Экстракт зеленого чая и его основной полифенол (-)-эпигаллокатехин галлат улучшают...
advertisement
Экстракт зеленого чая и его основной полифенол (-)-эпигаллокатехин галлат улучшают мышечную функцию у мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелой мышечной дистрофией, которая возникает у мальчиков (1:3500 новорожденных мальчиков). Заболевание характеризуется прогрессирующей атрофией мышц, начиная с раннего детства. Пациенты обычно умирают в возрасте 30, когда болезнь поражает сердечную и дыхательные мышцы. МДД возникает из-за мутации в гене дистрофина, что приводит к полному отсутствию соответствующего белка. Дистрофин -большой белок цитоскелета, расположенный на внутренней поверхности плазматической мембраны в обычных волокнах скелетных мышц. Он связывается как с ассоциированным с мембраной гликопротеиновым комплексом, так и F-актин сетью, позволяя образование непрерывности между внеклеточным пространством и внутриклеточным пространством мышечных клеток (для обзора см.. 6). Предполагается, что это обеспечивает защиту мышечных волокон от механического напряжения, вызванного сократительной активностью (32). Помимо устоявшейся структурной функции, недавно выяснилось, что дистрофин участвует не только в архитектуре мышечной клетки, но и сигнализации. Соответственно, дистрофические состояние связано с широким разнообразием клеточных нарушений, которые включают мембранную нестабильность, нарушение регуляции Ca2 + гомеостаза, повышенную восприимчивость к окислительному стрессу, повышение протеолитической активности, нарушение метаболизма энергии (6). В целом, эти вредные события приводят к гибели мышечных волокон, с последующей активацией процессов самовосстановления. Активированные клетки иммунной системы, в основном, макрофаги и лимфоциты, проникают в места некроза и непрерывно выпускают активные формы кислорода, что приводит к дальнейшему повреждению окружающей мышечной ткани (33, 38). В ходе дистрофических процессов регенеративная способность мышц истощается и приводит к замене функциональной мышечной массы фиброзной и жировой тканью. После идентификации и характеристики гена дистрофина почти 20 лет назад, значительные усилия сделаны, чтобы заменить или исправить мутировавший ген дистрофина с помощью гена или клеточной терапии (29). Однако эти подходы еще не привели к разработке терапии этого заболевания, в основном из-за вопросов, касающихся безопасности и ограничения векторов, ориентированных на все мышцы тела. До настоящего времени использовались только процедуры, которые улучшают продолжительность и качество жизни пациентов с МДД; они состоят из кинезитерапии, вентиляционной помощи и фармакологических вмешательств. В настоящее время единственным препаратом, предложенным для пациентов с МДД, являются глюкокортикоиды: преднизолон и дефлазакорт (25). Их действие на воспаление, экспрессия специфических для мышц генов, коррекция нарушениия регуляции Ca гомеостаза (22, 24), и активация кальциневрина / ядерного фактора активированных Т-клеток (NF-AT) пути (40) может объяснить их терапевтический эффект . Тем не менее, в некоторых случаях МДД пациенты, получавшие стероиды, могут страдать от побочных эффектов, присущих этому классу молекул. Кроме того, терапевтический эффект по улучшению продолжительности жизни и качества жизни пациентов с МДД не общепризнан (25). Таким образом, в настоящее время соединения, используемые в терапии, не удовлетворяют потребность. Следовательно, увеличение спектра препаратов для паллиативного лечения пациентов с МДД представляет серьезную проблему (15, 20). Текущие клинические испытания оценки потенциала различных соединений коррекции некоторых нарушений, упомянуты выше. Они включают иммуносупрессивные и противовоспалительные средства, такие как циклоспорин A (11) или пентоксифиллин (PTX) для блокирования проникновения активированных лимфоцитов, средства защиты митохондрий, чтобы предотвратить апоптоз, креатин улучшает баланс мышечной энергии и помогает правильной регуляции кальция (23, 31), или антиоксиданты, противодействующие окислительному повреждению (8, 15).Что касается антиоксидантной терапии, экстракт зеленого чая (ГТЕ) представляется перспективным кандидатом. Зеленый чай является первым напитком по потреблению во всем мире. Он очень популярен в Азии, где он был известен на протяжении веков как здоровый напиток. Зеленый чай был интенсивно изучен за последние 20 лет в связи со своими целебными свойствами (16, 27). Они включают его потенциал в качестве антиоксиданта (16, 28), противоопухолевые свойства (7), противовоспалительное (12), антибактериальное противовирусное (13) действие (4), антифиброзные (49), гиполипидемические (48), или кардиопротекторные свойства (34) . Кроме того, зеленый чай, как было показано, защишает мозг (17, 41) и сердце (3, 45) от повреждений при ишемии-реперфузии. Наконец, он модулирует клеточный поток Ca2 + (19). ГТЕ относится к горячей водорастворимой фракции листьев зеленого чая. Ее основными компонентами являются катехин полифенолы, но он также содержит теафлавин, витамины, аминокислоты, и кофеин. Среди полифенолов (-)эпигаллокатехин галлат (ЭГКГ) является наиболее распространенным, на него приходится 30-50% общих полифенолов, и известно, что он обуславливает наиболее полезные свойства, связанные с потреблением зеленого чая (7, 16, 46). Мы уже сообщали ранее (8), что ГТЕ снижает некроз в разгибателе пальцев (EDL) у мышей MDX, наиболее часто используемой животной модели МДД. В настоящем исследовании, дистрофические мыши штамма mdx5Cv (18) получили две дозы кофеина ГТЕ или дозу чистого ЭГКГ. С помощью гистологического исследования мышц ног и функциональной записи трицепса голени, мы обнаружили, что ЭГКГ ГТЕ защищают мышцы задних конечностей мышей от дистрофии и массивного некроза, и значительно улучшают мышечную силу и сопротивление усталости. