Е.И. Гогулинская, Н.Н. Зеленянская, Л.В. Герус

ДИАГНОСТИКА СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ ПОДВОЙНЫХ
СОРТОВ ВИНОГРАДА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ
КУЛЬТУРЫ ТКАНЕЙ IN VITRO
Е.И. Гогулинская, младший научный сотрудник,
Н.Н. Зеленянская, канд. с.-х. наук,
Л.В. Герус, канд. с.-х. наук,
Национальный научный центр «Институт виноградарства и
виноделия им. В.Е. Таирова», г. Одесса, Украина
E-mail: elena.kov@bk.ru
Приведены результаты исследований роста микроклонов подвойных
сортов винограда, выращенных на питательной среде с активным
кальцием. Показано, что в условиях засоления высота стебля и масса
вегетативной части растений уменьшались, снижалось содержание
пигментов в тканях листьев и изменялась флуоресценция хлорофилла.
Полученные
экспериментальные
данные
свидетельствуют
об
эффективности влияния засоления in vitro на микроклоны винограда и
возможности диагностики устойчивости винограда к карбонатному
хлорозу в условиях in vitro.
Ключевые слова: виноград, культура тканей in vitro,
микрочеренки, активный кальций, биометрические показатели,
содержание пигментов, индукция флуоресценции хлорофилла.
Почвенное засоление – стрессовый фактор среды, который
приводит
к
ухудшению
физиологического
состояния
неустойчивых растений и существенному снижению их
продуктивности. Согласно литературным данным виноград
лучше других плодовых культур приспосабливается к условиям
засоления и сохраняет это свойство в следующих поколениях.
Известно, что виноград может нормально расти и плодоносить на
почвах, которые содержат не более 0,3-0,4% вредных солей (от
сухого веса почвы). Наиболее существенно на виноград влияет
засоление почвы карбонатом кальция. Под воздействием
активного кальция у растений появляются признаки хлороза:
нарушается образование хлорофилла в листьях и снижается
активность фотосинтеза, угнетается развитие и плодоношение
кустов [1, 2].
Определение устойчивости к засолению новых сортов
винограда является одной из важных задач сортоиспытания.
Согласно принятой методике выделенные формы винограда
оценивают на устойчивость к карбонатам в течение нескольких
лет, что предполагает определенные трудовые и материальные
затраты – на выращивание саженцев, их высаживание на участке,
уход,
проведение
ежегодных
фенологических
и
агробиологических учетов и др. [3]. С помощью методов
культуры тканей и органов in vitro можно провести исследования
некоторых ценных показателей винограда, в том числе и
солеустойчивости, после выделения элитных форм, еще в первый
год их развития, до вступления в плодо- и лозоношение, что
потребует намного меньше времени и материальных затрат.
Солеустойчивость винограда в условиях культуры тканей in
vitro начали исследовать в 70-х годах. Преимущественно
искусственное засоление создавали путем внесения в
питательную среду хлорида натрия [4, 5]. Для изучения
устойчивости винограда к карбонатному хлорозу в питательной
среде создавали дефицит железа и добавляли бикарбонаты калия
и натрия [6]. В более поздних работах [7, 8] для засоления среды
применяли те же стрессовые агенты, а исследования дополнили
некоторыми физиологическими и биохимическими анализами.
Полученные
результаты
подчеркивают
целесообразность
применения культуры in vitro для тестирования устойчивости
винограда к карбонатному хлорозу, однако методики требуют
доработки, поскольку не учитывают все факторы стрессового
влияния на растения. Поэтому, целью нашей работы было создать
условия засоления активным кальцием и оценить устойчивость
микроклональных растений винограда в условиях in vitro.
Материалы и методы исследований. Работу выполняли в
отделе питомниководства и размножения винограда ННЦ «ИВиВ
им. В.Е. Таирова». Исследования проводили на подвоях селекции
ННЦ "ИВиВ им. В.Е. Таирова" Добрыня и Таировский 1. В
полевых условиях сорт Добрыня выдерживает от 14 до 19%
активного кальция, то есть является довольно устойчивым к
карбонатному хлорозу; для перспективной подвойной формы
Таировский 1 полевых данных устойчивости к карбонатам нет.
