ДИАГНОСТИКА СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ ПОДВОЙНЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ IN VITRO Е.И. Гогулинская, младший научный сотрудник, Н.Н. Зеленянская, канд. с.-х. наук, Л.В. Герус, канд. с.-х. наук, Национальный научный центр «Институт виноградарства и виноделия им. В.Е. Таирова», г. Одесса, Украина E-mail: elena.kov@bk.ru Приведены результаты исследований роста микроклонов подвойных сортов винограда, выращенных на питательной среде с активным кальцием. Показано, что в условиях засоления высота стебля и масса вегетативной части растений уменьшались, снижалось содержание пигментов в тканях листьев и изменялась флуоресценция хлорофилла. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об эффективности влияния засоления in vitro на микроклоны винограда и возможности диагностики устойчивости винограда к карбонатному хлорозу в условиях in vitro. Ключевые слова: виноград, культура тканей in vitro, микрочеренки, активный кальций, биометрические показатели, содержание пигментов, индукция флуоресценции хлорофилла. Почвенное засоление – стрессовый фактор среды, который приводит к ухудшению физиологического состояния неустойчивых растений и существенному снижению их продуктивности. Согласно литературным данным виноград лучше других плодовых культур приспосабливается к условиям засоления и сохраняет это свойство в следующих поколениях. Известно, что виноград может нормально расти и плодоносить на почвах, которые содержат не более 0,3-0,4% вредных солей (от сухого веса почвы). Наиболее существенно на виноград влияет засоление почвы карбонатом кальция. Под воздействием активного кальция у растений появляются признаки хлороза: нарушается образование хлорофилла в листьях и снижается активность фотосинтеза, угнетается развитие и плодоношение кустов [1, 2]. Определение устойчивости к засолению новых сортов винограда является одной из важных задач сортоиспытания. Согласно принятой методике выделенные формы винограда оценивают на устойчивость к карбонатам в течение нескольких лет, что предполагает определенные трудовые и материальные затраты – на выращивание саженцев, их высаживание на участке, уход, проведение ежегодных фенологических и агробиологических учетов и др. [3]. С помощью методов культуры тканей и органов in vitro можно провести исследования некоторых ценных показателей винограда, в том числе и солеустойчивости, после выделения элитных форм, еще в первый год их развития, до вступления в плодо- и лозоношение, что потребует намного меньше времени и материальных затрат. Солеустойчивость винограда в условиях культуры тканей in vitro начали исследовать в 70-х годах. Преимущественно искусственное засоление создавали путем внесения в питательную среду хлорида натрия [4, 5]. Для изучения устойчивости винограда к карбонатному хлорозу в питательной среде создавали дефицит железа и добавляли бикарбонаты калия и натрия [6]. В более поздних работах [7, 8] для засоления среды применяли те же стрессовые агенты, а исследования дополнили некоторыми физиологическими и биохимическими анализами. Полученные результаты подчеркивают целесообразность применения культуры in vitro для тестирования устойчивости винограда к карбонатному хлорозу, однако методики требуют доработки, поскольку не учитывают все факторы стрессового влияния на растения. Поэтому, целью нашей работы было создать условия засоления активным кальцием и оценить устойчивость микроклональных растений винограда в условиях in vitro. Материалы и методы исследований. Работу выполняли в отделе питомниководства и размножения винограда ННЦ «ИВиВ им. В.Е. Таирова». Исследования проводили на подвоях селекции ННЦ "ИВиВ им. В.