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Тестируемые соединения и пищевые гранулы. Полифенолы без фракции кофеина, обогащенные ГТЕ (Sunphenon DCF-1) были своего рода подарком от Taiyo Kagaku (Yokkaichi, Япония). ГТЕ состояла из 90% полифенолов, и остаточного кофеина 0,07%. Исходя из общих полифенолов или общих катехинов, содержание ЭГКГ составило 34,7%, или на 47,8%, соответственно. ЭГКГ (чистота> 99,9%) был приобретен у Yixin (Чжэцзян, Китай). ГТЕ, ЭГКГ были включены в стандартную еду грызунов по-Kliba Nafag (Kaiseraugst, Швейцария). Рацион контрольной группы состоял из стандартной еды грызунов без добавления вещества. Животные и лечение. Исследование было проведено на мышах mdx5Cv (18) и соответствующих им генетически нормальным аналогам, C57BL/6J мышам. Дистрофические животные mdx5Cv были любезно предоставлены доктором Серж Браун (трансгенные, Страсбург, Франция) с согласия лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). C57BL/6J мышей изначально приобретены у Charles River (Iffa Credo, Франция). Колонии впоследствии жили в нашем виварии. Животных содержали в пластиковых клетках Поддерживался цикл 12:12 ч-свет-темнота, свободный доступ к пище и воде на протяжении всего исследования. Все процедуры, связанные с животными были проведены в соответствии с руководящими принципами швейцарского Федерального ветеринарного бюро, на основании Швейцарского федерального закона о защите животных, и были одобрены Кантональная ветеринарной службой. Группы были собраны из помета 3-WK-старых животных. В большинстве случаев два помета получили тот же рацион, что каждая группа, наконец, содержащихся 7-10 животных. Mdx5Cv мышей начинали кормить при отъеме на 1 - 5 неделе обычным кормом (именуемый как "необработанной" группа), или кормом содержащим ГТЕ (0,05% и 0,25% вес / вес) или ЭГКГ (0,1% вес / вес). На основании исследования Granchelli соавт. (15), ПTК (0,1% вес / вес) была выбрана в качестве положительного контроля. Группа нормальных C57BL/6J мышей, получавших контрольный корм была также включена для сравнения. Вес мышей и потребление пищи. Мышей взвешивают дважды в неделю. Потребление продуктов питания контролировали только для животных изучаемых с 5-недельного периода. Потребление пищи рассчитывают как массу потребляемых гранул на грамм веса тела в день. Расчет был основан на вес мыши в конце каждой недели лечения. Изометрическая сила. В конце периода лечения животных анестезировали путем инъекции смеси уретана (1,5 г / кг внутрибрюшинно) и диазепама (валиум, 5 мг / кг внутрибрюшинно). Ахиллово сухожилие правой задней конечности было выделено и связан с датчиком силы, соединенным с самописцом (тип WTR331). Коленный сустав был твердо обездвижен. Два стальных электрода были вставлены в трехглавую мышцу голени (включая быстрые волокна, гликолитических икроножной мышцы и подошвенной мышцы и медленные, окислительные камбаловидной мышцы). Прямоугольные импульсы, 0,5 мсек, были доставлены с помощью контроллера. Напряжение и длина мышцы были скорректированы для получения максимальной изометрической силы сокращений. Оптимальная длина мышцы была определена. Фазовое подергивание было записано и абсолютное напряжение пика подергивания (Pt), время до пика (ТТП), и время, в течение половины релаксации от пика (RT1 / 2) были измерены. После 3минутной паузы, мышцы были подвергнуты анализу тетанизации с использованием 200 мс всплесков увеличения частоты (от 20 до 100 Гц с шагом 10 Гц) каждые 30 с. Самый сильный ответ (обычно получается в 90 или 100 Гц) был принят в качестве абсолютного оптимального тетанического напряжения (Ро). Максимальную напряженность обычно получают в течение первых пяти стимуляций. Амплитуда отклика затем уменьшается, по мере чего стимулы были повторены. Остаточная тетаническая напряженность выражается в процентах от максимального ответа. Абсолютное фазовое и тетаническое напряжение (в мН) были преобразованы в конкретные напряженности (в мН на мм2) после нормализации на общую площадь поперечного сечения мышц(CSA). CSA (в мм2) определяли путем деления массы трехглавой мышцы голени (в мг) на произведение оптимальной длины мышцы (в мм) и плотности скелетных мышцах млекопитающих (г = 1,06 мг · мм-3) . Ткани и плазма. Трицепс голени был тщательно расчленен и взвешен для расчета CSA. Камбаловидная и EDL с левой стороны, нестимулированные мышцы иссекали и замораживали в изопентане охлажденном жидким азотом. Блоки хранили при -80 ° C до обработки для гистологии. Кровь, которую собирали из грудной полости через аорту, была сокращена. Плазму приготовили и храненили при -80 ° С до измерения общего потенциала антиоксидантов. Гистологическая оценка. Поперечные срезы (толщиной 10 мкм) камбаловидной мышцы и EDL были получены из криостата (модель HM 560M, Microm, Volketswil, Швейцария), окрашены гематоксилином и эозином в соответствии с классическими процедурами. Фотографии с высоким разрешением были сделаны AxioCam MRC цифровой камерой (Zeiss, Feldbach, Швейцария), соединенной с инвертированным микроскопом (Zeiss Axiovert 35М). Одно сечение было проанализировано у каждого из 7-10 животных в каждой группе. Некроз (NRS) определяли с помощью программного обеспечения Metamorph (Visitron Systems, Puchheim, Germany) путем измерения поверхности всех здоровых тканей от всего поперечного сечения мышцы. Вся поверхность поперечного сечения также была измерена. NRS в конечном итоге выражали как процент от общей площади поперечного сечения поверхности. Образцы были закодированы и проанализированы наблюдателем, который не знал деталей исследования. Определение общего антиоксидантного потенциала в плазмы. Общий антиоксидантный потенциал плазмы оценивали с помощью коммерческого набора ( Антиоксидантный статус, Randox лаборатории, Ардморе, UK) в соответствии с инструкциями производителя. Общий потенциал антиоксиданта (в ммоль / л) определяли путем сравнения с контрольной сывороткой известного антиоксидантного статуса (Randox). Статистический анализ. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего непарного теста Стьюдента, контрольная группа mdx5Cv использовать в качестве опорной для сравнения с любой другой группой. Различия со значениями P ≤ 0,05 считались значимыми. РЕЗУЛЬТАТЫ Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПTК от веса мыши и приема пищи. Трех-недельные мыши имели средний вес тела 8,6 (SD 0,7) г. Как показано на рис. 1А, животные, которые получили 0,25% ГТЕ и 0,1% ЭГКГ были немного легче, чем необработанные mdx5Cv мышеи, когда они вошли в протокол. Затем средний вес тела был одинаковым во всех группах в течение следующих 4 недель. На пятой неделе лечения необработанные мыши mdx5Cv прибавили в весе быстрее, чем другие животные. Мыши стали значительно тяжелее, чем нормальные мышей и mdx5Cv мыши, получавшие низкую дозу ГТЕ или ПTК (фиг. 1А). После первой недели лечения, индекс потребления пищи варьировался от 0,146 (необработанные mdx5Cv) до 0,206 г / г массы тела / день (нормальные мыши) (фиг. 1B ). Индекс потребления продуктов питания нормирован после этого к значению ~ 0,150 г / г веса тела / день. Это соответствует суточной дозе препарата 75 и 375 мг / кг массы тела для групп, и 0,05% и 0,25% ГТЕ, соответственно, и 150 мг / кг массы тела у получавших ЕГКГ 0,1% и 0,1% ПТХ. Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на плазменный общий антиоксидантный потенциал. Общий антиоксидантный потенциал измеряли в плазме обоих обработанных и необработанных животных. Не было найдено существенных отличий между группами после 1 недели диеты (рис. 2). Однако, после 5 недель диетотерапии, все четыре группы представили небольшое, но значимое увеличение антиоксидантного потенциала плазмы (рис. 2). Значения (ммоль / л) варьировали от 1,72 (SD 0,16) для необработанных животных mdx5Cv до 2,35 (SD 0,55) для животных, которые получали ЭГКГ или ПТК. Доза ГТЕ повышает потенциал плазмы до ~ 2,10. Нормальные мыши имели антиоксидантный потенциал 1,85 (SD 0,35). Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на гистологию мышц. Поперечные срезы EDL и камбаловидной мышцы окрашивали гематоксилином и эозином. Здоровые и регенерирующие мышечные волокна было легко определить по наличию либо периферических или центральных ядер соответственно (рис. 3). Очаги некротических волокон были выделены наличием плотно расположенных иммунных клеток, а вновь образованные регенерирующие миотубы определялись как мелкокалиберные клетки с повышенной эозинофилией и большими центральными ядрами (фиг. 3, и D). Фракции мышц, пострадавших от некроза и регенерации показаны на рис. 4. EDL мышцы необработанных дистрофических мышей в 4-недельном возрасте имели ~ 30% NRS (рис. 3, А и D). Напротив, у мышей, которых кормили в течение 1 недели с высокой дозой ГТЕ, ЭГКГ, или ПТК (рис. 3, В и Е;. Рис. 4), часть некротических областей EDL мышцы упала до 17-20%. Это соответствует 31-42% защиты по сравнению с необработанными мышами mdx5Cv. Камбаловидная мышца более затронуты, NRS значение 45-53% во всех группах после 1 недели диетотерапии. Через 5 недель приема пищевых добавок, NRS значения были сходными во всех группах мышей с дистрофией, независимо от лечения. NRS значения достигли 56-64% для EDL мышц и 67-71% для камбаловидной мышцы (рис. 4). В то время эти фракции состояли главным образом из полностью регенерировавших зарождающихся волокон с несколькими признаками некротических волокон или проникновением иммунных клеток (рис. 3, F и G). Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на трицепс голени. После 1 недели кормления стандартным кормом, CSA нормальных трицепсов голени была значительно ниже, чем у мышей mdx5Cv (табл. 1). Это свидетельствует о гипертрофии дистрофических мышц, как сообщает Сакко и соавт. (36). Примечательно, за исключением низких доз ГТЕ, каждое из тестируемых соединений уменьшает CSA трицепсов почти до нормальных значений. В 8-недельном возрасте животных различие между нормальными и дистрофическими мышцами больше не видел. Mdx5Cv мыши, получавшие низкие дозы ГТЕ или ПТК, однако, снизили CSA значения. Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на параметры изометрической силы. В таблице 1 приведены конкретные уровни напряжения трехглавой мышцы голени. Этот параметр считается физиологически более актуальным, чем абсолютное напряжение, которое находится под влиянием изменений в абсолютной мышечной массе и оптимальной длины. В тот же период времени, необработанные мышцы mdx5Cv отображает весьма значительное снижение пика напряжения по сравнению с нормальными мышами (Pt = 33,2 против 60,2 mN/mm2 и 35,3 против 67,4 mN/mm2, через 1 и 5 недель, соответственно). После 1 недели, низкие дозы ГТЕ увеличили Pt на 22%, но это не существенно отличается от необработанных животных. Высокие дозы ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК добавки в течение 1 нед заметно дополнили Pt (+60% +94% и +66% соответственно, таблица 1) до значений, близких к нормальным мышам. Когда питание было продлено в течение 5 недель последовательно увеличена Pt от 42 до 59% по сравнению с необработанными дистрофическими животными (табл. 1). Аналогичным образом, максимальное тетаническое напряжение Po было значительно выше у нормальных мышей, чем у необработанных дистрофических мышей в обеих временных точках (+55% до +35% через 1 и 5 недель лечения соответственно). Кроме того, высокие дозы ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК за 1 неделю увеличили Po (+21 до +36% по сравнению с необработанными дистрофическими мышами). Тем не менее, увеличение было статистически значимым для ПТК-группы (табл. 1). В противоположность этому, после 5 недель лечения, тестируемые вещества больше не изменяли Ро, которое изменяется в пределах от -10% до +10% по сравнению со значениями необработанных мышей. После 1 и 5 недель лечения, Po значения были неизменными у нормальных мышей (335 и 347 mN/mm2, соответственно). За тот же период, Po значения были увеличены с 216 до 257 mN/mm2 в необработанных mdx5Cv (табл. 1).