ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ИРКУТСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
ИРКУТСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ
АКАДЕМИЯ
На правах рукописи
Карпова Екатерина Александровна
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ ПРИ
ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ И ПРИ ЕГО КОРРЕКЦИИ
06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология,
онкология и морфология животных
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук, профессор
О. П. Ильина
Улан-Удэ - 2014
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………
4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………............. 14
1.1. Морфофункциональные особенности течения патологических
процессов в печени при токсическом поражении ………………………... 14
1.2.
Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита
организма …………………………………………………………………… 20
1.3.
Общая
характеристика
нанокомпозитных
селенсодержащих
материалов…………………………………………………………………..
31
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ … 43
2.1. Материалы и методы исследований
43
2.1.1. Определение антиоксидантной активности препарата in vitro…… 44
2.1.2. Моделирование токсического повреждения печени……………… 45
2.1.3. Методы биохимического исследования …………………………… 46
2.1.4. Методы исследования острой токсичности………………………..
50
2.1.5. Методы патоморфологического исследования……………………. 50
2.1.6. Методы статистической обработки результатов исследований
2.2.
51
Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата
селена на организм животных……………………………………… 52
2.2.1. Антирадикальная активность нанокомпозитного препарата
селена in vitro……………………………………………………………….. 52
2.2.2. Антиоксидантная
активность
нанокомпозитного
препарата
селена in vivo…………………………………………………………. 54
2.2.3. Исследование острой токсичности нанокомпозитного препарата
селена…………………………………………………………………
2.2.4. Морфофункциональная
оценка
биологического
65
действия
нанокомпозитного препарата селена при токсическом поражении
печени………………………………………………………………… 66
ГЛАВА III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………..
91
3
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………..
105
ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………… 107
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
109
СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА
128
ПРИЛОЖЕНИЯ
132
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Функции печени в организме очень разнообразны: в ней вырабатывается
желчь, имеющая большое значение для пищеварения, печень задерживает и
ассимилирует продукты переваривания, в ней протекает синтез и расщепление
пуриновых тел, аминокислот, белков, жиров, накапливаются витамины и
микроэлементы. Этот орган способен фиксировать скрытые повреждения,
которые проявляются в ближайшие или отдаленные сроки. Огромное значение
играют барьерные функции печени – задерживаются или изменяются и выводятся
вместе с желчью многие ядовитые вещества эндогенного и экзогенного
происхождения. При заболеваниях печени падает её окислительная способность и
уменьшается обезвреживающая функции (Кудрявцев, 1984). Значительная роль
печени в синтезе и сохранении ферментов. Так в этом органе максимальная
активность фермента глутатионпероксидазы, которая напрямую зависит от
обеспеченности организма селеном.
В Иркутской области недостаток селена, также, как и недостаток йода в
почве, является геохимической патологией. Недостаточно селена содержится в
пахотном слое пашни Иркутской области, на территории Тулуно-Иркутского,
Качугского, Киренского, Братского округов (Кудрявцев А.П. Токсическая
дистрофия печени поросят. Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1984. 260 с.). Для
предотвращения патологий, связанных с недостатком селена, в животноводстве
используют препараты, в которых селен содержится в виде синтетических
комплексов селенита натрия или селен-метионина. Селен из этих препаратов
усваивается неполноценно, а носители, зачастую, нефизиологичны и могут
вызвать побочные эффекты (тошнота, анорексия, аллопеция) как при длительном
применении, так и при передозировке (Решетник Л.А. Биогеохимическое и
клиническое значение селена для здоровья человека // Сибирский медицинский
журнал. 1999. Т.18, № 3. С.16–22).
5
Селен (Se) привлекает внимание животноводов как биотический элемент,
выполняющий в исчезающе малых количествах важные биохимические функции,
а также как высокотоксичный элемент, неорганические соединения которого
более ядовиты, чем соединения молибдена, мышьяка и ванадия (Хеннинг А.
Минеральные
вещества,
витамины,
биостимуляторы
в
кормлении
сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1976. 158 с.; Георгиевский В.И.
Минеральное питание животных. М.: Колос, 1979. 471 с.; Синдирева А.В.
Критерии и параметры действия микроэлементов в системе почва-растениеживотное: автореф. дис. д-ра биолог. наук 03.02.08 / Анна Владимировна
Синдирева. Тюмень, 2012. 35 с.). Нижним пределом содержания селена в корме,
при котором наступают явления селеноза, считают 3-4 мг/кг корма. Концентрация
5 мг/кг является токсичной. При 8 мг/кг Se отмечаются тяжелые повреждения, а
при 10 мг/кг, например, цыплята уже не вылупляются (Хеннинг А. Минеральные
вещества, витамины, биостимуляторы в кормлении сельскохозяйственных
животных. 158 с.). Смертельная доза селенитов составляет 0,59-10 мг/кг массы
тела (Ветеринарная токсикология с основами экологии: учеб. пособие / под ред.
М.Н. Аргунова. СПб.: Лань, 2007. 416 с.).
Биологическая активность селена обусловлена его участием в регуляции
образования антиоксидантов. Существует тесная корреляция между уровнем в
организме
селена
и
активностью
селен-содержащего
фермента
глутатионпероксидазы, который предотвращает накопление в клетках перекисных
продуктов обмена веществ (Зайцев С.Ю. Биохимия животных. Фундаментальные
и клинические аспекты: учеб. СПб.: Лань, 2004. С. 271–272; Зайцев С.Ю.
Супрамолекулярные системы на границе раздела фаз как модели биомембран и
наноматериалы. Донецк - М.: Норд Компьютер, 2006. 189 с.; Георгиевский В.И.
Минеральное
питание
животных.
М.
1979.
471
с.;
Решетник
Л.А.
Биогеохимическое и клиническое значение селена для здоровья человека //
Сибирский медицинский журнал. 1999. Т.18. № 3. С.16–22).
6
Помимо
этого,
селен
играет
фундаментальную
роль
во
многих
метаболических функциях. Он участвует в поддержании иммунной системы
(Spasic M.B. Effect of term exposure to cold on the antioxidant defense system in the
rat // Free Rad. Biol. Med. 1993. № 3. P.291–299; Griffiths C. A comparison of the
monetized impact of IQ decrements from mercury emissions // Environ Health Perspect.
2007. P.841–847; Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current exposures and
clinical manifestations // N Engl J Med.
2003. Vol.349. P. 1731–1737; Jang M.
Characterization and recovery of mercury from spent fluorescent lamps // Waste
Management. 2005. Vol. 25. P.5–14; Psychological effects of low exposure to mercury
vapor: application of a computer-administered neurobehavioral evaluation system /
Liang Y.X. [et al.] // Environ Res. 1993. Vol. 60. P.320–327), улучшает подвижность
сперматозоидов (Corazza A. Mercury dosing solutions for fluorescent lamps // Journal
of Physics D-Applied Physics. 2008. Vol.41 p.144007), активирует гормоны
щитовидной железы (Eckelman M.J. Spatial Assessment of Net Mercury Emissions
from the Use of Fluorescent Bulbs // Environmental Science & Technology. 2008.
Vol.42. P.8564–8570; Reduction of mercury loss in fluorescent lamps coated with thin
metaloxide films / Hildenbrand V.D. [et al.]// Journal of the Electrochemical Society.
2003. Vol.150. P. H147–H155), а также профилактирует возникновение раковых
заболеваний (Ralston N. Nanomaterials: Nano-selenium captures mercury // Nature
Nanotechnology. 2003. Vol.3. P.527–528; Tunnessen W.W. Acrodynia - Exposure to
Mercury from Fluorescent Light-Bulbs // Pediatrics. 1987. Vol.79. P.786–789; Raposo
C. Mercury speciation in fluorescent lamps by thermal release analysis // Waste
Management. 2003. Vol.23. P. 879–886; Baughman T.A. Elemental mercury spills //
Environmental Health Perspectives. 2006. Vol.114. P.147–152; Celo V. Abiotic
methylation of mercury in the aquatic environment // Science of the Total Environment.
2006. Vol.368. P.126–137; Engelhaupt E. Do compact fluorescent bulbs reduce
mercury pollution? // Environmental Science & Technology. 2008. Vol.42. P.8176–
8176; Johnson N.C. Mercury vapor release from broken compact fluorescent lamps and
7
in situ capture by new nanomaterial sorbents // Environmental Science & Technology.
2008. Vol.42. P.5772–5778).
Дозы селена, незначительно превышающие терапевтические, являются
токсичными (Gilbert S.G. Neurobehavioral Effects of Developmental Methylmercury
Exposure // Environmental Health Perspectives. 1995. Vol.103. P.135–142). Сочетание
введенной дозы и химической формы селена играют фундаментальную роль в
определении его токсичности (Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current
exposures and clinical manifestations. P.1731–1737; Griffiths C. A comparison of the
monetized impact of IQ decrements from mercury emissions. P. 841–847).
В последние годы развивается новый подход к получению терапевтических
препаратов,
основанный
на
иммобилизации
лекарственных
средств
на
полимерных носителях. Это позволяет улучшить их фармакологические свойства
- увеличить активность и время действия, снизить токсичность и побочные
эффекты, увеличить избирательность воздействия на орган-мишень, а также
улучшить стабильность при хранении, то есть обеспечить безопасность и
эффективность действия.
Замечено, что комбинации различных материалов проявляют улучшенные
свойства по сравнению с индивидуальными веществами. Одними из самых
успешных примеров таких смесей являются композитные материалы, которые
сформированы из основного вещества, тем или иным образом распределенного в
объеме второго вещества, называемого матрицей. Особый интерес представляют
материалы, построенные одновременно из органической и неорганической
составляющих.
Одной из важных и актуальных тенденций в развитии лекарственной
терапии является создание нанокомпозитных систем доставки, повышающих
эффективность действия лекарственного вещества на организм человека или
животных (Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических
средств в клетки и их органеллы / Ткачук В.А. и [др.] // Междунар. форум по
нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008. С.191; Цыб А.Ф.
8
Лекарственные и радиофармацевтические препараты, создаваемые на основе
наномолекулярных технологий // Международный форум по нанотехнологиям
Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008. С.193; Швец В.И. Перспективные направления
создания эффективных лекарственных препаратов методами нанобиотехнологии
// Междунар. Форум по нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. 2008.
С.195; Niemeyer C.M. Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives.
Wiley-VCH, 2004. 491p; Kubik T. Nanotechnology on duty in medical applications //
Current Pharmaceutical Biotechnology. 2005. V.6. №1. Р.17 – 33; Torchilin V.
Nanoparticulates as Drug Carriers. N. Y.: World Scientific Publishing Co. 2006. 756p;
Bharаd Bushan. Springer Handbook of Nanotechnology. Berlin: Heidelberg: N. Y.:
Springer. 2007. 1916p; Ehud G. Plently of Room for Biology at the Bottom. An
Introduction to Bionanotechnology. N.Y.: Work Scientific Publishing Co., 2007. 200p;
Claudio N. Nanobiotechnology and Nanobiosciences. N.Y.: World Scientific Publishing
Co. 2008. 308p).
В последние десятилетия разработаны многочисленные системы носителей
лекарственных
веществ,
используемые
как
средства
контролируемого
распределения лекарств в органах и тканях организма (Niemeyer C.M.
Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. 491p; Torchilin V.
Nanoparticulates as Drug Carriers. 756p; Bharаd Bushan. Springer Handbook of
Nanotechnology. 1916p; Ehud G. Plently of Room for Biology at the Bottom. An
Introduction to Bionanotechnology. 200p; Claudio N. Nanobiotechnology and
Nanobiosciences. 308p.).
Сопоставимость «нано-био» размеров позволяет внедрить достижения
нанотехнологии в биологию, создавая объекты для медицинской диагностики,
целевой терапии, молекулярной и клеточной биологии (Niemeyer C.M.
Nanoparticles, proteins and nucleic acids: Biotechnology meets materials science //
Angew. Chem. Int. Edn. Eng. 2001. Vol.40. P.4128 - 4158).
9
Исходя из вышеизложенного, целью исследования стало изучение
действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных и его
роли в механизмах защиты поврежденной печени.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1.
Оценка антиоксидантной активности нанокомпозитного препарата селена in
vitro.
2.
Установление степени токсичности нанокомпозитного препарата селена.
3.
Определение концентрации факторов перекисного окисления липидов
(ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) на модели
токсического гепатита и на фоне введения нанокомпозитного препарата селена.
4.
Определение
факторов
супероксиддисмутаза
антиоксидантной
(СОД),
антиоксидантная
защиты
(АОЗ):
активность
(АОА),
глутатионпероксидаза (GSH), витамина А и Е.
5.
Установление саногенетического эффекта нанокомпозитного препарата
селена на морфологическую структуру печени.
Научная новизна:
В исследованиях in vitro показано, что композит селена с АГ обладает
антиоксидантной
аскорбиновой
активностью
кислоте.
Причем
и
не
уступает
антиоксидантная
по
данному
активность
показателю
обусловлена
наличием селена в наноразмерном состоянии.
Установлено, что нанокомпозитный препарат селена (наноразмерный Se в
решетке арабиногалактана) в выбранной нами дозе 2мг/100гр массы животного не
оказывает повреждающего действия на организм животных, а оказывает
выраженное протекторное действие на печень. Проявляет антиоксидантную
активность, о чем свидетельствует снижение уровня маркеров ПОЛ и повышение
активности глутатиона. Доказано, что применение нанокомпозитного препарата
селена в эксперименте и при коррекции токсического действия тетрахлорметана
на
организм
животных
морфологических нарушений.
способствует
уменьшению
метаболических
и
10
Таким образом, установлено, что Se, взятый в наноразмерном состоянии, не
проявляет повреждающего действия на организм животных. Нанокомпозитный
препарат селена (нано-Se), благодаря сродству арабиногалактановой матрицы к
асиалогликопротеиновым
гепатоцитов,
макрофагов,
рецепторам
(с
ретикулоцитов
мембранотропными
позволяет
свойствами)
изучаемому
данному
терапевтическому средству внедрять Se в эти клетки путем рецепторнообусловленного эндоцитоза. На основании анализа литературных данных и
собственных исследований разработана концептуальная схема протекторного
действия нано-Se при интоксикации тетрахлорметаном, важнейшим элементом
которой является ингибирование активности ПОЛ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные
экспериментальные
данные
являются
доклиническим
обоснованием применения нанокомпозитного препарата Se для профилактики и
лечения заболеваний животных, вызванных недостатком этого микроэлемента,
особенно в недостаточных по селену зонах. А так же для защиты печени от
повреждающего действия эндо- и экзотоксикантов.
Предложенная
концептуальная
схема
является
доклиническим
обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного препарата
селена на организм животных.
Препарат может применяться в экспериментальной и ветеринарной
практике для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний.
Апробация результатов исследований
Основные результаты исследования представлены на международной
Байкальской научно – практической конференции по проблемам ветеринарной
медицины «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» Иркутск, 15-16 марта
2011г.;
на региональной научно – практической конференции «Актуальные
проблемы АПК» г. Иркутск, 20-22 апреля 2011г.; в I Международной научнопрактической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21
веке» г. Москва 2013г.; на международной научно-практической конференции
11
молодых ученых «научные исследования и разработки к внедрению в АПК» в г.
Улан-Удэ
17-18
апреля
2013
г;
международной
научно-практической
конференции, посвященной 60 - летию аспирантуры ИрГСХА 3-5 декабря 2013г.;
в семинаре «Научно-практические аспекты применения лекарственных растений в
производстве пищевых продуктов 19-20 декабря 2013 г., Казахстан, г. Семей.
Внедрение результатов научных исследований в практику
Материалы
по
экспериментальному
исследованию
нанокомпозитного
препарата селена используются:
1.
в
учебном
процессе
и
научной
работе
ФГБОУ
«Иркутская
государственная сельскохозяйственная академия» при чтении дисциплин
«Ветеринарная патофизиология» и «Ветеринарная экология» на кафедре
анатомии, физиологии и микробиологии (протокол №2 от 23.09.2013 г);
2.
в учебном процессе факультета ветеринарной медицины на кафедре
нормальной, патологической физиологии, фармакологии и токсикологии по
курсу «клиническая фармакология» и «токсикология» (акт внедрения от 13
декабря 2013г.);
3.
используются в учебном процессе и научной работе на кафедре
патанатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная
академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» (протокол №19 от
11.12.2013);
4.
используются в учебном процессе по курсу «Внутренние болезни
животных», «Токсикология», «Фармакология» ФГБОУ ВПО Алтайский
государственный аграрный университет (протокол №11 от 17.12.2013);
5.
используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе
кафедры патологии, морфологии и физиологии, факультета ветеринарной
медицины и зоотехнии ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный
аграрный университет» (протокол №4 от 16.12.2013);
6.
приняты к внедрению в производство или к использованию в
разработках на кафедрах института ветеринарной медицины и биотехнологии
12
ФГБОУ ВПО Омского государственного аграрного университета им. П.А.
Столыпина (от 18.12.2013);
7.
приняты к использованию в учебном процессе кафедры анатомии,
патологической анатомии и хирургии, а также используются в научноисследовательской
работе
Института
прикладной
биотехнологии
и
ветеринарной медицины КрасГАУ (протокол №6 от 27.11.2013);
8.
используются в учебном процессе кафедры «Внутренние незаразные
болезни и акушерство» ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный
аграрный университет» (протокол №4 от 15.12.2013);
9.
приняты к внедрению в учебный процесс и научную работу кафедры
морфологии и физиологии животных Сельскохозяйственного института
ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова»
(протокол №6 от 27 декабря 2013г);
10.
используются
в
учебном
процессе
при
изучении
дисциплин
«Ветеринарная токсикология», «Клиническая фармакология», «Внутренние
болезни животных» и в научных исследованиях на кафедрах фармакологии и
токсикологии и внутренних незаразных болезней ФГБОУ ВПО «СанктПетербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол
№8 от 15 января 2014г);
11.
получена приоритетная заявка на изобретение «Антиоксидантное
средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного
селена и способы его получения и применения»: заявление от 30.12.2013;
регистрационный № 2013159311.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в
рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ
для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук,
получена 1 приоритетная заявка на изобретение РФ.
13
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит
из
введения,
трех
глав,
включающих
обзор
литературы,
собственных
исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений и
рекомендаций, и списка литературы и приложений; иллюстрирована 8 таблицами
и 23 рисунками. Указатель литературы включает 180 источников, из них 119
работ отечественных и 61 – зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Новый нанокомпозитный препарат селена в экспериментах in vitro обладает
антиоксидантным действием.
2. В исследованиях in vivo изучаемый препарат достоверно снижает негативные
эффекты
перекисного
окисления
липидов,
усиливает
систему
антиоксидантной защиты.
3. В условиях эксперимента при токсическом повреждении, обеспечивает более
раннюю регенерацию клеток печени и меньшим повреждением в данной
группе.
14
ГЛАВА 1
(обзор литературы)
1.1. Морфофункциональные
особенности
течения
патологических
процессов в печени при токсическом поражении
Функции
печени
в
организме
очень
разнообразны.
Она
является
центральным органом химического гомеостаза организма, так как в печени
создается единый энергетический пул для метаболизма углеводов, белков и
жиров. (Фельдман, Г.Л. Биоритмология. Ростов-на-Дону: Изд-во Рост, ин-та, 1982.
80с.). Кровь, поступающая по воротной вене в печень, содержит многие
продукты, образовавшиеся в результате пищеварения, а также вещества,
приносимые в орган по селезеночной вене. Гепатоциты – первые клетки, с
которыми эти компоненты вступают в контакт, именно клетки печени участвуют
в их переработке (Козлов Н.А., Яглов В.В. Частная гистология домашних
животных; под ред. В. В. Яглова. М.: Зоомедлит, 2007. 169с; Зайцев С.Ю.,
Конопатов Ю.В. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты:
учеб. СПб.: Лань, 2004. 384с.). Поступающие из кишечника в печень ядовитые
продукты вызывают поражения печени. Типы поражения зависят от природы
химического вещества и продолжительности действия и сопровождаются
различными
Сравнительная
нарушениями
ферментативного
биохимическая
характеристика
равновесия
(Бачко
метаболических
С.С.
свойств
различных гепатопротектеров в условиях токсического поражения печени: дис.
канд. мед. наук: 03.01.04 / Сергей Сергеевич Бачко. Краснодар, 2011. 170с.;
Подымова С. Д. Болезни печени. М.: Медицина, 1993. 544 стр.).
При ряде заболеваний вирусной и бактериальной природы в печени
обнаруживают бинуклеарные и многоядерные гепатоциты (Lefkowitch J.H.,
Apfelbaum T.F. Non-A, non-B hepatitis: characterization of liver biopsy pathology // J.
Clin. Gastroenterol. 1989. Vol.11. № 2. P.225–232; Changes to hepatocyte ploidy and
binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis / Toyoda H. [et al.] // Gut.
15
2005. Vol.54, № 2. P.297–302), что также может быть обусловлено действием
токсического вещества (Lythrum hyssopifolia (lesser loosestrife) poisoning of sheep
in Victoria / Lancaster M.J. [et al.] // Aust. Vet. J. 2009. Vol.87. № 12. P.476–479),
индуцировано влиянием некоторых гормонов (Tongiani R., Paolicchi A., Chieli E.
Cytological and quantitative cytochemical changes in the hepatocyte population of
newborn rats following hydrocortisone administration // Acta. Histochem. 1987. Vol.82,
№ 2. P.137–148), в результате старения организма (Schmucker D.L. Hepatocyte fine
structure during maturation and senescence // J. Electron Microsc. Tech. 1990. Vol.14,
№2. P.106–125) и сопряжено с участием данных клеток в процессах регенерации
(Aurora-A overexpression in mouse liver causes p53-dependent premitotic arrest during
liver regeneration / Li C.C. [et al.] // Mol. Cancer Res. 2009. Vol.7. №5. P.678–688).
Механизмы возникновения некроза гепатоцитов различаются в зависимости
от типа токсина. Так, при отравлении четыреххлористым углеродом возникает
нарушение функционирования ферментативных систем эндоплазматического
ретикулума. Дистрофические изменения гепатоцитов при воздействии аллилового
спирта, четыреххлористого углерода связаны с усилением перекисного окисления
ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов. При воздействии металлов
патогенез связан с блокадой функционально активных сульфгидрильных (SH)
групп ферментов (Калетина Н.И. Токсикологическая химия. Метаболизм и
анализ: учеб. Пособие. М.: ГЭОТАР, 2008. 101 с.; Корой П.В. Система протеина С
при хронических заболеваниях печени и противовирусная терапия // Клиническая
медицина 2008. №2. С.63–66).
Действие токсических веществ чаще всего приводит к дистрофии печени,
при этом часть печеночных клеток лизируется и исчезает. Чаще это происходит
вокруг центральных вен, реже – по периферии долек. Дольки печени становятся в
центре красными, а по периферии серо-желтыми или наоборот (Кокуричев П.И.,
Домнин Б.Г., Кокуричева М.П. Патологическая анатомия сельскохозяйственных
животных: альбом. СПб.: Агропромиздат. 1994. 199с.). Детоксикация веществ же
может быть произведена только функционально и энергетически полноценными
16
клетками, с нормальным течением биологического окисления. Поэтому очень
важно в терапевтической практике восстановить архитектонику печеночной ткани
(Зайцев, С. Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты :
учеб. СПб., 2004. 271–272 с.)
Гибель клеток протекает либо по пути апоптоза, либо – некроза. Самым
ранним проявлением апоптоза являются падение электрохимического потенциала
митохондриальной мембраны и повышение продукции активных форм кислорода.
(Kountouras J. Apoptosis in hepatitis C / J. Kountouras, D. Chatzopoulos, C. Zavos // J.
Viral. Hepat. 2003. №10. P.335–342; Chen C.J., Risk of Hepatocellular Carcinoma
Across a Biological Gradient of Serum Hepatitis B Virus DNA Level / C.J. Chen, H.I.
Yang, J. Su // JAMA. 2006. №295. P.65–73). Морфологически апоптоз
характеризуется образованием мембранных пузырей, агрегацией хроматина
вблизи ядерной мембраны, конденсацией и фрагментацией клетки с образованием
апоптических телец с последующим их фагоцитозом. В отличие от некроза, при
апоптозе не возникает выраженной воспалительной реакции. Различия между
некрозом и апоптозом на стадии их инициирования не столь очевидны, и одни и
те же факторы (АФК, оксид азота (II)) могут стимулировать оба процесса.
Гепатотоксиканты вызывают гибель клеток печени по механизму как некроза, так
и апоптоза (S-adenosylmethionine (SAMe) attenuates acetaminophen hepatotoxicity in
C57BL/6 mice / Valentovic M. [et al.] // Toxicol. Lett. 2004. №154. P.165–174).
Гибель паренхимы при хроническом гепатите высокой степени активности
может проявляться мостовидным некрозом с массивным поражением портальных
и перипортальных зон. При менее активном заболевании имеется скопление
апоптичных и атрофированных гепатоцитов, часто с застоем в синусоидах. После
полной организации поражений их идентифицируют по близости печеночных вен
к портальным трактам после рассасывания паренхимы, находящейся между ними
(Шифф Юджин Р., Майкл Ф. Соррел, Уиллис С. Мэддрей. Введение в
гепатологию: пер. с англ.; под ред. В.Т. Ивашкина, А.О. Буеверова, М.В.
Маевской. М.: ГЭОТАР–Медиа, 2011. 704 с.; Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В.,
17
Смирнов А.В.
Инфекционная гепатология : руководство для врачей. М. :
ГЭОТАР-медиа, 2012. 640 с.).
Апоптоз гепатоцитов вызывает фиброзные образования и предшествует
фиброзу печени. Апоптозные гепатоциты поглощаются звездчатыми клетками,
что приводит к их активации, и Купферовскими клетками, это обуславливает
выделение ряда противовоспалительных и проапоптозных цитокинов. Цитокины
Купферовских клеток вызывает активацию звездчатых клеток и последующий
апоптоз. Активированные звездчатые клетки
играют ключевую роль в
формировании фиброза (Там же).
