Глава 1. ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ,
ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
СВЕРДЛОВСКОЙ ОБЛАСТИ «ЦЕНТР СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ВИДОВ
МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ
«ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКИХ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ»
На правах рукописи
ЦАУР Григорий Анатольевич
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И МОНИТОРИНГ
МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ В ЛЕЧЕНИИ ОСТРЫХ
ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
14.01.21 – Гематология и переливание крови
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор
Румянцев Сергей Александрович
доктор медицинских наук, профессор
Цвиренко Сергей Васильевич
Екатеринбург 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 6
Глава 1. ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ) ............................................................................................................. 16
1.1. Злокачественные новообразования у детей первого года жизни ............ 16
1.2. Пренатальное происхождение острых лейкозов у детей первого года
жизни .................................................................................................................... 17
1.3. Эпидемиология острых лейкозов у детей первого года жизни ............... 20
1.4. Острый лимфобластный лейкоз у детей первого года жизни ................. 21
1.4.1. Клинико-лабораторные показатели .............................................. 21
1.4.2. Цитогенетические исследования ................................................... 27
1.4.3. Иммунофенотипическая характеристика ..................................... 29
1.4.4. Результаты терапии ........................................................................ 32
1.5. Острый миелоидный лейкоз у детей первого года жизни ....................... 35
1.5.1. Клинико-лабораторные показатели .............................................. 35
1.5.2. Цитогенетические исследования ................................................... 38
1.5.3. Иммунофенотипическая характеристика ..................................... 44
1.5.4. Результаты терапии ........................................................................ 45
1.6. Структура и функции гена MLL ................................................................. 46
1.7. Перестройки гена MLL ................................................................................ 53
1.7.1. Механизм действия химерных генов с участием MLL ............... 53
1.7.2. Спектр перестроек 11q23/MLL ...................................................... 55
1.7.3. Прогностическое значение перестроек 11q23/MLL .................... 75
1.7.4. Методы выявления перестроек 11q23/MLL ................................. 76
1.8. Прогностическое значение ответа опухолевых клеток на интенсивную
химиотерапию. Определение минимальной остаточной болезни при остром
лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни ..................................... 81
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................... 93
2.1. Характеристика пациентов.......................................................................... 93
3
2.2. Методы обследования пациентов ............................................................... 97
2.2.1. Иммунофенотипирование .............................................................. 97
2.2.2. Цитогенетическое исследование ................................................... 99
2.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ......................................... 100
2.2.4. Обратно-транскриптазная ПЦР ................................................... 102
2.2.5. Секвенирование ............................................................................ 106
2.2.6. Длинная инвертированная ПЦР .................................................. 107
2.2.7. Определение минимальной остаточной болезни в кДНК
методом ПЦР в режиме реального времени ........................................ 107
2.2.8. Определение минимальной остаточной болезни путем
выявления химерных генов с участием MLL в геномной ДНК методом
ПЦР в режиме реального времени ........................................................ 109
2.3. Статистическая обработка полученных данных ..................................... 120
Глава 3. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ
ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ ......................................................................................... 121
3.1. Цитогенетическая характеристика острого лимфобластного лейкоза . 121
3.2. Перестройки 11q23/MLL при остром лимфобластном лейкозе ............ 126
3.3. Цитогенетическая характеристика острого миелоидного лейкоза ....... 135
3.4 Выявление транслокации t(7;12)(q36;p12) ............................................... 141
3.5. Перестройки 11q23/MLL при остром миелоидном лейкозе................... 147
3.6. Цитогенетическая характеристика других вариантов острого лейкоза 158
3.7. Перестройки 11q23/MLL при других вариантах острого лейкоза......... 158
3.8. Использование метода флуоресцентной гибридизации in situ для
выявления перестроек гена MLL ..................................................................... 159
3.9. Структура химерных генов с участием MLL и ее взаимосвязь с
клинико-лабораторными характеристиками острых лейкозов ................. 172
Глава 4. ДИАГНОСТИКА РЕДКИХ ПЕРЕСТРОЕК 11q23/MLL ПРИ ОСТРЫХ
ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ ................................................. 184
4.1. Транслокация t(11;19)(q23;p13) / MLL-MYO1F ....................................... 184
4
4.2. Транслокации t(2;11)(p21;q23) и t(X;11)(q24;q23) / MLL-SEPT6 .......... 188
4.3. Транслокация t(11;17)(q23;q25) / MLL-SEPT9......................................... 190
4.4. Частичный тандемный повтор в гене MLL (MLL-PTD) ......................... 190
4.5. Транслокация t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3 ............................................ 192
4.6. Транслокация t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 ........................................... 195
4.7. Транслокация t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 ........................................ 197
4.8. Транслокация t(1;11)(q21;q23) / MLL-MLLT11 ........................................ 198
Глава
5.
ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА
ОСТРЫХ
ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ ................................................. 201
5.1. Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного
лейкоза ................................................................................................................ 201
5.2. Иммунофенотипическая
характеристика
острого
миелоидного
лейкоза ................................................................................................................ 204
5.3. Возможность использования экспрессии NG2 в качестве маркера для
мониторинга минимальной остаточной болезни ........................................... 205
Глава 6. ДИАГНОСТИКА МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ ......... 207
6.1. Определение минимальной остаточной болезни методом ПЦР в режиме
реального времени у пациентов с наличием химерных гена и транскрипта
MLL-EPS15 ......................................................................................................... 207
6.2.
Сравнительный
остаточной
болезни
транскриптазной
ПЦР
анализ
результатов
методами
у
детей
проточной
первого
диагностики
цитометрии
года
жизни
минимальной
и
обратноc
острым
лимфобластным лейкозом и перестройками 11q23/MLL .............................. 215
6.3. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в костном
мозге, выявленной методами обратно-транскриптазной ПЦР и ПЦР в
режиме реального времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей
первого года жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby ......... 217
6.4. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в
периферической крови, выявленной методом ПЦР в режиме реального
времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни,
5
получающих лечение по протоколу MLL-Baby............................................. 229
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 237
ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 242
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 244
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ .................................... 245
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .............................. 246
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 249
6
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Среди всех онкологических заболеваний у детей первого года жизни острые
лейкозы
(ОЛ)
по
частоте
встречаемости
находятся
на
втором
месте:
заболеваемость в разных странах мира колеблется в пределах 30,0-32,0 на 1 млн.
детcкого
населения
соответствующего
возраста
[10,191,255].
Острый
лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) у детей первого года жизни составляет от 2,5 до 5%
всех случаев ОЛЛ у детей [41,190,348,373]. На долю острого миелоидного лейкоза
(ОМЛ) у детей первого года жизни приходится 7-13% от общего числа случаев
ОМЛ у детей [48,162,277,383,387,454].
В настоящее время в Российской Федерации (РФ) достигнуты значительные
успехи в лечении ОЛЛ и ОМЛ у детей старше 1 года, неуклонно повышается
бессобытийная (БСВ) и общая выживаемость (ОВ) пациентов, снижается частота
развития рецидивов [4,6,13,15]. В то же время результаты терапии ОЛЛ у детей
первого года жизни остаются неудовлетворительными: БСВ редко превышает
45%,
а
основной
причиной
неудачи
терапии
На
[14,33,58,224,237,238,335,348,396,445,455].
эффективным
способом
прогнозировать
определение
минимальной
остаточной
являются
сегодняшний
развитие
болезни
день
рецидивов
(МОБ).
Для
рецидивы
наиболее
считается
этой
цели
применяются такие высокочувствительные методы клинической лабораторной
диагностики как многоцветная проточная цитометрия и различные варианты
полимеразной цепной реакции (ПЦР). Однако биологические особенности ОЛ у
детей первого года жизни требуют создания специальных методов выявления
МОБ с последующим сравнительным анализом полученных результатов между
собой и оценкой вероятности развития рецидивов.
Актуальность создания системы мониторинга МОБ у детей этой возрастной
группы обусловлена еще и тем, что в РФ Л.Г. Фечиной разработан оригинальный
отечественный протокол MLL-Baby для терапии ОЛЛ у детей первого года жизни
7
[108], который предусматривает многократное определение МОБ. Это, в свою
очередь, обуславливает необходимость установления роли наличия и величины
МОБ в различные точки наблюдения для прогнозирования исходов терапии.
Определение МОБ невозможно без всесторонней оценки инициальных
характеристик лейкозных клеток, включая наличие и тип перестройки гена MLL
(myeloid-lymphoid
leukemia,
mixed-lineage
leukemia),
расположенного
в
хромосомном районе 11q23 [99,214,448], других молекулярно-генетических и
цитогенетических характеристик ОЛ, а также иммунофенотипа опухолевых
бластов с использованием стандартного цитогенетического исследования,
флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), ПЦР, проточной цитометрии. Более
того, считается, что целый ряд объективных факторов затрудняют диагностику
ОЛ у детей первого года жизни: криптические варианты транслокаций, большое
разнообразие перестроек 11q23/MLL, существование различных типов химерных
транскриптов с участием гена MLL, нестабильность иммунофенотипа опухолевых
бластов, однако изучению этих аспектов посвящены лишь единичные работы
[231,320,344,378].