Интересно, что в результате изменений Pt и Ро после диет, соотношение фазового к тетанического напряжения были значительно повышены всеми веществами по сравнению с необработанными mdx5Cv (+24 до +59%), что привело к почти нормальным значениям в течение 5 недель (табл. 1). Кривые, соединяющие тетаническое напряжение и частоту стимуляции, были созданы (рис. 5). Фракцию максимального усилия, развиваемого у необработанных дистрофических животных на низкой частоте стимуляции (т.е. в условиях неполной столбняк), была меньше, чем их нормальные аналоги. При 20 Гц, доля от максимальной силы была разработана 20 против 24% (т.е. +20%) после 1 недели и 17 против 22% (т.е. +28%) после 5 недель для дистрофических против контрольных мышей, соответственно. После лечения значения дистрофических животных были сдвинуты вверх и стали аналогичным контрольным животным (рис. 5), особенно при высоких дозах ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК. Этот эффект хорошо видно после 1 недели, а через 5 недель набранные силы во всех четырех группах животных mdx5Cv стали значительно выше, чем у необработанных мышей mdx5Cv, приближая значения к здоровым необработанным контрольным животным. Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на сокращение и расслабление. Время до пика (ТТП) и время полу -релаксации от пика (RT1 / 2) (таблица 1) были определены из оптимальных фазовых следов подергивания. ВДП составило ~ 40-41 мс для нормальных и необработанных животных в любом возрасте. Диета в течение 1 недели существенно не изменяет этот параметр. Кормление животных в течение 5 недель ГТЕ, ЭГКГ, или ПТК уменьшили ТТП от 2 до 10%, что свидетельствует о более быстром сокращении. Статистическая значимость была достигнута у животных, которые получали ЭГКГ и ПТК, но не ГТЕ (табл. 1). Четырехнедельные нормальные и дистрофические животные, которых кормили стандартной диетой, имели сходные RT1 / 2 значения (табл. 1). Никаких существенных изменений не было замечено при кормлении добавками, хотя ЭГКГ это значение увеличил на 22% по сравнению с необработанными мышами. В отличие от этого, трицепс голени от нормальных 8-WK-старых животных расслабился намного быстрее, чем у соответствующего возраста дистрофических животных. Интересно, что RT1 / 2 значение мышей mdx5Cv обработанных любым из тестируемых веществ было значительно уменьшено по сравнению с необработанными животными mdx5Cv, падая до значений, аналогичные нормальных животных (табл. 1). Эффекты ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК на сопротивление усталости. Сопротивление трицепсов голени повторяющейся тетанизации оценивалась в анализе усталости. Как показано на рис. 6, тетанизация, напряженность была сохранена для <1 мин. Затем она резко снизилась в течение 1-2 мин. Наконец, кривые достигали плато, со значением соответствующему остаточному напряжению. Четырехнедельные необработанные животные представлены примерно аналогичными моделями усталости и подобной остаточной силой в конце анализа (рис. 6). Тем не менее, значения нормальной мышцы были всегда выше значения дистрофических мышц. Низкие дозы ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК особенно не изменяют шаблон уменьшения силы. После диетотерапии в течение 5 недель, ответы представлены почти перевернутым изображением 1-недельных данных: нормальные животные стали устойчивы, необработанные дистрофические мыши более устойчивы, чем нормальные, и, за исключением низких доз ГТЕ, все добавки присвоили дистрофическим животным повышенную устойчивость к усталости. Остаточное усилие варьировались от всего лишь 18% максимального напряжения для нормальных мышей до ~ 24% необработанных дистрофических мышей и 36% мышей mdx5Cv получавших ПТК, высокие дозы ГТЕ, и ЭГКГ соответственно (рис. 6). Таким образом, испытуемые вещества сделали дистрофические мышцы на 33-50% более устойчивыми к усталости по сравнению с необработанными дистрофическими мышцами. ОБСУЖДЕНИЕ Конкретные цели настоящего исследования были: 1) изучение влияния ГТЕ и его основных компонентов полифенольных, ЭГКГ, на тканевые и функциональные изменения присущие дистрофическим состоянием, 2) исследовать, могут ли эти вещества улучшают качество мышц и функциональные свойства, и 3) установить, обладают ли эти вещества терапевтическим потенциалом для симптоматического лечения МДД. Ранее нами было показано, что ГТЕ за 1 неделю уменьшает некроз на 0,05% (вес / вес) у мышей MDX (8). Мы исследовали влияние в 5 раз более высокой дозы ГТЕ (0,25% вес / вес) и ЭГКГ в дозе, соответствующей содержанию ЭГКГ в 0,25% ГТЕ. На основе исследования, проведенного Granchelli и коллегами (15), мы использовали ПТК в качестве положительного контроля, потому что это был самый эффективный из панели из 27 фармакологических препаратов, улучшающих в целом напряженность 10-WK-старых мышей MDX на 51%. Наши исследуемые вещества добавили в рацион 3-недельных дистрофических мышей, для того, чтобы в течение 1 нед исследовать влияние на возникновение массовой волны дистрофии, происходящей в 3 - 4 недельном возрасте, или в течение 5 недель. До сих пор несколько исследований (5, 8, 10, 26, 37) имели дело с последствиями ГТЕ на функции скелетных мышц. Кроме того, в меру наших знаний, потенциал ЭГКГ при атрофии