В любом случае, изменения в печени зависят от химической структуры,
дозы и путей поступления токсического вещества. Выявляют широкий спектр
дистрофических изменений гепатоцитов: баллонную или жировую дистрофию,
центролобулярный некроз гепатоцитов. При прекращении поступления ядовитых
продуктов
происходит
регенерация
печени;
размножаются
и
клетки
междольковой соединительной ткани, что нередко приводит к развитию цирроза
(Кокуричев П.И. Патологическая анатомия сельскохозяйственных животных:
альбом. 199с.; Неалкогольная жировая болезнь печени: клиника, диагностика и
лечение / Мехтиев С.Н. [и др.] // Лечащий врач. 2008. №2.
С.29–37;
Жерновков В.Е. Сравнительное изучение структурного состояния плазматических
мембран головного мозга и печени мышей под действием тиролиберина in vitro /
В.Е. Жерновков, Н.П. Пальмина // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. 2007.
Т.144, №8. С.151–154; Хотимченко М.Ю., Коленченко Е.А.
Эффективность низкоэтерифицированного пектина при токсическом поражении
печени, вызванном введением свинца // Бюллетень экспериментальной биологии
и медицины. 2007. Т.144, №7. С.65–67; Гарбузенко Д.В. Механизмы компенсации
структуры и функции печени при ее повреждении и их практическое значение //
Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2008.
Т.18, №6. С.14–21).
18
В цирротически-измененной паренхиме печени увеличивается диаметр ядер
гепатоцитов. Данное изменение является одним из признаков дисплазии
гепатоцитов (Бенявский М.В., Должников А.А. Количественная патоморфология
гепатоцитов при циррозе печени // Вестник ВолГМУ. 2005. №1(13). С.8-11). Так, с
увеличением ядер, уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).
Это отношение позволяет оценивать уровень метаболизма в клетке и проявления
компенсаторных реакций. В норме ЯЦО>1 в стволовых клетках, малых
лимфоцитах и в стареющих клетках. В высокодифференцированных же клетках
ЯЦО<1 (Хапажева М.Ж., Гутова Ф.З., Отарова Д.Д. Цитология: методические
указания для самостоятельной работы студентов. Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2008.
26с). Особенно показательна разница ЯЦО клеток во время внутриутробного
развития. В период 7-14 недельного внутриутробного развития ЯЦО наиболее
высокое и значительно понижается по мере повышения дифференцировки клеток
паренхиматозных
органов
цитоплазматические
(Пономарев
взаимоотношения
Б.Л.,
в
Петрова
Л.М.
паренхиматозных
Ядерноорганах
развивающегося плода человека // Фундаментальные науки и практика. 2010.
Т.№1. С.108).
При вирусном циррозе печени величина ядерно-цитоплазматического
отношения больше, чем при алкогольном (Бенявский М.В., Должников А.А.
Количественная патоморфология гепатоцитов при циррозе печени // Вестник
ВолГМУ. 2005. №1(13). С.8-11).
В рубцовой печени наблюдается абсолютное увеличение количества многих
матриксных белков. После некроза гепатоцитов каркас соединительной ткани
вновь
быстро
и
упорядоченно
заселяется
гепатоцитами.
При
задержке
регенерации отложение коллагена звездчатыми клетками разрушает каркас и
предотвращает восстановление до нормы (Шифф Юджин Р. Введение в
гепатологию: пер. с англ.; под ред. В.Т. Ивашкина, А.О. Буеверова, М.В.
Маевской. М. 704 с).
19
Расширение пространства Диссе может способствовать плохому транспорту
веществ к поверхности гепатоцитов, а также, возможно, формированию
портальной гипертензии. Отложение фибрилл амилоида может значительно
расширять пространство Диссе и вызывать атрофию подлежащих гепатоцитов
(Там же).
Механизм сосудистой окклюзии при хроническом заболевании печени
зависит от природы основного заболевания. Главным диагностическим признаком
при хроническом гепатите является воспаление и расширение портальных трактов
с инфильтрацией в них фибробластических элементов. При большинстве форм
хронического гепатита флебит воротной и печеночных вен возникает вследствие
сопутствующего воспаления в прилежащих тканях печени (Шифф Юджин Р.
Введение в гепатологию: пер. с англ.; под ред. В.Т. Ивашкина, А.О. Буеверова,
М.В. Маевской. М. 704 с.; Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Смирнов А.В.
Инфекционная гепатология : руководство для врачей. М. : ГЭОТАР-медиа, 2012.
640 с.).
Синтетическая и депонирующая функции заключаются в том, что в
гепатоцитах из аминокислот синтезируются белки плазмы крови: альбумины, α- ,
β- глобулины, которые в кровеносной системе транспортируют гормоны, железо,
триптофан, липиды, протромбин и фибриноген. Из моносахаридов крови в
гепатоцитах полимеризуется гликоген, который, накапливаясь в них, снижает
концентрацию
глюкозы
в
крови.
В
клетках
печени
накапливаются
жирорастворимые витамины – A, D, E, K. Одна из важнейших функций печени –
экзокринная – образование и выделение желчи (Козлов Н.А., Яглов В.В. Частная
гистология домашних животных; под ред. В. В. Яглова. М. 169с). При патологиях
печени наблюдается холестаз (Подымова С.Д. Болезни печени: 3-е изд.,
руководство для врачей. М.: Медицина, 1998. 703с). Внепеченочный холестаз
связан с нарушением оттока желчи, вызванного механическими факторами.
Синдром внутрипеченочного холестаза - с действием лекарств, инфекционных
агентов, аутоиммунных, метаболических или генетических факторов (Там же).
20
Внутридольковый холестаз вызывается недостаточной секрецией желчи
клетками печени и желчными канальцами из-за повреждений клеточных
органелл. Междольковый холестаз связан с деструкцией и сокращением числа
малых междольковых протоков. Поэтому образовавшиеся новые протоки будут
являться декомпенсирующими. Для цирроза печени алкогольной этиологии
характерно образование протоков, которые являются продолжением или
боковыми ответвлениями уже существующих в сочетании с перипортальным
холестазом (Там же).
Введение в организм лабораторных животных (крыс) четыреххлористого
углерода – гепатотропного токсина - способствует выраженному повреждению
мембран гепатоцитов, активации процессов липопероксидации, дисбалансу в
работе ферментативного звена антиоксидантной системы организма, нарушению
метаболизма
липидов,
биохимическая
белков,
характеристика
углеводов
(Бачко
метаболических
С.С.
Сравнительная
свойств
различных
гепатопротектеров в условиях токсического поражения печени: дис. канд. мед.
наук: 03.01.04. / Сергей Сергеевич Бачко. Краснодар, 2011. 170с), то есть
токсическое действие CCL4 проявляется развитием колликвационного некроза,
белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, локализованных преимущественно в
центральной зоне печеночной дольки (Руководство по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. под общ. ред.
члена-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. 832 с).
1.2. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита
организма
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является неотъемлемой частью
жизни организма, его гомеостаза. Именно благодаря ПОЛ происходит
обновление липидов биомембран, митогенез, окислительное фосфорилирование в
митохондриях, перенос электронов, восстановление железа и др. (Болдырев А.А.,
Биомембранология: учеб. пособие/ Петрозаводск: Изд-во Кар. НЦ РАН, 2006.
21
226с.). Постоянно протекающие реакции пероксидации в клеточных мембранах
способствуют обновлению их липидного состава и поддержанию активности
липидзависимых ферментов. Активация ПОЛ необходима для неспецифической
адаптации
организма
в
окружающей
среде
(Величковский
Б.Т.
Свободнорадикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации
организма к факторамокружающей среды // Вестн. РАМН. 2001. № 6. С.45–52).
Доказана роль ПОЛ в различных физиологических процессах, таких как
физические тренировки, когда во время тренировок наступает гипоксическая
активность с целым рядом негативных аспектов кислорода, то есть наступление
окислительного стресса (Стаценко Е.А. Окислительный стресс в дозировании
физических нагрузок // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация. 2009. № 4.
С.33–36; Powers S.K. Influence of exercise and fiber type on antioxidant enzyme
activity in rat skeletal muscle // Amer. J. Physiol. 1994. Vol.266. P.375–380);
холодовые адаптации (Саяпина И.Ю. Количественный анализ функциональной
активности семенника крыс при окислительном стрессе, индуцированном
адаптацией к низким температурам // Вестник новых медицинских технологий.
2011. Т.18, №2. С.155–157; Spasic M.B. Effect of term exposure to cold on the
antioxidant defense system in the rat // Free Rad. Biol. Med. 1993. № 3. P.291–299);
пищевые адаптогенов и диеты, oбoгащенные жирными кислотами (Сазонтова
Т.Г. Адаптация к периодической гипоксии и диета с ПНЖК щ-3-класса,
обладающие кардиопротективным действием, повышают устойчивость Сатранспорта саркоплазматического ретикулума миокарда к свободнорадикальному
окислению // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. № 7. С.
42–45); гипобарическая тренировка, обладающая мембраностабилизирующим
эффектом в обычном и адаптационном режиме (Киселев С.О. Механизм действия
ГБО на организм // Гипербарическая физиология и медицина. 2002. № 2. С.3–7);
важное значение имеет оксидативный баланс для нормального течения
беременности
(Ванько
Л.В.,
Сафронова
В.Г.,
Матвеева
Н.К.
Значение
оксидативного стресса в развитии осложнений беременности и послеродового
22
периода // Акушерство и гинекология. 2010. № 2. С.7–11; Колесникова Л.И. [и
др.] Изучение состояния процесса липопероксидации у женщин различных
этнических групп с угрозой прерывания беременности // Бюллетень ВСНЦ СО
РАМН. 2010. № 6 (76). С.31–33).
В
настоящее
время
любой
патологический
процесс
в
организме
рассматривается с точки зрения перекисного окисления липидов. При
патологических состояниях в организме баланс в системе ПОЛ-АОЗ изменяется,
приводя к развитию «окислительного стресса» или нарушению прооксидантноантиоксидантного баланса в пользу прооксидантных факторов, которые могут
вызвать потенциальные повреждения (Балаболкин М.И., Креминская В.М.,
Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе диабетической
нейропатии и возможность его коррекции препаратами а-липоевой кислоты //
Проблемы эндокринологии. 2005. Т.51, № 3. С.22–33; Дубинина Е.Е.
Роль
активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей
при состояниях окислительного стресса // Вопросы медицинской химии. 2001. Т.
47,
вып.
6.
С.561–581;
Зенков Н.К.,
Ланкин
В.З.,
Меньшикова Е.Б.
Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты.
М.:
МАИК Наука, 2001. 343 с.; Колесникова Л.И., Осипова Е.В., Гребенкина Л.А.
Окислительный стресс при репродуктивных нарушениях эндокринного генеза у
женщин. Новосибирск: Наука, 2011. 116 с.; Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К.
Свободнорадикальное
окисление
как
универсальный
компенсаторно-
приспособительный механизм // Компенсаторно-приспособительные процессы:
фундаментальные и клинические аспекты. Новосибирск, 2002. С.304–305; Sies H.
Оxidative Stress: Oxidants and antioxidants // Academic Press, London. 1991. P.15–
22; Betteridge D.J. What is oxidative stress // Metabolism. 2000. Vol.49. P.1865–
1874).
Окислительный стресс проявляется усилением процессов ПОЛ, о чем
говорит характерное увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов.
Причем данные о содержании продуктов ПОЛ несут информацию о степени и
23
глубине
патологического
процесса.
Маркерами
ПОЛ
являются
такие
интермедиаты, как диеновые конъюгаты (ДК), малоновый диальдегид (МД),
наличие двойных связей (Дв.св.), общая антиокислительная активность (АОА),
супероксиддисмутазы (СОД), содержание окисленного (GSH) и восстановленного
(GSSG) глутатионов и их соотношение.
В
организме
образуются
промежуточные
и
побочные
продукты
восстановления молекул кислорода – активные формы кислорода, такие как
супероксидный
(О2-),
гидроксильный
(НО·),
пергидроксильный
(НО2∙),
пероксильный (RO2∙) и алкоксильный (RO∙) радикалы, оксид азота (NO∙),
пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др.
Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и
синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном
(синглетном)
состоянии
(Владимиров
Ю.А.
Свободные
радикалы
и
антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51; Осипов О.А., Азизова Ю.А.,
Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи
соврем. биологии, 2003. Т. 31. C.180–208; Титов В.Н. Основы патогенетической
классификации форм артериальной гипертонии // Российский кардиологический
журнал. 2009. № 2 (76). С.79–95) и образующийся в ходе процессов, связанных с
транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию
АФК расходуется от 1 до 5% потребляемого кислорода. Однако эта величина
может существенно возрастать при изменении кислородного баланса организма –
при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления
молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона,
перекиси водорода, гидроксильного радикала.
Обладая
исключительно
высокой
реакционной
способностью,
АФК
подвергают окислительной деструкции многие компоненты клеток (нуклеиновые
кислоты, белки, углеводы), но особое значение для поддержания гомеостаза имеет
свободнорадикальное
перекисное
окисление
липидов,
что
обусловлено
решающей ролью биомембран в обеспечении функционирования живого
24
организма (Владимиров Ю.А., Арчаков В. И. Перекисное окисление липидов в
биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.; Ланкин В.З., Тихадзе А.К.,
Осис Ю.Г. Моделирование каскада ферментных реакций в липосомах,
включающих свободнорадикальное окисление, восстановление и гидролиз
полиеновых ацилов фосфолипидов для исследования влияния этих процессов на
структурно-динамические параметры мембраны // Биохимия. 2002. Т.67, № 5.
С.679–689).
Среди кислородных свободных радикалов наибольшее значение отводят
супероксидному
анион-радикалу
(О2-),
поскольку
именно
он
считается
родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный
радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле
кислорода в основном состоянии (Chen R., Warden J.T., Stonken J.A. Microdialysis
sampling combined with electron spin resonance for superoxide radical detection in
microliter samples // Anal. Chem., 2004. Vol.76. P.4734–4740). СОР активно
восстанавливает железо из трехвалентного в двухвалентное состояние в
присутствии ионов негемового железа. Поскольку двухвалентное железо играет
важную роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов,
это свойство СОР имеет большое значение (Владимиров Ю.А. Свободные
радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51).
Образование супероксида в организме в основном происходит при работе
митохондриальной и микросомальной цепей переноса электронов, в результате
потери электронов с восстановленных элементов этих цепей на молекулярный
кислород (Осипов О.А., Азизова Ю.А., Владимиров Ю.А. Активные формы
кислорода и их роль в организме // Успехи соврем. биологии, 2003. Т.31. C.180–
208), при активации фагоцитирующих клеток крови и тканевых макрофагов
(Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998.
№ 7. С.43–51), в ходе энзиматических реакций при действии так называемых
«перекись продуцирующих ферментов», моно- и диаминооксидаз, моно- и
диоксигеназ, при окислении гемоглобина и миоглобина, а также любых склонных
25
к
аутоокислению
селенсодержащего
биомолекул:
глутатиона,
аскорбиновой
биогенных
кислоты,
аминов
восстановленного
(Свободнорадикальное
окисление и старение / Хавинсон В.Х. [и др.]. СПб.: Наука, 2003. 328с).
Супероксиданион – радикал – пусковое звено каскада радикальных реакций,
приводящих к образованию большинства АФК и продуктов ПОЛ.
Высокоспецифичный фермент-антиокидант – СОД регулирует уровень О2в клетках. СОД ускоряет реакции дисмутации радикала с образованием молекул
перекиси водорода и кислорода (Okado-Matsumoto A., Fridovich I. Subcellular
distribution of superoxide dismutases in rat liver: Cu, Zn-SOD in mitochondria // J.
Biol. Chem. 2003. Vol.276. P.38–39).
О2- + О2- + 2Н+ → Н2 О2 + О2
Образование
О2-
сопровождается
накоплением
Н2О2
в
результате
дисмутации (неферментативно или в присутствии супероксиддисмутазы) (Дубина
Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментной антиоксидантной
защиты плазмы крови человека // Биохимия. 2005. Вып.2. С.3–18). Н2О2 довольно
стабилен при отсутствии каталазы и ионов металла, легко воспринимается
клеткой как вода из-за своей незаряженной ковалентной структуры. Однако с
ростом концентрации Н2О2 агрессивность его увеличивается и проявляется
цитотоксическое действие; может вызвать гибель фибробластов, гепатоцитов и
эндотелиальных клеток. В сублетальных концентрациях Н2О2 значительно
изменяет статус эндотелиальных клеток, повреждает Сu-, Zn-СОД, тем самым
снижая антиоксидантную защиту клеток (Окислительный стресс. Прооксиданты и
антиоксиданты / Меньщикова Е.Б. [и др]. М.: Слово, 2006. 553 с).
Гидроксильный радикал (НО∙). Одноэлектронное восстановление Н2О2
приводит к образованию гидроксильных радикалов, обладающих чрезвычайно
высокой реакционной способностью. Разложение Н2О2 в присутствии ионов
двухвалентного железа является основным путем образования НО∙ (реакция
Фентона) (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в
26
биомембранах. М.: Наука, 2003. С.230–272; Chemical kinetics: Fundamentals and
new developments / E.T. Denisov et al. Elsevier, 2003. 547 p.):
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + HO∙
ОН- радикалы обладают высокой химической активностью и время их
жизни в клетке составляет около 10-9 с, а расстояние, которое они успевают
пройти за это время от места их образования, не превышает 100 нм. Таким
образом, клеточная топография повреждающего действия ∙ОН-радикалов и, как
следствие этого, характер эффекта повреждения во многом зависит от места их
образования (Kira Y., Sato E.F., Inoue M. Association of Cu-Zn-type superoxide
dismutase with mitochondria and peroxisomes. // Arsh. Biochem. Biophys. 2003.
Vol.399. P. 96–102).
Важно отметить, что в организме нет специальных ферментативных систем,
которые
обладали
бы
ингибирующей
способностью
по
отношению
к
гидроксильному радикалу (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б.,
Окислительный стресс. М.: Наука, 2004. 343 с.). Следовательно, при целом ряде
патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК,
организм становится практически беззащитным в отношении повреждающего
действия этого соединения. Предотвратить повреждающее действие на клеточные
структуры
можно
лишь
за
счет
снижения
концентрации
радикалов
предшественников ОН·, в частности, супероксиданион-радикала и перекиси
водорода.
Синглентный кислoрод (1О2), в отличии от молекулы О2, обладает высокой
химической активностью, особенно по отношению к молекулам с участками
повышенной плoтности (ненасыщенные жирные кислоты клеточных мембран,
ароматические аминокислоты, основания). Типичными для 1О2 являются реакции
взаимодействия с двойной связью. Это свойство 1О2 особенно важно для
инициирoвания перекиснoгo oкисления ненасыщенных липидoв в биологических
мембранах (Меньщикова Е.Б. [и др]. Окислительный стресс. Прооксиданты и
антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 553 с).
27
Наиболее эффективно останавливает повреждающее действие 1О2 βкаротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 молекул прежде,
чем он подвергнется окислительной деструкции (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.
Перекисное окисление липидов в биомембранах. С.230–272).
Гипохлорит (НОСl), или хлорноватистая кислота, не является свободным
радикалом, но является сильнейшим окислителем. Он образуется в нейтрофилах
при участии фермента миелопероксидазы (Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: role in
neutrophil – mediated toxicity // Molecular Biologi and Infectious Diseases. 2006.
Vol.24.
P.283–289). Атакует простейшие амины, сульфгидрильные группы в
белках, хлорированные пуриновые основания в молекулах ДНК (Хавинсон В.Х.
[и др.]. Свободнорадикальное окисление и старение. 328с).
Все вышеперечисленные АФК являются факторами, активирующими
перекисное
окисление
липидов.
Процессы
ПОЛ
прoтекают
в
три
последовательных этапа: процесс зарождения цепей, процессы развития цепных
реакций и обрыв цепей (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б.,
Окислительный стресс. 343 с.).
На стадии инициирования под действием свободных радикалов О2,
ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических
веществ, относящихся к прooксидантам, происходит отрыв атома водорода в
альфа-положении по отношению к двойной связи. Наличие двoйной связи в
жирной кислoте oслабляет связь С-Н в смежных углерoдных атомах и тем самым
облегчает отщепление Н∙. Чем длиннее ненасыщенная боковая цепь кислоты
жирного ряда, тем сильнее у неё склонность подвергнуться липидному окислению
(Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соровский
образовательный журнал. 2000. Т.6, №12. С.13 -19; Хавинсон В.Х. [и др.].
Свободнорадикальное окисление и старение. 328с; Denisov E.T. et al. Chemical
kinetics: Fundamentals and new developments. Elsevier, 2003. 547p). Радикал с
углеродом в центре претерпевает молекулярную перегруппировку с образование
диена, содержащего сопряженные двойные связи, который в дальнейшем
28
соединяется с О2 и образует радикал пероксида, который способен отделить атом
водорода от другой жирной кислоты. Возникшие в результате этой реакции
органические
перекиси
и
новый
радикал
способствуют
продолжению
окислительных реакций, приобретающих цепной характер (Рисунок 2) (Зенков
Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б., Окислительный стресс. 343 с.).
Рисунок 2 - Реакции перекисного окисления липидов (Владимиров Ю.А.
Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51).
Считается, что образование перекисей липидов осуществляется двумя
путями: неферментативным – аскорбат зависимым (аскорбиновая кислота
регенерирует ионы за счет обратного восстановления Fe3+ до Fe2+) - происходит
во всех мембранных структурах и ферментативным (НАДФН-зависимым) –
преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме (Gutteridge J.M.C. Lipid
peroxidation and antioxidation as biomarkers of tissues damage // Clinikal Chemistry.
2005. Vol.41, № 12. P.1819–1828).
29
Процессы
ПОЛ
будут
продолжаться
и
истощать
субстраты
(полиненасыщенные жирные кислоты) до тех пор, пока в этот процесс не
вмешается глутатионпероксидаза, восстановленные глутатион, витамин Е, Se или
другие антиоксиданты (Birringer M., EyTina J.H., Salvatore B.A. Vitamin E
analogues as inducers of apoptosis: structure-function relation // Br. J. Cancer. 2003.
Vol.88. P.1948-1955). В этом случае произойдет прерывание цепной реакции.
Наличие в организме антиракдикальной защиты ограничивает процессы
пероксидации (Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б., Окислительный
стресс. 343 с).
Как было установлено Halliwell (Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Oxygen
toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease // Biochem. 2004. Vol.215. P.1–
14), поврежденные ткани подвержены перекисному окислению липидов в гораздо
большей
степени,
чем
здоровые.
Причиной
этому
является
«утечка»
антиоксидантов из поврежденных клеток, выделение ионов металла (особенно
железа и меди) и металлопротеинов (Воскресенский О.Н., Левицкий А.П.
Перекиси липидов в живом организме // Вопросы медицинской химии. 2003. Т.
16. №6. С.563–583). Происходит нарушение мембранных структур, изменение
транспорта ионов Са2+, создающее угрозу жизни клетки (Michiels C., Remacle J.
Cytotoxicity of linoleic acid peroxide, malondialdehyde and 4-hydroxynonenal towards
human fibroblast // Toxicology, 2004. Vol.66. P.225–234).
Невозможно существование организма в кислородсодержащем окружении
без
защитных
систем,
неферментативные
основу
которых
антиоксиданты
составляют
(Петрович
ферментативные
Ю.А.,
Гуткин
и
Д.В.
Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и
стресса // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2005. № 5.
С.85–92). Адекватность защиты от пероксидации обеспечивает непрерывная,
многоступенчатая, антирадикальная защита. Отсутствие или сбой последней
непременно
приведут
к
накоплению
окислительных
повреждений
и
возникновению окислительного стресса (Колесникова Л.И. Роль процессов
30
перекисного окисления липидов в патогенезе осложнений беременности: автореф.
дис. … д-ра мед. наук. Иркутск, 1993. 39 с.; Меньщикова Е.Б. [и др].
Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 553 с.;
Меньщикова Е.Б. [и др]. Окислительый стресс. Патологические состояния и
заболевания. Новосибирск, 2008. 284с). Защитная система включает в себя
низкомолекулярные соединения, такие как витамины (токоферолы, аскорбат,
ретинол, кверцитин, рутин), белки (трансферрин, церулоплазмин и др.), которые
препятствуют
генерации
активных
форм
кислорода
и
нейтрализуют
образующиеся при их участии вторичные радикалы. Кроме того, к группе
низкомолекулярных антиоксидантов относятся весьма различные соединения –
некоторые аминокислоты, мочевина, мочевая кислота, карнозин, и др. (Кения
М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при
окислительном стрессе // Успехи современной биологии. 1993. № 4. С.456–470). В
формировании
системы
АОЗ
не
менее
важную
роль
играют
такие
антиоксидантные ферменты, как металлозависимые каталазы: СОД, пероксидазы,
каталаза, селенозависимая небелковая система глутатиона («восстановленный –
окисленный глутатион») GSH, которые способны нейтрализовывать активные
формы кислорода и токсичные продукты пероксидации липидов, превращая их в
нейтральные
безвредные
антиоксидантный
эффект
соединения
(Герасимов
и
А.М.,
таким
Шаов
образом
М.Т.,
обеспечивая
Деленян
Н.В.
Противокислородная защита организма М., 1998. 187 с.; Бурлакова Е.Б., Храпова
Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран // Успехи химии, 2004. Т.54.
C.1540–1558;
Кравченко
Ю.В.
Экспериментальное исследование системы
антиоксидантной защиты на этапах онтогенеза при токсическом и алиментарном
воздействии: дисс. канд. биол. наук: 03.00.04. Москва, 2005. 162 с.; Глутатионовая
антиоксидантная система у больных сахарным диабетом / Колесниченко Л.С. [и
др].// Сибирский медицинский журнал. 2009. № 1. С.31–33).
Главной ферментативной антиоксидантной системой плазмы крови является
селенсодержащий фермент глутатионпероксидаза внеклеточных жидкостей и
31
глутатионпероксидаза гидроперекисей липидов (Калинина Е.В. Современные
представления об антиоксидантной роли глутатиона и глутатионзависимых
ферментов // Вестник Российской АМН. 2010. №3. С.46-54). GSH является
элементом
антиоксидантной
защиты
организма,
поскольку
разрушает
гидроперекиси жирных кислот (линолевой, линоленовой) и превращает их в
малотоксичные вещества. Эта роль селена в предохранении мембран клеток от
повреждений отражает синергизм витамина Е и селена.