Микроклоны винограда выращивали на питательной среде
Мурасиге и Скуга по стандартной технологии. Одноглазковые
микрочеренки высаживали на питательные среды с различным
содержанием карбоната кальция CaCO3. Поскольку карбонат
кальция практически нерастворим в воде, его действующая
концентрация в среде культивирования была намного ниже
внесенного количества. Содержание «активного кальция» в
растворе определяли по адаптированной к нашим условиям
методике Друино-Галле [9]. Было установлено, что доступными
были 2,5-7,5% «активного кальция» (по шкале Галле). В
контрольном варианте экспланты высаживали на стандартную
питательную среду, без добавления CaCO3. В каждом варианте
высаживали по 15 микрочеренков, исследования проводили в
двух повторностях. Через 30 и 50 дней после высаживания
эксплантов определяли агробиологические показатели роста
микроклонов. Для оценки состояния фотосинтетического
аппарата исследовали содержание пигментов в тканях листьев
[10] и измеряли интенсивность флуоресценции хлорофилла
листьев растений с помощью хронофлуориметра «Флоратест»
[11].
Результаты. Одним из основных показателей, который
показывает степень стрессового воздействия на растительный
организм, является сила роста. Под влиянием засоления заметно
снижается величина всех параметров, которые характеризуют
процессы роста – высота растений, размеры отдельных органов и
др. [12]
В условиях культуры тканей in vitro определили, что
условия засоления отрицательно влияли на приживаемость
микрочеренков винограда. Так, на средах с активным кальцием
этот показатель уменьшался уже на 5-7-й день после
высаживания, тогда как у контрольных эксплантов уровень
приживаемости оставался высоким (95-100%). В зависимости от
уровня засоления приживалось 74-80% черенков сорта Добрыня
и 80-90% черенков формы Таировский 1. На 10-й день
количество жизнеспособных эксплантов на засоленных средах
уменьшалось, наименьшим этот показатель был в варианте 7,5%
CaCO3. Пролиферация почек начиналась на 5-7 день. Так, в
контрольном варианте у 35-50% черенков наблюдали развитие
боковых почек, на средах с активным кальцием этот показатель
снижался - до 27-40% у формы Таировский 1 и до 9-30% у сорта
Добрыня. На 10-й день у части эксплантов было отмечено
появление корней, как в контрольном, так и опытных вариантах.
Корнеобразование было заметно ниже только в варианте 7,5%
CaCO3, а на среде с 5,0-6,3% CaCO3 корней образовывались даже
больше, чем в контроле. Однако, на 15-20-й день у черенков на
стрессовых средах было отмечено частичное повреждение
листовых пластинок.
Через 30 и 50 дней у сформированных растений измеряли
высоту и массу прироста, подсчитывали количество листьев и
корней. Полученные данные свидетельствуют, что микроклоны
винограда формы Таировский 1 по сравнению с сортом Добрыня
в целом имели более длинный стебель и большее количество
листьев, однако масса вегетативной части и количество корней у
них было меньшим, особенно в вариантах 5,0-7,5% CaCO3 (табл.).
Через 50 дней отметили значительный прирост высоты стебля
микроклонов как в контрольном (на 118,9% у сорта Добрыня и
78,9% у Таировского 1), так и у вариантах с 2,5-6,3% CaCO3.
Масса побега растений на стрессовых средах уменьшалась с
увеличением содержания активного кальция. Например, у
микроклонов сорта Добрыня в варианте 5,0% CaCO3 масса
прироста составляла 0,43 г, а в варианте 7,5% CaCO3 - 0,38 г, что
на 23,2-33,9% меньше, чем в контроле. Масса побега у подвоя
Таировский 1 на средах с активным кальцием снижалась еще
больше - на 32,7-69,4% по сравнению с контролем. Таким
образом, внесение соли CaCO3 в питательную среду приводило к
удлинению стебля растений, в основном за счет увеличения
длины междоузлий, кроме того такие растения имели меньшее
количество листьев и корней. Рост биомассы зеленой части
микроклонов
значительно
замедлялся,
что
может
свидетельствовать об угнетении процессов биосинтеза в
организме растений под влиянием избыточного количества
кальция в среде.
Согласно исследованиям многих ученых в условиях
засоления у большинства культурных растений подавляется
процесс фотосинтеза, снижается функциональная активность
хлорофилла [2]. Например, у сильно пораженного карбонатным
хлорозом винограда сорта Изабелла количество хлорофилла в
листьях была в 3-4 раза ниже, чем у здоровых кустов [1].
Таблица
Показатели роста микроклонов винограда на среде с активным
кальцием (через 30 и 50 дней после высаживания)
Высота
растений, см
Вариант
через
30
дней
через
50
дней
Контроль
2,5% CaCO3
3,8% CaCO3
5,0% CaCO3
6,3% CaCO3
7,5% CaCO3
НСР 0,05
3,70
4,15
2,85*
2,43*
2,20*
1,90*
0,58
8,10
4,85*
6,50*
7,20
6,00*
5,40*
1,19
Контроль
2,5% CaCO3
3,8% CaCO3
5,0% CaCO3
6,3% CaCO3
7,5% CaCO3
НСР 0,05
4,08
5,00*
3,92
2,90*
2,56*
3,15*
0,54
Количество
листьев, шт.