Показано, что клинические особенности ОЛ и чувствительность к терапии
зависят не только от наличия перестройки гена MLL, но и от его гена-партнера
[325,336], которых на сегодняшний день известно 79 [433]. Наиболее частыми
партнерами MLL являются гены AF4, MLLT1 MLLT3, MLLT10, MLLT4, ELL, на
долю которых суммарно приходится около 85% всех случаев MLL-позитивных
ОЛ, как у детей, так и у взрослых [289,320,433]. В то же время, за счет оставшихся
15% и достигается большое разнообразие химерных генов с участием MLL, и
именно их биологические особенности и клинические характеристики ОЛ,
ассоциированных с редкими перестройками гена MLL, являются наименее
изученными. Традиционно считается, что наиболее неблагоприятной при ОЛЛ
является транслокация t(4;11)/MLL-AF4, в то время как прогноз для пациентов с
t(11;19)/MLL-MLLT1 и t(9;11)/MLL-MLLT3 несколько лучше [336]. С другой
стороны, в рамках проспективного исследования Interfant-99 пациенты с любой из
вышеперечисленных транслокаций имели сходную величину бессобытийной
8
выживаемости [33]. Наиболее неблагоприятными транслокациями при ОМЛ
являются t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 и t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4 [325].
Ранее изучение ОЛ у детей первого года жизни часто сводилось к
исследованию характеристик пациентов, имеющих перестройки 11q23/MLL, и не
уделялось должного внимания группе пациентов без данных перестроек. Вместе с
тем, помимо перестроек 11q23/MLL в исследуемой возрастной группе могут
выявляться и другие цитогенетические и молекулярно-генетические аберрации,
среди которых особый интерес представляет транслокация t(7;12)(q36;p13) [216],
которая специфична для ОМЛ у детей первого года жизни, ассоциирована с
неблагоприятным прогнозом заболевания и во многих случаях является
криптической.
Таким
образом,
инициальных
оценка
МОБ,
базирующаяся
цитогенетических,
на
основе
анализа
молекулярно-генетических
и
иммунофенотипических свойств опухолевых бластов при ОЛ у детей первого
года жизни является актуальным вопросом детской гематологии/онкологии.
Степень разработанности темы исследования
Комплексная характеристика ОЛ у детей первого года жизни с
использованием
данных
цитогенетики,
молекулярной
генетики,
FISH,
иммунофенотипирования как при наличии перестроек 11q23/MLL, так и при их
отсутствии встречается крайне редко [231], а в нашей стране ранее не
проводилась. Нерешенными остаются вопросы о частоте встречаемости и спектре
перестроек 11q23/MLL, их взаимосвязи с возрастом, структуре химерных генов с
участием MLL, характеристике иммунофенотипа опухолевых бластов при ОЛЛ и
ОМЛ. Выявление МОБ с применением химерных транскриптов
в данной
возрастной группе ранее не проводилось. Не выполнялась оценка сопоставимости
результатов мониторинга МОБ методами проточной цитометрии и обратнотранскриптазной ПЦР. Роль МОБ в оценке прогноза при лечении по российскому
мультицентровому протоколу MLL-Baby неизвестна.
9
Цель исследования
Разработать и внедрить в практику систему определения минимальной
остаточной болезни для мониторинга лечения острых лейкозов у детей первого
года
жизни
на
основе
инициальных
молекулярно-генетических
и
иммунологических характеристик бластных клеток.
Задачи исследования
1. Изучить кариотип опухолевых бластов, а также спектр и частоту
перестроек 11q23/MLL при ОЛ у детей первого года жизни.
2. Найти взаимосвязь между возрастом и выявлением перестроек
11q23/MLL при ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни.
3. Установить взаимосвязь между структурой химерных генов с участием
MLL и клинико-лабораторными характеристиками ОЛ у детей первого года
жизни.
4. Разработать
методический
подход
для
выявления
транслокации
t(7;12)(q36;p13).
5. Дать характеристику иммунофенотипу опухолевых бластов при ОЛЛ и
ОМЛ у детей первого года жизни в зависимости от наличия перестроек
11q23/MLL.
