., Wilkin, G. P., and
Steinhauser, C. (2000). “Functional and molecular properties of human astrocytes in
acute hippocampal slices obtained from patients with temporal lobe epilepsy.”
Epilepsia, 41(Suppl 6), S181-4.
244
248. Schwartzkroin, P. A. (1986). “Hippocampal slices in experimental and human
epilepsy.” Adv Neurol, 44, 991-1010.
249. Schwarzer, C., Tsunashima, K., Wanzenbock, C., Fuchs, K., Sieghart, W., and Sperk,
G. (1997). “GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus II: altered distribution
in kainic acid-induced temporal lobe epilepsy.” Neuroscience, 80(4), 1001-17.
250. Shaw, C., Cameron, L., March, D., Cynader, M., Zielinski, B., and Hendrickson, A.
(1991). “Pre- and postnatal development of GABA receptors in Macaca monkey visual
cortex.” J Neurosci, 11(12), 3943-59.
251. Shields, C. R., Tran, M. N., Wong, R. O., and Lukasiewicz, P. D. (2000). “Distinct
ionotropic GABA receptors mediate presynaptic and postsynaptic inhibition in retinal
bipolar cells.” J Neurosci, 20(7), 2673-82.
252. Shigemoto, R., Kinoshita, A., Wada, E., Nomura, S., Ohishi, H., Takada, M., Flor, P. J.,
Neki, A., Abe, T., Nakanishi, S., and Mizuno, N. (1997). “Differential presynaptic
localization of metabotropic glutamate receptor subtypes in the rat hippocampus.” J
Neurosci, 17(19), 7503-22.
253. Shigemoto, R., Kulik, A., Roberts, J. D., Ohishi, H., Nusser, Z., Kaneko, T., and
Somogyi, P. (1996). “Target-cell-specific concentration of a metabotropic glutamate
receptor in the presynaptic active zone.” Nature, 381(6582), 523-5.
254. Sigworth, F. J. (1980). “The variance of sodium current fluctuations at the node of
Ranvier.” J Physiol, 307, 97-129.
255. Smirnov, S., Paalasmaa, P., Uusisaari, M., Voipio, J., and Kaila, K. (1999).
“Pharmacological isolation of the synaptic and nonsynaptic components of the GABAmediated biphasic response in rat CA1 hippocampal pyramidal cells.” J Neurosci,
19(21), 9252-60.
256. Sodickson, D. L., and Bean, B. P. (1996). “GABAB receptor-activated inwardly
rectifying potassium current in dissociated hippocampal CA3 neurons.” J Neurosci,
16(20), 6374-85.
257. Soghomonian, J. J., and Martin, D. L. (1998). “Two isoforms of glutamate
decarboxylase: why?” Trends Pharmacol Sci, 19(12), 500-5.
258. Sohal, V. S., Huntsman, M. M., and Huguenard, J. R. (2000). “Reciprocal inhibitory
connections regulate the spatiotemporal properties of intrathalamic oscillations.” J
Neurosci, 20(5), 1735-45.
259. Soltesz, I., and Nusser, Z. (2001). “Neurobiology. Background inhibition to the fore.”
Nature, 409(6816), 24-5, 27.
260. Soltesz, I., Smetters, D. K., and Mody, I. (1995). “Tonic inhibition originates from
synapses close to the soma.” Neuron, 14(6), 1273-83.
261. Sorra, K. E., and Harris, K. M. (1993). “Occurrence and three-dimensional structure of
multiple synapses between individual radiatum axons and their target pyramidal cells in
hippocampal area CA1.” J Neurosci, 13(9), 3736-48.
245
262. Spauschus, A., Eunson, L., Hanna, M. G., and Kullmann, D. M. (1999). “Functional
characterization of a novel mutation in KCNA1 in episodic ataxia type 1 associated
with epilepsy.” Ann N Y Acad Sci, 868, 442-6.
263. Speckmann, E. J., Straub, H., and Kohling, R. (1993). “Contribution of calcium ions to
the generation of epileptic activity and antiepileptic calcium antagonism.”
Neuropsychobiology, 27(3), 122-6.
264. Sperk, G., Schwarzer, C., Tsunashima, K., Fuchs, K., and Sieghart, W. (1997).
“GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical
distribution of 13 subunits.” Neuroscience, 80(4), 987-1000.