Существует тесная корреляция между уровнем в организме селена и
активностью глутатионпероксидазы, которая предотвращает накопление в
клетках перекисных продуктов обмена веществ. Например,
2GSH + H2O2 = 2GS + 2H2O
Селен и витамин Е дополняют эффекты друг друга; оба входят в структуру
мембран клеток, где витамин Е связан с арахидоновой кислотой фосфолипидов, а
селен связан с белками, содержащими «негеминовое» железо, предохраняя его от
окисления.
Селен способствует нейтрализации жирных кислот за счет активации
глутатионпероксидазы. В свою очередь, витамин Е предохраняет окисление
жирных кислот мембран клеток, выполняя таким образом роль антиоксиданта
(Зайцев С.Ю., Конопатов Ю.В. Биохимия животных. Фундаментальные и
клинические аспекты: учеб. СПб.: Лань, 2004. 271–272с.; Зайцев С.Ю.
Супрамолекулярные наноразмерные системы на границе фаз: Концепции и
перспективы для бионанотехнологий. М.: ЛЕНАНД, 2010. 208с.; Георгиевский
В.И. Минеральное питание животных. М. 1979. 471 с).
1.3. Общая характеристика нанокомпозитных селенсодержащих
материалов
Нанотехнологии в медицине приобретают все большую популярность. Они
позволяют достоверно определять такие биомаркеры как ДНК, белки,
метаболиты в целях диагностики заболеваний и контроля за процессом лечения.
32
Дают возможность проводить визуализацию патологических процессов в
организме с помощью селективных контрастных агентов на основе наночастиц,
диагностировать инфекционные и вирусные заболевания человека и животных
при помощи биочипов и тест-систем нового поколения (Нанотехнологии. Азбука
для всех / под. ред. Ю. Д. Третьякова. М.: Физматлит, 2008. 368 с). Для медицины
созданы нанороботы для коррекции клеточных и молекулярных дефектов в
организме. Так, для наилучшей и более точной доставки лекарственных веществ
в клетки-мишени (в частности в опухолевые клетки) разработан наноробот (это
генно-модифицированная бактерия сальмонелла, которая «тянется» к опухолям
посредством хемотаксиса). В сальмонелле находится наноробот, выпускающий
капсулу с лекарственным веществом, как только бактерия достигнет опухоли
(Корейцы сделали наноробота для борьбы с раком [Электронный ресурс] / Режим
доступа:
http://www.nanonewsnet.ru/news/2014/koreitsy-sdelali-nanorobota-dlya-
borby-s-rakom . 8.01.2014). Стоит обратить внимание на тот факт, что наноробот
все же содержит лекарственное вещество, т.е. химический элемент, обладающий
противоопухолевой активностью, а, вероятно, и токсическим действием на
организм.
Всё больше встречается разработок адресной доставки лекарственных
веществ в клетки и ткани с помощью наночастиц, вирусных частиц, липосом и
молекулярных моторов (Конструирование наночастиц для адресной доставки
терапевтических средств в клетки и их органеллы / Ткачук В.А. и [др.] / С.191;
Ламажапова Г П. Морфология органов иммуногенеза нерпы байкальской и
эксперементальная оценка эффективности её липидов при разных патологиях:
автореф. дис. д-ра биол. наук: 06.02.01 / Галина Петровна Ламажапова. Улан-Удэ,
2011. 290 с.).
Вопросам диспергирования в фармацевтической технологии придается особое
значение. Известно, что с уменьшением размера частиц резко увеличивается
поверхностная энергия диспергируемого лекарственного вещества. При тонком
измельчении
лекарственные
вещества
лучше
растворяются,
значительно
33
изменяют
свои
химические
свойства
и
реакционную
способность.
Диспергирование может существенным образом влиять на терапевтическую
активность
лекарственных
веществ
вследствие
изменения
процессов
их
всасывания. Это происходит при изменении растворимости лекарственных
веществ, при этом скорость растворения прямо пропорциональна площади
поверхности и обратно пропорциональна величине частиц вещества (Технология
лекарственных форм: учеб. под ред. Т.С. Кондратьевой. М.: Медицина, 1991. Т.1.
496с). Уменьшение размера частиц вещества до десятка нанометров и ниже
приводит к тому, что свойства вещества начинают определяться не только и не
столько его химическим составом, сколько размером. (Наноразмерные пленки
антител
на
основе
полиэлектролитов
для
целей
высокочувствительной
иммунодиагностики / Евтушенко Е.Г. [и др.] // Российские нанотехнологии :
электронный
журнал.
2007.
Т.2,
№1-2.
С.145-153.
Режим
доступа:
http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405. 11.02.2013; Олейников В.А.,
Суханова А.В., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы
в биологии и медицине // Российские нанотехнологии: электронный журнал. 2007.
Т.2,
№1-2.
С.160-173.
http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405.
11.02.2013; Garnett M.C., Kallinteri P. Nanomedicines and nanotoxicology: some
physiological principles // Occupatinal Medicine-Oxford. 2006. P.307-311). В отличие
от «классических» частиц, доля поверхностных атомов у наночастиц значительно
больше и растет с уменьшением частицы (Сеземин И.А. Наноматериалы:
перспективы антибактериального применения в ветеринарии [Электронный
ресурс]
//
Ветеринарная
медицина:
сайт.
–
Режим
доступа:
http://veterinarua.ru/stati-i-issledovaniya/1147-nanomaterialy-perspektivyantibakterialnogo-primeneniya-v-veterinarii.html.
11.11.2013;
Лен,
Ж.–М.
Супрамолекулярная химия: Концепции и перспективы. Новосибирск: Наука, 1998.
334с). Поскольку фармакологический «ответ» на лекарственное вещество прямо
пропорционален его концентрации в требуемой области и ряду других
параметров, а распределение молекул в организме определяется их физико –
34
химическими свойствами (и они не всегда обладают необходимой аффинностью к
поврежденной области), то зачастую для эффективного лечения требуется
введение в организм значительно больших количеств лекарственных веществ, чем
необходимо для данной патологии органа и ткани. Такое экстенсивное
применение приводит к проникновению лекарственных веществ в здоровые
органы, ткани и клетки, что вызывает токсические эффекты (Тырхеев, А. П.
Общая рецептура и технология лекарственных форм: учеб.–метод. пособие. УланУдэ: Изд-во БГСХА им. В. Р. Филиппова, 2008. 68 с.; Torchilin V. Nanoparticulates
as Drug Carriers. 756p.).
Идея создания новых систем доставки лекарственных веществ принадлежит
области онкологии. Поскольку препараты для лечения опухолей обладают
высокой общей токсичностью, молекулы, высокой реакционной способностью, то
стало
необходимым
создание
особых
систем
направленной
доставки,
обеспечивающих, с одной стороны, физическую изоляцию активного начала от
внешней среды на пути к мишени и, с другой – его высвобождение в пораженном
участке или внутри него (Новый биологически активный препарат на основе
наночастиц селена / Храмцов А.Г. [и др.] С.122-125). Всё больше открытий
сделано в пользу использования композитных материалов в медицине и
ветеринарии
(Медицинские
нанотехнологии.
Перспективы
использования
фуллеренов в терапии болезней органов дыхания / Ширинкин С.В. [и др.]. / отв.
ред. докт. мед. наук, проф. М. В. Покровский. Петрозаводск: Карельский научный
центр РАН, 2009. 183с).
Однако
введение
только
размерного
параметра
нельзя
признавать
удовлетворительным и окончательным в создании нанокомпозитных систем
доставки
лекарственных
веществ. Во-первых,
в
данном
случае
многие
лекарственные вещества должны быть отнесены к объектам обычной медицины,
т.к. размеры их не превышают 1 нм. Во-вторых, введение только размерного
параметра не позволяет выделить существенного принципиального отличия
нанофармакологических препаратов от фармакологических препаратов обычной
35
медицины (Головин Ю.И. Введение в нанотехнику. М.: Машиностроение, 2007.
496 с).
В основе нанотехнологий лежат особые свойства наночастиц, отличные от
свойств объемной фазы, а именно проявление квантовых эффектов и
существенная роль свободной поверхности (Головин Ю.И. Введение в
нанотехнику. 496 с).
Исследования процессов всасывания лекарственных веществ и проведенные
опыты показали, что на терапевтическую эффективность особое влияние
оказывают следующие факторы, которые и названы фармацевтическими:
физическое
состояние
лекарственного
вещества
(размер
частиц,
форма
кристаллов, наличие или отсутствие заряда на поверхности частиц и др.);
химическая природа лекарственного вещества (соль, кислота, основание,
количество гетероциклов, эфирные связи, комплексные соединения и т.д.);
вспомогательные вещества, их природа, физическое состояние, количество; вид
лекарственной формы и пути ее введения; фармацевтическая технология. Более
того, сочетание введенной дозы и химической формы лекарственного вещества
играют фундаментальную роль в определении его токсичности (Griffiths C. A
comparison of the monetized impact of IQ decrements from mercury emissions. P.841–
847; Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current exposures and clinical
manifestations. P.1731–1737).
Среди перечисленных факторов наибольшее значение имеют следующие
факторы:
физическое
состояние
лекарственного
вещества,
наличие
вспомогательных веществ и их природа (Пат. 2392944 Российская федерация.
МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02. Препарат для лечения и профилактики
нарушения обмена селена для сельскохозяйственных животных / Оробец В. А.,
Серов А. В., Беляев В. А., Киреев И. В., Мирошниченко М. В.; заявитель и
патентообладатель ФГОУ ВПО Ставропольский гос. агр. ун-т. № 2008137463/15;
заявл 18.09.2008; опубл. 27.06.2010, Бюл. №18. 10 с). Немаловажным фактором
при применении нанотехнологий является и «отслеживание» наночастиц в
36
биологическом материале. Это возможно благодаря возможности наночастиц к
флуоресценции или наличию квантовых точек.
Поскольку ведется активная работа в изучении биологического действия
нанокомпозитных материалов, уже сделано большое количество открытий и
исследований в области синтезирования и применения препаратов на основе
наночастиц химических элементов и органических полимеров - стабилизаторов
(матриц) (Нанотехнологии и наноматериалы в ветеринарии [Электронный ресурс]
/ Министерство сельского хозяйства РФ. М., 2011. 15с. –Электрон. версия печат.
публ. – Режим доступа: http://guv.tatarstan.ru/rus/file/pub/pub_95316.pdf . –
11.09.2013).
В качестве азотсодержащих полимеров могут быть использованы:
поливинилпирролидон, желатин, хитозан и другие азотсодержащие полимеры,
способные стабилизировать наночастицы нуль-валентного селена. Препарат
повышает иммунную резистентность организма животных и может быть
использован в качестве препарата, снижающего частоту селенового дефицита.
(Пат. 2392944 Российская федерация. МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02.
Препарат для лечения и профилактики нарушения обмена селена для
сельскохозяйственных животных / Оробец В. А., Серов А. В., Беляев В. А.,
Киреев И. В., Мирошниченко М. В.; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО
Ставропольский гос. агр. ун-т. – № 2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл.
27.06.2010, Бюл. № 18. – 10 с).
В качестве матрицы-носителя используется бычий сывороточный альбумин
(BSA) (Zhang J.-S. [et al.] Biological effects of nano red elemental selenium. 2001. P.
27–38). Cтабилизированные белком наночастицы селена с размерами 20 – 60 нм
полностью сохраняют спектр биологической активности ионного селена:
стимулируют синтез селеносодержащих ферментов, но при этом в несколько раз
менее токсичны, чем селенит натрия (Biological effects of nano red elemental
selenium / Zhang J.-S. [et al.] // 2001. P. 27–38).
37
В качестве белковой матрицы для препаратов, содержащих наноселен,
используют и белок сыворотки молока лактоферрин (Пат. 2485964 Российская
федерация.
МПК
A61K35/20;
A61K33/04;
A61P37/02;
B82B1/00.
Иммуностимулирующая композиция для животных / Козлов С.В., Степанов В.С.,
Фомин А.С., Строгов В.В., Субботин А.М., Ларионов С.В., Староверов С.А.,
Волков А.А.; заявители и патентообладатели – Староверов С.А., Волков А.А. –
2012100596/15; заявл. 10.01.2012; опубл. 27.06.2013, бюл №18. – 1 с). Однако надо
заметить, что белок молока является аллергеном.
Данные изобретения имеют ряд преимуществ по биологическому
действию по сравнению с неорганическими и органическими соединениями
селена:
- уменьшение токсичности,
- высокую усвояемость и доступность для организма,
- повышение антиоксидантного эффекта,
- удобность введения и дозировки.
На кафедре терапии и фармакологии Ставропольского государственного
аграрного университета было установлено, что при внутрибрюшинном введении
препарата нано-Se LD50 мышей составляет 32,9 ± 0,3 мг/кг. Для сравнения,
соответствующий показатель для
селенита натрия – 10
мг/кг (Новый
биологически активный препарат на основе наночастиц селена / Храмцов А.Г. [и
др.]. С.122-125).
Китайские исследователи доказали, что LD50 для нано-Se составила 113,0 мг
Se/кг, в то время, как LD50 селенита натрия – 15,7 мг Se/кг (Biological effects of
nano red elemental selenium / Zhang J.-S. [et al.]. 2001. P. 27–38). Таким образом
острая токсичность селена в наноразмерной форме в 7 раз ниже селенита натрия
на основе дозы селена.
В работах Копейкина В.В и Валуевой С.В. (Синтез наночастиц селена в
водных растворах поливинилпирролидона и морфологические характеристики
образующихся нанокомпозитов / Копейкин В.В. [и др.] // Высокомолекулярные
38
соединения. Сер. А. 2003. Т.45. № 4. С.615–622) было показано, что новые
высокоэффективные перевязочные и шовные материалы с антимикробной,
противовирусной, репаративной и имунностимулирующей активностью могут
быть получены на основе наночастиц нано-а-Se0, стабилизированных поли-Nвинилпирролидоном (ПВП).
В своей работе Tran, Sarin, Hurt, Webster (Tran, P. A. Differential effects of
nanoselenium doping on healthy and cancerous osteoblasts in coculture on titanium / P.
A. Tran, L. Sarin, R. H. Hurt, T. J. Webster // Int J Nanomedicine. – 2010. – Режим
доступа:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Differential+effects+of+nanosele
nium+doping+on+healthy+and+cancerous+osteoblasts+in+coculture+on+titanium.)
показали, что использование подложки с селеновым нанокластером на
поверхности титанового ортопедического имплантата способствует нормальной
пролифирации остеобластов и препятствует развитию рака остеобластов.
Нано-селен обладает и противоопухолевой активностью, что было доказано
авторами из технического университета Гонконга (Pat. CN 102895258 A, МПК
A61P 35/00, A61K 9/00, A61K 31/715, a61K 33/04. Pleurotus tuber-regium
polysaccharide functionalized nanometer selenium hydrosol having anti-tumor activity
and preparation method thereof / 陈填烽, 黄家兴, 吴华莲, 郑文杰, 黄文健, 文咏贤 ;
applicant and patentee 香港理工大学. – № CN 201110208539 ; declared 25.07.2011 ;
published 30.01.2013. 13 с). В данном изобретении носителем нано-селена является
полисахарид склероция съедобного гриба Pleurotus tuber-regium.
Нужно заметить, что приведенные выше матрицы-носители для нано-селена
(поливинилпирролидон, бычий сывороточный альбумин, желатин, хитозан,
декстран,
целлюлоза,
крахмал,
карбоксиметилцеллюлоза)
не
обладают
мембранотропными свойствами.
Исходя из представлений биохимической фармакологии, развивающихся в
современных исследованиях (Юркевич А.М., Швец В.И. Пути создания нового
поколения лекарственных и биохимических препаратов с использованием лигандрецепторных взаимодействий для активного мембранного транспорта // Вестник
39
РАМН. 1999. №3. С.3-8; Ильина О.П. Этиопатогенетические аспекты течения
эндемического зоба у крупного рогатого скота: в 2 кн. Иркутск: ИрГСХА, 2000.
Кн. 1. 102с.), можно полагать, что критерием максимальной специфической
активности любого фармакологического препарата чаще всего является некая
суммарная величина, зависящая как от активности и токсичности вещества, так и
от способности лучшим способом достигать биологическую мишень, не
затрагивая при этом другие клетки, органы и системы организма. Для достижения
такого эффекта направленной доставки лекарственного вещества в клетку
необходимо наличие механизма «молекула-носитель и чувствительный рецептор»
или «лиганд-рецепторное взаимодействие».
В общих чертах такие соединения должны быть достаточно сложными и
содержать участки, которые могли бы обеспечить взаимодействие вещества с
рецептором для его узнавания и связывания на поверхности рецептора с
последующим транспортом внутрь клетки и (или) переносом через мембраны, а
также участки молекул, имеющие сродство к активным центрам ферментов и
выполняющие роль их активаторов, регуляторов или ингибиторов. Эти
требования коллективом авторов (Ильина О.П. Этиопатогенетические аспекты
течения эндемического зоба у крупного рогатого скота: в 2 кн. Иркутск: ИрГСХА,
2000. Кн.2. 72 с) были сформулированы следующим образом:
1. Синтезированные
соединения
должны
содержать
участки,
соответствующие фрагментам лигандов, обеспечивающих узнавание и
связывание с участками рецепторов.
2. В
них
должны
присутствовать
фармакологически
активные
(фармакофорные) группировки.
3. Они должны содержать группы-спейсеры, которые были бы способны
выполнять функцию субстратов ферментов, отщепляющих фармакофоры
вблизи клеточной мишени.
Так для осуществления гликонаведения необходимы углеводные молекулыносители и рецепторы-лектины клеточной мембраны с высокой аффинностью к
40
этим углеводам. На поверхности мембран гепатоцитов содержится наибольшее
количество асиалогликопротеиновых рецепторов. Эти рецепторы связывают
асиалогликопротеины плазмы, а также другие полимеры с присоединенными
концевыми или боковыми галактозильными группами для последующего
внедрения их в клетку путем опосредованного рецепторами эндоцитоза. После
поглощения рецептор возвращается на поверхность клетки, лиганд же либо
расщепляется лизосомальными гидролазами, либо, избежав лизосомального
расщепления, выделяется неизменным во внеклеточную среду путем экзоцитоза
(Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы
сибирской и его металлопроизводных / Дубровина В.И. [и др.]. Иркутск, 2007. 145
с.).
Среди природных полисахаридов перспективно отличается арабиногалактан
лиственницы
сибирской
(Larix
sibirica),
который
способен
доставлять
лекарственные средства непосредственно в гепатоциты и макрофаги, является
водорастворимым и обладает невысокой молекулярной массой 10-14 кД.
(Медведева С.А., Александрова Г.П., Грищенко Л.А.
Арабиногалактан
лиственницы – перспективная полимерная матрица для лекарственных средств.
С.101–102).
В
ряде
работ
было
показано,
что
арабиногалактан
обладает
иммуномодуляторной активностью (Структура и иммуномодулирующее действие
арабиногалактана
лиственницы
сибирской
и
его
металлопроизводных
/
Дубровина В.И. [и др.]. 145с), проявляет гастропротекторные свойства (К оценке
фармакологических свойств арабиногалактана / В. К. Колхир [и др.] // Тез докл.
III Росс. нац. конгресса «Человек и лекарство». М., 1996. С.27.), обладает
антиметастазной активностью (Arabinogalactan for hepatic drug delivery / Groman
E.V. [et al.] // Bioconjugate Chem. 1994. Vol.5, № 6. Р.547–556). Положительные
результаты исследований по внедрению конъюгата АГ с хелатом кобальта в
печень показали, что АГ можно использовать для адресной доставки хелата к
гепатоцитам (Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана
41
лиственницы сибирской и его металлопроизводных / Дубровина В.И. [и др.]. 145
с.). Все это делает очень привлекательным использование его в качестве
биологически активной матрицы-носителя лекарственных средств.
В Иркутском Институте Химии им. А.Е. Фаворского (ФГБУН ИрИХ им.
А.Е. Фаворского СО РАН) был получен нанокомпозитный препарат селена в
реакции
взаимодействия
водного
раствора
природного
водорастворимого
полисахарида арабиногалактана с концентрацией 1-50% в качестве стабилизатора
и восстановителя, образующего наноразмерные частицы с водными растворами с
содержанием в них солей металла от 0,0067 до 2 ммоль в присутствии гидроксида
аммония или натрия.
C
целью
разработки
методов
синтеза
новых
водорастворимых
высокобиодоступных нанобиоконъюгатов - элементный селен/арабиногалактан
(Многофункциональные самоорганизующиеся гибридные нанобиокомпозиты на
основе природных полимеров / Б. А. Трофимов [и др.]. изучены
http://edu-cons.net/atlas_last/doc/302/1(2).pdf)
Режим доступа:
редокс-превращения
селенсодержащих органических и неорганических соединений под действием
окислителей или восстановителей в присутствии арабиногалактана как природной
наностабилизирующей матрицы.
Оказалось,
что
восстановление
в
воде
гидразином
различных
селенсодержащих неорганических соединений (SeO2, H2Se2O3, Na2Se2O3) в
присутствии арабиногалактана приводит к образованию наночастиц элементного
селена,
инкапсулированных
в
макромолекулы
арабиногалактана
(Многофункциональные самоорганизующиеся гибридные нанобиокомпозиты на
основе природных полимеров / Б. А. Трофимов [и др.]. -
Режим доступа:
http://edu-cons.net/atlas_last/doc/302/1(2).pdf). Новый нанобиокомпозит обладает
высокой
агрегативной
полученных
образцов
устойчивостью
и
нанобиокомпозитов
водорастворимостью.
показывает,
что
Изучение
наночастицы
элементного селена имеют кристаллическую структуру и дают рефлексы, по
42
уширению которых рассчитан средний размер наночастиц (средняя область
когерентного рассеяния), равный 40-100 нм (Рисунок 1).
Рисунок 1 - Дифрактограмма полученных нанобиокомпозитов
Напротив, окисление диселенофосфинатов щелочных металлов перекисью
водорода в воде в присутствии арабиногалактана дает ренгеноаморфные
наночастицы селена в арабиногалактановой матрице.
Однако, несмотря на неупорядоченность кристаллической решетки в случае
синтеза
из
диселенофосфинатов
нанобиокомпозиты
проявляют
щелочных
металлов,
люминесцентные
свойства
все
селеновые
полидисперсных
«квантовых точек» – возбуждаются и излучают свет практически во всем
видимом диапазоне частот.
Таким
оригинальных
образом,
получены
и
люминесцентных
селен/арабиногалактан,
перспективных
диагностики и лечения в биомедицине.
наработаны
лабораторные
нанобиокомпозитов
для
визуальной
партии
элементный
флуоресцентной
43
ГЛАВА 2
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы и методы исследований
Работа является итогом научных исследований, выполненных автором в
соответствии с планом научно-исследовательской работы, проводимой в
сотрудниками ФГБОУ ВПО ИрГСХА (номер государственной регистрации
01200602837).
Эксперимент
выполнен
в
Иркутской
государственной
сельскохозяйственной академии (ректор к.с-х.н. Такаландзе Г.О.) г. Иркутск.
Биохимические исследования проводились на базе ФГБУ «Научный центр
проблем здоровья и репродукции человека» СО РАМН (директор д.м.н.,
Колесникова
Л.И.),
г.
Иркутск.
Морфологические
и
гистохимические
исследования проводились в ИЛЦ ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная
техническая академия» (директор Бадеников А.В.) г. Ангарск. Эксперименты
были проведены на белых нелинейных крысах массой 180-220 г, разводимых в
виварии ангарской государственной технической академии (ветеринарное
удостоверение 238 № 0018942 от 22 ноября 2011 г.) и на белых мышах, массой 2022 г, разводимых в виварии научно-исследовательского противочумного
института Сибири и Дальнего Востока (ветеринарный сертификат 254 №0336050
от 28.07.2010).
Нанокомпозитный препарата селена (нано-Se) был синтезирован в ФГБУН
«Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского» СО РАН. Этот порошок
представляет собой гибридные органо-неорганические материалы, в качестве
неорганической фазы которых выступают наноразмерные частицы элементного
селена в количестве 0,54-0,55% и размером 40-100 нм, а в качестве органической
фазы – природный галактозосодержащий полисахарид АГ с гепатотропной
активностью. Порошок оранжевого цвета, хорошо растворимый в воде.
44
Все исследования выполнены в соответствии с этическими требованиями по
работе
с
экспериментальными
животными,
изложенными
в
следующих
нормативно-правовых документах: «Правила проведения работ с использованием
экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР №775 от
12.08.1977 г.), Хельсинская декларация всемирной медицинской ассоциации, 2000
г.; «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических
веществ»
(2005),
«Правила
лабораторной
практики»
(приложение к приказу МЗ РФ №708н от 23.08.2010 г.)
2.1.1. Определение антиоксидантной активности препарата in vitro
Определение антиоксидантной активности in vitro проводили в ИИХ СО
РАН.
Для
оценки
антиоксидантной
активности
(АОА)
нанокомпозитного
препарата селена использовали спектрофотометрический метод, в котором
радикал-катион
2,2'-азинобис(3-этилбентиозолин-6-сульфоновой
кислоты)
диаммониевой соли (ABTS+•), имеющий характерное поглощение в области 600850 нм, генерировали персульфатом калия и измеряли процент ингибирования
поглощения добавляемыми антиоксидантами (Antioxidant activity applying an
improved abts radical cation decolorization assay / Re R. [et al.] // Free Radical Biology
& Medicine. 1999. Vol.26, №. 9/10. P.1231–1237).
Методика определения.
Антиоксидантную активность определяли по методике, описанной в работе
(Применение радикал катионов ABTS+ в оценке антирадикальной активности
флавоноидов / И. Р. Ильясов и др. // Фармация. 2008. №6. С.15–18). Для
определения АОА использовали раствор чистого арабиногалактана, а также его
нанокомпозита с селеном с концентрациями 0,54-0,55% в дистиллированной воде.