6. Оценить возможность использования антигена NG2 для мониторинга
МОБ при ОЛЛ из B-линейных предшественников.
7. Провести сравнительный анализ двух методов определения МОБ при
ОЛЛ у детей первого года жизни - проточной цитометрии и обратнотранскриптазной
полимеразной
цепной
реакции
с
детекцией
химерных
транскриптов с участием MLL.
8. Оценить связь МОБ в костном мозге с бессобытийной выживаемостью и
развитием рецидивов при терапии ОЛЛ у детей первого года жизни по протоколу
MLL-Baby.
10
9. Оценить роль использования периферической крови для определения
МОБ у детей первого года жизни с ОЛЛ, получающих лечение по протоколу
MLL-Baby.
Научная новизна исследования
Впервые в РФ в группе пациентов первого года жизни с ОЛ определены
частота и спектр перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ и ОМЛ, а также описаны
различные механизмы формирования химерных генов с участием MLL, включая
реципрокные транслокации (73,6%), транс-сплайсинг (15,3%) и инсерции (11,1%).
Были выявлены закономерности в локализации точек разрыва в ДНК гена
MLL в зависимости от типа ОЛ у детей первого года жизни. При ОЛЛ наиболее
частой зоной разрыва в ДНК гена MLL является 11-й интрон, а при ОМЛ — 9-й
интрон.
Впервые в нашей стране были описаны различные типы химерных
транскриптов в зависимости от зоны слияния в MLL и генах-партнерах. У
пациентов с ОЛЛ выявлено 9 транскриптных вариантов химерного гена MLL-AF4,
5 транскриптных вариантов MLL-MLLT3, 3 — MLL-MLLT1, 2 — MLL-EPS15.
Среди различных транскриптов MLL-AF4 наиболее часто был обнаружен вариант
со слиянием 11-го экзона гена MLL и 4-го экзона AF4 (e11e4) – в 8 случаях из 26
(30,8%). Среди 5 транскриптных вариантов химерного гена MLL-MLLT3
преобладал e11e6. Из 14 пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 7
имели вариант с местами слияния в 11-м экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLT1, 6
— вариант е10е2 и двое — е9е2. При ОМЛ оценка структуры химерных
транскриптов выявила по 4 транскриптных варианта MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10
и 1 — MLL-MLLT11. У пациентов с MLL-MLLT3 преобладал вариант e11e6, также
обнаруженный в 4 из 7 случаев. Среди пациентов с наличием MLL-MLLT10 было
выявлено по 2 случая химерных транскриптов е8е15, е9е9, e9е10 и 1 случай e9e4.
Среди генов-партнеров MLL наиболее разнообразна была локализация зон
слияния в генах AF4 (при ОЛЛ) и MLLT10 (при ОМЛ).
11
Впервые определена частота встречаемости перестроек гена MLL с
одновременной делецией 3’-конца гена MLL при ОЛ у детей первого года жизни,
которая составляет 7,6%.
Охарактеризован иммунофенотип опухолевых бластов у детей первого года
жизни с ОЛЛ и ОМЛ, который ассоциирован с наличием перестроек 11q23/MLL.
Впервые установлена негативная прогностическая роль сохранения МОБ в
костном мозге при ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по
протоколу MLL-Baby.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан алгоритм диагностики и определения МОБ, позволяющий
выявлять любую перестройку 11q23/MLL, а также проводить оценку МОБ при
острых лейкозах у детей первого года жизни.
Показано, что длительное сохранение МОБ в костном мозге при ОЛЛ у
детей первого года жизни, получающих терапию по протоколу MLL-Baby,
связано с высокой вероятностью развития рецидива.
Детально охарактеризованы частые и редкие перестройки 11q23/MLL. При
ОЛЛ установлена взаимосвязь возраста пациентов с выявлением перестроек
11q23/MLL.
Разработана комбинация праймеров и флуоресцентных зондов для
выявления химерных транскриптов MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11,
MLL-MYO1F методом ПЦР в режиме реального времени.
Показана возможность выявления транслокации t(7;12)(q36;p13) методом
FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда.
Описаны
аберрации
иммунофенотипа,
выявление
которых
дает
возможность предположить наличие перестроек 11q23/MLL и требует их
верификации с использованием всех доступных молекулярно-генетических
методов.
Использование предложенного алгоритма мониторинга МОБ при ОЛ у
12
детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых
бластов дает возможность надежно выявлять перестройки 11q23/MLL, в том числе
редкие, ранее неописанные, что позволяет развивать знания о биологии
опухолевого процесса и, тем самым, совершенствовать терапию.