мышц никогда не были исследованы. Наши текущие результаты могут быть изложены следующим образом. Во-первых, тестируемые вещества задерживают некроз мышц: EDL, но не в камбаловидной мышце. Во-вторых, важно, что структурные и механические свойства дистрофических мышц были исправлены почти до нормальных значений исследуемыми веществами. Это было определено путем количественного анализа трицепса голени мышц. Наконец, тестируемые вещества изменяли механические параметры дистрофических мышц, причем наиболее важными из которых являются улучшение выходной силы и мышечного сопротивления усталости. В целом, ЭГКГ был немного более эффективным по сравнению с ГТЕ. Это было неожиданно, потому что ЭГКГ лучше защищен от окисления при ассоциации с другими полифенолами, как ГТЕ, чем при введении одного (47). Это может отражать контрастные эффекты различных полифенолов на специфические функции клетки. Кроме того, может быть конкуренция между различными полифенолами для клеточных мишеней, на которых ЭГКГ имеет выраженный эффект. ПТК и полифенолы из ГТЕ имеют горький вкус, который может повлиять на потребление продуктов питания и изменить темп роста. Однако, как показано на рис. 1А, это был не тот случай. Средняя масса тела была неизменной при использовании ГТЕ, ЭГКГ, ПТК. Незначительные изменения в массе тела во время пятой недели лечения могут быть связаны с неравномерным распределением мужских и женских особей. У дистрофических животных увеличилось количество потребляемой пищи в течение первой недели приема препаратов, но их масса тела остается неизменной (рис. 1б). Это может отражать повышенную двигательную активность и поисковое поведение. Это улучшение может быть также благодаря более эффективному использованию жиров с помощью βокисления, поскольку ГТЕ, как сообщается, стимулирует липолитическую активность в пробирке (48) и в естественных условиях (26). Тем не менее, в последнем исследовании животных подвергали упражнениям на выносливость, в то время как в нашем исследовании, животные имели пассивный образ жизни. В большинстве мышц конечностей мыши, истощение начинается в конце третьей недели жизни, и обычно за ним следует эффективная регенерация, которая завершается в ~ 7-8 недельном возрасте (43). Процесс вырождения продолжается после этого, но в гораздо более медленном темпе. В этом исследовании мы обнаружили, что дополнительное питание ГТЕ, ЭГКГ, или ПТК в течение 1 нед предоставило возможность защитить значительную часть (до 42%) EDL мышечных волокон. Тем не менее, камбаловидная мышца вырвались из этого защитного эффекта. Такая дифференциальная чувствительность EDL против камбаловидной мышцы к тестируемым веществам была отмечена в предыдущих исследованиях (8, 31) и, вероятно, будет в силу различных физиологических функций: EDL содержит быстро сокращающихся мышечные волокна, в то время как камбаловидная мышца имеет медленно сокращающиеся волокна и участвует в поддержании позы и, следовательно, постоянно стимулируется. В результате камбаловидная мышца является более предрасположенной к повреждению. В самом деле, некротические волокна уже присутствуют в камбаловидной мышце у 3-WKдистрофических старых мышей (см. 31, а Dorchies О.М., неопубликованные наблюдения), т. е. в то время, когда мы решили начать пищевые добавки. Эта особенность, вероятно, причина, почему дистрофическая камбаловидная мышца нечувствительна к терапевтическому вмешательству. В противоположность этому, EDL мышца, в которой отмечается позднее начало некроза, как можно ожидать, более чувствительна к защитным препаратам. Защитные эффекты больше не наблюдались после 5 недель лечения, предполагая, что ГТЕ, ЭГКГ, и ПТК задерживают некроз, но были не в состоянии противодействовать долгосрочному патологическому процессу. Вероятно, степень некроза и его скорость прогрессирования преодолели положительный эффект испытуемых веществ. Мышиный и человеческий патогенез отличаются главным образом по отношению к регенеративной способности мышц. Она является достаточно эффективной у мышей, но быстро исчерпывается в организме человека. У мышей первая массовая волна некроза с последующей второй фазой, продолжающейся в течение большей части жизни животного, и характеризуется медленной, хронической дегенерацией (33). Этот период связан с низким хроническим окислительным стрессом, который напоминает дистрофическое медленно прогрессирующее состояние человека. Если ГТЕ и ЭГКГ защищают мышцы благодаря их антиоксидантным свойствам, мы предполагаем, что они будут эффективными во время этой фазы характеризующейся хроническим окислительным стрессом. NRS найденные значения EDL и камбаловидной мышцы необработанных мышей были ниже, чем в наших предыдущих исследованиях (30% против 40-45% для EDL, и 50% против 70-75% для камбаловидной, соответственно) (8, 31). Различия в генетическом фоне (C57BL/10 для часто используемых MDX мышей против C57BL / 6 для mdx5Cv), а также улучшение метода, используемого для гистологического анализа, вероятно, с учетом этого получено небольшое расхождение. Никаких признаков фиброза не было видно, наверное, потому что животные были слишком молоды для развития этой функции. Изометрические записи силы были совместимы с эффективной регенерацией и созреванием мышц. Единственное неоднозначное наблюдение состояло из повышенной утомляемости в 4-недельном возрасте у дистрофических животных, обработанных в течение 1 недели 0,25% ГТЕ. На самом деле, EDL мышцы состоят почти исключительно из быстро сокращающихся волокон типа II [~ 80% IIB типа и 20% Тип IIX волокна (1)]. Тип IIB волокон, как сообщалось, более восприимчив, чем другие типы волокон к гибели клеток (33). Таким образом, значительная часть волокон защищенные ГТЕ, должны состоять из волокон типа II. Аналогично, трехглавая мышца голени