Растворы аскорбиновой кислоты в воде и кверцетина в этаноле готовили с
концентрациями 0,002 моль/л и 0,00057 моль/л, соответственно. Генерирование
катион-радикала ABTS+• проводили, добавляя к 2,5 мл раствора ABTS с
45
концентрацией 7 ммоль/л в солевом фосфатном буфере (PBS рН=7,4) равный
объем раствора персульфата калия в том же буфере с концентрацией 2,5 ммоль/л.
Для приготовления рабочего раствора ABTS+• его исходный раствор разбавляли
буфером PBS, термостатировали в течение 15 мин при фиксированной
температуре 30˚С. Затем измеряли оптическую плотность рабочего раствора
ABTS˙+ при длине волны 730 нм. Если поглощение в максимуме составляло
0,7±0,01 единиц оптической плотности, то продолжали эксперимент, прибавляя
по 3,9 мл рабочего раствора ABTS˙+ к ранее отобранным микроколичествам от 10
до 60 мкл соответствующего антиоксиданта с концентрациями, которые вызывали
подавление поглощения ABTS˙+ в интервале 20-60%. Емкости с рабочими
растворами интенсивно встряхивали, выдерживали в темноте при температуре
30˚С в течение 4 минут, а затем измеряли оптическую плотность при 730 нм.
Раствор сравнения - PBS, толщина кюветы d=1 см.
Процент ингибирования рассчитывали по формуле:
% ингибирования = 100 • (1 - А2/А1)
где А1 - оптическая плотность раствора ABTS˙+ на длине волны 730 нм без
добавления исследуемого образца;
А2 - оптическая плотность раствора ABTS˙+ через 4 минуты после
добавления исследуемого образца.
2.1.2. Моделирование токсического повреждения печени
Токсическое
повреждение
печени
моделировали
путем
подкожного
введения 50% масляного (оливковое масло) раствора тетрахлорметана (CCL4) на
протяжении 4 дней в дозе 2 мл/кг. Введение изучаемых веществ осуществляли за
1 час до применения гепатотоксина. Контрольные животные получали токсикант
и эквиобъемное с гепатопротектором количество воды (Таблица 1) (Руководство
по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ. под общ. ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. М.: Медицина,
2005. 832 с).
46
Изучаемый композитный препарат нано-Se вводили животным перорально
через зонд в дозе 2 мг/100 г массы животного (исходя из информации о
содержании селена в нанокомпозитном препарате и эффективных доз селенита
натрия), предварительно растворив сухой препарат в 3 мл воды. Поскольку АГ
входит в состав изучаемого препарата, он явился препаратом сравнения и его
также растворяли в воде и вводили перорально через зонд в дозе 20мг/100 г
(Гуцол Л.О. Патогенетическое обоснование применения арабиногалактана для
коррекции нарушений в печени при интоксикациях фенилгидрозином и
этиленгликолем: дис. канд. биол. наук: 14.00.16. Иркутск, 2006. 165 с).
Группа интактных животных содержалась в тех же условиях, при таком же
кормлении, как опытные и контрольные группы.
Таблица 1 – Дизайн эксперимента
Воздействие на животных
Обозначение групп
n
Четыреххлористый углерод в 50%
CCL4
30
CCL4 +АГ
30
ССL4 + Nano-Se
30
Интактные животные
30
масляном растворе, 0,4 мл/100 г массы,
п/к,
Четыреххлористый углерод в 50%
масляном растворе, 0,4 мл/100 г массы,
п/к, + АГ 20 мг/ 100 г, peros
Четыреххлористый углерод в 50%
масляном растворе, 0,4 мл/100 гр
массы, п/к, + нано-Se 2 мг/100 г, peros
Интактные животные
2.1.3. Методы биохимического исследования
После декапитации животных в сыворотке крови проводили определение
содержания двойных связей (Дв.св.) конъюгированных диенов (ДК), малонового
диальдегида (МДА), общую антиокислительную активность (АОА), токоферола и
ретинола. В клеточном содержимом крови проводили определение активности
47
супероксиддисмутазы
(СОД),
cодержание
окисленного
(GSSG)
и
восстановленного (GSH) глутатионов и их соотношение. Исследования крови и ее
компонентов на содержание компонентов системы пероксидации липидовантиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) проводили в ФГБУ «Научный центр
проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, согласно
применяемой в этом учреждении лабораторной технологии (Колесникова Л.И.
Роль процессов перекисного окисления липидов в патогенезе осложнений
беременности: автореф. дис. д-ра мед. наук. Иркутск, 1993. 39 с.).
Определение концентрации МДА
Концентрацию МДА в сыворотке крови определяли по методу В.Б.
Гаврилова, А.Р. Гавриловой, Л.М. Мажуль, с помощью тиобарбитуровой кислоты
(ТБК) (Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения
продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с
тиобарбитуровой кислотой // Вопросы медицинской химии. 1987. № 1. С.118–122;
Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение
содержания гидроперикисей липидов в плазме крови // Лабораторное дело. 1983.
№ 3. С.33–36). Принцип метода основан на образовании окрашенного комплекса
при взаимодействии МДА с тиобарбитуровой кислотой. При нагревании в кислой
среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с
образованием малонового диальдегида, связывание молекулы которого с двумя
молекулами ТБК приводит к формированию окрашенного комплекса. Реакцию
проводят под контролем внутреннего и внешнего стандарта, используя растворы:
контрольный (0,2 мл дистиллированной воды вместо сыворотки) и стандартный
(0,2 мл 5·10-6М раствора 1,1,3,3 - тетраметоксипропана («ICN») вместо сыворотки,
что соответствует содержанию 1 нмоль МДА пробы). В каждой пробе
регистрировали интенсивность флуоресценции при возб=515нм и исп=554нм на
спектрофлюорофотометре Shimadzu (RF-1501, Япония). Концентрацию МДА
выражали в мкмоль/л.
48
Определение содержания субстратов с сопряженными ненасыщенными
двойными связями (ДВ. СВ.), диеновых конъюгат (ДК), кетодиенов и
сопряженных триенов (КД и СТ)
Содержание
ДК
И.А.Волчегорского,
в
сыворотке
А.Г.Налимова,
крови
определяли
Б.Г.Яровинского,
по
методу
Р.И.Лифшица
(Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного
определения липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / Волчегорский
И.А. [и др.] // Вопросы медицинской химии. 1989. № 1. С.127–131). Принцип
метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых
структур гидроперекисей липидов в области 220 (ДВ.СВ.), 232 (ДК), 278 (КД и
СТ) нм. Измерения производились на спектрофотометре СФ–56 (Россия). Для
расчета ДК использовался молярный коэффициент экстинкции: К=2,2 · 10 5 Моль-1
См-1. Содержание двойных связей (ДВ. СВ.) и кетодиенов и сопряженных триенов
(КД и СТ) выражали в отн. ед., диеновых конъюгатов (ДК) в мкмоль/л.
Определение активности супероксиддисмутазы (СОД)
Определение активности СОД проводили методом H.P. Misra, I. Fridovich
(Misra H.P. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a
simple assay for superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1972. Vol.247. P.3170–3175).
Метод основан на способности СОД тормозить реакцию аутоокисления
адреналина при РН = 10,2. Реакцию в пробах, содержащих гемолизат
эритроцитов, начинали добавлением адреналина. Измерение активности СОД
проводили на спектрофлюорофотометре Shimadzu (RF-1501, Япония) при = 320
нм. За условную единицу активности фермента принимали такое количество
СОД,
которое
требовалось
для
ингибирования
скорости
аутоокисления
адреналина на 50%. Активность СОД выражали в усл.ед.
Определение общей антиокислительной активности крови (АОА)
Определение проводили по методу Г.И. Клебанова, И.В. Бабенкова, Ю.О.
Теселкина. Для оценки АОА использовали модельную систему, представляющую
собой суспензию липопротеидов желтка куриных яиц, позволяющую оценить
49
способность сыворотки крови тормозить накопление МДА в суспензии. ПОЛ
индуцировали добавлением Fe 2 SO 4  7H 2 O, причем контрольная проба не
содержала плазмы крови. Общую АОА крови определяли на спектрофотометре
СФ-56 (Россия) и выражали в усл.ед. оптической плотности (Клебанов Г.И.
Оценка АОА плазмы крови с применением желточных
липопротеидов //
Лабораторное дело. 1988. №5. С.59–60).
Определение α-токоферола и ретинола
Использовали
метод
Р.Ч.
Черняускене,
З.З.
Варшкявичене,
П.С.
Грибаускаса (Одновременное определение концентраций витаминов Е и А в
сыворотке крови / Черняускене Р.Ч. [и др.] // Лаб. дело. 1984. №6. С.362–365).
Метод предусматривает удаление веществ, препятствующих определению, путем
омыления проб в присутствии больших количеств аскорбиновой кислоты и
экстракцию
неомыляющихся
липидов
гексаном
с
последующим
флуориметрическим определением содержания - токоферола и ретинола на
спектрофлюорофотометре Shimadzu (RF-1501, Япония). В качестве внешнего
стандарта используются: D, L, -токоферол фирмы Serva и all-trans-retinol
фирмы " Sigma". При этом -токоферол обладает интенсивной флюоресценцией с
максимумом возбуждения при еx = 294 нм и испускания при еm = 330 нм;
ретинол - при еx = 335 и еm = 460 нм. Содержание  - токоферола и ретинола
выражали в мкмоль/л.
Определение восттановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона
Суть метода заключается в способности GSH специфично реагировать с
ортофталевым альдегидом при рH 8.0, с образованием флуоресцентного продукта,
который может быть активирован при 350 нм с пиком эмиссии при 420 нм.
Определение GSSG проводили аналогично с ортофталевым альдегидом, но в
более щелочной среде (рН 12). Кроме того, для предотвращения окисления GSH в
GSSG в пробы добавлен N-этилмалиенит. Условия регистрации флуоресценции
были идентичны. Измерения проводились на спектрофлюорофотометре Shimadzu
(RF-1501, Япония) при еx=350нм и еm=420нм, выражали в ммоль/л (Hissin, H. Y.
50
Fluometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues / H.
Y. Hissin, R. Hilf // Anal. Biochem. – 1976. Vol. 74, №1. P. 214–226).
2.1.4. Методы исследования острой токсичности
Исследования проводили согласно Руководству по экспериментальному
(доклиническому)
(Руководство
по
исследованию
новых
фармакологических
экспериментальному (доклиническому)
изучению
веществ
новых
фармакологических веществ. под общ. ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У.
Хабриева. М.:
Медицина, 2005. 832с), с соблюдением правил работы с
экспериментальными животными (Правила проведения работ с использованием
экспериментальных животных (приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г.,
№755). Исследования проведены на 60 мышах (30 самцов, 30 самок), массой 2022 г, выращиваемых в виварии Научно-исследовательского противочумного
института Сибири и Дальнего Востока. Животные были разделены на 6 групп.
Все животные получали препараты, разведенные водой, per os; первые 6 ч после
дачи препарата за животными вели непрерывное наблюдение. Животные первой
группы получали селенит натрия в дозе 4,56 мг Se/кг (токсическая доза селенита
натрия) - контрольная группа, животные второй группы получали 9,12 мг Se/кг
(летальная доза селенита натрия согласно литературным данным), животные
третей группы – 9,50 мг Se/кг. Исследуемый препарат давали, начиная с дозы 9,12
мг Se/кг и далее увеличивали дозу в 2 раза, то есть 4 группа получала нано-Se в
дозе, эквивалентной смертельной дозе по содержанию селена в препарате
селенита натрия (9,12 мг Se/кг); 5 группа – наноселен (20 мг Se/ кг); 6 группа –
наноселен (40 мг Se/кг). За животными вели наблюдение 14 дней.
2.1.5. Методы патоморфологического исследования
Материалом служили головной мозг, легкие, печень, желудок, почки,
селезенка крыс. Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего
осуществляли проводку и заливку в парафин + воск. С каждого блока получали
51
серийные срезы (5 мкм) на микротоме С. Reichert. w. ien № 2281 и окрашивали их
гемотоксилин-эозином по Карачи (Меркулов Г.А. Курс патогистологической
техники. Л.: Медицина, 1969. 424с). Морфометрию проводили с помощью
окуляра-микрометра LOMO MOB -1-16* на микроскопе LOMO Микмед -1. В
нефиксированных срезах печени, приготовленных в криостате (10 мкм), методом
гистохимического анализа определяли содержание общих липидов по Лизону
(судан черный), гликоген - по методу А. Л. Шабадаша, 1947 (Шабадаш А.Л.
Рациональная
методика
гистохимического
обнаружения
гликогена
и
ее
теоретическое обоснование // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1947. №66. С.745–760.)
контроль
проводили
сукцинатдегидрогеназы
с
диастазой,
(СДГ,
по
активность
Нахласу),
ЩФ
(по
(Меркулов
Берстону)
Г.А.
Курс
патогистологической техники. Л.: Медицина, 1969. 424с). Патоморфологические
исследования проведены в отделе токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО
«Ангарская государственная техническая академия».
2.1.6. Методы статистической обработки исследований
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью
лицензионного пакета прикладных программ STATISTICA 6.1. (Statsoft Inc.,
США); правообладатель лицензии ФГБУ «Научный центр проблем здоровья
семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН (г. Иркутск).
Статистическую обработку проводили параметрически с учетом t-критерия
Стьюдента, причем разность различий средних арифметических признавали
значимой при Р ≤ 0,05.
52
2.2. Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата
селена на организм животных
2.2.1. Антирадикальная активность нанокомпозитного препарата
селена in vitro
Как уже говорилось выше, селен обладает антиоксидантным действием.
Основная задача, которая решалась на данном этапе исследований – оценить
антиоксидантное действие нанокомпозитного препарата селена в условиях in vitro
и сравнить его с АГ, а также с известным антиоксидантом – аскорбиновой
кислотой.
На основании полученных результатов строили графики зависимости
процента ингибирования от концентрации антиоксиданта (Рисунок 3) и
определяли IC50 - концентрацию, при которой нейтрализуется 50% радикалкатионов,
также
рассчитывали
наиболее
универсальную
относительную
характеристику АРА - TEAC - эквивалент антиоксидантной активности в
пересчете на тролокс, активность которого принимают за 1. Данные по АРА
изученных соединений представлены в таблице 2.
53
90
80
70
% ингибирования
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
концентрация Se в р-ре нанокомпозита в пересчете на массу атома селена, мкмоль
Рисунок 3 - Влияние концентрации антиоксиданта - нанокомпозита
арабиногалактана с Se на процент ингибирования ABTS˙+( r2 = 0,98)
Достоверность полученных величин IC50 оценивали среднеквадратической
ошибкой (s) и доверительным интервалом среднего значения (∆x), вычисленным
для n измерений при 95% вероятности по формулам (Doerffel K. Statistics in
Analytical Chemistry / K. Doerffel // Deut. Verlag Grundstoffind., Leipzig, 1966.).
Как видно из таблицы 2, АРА композита селена с арабиногалактаном не
уступает АРА аскорбиновой кислоты. Поскольку исходный арабиногалактан не
способен ингибировать ABTS˙+ при значительно более высоких концентрациях,
чем композит на его основе, можно полагать, что АРА последнего определяется
наличием Se.
54
Таблица 2 - Xарактеристика антирадикальной активности
исследуемых соединений для их молярных концентраций
Соединение
IC50,
мкмоль/л
TEACмIC50
Арабиногалактан
Не обладает
Нанокомпозит
арабиногалактана
и селена
Стандарт
(аскорбиновая
кислота)
18±2.9*
s=2.5; n=6
Не
обладает
0.91
16.1±1.1
s=0.96; n=5
0.98
TEACм
IC50,
лит. данные мкмоль/л
лит. данные
0.712
13.742
2.2.2. Антиоксидантная активность нанокомпозитного
препарата селена in vivo
Существующие литературные данные и собственные исследования in vitro,
свидетельствующие об антиоксидантной роли Se, позволили нам выдвинуть
гипотезу о том, что позитивный эффект при даче нанокомозитного препарата
селена при токсическом повреждении печени определяется адресной доставкой Se
в клетки печени при помощи АГ, что и определяет антиокисдантную защиту и
протекторное действие на гепатоциты.
Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 3, содержание
Дв. св. в каждой из четырех исследованных групп имеет сходную тенденцию к
изменению: самая высокая величина измеряемого показателя остается у
интактных животных, затем несколько снижается в группе с нано-Se, заметно
ниже в группе с арабиногактаном и самый низкий показатель Дв.св. в серии
животных, которые получали чистый четыреххлористый углерод. Другими
словами, нанокомпозитный препарат селена во все сроки эксперимента
предохраняет ненасыщенные структуры жирных кислот от окисления, что в
последующем может положительно сказаться на характер течения процессов
липопероксидации мембранных структур.
55
Таблица 3 - Содержание субстратов, продуктов ПОЛ и общей АОА при
затравке экспериментальных животных четыреххлористым углеродом и
выведения их из опыта в разные сроки (М ± m)
Сроки
забор
а
матер
иала
7
сутки
Группы
экспериме
нтальных
животных
нано-Se
АГ
CСl4
интактные
14
сутки
нанo-Se
АГ
CСl4
интактные
21
сутки
нанo-Se
АГ
CCL4
интактные
Исследуемые параметры
Дв.св.
(усл.ед)
1,300±0,
092●
0,776±0,
145
0,378±0,
081
1,613±0,
248
1,560±0,
144
0,586±0,
201●♦
0,374±0,
029
1,430±0,
081
1,093±0,
123
0,755±0,
129
0,473±0,
078
ДК(мкМ
/л)
1,950±0,
129♦
2,300±0,
233♦
3,424±0,
631
1,326±0,
155
1,753±0,
259
2,616±0,
280
3,631±0,
385
1,256±0,
148
1,257±0,
062*●♦
2,110±0,
304se
2,993±0,
313
1,440±0, 1,460±0,
206
227
КД_СТ
(усл.ед.)
0,786±0,
161♦
1,043±0,
136♦
2,425±0,
350
0,770±0,
107
0,793±0,
159
1,200±0,
221
2,370±0,
221
0,466±0,
117
0,670±0,
147
1,340±0,
237
1,898±0,
189
МДА
(мкМ/л)
2,290±0,
287*
2,960±0,
141se♦
3,575±0,
512
1,763±0,
229
2,426±0,
337
3,156±0,
261
4,092±0,
393
1,886±0,
217
1,938±0,
247
3,325±0,
481
3,204±0,
404
AOA
(усл.ед.)
20,26±1,6
64
13,50±1,7
26
9,020±1,6
30
19,90±1,7
84
18,43±0,8
60●♦
11,43±1,3
68●
7,706±1,7
46
19,96±3,4
42
20,22±1,6
16
12,18±2,2
42♦
8,702±0,8
53
0,553±0, 2,100±0,
182
254
20,00±1,3
63
Примечание: ● – р < 0,05 - в сравнении с интактными животными; * - р <
0,05 – в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - р < 0,05- в сравнении с
группой CCL4.
56
Действительно, как показывают результаты таблицы 3, концентрация
первичных
продуктов
ПОЛ
при
использовании
нано-Se
иногда
даже
статистически значимо не отличается от аналогичных показателей, характерных
для серии интактных животных.
Представляется закономерным, что наноселен, введенный в матрицу
арабиногалактана, оказывает положительный эффект и при генерации так
называемых
ТБК-активных
продуктов,
которые
могут
ингибировать
биологически активные амины и которые вносят значительный вклад в генерацию
эндогенной интоксикации (Зайчик А.Ш. Основы патохимии. Том 2. СПб.: ЭлбиСПб, 2001. 688 с).
Не исключено, что определенная защитная функция от вводимого
токсиканта обусловлена и арабиногактаном, который может обладать этим
эффектом в серии экспериментов через 21 сутки, когда потери наночастиц селена
значительны, а освободившаяся органическая матрица может проявить описанные
антиоксиданные гепатопротективные свойства (Колесникова Л.И. Окислительный
стресс при репродуктивных нарушениях эндокринного генеза у женщин.
Новосибирск: Наука, 2011. 116 с.; Чистяков Ю.В. Основы бионеорганической
химии. М.: КолосС, 2007. 539 с).
Известно, что достоверную информацию о состоянии любой редокссистемы, включая целостный организм, можно получить не только изучая
активность радикальных процессов, но и при одновременном исследовании
компонентов, определяющих мощность антиоксидантной подсистемы с ее
низкомолекулярными и ферментативными звеньями (Колесникова Л.И. Роль
процессов
перекисного
окисления
липидов
в
патогенезе
осложнений
беременности: автореф. дис. д-ра мед. наук. Иркутск, 1993. 39 с.; Сазонтова Т.Г.
Значение баланса прооксидантов и антиоксидантов – равнозначных участников
метаболизма // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007.
№ 3. С. 2–18).
57
ДК – нетоксичный промежуточный продукт ПОЛ, и при дальнейшем
окислении ДК образуют МДА, который оказывает отрицательное воздействие на
организм, известное как редокс-ассоциированные поражения. Во все сроки
эксперимента содержание промежуточных продуктов (ДК) в группе нанo-Se
ниже, чем в группах сравнения, и приближается к показателю группы интактных
животных. Следовательно, и образование МДА из ДК достоверно ниже, чем в
остальных группах. Такой показатель как АОА – показатель защиты организма от
действия свободных радикалов и соединений О2 – всегда оставался на одном
уровне в группе нанo-Se и даже превышал таковой у интактных животных, в то
время как в группах с АГ и CCL4 был значительно снижен во все дни
эксперимента.
Анализ такого интегрального показателя, как величина общей АОА,
показывает (Таблица 3), что при введении экспериментальным животным
наноселена этот показатель практически не изменяется по сравнению с таковым
для интактных крыс; кроме того, статистически значимо он превышает
аналогичные данные для арабиногалактана и особенно для четыреххлористого
углерода.
Изменение содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови во всех группах
и во все сроки эксперимента наглядно показано на рисунке 4.
58
Рисунок 4 - Изменение содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови
Изменение концентрации жирорастворимых витаминов, которые являются
компонентами общей антиоксидантной активности и играют важнейшую роль в
гомеостазе вязкостных свойств мембран, приведены в таблице 4.
Таблица 4 - Содержание ретинола и α-токоферола при затравке
экспериментальных животных четыреххлористым углеродом, коррекции
патологии нанопрепаратом селена и выведения их из опыта в разные сроки,
М±m
Сроки
Группы
забора
эксперименталь
Исследуемые параметры
материал ных животных
а
7 сутки
α-токоферол (мкМ/л)
ретинол (мкМ/л)
нано-Se
9,000±0,746*
0,83±0,159
АГ
11,886±1,717se
1,563±0,225•
59
14 сутки
21 сутки
CCL4
5,208±1,084
0,454±0,127
интактные
7,010±1,020
0,776±0,085
нано-Se
9,456±1,737
0,930±0,152
АГ
14,403±1,241
2,016±0,087•
CCL4
5,554±1,128
0,374±0,103
интактные
8,420±1,698
1,040±0,220
нанo-Se
7,215±1,082
1,185±0,163•
АГ
14,440±1,916•♦
1,362±0,148•
CСL4
6,569±0,854
0,600±0,100
интактные
11,230±0,791
1,140±0,355
Примечание: ● – р < 0,05 - в сравнении с интактными животными; * - р <
0,05 – в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - р < 0,05- в сравнении с
группой CCL4 .
Рассматривая изменение концентрации жирорастворимых витаминов,
которые являются компонентами общей АОА и могут играть важнейшую роль в
гомеостазе вязкостных свойств мембран, обращает на себя внимание необычный
факт: наибольший эффект в сохранении концентрации этих витаминов при
затравке ССl4 оказывает арабиногалактан, который обладает гидрофильными
свойствами. Ранее уже обращалось внимание на то, что АГ может обладать
собственными свойствами, как макромолекула, образуя устойчивые комплексы с
родственными компонентами клетки и отдельными молекулами, находящимися в
растворенном состоянии в жидком содержимом крови или лимфы. Вероятно,
арабиногалактан способен экранировать крупные молекулярные структуры и
даже отдельные клетки, что существенно изменяет состояние водных структур,
как это постулирует Гильберт Линг (Линг Г. Физическая теория живой клетки
(незамеченная революция). СПб.: Наука, 2008. 376 с).
Супероксиддисмутаза (СОД) – фермент – показатель защиты мембран
клеток от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся при
активации ПОЛ – достаточно высок в группе нано-Se (таблица 5). Также
60
небольшое повышение активности СОД является компенсаторным механизмом
защиты клеток от окислительного стресса (Перекисное окисление липидов и
состояние антиоксидантной системы в эритроцитах, больных раком почки / М. Н.
Герасименко [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –
2012. № 3. С.693).
Селеносодержащий фермент глутатион восстановленный (GSH) является
важнейшим внутриклеточным антиоксидантом (The changing faces of glutathione, a
cellular protagonist / A. Pompella [et al.] // Biochem. Phermacol. 2003. Vol.66. P.
1499–1503) и его активность зависит от наличия в организме элементного селена,
а также витамина Е. В клетках же глутатион восстанавливает любую
дисульфидную связь. При этом GSH превращается в GSSG. Содержание GSH в
группе нанo-Se достаточно высокое и приближается к показателям группы
интактных животных, что говорит о высоком уровне антиоксидантной защиты
клетки во все сроки эксперимента (Таблица 5).
