Эфекктивность генной экспрессии при использовании аден- ассоциированного вектора in vivo.

Эфекктивность генной экспрессии при использовании аденассоциированного вектора in vivo.
Yi Lai,1 Yongping Yue,1 Mingju Liu,1 Arkasubhra Ghosh,1 John F Engelhardt,2 Jeffrey S Chamberlain,3 and
Dongsheng Duan1
1
Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri School of Medicine, 1
Hospital Dr., Room M610G, MSB, Columbia, Missouri 65212, USA.
2
Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa, 51 Newton Rd., Room 1-111, BSB, Iowa
City, Iowa 52242, USA.
3
Department of Neurology, University of Washington School of Medicine, 1959 NE Pacific St., Room
K2438 HSB, Seattle, Washington 98195, USA.
Correspondence should be addressed to D.D. (Email: duand@missouri.edu).
The publisher's final edited version of this article is available at Nat Biotechnol
See other articles in PMC that cite the published article.
Несмотря на то, что аден-ассоциированные вирусы имеют малый объем капсида для переноса
генетического материала , они могут быть использованы в качестве вектора. К сожалению их
эффективность достаточно низкая.. Здесь мы показали, что рациональная конструкция генетического
материала имеет большое влияние на экспрессию переносимых генов. Используя матричную РНК
как проводник, мы увеличили эффективность вектора и добились распространенной экспрессии 6-kb
ΔH2-R19 мини-дистрофина в скелетной мускулатуре mdx мышей- модели для миодистрофии
Дюшена. Фенотип болезни имеющихся у мышей был улучшен благодаря терапии. Данная стратегия
может быть использована и для лечения других, сходных заболеваниях.
AAV многообещаущий вектор для генной терапии.1-3. Однако, они не могут переносить большые
участки генетического матерьяла.Генетический материал до 5-kb считается предельно допустимым
для AAV 4. Несмотря на такую вместимость AAV 5-7, 5 лет назад был разработан метод двойного
транс сплайсинга, позволяющий переносить до 10-kb генетического материала8-11. При
использовании данного метода большой участок гена делится на 2 части. 5′ фрагмент и меченая
последовательность упаковывается в донорский вирус. 3′ фрагмент и последовательность для
наращивания упаковывается в акцепторный вирус.. Экспрессия протеина достигается при коинфекции вирусами клетки.
Ободряющие предварительные результаты были получены при лечении дефицита таких белков , как
эритропоэтин и фактора VIII8,12. К сожалению, эффективность трансдукции структурных протеинов
находится на низком уровне для достижения терапевтического эффекта.11.Некоторые улучшения
были получены при использовании новых серотипов вируса или разработке перевернутой
терминальной повторяющейся последовательности. 13,14.Тем не менее имеются сомнения по
использованию метода двойного транс-сплайсинга. В последнее время наша лаборатория достигла
значительных улучшений по преодалению данного барьера. 14,15.Наши результаты свидетельствуют о
том, что аккумуляция мРНК происходит лучше как донорским так и акцепторным вирусом. 15.
Уникальная черта транс-сплайсинг векторов- трансляция и сплайсинг через двойное-D (dD)-ITR
соединение в реконструируемом вирусном геноме. 6. Мы предполагаем, что продукция мРНК в
реконструируемом геноме происходит под влиянием ДНК последовательности dD-ITR структуры.
Рациональный выбор сайта разделения гена и оптимизация интронных и экзонных сигналов
сплайсинга могут улучшать эффективность трансдукции у данных векторов.В этом исследовании мы
проверяем эту гипотезу с использованием 6-kb ΔH2-R19 (ΔH2) гена мини-дистрофина.
ΔH2 мини-ген был получен усечением высоко функционального укороченного гена
пациентов(Δexon17-48)16,17.пациенты с делецией экзонов 17-48 имеют незначительно выраженные
проявления болезни и живут до 60 лет16. ΔH2 мини-ген практически идентичен нормальному гену
дистрофина. Трансгенная экспрессия ΔH2 мини-гена полностья возмещает недостаток дистрофина у
mdx мышей и схожих по недостатку дистрофина.17.Эти исследования предпологают, что ΔH2 миниген может служить альтернативой поврежденному гену и приводить к уменьшению выроженности
симптомов.