Количество
корней, шт.
Масса
побега
через
50
дней, г
через через
30
50
дней
дней
Добрыня
через
30
дней
через
50
дней
6,80
3,40
4,40*
3,85
4,60*
3,00
1,65* 5,75*
1,52* 3,78*
1,40* 1,75*
0,68
0,56
Таировский 1
7,30
6,88
4,15
8,08
5,48*
4,36
6,01* 2,80* 4,53*
5,65
2,50* 4,67*
5,63
2,82* 4,60*
4,67*
3,25*
4,30
0,80
1,03
0,83
4,20
2,45*
2,25*
2,65*
2,71*
2,40*
0,63
3,75
1,40*
2,40*
1,90*
1,85*
2,40*
0,56
0,56
0,46
0,52
0,43*
0,37*
0,38*
0,10
2,00
2,58*
1,83
2,10
2,28
1,35*
0,42
2,28
2,56
1,80
1,75
2,33
1,83
0,52
0,49
0,35*
0,49
0,33*
0,17*
0,15*
0,07
Примечание: * - достоверная разница с контролем.
Согласно полученным данным количество хлорофиллов «а»
и «b» и каротиноидов в листьях микроклонов, выращенных на
средах с активным кальцием, было значительно ниже, чем у
контрольных растений. Так, у подвоя Добрыня на 30-й день
культивирования сумма хлорофиллов в тканях листьев
уменьшалась на 41,9-71,3% (рис. 1), содержание каротиноидов соответственно на 24,0-66,0%. Через 50 дней у растений этого
сорта было отмечено некоторое увеличение количества
пигментов, однако эти значения были меньше, чем в контроле.
У формы Таировский 1 разница между показателями
контрольных и опытных вариантов была меньше, чем у сорта
Добрыня. У растений на средах с активным кальцием содержание
хлорофиллов «а» и «b» снижалось по сравнению с контролем на
38,7-52,3%, каротиноидов - на 32,9-51,9% (рис. 1). Однако, через
50 дней у растений Таировского 1, в отличие от Добрыни,
зафиксировали значительное падение содержания пигментов в
тканях листьев, в некоторых вариантах - более чем в два раза. Это
показывает ухудшение состояния микроклонов в условиях
засоления питательной среды активным кальцием, что
подтверждается и показателями роста, в частности, меньшими
значениями высоты стебля и биомассы прироста.
Добрыня
через 30 дней
7,5% CaCO3
6,3% CaCO3
5,0% CaCO3
3,8% CaCO3
2,5% CaCO3
Контроль
7,5% CaCO3
6,3% CaCO3
5,0% CaCO3
3,8% CaCO3
2,5% CaCO3
Контроль
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Таировский 1
через 50 дней
Рисунок 1 – Сумма хлорофиллов а и b в тканях подвоев (мг/г
сырого веса) после высаживания на среду с активным кальцием
Во многих научных исследованиях показана тесная
взаимосвязь
индукционных
процессов
флуоресценции
хлорофилла листьев с функционированием фотосинтетического
апарата и физиологического состояния растений в целом [13, 14].
Условия засоления существенно влияют на флуоресценцию
хлорофилла листьев растений и кинетику отдельных ее этапов,
однако изменения не столь значительны, как, например, в случае
стрессовых температур и обезвоживания. В основном наблюдают
световой спад переменной флуоресценции хлорофилла и
увеличение начальной скорости ее нарастания [14].
В ходе исследований отметили разницу между индукцией
флуоресценции хлорофилла (ИФХ) листьев контрольных
растений и растений, выращенных на засоленных средах, причем
проявились и сортовые особенности подвоев (рис. 2).
Определили, что у микроклонов винограда сорта Добрыня во
всех опытных вариантах интенсивность флуоресценции была
выше, чем в контроле.
Добрыня
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
Таировский 1
6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86
Контроль
2,5% CaCO3
5,0% CaCO3
7,5% CaCO3
Рисунок 2 – График интенсивности флуоресценции хлорофилла
листьев микроклонов подвоев винограда (отн. ед.), выращенных
на питательных средах с активным кальцием
Максимальные величины флуоресценции достигали 1,17831,2681 отн. ед. (для сравнения - в контроле максимум
флуоресценции составил 1,1085 отн. ед.). Наиболее высокие
значения были в вариантах 6,3-7,5% CaCO3. У подвоя Таировский
1 наибольший выход флуоресценции зафиксировали в
контрольном варианте (Fmax = 1,2373 отн. ед.), у вариантах с
активным кальцием графики ИФХ находились на более низком
кинетическом уровне, чем в контроле (на 11,6-28,8%).