Таблица 5 - Активность СОД и концентрация восстановленной и
окисленной форм глутатиона при затравке экспериментальных животных
четыреххлористым углеродом и выведения их из опыта в разные сроки,
М ±m
Сроки
Группы
забора
эксперимен
материа
тальных
ла
животных
7 сутки
Исследуемые параметры
СОД (усл.ед)
GSH (мМ/л)
GSSG (мМ/л)
Нано-Se
1,620±0,084*
1,826±0,069*•
1,380±0,105*
АГ
1,343±0,040se♦
1,144±0,177se♦
1,380±0,032se♦
CCL4
1,078±0,130
1,144±0,086
1,233±0,099
интактные
1,637±0,071
2,013±0,172
1,436±0,059
61
1,730±0,097
1,940±1,130•
1,686±0,092
АГ
1,390±0,083
1,276±0,153•♦
1,473±0,056
CCL4
1,100±0,091
1,093±0,077
1,204±0,069
интактные
1,606±0,118
2,026±0,062
1,660±0,093
1,705±0,069*
1,790±0,641*•♦
1,548±0,158•
АГ
1,362±0,166se♦
1,235±0,086se
1,290±0,106
CCL4
1,213±0,067
1,160±0,064
1,014±0,083
интактные
1,650±0,102
2,030±0,065
1,700±0,073
14 сутки Нано-Se
21 сутки Нанo-Se
Примечание: ● – р < 0,05 - в сравнении с интактными животными; * - р <
0,05 – в сравнении с группой арабиногалактана; ♦ - р < 0,05- в сравнении с
группой CCL4 .
При изучении факторов, находящихся в клеточном содержимом крови
(СОД, GSH, GSSG), были получены данные, сходные с теми, которые отражены в
таблице 3. Так же, как и при исследовании содержания продуктов ПОЛ, при
затравке четыреххлористым углеродом, последний снижал величину СОД, а АГ
несколько увеличивал активность фермента. Как и в предыдущем опыте,
активность СОД при введении нанопрепарата находилась на уровне этого
показателя у интактных животных. Небольшое повышение активности СОД
является компенсаторным механизмом защиты клеток от окислительного стресса
(Перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы в
эритроцитах, больных раком почки / М. Н. Герасименко [и др.] // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. 2012. № 3. С. 693).
Снижение СОД ускоряет образование ДК и липопероксидов, при этом
активизируется пероксидаза и процесс образования МДА замедляется.
Содержание
восстановленной
формы
глутатиона
после
введения
наноселена, было существенно выше, чем при инъекциях чистого токсиканта и
АГ, и приближалось к показателям животных интактной серии.
Наблюдалась также сходная динамика изменения уровня окисленной
формы глутатиона при воздействии ССl4 и АГ. Однако содержание данного
62
показателя при воздействии арабиногалактана через неделю находилось на том же
уровне, что и в группе животных, получавших нанокомпозитный препарат селена.
Вместе с тем, при введении нанокомпозитного препарата селена на фоне
затравки экспериментальных животных четыреххлористым углеродом, величины
активности СОД и концентрация окисленного и восстановленного глутатионов
были близки к соответствующим показателям животных интактной серии.
Таким образом, исследование нового органического препарата селена, с
размером наночастиц 40-100 нм, внедренного в матрицу арабиногалактана,
показало выраженные антиоксидантные свойства на исследованной модели
токсического поражения печени четыреххлористым углеродом. Кроме того,
результаты исследования показали позитивный эффект коррекции нано Se в
решетке арабиногалактана на метаболизм витаминов в опытных группах, что
является научной основой для дальнейшего его исследования c целью
клинического применения в ветеринарной медицине и медицине человека.
На основании полученных результатов о содержании продуктов ПОЛ в
сыворотке крови определяли коэффициент окислительного стресса (Таблица 6).
Коэффициент
окислительного
стресса
(КОС)
рассчитывается
как
соотношение продуктов ПОЛ к показателям АОЗ (Пат. с. 2011617323 РФ.
Программа для расчета коэффициента окислительного стресса на основе
параметров системы перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты в
крови / Л. И. Колесникова, Л. А. Гребенкина, В. П. Олифиренко, Е. В. Осипова,
М. И. Долгих, Н. А. Курашова, М. А. Даренская ; заявитель и патентообладатель
Учреждение РАМН НЦ ПЗСРЧ СО РАМН. - № 2011615688 // Свидетельство о
гос. регистрации программы для ЭВМ. М., 2011. 1 с.).
КОС = (ДКi / ДКn) * (КД-СТi / КД-СТn)*(ТБК-АПi / ТБК-АПn)
(СОДi / СОДn)*(GSHi/GSSGn)*(Ei/En)*(Ai/An)
i – уровни показателей группы больных
n – уровни показателей контрольной группы
При КОС >1 регистрируют развитие окислительного стресса.
63
Таблица 6 – Коэффициент окислительного стресса
День
Группа животных
КОС
эксперимента
7 сутки
14 сутки
21 сутки
Нано-Se
1,646±0,498*
АГ
2,048±0,545*
CCL4
113,49±42,424*
интактные
1,037±0,28
Нано-Se
2,995±0,769*
АГ
4, 591±0,960*
CCL4
414,554±181,377*
интактные
1,069±0,44
Нано-Se
0,164±0,496*
АГ
7,312±1,721*
CCL4
87,807±28,8*
интактные
1,095±0,598
Примечание: *р ≤0,005 по сравнению с нормальными значениями.
Учитывая то, что при КОС >1 регистрируют развитие окислительного
стресса, он развивается во всех группах. При этом в группе CCL4 окислительный
стресс
становится
все
более
интенсивным
к
21
дню
эксперимента,
компенсаторные механизмы организма не справляются с токсической нагрузкой.
Здесь мы можем смело говорить об интенсивно развивающейся патологии и уже
не только печени, но и всего организма в целом. Действие АГ показало
наилучшие результаты в состоянии АОЗ, но только на 7 сутки. В дальнейшем
наступление окислительного стресса все же оказалось неизбежным. Мы
связываем это с тем, что использование АГ в качестве полимерной матрицы для
получения лекарственных препаратов способно пролонгировать их действие
(Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы
64
сибирской и его металлопроизводных / Дубровина В.И. [и др.]. 145 с.). В то время,
как сам АГ заканчивает свое действие и элиминируется из организма,
доставленный им к гепатоцитам наноселен начинает свое действие. В группе
нанo-Se
антирадикальное
действие
обусловлено
наличием
селена
в
наноразмерном состоянии, что доказано в наших экспериментах in vitro, а также
in vivo и наглядно показано на рисунке 5.
Группы сравнивали между собой и с интактными животными. Показания
считали достоверными при (р≤0,05).
Рисунок 5 - КОС (*-р ≤0,05)
Из рисунка 5 видно, что у интактных животных отсутствует окислительный
стресс (КОС=1,037±0,28). АГ сначала оказывает защитное действие на организм
животных. Однако, обладая гепатопротекторным действием, он не обладает
антирадикальной активностью (Таблица 2), то КОС увеличивается со временем,
превышая уровни КОС интактных животных и не достигая уровней КОС группы
CCL4 (КОС=87,807±28,8 к 21 дню), где явное наличие сильного окислительного
стресса (р ≤0,005).
65
Нанокомпозитный препарат селена проявляет мощное защитное действие
на организм. На 7 сутки исследования КОС практически сравним с КОС
интактных животных (р ≤0,005). На 14 день – наблюдается небольшое увеличение
КОС. Возможно, это связано с тем, что в данном сроке происходит активная
регенерация органов и тканей, усиление метаболических процессов с активным
расходованием Se. Получается, что к 21 суткам потери наночастиц селена
значительны. Однако КОС остается <1, значит, окислительного стресса нет, и
организм животного пришел в нормальное физиологическое состояние не только
по биохимическим показателям, но и по морфологическим.
Также, учитывая результаты исследований in vitro, чистый АГ не обладает
антирадикальным действием. В группе нанo-Se антиокисдантное действие
обусловлено наличием селена в наноразмерном состоянии, что доказано в наших
экспериментах in vitro, а также in vivo и наглядно показано в таблице 2.
2.2.3. Исследование острой токсичности нанокомпозитного
препарата селена
Таблица 7 показывает результаты токсичности исследуемого препарата на
мышах. Изучаемый нанокомпозитный препарат (арабиногалактан + нано-Se) в
дозе 9,12 мг Se/кг не вызвал смерть ни одной мышки; в дозе 20 мг Se/кг – все
мыши опытной группы остались живы; доза 40 мг Se/кг также не явилась
летальной для животных. Препарат сравнения, селенит натрия, вызывает 100%
гибель мышей в дозе 9,50 мг Se/кг.
Таблица 7 - острая токсичность нано-Se и селенита натрия
Доза нано-Se (мг
Se/ кг)
9,12
20
40
Гибель животных
(%)
-
Доза селенита
натрия
4,56
9,12
9,50
Гибель животных
(%)
16,7
50
100
Большее количество исследуемого препарата невозможно было ввести,
поскольку объем желудка мышки равен 1 мл (Руководство по лабораторным
66
животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под
ред. акад. РАРАН, члена-корр. РАМН Н. Н. Каркищенко, акад. РАМН С. В.
Грачева. М.: Профиль–2С, 2010. 358 с).
Действительно, полученные нами данные, свидетельствуют о более низкой
токсичности нано-селена и схожи с данными отечественных и зарубежных
коллег.
2.2.4. Морфофункциональная оценка биологического действия
нанокомпозитного препарата селена при токсическом
поражении печени
Потребность в исследованиях на животных моделях растет вместе с
разработкой
новых
лекарственных
препаратов,
материалов
клеточных
технологий, разработок нанобиотехнологий (Руководство по лабораторным
животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях / под
ред. акад. РАРАН, члена-корр. РАМН Н. Н. Каркищенко, акад. РАМН С. В.
Грачева. М.: Профиль–2С, 2010. 358с.). Так и печень крыс является объектом
многочисленных экспериментальных исследований. Применение методов оценки
состояния различных органов и тканей, а, следовательно, и целостного организма
при действии не только токсических, но и лекарственных веществ, требует
глубокого понимания множества физиологических процессов, направленных на
поддержание гомеостаза. Как правило, характер ответной реакции напрямую
связан с морфофункциональным состоянием той или иной ткани организма.
Патоморфологические изменения в органах на 7 день эксперимента при
воспроизведении экспериментальной токсической дистрофии печени у крыс
подтверждают, что наиболее выраженные изменения обнаруживаются в печени.
Макроскопически этот орган глинистого цвета, в отдельных случаях печень имеет
исчерченный мраморный рисунок, печеночная ткань истонченная, дряблая. На
разрезе – микроочаги с некротическими массами.
В желудке и кишечнике
изменения нами не обнаружены. Почки уменьшены в размере, границы мозгового
67
и коркового слоев сглажены. В легких обнаружены темные пятна, что указывает
на наличие кровоизлияний.
Патологоморфологические
токсического
поражения
изменения
печени
в
органах
нанокомпозитным
при
коррекции
препаратом
селена
отличаются от таковых у животных, не получавших гепатопротектор. Печень
немного уменьшена в размере, коричневого цвета, нормальной консистенции,
блестящая снаружи и на разрезе. Почки темно-коричневого цвета, имеют
нормальные размеры, границы мозгового и коркового слоя сохранены. Легкие
слегка спавшиеся. Желудок и кишечник без изменений.
В группе сравнения (АГ) у животных печень светло – бордового цвета,
истончена, блестящая. Селезенка уплощена. Почки, легкие, кишечник и желудок
без изменений.
На 14 день эксперимента патоморфологически в группе CCL4 явных
улучшений не наблюдалось. Печень все так же имела мраморную, глиняную
окраску. Очаги кровоизлияний в легких. Желтушность внутренних тканей, кожи,
слизистых оболочек.
В группе животных, получавших нано-Se в грудной полости обнаружено
небольшое количество транссудата.
Селезенка нормального строения, темно-
бордовая. Легкие в норме. Печень коричневого цвета. У отдельных животных
края печени чуть закругленные, у других животных печень слегка уменьшена в
размере. Определенной зависимости мы не обнаружили.
После
патоморфологической
оценки,
внутренние
органы
животных
исследовали микроскопически.
В почках обнаружена белковая дистрофия эпителия извитых канальцев,
слущивание эпителия в просвете канальцев, расширение просвета между
капсулой Шумлянского - Боумена и сосудистым клубочком (Рисунок 6, 6а).
68
Рисунок 6 - Срез почки крысы. 7 день эксперимента. Группа CCL4.
Стрелкой указано расширение пространства между капсулой Шумлянского Боумена и сосудистым клубочком. Окр. гематоксилин с эозином. Ок.10, Об.40.
69
Рисунок 6А - Срез почки крысы. 7 день эксперимента. Группа CCL4.
стрелкой указан слущенный эпителий. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об.
90.
В сердечной мышце явлений застойного полнокровия не выявлено,
отчетливо видна поперечная исчерченность миофибрилл. Сердечная мышца
равномерно окрашена (Рисунок 7).
Рисунок 7 - Сердечная мышца. 7 день эксперимента. Окр. гематоксилин с
эозином. Ок. 10. Об. 40.
При гистологическом исследовании селезенки в группе CCL4 было
выявлено выраженное полнокровие красной пульпы и уменьшение размера
лимфоидных фолликул (Рисунок 8).
70
2
1
Рисунок 8 – Группа CCL4. Селезенка. 7 день эксперимента. 1 – белая пульпа; 2красная пульпа. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 40
При попадании в организм четыреххлористого углерода, он, в большей
степени, выделяется с выдыхаемым воздухом. В легких у животных группы CCL4
обнаружено утолщение межальвеолярных перегородок и увеличение размера
альвеол за счет нарушения целостности последних (Рисунок 9).
71
Рисунок 9 - Группа CCL4. Легкие. 7 день эксперимента. Стрелками указано
утолщение межальвеолярных перегородок. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10.
Об. 40.
В головном мозге - явление перецеллюлярного и периваскулярного отёка
глии, гиперхроматоз ядер нейтрофилов (Рисунок 10).
72
2
1
1
А
2
1
2
1
Б
Рисунок 10 - Препарат головного мозга крысы 7 день эксперимента; а – CCL4; б –
опытная группа нано-Se. Проявление перицеллюлярного (1) и периваскулярного
(2) отека глии. Окр. гематоксилин с эозином, Ок.10, Об. 40.
73
Слизистые оболочки пищевода (Рисунок 11), тонкого (Рисунок 12) и
толстого
кишечника
без
изменений.
Также
нами
не
было
выявлено
гистологических изменений в желудке (Рисунок 13).
2
1
3
Рисунок 11 - Препарат пищевода крысы 7 день эксперимента: группа нано-Se. 1неороговевающий эпителий, 2 – соединительнотканные клетки, 3 – мышечная
оболочка. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 20.
74
3
1
4
2
5
Рисунок 12 - Препарат тонкого кишечника крысы 7 день эксперимента: группа
нано-Se. 1 – ворсинки тощей кишки; 2 – крипты; 3 – каемчатые клетки; 4 –
бокаловидные клетки; 5 – мышечный слой. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10.
Об. 20.
75
1
3
3'
2
3
3’
4
Рисунок 13 - Препарат желудка крысы 7 день эксперимента: группа нано-Se. 1 –
цилиндрический железистый эпителий; 2 – желудочные ямки; 3 – желудочные
трубчатые железы; 3’ – дно желудочных желез; 4 – мышечная оболочка. Окр.
гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 20.
Наиболее выраженные морфологические изменения после действия токсина
были обнаружены в почках и печени.
На 7 день эксперимента. После воздействия тетрахлорметаном в почках
обнаружена дисквамация эпителия извитых канальцев, расширение просвета
между боуменовой капсулой и сосудистым клубочком - отек, деформация
капсулы почечного канальца (Рисунок 6А). В клубочках - распад отдельных
капиллярных сегментов (Рисунок 14)
76
Рисунок 14 - 7 день эксперимента. Группа CCL4. Почечный клубочек, стрелкой
указан распад капиллярных сегментов; 1 – расширение просвета. Окр.
гематоксилин с эозином. Увеличение: ок. 10, об. 90.
Просвет капсулы Шумлянского-Боумена у животных, получавших наноSe
перорально в дозе 2мг/100 г немного увеличен, что свидетельствует о наличии
отека (Рисунок 15). Капсула четко выражена. Встречаются почечные клубочки
частично с сегментарным поражением.
77
Рисунок 15 - Почечный клубочек крысы. 7 день эксперимента. Группа нано-Se. 1 расширение пространства между боуменовой капсулой и сосудистым клубочком.
Окр. гематоксилин с эозином. Увеличение: ок 10, об. 90.
На 14 день в группе животных, получавших нано-Se, на фоне клубочков,
имеющих отек в пространстве капсулы Шумлянского - Боумена находятся
клубочки с нормальной морфологической структурой (Рисунок 16). Почечные
клубочки восстанавливаются - имеют узкое полулунное пространство в просвете
капсулы Шумлянского-Боумена, капсула ровная.
приближается к картине среза почки интакных крыс.
Гистологическая картина
78
Рисунок 16 - Почечные клубочки крысы. 14 день эксперимента. Группа наноSe. 1
– нормальное морфологическое строение почечного клубочка; 2 – расширенное
пространство. Окр. Гематоксилин с эозином. Увеличение: ок. 10, об. 90.
Для более детального исследования ответной реакции организма на
действие ССl4 и введение нано-Se нами была выбрана печень. Этот орган
способен накапливать скрытые повреждения, которые проявляются в ближайшие
или отдаленные сроки. Повреждающее действие на печень проявляется в
повышении
активности
печеночных
ферментов
(сукцинатдегидрогеназы,
щелочной фосфатазы), гипогликемии, а морфологически – в развитии жировой,
белковой, гидропической дистрофии и гибели гепатоцитов.
Мы
изучили
комплексное
морфофункциональное
состояние
регенерирующей и интактной печени крыс после токсического поражения печени
ССl4 и её коррекции препаратом наноселена.
При микроскопическом исследовании на 7 день эксперимента в группе
CCL4 в печени отмечены проявления выраженной жировой дистрофии
79
гепатоцитов в области центральных вен, что подтверждается гистохимическими
исследованиями. Гепатоциты увеличены в размере, с округлыми вакуолями
различных размеров, со смещением ядра к клеточной мембране. Большинство
гепатоцитов с практически опустошенной цитоплазмой, пикнотичнымии и
гиперхромными ядрами, что свидетельствует о состоянии паранекроза. По
периферии этих очагов гепатоциты были меньшего размера с гиперхромным
ядром (Рисунок 17а). На 7 день эксперимента в группе нано-Se в печени
отмечается средне- и мелкокапельная жировая инфильтрация вокруг центральных
вен (Рисунок 17б). Размер гепатоцитов практически соответствовал интактным
животным. Встречаются лишь отдельные гепатоциты в состоянии паранекроза с
опустошенной цитоплазмой и гиперхромным пикнотичным ядром. Биллиарный
эпителий не был изменен, воспалительных инфильтратов не отмечено, также не
отмечено застойного полнокровия в магистральных сосудах и капиллярах.
1
А
80
2
Б
Рисунок 17 - печень крысы, 7 сутки эксперимента; а. - ССL4; б. – CCL4 + нано-Se.
Небольшое
расширение
синусоидов,
отсутствует
гемодинамическое
расстройство. В цитоплазме выявляются вакуоли (м.б. гидропическая дистрофия).
1 – крупнокапельная жировая дистрофия; 2 – мелко- и среднекапельная жировая
дистрофия. Окр. Гематоксилин с эозином. Ок. 10, Об. 40.
На 14 день эксперимента в группе животных нано-Se гепатоциты без
выраженной зернистой дистрофии, имеют более менее мономорфные размеры с
хорошо выраженным ядром и равномерно распределенным хроматином (Рисунок
18а, б). Гепатоциты с гиперхромным ядром очень редки. Магистральные сосуды и
синусоиды свободные от элементов крови.
81
А
Б
Рисунок 18 - Печень крысы, 14 сутки эксперимента; а. - ССL4; б. - CCL4 + наноSe. Окраска гематоксилин - эозином. Ок. 10, Об. 20 (а), 40 (б).
82
Также
выявленное
скопление
липидов
было
подтверждено
гистохимическим исследованием (Рисунок 19). На 7 сутки эксперимента при
исследовании на общие липиды в группе CCL4 –очаги ярко-выраженной жировой
инфильтрации.
При
введении
нано-Se
–
очаги
инфильтрации
липидов
значительно меньших размеров и не так явно выражены. Содержание общих
липидов на 14 сутки (Рисунок 19б) - выраженное отсутствие образования липидов
в клетках печени при коррекции препаратом нано-Se токсического поражения
печени.
1
2
А
83
1
2
Б
Рисунок 19 - Выраженное скопление липидов в области центральных вен (А – 7
сутки; Б – 14 сутки). 1 – группа CCL4; 2 – опытная группа нано-Se. Окраска
суданом черным. Ок. 10. Об. 20.
На 7 сутки эксперимента в группе CCL4 активность щелочной фосфатазы
увеличена как в желчных капиллярах, так и магистральных желчных протоках
(Рисунок 20а). В опытной группе активность ЩФ заметно снижена (Рисунок 20
б), на 14 день эксперимента она сохраняется, но в норму приходит не полностью.
84
1
2
А
1
2
Б
Рисунок 20 - Определение активности ЩФ (А-7 сутки, Б – 14 сутки). 1 – CCL4; 2 –
нано-Se. Окр. методом азосочетания. Ок. 10. Об. 40.
85
Поскольку арабиногалактан сам обладает мембранотропными свойствами и
оказывает протекторное действие на гепатоциты, представилось интересным
сравнить действие на гепатоциты чистого арабиногалактана, и препарата нано-Se,
где элементный Se встроен в решетку арабиногалактана.
Содержание гликогена в печени в обеих группах на 7 день эксперимента
оставалось выше, чем в группе ССL4. В группе АГ и нано-Se отмечено диффузное
снижение гликогена (Рисунок 21а). На 14 день эксперимента гликоген приходит в
норму (Рисунок 21б). В группе АГ все так же заметно его снижение по сравнению
с интактными животными. Однако в группе нано-Se содержание гликогена на 14
день эксперимента даже значительно выше, чем у интактных животных.
1
А
2
86
1
Б
2
Рисунок 21 - Гликоген. (А – 7 сутки, Б – 14 сутки). 1 – действие нано-Se; 2 –
действие арабиногалактана. Ок. 10. Об 40.
Активность сукцинатдегидрогеназы заметно увеличена в группе АГ по
сравнению с группой ССl4 (Рисунок 22).
87
1
2
Рисунок 22 – определение СДГ по Нахласу. 1 - выраженное снижение активности
сукцинатдегидрогеназы в печени при воздействии CCL4. 2 – АГ. Ок. 10. Об 40.
Таким образом, рассматривая особенности течения патологического
процесса в организме при интоксикации CCL4, следует отметить выраженность
дегенеративных процессов в печени и головном мозге (Дядик В.П., Бычкова В.И.
Перикисное окисление липидов и их обмен при вирусном гепатите // Врачебное
дело. 1986. №11. С.114–117), что было подтверждено в нашем опыте. ССl4
вызывает
изменения
повреждающему
ткани
действию
печени,
наибольшей
токсического
агента
чувствительностью
обладают
к
гепатоциты.
Некротические и дистрофические процессы в них наиболее выражены на 7 сутки
эксперимента после отравления, это отражается в изменении ультраструктуры и
морфологии клеток печени, в резком снижении содержания гликогена,
увеличении синтеза нейтрального жира и развитии жировой инфильтрации.
Под влиянием CCL4 угнетается пролиферация гепатоцитов и последующая
их цитодифференцировка, образуются многочисленные атипические митозы,
замедляется
формирование
печеночных
балок.
(Руководство
по
88
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ. под общ. ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. М.: Медицина,
2005. 832 с). В то же время, при профилактическом введении АГ и, в большей
степени, препарата нано-Se, отмечается значительный положительный эффект как
на уровне метаболических процессов (нормализация активности ферментов в
печени: СДГ, ЩФ и содержание гликогена и липидов), так и в морфоструктуре
гепатоцитов. При данном токсическом воздействии печень является наиболее
чувствительным к повреждению органом, определяющим дальнейшую патологию
организма. В связи с этим профилактическое и лечебное применение АГ и, в
большей степени, нано-Se, улучшает морфофункциональное состояние печени.
Исследуемый нанокомпозитный препарат не вызывает значительных
изменений в ткани печени. Дистрофические процессы в гепатоцитах отсутствуют
уже на 14 день эксперимента. Происходит восстановление архитектоники.
Как уже было сказано выше, при некоторых заболеваниях вирусной и
бактериальной природы в печени обнаруживают бинуклеарные и многоядерные
гепатоциты (Lefkowitch J.H. Non-A, non-B hepatitis: characterization of liver biopsy
pathology // J. Clin. Gastroenterol. 1989. Vol.11. № 2. P.225–232; Changes to
hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis /
Toyoda H. [et al.] // Gut. 2005. Vol.54, № 2. P.297–302), что так же может быть
обусловлено действием токсического вещества (Lythrum hyssopifolia (lesser
loosestrife) poisoning of sheep in Victoria / Lancaster M.J. [et al.] // Aust. Vet. J. 2009.
Vol.87. № 12. P.476–479), индуцировано влиянием некоторых гормонов (Tongiani
R., Paolicchi A., Chieli E. Cytological and quantitative cytochemical changes in the
hepatocyte population of newborn rats following hydrocortisone administration // Acta.
Histochem. 1987. Vol.82, № 2. P.137–148), при старении организма (Schmucker D.L.
Hepatocyte fine structure during maturation and senescence // J. Electron Microsc.
Tech. 1990. Vol.14, №2. P.106–125). Однако образование двуядерных гепатоцитов
может быть обусловлено с участием данных клеток в процессах регенерации
(Влияние
сукцинатсодержащих
препаратов
на
процессы
репаративной
89
регенерации печени в эксперименте / Д. С. Суханов [и др.] // Хирургия. Журнал
им. Н. И. Пирогова. 2011. №1. С.56–60; Aurora-A overexpression in mouse liver
causes p53-dependent premitotic arrest during liver regeneration / Li C.C. [et al.] // Mol.
Cancer Res. 2009. Vol.7. №5. P. 678–688).
При морфометрическом анализе ткани печени (Таблица 8) установили, что
внутриклеточные регенерации изменяются в течение всего периода исследования.
В опытной группе нано-Se количество двуядерных гепатоцитов увеличено на 3,1
% по сравнению с интактными животными, в то время как в группе АГ – снижено
на 9,4%, CCL4 - снижено на 15,6%.