Для определения оптимального сайта разделения гена, мы смотрели сплайсинговые сигналы из серий
экзон/интрон/экзон соединений ΔH2 мини-гена с использованием RPA. Рассмотривая ограничения
вместимости одного AAV вириона мы пришли к выводу, что лучше всего разделить ген между 51 и
65 экзоном. Мы выбрали наиболее подходящий сайт для разделения и закрепления U1snRNA 18. Эти
экзон/интрон/экзон сигналы- 56/56/57, 60/60/61 и 63/63/64. Мы также выбрали 53/53/54 сигнал,
который не достаточно подходил для закрепления U1snRNA18.
Мы синтезировали серия мини-кассет для воспроизведения вирусного генома. Затем мы проверили
профиль сплайсинга и аккумуляцию мРНК при помощи RPA (Supplementary Methods online)15.
60/60/61сигнал оказался наиболее благоприятным (Table 1). Интересно, что 63/63/64 сигнал показал
наибольшую эффективность при RPA (Fig. 1b, Table 1).Удивительно, что 56/56/57 сигнал оказался
наихудшим.
Figure 1
Исследование эндогенных сплайсинговых сигналов RPA был
использован для оценки сплайсинга и аккумуляции мРНК в выбранном
экзон/интрон/экзонном сигнале в присутствии dD-ITR структуры. (a)
(more ...)
Table 1
Предварительные параметры сплайсинга и RPA результаты
RPA результаты показали, что 60/60/61 и 63/63/64 сигналы наиболее подходили для разрезания
мини гена. Мы сконструировали две последовательности для транс сплайсин векторов, основываясь
на полученных эндогенных сигналах от интронов 60 и 63. (Fig. 2a). Миниген был разделен между
экзонами 60 и 61, 63 и 64. (Fig. 1).Гентический материал был упакован в капсид AAV серотипа 6 и
введены вместе или порознь в переднюю большеберцовую мышцу и длинный разгибатель пальцев у
2-х месячных mdx мышей (Supplementary Note and Supplementary Fig. 1 online). Миниген не был
обнаружен в мышцах, куда ввели только один вирус. (Figs. 2b2b and and3b,3b, and Supplementary
Fig. 2 online). Через 1 месяц после инъекции низкие уровни минигена были обнаружены в мышцах
куда ввели AV.Donor.63 и AV.Acceptor.63 (Fig. 2). The 60/60/61 junction yielded the highest level of
mRNA in the RPA (Fig. 1).Уровни экспрессии минидистрофина были выше при использовании
AV.Donor.60 and AV.Acceptor.60 (Fig. 2).Через 3 месяца после инъекции ∼80% (от 46% до 96%)
миофибрилл были преобразованы. (Fig. 3a, Supplementary Fig. 2 onlineВажно, что при большом
уровне трансдукции не наблюдалась клеточного иммунного ответа. (Supplementary Fig. 3 online).
Figure 2
Экспрессия ΔH2 минидистрофина от 2 независимых наборов AAV векторов. EDL и
TA мышцы от 2-х месячных mdx мышей получивших 1 × 1010 вирусных частиц 2 ×
1010 вирусных частиц (more ...)
Figure 3
Распространенная экспрессия минидистрофина AV.Донор.60 and AV.Акцептор.60
ко-иннфекция мышц mdx животных. (a) Экспрессия минидистрофина в mdx TA
мышце. 2 × 1010 вирусных частиц (more ...)