265. Stanton, P. K. (1996). “LTD, LTP, and the sliding threshold for long-term synaptic
plasticity.” Hippocampus, 6(1), 35-42.
266. Stasheff, S. F., Mott, D. D., and Wilson, W. A. (1993). “Axon terminal
hyperexcitability associated with epileptogenesis in vitro. II. Pharmacological
regulation by NMDA and GABAA receptors.” J Neurophysiol, 70(3), 976-84.
267. Strata, F., and Cherubini, E. (1994). “Transient expression of a novel type of GABA
response in rat CA3 hippocampal neurones during development.” J Physiol, 480(Pt 3),
493-503.
268. Stringer, J. L., and Lothman, E. W. (1988). “Epileptiform discharges induced by
altering extracellular potassium and calcium in the rat hippocampal slice.” Exp Neurol,
101(1), 147-57.
269. Suzuki, S. S., and Smith, G. K. (1988). “Spontaneous EEG spikes in the normal
hippocampus. II. Relations to synchronous burst discharges.” Electroencephalogr Clin
Neurophysiol, 69(6), 532-40.
270. Swann, J. W., Smith, K. L., and Brady, R. J. (1986). “Extracellular K+ accumulation
during penicillin-induced epileptogenesis in the CA3 region of immature rat
hippocampus.” Brain Res, 395(2), 243-55.
271. Takamori, S., Rhee, J. S., Rosenmund, C., and Jahn, R. (2000). “Identification of a
vesicular glutamate transporter that defines a glutamatergic phenotype in neurons.”
Nature, 407(6801), 189-94.
272. Tanabe, Y., Nomura, A., Masu, M., Shigemoto, R., Mizuno, N., and Nakanishi, S.
(1993). “Signal transduction, pharmacological properties, and expression patterns of
two rat metabotropic glutamate receptors, mGluR3 and mGluR4.” J Neurosci, 13(4),
1372-8.
273. Tanaka, K., Watase, K., Manabe, T., Yamada, K., Watanabe, M., Takahashi, K.,
Iwama, H., Nishikawa, T., Ichihara, N., Kikuchi, T., Okuyama, S., Kawashima, N.,
Hori, S., Takimoto, M., and Wada, K. (1997). “Epilepsy and exacerbation of brain
injury in mice lacking the glutamate transporter GLT-1.” Science, 276(5319), 1699702.
246
274. Tancredi, V., Avoli, M., and Hwa, G. G. (1988). “Low-magnesium epilepsy in rat
hippocampal slices: inhibitory postsynaptic potentials in the CA1 subfield.” Neurosci
Lett, 89(3), 293-8.
275. Tashiro, A., Goldberg, J., and Yuste, R. (2002). “Calcium oscillations in neocortical
astrocytes under epileptiform conditions.” J Neurobiol, 50(1), 45-55.
276. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., and Pawelzik, H. (2000). “Differential
sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1
interneurons in slices of rat hippocampus.” Eur J Neurosci, 12(2), 425-36.
277. Tizzano, J. P., Griffey, K. I., and Schoepp, D. D. (1995a). “Induction or protection of
limbic seizures in mice by mGluR subtype selective agonists.” Neuropharmacology,
34(8), 1063-7.
278. Tizzano, J. P., Griffey, K. I., and Schoepp, D. D. (1995b). “Receptor subtypes linked to
metabotropic glutamate receptor agonist- mediated limbic seizures in mice.” Ann N Y
Acad Sci, 765, 230-5; discussion 248.
279. Tokuda, M., and Hatase, O. (1998). “Regulation of neuronal plasticity in the central
nervous system by phosphorylation and dephosphorylation.” Mol Neurobiol, 17(1-3),
137-56.
280. Traub, R. D., and Dingledine, R. (1990). “Model of synchronized epileptiform bursts
induced by high potassium in CA3 region of rat hippocampal slice. Role of
spontaneous EPSPs in initiation.” J Neurophysiol, 64(3), 1009-18.
281. Traub, R. D., Jefferys, J. G., and Whittington, M. A. (1994). “Enhanced NMDA
conductance can account for epileptiform activity induced by low Mg2+ in the rat
hippocampal slice.” J Physiol, 478 Pt 3, 379-93.
282. Treiman, D. M. (2001). “GABAergic mechanisms in epilepsy.” Epilepsia, 42(Suppl 3),
8-12.