Е. Таирова" Добрыня и Таировский 1. В полевых условиях сорт Добрыня выдерживает от 14 до 19% активного кальция, то есть является довольно устойчивым к карбонатному хлорозу; для перспективной подвойной формы Таировский 1 полевых данных устойчивости к карбонатам нет. Микроклоны винограда выращивали на питательной среде Мурасиге и Скуга по стандартной технологии. Одноглазковые микрочеренки высаживали на питательные среды с различным содержанием карбоната кальция CaCO3. Поскольку карбонат кальция практически нерастворим в воде, его действующая концентрация в среде культивирования была намного ниже внесенного количества. Содержание «активного кальция» в растворе определяли по адаптированной к нашим условиям методике Друино-Галле [9]. Было установлено, что доступными были 2,5-7,5% «активного кальция» (по шкале Галле). В контрольном варианте экспланты высаживали на стандартную питательную среду, без добавления CaCO3. В каждом варианте высаживали по 15 микрочеренков, исследования проводили в двух повторностях. Через 30 и 50 дней после высаживания эксплантов определяли агробиологические показатели роста микроклонов. Для оценки состояния фотосинтетического аппарата исследовали содержание пигментов в тканях листьев [10] и измеряли интенсивность флуоресценции хлорофилла листьев растений с помощью хронофлуориметра «Флоратест» [11]. Результаты. Одним из основных показателей, который показывает степень стрессового воздействия на растительный организм, является сила роста. Под влиянием засоления заметно снижается величина всех параметров, которые характеризуют процессы роста – высота растений, размеры отдельных органов и др. [12] В условиях культуры тканей in vitro определили, что условия засоления отрицательно влияли на приживаемость микрочеренков винограда. Так, на средах с активным кальцием этот показатель уменьшался уже на 5-7-й день после высаживания, тогда как у контрольных эксплантов уровень приживаемости оставался высоким (95-100%). В зависимости от уровня засоления приживалось 74-80% черенков сорта Добрыня и 80-90% черенков формы Таировский 1. На 10-й день количество жизнеспособных эксплантов на засоленных средах уменьшалось, наименьшим этот показатель был в варианте 7,5% CaCO3. Пролиферация почек начиналась на 5-7 день. Так, в контрольном варианте у 35-50% черенков наблюдали развитие боковых почек, на средах с активным кальцием этот показатель снижался - до 27-40% у формы Таировский 1 и до 9-30% у сорта Добрыня. На 10-й день у части эксплантов было отмечено появление корней, как в контрольном, так и опытных вариантах. Корнеобразование было заметно ниже только в варианте 7,5% CaCO3, а на среде с 5,0-6,3% CaCO3 корней образовывались даже больше, чем в контроле. Однако, на 15-20-й день у черенков на стрессовых средах было отмечено частичное повреждение листовых пластинок. Через 30 и 50 дней у сформированных растений измеряли высоту и массу прироста, подсчитывали количество листьев и корней. Полученные данные свидетельствуют, что микроклоны винограда формы Таировский 1 по сравнению с сортом Добрыня в целом имели более длинный стебель и большее количество листьев, однако масса вегетативной части и количество корней у них было меньшим, особенно в вариантах 5,0-7,5% CaCO3 (табл.). Через 50 дней отметили значительный прирост высоты стебля микроклонов как в контрольном (на 118,9% у сорта Добрыня и 78,9% у Таировского 1), так и у вариантах с 2,5-6,3% CaCO3. Масса побега растений на стрессовых средах уменьшалась с увеличением содержания активного кальция. Например, у микроклонов сорта Добрыня в варианте 5,0% CaCO3 масса прироста составляла 0,43 г, а в варианте 7,5% CaCO3 - 0,38 г, что на 23,2-33,9% меньше, чем в контроле. Масса побега у подвоя Таировский 1 на средах с активным кальцием снижалась еще больше - на 32,7-69,4% по сравнению с контролем. Таким образом, внесение соли CaCO3 в питательную среду приводило к удлинению стебля растений, в основном за счет увеличения длины междоузлий, кроме того такие растения имели меньшее количество листьев и корней. Рост биомассы зеленой части микроклонов значительно замедлялся, что может свидетельствовать об угнетении процессов биосинтеза в организме растений под влиянием избыточного количества кальция в среде. Согласно исследованиям многих ученых в условиях засоления у большинства культурных растений подавляется процесс фотосинтеза, снижается функциональная активность хлорофилла [2]. Например, у сильно пораженного карбонатным хлорозом винограда сорта Изабелла количество хлорофилла в листьях была в 3-4 раза ниже, чем у