Чтобы установить функциональную состоятельность минидистрофина мы исследовали дистрофинассоциированный гликопротеиновый комплекс (DGC). Три компонента DGC были восстановлены в
сарколемме (Supplementary Fig. 4 online
Последующие тесты проводились для определения мышечной силы. Мы определили
терапевтический эффект в мышцах 2х месячных mdx мышей.В среднем ко-инфекция вызывала
экспрессию минидистрофина в 49% миофибрилл (от 12% до 98%) (Fig. 3b,c). Процентное
соотношение молодых миофибрилл, как показатель иышечной дегенерации и регенерации было
снижено от 85% при использовании AV.Acceptor.60 до 20% при использовании AV.Donor.60 и
AV.Acceptor.60 (Fig. 3c). При введении AAV вектора, в дистрофин-позитивные волокна были
защищены от повреждения. (Fig. 3b,c).При проведении физиологических испытаний мы наблюдали
значительное увеличение силы в леченных волокнах. P < 0.018 (Fig. 3c, Supplementary Note and
Supplementary Fig. 1 online). Кроме того эти мышцы стали более устойчивы к повреждению при
эксцентричном сокращении (Fig. 3c).
Затем мы оценивали результаты введения вектора в длинный разгибатель пальцев у месячных
мышей. Удивительно, что наибольшая трансдукция наблюдалась через 6 месяцев после инъекции.
(Fig. 3d). В среднем эффективная трансдукция наблюдалась в 40% (от 18% до 73%) (Supplementary
Fig. 5b).Несмотря на достаточно эффективную генную трансформацию мы наблюдали умеренное
улучшение в опытах с эксцентричным сокращением. (Fig. 3d). Другие параметры такие, как
регенерация, фиброз, лейкоцитарная инфильтрация были не изменены. (Supplementary Fig. 5 online).
Эти данные показывают,что раннее лечение может быть решаюшим фактором при лечении
миодистрофии Дюшена. .
Технология использования двух векторов для переноса больших терапевтических генов требует
дальнейших разработок. Данная технология, несмотря на теоретические прогнозы, не так хороша на
лечебном уровне.. Мы определили что кольцевая РНК более эффективна для трансдукции транссплайсинг векторов.15.Уровень поглощения мРНК может повышать генную экспрессию,
обусловленную транс-сплайсинг вектором. Проверяя эту гипотезу, мы исследовали поглощение
мРНК20,21 Мы исследовали несколько видов транс-сплайсинг векторов, по результатам сигналов
dD-ITR от различных интронов по результатам РНК аккумуляции. Мы выявили, что наибольший
уровень аккумуляции РНК наблюдается от интронов 60 и 63, что обуславливало выбор уровня
разделения фрагментов гена. Мы также исследовали продукцию белка при использовании этих двух
типов векторов.
Резюмирую выше сказанное, мы разработали стратегию рационального конструирования AAV
векторов. Эти данные дают толчек к развитию технологии транс-сплайсинг векторов для переноса
больших терапевтических генов, а также использованию сложных механизмов регуляции
транскрипции элементов AAV векторов.

Other Sections▼
Методы
Оценка эндогенных сплайсинговых сигналов
Экзон-интронное соединение у интронов 53, 56, 60 и 63 в человеческом гене дистрофина
амплифицирован ПЦР HEK293 ДНК (Supplementary Methods online). Двойной D-ITR сигнал
полученный из циркулярного AAV генома изолированного из инфецированных мышц15.Миниконструкция была собрана на pcDNA3.1(+) (Invitrogen) (Fig. 1).Общие из плазмид были
генерированы включая (в последовательности экзон/интрон/экзон) p53/53/54, p56/56/57, p60/60/61 и
p63/63/64.Шаблон для RPA проб были амплифицированы для каждой плазмиды и клонированы
pGEM3Z (Promega) (Supplementary Methods online). RPA пробы (для гена дистрофина и
человеческого гена β-актина) произведены in vitro как описано прежде15.