283. Tursky, T., Lassanova, M., Sramka, M., and Nadvornik, P. (1976). “Formation of
glutamate and GABA in epileptogenic tissue from human hippocampus in vitro.” Acta
Neurochir (Wien), (23(Suppl)), 111-8.
284. Twery, M. J., Phelan, K. D., and Gallagher, J. P. (1992). “Spontaneous bursting and
non-bursting activity in morphologically identified neurons of the rat dorsolateral septal
nucleus, in vitro.” Neuroscience, 46(3), 669-79.
285. van den Pol, A. N., Gao, X. B., Patrylo, P. R., Ghosh, P. K., and Obrietan, K. (1998).
“Glutamate inhibits GABA excitatory activity in developing neurons.” J Neurosci,
18(24), 10749-61.
286. Ventura, R., and Harris, K. M. (1999). “Three-dimensional relationships between
hippocampal synapses and astrocytes.” J Neurosci, 19(16), 6897-906.
287. Vetter, P., Garthwaite, J., and Batchelor, A. M. (1999). “Regulation of synaptic
transmission in the mossy fibre-granule cell pathway of rat cerebellum by metabotropic
glutamate receptors.” Neuropharmacology, 38(6), 805-15.
247
288. Vignes, M., and Collingridge, G. L. (1997). “The synaptic activation of kainate
receptors.” Nature, 388(6638), 179-82.
289. Villarreal, D. M., Do, V., Haddad, E., and Derrick, B. E. (2002). “NMDA receptor
antagonists sustain LTP and spatial memory: active processes mediate LTP decay.” Nat
Neurosci, 5(1), 48-52.
290. Vinogradova, O. S. (2001). “Hippocampus as comparator: role of the two input and two
output systems of the hippocampus in selection and registration of information.”
Hippocampus, 11(5), 578-98.
291. Vizi, E. S. (1998). “Different temperature dependence of carrier-mediated
(cytoplasmic) and stimulus-evoked (exocytotic) release of transmitter: a simple method
to separate the two types of release.” Neurochem Int, 33(4), 359-66.
292. Vizi, E. S. (2000). “Role of high-affinity receptors and membrane transporters in
nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system.” Pharmacol
Rev, 52(1), 63-89.
293. Vizi, E. S., and Kiss, J. P. (1998). “Neurochemistry and pharmacology of the major
hippocampal transmitter systems: synaptic and nonsynaptic interactions.”
Hippocampus, 8(6), 566-607.
294. Vogt, K. E., and Nicoll, R. A. (1999). “Glutamate and gamma-aminobutyric acid
mediate a heterosynaptic depression at mossy fiber synapses in the hippocampus.” Proc
Natl Acad Sci U S A, 96(3), 1118-22.
295. von Gersdorff, H., Schneggenburger, R., Weis, S., and Neher, E. (1997). “Presynaptic
depression at a calyx synapse: the small contribution of metabotropic glutamate
receptors.” J Neurosci, 17(21), 8137-46.
296. von Oertzen, J., Urbach, H., Blumcke, I., Reuber, M., Traber, F., Peveling, T., Menzel,
C., and Elger, C. E. (2002). “Time-efficient T2 relaxometry of the entire hippocampus
is feasible in temporal lobe epilepsy.” Neurology, 58(2), 257-64.
297. Vreugdenhil, M., and Wadman, W. J. (1992). “Enhancement of calcium currents in rat
hippocampal CA1 neurons induced by kindling epileptogenesis.” Neuroscience, 49(2),
373-81.
298. Walker, M. C., Ruiz, A., and Kullmann, D. M. (2001). “Monosynaptic GABAergic
signaling from dentate to CA3 with a pharmacological and physiological profile typical
of mossy fiber synapses.” Neuron, 29(3), 703-15.
299. Wall, M. J., and Usowicz, M. M. (1997). “Development of action potential-dependent
and independent spontaneous GABAA receptor-mediated currents in granule cells of
postnatal rat cerebellum.” Eur J Neurosci, 9(3), 533-48.
300. Walton, M., Henderson, C., Mason-Parker, S., Lawlor, P., Abraham, W. C., Bilkey, D.,
and Dragunow, M. (1999). “Immediate early gene transcription and synaptic
modulation.” J Neurosci Res, 58(1), 96-106.
248
301. Wan, H., and Cahusac, P. M. (1995). “The effects of L-AP4 and L-serine-O-phosphate
on inhibition in primary somatosensory cortex of the adult rat in vivo.”