Таблица 8 - Количество гепатоцитов в 1 поле зрения, 14 сутки
эксперимента (среднее значение 40 полей зрения)
Группа животных
Количество
двуядерных Количество гепатоцитов в
гепатоцитов в 1 поле зрения
1 поле зрения
интактные
1,60±0,11
109,19±0,57
CCL4
1,35±0,21
64,28±2,17
АГ
1,45±0,17
116,75±2,12
Нано-Se
1,65±0,19
119,15±3,82
Таким образом, у крыс, получавших нанокомпозитный препарат, быстрее
восстанавливалась балочная структура печени. Об этом свидетельствует
количество гепатоцитов в одном поле зрения.
При анализе морфометрической характеристики ткани печени установлено,
что ее восстановление у контрольных животных регистрируется уже на первом
сроке исследования (7-е сутки), причем степень выраженности внутриклеточных
регенераторных реакций меняется в течение всего периода наблюдения. Так, на
первом сроке наблюдения отмечено увеличение количества гепатоцитов с
наличием двух ядрышек (в 1,4 раза, р<0,02) по сравнению с показателями у
интактных животных. На 14 день эксперимента в печени контрольной группы
90
животных повышается и относительное количество двуядерных гепатоцитов в
3,1раза (р<0,05).
91
ГЛАВА III
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В экспериментальных исследованиях показано, что селен в наноразмерном
состоянии оказывает антиоксидантную, иммунологическую, противоопухолевую
активность, причем токсичность селена значительно снижается за счет изменения
размера молекулы элементного селена (Пат. 2392944 Российская федерация. МПК
А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02. Препарат для лечения и профилактики
нарушения обмена селена для сельскохозяйственных животных / Оробец В.А.,
Серов А.В., Беляев В.А., Киреев И.В., Мирошниченко М.В.; заявитель и
патентообладатель
ФГОУ
ВПО
Ставропольский
гос.
агр.
ун-т.
–
№
2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл. 27.06.2010, Бюл. № 18. – 10 с; Biological
effects of nano red elemental selenium / Zhang J.-S. [et al.]. 2001. P.27–38; Pat. CN
102895258 A, МПК A61P 35/00, A61K 9/00, A61K 31/715, a61K 33/04. Pleurotus
tuber-regium polysaccharide functionalized nanometer selenium hydrosol having antitumor activity and preparation method thereof / 陈填烽, 黄家兴, 吴华莲, 郑文杰,
黄文健, 文咏贤 ; applicant and patentee 香港理工大学. – № CN 201110208539;
declared 25.07.2011; published 30.01.2013. 13 с).
Существует вероятность, что позитивный эффект применения селена в
наноразмерном состоянии зависит и от матрицы, на которой он был синтезирован
и стабилизирован, так как матрица сама по себе обладает специфическим
действием.
В нашей работе мы показали в исследованиях in vitro, что используемая
арабиногалактановая
матрица-носитель
сама
по
себе
не
обладает
антирадикальным действием (Рисунок 3; таблица 2), как это указано в работах
(Гуцол Л.О. Патогенетическое обоснование применения арабиногалактана для
коррекции нарушений в печени при интоксикациях фенилгидрозином и
этиленгликолем: дис. … канд. биол. наук: 14.00.16. Иркутск, 2006. 165 с; Ли О.Н.
92
Антиоксидантные свойства арабиногалактана в условиях холодового стресса: дис.
канд. мед. наук: 14.03.06. Владивосток, 2011. 130с). Возможно, антирадикальный
эффект проявляется за счет активации иммунной системы организма (Gardiner T.
Biological activity of eight known dietary monosaccharids required for glycoprotein
synthesis and cellular recognition processes: summary // GlycoScience & Nutrition.
2000. №1. P.1- 4), или за счет гепатозащитного действия, когда АГ связывается с
асиалогликопротеиновыми рецепторами гепатоцитов, тем самым предотвращая
взаимодействие клеток печени с вредоносным агентом, в результате чего не
повреждается мембрана клеток и значительно снижается образование продуктов
перекисного
окисления
липидов.
Наличие
механизма
«гликонаведения»
предотвращает потерю углеводных молекул через почки. Возможно, АГ за счет
решетчатой
структуры
обладает
сорбционными
свойствами
(Ли
О.Н.
Антиоксидантные свойства арабиногалактана в условиях холодового стресса: дис.
канд. мед. наук: 14.03.06. Владивосток, 2011. 130с). Вредоносный агент попадает
в решетчатую структуру и уже не оказывает своего вредного действия, что также
снижает образование токсических продуктов перекисного окисления липидов.
В наших опытах in vitro антирадикальный эффект нанокомпозитного
препарата на основе АГ и селена в наноразмерном состоянии проявляется как раз
за счет наличия селена в препарате. Более того, диспергированные и
стабилизированные молекулы селена обладают антиоксидантным действием.
Об антиоксидантной активности селена сказано немало (Влияние селена на
процессы свободнорадикального окисления в регенерации кости после перелома /
М. В. Козлова [и др.] // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.
1997. №2. С.35–37; Ujang Tinggi. Selenium: it is role as antioxidant in human heath //
Enviromental Health and Preventive Medicine. 2008. Vol.13(2). P.102–108; The
selenium content of cell culture serum influences redox-regulated gene expression / T.
C. Karlenius [et al.] // Biotechniques. 2011. Vol50(5). P.295 – 301; Selenium
Compound Protects Corneal Epithelium against Oxidative Stress [Electronic resource] /
Akihiro
Higuchi
[et
al.]
Режим
доступа:
93
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3458096/). Селен является активным
центром глутионпероксидазы, что и обуславливает антирадикальное действие
(Антиоксидантная терапия в комплексном управлении сахарным диабетом / Н. А.
Черникова [и др.] // ConsiliumMedicum=Врачебный консилиум. 2010. Т.12, №12.
С.37–40). Так, например, в пубертатный период функиональное состояние
ферментного звена антиоксидантной защиты в значительной степени зависит от
алиментарного фактора, связанного с обеспеченностью селеном (Кравченко Ю.В.
Экспериментальное исследование системы антиоксидантной защиты на этапах
онтогенеза при токсическом и алиментарном воздействии: дисс. канд. биол. наук:
03.00.04. Москва, 2005. 162с).
Полученные нами данные в эксперименте in vitro дали возможность
провести сравнительный анализ результатов, полученных на животных. Но
прежде чем изучить действие препарата, нужно было смоделировать в организме
животных патологию с активацией ПОЛ. Для этого решено было в качестве
повреждающего агента использовать четыреххлористый углерод.
Действие тетрахлорметана на организм животных и человека по существу
является общеклеточным. Хотя основной токсический удар приходится на печень
и почки, в той или иной степени действию токсина подвержены все органы и
ткани. В них нарушается обмен веществ, окислительное фосфорилирование,
синтез белка.
Метаболические превращения ССl4 осуществляются в эндоплазматическом
ретикулуме гепатоцитов. На первом этапе происходит отщепление одного атома
хлора.
В
результате
происходит
образование
свободных
радикалов
и
аутокаталитическое перекисное окисление липидов, что приводит к нарушению
структуры и функции внутриклеточных мембран, микросом митохондрий и
лизосом с высвобождением активных ферментов и аутолизису клеток. При
токсическом
поражении
печени
тетрахлорметаном
АФК
связаны
с
преобразованием проницаемости митохондрий при апоптозе и некрозе клеток
(Шифф Юджин Р. Введение в гепатологию: пер. с англ.; под ред. В.Т. Ивашкина,
94
А.О. Буеверова, М.В. Маевской. М. 704с). Образование супероксидного иона
происходит
на
гладком
саркоплазматическом
ретикулуме
с
участием
микросомальных монооксигеназ. Реакция резко ускоряется с вовлечением в
процесс цитохромоксидазы Р-450. Результат – усиление ПОЛ. Активацию ПОЛ
определяют по уровню ДК и МДА (Клиническая токсикология детей и
подростков. под ред. И.В. Марковой, В.В. Афанасьева, Э.К. Цыбулькина. ч.2.
СПб.: «Интермедика», «Специальная литература», 1999. 616с).
Животным перорально задавали композитный препарат с содержанием
селена в наноразмерном состоянии (закономерности распространения селена по
тканям
одинаковы
при
любом
способе
введения)
(Георгиевский
В.И.
Минеральное питание животных. М. 1979. 471 с.). Нанокомпозитный препарат
селена достоверно снижает активацию ПОЛ. Снижение образование нетоксичных
ДК предупреждает образование токсичного МДА (1,950±0,092 и 2,290±1,6287
соответственно) уже на 7 день эксперимента по сравнению с другими опытными
группами, к 21 дню эксперимента количество ДК и МДА даже ниже, чем в группе
интактных животных (1, 257±0,062 и 1,938±0,247; 1,460±0,227 и 2,100±0,254 – ДК
и МДА в группе нано-Se и интактных животных соответственно).
Но мало говорить лишь только о ДК и МДА, поскольку ПОЛ – это сложная
система гомеостаза в организме, которая зависит от многих факторов: стресс,
кормление, содержание, у самок – беременность и др. (Стресс и его роль в
патологии / Г. Е. Григорьев [и др.] // Материалы научно-практической
конференции, посвященной 70-летию образования ИрГСХА, 3-6 февр. 2004 г.
Зооветеринарный факультет. 2004. С.48–54; Изучение состояния процесса
липопероксидации у женщин различных этнических групп с угрозой прерывания
беременности / Л. И. Колесникова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010.
№6 (76). С. 31–33; Оценка антиоксидантного статуса у женщин с эндокринным
бесплодием / Л. И. Колесникова [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней.
2010. Т.LIX, № 4. С.57–60; Перекисное окисление липидов и состояние эритрона
у новорожденных крысят в норме и при нарушении сенсорно-двигательных
95
рефлексов / Л. И. Колесникова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии
и медицины. 2013. Т.156, № 10. С.430–432; Окислительый стресс. Патологические
состояния и заболевания / Е. Б. Меньщикова [и др]. Новосибирск, 2008. 284 с).
Огромное значение имеет и обеспеченность организма животных витаминами, и
реактивность антиоксидантной защиты, которая представлена глутатионом и
СОД.
Содержание Дв.св в каждой из четырех исследуемых групп имеет
тенденцию к изменению: самая высокая величина измеряемого показателя
остается у интактных животных (1,613±0,248 усл.ед.), затем несколько снижается
в
группе
с нано-Se
(1,300±0,092
усл.ед.),
заметно
ниже
в
группе
с
арабиногалактаном (0,776 0,145 усл.ед.) и самый низкий показатель Дв.св. в
серии животных, которые получали чистый CCL4 (0,378±0,081 усл.ед.). Подобная
картина наблюдается и на 14 сутки эксперимента: в группе интактных животных
показатель Дв.св (1,430±0,081 усл.ед.), в группе с применением нано-Se –
1,560±0,144 усл.ед., АГ – 0,568±0,201 усл.ед., и наконец в контрольной группе с
CCL4 – 0,374±0,029 усл.ед.
В сыворотке крови определяли содержание продуктов ПОЛ и активность
ферментов АОЗ.
Количество ДК (мкМ/л) на 7 день эксперимента в группе нано-Se
достоверно уменьшалось по сравнению с группой CCL4 на 43,1%, по сравнению с
группой АГ уменьшалось на 15,2%, однако увеличилось на 47% по сравнению с
интактными животными. На 14 день эксперимента в опытной группе нано-Se
количество ДК (мкМ/л) уменьшилось ещё на 10,1% по сравнению с 7 днём
эксперимента (1,950±0,129 мкМ/л - 7 день против 1,753±0,259 мкМ/л - 14 день
эксперимента). И также оставалось низким по сравнению с группами АГ и ССL4
(2,616±0,280 и 3,631±0,385 мкМ/л соответственно). Однако содержание диеновых
конъюгатов всё так же оставалось ниже в группе интактных животных
(1,256±0,148 мкМ/л). И только лишь на 21 сутки эксперимента содержание ДК в
96
группе нано-Se достоверно не отличалось с содержанием ДК в группе интактных
животных (1,257±0,062 и 1,460±0,227 мкМ/л).
Уровень МДА в группе нано-Se увеличивался на 29,8% на 7 день
эксперимента, на 28,6% на 14 день эксперимента и снижался на 7,7% на 21 день
эксперимента по сравнению с группой интактных животных (2,290±0,287;
2,424±0,337 и 1,938±0,247мкМ/л против 1,763±0,229; 1,886±0,217 и 2,100±0,254
мкМ/л - нано-Se и АГ соответственно на 7, 14 и 21 день эксперимента). Однако
уровень МДА в группе с АГ во все дни эксперимента оставался выше, чем в
группе нано-Se и был в пределах 2,960±0,141 - 3,325±0,481 мкМ/л. Самый
высокий уровень данного показателя был в группе CCL4 (3,575±0,512; 3,204±0,404
и 4,092±0,393 мкМ/л).
Как показывают результаты наших исследований, концентрация первичных
продуктов ПОЛ при использовании нано-Se статистически значимо не отличается
от аналогичной в группе интактных животных (Рисунок 1).
Оценивая антиоксидантную активность выявили, что уровень АОА всегда
оставался на одном уровне в группе нано-Se и даже превышал таковой у
интактных животных, в то время как в группах с АГ и ССL4 значительно был
снижен во все дни эксперимента.
Таким
образом,
препарат
наноселена
во
все
сроки
эксперимента
предохраняет ненасыщенные структуры жирных кислот от окисления.
Жирорастворимые витамины (особенно А и Е) принимают активное участие
в защите клеточных мембран от повреждений. Так, содержание витамина Е в
сыворотке крови крыс после воздействия токсиканта и дачи АГ и нано-Se,
превышало содержание в сыворотке крови интактных крыс на 69,5% и 28,3%
соответственно. Проявляется синергизм действия селена и витамина Е. Через
неделю после отмены токсиканта и завершения дачи препаратов животным,
уровень витамина Е в группах АГ и нано-Se всё так же выше, чем у интактных
животных (на 35,4% и 12,3% соответственно). На 21 сутки эксперимента картина
содержания витамина изменяется: в группе АГ он остается на прежнем уровне, но
97
в группе нано-Se содержание витамина Е падает на 35,8% по сравнению с
интактными животными. Подобная картина наблюдается и при изучении
содержания витамина А в сыворотке крови животных всех опытных групп.
Мы связываем такую динамику содержания витамина Е с тем, что сам АГ
обладает собственными свойствами, как макромолекула, образуя устойчивые
комплексы с родственными компонентами клетками, и, как указывают некоторые
исследователи (Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана
лиственницы сибирской и его металлопроизводных / Дубровина В.И. [и др.].
145с.), проявляет пролонгированное действие.
Изменения в содержании СОД имеют явный характер на 7 день
эксперимента. Так при действии тетрахлорметана содержание СОД снижалось на
34,15%, в группе животных, которым давали чистый АГ – снижалось на 17,96%, а
в группе нано-Se снижалось на 1,038%. На 14 день эксперимента содержание
СОД в сыворотке крови интактных животных практически не изменился, также
остался
на
прежнем
уровне
ив
группе
АГ
(1,343±0,040
(усл.ед)
и
1,390±0,083(усл.ед) на 7 и 14 день соответственно), и увеличивается на 7,72% в
группе нано-Se по сравнению с интактными животными (1,730± 0,097(усл.ед) и
1,606± 0,118(усл.ед) соответственно).
На 21 день эксперимента содержание СОД в группах животных
«интактные», «АГ» и «нано-Se» остается практически на прежнем уровне, а в
группе CCL4, где содержание этого фермента всегда было ниже, начинает
увеличиваться и приближаться к показателям интактной группы.
СОД – относится к группе антиоксидантных ферментов и катализирует
дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода. Известно, что СОД
обладает
самой
(Супероксиддисмутаза
энциклопедия.
высокой
скоростью
[Электронный
–
ресурс]
каталитической
//
Режим
ВикипедиЯ:
реакции
Свободная
доступа:
http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D1%83%D0%BF%D0%B5%D1%80%D0%B
E%D0%BA%D1%81%D0%B8%D0%B4%D0%B4%D0%B8%D1%81%D0%BC%D1
98
%83%D1%82%D0%B0%D0%B7%D0%B0. – 19.03.2013.) и быстро разрушается.
Из экспериментов становится видно, что действие токсина истощает содержание
этого прооксиданта, а АГ и нано-Se, снижая образование ТБК-активных
продуктов, способствуют сохранению СОД в клетках.
На рисунке 5 показано развитие окислительного стресса, который мы также
измерили, используя показатель КОС (Пат. с. 2011617323 РФ. Программа для
расчета коэффициента окислительного стресса на основе параметров системы
перекисного окисления липидов - антиоксидантной защиты в крови / Л. И.
Колесникова, Л. А. Гребенкина, В. П. Олифиренко, Е. В. Осипова, М. И. Долгих,
Н. А. Курашова, М. А. Даренская ; заявитель и патентообладатель Учреждение
РАМН НЦ ПЗСРЧ СО РАМН. - № 2011615688 // Свидетельство о гос.
регистрации программы для ЭВМ. М., 2011. 1 с.). КОС свидетельствует о
защитном действии на организм нанокомпозитного препарата селена от
разрушающего действия оксидантов.
Поскольку
четыреххлористый
углерод
оказывает
свое
действие
преимущественно на печень и почки (Клиническая токсикология детей и
подростков. под ред. И. В. Марковой, В. В. Афанасьева, Э. К. Цыбулькина. ч.2.
СПб.: «Интермедика», «Специальная литература», 1999. 616с), а АГ может
использоваться для адресной доставки веществ к рецепторам гепатоцитов
(Arabinogalactan for hepatic drug delivery / Groman E.V. [et al.] // Bioconjugate Chem.
1994. Vol.5, № 6. Р.547–556), и селен в основном накапливается в тканях почек и
печени (Георгиевский В.И. Минеральное питание животных. М. 1979. 471 с.), то
изучая
патоморфологические
изменения
при
действии
экзотоксина
и
профилактическом использовании нанокомпозитного препарата селена, особое
внимание уделяли печени и почкам.
Обзорная микроскопия печени интактных крыс показала, что гепатоциты
располагаются радиально, двумя тяжами в печеночной балке. Между рядами
слепо начинаются и направляются к периферии желчные капилляры. Между
печеночными балками находятся синусоидные кровеносные капилляры, в
99
которых содержатся звездчатые макрофаги – клетки Купфера. Вокруг стенки
синусоида находится пространство Диссе. В печени содержатся двуядерные
гепатоциты, нередко – полиплоидные гепатоциты, поэтому размеры гепатоцитов
могут сильно различаться в зависимости от плоидности (Козлов Н.А., Яглов В.В.
Частная гистология домашних животных; под ред. В. В. Яглова. М. 169с;
Морфологические
реакции
внутренних
органов
беременных
крыс
на
парантеральное введение золотых наночастиц / Цыганова Н. А. [и др.] //
Фундаментальные исследования. 2013. №4-2. С.394-397). Регенерация печени
после некоторых заболеваний, например, инфаркт миокарда, происходит в
большей
степени
за
счет
гипертрофии
гепатоцитов,
чем
за
счет
их
полиплоидизации (Клеточные механизмы регенерации печени крыс после
экспериментального инфаркта миокарда / Е. В. Байдюк [и др.] // Цитология. –
2012. Т.54, № 12. С.873–882).
При
отравлении
животных
тетрахлорметаном
выявляют
умеренное
полнокровие, очаги некроза гепатоцитов в области центральных вен. Находят
разрушенные гепатоциты в состоянии паранекроза, и, как следствие усиленных
процессов регенерации – гипертрофированные гепатоциты с хорошо выраженным
ядром. Вокруг центральных вен находят капли липидов крупных, средних или
мелких размеров (Морфологические изменения печени при остром отравлении
этиловым и пропиловым спиртами, этиленгликолем и их смесью / В. В.
Бенеманский [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2008. №4(62). С.68-72).
Перечисленные изменения в морфологическом строении печени полностью
отражают картину воздействия тетрахлорметана на организм лабораторных крыс
и в наших исследованиях. Острое отравление животных четыреххлористым
углеродом привело к развитию центролобулярных некрозов с кровоизлияниями.
Некоторые авторы указывают на отсутствие застойного полнокровия в сосудах
(Там же), однако в наших опытах после воздействия CCL4 имеется полнокровие
сосудов (Рисунок 15 А).
100
Показательна морфологическая картина печени крыс при профилактической
даче нанокомпозитного препарата селена. Так на 7 день эксперимента в группе
нано-Se в печени отмечается средне- и мелкокапельная жировая инфильтрация
вокруг центральных вен (Рисунок 14б). Это означает, что все-таки повреждающее
действие тетрахлорметана неизбежно, однако, в сравнительной морфологии,
поражения не столь критичны, как, например, при действии только токсического
агента. Размер гепатоцитов практически соответствовал интактным животным.
Встречаются
лишь
отдельные
гепатоциты
в
состоянии
паранекроза
с
опустошенной цитоплазмой и гиперхромным пикнотичным ядром. Биллиарный
эпителий не был изменен, также не отмечено застойного полнокровия в
магистральных сосудах и капиллярах, что указывает на отсутствие отека. К 14
дню эксперимента печень полностью восстанавливается, в то время как в других
опытных группах только стартуют процессы регенерации.
Дисфункция
клеток
печени
подтверждается
и
гистохимическими
исследованиями. Выявленное скопление липидов в опытных группах было
подтверждено гистохимическим исследованием (Рисунок 16), как и полное
отсутствие образования липидов в клетках печени к 14 дню эксперимента при
даче препарата нано-Se.
Гибель паренхимы при хроническом гепатите высокой степени активности
проявляется некрозом клеток печени (Рисунок 15а). Скопление апоптичных и
атрофированных гепатоцитов с застоем в синусоидах также заметно снижалось
при коррекции поражения нанопрепаратом. Метаболическая гетерогенность,
которая наблюдается при зональных повреждениях печени при токсическом
воздействии углеводородов, была слабо выражена или вовсе не выражена после
дачи крысам нано-Se.
Изучение активности щелочной фосфатазы – важный критерий при
постановке диагноза и при коррекции лечения, поскольку ЩФ увеличивается при
наличии абсцессов в печени, либо при наличии камней в желчном пузыре
(Endotoxin- and ATP-neutralizing activity of alkaline phosphatase as a strategy to limit
101
neuroinflammation / Ruth Huizinga [et al.] // J. Neuroinflammation. 2012. №9. Р. 266).
Повышение уровня активности щелочной фосфотазы – показатель наличия
холестаза
(Ермолаева
Л.А.
Токсическое
действие
этопозида
на
морфофункциональное состояние печени крыс // Сибирский онкологический
журнал. 2007. №S2. С. 47). В нашем же случае повышение активности ЩФ в
группе животных, получавших токсин, связано с нарушением архитектуры ткани
печени. На 7 сутки эксперимента в группе CCL4 активность щелочной фосфатазы
увеличена как в желчных капиллярах, так и магистральных желчных протоках
(Рисунок 17а). В опытной группе активность ЩФ заметно снижена (Рисунок 17б),
на 14 день эксперимента она сохраняется, но в норму приходит не полностью.
Активность СДГ в наших опытах в опытной группе нано-Se сохранялась и
была подобна активности СДГ в печени интактных крыс. Снижение СДГ
указывает на стрессовое состояние в организме (Enzymes of energy metabolism in
brain and chronic stress / N. I. Koshoridze [et al.] // Journal of stress Phisiology &
Biochemistry. 2009. Vol.5. №1-2. Р.32–37). Активность сукцинатдегидрогеназы
заметно уменьшена группе ССL4 (Рисунок 19а), по сравнению с группой с
группой АГ (Рисунок 19б).
В сравнительном аспекте нано-Se оказал лучшее действие, чем АГ.
Анализируя данные исследований антиоксидантного действия, мы предполагаем,
что на первом этапе защитное действие оказывают два компонента исследуемого
препарата - высвободившийся из АГ-матрицы селен и сам АГ (Структура и
иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его
металлопроизводных / Дубровина В.И. [и др.]. 145 с.).
Как уже было сказано, после воздействия на организм животных
четыреххлористым
углеродом
образуется
большое
количество
ядовитых
продуктов метаболизма, которые выделяются почками. В основе поражения почек
лежит прямое нефротоксическое действие тетрахлорметана, еще большее продуктов его метаболизма.
102
Анализируя литературные данные и результаты собственных исследований,
можно сделать вывод, что нанокомпозитный препарат, защищая клетки печени от
воздействия четыреххлористого углерода, препятствует образованию токсических
продуктов ПОЛ, которые не действуют разрушающе на гепатоциты. Поскольку
токсических продуктов образуется меньше, почки, выводя конечные продукты
обменов ядовитых веществ, в меньшей степени подвергаются отрицательному
воздействию этих продуктов. Однако на основании наших экспериментах нельзя
говорить о непосредственном защитном действии нанокомпозитного препарата
селена на почки. В почках имеется воспалительный отек, но выражен он намного
слабее, чем если не использовать гепатопротекторный препарат.
Полученные нами данные при изучении острой токсичности препарата
нано-Se peros не повлияло на их общее состояние и не привело к гибели ни одной
мышки. В первый час после введения препарата два самца спрятались в угол
клетки и были неактивны, но активно отреагировали на дачу корма, после чего
вели себя как остальные животные. У животных отсутствовали симптомы острого
отравления: дефекация и мочеиспускание в норме, мыши были активны,
подвижны, с нормальной координацией движений, стандартной реакцией на
внешние раздражители, активно реагировали на дачу корма, имели хороший
внешний вид.
За срок наблюдения (14 дней) все животные опытной группы остались
живыми, поэтому определить LD50 не представилось возможным.
Согласно ГОСТу 12.1.007-76 (ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов
безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования
безопасности), нанокомпозитный препарат селена относится, как минимум, ко II
классу опасности (высокоопасные вещества), в то время, как селенит натрия – к I
классу опасности (чрезвычайно опасные вещества).