AAV вектор и животные
Было синтезировано два вида транс –сплайсинг векторов согласно эндогенным сплайсинговым
сигналам от интрона 60 и 63. Каждый вид включал донор и акцептор.Промежуточное звено
конструкции были вставлены между прежде описанными множественно клонированными
AAV cis плазмидами (Supplementary Methods online). AAV-6 плазмиды (pMTrep2 и pCMVcap6)
были даны A. Dusty Miller23. Псевдотип рекомбинантного AAV генерирован плазмидной
трансфекцией cis плазмидой, pMTrep2, pCMVcap6 и pHelper (Stratagene) в отношении 1:1:3:3 в
HEK293 клетках. Неочищеннный лизат был очищен CsCl isopycnic ультрацентрифугированием и
титрован.24. Мdx мыши куплены в лаборатории Jackson .Размножение и опыты на мышах описаны
протоколом 24,25
Экспрессия протеинов и морфология
Экспрессия минидистрофина была оценена при помощи реакции иммунофлюоресценции26,27.
Антитела использованные для анализа включали Dys-3 (моноклональные, Novocastra, Newcastle, UK;
1:10 и 1:20 для иммуноблоттинга, специфические для человеческого дистрофина ), Dys-2
(моноклональные, Novocastra, 1:30 и 1:100 для иммуноблоттинга,специфические для человеческого
дистрофина), Mandys 8 (моноклональные, Sigma; 1:100 специфичные для экзона 32) и аффинные
очишеные поликлональные анти дистрофиновые N-терминальные антитела (1:600 )17,25 Компоненты
DGC оценивались с использованием моноклональных антител против β-дистрогликану (Novocastra,
1:50), β-саркогликану (Novocastra, 1:50), dystrobrevin (BD Bioscience; 1:200), и синтрофину (Abcam;
1:200).Эффективность трансдукции была установлена отношением общего числа Dys-3 позитивных
клеток к общему числу миофибрилл при окраске гемотоксилином, эозином
Физиология мышц
Длинный разгибатель пальцев был осторожно изолирован и установлен в растворе Рингера на
двойной серводвигатель. Мышечная стимуляция, сбор данных и их анализ проводились с помощью
программы DMC/DMA. Абсолютная мышечная сила была измерена при 80, 120 и 150Гц.
Определенная сила была рассчитана как отношение абсолютной мышечной силы к площади сечения
мышечного волокна.
Статистический анализ.
Статистический анализ проводился при помощи программы SPSS. Для проверки достоверности
использовался T-test и дисперсионный анализ. Результаты считались достоверны при Р<0,05
Ссылки
1. Duan D, Yue Y, Engelhardt JF. In: Lung Biology in Health and Disease, Gene Therapy in Lung Disease.
Albelda SM, editor. Marcel Dekker Inc.; New York, NY: 2002. pp. 51–92.
2. Kay MA, et al. Evidence for gene transfer and expression of factor IX in haemophilia B patients treated
with an AAV vector. Nat. Genet. 2000;24:257–261. [PubMed]
3. Carter BJ. Adeno-associated virus vectors in clinical trials. Hum. Gene Ther. 2005;16:541–550. [PubMed]
4. Dong JY, Fan PD, Frizzell RA. Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adenoassociated virus. Hum. Gene Ther. 1996;7:2101–2112. [PubMed]
5. Duan D, et al. Circular intermediates of recombinant adeno-associated virus have defined structural
characteristics responsible for long term episomal persistence in muscle. J. Virol. 1998;72:8568–8577.
[PMC free article] [PubMed]
6. Duan D, Yan Z, Yue Y, Engelhardt JF. Structural analysis of adeno-associated virus transduction
intermediates. Virology. 1999;261:8–14. [PubMed]
7. Yue Y, Duan D. Double strand interaction is the predominant pathway for intermolecular recombination
of adeno-associated viral genomes. Virology. 2003;313:1–7. [PubMed]
8. Yan Z, Zhang Y, Duan D, Engelhardt JF. Trans-splicing vectors expand the utility of adeno-associated
virus for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000;97:6716–6721. [PMC free article] [PubMed]
9. Sun L, Li J, Xiao X. Overcoming adeno-associated virus vector size limitation through viral DNA
heterodimerization. Nat. Med. 2000;6:599–602. [PubMed]
10. Nakai H, Storm TA, Kay MA. Increasing the size of rAAV-mediated expression cassettes in vivo by
intermolecular joining of two complementary vectors. Nat. Biotechnol. 2000;18:527–532. see comments.