здоровых кустов [1]. Таблица Показатели роста микроклонов винограда на среде с активным кальцием (через 30 и 50 дней после высаживания) Высота растений, см Вариант через 30 дней через 50 дней Контроль 2,5% CaCO3 3,8% CaCO3 5,0% CaCO3 6,3% CaCO3 7,5% CaCO3 НСР 0,05 3,70 4,15 2,85* 2,43* 2,20* 1,90* 0,58 8,10 4,85* 6,50* 7,20 6,00* 5,40* 1,19 Контроль 2,5% CaCO3 3,8% CaCO3 5,0% CaCO3 6,3% CaCO3 7,5% CaCO3 НСР 0,05 4,08 5,00* 3,92 2,90* 2,56* 3,15* 0,54 Количество листьев, шт. Количество корней, шт. Масса побега через 50 дней, г через через 30 50 дней дней Добрыня через 30 дней через 50 дней 6,80 3,40 4,40* 3,85 4,60* 3,00 1,65* 5,75* 1,52* 3,78* 1,40* 1,75* 0,68 0,56 Таировский 1 7,30 6,88 4,15 8,08 5,48* 4,36 6,01* 2,80* 4,53* 5,65 2,50* 4,67* 5,63 2,82* 4,60* 4,67* 3,25* 4,30 0,80 1,03 0,83 4,20 2,45* 2,25* 2,65* 2,71* 2,40* 0,63 3,75 1,40* 2,40* 1,90* 1,85* 2,40* 0,56 0,56 0,46 0,52 0,43* 0,37* 0,38* 0,10 2,00 2,58* 1,83 2,10 2,28 1,35* 0,42 2,28 2,56 1,80 1,75 2,33 1,83 0,52 0,49 0,35* 0,49 0,33* 0,17* 0,15* 0,07 Примечание: * - достоверная разница с контролем. Согласно полученным данным количество хлорофиллов «а» и «b» и каротиноидов в листьях микроклонов, выращенных на средах с активным кальцием, было значительно ниже, чем у контрольных растений. Так, у подвоя Добрыня на 30-й день культивирования сумма хлорофиллов в тканях листьев уменьшалась на 41,9-71,3% (рис. 1), содержание каротиноидов соответственно на 24,0-66,0%. Через 50 дней у растений этого сорта было отмечено некоторое увеличение количества пигментов, однако эти значения были меньше, чем в контроле. У формы Таировский 1 разница между показателями контрольных и опытных вариантов была меньше, чем у сорта Добрыня. У растений на средах с активным кальцием содержание хлорофиллов «а» и «b» снижалось по сравнению с контролем на 38,7-52,3%, каротиноидов - на 32,9-51,9% (рис. 1). Однако, через 50 дней у растений Таировского 1, в отличие от Добрыни, зафиксировали значительное падение содержания пигментов в тканях листьев, в некоторых вариантах - более чем в два раза. Это показывает ухудшение состояния микроклонов в условиях засоления питательной среды активным кальцием, что подтверждается и показателями роста, в частности, меньшими значениями высоты стебля и биомассы прироста. Добрыня через 30 дней 7,5% CaCO3 6,3% CaCO3 5,0% CaCO3 3,8% CaCO3 2,5% CaCO3 Контроль 7,5% CaCO3 6,3% CaCO3 5,0% CaCO3 3,8% CaCO3 2,5% CaCO3 Контроль 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Таировский 1 через 50 дней Рисунок 1 – Сумма хлорофиллов а и b в тканях подвоев (мг/г сырого веса) после высаживания на среду с активным кальцием Во многих научных исследованиях показана тесная взаимосвязь индукционных процессов флуоресценции хлорофилла листьев с функционированием фотосинтетического апарата и физиологического состояния растений в целом [13, 14]. Условия засоления существенно влияют на флуоресценцию хлорофилла листьев растений и кинетику отдельных ее этапов, однако изменения не столь значительны, как, например, в случае стрессовых температур и обезвоживания. В основном наблюдают световой спад переменной флуоресценции хлорофилла и увеличение начальной скорости ее нарастания [14]. В ходе исследований отметили разницу между индукцией флуоресценции хлорофилла (ИФХ) листьев контрольных растений и растений, выращенных на засоленных средах, причем проявились и сортовые особенности подвоев (рис. 2). Определили, что у микроклонов винограда сорта Добрыня во всех опытных вариантах интенсивность флуоресценции была выше, чем в контроле. Добрыня 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 Таировский 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 Контроль 2,5% CaCO3 5,0% CaCO3 7,5% CaCO3 Рисунок 2 – График интенсивности флуоресценции хлорофилла листьев микроклонов подвоев винограда (отн. ед.), выращенных на питательных средах с активным кальцием Максимальные величины флуоресценции достигали 1,17831,2681 отн. ед. (для сравнения - в контроле максимум флуоресценции составил 1,1085 отн. ед.). Наиболее высокие значения были в вариантах 6,3-7,5% CaCO3. У подвоя Таировский 1 наибольший