Интенсивность флуоресценции контрольных растений подвоя
Добрыня была ниже, чем в опытных. Для сорта Таировский 1
была характерной противоположная закономерность: все
микроклоны, выращенные на среде с активным кальцием, имели
меньшие максимальные показатели флуоресценции по
сравнению с контролем, что вместе с уменьшением количества
хлорофиллов
свидетельствует
об
общем
угнетении
фотосинтетической активности растений под влиянием активного
кальция.
Таким образом, выращивание микроклонов винограда на
среде с карбонатом кальция сопровождалось появлением у
растений основных признаков хлороза - угнетением развития,
уменьшением вегетативной массы и снижением содержания
пигментов в тканях. Следует отметить, что у формы Таировский
1 признаки хлороза были выражены сильнее, чем у сорта
Добрыня. Проведенные исследования свидетельствуют об
эффективности
влияния
искусственного
засоления
на
микроклоны винограда, а также о наличии сортоспецифической
реакции растений на стресс и подтверждают целесообразность
приема культивирования микрочеренков на среде с активным
кальцием для оценки солеустойчивости винограда. На основании
полученных результатов установлена возможность диагностики
устойчивости винограда к карбонатному хлорозу в условиях in
vitro.
Список литературы
1. Мишуренко
А.Г.
Виноградный
питомник
/ А.Г. Мишуренко.– [2-е изд.]. – М.: Колос, 1964. – 343 с.
2. Унгурян В.Г. Почва и виноград / В.Г. Унгурян. – Кишинев:
Штиинца, 1979. – 212 с.
3. Методика государственного сортоиспытания плодовых,
ягодных культур и винограда / Государственная комиссия по
сортоиспытанию
сельскохозяйственных
культур
при
Министерстве сельского хозяйства СССР. – М.: Изд-во Колос,
1961. – Вып. V. – 160 с.
4.
Alexander Dmc.E. Effect of chloride in solution culture on
growth and chloride uptake of Sultana and Salt Creek grape vines /
Dmc.E. Alexander, J. Groot Obbink // Aust. J. Exp. Agric. Animal.
Husb. – 1971. – Vol. 11. – Pp. 357-361.
5.
Sivritepe M. Determination of salt tolerance in some grapevine
cultivars (Vitis vinifera) under in vitro conditions / M. Sivritepe,
A. Eris // Turkish J. Biol. - 1999. - Vol. 23. - Pp. 473-485.
6. Bavaresco L. Investigations on some physiological parameters
involved in chlorosis occurrence in grafted grapevines / L. Bavaresco,
М. Fregoni, Р. Fraschini // J. Plant Nutri. - 1992. – № 15. – Р. 17791807.
7. Tangolar S.G. Use of in vitro method to evaluate some grapevine
varieties for tolerance and susceptibility to sodium bicarbonateinduced chlorosis / S.G. Tangolar, G. Ünlüb, S. Tangolarb et al. / In
Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. - 2008.- Vol. 44, Is.
3. - Рp. 233-237.
8. Wei L.C. In vitro cultured subclover root can develop Fe
deficiency stress response / L.C. Wei, W.R. Ocumpaugh,
R.H. Loeppert // Physiol Plant. – 1997. – Vol. 100. – Pp. 975-981.
9. Оценка
пригодности
почв
под
виноградниками
(методические рекомендации) / [Яхонтов А.Ф., Скворцов А.Ф.,
Драган Н.А. и др.] – Симферополь: ВНИИВиПП «Магарач»,
УНИИВиВ им. В.Е. Таирова, 1990. – 42 с.
10. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений
/ Х.Н. Починок. – К. : Наукова думка, 1976. – 334 с.
11. Брайон О.В. Інструментальне вивчення фотосинтетичного
апарату за допомогою індукції флуоресценції хлорофілу:
методичні вказівки для студентів біологічного факультету
/ О.В. Брайон, Д.Ю Корнеев, О.О. Снегур, О.І. Китаєв. – К.:
Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2000.
– 15 с.
12. Строгонов Б.П. Структура и функции клеток при засолении
/ Б.П. Строгонов, В.В. Кабанов, Н.И. Шевякова и др. — М.:
Наука, 1970. — 318 с.
13. Рубин А.Б. Первичные процессы фотосинтеза / А.Б. Рубин //
Соросовский образовательный журнал. – 1997. – № 10. – С.
14. Карапетян Н.В. Переменная флуоресценция хлорофилла как
показатель
физиологического
состояния
растений
/ Н.В. Карапетян, Н.Г. Бухов // Физиология растений. – 1986. – Т.
33, № 5. – С. 1013-1026.