[PubMed]
11. Duan D, Yue Y, Engelhardt JF. Expanding AAV packaging capacity with trans-splicing or overlapping
vectors: a quantitative comparison. Mol. Ther. 2001;4:383–391. [PubMed]
12. Chao H, Sun L, Bruce A, Xiao X, Walsh CE. Expression of human factor VIII by splicing between
dimerized AAV vectors. Mol. Ther. 2002;5:716–722. [PubMed]
13. Reich SJ, et al. Efficient trans-splicing in the retina expands the utility of adeno-associated virus as a
vector for gene therapy. Hum. Gene Ther. 2003;14:37–44. [PubMed]
14. Yan Z, Zak R, Zhang Y, Engelhardt JF. Inverted terminal repeat sequences are important for
intermolecular recombination and circularization of adeno-associated virus genomes. J. Virol. 2005;79:364–
379. [PMC free article] [PubMed]
15. Xu Z, et al. Trans-splicing adeno-associated viral vector-mediated gene therapy is limited by the
accumulation of spliced mRNA but not by dual vector coinfection efficiency. Hum. Gene Ther.
2004;15:896–905. [PMC free article] [PubMed]
16. England SB, et al. Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin.
Nature. 1990;343:180–182. [PubMed]
17. Harper SQ, et al. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular
dystrophy. Nat. Med. 2002;8:253–261. [PubMed]
18. Sironi M, et al. Analysis of splicing parameters in the dystrophin gene: relevance for physiological and
pathogenetic splicing mechanisms. Hum. Genet. 2001;109:73–84. [PubMed]
19. Chao DS, et al. Selective loss of sarcolemmal nitric oxide synthase in Becker muscular dystrophy. J.
Exp. Med. 1996;184:609–618. [PMC free article] [PubMed]
20. Cartegni L, Chew SL, Krainer AR. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations
that affect splicing. Nat. Rev. Genet. 2002;3:285–298. [PubMed]
21. Ibrahim el C, Schaal TD, Hertel KJ, Reed R, Maniatis T. Serine/arginine-rich protein-dependent
suppression of exon skipping by exonic splicing enhancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005;102:5002–
5007. [PMC free article] [PubMed]
22. Li X, Manley JL. Inactivation of the SR protein splicing factor ASF/SF2 results in genomic instability.
Cell. 2005;122:365–378. [PubMed]
23. Halbert CL, Allen JM, Miller AD. Adeno-associated virus type 6 (aav6) vectors mediate efficient
transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of aav2 vectors. J. Virol.
2001;75:6615–6624. [PMC free article] [PubMed]
24. Duan D, Yue Y, Yan Z, Engelhardt JF. A new dual-vector approach to enhance recombinant adenoassociated virus-mediated gene expression through intermolecular cis activation. Nat. Med. 2000;6:595–598.
[PubMed]
25. Liu M, et al. Adeno-associated virus-mediated micro-dystrophin expression protects young mdx muscle
from contraction-induced injury. Mol. Ther. 2005;11:245–256. [PMC free article] [PubMed]
26. Yue Y, et al. Microdystrophin gene therapy of cardiomyopathy restores dystrophin-glycoprotein
complex and improves sarcolemma integrity in the mdx mouse heart. Circulation. 2003;108:1626–1632.
[PMC free article] [PubMed]
27. Yue Y, Skimming JW, Liu M, Strawn T, Duan D. Full-length dystrophin expression in half of the heart
cells ameliorates beta-isoproterenol-induced cardiomyopathy in mdx mice. Hum. Mol. Genet.
2004;13:1669–1675. [PMC free article] [PubMed]
28. Ervasti JM, Campbell KP. Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex. Cell.
1991;66:1121–1131. [PubMed]