выход флуоресценции зафиксировали в контрольном варианте (Fmax = 1,2373 отн. ед.), у вариантах с активным кальцием графики ИФХ находились на более низком кинетическом уровне, чем в контроле (на 11,6-28,8%). Интенсивность флуоресценции контрольных растений подвоя Добрыня была ниже, чем в опытных. Для сорта Таировский 1 была характерной противоположная закономерность: все микроклоны, выращенные на среде с активным кальцием, имели меньшие максимальные показатели флуоресценции по сравнению с контролем, что вместе с уменьшением количества хлорофиллов свидетельствует об общем угнетении фотосинтетической активности растений под влиянием активного кальция. Таким образом, выращивание микроклонов винограда на среде с карбонатом кальция сопровождалось появлением у растений основных признаков хлороза - угнетением развития, уменьшением вегетативной массы и снижением содержания пигментов в тканях. Следует отметить, что у формы Таировский 1 признаки хлороза были выражены сильнее, чем у сорта Добрыня. Проведенные исследования свидетельствуют об эффективности влияния искусственного засоления на микроклоны винограда, а также о наличии сортоспецифической реакции растений на стресс и подтверждают целесообразность приема культивирования микрочеренков на среде с активным кальцием для оценки солеустойчивости винограда. На основании полученных результатов установлена возможность диагностики устойчивости винограда к карбонатному хлорозу в условиях in vitro. Список литературы 1. Мишуренко А.Г. Виноградный питомник / А.Г. Мишуренко.– [2-е изд.]. – М.: Колос, 1964. – 343 с. 2. Унгурян В.Г. Почва и виноград / В.Г. Унгурян. – Кишинев: Штиинца, 1979. – 212 с. 3. Методика государственного сортоиспытания плодовых, ягодных культур и винограда / Государственная комиссия по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур при Министерстве сельского хозяйства СССР. – М.: Изд-во Колос, 1961. – Вып. V. – 160 с. 4. Alexander Dmc.E. Effect of chloride in solution culture on growth and chloride uptake of Sultana and Salt Creek grape vines / Dmc.E. Alexander, J. Groot Obbink // Aust. J. Exp. Agric. Animal. Husb. – 1971. – Vol. 11. – Pp. 357-361. 5. Sivritepe M. Determination of salt tolerance in some grapevine cultivars (Vitis vinifera) under in vitro conditions / M. Sivritepe, A. Eris // Turkish J. Biol. - 1999. - Vol. 23. - Pp. 473-485. 6. Bavaresco L. Investigations on some physiological parameters involved in chlorosis occurrence in grafted grapevines / L. Bavaresco, М. Fregoni, Р. Fraschini // J. Plant Nutri. - 1992. – № 15. – Р. 17791807. 7. Tangolar S.G. Use of in vitro method to evaluate some grapevine varieties for tolerance and susceptibility to sodium bicarbonateinduced chlorosis / S.G. Tangolar, G. Ünlüb, S. Tangolarb et al. / In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. - 2008.- Vol. 44, Is. 3. - Рp. 233-237. 8. Wei L.C. In vitro cultured subclover root can develop Fe deficiency stress response / L.C. Wei, W.R. Ocumpaugh, R.H. Loeppert // Physiol Plant. – 1997. – Vol. 100. – Pp. 975-981. 9. Оценка пригодности почв под виноградниками (методические рекомендации) / [Яхонтов А.Ф., Скворцов А.Ф., Драган Н.А. и др.] – Симферополь: ВНИИВиПП «Магарач», УНИИВиВ им. В.Е. Таирова, 1990. – 42 с. 10. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений / Х.Н. Починок. – К. : Наукова думка, 1976. – 334 с. 11. Брайон О.В. Інструментальне вивчення фотосинтетичного апарату за допомогою індукції флуоресценції хлорофілу: методичні вказівки для студентів біологічного факультету / О.В. Брайон, Д.Ю Корнеев, О.О. Снегур, О.І. Китаєв. – К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2000. – 15 с. 12. Строгонов Б.П. Структура и функции клеток при засолении / Б.П. Строгонов, В.В. Кабанов, Н.И. Шевякова и др. — М.: Наука, 1970. — 318 с. 13. Рубин А.Б. Первичные процессы фотосинтеза / А.Б. Рубин // Соросовский образовательный журнал. – 1997. – № 10. – С. 14. Карапетян Н.В. Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель физиологического состояния растений / Н.В. Карапетян, Н.Г. Бухов // Физиология растений. – 1986. – Т. 33, № 5. – С. 1013-1026.