Полученные нами данные о токсичности препарата нано-селена, схожи с
данными отечественных и зарубежных ученых. И, как уже было указано выше,
при внутрибрюшинном введении препарата на основе нано-Se LD50 мышей
103
составляет 32,9±0,3 мг/кг. Для сравнения соответствующий показатель для
селенита натрия – 10 мг/кг (Новый биологически активный препарат на основе
наночастиц селена / Храмцов А.Г. [и др.] С.122-125); для азотсодержащего
полимера поливинилпирролидона LD50 – 25,38, а LD100 – 44,18; для желатина LD50
– 17,31, а LD100 – 36,15; для хитозана LD50 – 22,73, а LD100 – 39,93; токсичность
препарата сравнения - селенита натрия составила LD50 – 5,13, а LD100 – 9,23 (Пат.
2392944 Российская федерация. МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02.
Препарат для лечения и профилактики нарушения обмена селена для
сельскохозяйственных животных / Оробец В. А., Серов А. В., Беляев В. А.,
Киреев И. В., Мирошниченко М. В.; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО
Ставропольский гос. агр. ун-т. – № 2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл.
27.06.2010, Бюл. № 18. 10 с).
Китайские исследователи доказали, что LD50 для нано-Se (стабилизатор бычий сывороточный альбумин (БСА) составила 113,0 мг Se/кг, в то время, как
LD50 селенита натрия – 15,7 мг Se/кг (Zhang J. Elemental selenium at Nano Size
(Nano-Se) as a potential chemopreventive Agent with reduced risk of selenium toxicity:
comparison with Se-Methelselenocysteine in mice // Toxicological sciences. 2008. №
10 (1). P.22–30).
Таким
образом,
токсичность
селена
в
наноразмерном
состоянии
значительно снижена, причем значительную роль в этом играет природа матрицыносителя (Garnett M.C., Kallinteri P. Nanomedicines and nanotoxicology: some
physiological principles. P.307-311).
Полученные в ходе эксперимента результаты позволили разработать
концептуальную схему саногенетического эффекта нано- Se при токсическом
поражении печени животного (Рисунок 23).
CCL4
Нарушение окислительного
фосфорилирования
Нарушение белковообразовательной
функции
Нарушение фермента
моноаминооксидазы
Снижение уровня естественных антиоксидантов
Нано-Se мембранопр
отекторный
эффект
Образование свободных радикалов и усиление ПОЛ
Нано-Se –
антиоксидант
ный эффект
Нарушение структуры и проницаемости клеточных мембран,
высвобождение активных ферментов, аутолизис.
Токсический шок, поражение
нервной системы
Тромбозы, геморрагии в легких, в
органах брюшной полости.
Острая печеночная и почечная
недостаточность
Летальный исход
Рисунок 23 – Концептуальная схема саногенетического действия нанокомпозитного препарата селена при токсическом
поражении печени.
ВЫВОДЫ
1. В
исследованиях
in
vitro
показано,
что
нанокомпозитный
препарат
арабиногалактан + нано-селен обладает антирадикальным действием, причем
действие это выражено именно за счет наличия селена в препарате.
Антиоксидантная активность селена сохраняется при его диспергировании
(размер 1-100 нм) и хорошо выражена в нанокомпозитном препарате нано-Se
+ АГ.
2. Нанокомпозитный препарат селена в дозе 2 мг /100г массы животного не
оказывает
токсического
действия
на
организм.
Таким
образом,
диспергированные и стабилизированные арабиногалактановой матрицей
молекулы селена имеют меньшую токсичность по сравнению с элементным
селеном.
3. Полученный антиоксидантный эффект на организм животных сильнее
выражен в группе животных, получавших препарат АГ+нано-Se и связан
именно с наличием селена в препарате.
4. Оценка показателя коэффициента окислительного стресса подтверждает
защитное, антиоксидантное действие изучаемого препарата. КОС в группе
нано-Se на 21 день эксперимента 0,164±0,496, в то время как в группе
животных CCL4 этот показатель равен 87,807±28,8, в группе АГ – 7,312±1,721.
В группе интактных животных – 1,095±0,598 (р<0,05).
5. Нанокомпозитный препарат Sе в значительной степени снижает токсическое
воздействие CCL4 на печень, что проявляется в меньшей степени дегенерации
гепатоцитов, уменьшении жировой дистрофии и нормализации активности
ферментов в цитоплазме гепатоцитов. Количество двуядерных гепатоцитов
увеличивалось на 3,1% по сравнению с интактными животными, что
указывает на регенерацию ткани печени.
6. В восстановительном периоде (14 сутки после воздействия) морфологически
структура печени, а также метаболические процессы (активность СДГ, ЩФ,
106
содержание гликогена и общих
липидов) при введении
незначительной степени отличались от интактных животных.
нано-Se в
107
ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ
Результаты исследования являются доклиническим изучением нового
наноструктурированого
композитного
препарата
селена
и
могут
быть
использованы в следующих областях:
1. Полученные
результаты
исследований
можно
использовать
при
написании учебных пособий и монографий.
2. Предложенная
концептуальная
схема
является
доклиническим
обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного
препарата селена на организм животных.
3. В экспериментальной и ветеринарной практике для профилактики и
лечения редокс-зависимых заболеваний.
108
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АГ – арабиногалактан
АОА – антиоксидантная активность
АОЗ – антиоксидантная защита
АРА – антирадикальная активность
АФК – активные формы кислорода
Дв.св. – двойные связи
ДК – диеновые конъюгаты
КД и СТ – кетодиены и сопряженные триены
КОС – коэффициент окислительного стресса
МДА – малоновой диальдегид
НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
ПОЛ – перикисное окисление липидов
СОД – супероксиддисмутаза
СОР – супероксидный радикал
ТБК-АП – тиобарбитуровая кислота – активные продукты
ЯЦО – ядерно-цитоплазматическое отношение
GSH – восстановленный глутатион
GSSG – окисленный глутатион
109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Антиоксидантная терапия в комплексном управлении сахарным диабетом /
Н. А. Черникова [и др.] // ConsiliumMedicum=Врачебный консилиум. – 2010. – Т.
12, № 12. – С. 37–40.
2.
Балаболкин, М. И. Роль окислительного стресса в патогенезе диабетической
нейропатии и возможность его коррекции препаратами а-липоевой кислоты / М.
И. Балаболкин, В. М. Креминская, Е. М. Клебанова // Проблемы эндокринологии.
– 2005. – Т. 51, № 3. – С. 22–33.
3.
Бачко, С. С. Сравнительная биохимическая характеристика метаболических
свойств различных гепатопротектеров в условиях токсического поражения печени
: дис. … канд. мед. наук : 03.01.04 / Сергей Сергеевич Бачко. – Краснодар, 2011. –
170 с.
4.
Бенявский, М.В., Должников, А.А. Количественная патоморфология
гепатоцитов при циррозе печени / М.В. Бенявский, А.А. Должников // Вестник
ВолГМУ. – 2005. - №1(13). – С. 8-11.
5.
Болдырев, А. А. Биомембранология : учеб. пособие / А. А. Болдырев,
Кяйвяряйен Е. И., В. А. Илюха. – Петрозаводск : Изд-во Кар. НЦ РАН, 2006. – 226
с.
6.
Бурлакова, Е. Б. Перекисное окисление липидов мембран / Е. Б. Бурлакова,
Н. Г. Храпова // Успехи химии, 2004. – Т. 54. – C. 1540–1558.
7.
Ванько, Л. В. Значение оксидативного стресса в развитии осложнений
беременности и послеродового периода / Л. В. Ванько, В. Г. Сафронова, Н. К.
Матвеева // Акушерство и гинекология. – 2010. – № 2. – С. 7–11.
8.
Величковский, Б. Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и
долговременной адаптации организма к факторамокружающей среды / Б. Т.
Величковский // Вестн. РАМН. – 2001. – № 6. – С. 45–52.
9.
Ветеринарная токсикология с основами экологии : учеб. пособие / под ред.
М. Н. Аргунова. – СПб. : Лань, 2007. – 416 с.
110
10.
Владимиров Ю. А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю. А.
Владимиров, А. И. Арчаков. – М. : Наука, 2003. – С. 230–272.
11.
Владимиров, Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических
мембранах / Ю. А. Владимиров, В. И. Арчаков. – М. : Наука, 1972. – 252 с.
12.
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю. А.
Владимиров // Соровский образовательный журнал. – 2000. Т.6, №12. – С. 13 -19.
13.
Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А.
Владимиров // Вестн. РАМН. – 1998. – № 7. – С. 43–51.
14.
Влияние селена на процессы свободнорадикального окисления в регенерати
кости после перелома / М. В. Козлова [и др.] // Патологическая физиология и
экспериментальная терапия. – 1997. – № 2. – С. 35–37.
15.
Влияние сукцинатсодержащих препаратов на процессы репаративной
регенерации печени в эксперименте / Д. С. Суханов [и др.] // Хирургия. Журнал
им. Н. И. Пирогова. – 2011. – № 1. – С. 56–60.
16.
Воскресенский, О. Н. Перекиси липидов в живом организме / О. Н.
Воскресенский, А. П. Левицкий // Вопросы медицинской химии. – 2003. – Т. 16. –
№ 6. – С. 563–583.
17.
Гаврилов, В. Б. Анализ методов определения продуктов перекисного
окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой / В.
Б. Гаврилов, А. Р. Гаврилова, Л. М. Мажуль // Вопросы медицинской химии. –
1987. – № 1. – С. 118–122.
18.
Гаврилов,
В.
Б.
Спектрофотометрическое
определение
содержания
гидроперикисей липидов в плазме крови / В. Б. Гаврилов, М. И. Мишкорудная //
Лабораторное дело. – 1983. – № 3. – С. 33–36.
19.
Гарбузенко, Д. В. Механизмы компенсации структуры и функции печени
при ее повреждении и их практическое значение / Д. В. Гарбузенко // Российский
журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. –2008. – Т. 18, № 6. –
С. 14–21.
111
20.
Георгиевский, В. И., Минеральное питание животных / В. И. Георгиевский,
П. Н. Анненков, В. Т. Самохин. – М. : Колос, 1979. – 471 с.
21.
Герасимов, А. М. Противокислородная защита организма / А. М.
Герасимов, Н. В. Деленян, М. Т. Шаов. – М., 1998. – 187 с.
22.
Глутатионовая антиоксидантная система у больных сахарным диабетом / Л.
С. Колесниченко [и др.] // Сибирский медицинский журнал. – 2009. – № 1. – С.
31–33.
23.
Головин, Ю. И. Введение в нанотехнику / Ю. И. Головин. – М. :
Машиностроение, 2007. – 496 с.
24.
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные
вещества.
Классификация
и
общие
требования
безопасности.
–
М.
:
Стандартинформ, 2007. – 7 с.
25.
Гуцол, Л. О. Патогенетическое обоснование применения арабиногалактана
для коррекции нарушений в печени при интоксикациях фенилгидрозином и
этиленгликолем : дис. … канд. биол. наук : 14.00.16 / Людмила Олеговна Гуцол. –
Иркутск, 2006. – 165 с.
26.
Дубина, Е. Е. Некоторые особенности функционирования ферментной
антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е. Е. Дубина // Биохимия. –
2005. – Вып. 2. – С. 3–18.
27.
Дубинина, Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных
молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е. Е.
Дубинина // Вопросы медицинской химии. – 2001. – Т. 47, вып. 6. – С. 561–581.
28.
Дядик, В. П. Перикисное окисление липидов и их обмен при вирусном
гепатите / В. П. Дядик, В. И. Бычкова // Врачебное дело. – 1986. – № 11. – С. 114–
117.
29.
Ермолаева Л.А. Токсическое действие этопозида на морфофункциональное
состояние печени крыс / Л.А. Ермолаева // Сибирский онкологический журнал.
2007. №S2. С. 47.
112
30.
Жерновков, В.
Е.
Сравнительное
изучение
структурного
состояния
плазматических мембран головного мозга и печени мышей под действием
тиролиберина in vitro / В. Е. Жерноков, Н. П. Пальмина // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С.151–154.
31.
Зайцев, С. Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические
аспекты : учеб. / С. Ю. Зайцев, Ю. В. Конопатов. – СПб. : Лань, 2004. – 271–272 с.
32.
Зайцев, С. Ю. Супрамолекулярные наноразмерные системы на границе фаз:
Концепции и перспективы для бионанотехнологий / С. Ю. Зайцев. – М. :
ЛЕНАНД, 2010. – 208 с.
33.
Зайцев, С. Ю. Супрамолекулярные системы на границе раздела фаз как
модели биомембран и наноматериалы / С. Ю. Зайцев. – Донецк : М. - Донецк :
Норд Компьютер, 2006. – 189 с.
34.
Зайчик, А. Ш. Основы патохимии / А. Ш. Зайчик, Л. П. Чурилов. – Том 2. –
СПб. : Элби-СПб, 2001. – 688 с.
35.
Зенков,
Н.
К.
Окислительный
стресс:
Биохимический
и
патофизиологический аспекты / Н. К. Зенков, В. З. Ланкин, Е. Б. Меньшикова. –
М. : МАИК Наука, 2001. – 343 с.
36.
Зенков, Н. К. Окислительный стресс / Н. К. Зенков, В. З. Ланкин, Е. Б.
Меньщикова. – М. : Наука, 2004. – 343 с.
37.
Изучение состояния процесса липопероксидации у женщин различных
этнических групп с угрозой прерывания беременности / Л. И. Колесникова [и др.]
// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2010. – № 6 (76). – С. 31–33.
38.
Ильина, О. П. Этиопатогенетические аспекты течения эндемического зоба у
крупного рогатого скота : в 2 кн. / О. П. Ильина, Б. Я. Власов, Ю. А. Тарнуев. –
Иркутск : ИрГСХА, 2000. – Кн. 1. –102 с.
39.
Ильина, О. П. Этиопатогенетические аспекты течения эндемического зоба у
крупного рогатого скота : в 2 кн. / О. П. Ильина, Б. Я. Власов, Ю. А. Тарнуев. –
Иркутск : ИрГСХА, 2000. – Кн. 2. – 72 с.
113
40.
Калетина, Н. И. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ : учеб.
пособие / Н. И. Калетина. – М. : ГЭОТАР, 2008. – 101 с.
41.
Калинина, Е.В. Современные представления об антиоксидантной роли
глутатиона и глутатионзависимых ферментов / Е.В. Калинина [и др.] // Вестник
Российской АМН. – 2010. - №3. – С. 46-54.
42.
Кения, М. В. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном
стрессе / М. В. Кения, А. И. Лукаш, Е. П. Гуськов // Успехи современной
биологии. – 1993. – № 4. – С. 456–470.
43.
Киселев, С. О. Механизм действия ГБО на организм / С. О. Кисилев //
Гипербарическая физиология и медицина. – 2002. – № 2. – С. 3–7.
44.
Клебанов, Г. И. Оценка АОА плазмы крови с применением желточных
липопротеидов / Г. И. Клебанов, И. В. Бабенкова, Ю. О. Теселкин // Лабораторное
дело. – 1988. – № 5. – С. 59–60.
45.
Клеточные механизмы регенерации печени крыс после экспериментального
инфаркта миокарда / Е. В. Байдюк [и др.] // Цитология. – 2012. – Т. 54, № 12. –
С.873–882.
46.
Клиническая токсикология детей и подростков / под ред. И. В. Марковой, В.
В. Афанасьева, Э. К. Цыбулькина. – ч. 2. – СПб. : «Интермедика», «Специальная
литература», 1999. – 616 с.
47.
Козлов, Н. А. Частная гистология домашних животных / Н. А. Козлов, В. В.
Яглов ; под ред. В. В. Яглова. – М. : Зоомедлит, 2007. – 169 с.
48.
Кокуричев,
П.
И.
Патологическая
анатомия
сельскохозяйственных
животных : альбом / П. И. Кокуричев, Б. Г. Домнин, М. П. Кокуричева. – СПб. :
Агропромиздат. 1994. – 199 с.
49.
Колесникова, Л. И. Окислительный стресс при репродуктивных нарушениях
эндокринного генеза у женщин / Л. И. Колесникова, Е. В. Осипова, Л. А.
Гребенкина. – Новосибирск : Наука, 2011. – 116 с.
114
50.
Колесникова, Л. И. Роль процессов перекисного окисления липидов в
патогенезе осложнений беременности : автореф. дис. … д-ра мед. наук / Любовь
Ильинична Колесникова. – Иркутск, 1993. – 39 с.
51.
К оценке фармакологических свойств арабиногалактана / В. К. Колхир [и
др.] // Тез докл. III Росс. нац. конгресса «Человек и лекарство». М., 1996. С. 27.
52.
Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических
средств в клетки и их органеллы / Ткачук, В. А. и [др.] // Междунар. форум по
нанотехнологиям Rusnanotech-08: сб. тез. докл. – М., 2008. – С. 191.
53.
Корейцы сделали наноробота для борьбы с раком [Электронный ресурс] /
Режим доступа: http://www.nanonewsnet.ru/news/2014/koreitsy-sdelali-nanorobotadlya-borby-s-rakom . – 8.01.2014
54.
Корой, П. В. Система протеина С при хронических заболеваниях печени и
противовирусная терапия / П. В. Корой // Клиническая медицина 2008. – № 2. – С.
63–66.
55.
Кравченко,
Ю.
В.
Экспериментальное
исследование
системы
антиоксидантной защиты на этапах онтогенеза при токсическом и алиментарном
воздействии : диссер. … канд. биол. наук : 03.00.04 / Юлия Валериевна
Кравченко. – Москва, 2005. – 162 с.
56.
Кудрявцев, А. П. Токсическая дистрофия печени поросят / А. П. Кудрявцев.
– Иркутск : Изд-во Иркут. ун-та, 1984. – 260 с.
57.
Ламажапова, Г. П. Морфология органов иммуногенеза нерпы байкальской и
эксперементальная оценка эффективности её липидов при разных патологиях :
дис. … д-ра биол. наук : 06.02.01 / Галина Петровна Ламажапова. – Улан-Удэ,
2011. – 290 с.
58.
Ланкин, В. З. Моделирование каскада ферментных реакций в липосомах,
включающих свободнорадикальное окисление, восстановление и гидролиз
полиеновых ацилов фосфолипидов для исследования влияния этих процессов на
структурно-динамические параметры мембраны / В. З. Ланкин, А. К. Тихадзе, Ю.
Г. Осис // Биохимия. – 2002. – Т. 67, № 5. – С. 679–689.
115
59.
Лен, Ж.–М. Супрамолекулярная химия: Концепции и перспективы / Ж.–М.
Лен. – Новосибирск : Наука, 1998. – 334 с.
60.
Ли, О. Н. Антиоксидантные свойства арабиногалактана в условиях
холодового стресса : дис. … канд. мед. наук : 14.03.06 / Ольга Николоевна Ли. –
Владивосток, 2011. – 130 с.
61.
Линг, Г. Физическая теория живой клетки (незамеченная революция) / Г.
Линг. – СПб. : Наука, 2008. – 376 с.
62.
Медведева,
С.
А.
Арабиногалактан
лиственницы
–
перспективная
полимерная матрица для лекарственных средств / С. А. Медведева, Г. П.
Александрова, Л. А.
Грищенко // II Всероссийская конференция Химия и
технология растительных веществ, Казань, 24-27 июня 2002 г. – Казань, 2002. –
С. 101–102.
63.
Медицинские нанотехнологии. Перспективы использования фуллеренов в
терапии болезней органов дыхания / С. В. Ширинкин, Т. О. Волкова, Н. Н. Немова
; [отв. ред. докт. мед. наук, проф. М. В. Покровский]. – Петрозаводск : Карельский
научный центр РАН, 2009. – 183 с.
64.
Меньщикова, Е. Б. Свободнорадикальное окисление как универсальный
компенсаторно-приспособительный механизм / Е. Б. Меньщикова, Н. К. Зенков //
Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические
аспекты : материалы Всерос. конф., 4–6 нояб. 2002 г. – Новосибирск, 2002. – С.
304–305.
65.
Меркулов, Г. А. Курс патогистологической техники / Г. А. Меркулов. – Л. :
Медицина, 1969. – 424 с.
66.
Морфологические изменения печени при остром отравлении этиловым и
пропиловым спиртами, этиленгликолем и их смесью / В. В. Бенеманский [и др.] //
Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2008. - №4 (62). – С. 68-72.
67.
Морфологические реакции внутренних органов беременных крыс на
парантеральное введение золотых наночастиц / Цыганова Н. А. [и др.] //
Фундаментальные исследования. – 2013. – № 4-2. – С. 394-397.
116
68.
Многофункциональные
самоорганизующиеся
гибридные
нанобиокомпозиты на основе природных полимеров / Б. А. Трофимов [и др.]. Режим доступа: http://edu-cons.net/atlas_last/doc/302/1(2).pdf
69.
Наноразмерные пленки антител на основе полиэлектролитов для целей
высокочувствительной иммунодиагностики / Е. Г. Евтушенко [и др.] //
Российские нанотехнологии : электронный журнал. – 2007. – Т. 2, № 1-2. – С. 145153. – Режим доступа: http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405. –
11.02.2013.
70.
Нанотехнологии и наноматериалы в ветеринарии [Электронный ресурс] /
Министерство сельского хозяйства РФ. – М., 2011. – 15 с. –Электрон. версия
печат. публ. – Режим доступа: http://guv.tatarstan.ru/rus/file/pub/pub_95316.pdf . –
11.09.2013.
71.
Нанотехнологии. Азбука для всех / под. ред. Ю. Д. Третьякова. – М. :
Физматлит, 2008. – 368 с.
72.
Неалкогольная жировая болезнь печени: клиника, диагностика и лечение /
С. Н. Мехтиев [и др.] // Лечащий врач. – 2008. – № 2. – С.29–37.
73.
Новый биологически активный препарат на основе наночастиц селена / А.
Г. Храмцов [и др.] // Вестник Северо-Кавказского ГТУ. – 2010. – № 4 (25). – С.
122-125.
74.
Одновременное определение концентраций витаминов Е и А в сыворотке
крови / Р.Ч. Черняускене [и др.] // Лаб. дело. – 1984. – № 6. – С. 362–365.
75.
Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньщикова
[и др]. – М. : Слово, 2006. – 553 с.
76.
Окислительый стресс. Патологические состояния и заболевания / Е. Б.
Меньщикова [и др]. – Новосибирск, 2008. – 284 с.
77.
Олейников, В.А. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в
биологии и медицине / В. А. Олейников, А. В. Суханова, И. Р. Набиев //
Российские нанотехнологии : электронный журнал. – 2007. – Т. 2, № 1-2. – С. 160173. – http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405. – 11.02.2013.
117
78.
Осипов, О. А. Активные формы кислорода и их роль в организме / О. А.
Осипов, Ю. А. Азизова, Ю. А. Владимиров // Успехи соврем. биологии, 2003. – Т.
31. – C. 180–208.
79.
Оценка антиоксидантного статуса у женщин с эндокринным бесплодием /
Л. И. Колесникова [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Т.
LIX, № 4. – С. 57–60.
80.
Пат. 2485964 Российская федерация. МПК A61K35/20; A61K33/04;
A61P37/02; B82B1/00. Иммуностимулирующая композиция для животных /
Козлов С.В., Степанов В.С., Фомин А.С., Строгов В.В., Субботин А.М., Ларионов
С.В., Староверов С.А., Волков А.А.; заявители и патентообладатели – Староверов
С.А., Волков А.А. – 2012100596/15; заявл. 10.01.2012; опубл. 27.06.2013, бюл
№18. – 1 с.
81.
Пат. 2392944 Российская федерация. МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р
3/02. Препарат для лечения и профилактики нарушения обмена селена для
сельскохозяйственных животных / Оробец В. А., Серов А. В., Беляев В. А.,
Киреев И. В., Мирошниченко М. В. ; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО
Ставропольский гос. агр. ун-т. – № 2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл.
27.06.2010, Бюл. № 18. – 10 с.
82.
Пат.
с.
2011617323
РФ.
Программа
для
расчета
коэффициента
окислительного стресса на основе параметров системы перекисного окисления
липидов - антиоксидантной защиты в крови / Л. И. Колесникова, Л. А.
Гребенкина, В. П. Олифиренко, Е. В. Осипова, М. И. Долгих, Н. А. Курашова, М.
А. Даренская ; заявитель и патентообладатель Учреждение РАМН НЦ ПЗСРЧ СО
РАМН. - № 2011615688 // Свидетельство о гос. регистрации программы для ЭВМ.
– М., 2011. – 1 с.
83.
Перекисное окисление липидов и состояние антиоксидантной системы в
эритроцитах, больных раком почки / М. Н. Герасименко [и др.] // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 3. – С. 693.
118
84.
Перекисное окисление липидов и состояние эритрона у новорожденных
крысят в норме и при нарушении сенсорно-двигательных рефлексов / Л. И.
Колесникова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –
2013. – Т. 156, № 10 – С. 430–432.
85.
Петрович, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе
воспаления, ишемии и стресса / Ю. А. Петрович, Д. В. Гуткин // Патологическая
физиология и экспериментальная терапия. – 2005. – № 5. – С. 85–92.
86.
Подымова, С.Д. Болезни печени / С.Д. Подымова. – 3-е изд., руководство
для врачей. – М.: Медицина, 1998. – 703 с.
87.
Подымова С. Д. Болезни печени / С.Д. Подымова. - М. : Медицина, 1993.-
544 стр.
88.
Пономарев,
Б.Л.,
Петрова
Л.М.
Ядерно-цитоплазматические
взаимоотношения в паренхиматозных органах развивающегося плода человека /
Б.Л. Пономарев, Л.М. Петрова // Фундаментальные науки и практика. – 2010. – Т.
№1. – С. 108.
89.
Применение радикал катионов ABTS+ в оценке антирадикальной активности
флавоноидов / И. Р. Ильясов [и др.] // Фармация. – 2008. – № 6. – С. 15–18.
90.
Решетник, Л. А. Биогеохимическое и клиническое значение селена для
здоровья человека / Л. А. Решетник, Е. О. Парфенова // Сибирский медицинский
журнал. – 1999. – Т. 18, № 3. – С. 16–22.
91.
Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в
биомедицинских исследованиях / под ред. акад. РАРАН, члена-корр. РАМН Н. Н.
Каркищенко, акад. РАМН С. В. Грачева. – М. : Профиль–2С, 2010. – 358 с.