состоит также в основном из волокон типа II (икроножной мышцы и подошвенной мышцы представляют> 90% трицепса голени). Таким образом, разумно предположить, что быстро сокращающиеся компоненты трицепса голени получают выгоду от защиты, схожую с EDL, не найденную для других мышц. Защита трехглавой мышцы голени при приеме ГТЕ должна привести к повышенной утомляемости по сравнению с необработанным состоянии. Кроме того, тот факт, что мышцы дистрофических мышей, получавших добавки к рациону, отображают квази-восстановление этих параметров, предполагает, что дистрофический фенотип обработанных животных стал похож на нормальные мышцы. Скорость сжатия и напряжение при сокращении мышечных волокон в основном диктуется характером экспрессии тяжелых цепей миозина. Таким образом, вероятность того, что дистрофические животные могут отображать картину распределения этих цепей миозина аналогичную тем, которые имеются у нормальных животных, могли бы объяснить это функциональное улучшение. С другой стороны, повышение устойчивости к усталости в 8-недельном возрасте у мышей, получавших ГТЕ или ЭГКГ в течение 5 недель можно объяснить накоплением устойчивых типа I и типа IIA волокон. Определение изоформ миозина должно пролить свет на молекулярные основы, лежащие в основе улучшенного выхода силы и устойчивости к усталости. Мы обнаружили, что стимулированные мышцы не восстанавливаются после лечения (не показан) в течение до 1 часа после окончании анализа. Все три исследованных вещества известны противовоспалительным действием (12). Тем не менее, наш интерес к ГТЕ и ЭГКГ, в качестве кандидатов для паллиативного лечения МДД, опирается прежде всего на их антиоксидантный потенциал, найденый в пробирке и в естественных условиях исследования (16). ГТЕ и ЭГКГ оказывает свое благотворное влияние на дистрофические мышцы, действуя как антиоксиданты. Тем не менее, предыдущие и текущие работы в пробирке в нашей лаборатории убедительно доказывают, что полифенолы из ГТЕ действительно в состоянии защитить культурные клетки скелетных мышц от активных форм кислорода. ГТЕ в зависимости от дозы противодействует повреждениям индуцированным свободными радикалами (8). Кроме того, мы покажем здесь, что ГТЕ или ЭГКГ привел к значительному увеличению антиоксидантного потенциала плазмы. Наконец, антиоксиданты, как полагают, модулируют окислительно-восстановительное состояние тиольных фрагментов легкой цепи миозина, позволяющие получать оптимальное напряжение (2). Таким образом, представляется вероятным, что ЭГКГ ГТЕ действуют через их антиоксидантную активность в естественных условиях. Это действие видели на тканевом уровне в 4-недельном возрасте на EDL мышце. Тем не менее, если единственный вклад ГТЕ и ЭГКГ был в защите мышечных тканей от окислительного стресса, индуцированного повреждения, не существовало бы фенотипического различия между обработанной и необработанной дистрофическими мышцами после регенерации. В знак несогласия с этим утверждением выступили наши результаты на животных, обработанных за 5 недель: в то время как гистология была одинаковой во всех группах животных независимо от лечения, функциональная запись силы выявила множественные изменения в механических свойств мышц. Это наводит на мысль, что ЭГКГ ГТЕ оказывают прямое действие на скелетные мышечные волокна. В соответствии с этой гипотезой, текущая работа в лаборатории предполагает, что положительно влияет на миогенез путем содействия формированию миотубы миобластами и путем усиления экспрессии нескольких мышц-специфических белков, в том числе тяжелых цепей миозина, саркомерных αактинин и дистрофина. Если мыши с дистрофией и реагировали на ГТЕ за счет избыточной экспрессии структурных белков, таких как те, которые определены в пробирке, но не исследовано еще. В этом контексте, избыточная экспрессия атрофина, гомолога дистрофина, способна компенсировать отсутствие дистрофина (39) и является важным вопросом для решения. Из-за нарушения регуляции клеточного гомеостаза кальция, дефицит дистрофина участвует в течении событий, приводящих к смерти мышечного волокна (14), это наводит на мысль, что диетические мероприятия мешали этому процессу. Соответственно, диетическое вмешательство в состоянии исправить нарушение регуляции у мышей MDX (35). Интересно, что дистрофические животные, которые получали ЭГКГ в течение 5 недель, представили повышенную скорость сжатия. Кроме того, мышцы от животных, получавших ГТЕ или ЭГКГ расслабляются значительно быстрее по сравнению с необработанными дистрофическими животными. Улучшенная скорость релаксации после лечения ГТЕ и ЭГКГ может возникнуть в результате повышенной экспрессии и / или повышенной активностью эндоплазматического ретикулума Са2 + АТФазы. ГТЕ, как уже сообщалось, изменяет гомеостаз Ca2 + в тромбоцитах (19) и в хромаффинных клетках (30). Наши результаты показывают, что ГТЕ изменяет гомеостаз кальция также в скелетных мышцах. По сравнению с ЭГКГ, другие полифенолы из зеленого чая (например, эпикатехин, эпигаллокатехин и эпикатехингаллат) имеют меньшие антиоксидантные свойства и им было приписано меньше биологических эффектов. Насколько нам известно, ЭГКГ является единственным полифенолом из ГТЕ, для которого мембранный рецептор был идентифицирован (42). Связывание ЭГКГ с этим рецептором приводит к ингибированию роста раковых клеток, независимо от его антиоксидантного действия. Использование других очищенных полифенолов в будущих экспериментах должны помочь определить относительный вклад антиоксидантных и неантиоксидантных эффектов ЭГКГ и ГТЕ. В заключение, мы обнаружили, что ГТЕ и его основной ЭГКГ были эффективны в защите быстро сокращающихся мышц EDL от некроза. Вполне вероятно, что такая же защита произошла в быстро сокращающейся части трехглавой мышцы голени, которая