Neuropharmacology, 34(8), 1053-62.
302. Wang, T. L., Hackam, A. S., Guggino, W. B., and Cutting, G. R. (1995). “A single
amino acid in gamma-aminobutyric acid rho 1 receptors affects competitive and
noncompetitive components of picrotoxin inhibition.” Proc Natl Acad Sci U S A,
92(25), 11751-5.
303. Wegelius, K., Pasternack, M., Hiltunen, J. O., Rivera, C., Kaila, K., Saarma, M., and
Reeben, M. (1998). “Distribution of GABA receptor rho subunit transcripts in the rat
brain.” Eur J Neurosci, 10(1), 350-7.
304. Whittington, M. A., Traub, R. D., and Jefferys, J. G. (1995). “Erosion of inhibition
contributes to the progression of low magnesium bursts in rat hippocampal slices.” J
Physiol, 486(Pt 3), 723-34.
305. Woodward, R. M., Polenzani, L., and Miledi, R. (1993). “Characterization of
bicuculline/baclofen-insensitive (rho-like) gamma- aminobutyric acid receptors
expressed in Xenopus oocytes. II. Pharmacology of gamma-aminobutyric acidA and
gamma-aminobutyric acidB receptor agonists and antagonists.” Mol Pharmacol, 43(4),
609-25.
306. Wotring, V. E., Chang, Y., and Weiss, D. S. (1999). “Permeability and single channel
conductance of human homomeric rho1 GABAC receptors.” J Physiol, 521 Pt 2, 32736.
307. Wu, L. G., and Saggau, P. (1997). “Presynaptic inhibition of elicited neurotransmitter
release.” Trends Neurosci, 20(5), 204-12.
308. Wu, S., Wright, R. A., Rockey, P. K., Burgett, S. G., Arnold, J. S., Rosteck, P. R., Jr.,
Johnson, B. G., Schoepp, D. D., and Belagaje, R. M. (1998). “Group III human
metabotropic glutamate receptors 4, 7 and 8: molecular cloning, functional expression,
and comparison of pharmacological properties in RGT cells.” Brain Res Mol Brain Res,
53(1-2), 88-97.
309. Xu, M., and Akabas, M. H. (1996). “Identification of channel-lining residues in the M2
membrane-spanning segment of the GABA(A) receptor alpha1 subunit.” J Gen Physiol,
107(2), 195-205.
310. Yatani, A., and Brown, A. M. (1989). “Rapid beta-adrenergic modulation of cardiac
calcium channel currents by a fast G protein pathway.” Science, 245(4913), 71-4.
311. Yokoi, M., Kobayashi, K., Manabe, T., Takahashi, T., Sakaguchi, I., Katsuura, G.,
Shigemoto, R., Ohishi, H., Nomura, S., Nakamura, K., Nakao, K., Katsuki, M., and
Nakanishi, S. (1996). “Impairment of hippocampal mossy fiber LTD in mice lacking
mGluR2.” Science, 273(5275), 645-7.
312. Zaczek, R., and Coyle, J. T. (1982). “Excitatory amino acid analogues: neurotoxicity
and seizures.” Neuropharmacology, 21(1), 15-26.
249
313. Zhang, D., Pan, Z. H., Awobuluyi, M., and Lipton, S. A. (2001). “Structure and
function of GABA(C) receptors: a comparison of native versus recombinant receptors.”
Trends Pharmacol Sci, 22(3), 121-32.
314. Zhang, D., Pan, Z. H., Zhang, X., Brideau, A. D., and Lipton, S. A. (1995a). “Cloning
of a gamma-aminobutyric acid type C receptor subunit in rat retina with a methionine
residue critical for picrotoxinin channel block.” Proc Natl Acad Sci U S A, 92(25),
11756-60.
315. Zhang, H. G., Lee, H. J., Rocheleau, T., ffrench-Constant, R. H., and Jackson, M. B.
(1995b). “Subunit composition determines picrotoxin and bicuculline sensitivity of
Drosophila gamma-aminobutyric acid receptors.” Mol Pharmacol, 48(5), 835-40.
316. Zhorov, B. S., and Bregestovski, P. D. (2000). “Chloride channels of glycine and
GABA receptors with blockers: Monte Carlo minimization and structure-activity
relationships.” Biophys J, 78(4), 1786-803.
250