92.
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / под общ. ред. члена-корр. РАМН, проф. Р. У.
Хабриева. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 2005. – 832 с.
93.
Сазонтова, Т. Г. Адаптация к периодической гипоксии и диета с ПНЖК щ-
3-класса, обладающие кардиопротективным действием, повышают устойчивость
Са-транспорта
саркоплазматического
ретикулума
миокарда
к
119
свободнорадикальному окислению / Т. Г. Сазонова, Ю. В. Архипенко, Ф. З.
Меерсон // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1995. – № 7. –
С. 42–45.
94.
Сазонтова, Т. Г. Значение баланса прооксидантов и антиоксидантов –
равнозначных участников метаболизма / Т. Г. Сазонтова, Ю. В. Архипенко //
Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2007. – № 3. – С. 2–
18.
95.
Саяпина, И. Ю. Количественный анализ функциональной активности
семенника крыс при окислительном стрессе, индуцированном адаптацией к
низким температурам / И. Ю. Саяпина // Вестник новых медицинских технологий.
– 2011. – Т. 18, № 2. – С. 155–157.
96.
Свободнорадикальное окисление и старение / В. Х. Хавинсон [и др.]. – СПб.
: Наука, 2003. – 328 с.
97.
Сеземин,
И.
А.
Наноматериалы:
перспективы
антибактериального
применения в ветеринарии [Электронный ресурс] / И. А. Сеземин, М. Б. Лосев //
Ветеринарная медицина : сайт. – Режим доступа: http://veterinarua.ru/stati-iissledovaniya/1147-nanomaterialy-perspektivy-antibakterialnogo-primeneniya-vveterinarii.html. – 11.11.2013.
98.
Синдирева, А. В. Критерии и параметры действия микроэлементов в
системе почва-растение-животное : автореф. дис. … д-ра биолог. наук : 03.02.08 /
Анна Владимировна Синдирева. – Тюмень, 2012. – 35 с.
99.
Синтез наночастиц селена в водных растворах поливинилпирролидона и
морфологические характеристики образующихся нанокомпозитов / В. В.
Копейкин [и др.] // Высокомолекулярные соединения. Серия А. – 2003. – Т. 45, №
4. – С. 615–622.
100. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного
определения липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / И. А.
Волчегорский [и др.] // Вопросы медицинской химии. – 1989. – № 1. – С. 127–131.
120
101. Стаценко, Е. А. Окислительный стресс в дозировании физических нагрузок /
Е. А. Стаценко, Е. Л. Алькевич // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация. –
2009. – № 4. – С. 33–36.
102. Стресс и его роль в патологии / Г. Е. Григорьев [и др.] // Материалы научнопрактической конференции, посвященной 70-летию образования ИрГСХА, 3-6
февр. 2004 г. Зооветеринарный факультет. – 2004. – С. 48–54.
103. Структура
и
иммуномодулирующее
действие
арабиногалактана
лиственницы сибирской и его металлопроизводных / Дубровина В. И [и др.]. –
Иркутск, 2007. – 145 с.
104. Супероксиддисмутаза [Электронный ресурс] // ВикипедиЯ: Свободная
энциклопедия.
–
Режим
доступа:
http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D1%83%D0%BF%D0%B5%D1%80%D0%B
E%D0%BA%D1%81%D0%B8%D0%B4%D0%B4%D0%B8%D1%81%D0%BC%D1
%83%D1%82%D0%B0%D0%B7%D0%B0. – 19.03.2013.
105. Технология лекарственных форм : учеб. : в 2 т. / Т. С. Кондратьева [и др.] ;
под ред. Т. С. Кондратьевой. – М. : Медицина, 1991. – Т. 1. – 496 с.
106. Титов, В. Н. Основы патогенетической классификации форм артериальной
гипертонии / В. Н. Титов // Российский кардиологический журнал. – 2009. – № 2
(76). – С. 79–95.
107. Ткачук, В. А. Нанотехнологии в медицине: состояние и перспективы
[Электронный
ресурс]
/
В.А.
Ткачук.
–
Режим
доступа:
http://nano.msu.ru/files/basics/lecture_Tkachuk.pdf. – 14.11.2013.
108. Тырхеев, А. П. Общая рецептура и технология лекарственных форм : учеб.–
метод. пособие / А. П. Тырхеев. – Улан-Удэ : Изд-во БГСХА им. В. Р. Филиппова,
2008. – 68 с.
109. Учайкин В.Ф. Инфекционная гепатология : руководство для врачей / В.Ф.
Учайкин, Т.В. Чередниченко, А.В. Смирнов. - М. : ГЭОТАР-медиа, 2012. - 640 с.
110. Фельдман, Г.Л. Биоритмология / Г.Л. Фельдман. - Ростов-на-Дону: Изд-во
Рост, ин-та, 1982. - 80 с.
121
111. Хеннинг, А. Минеральные вещества, витамины, биостимуляторы в
кормлении сельскохозяйственных животных / А. Хеннинг ; пер. с нем. Н. С.
Гельман ; под ред. А. Л. Падучевой, Ю. И. Раецкой. – М. : Колос, 1976. – 158 с.
112. Хотимченко, М. Ю. Эффективность низкоэтерифицированного пектина при
токсическом поражении печени, вызванном введением свинца / М. Ю.
Хотимченко, Е. А. Коленченко // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 65–67.
113. Цитология: методические указания для самостоятельной работы студентов /
М.Ж. Хапажева, Ф.З. Гутова, Д.Д. Отарова. – Нальчик : Каб.-Балк. ун-т, 2008. –
26с.
114. Цыб,
А.Ф.
Лекарственные
и
радиофармацевтические
препараты,
создаваемые на основе наномолекулярных технологий // Международный форум
по нанотехнологиям Rusnanotech-08 : сб. тез. докл. – М., 2008. – С 193.
115. Чистяков, Ю. В. Основы бионеорганической химии / Ю. В. Чистяков. – М. :
КолосС, 2007. – 539 с.
116. Шабадаш, А. Л. Рациональная методика гистохимического обнаружения
гликогена и ее теоретическое обоснование / А.Л. Шабадаш // Изв. АН СССР. Сер.
Биол. — 1947. — №66. — С. 745–760.
117. Швец,
В.
И.
Перспективные
направления
создания
эффективных
лекарственных препаратов методами нанобиотехнологии // Междунар. Форум по
нанотехнологиям Rusnanotech-08 : сб. тез. докл. – М., 2008. –С. 195.
118. Шифф, Юджин Р. Введение в гепатологию : пер. с англ. / Юджин Р. Шифф,
Майкл Ф. Соррел, Уиллис С. Мэддрей ; под ред. В. Т. Ивашкина, А. О. Буеверова,
М. В. Маевской. – М. : ГЭОТАР–Медиа, 2011. – 704 с.
119. Юркевич,
лекарственных
А.М.,
и
Швец,
В.И.
биохимических
Пути
препаратов
создания
с
нового
поколения
использованием
лиганд-
рецепторных взаимодействий для активного мембранного транспорта / А.М.
Юркевич, В. И. Швец // Вестник РАМН. – 1999. - №3 – С. 3-8.
122
120. Antioxidant activity applying an improved abts radical cation decolorization
assay / R. Re [et al.] // Free Radical Biology & Medicine. – 1999. – Vol. 26, №. 9/10. –
P. 1231–1237.
121. Arabinogalactan for hepatic drug delivery / E. V. Groman [et al.] // Bioconjugate
Chem. – 1994. – Vol. 5, № 6. – Р. 547–556.
122. Aurora-A overexpression in mouse liver causes p53-dependent premitotic arrest
during liver regeneration / C.C. Li [et al.] // Mol. Cancer Res. – 2009. – Vol. 7. – № 5. –
P. 678–688.
123. Baughman, T. A. Elemental mercury spills / T. A. Baughman // Environmental
Health Perspectives. – 2006. – Vol. 114. – P. 147–152.
124. Betteridge, D. J. What is oxidative stress / D. J. Betteridge // Metabolism. – 2000.
– Vol. 49. – P. 1865–1874.
125. Bharаd Bushan. Springer Handbook of Nanotechnology / Bhard Bushan. – 2nd
edition. – Berlin : Heidelberg : N. Y. : Springer, 2007. – 1916 p.
126. Biological effects of nano red elemental selenium / J.-S. Zhang [et al.] //
BioFactors. – 2001. – Vol. 15. – P. 27–38.
127. Birringer, M. Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: structure-function
relation / M. Birringer, J. H. EyTina, B. A. Salvatore // Br. J. Cancer. – 2003. – Vol. 88.
– P. 1948-1955.
128. Celo, V. Abiotic methylation of mercury in the aquatic environment / V. Celo, D.
R. S. Lean, S. L. Scott // Science of the Total Environment. – 2006. – Vol. 368. – P.
126–137.
129. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic
viral hepatitis / H. Toyoda [et al.] // Gut. – 2005. – Vol. 54, № 2. – P. 297–302.
130. Chemical kinetics: Fundamentals and new developments / E.T. Denisov et al. –
Elsevier, 2003. – 547 p.
131. Chen, C. J. Risk of Hepatocellular Carcinoma Across a Biological Gradient of
Serum Hepatitis B Virus DNA Level / C. J. Chen, H. I. Yang, J. Su // JAMA. –2006. –
№ 295. – P.65–73.
123
132. Chen, R. Microdialysis sampling combined with electron spin resonance for
superoxide radical detection in microliter samples / R. Chen, J. T. Warden, J. A.
Stonken // Anal. Chem., 2004. – Vol. 76. – P. 4734–4740.
133. Clarkson, T. W. The toxicology of mercury-current exposures and clinical
manifestations / T. W. Clarkson, L. Magos, G. J. Myers // N Engl J Med. – 2003. – Vol.
349. – P. 1731–1737.
134. Claudio, N. Nanobiotechnology and Nanobiosciences / N. Claudio. – N. Y.
World Scientific Publishing Co., 2008. – 308 p.
135. Corazza, A. Mercury dosing solutions for fluorescent lamps / A. Corazza, C.
Boffito // Journal of Physics D-Applied Physics. – 2008. – Vol. 41. p.144007
136. Doerffel K. Statistics in Analytical Chemistry / K. Doerffel // Deut. Verlag
Grundstoffind., Leipzig, 1966.
137. Eckelman, M. J. Spatial Assessment of Net Mercury Emissions from the Use of
Fluorescent Bulbs / M. J. Eckelman, P. T. Anastas, J. B. Zimmerman // Environmental
Science & Technology. – 2008. – Vol. 42. – P. 8564–8570.
138. Ehud, G. Plently of Room for Biology at the Bottom. An Introduction to
Bionanotechnology / G. Ehud. – N. Y. : Work Scientific Publishing Co., 2007. – 200 p.
139. Endotoxin- and ATP-neutralizing activity of alkaline phosphatase as a strategy to
limit neuroinflammation / Ruth Huizinga [et al.] // J. Neuroinflammation. – 2012. – № 9
– Р. 266
140. Engelhaupt, E. Do compact fluorescent bulbs reduce mercury pollution? / E.
Engelhaupt // Environmental Science & Technology. – 2008. – Vol. 42. – P. 8176–
8176.
141. Enzymes of energy metabolism in brain and chronic stress / N. I. Koshoridze [et
al.] // Journal of stress Phisiology & Biochemistry. – 2009. – Vol. 5. – № 1-2. – Р. 32–
37.
142. Gardiner T. Biological activity of eight known dietary monosaccharids required
for glycoprotein synthesis and cellular recognition processes: summary / T. Gardiner //
GlycoScience & Nutrition. – 2000. – № 1. – P. 1- 4
124
143. Garnett, M. C. Nanomedicines and nanotoxicology: some physiological
principles / M. C. Garnett, P. Kallinteri // Occupatinal Medicine-Oxford. – 2006. – P.
307-311.
144. Gilbert, S. G. Neurobehavioral Effects of Developmental Methylmercury
Exposure / S. G. Gilbert, K. S. Grantwebster // Environmental Health Perspectives. –
1995. – Vol. 103. – P. 135–142.
145. Griffiths, C. A comparison of the monetized impact of IQ decrements from
mercury emissions / C. Griffiths, A. McGartland, M. Miller // Environ Health Perspect.
– 2007. – Vol. 115. – P. 841–847.
146. Gutteridge, J. M. C. Lipid peroxidation and antioxidation as biomarkers of tissues
damage / J. M. C. Gutteridge // Clinikal Chemistry. – 2005. – Vol. 41, № 12. – P. 1819–
1828.
147. Halliwell, B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease / B.
Halliwell, J. M. C Gutteridge // Biochem. – 2004. – Vol. 215. – P. 1–14.
148. Hissin, H. Y. Fluometric method for determination of oxidized and reduced
glutathione in tissues / H. Y. Hissin, R. Hilf // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 74, № 1. –
P. 214–226.
149. Jang, M. Characterization and recovery of mercury from spent fluorescent lamps /
M. Jang, S. M. Hong, J. K. Park // Waste Management. – 2005. – Vol. 25. – P. 5–14.
150. Johnson, N. C. Mercury vapor release from broken compact fluorescent lamps
and in situ capture by new nanomaterial sorbents / N. C. Johnson [et al.] //
Environmental Science & Technology. – 2008. – Vol. 42. – P. 5772–5778.
151. Kira, Y. Association of Cu-Zn-type superoxide dismutase with mitochondria and
peroxisomes / Y.Kira, E. F. Sato, M. Inoue // Arsh. Biochem. Biophys. – 2003. – Vol.
399. – P. 96–102.
152. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: role in neutrophil – mediated toxicity / S. J.
Klebanoff // Molecular Biologi and Infectious Diseases. – 2006. – Vol. 24. – P. 283–
289.
125
153. Kountouras, J. Apoptosis in hepatitis C / J. Kountouras, D. Chatzopoulos, C.
Zavos // J. Viral. Hepat. – 2003. – № 10. – P. 335–342.
154. Kubik, T. Nanotechnology on duty in medical applications / T. Kubik, K.
Bogunia-Kubik, M. Sugisaka // Current Pharmaceutical Biotechnology. – 2005. – V. 6.
- №1. – Р. 17 – 33.
155. Lefkowitch, J. H. Non-A, non-B hepatitis: characterization of liver biopsy
pathology / J. H. Lefkowitch, T. F. Apfelbaum // J. Clin. Gastroenterol. – 1989. – Vol.
11. – № 2. – P. 225–232.
156. Lythrum hyssopifolia (lesser loosestrife) poisoning of sheep in Victoria / M. J.
Lancaster [et al.] // Aust. Vet. J. – 2009. – Vol. 87. – № 12. – P. 476–479.
157. Michiels, C. Cytotoxicity of linoleic acid peroxide, malondialdehyde and 4hydroxynonenal towards human fibroblast / C. Michiels, J. Remacle // Toxicology,
2004. – Vol. 66. – № 2. – P. 225–234.
158. Misra, H. P. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a
simple assay for superoxide dismutase / H. P. Misra, I. Fridovich // J. Biol. Chem. –
1972. – Vol. 247. – P. 3170–3175.
159. Niemeyer C.M. Nanoparticles, proteins and nucleic acids: Biotechnology meets
materials science / C. M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Edn. Eng. – 2001. – Vol. 40. –
P. 4128 - 4158.
160. Niemeyer, C. M. Nanobiotechnology : Concepts, Applications and Perspectives /
C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin. – Wiley-VCH, 2004. – 491 p.
161. Okado-Matsumoto, A. Subcellular distribution of superoxide dismutases in rat
liver: Cu, Zn-SOD in mitochondria / A. Okado-Matsumoto, I. Fridovich // J. Biol.
Chem., 2003. – Vol. 276. – P. 38–39.
162. Pat. CN 102895258 A, МПК A61P 35/00, A61K 9/00, A61K 31/715, a61K
33/04. Pleurotus tuber-regium polysaccharide functionalized nanometer selenium
hydrosol having anti-tumor activity and preparation method thereof / 陈填烽, 黄家兴,
126
吴华莲, 郑文杰, 黄文健, 文咏贤 ; applicant and patentee 香港理工大学. – № CN
201110208539 ; declared 25.07.2011 ; published 30.01.2013. – 13 с.
163. Powers, S. K. Influence of exercise and fiber type on antioxidant enzyme activity
in rat skeletal muscle / S. K. Powers, D. Criswell, J. Lawler // Amer. J. Physiol. – 1994.
– Vol. 266. – P. 375–380.
164. Psychological effects of low exposure to mercury vapor: application of a
computer-administered neurobehavioral evaluation system / Y. X. Liang [et al.] //
Environ Res. – 1993. – Vol. 60. – P. 320–327.
165. Ralston, N. Nanomaterials: Nano-selenium captures mercury / N. Ralston //
Nature Nanotechnology. – 2003. – Vol. 3. – P. 527–528.
166. Raposo, C. Mercury speciation in fluorescent lamps by thermal release analysis /
C. Raposo, C. C. Windmoller, W. A. D. Junior // Waste Management. – 2003. – Vol.
23. – P. 879–886.
167. Reduction of mercury loss in fluorescent lamps coated with thin metaloxide films
/ V. D. Hildenbrand [et al.] // Journal of the Electrochemical Society. – 2003. – Vol.
150. – P. H147–H155.
168. S-adenosylmethionine (SAMe) attenuates acetaminophen hepatotoxicity in
C57BL/6 mice / M. Valentovic [et al.] // Toxicol. Lett. – 2004. – № 154. – P. 165–174.
169. Schmucker, D. L. Hepatocyte fine structure during maturation and senescence /
D. L. Schmucker // J. Electron Microsc. Tech. – 1990. – Vol. 14, № 2. – P. 106–125.
170. Selenium Compound Protects Corneal Epithelium against Oxidative Stress
[Electronic resource] / Akihiro Higuchi [et al.] // PLoS One. – 2012. – Vol 7(9). –
e45612. – Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3458096/. –
19.10.2013.
171. Sies, H. Оxidative Stress: Oxidants and antioxidants / H. Sies // Academic Press,
London. – 1991. – P. 15–22.
172. Spasic, M. B. Effect of term exposure to cold on the antioxidant defense system
in the rat / M. B. Spasic, Z. S. Spasic, B. Buzadzic // Free Rad. Biol. Med. – 1993. – №
3. – P. 291–299.
127
173. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist / A. Pompella [et al.] //
Biochem. Phermacol. – 2003. – Vol. 66. – P. 1499–1503.
174. The selenium content of cell culture serum influences redox-regulated gene
expression / T. C. Karlenius [et al.] // Biotechniques. – 2011. – Vol 50(5). – P. 295 –
301.
175. Tongiani, R. Cytological and quantitative cytochemical changes in the hepatocyte
population of newborn rats following hydrocortisone administration / R. Tongiani, A.
Paolicchi, E. Chieli // Acta. Histochem. – 1987. – Vol. 82, № 2. – P. 137–148.
176. Torchilin, V. Nanoparticulates as Drug Carriers / V. Torchilin. – N. Y. : World
Scientific Publishing Co., 2006. – 756 p.
177. Tran, P. A. Differential effects of nanoselenium doping on healthy and cancerous
osteoblasts in coculture on titanium / P. A. Tran, L. Sarin, R. H. Hurt, T. J. Webster //
Int
J
Nanomedicine.
–
2010.
–
Режим
доступа:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Differential+effects+of+nanoselenium+do
ping+on+healthy+and+cancerous+osteoblasts+in+coculture+on+titanium.
178. Tunnessen, W. W. Acrodynia - Exposure to Mercury from Fluorescent LightBulbs / W. W.Tunnessen, K. J.Mcmahon, M. Baser // Pediatrics. – 1987. – Vol. 79. – P.
786–789.
179. Ujang Tinggi. Selenium: it is role as antioxidant in human heath / Ujang Tinggi //
Enviromental Health and Preventive Medicine. – 2008. – Vol. 13(2). – P. 102–108.
180. Zhang, J. Elemental selenium at Nano Size (Nano-Se) as a potential
chemopreventive Agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with SeMethelselenocysteine in mice / J. Zhang, X. Wang, Tongwen Xu // Toxicological
sciences. – 2008. – № 101 (1). – P. 22–30.
128
СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА
Рисунки:
1. Дифрактограмма полученных нанобиокомпозитов (стр. 25).
2. Реакции перекисного окисления липидов (Владимиров Ю.А. Свободные
радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51) (стр. 33).
3. Влияние концентрации антиоксиданта - нанокомпозита арабиногалактана с
Se на процент ингибирования ABTS˙+( r2 = 0,98) (стр. 53).
4. Изменение содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови (57).
5. КОС (*-р ≤0,05) (стр. 64).
6. Срез почки крысы. 7 день эксперимента. Группа CCL4. Стрелкой указано
расширение пространства между капсулой Шумлянского - Боумена и
сосудистым клубочком. Окр. гематоксилин с эозином. Ок.10, Об.40. (стр.
67-68).
6А. Срез почки крысы. 7 день эксперимента. Группа CCL4. стрелкой указан
слущенный эпителий. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 90. (стр. 68).
7. Сердечная мышца. 7 день эксперимента. Окр. гематоксилин с эозином. Ок.
10. Об. 40. (стр. 69).
8. Группа CCL4. Селезенка. 7 день эксперимента. Окр. гематоксилин с
эозином. Ок. 10. Об. 40. (стр. 70).
9. Группа CCL4. Легкие. 7 день эксперимента. Стрелками указано утолщение
межальвеолярных перегородок. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об.
40. (стр. 71).
10. Препарат головного мозга крысы 7 день эксперимента; а – CCL4; б –
опытная
группа
нано-Se.
Проявление
перицеллюлярного
(1)
и
периваскулярного (2) отека глии. Окр. гематоксилин с эозином, Ок.10, Об.
40. (стр. 72).
11. Препарат пищевода крысы 7 день эксперимента: группа нано-Se. 1неороговевающий эпителий, 2 – соединительнотканные клетки, 3 –
мышечная оболочка. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 20. (стр. 73).
129
12. Препарат тонкого кишечника крысы 7 день эксперимента: группа нано-Se.
1 – ворсинки тощей кишки; 2 – крипты; 3 – каемчатые клетки; 4 –
бокаловидные клетки; 5 – мышечный слой. Окр. гематоксилин с эозином.
Ок. 10. Об. 20. (стр. 74).
13. Препарат желудка крысы 7 день эксперимента: группа нано-Se. 1 –
цилиндрический железистый эпителий; 2 – желудочные ямки; 3 –
желудочные трубчатые железы; 3’ – дно желудочных желез; 4 – мышечная
оболочка. Окр. гематоксилин с эозином. Ок. 10. Об. 20. (стр. 75).
14. 7 день эксперимента. Группа CCL4. Почечный клубочек, стрелкой указан
распад
капиллярных
сегментов;
1
–
расширение
просвета.
Окр.
гематоксилин с эозином. Увеличение: ок. 10, об. 90. (стр. 76).
15. Почечный клубочек крысы. 7 день эксперимента. Группа нано-Se. 1 расширение пространства между боуменовой капсулой и сосудистым
клубочком. Окр. гематоксилин с эозином. Увеличение: ок 10, об. 90. (стр.
77).
16. Почечные клубочки крысы. 14 день эксперимента. Группа наноSe. 1 –
нормальное
морфологическое
строение
почечного
клубочка;
2
–
расширенное пространство. Окр. Гематоксилин с эозином. Увеличение: ок.
10, об. 90. (стр. 78).
17. печень крысы, 7 сутки эксперимента; а. - ССL4; б. – CCL4 + нано-Se.
Небольшое расширение синусоидов, отсутствует гемодинамическое
расстройство. В цитоплазме выявляются вакуоли (м.б. гидропическая
дистрофия). 1 – крупнокапельная жировая дистрофия; 2 – мелко- и
среднекапельная жировая дистрофия. Окр. Гематоксилин с эозином. Ок. 10,
Об. 40. (стр. 80).
18. Печень крысы, 14 сутки эксперимента; а. - ССL4; б. - CCL4 + нано-Se.
Окраска гематоксилин - эозином. Ок. 10, Об. 20 (а), 40 (б). (стр. 81).
130
19. Выраженное скопление липидов в области центральных вен (А – 7 сутки; Б
– 14 сутки). 1 – группа CCL4; 2 – опытная группа нано-Se. Окраска суданом
черным. Ок. 10. Об. 20. (стр. 83).
20. Определение активности ЩФ (А-7 сутки, Б – 14 сутки). 1 – CCL4; 2 – наноSe. Окр. методом азосочетания. Ок. 10. Об. 40. (стр. 84).
21. Гликоген. (А – 7 сутки, Б – 14 сутки). 1 – действие нано-Se; 2 – действие
арабиногалактана. Ок. 10. Об 40. (стр. 86).
22. определение СДГ по Нахласу. 1 - выраженное снижение активности
сукцинатдегидрогеназы в печени при воздействии CCL4. 2 – АГ. Ок. 10. Об
40. (стр. 87).
23. Концептуальная схема саногенетического действия нанокомпозитного
препарата селена при токсическом поражении печени (стр. 104)
Таблицы:
1. Дизайн эксперимента (стр. 46).
2. Xарактеристика антирадикальной активности исследуемых соединений для
их молярных концентраций (стр. 53-54).
3. Содержание субстратов, продуктов ПОЛ и общей АОА при затравке
экспериментальных животных четыреххлористым углеродом и выведения
их из опыта в разные сроки (М ± m) (стр. 54-55).
4. Содержание ретинола и α-токоферола при затравке экспериментальных
животных
четыреххлористым
углеродом,
коррекции
патологии
нанопрепаратом селена и выведения их из опыта в разные сроки, М ± m
(стр. 58).
5. Активность СОД и концентрация восстановленной и окисленной форм
глутатиона при затравке экспериментальных животных четыреххлористым
углеродом и выведения их из опыта в разные сроки, М ±m (стр. 60).
6. Коэффициент окислительного стресса (стр. 62-63).
7. Острая токсичность нано-Se и селенита натрия (стр. 65).
131
8. Количество гепатоцитов в 1 поле зрения, 14 сутки эксперимента (среднее
значение 40 полей зрения) (стр. 89).