состоит из икроножной мышцы и подошвенной мышцы. Хотя окончательный механизм действия остается уточнить, эти вещества оказывали заметное воздействие на механические свойства мышц через 1 и 5 недель лечения. Таким образом, мы предполагаем, что ГТЕ полифенолы ведут себя как агенты с множественными точками приложения, которые способны положительно влиять на последствия отсутствия дистрофина (20, 44). Как таковые, эти соединения четко заслуживают дальнейшего рассмотрения их потенциала в качестве паллиативного лечения для пациентов с МДД. Дополнительные характеристики делают ГТЕ и полифенолы кандидатами в терапевтические агенты, потому что они активны при пероральном введении, имеют хорошо документированную фармакокинетику, фармакодинамику и отсутствие отрицательного токсикологического действия или побочных эффектов, и легко доступны по низким ценам. Эти характеристики можно надеяться, исключает трудоемкий процесс для обычной разработки лекарств и обеспечить пациентов и их семей недорогим неинвазивным лечением. Действительно, такие препараты могут быть использованы в ближайшем будущем в клинических испытаниях у пациентов с МДД. Ссылки 1. ↵ Agbulut O, Li Z, Mouly V, and Butler-Browne GS. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell 88: 131–135, 1996. CrossRef Medline 2. ↵ Andrade FH, Reid MB, Allen DG, and Westerblad H. Effect of hydrogen peroxide and dithiothreitol on contractile function of single skeletal muscle fibres from the mouse. J Physiol 509: 565–575, 1998. Abstract/FREE Full Text 3. ↵ Aneja R, Hake PW, Burroughs TJ, Denenberg AG, Wong HR, and Zingarelli B. Epigallocatechin, a green tea polyphenol, attenuates myocardial ischemia reperfusion injury in rats. Mol Med 10: 55–62, 2004. CrossRef Medline 4. ↵ Arakawa H, Maeda M, Okubo S, and Shimamura T. Role of hydrogen peroxide in bactericidal action of catechin. Biol Pharm Bull 27: 277–281, 2004. CrossRef Medline 5. ↵ Ashida H, Furuyashiki T, Nagayasu H, Bessho H, Sakakibara H, Hashimoto T, and Kanazawa K. Anti-obesity actions of green tea: possible involvements in modulation of the glucose uptake system and suppression of the adipogenesis-related transcription factors. Biofactors 22: 135–140, 2004. Medline 6. ↵ Blake DJ, Weir A, Newey SE, and Davies KE. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol Rev 82: 291–329, 2002. Abstract/FREE Full Text 7. ↵ Brown MD. Green tea (Camellia sinensis) extract and its possible role in the prevention of cancer. Altern Med Rev 4: 360–370, 1999. Medline 8. ↵ Buetler TM, Renard M, Offord EA, Schneider H, and Ruegg UT. Green tea extract decreases muscle necrosis in mdx mice and protects against reactive oxygen species. Am J Clin Nutr 75: 749–753, 2002. Abstract/FREE Full Text 9. ↵ Chow HH, Cai Y, Alberts DS, Hakim I, Dorr R, Shahi F, Crowell JA, Yang CS, and Hara Y. Phase I pharmacokinetic study of tea polyphenols following single-dose administration of epigallocatechin gallate and polyphenon E. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 10: 53–58, 2001. Abstract/FREE Full Text 10. ↵ Das M, Vedasiromoni JR, Chauhan SP, and Ganguly DK. Effect of green tea (Camellia sinensis) extract on the rat diaphragm. J Ethnopharmacol 57: 197–201, 1997. CrossRef Medline 11. ↵ De Luca A, Nico B, Liantonio A, Didonna MP, Fraysse B, Pierno S, Burdi R, Mangieri D, Rolland JF, Camerino C, Zallone A, Confalonieri P, Andreetta F, Arnoldi E, Courdier-Fruh I, Magyar JP, Frigeri A, Pisoni M, Svelto M, and Conte Camerino D. A multidisciplinary evaluation of the effectiveness of cyclosporine A in dystrophic mdx mice. Am J Pathol 166: 477–489, 2005. Medline 12. ↵ Dona M, Dell’Aica I, Calabrese F, Benelli R, Morini M, Albini A, and Garbisa S. Neutrophil restraint by green tea: inhibition of inflammation, associated angiogenesis, and pulmonary fibrosis. J Immunol 170: 4335–4341, 2003. Abstract/FREE Full Text 13. ↵ Fassina G, Buffa A, Benelli R, Varnier OE, Noonan DM, and Albini A. Polyphenolic antioxidant (−)epigallocatechin-3-gallate from green tea as a candidate anti-HIV agent. AIDS 16: 939–941, 2002. CrossRef Medline 14. ↵ Gailly P. New aspects of calcium signaling in skeletal muscle cells: implications in Duchenne muscular dystrophy. Biochim Biophys Acta 1600: 38–44, 2002. Medline 15. ↵ Granchelli JA, Pollina C, and Hudecki MS. Pre-clinical screening of drugs using the mdx mouse. Neuromuscul Disord 10: 235–239, 2000. CrossRef Medline 16. ↵ Higdon JV and Frei B. Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions. Crit Rev Food Sci Nutr 43: 89–143, 2003. CrossRef Medline 17. ↵ Hong JT, Ryu SR, Kim HJ, Lee JK, Lee SH, Kim DB, Yun YP, Ryu JH, Lee BM, and Kim PY. Neuroprotective effect of green tea extract in experimental ischemia-reperfusion brain injury. Brain Res Bull 53: 743–749, 2000. CrossRef Medline 18. ↵ Im WB, Phelps SF, Copen EH, Adams EG, Slightom JL, and Chamberlain JS. Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different mutations. Hum Mol Genet 5: 1149–1153, 1996. Abstract/FREE Full Text 19. ↵ Kang WS, Chung KH, Chung JH, Lee JY, Park JB, Zhang YH, Yoo HS, and Yun YP. Antiplatelet activity of green tea catechins is mediated by inhibition of cytoplasmic calcium increase. J Cardiovasc Pharmacol 38: 875–884, 2001. CrossRef Medline 20. ↵ Khurana TS and Davies KE. Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2: 379–390, 2003. CrossRef Medline 21. ↵ Lambert JD, Lee MJ, Lu H, Meng X, Hong JJ, Seril DN, Sturgill MG, and Yang CS. Epigallocatechin-3-gallate is absorbed but extensively glucuronidated following oral administration to mice. J Nutr 133: 4172–4177, 2003. Abstract/FREE Full Text 22. ↵ Leijendekker WJ, Passaquin AC, Metzinger L, and Ruegg UT. Regulation of cytosolic calcium in skeletal muscle cells of the mdx mouse under conditions of stress. Br J Pharmacol 118: 611–616, 1996. Medline 23. ↵ Louis M, Lebacq J, Poortmans JR, Belpaire-Dethiou MC, Devogelaer JP, Van Hecke P, Goubel F, and Francaux M. Beneficial effects of creatine supplementation in dystrophic patients. Muscle Nerve 27: 604–610, 2003. CrossRef Medline 24. ↵ Metzinger L, Passaquin AC, Leijendekker WJ, Poindron P, and Ruegg UT. Modulation by prednisolone of calcium handling in skeletal muscle cells. Br J Pharmacol 116: 2811–2816, 1995. Medline 25. ↵ Muntoni F, Fisher I, Morgan JE, and Abraham D. Steroids in Duchenne muscular dystrophy: from clinical trials to genomic research. Neuromuscul Disord 12, Suppl 1: S162-S165, 2002. CrossRef Medline 26. ↵ Murase T, Haramizu S, Shimotoyodome A, Nagasawa A, and Tokimitsu I. Green tea extract improves endurance capacity and increases muscle lipid oxidation in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288: R708–R715, 2005. Abstract/FREE Full Text 27. ↵ Nakachi K, Eguchi H, and Imai K. Can teatime increase one’s lifetime? Ageing Res Rev 2: 1–10, 2003. CrossRef Medline 28. ↵ Nakagawa T and Yokozawa T. Direct scavenging of nitric oxide and superoxide by green tea. Food Chem Toxicol 40: 1745–1750, 2002. CrossRef Medline 29. ↵ Nowak KJ and Davies KE. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment: Third in Molecular Medicine Review Series. EMBO Rep 5: 872–876, 2004. CrossRef Medline 30. ↵ Pan CY, Kao YH, and Fox AP. Enhancement of inward Ca2+ currents in bovine chromaffin cells by green tea polyphenol extracts. Neurochem Int 40: 131–137, 2002. CrossRef Medline 31. ↵ Passaquin AC, Renard M, Kay L, Challet C, Mokhtarian A, Wallimann T, and Ruegg UT. Creatine supplementation reduces skeletal muscle degeneration and enhances mitochondrial function in mdx mice. Neuromuscul Disord 12: 174–182, 2002. CrossRef Medline 32. ↵ Petrof BJ, Shrager JB, Stedman HH, Kelly AM, and Sweeney HL. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc Natl Acad Sci USA 90: 3710–3714, 1993. Abstract/FREE Full Text 33. ↵ Rando TA. Oxidative stress and the pathogenesis of muscular dystrophies. Am J Phys Med Rehabil 81: S175– 186, 2002. CrossRef Medline 34. ↵ Riemersma RA, Rice-Evans CA, Tyrrell RM, Clifford MN, and Lean MEJ. Tea flavonoids and cardiovascular health. QJM 94: 277–282, 2001. Abstract/FREE Full Text 35. ↵ Ruegg UT, Nicolas-Metral V, Challet C, Bernard-Helary K, Dorchies OM, Wagner S, and Buetler TM. Pharmacological control of cellular calcium handling in dystrophic skeletal muscle. Neuromuscul Disord 12: S155– S161, 2002. CrossRef Medline 36. ↵ Sacco P, Jones DA, Dick JR, and Vrbova G. Contractile properties and susceptibility to exercise-induced damage of normal and mdx mouse tibialis anterior muscle. Clin Sci (Lond) 82: 227–236, 1992. Medline 37. ↵ Saito M, Saito K, Kunisaki N, and Kimura S. Green tea polyphenols inhibit metalloproteinase activities in the skin, muscle, and blood of rainbow trout. J Agric Food Chem 50: 7169–7174, 2002. CrossRef Medline 38. ↵ Spencer MJ and Tidball JG. Do immune cells promote the pathology of dystrophin-deficient myopathies? Neuromuscul Disord 11: 556–564, 2001. CrossRef Medline 39. ↵ Squire S, Raymackers JM, Vandebrouck C, Potter A, Tinsley J, Fisher R, Gillis JM, and Davies KE. Prevention of pathology in mdx mice by expression of utrophin: analysis using an inducible transgenic expression system. Hum Mol Genet 11: 3333–3344, 2002. Abstract/FREE Full Text 40. ↵ St-Pierre SJG, Chakkalakal JV, Kolodziejczyk SM, Knudson JC, Jasmin BJ, and Megeney LA. Glucocorticoid treatment alleviates dystrophic myofiber pathology by activation of the calcineurin/NF-AT pathway. FASEB J 18: 1937–1939, 2004. Abstract/FREE Full Text 41. ↵ Suzuki M, Tabuchi M, Ikeda M, Umegaki K, and Tomita T. Protective effects of green tea catechins on cerebral ischemic damage. Med Sci Monit 10: BR166–BR174, 2004. Medline 42. ↵ Tachibana H, Koga K, Fujimura Y, and Yamada K. A receptor for green tea polyphenol EGCG. Nat Struct Mol Biol 11: 380–381, 2004. CrossRef Medline 43. ↵ Tanabe Y, Esaki K, and Nomura T. Skeletal muscle pathology in X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) mouse. Acta Neuropathol (Berl) 69: 91–95, 1986. CrossRef Medline 44. ↵ Tidball J and Wehling-Henricks M. Evolving therapeutic strategies for Duchenne muscular dystrophy: targeting downstream events. Pediatr Res 56: 831–841, 2004. CrossRef Medline 45. ↵ Townsend PA, Scarabelli TM, Pasini E, Gitti G, Menegazzi M, Suzuki H, Knight RA, Latchman DS, and Stephanou A. Epigallocatechin-3-gallate inhibits STAT-1 activation and protects cardiac myocytes from ischemia/reperfusioninduced apoptosis. FASEB J 18: 1621–1623, 2004. Abstract/FREE Full Text 46. ↵ Wang HK. The therapeutic potential of flavonoids. Expert Opin Investig Drugs 9: 2103–2119, 2000. CrossRef Medline 47. ↵ Williams SN, Pickwell GV, and Quattrochi LC. A combination of tea (Camellia sinensis) catechins is required for optimal inhibition of induced CYP1A expression by green tea extract. J Agric Food Chem 51: 6627–6634, 2003. CrossRef Medline 48. ↵ Yeh CW, Chen WJ, Chiang CT, Lin-Shiau SY, and Lin JK. Suppression of fatty acid synthase in MCF-7 breast cancer cells by tea and tea polyphenols: a possible mechanism for their hypolipidemic effects. Pharmacogenomics J 3: 267–276, 2003. Medline 49. ↵ Zhong Z, Froh M, Lehnert M, Schoonhoven R, Yang L, Lind H, Lemasters JJ, and Thurman RG. Polyphenols from Camellia sinensis attenuate experimental cholestasis-induced liver fibrosis in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 285: G1004–G1013, 2003. Abstract/FREE Full Text Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org Оригинал статьи: http://ajpcell.physiology.org/cgi/content/full/290/2/C616