Эффективность разработанного диагностического метода у детей первого
года жизни позволяет считать перспективным его использование для улучшения
результатов лечения ОЛ у пациентов различных возрастных групп.
Методология и методы исследования
В работе проанализированы данные 254 пациентов в возрасте от 1 до 365
дней с установленным диагнозом ОЛ в период с 08.06.1999 по 24.03.2013.
Для проведения исследования применялись различные методы клинической
лабораторной
диагностики.
цитогенетический
Для
анализ,
первичной
диагностики
иммунофенотипирование,
использовались
флуоресцентная
гибридизация in situ, различные варианты ПЦР, секвенирование нуклеотидных
последовательностей.
Определение
МОБ
выполняли
методами
обратно-
транскриптазной полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени, а также многоцветной проточной цитометрией. Для
статистической обработки рассчитывали адекватные поставленным задачам
непараметрические критерии, исходя из характера сравниваемых величин и
количества пациентов в группах.
Положения, выносимые на защиту
1. С целью поиска маркеров для последующего мониторинга МОБ
необходимо использование комплекса методов клинической лабораторной
диагностики, включая проточную цитометрию, стандартное цитогенетическое
исследование, флуоресцентную гибридизацию in situ и различные варианты
полимеразной цепной реакции.
13
2. Предложенный комплексный подход к определению МОБ показал
высокую
качественную
сопоставимость
между
результатами
проточной
цитометрии и обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции.
3. Использование данных определения МОБ позволило прогнозировать
результаты лечения детей первого года жизни с ОЛЛ по протоколу MLL-Baby.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности полученных результатов основана на достаточном
количестве выполненных исследований с использованием современных методов
клинической лабораторной диагностики, применении коммерчески доступных
калибраторов и контрольных материалов, участии в международных системах
контроля качества, а также на использовании адекватных сформулированным
задачам методов статистической обработки данных с применением специального
программного обеспечения.
Материалы работы были представлены на V-IX Российских симпозиумах
«Биологические
заболеваний»
основы
(Москва,
терапии
2007,
онкологических
2009,
2011,
2013,
и
гематологических
2015),
Совещании
мультицентровой группы «Москва-Берлин» по изучению острых лейкозов у детей
(Москва,
2007),
Х
Международной
научно-практической
конференции
«Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 2007), 4 м
съезде Детских онкологов России (Москва, 2008), I Всероссийском конгрессе
«Генетика опухолей кроветворной системы» (Ростов-на-Дону, 2010), Российском
конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической
медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010),
Национальных
днях Лабораторной медицины России (Москва, 2011), Научной конференции
«Актуальные вопросы онкогенетики» (Москва, 2011), XV и XVII Российских
онкологических конгрессах, (Москва, 2011, 2013), Всероссийской научнопрактической
конференции
«Клиническая
лабораторная
диагностика
в
гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2011), I и II Конгрессах
14
гематологов России (Москва, 2012, 2014), Всероссийской научно-практической
конференции
«Молекулярно-генетические
и
иммуногенетические
методы
диагностики в практике врача гематолога» (Санкт-Петербург, 2013), IV
Межрегиональном совещании Национального общества детских гематологов и
онкологов (Москва,2014), 12-19м конгрессах Европейской гематологической
ассоциации (Вена, 2007; Берлин, 2008; Копенгаген, 2009; Барселона, 2010;
Лондон, 2011; Амстердам, 2012; Стокгольм, 2013; Милан, 2014), 49-56й
ежегодных конференциях Американского общества гематологов (Атланта, 2007;
Сан-Франциско, 2008; Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010; Сан Диего, 2011;
Атланта, 2012; Новый Орлеан, 2013, Сан-Франциско, 2014), 39-42м и 44-46м
конгрессах Международного общества детской онкологии (Мумбай, 2007,
Берлин, 2008, Сан-Паулу, 2009, Бостон, 2010, Лондон, 2012, Гонконг 2013,
Торонто, 2014).
По теме диссертации опубликовано 17 статей, в том числе 15 — в изданиях,
рекомендованных в перечне Высшей Аттестационной Комиссии Министерства
образования и науки РФ, а также 1 статья в зарубежном журнале.
Личный вклад автора
Личный вклад состоит в детальном планировании научной работы,
тщательном анализе научной литературы, посвященной проблеме ОЛ у детей
первого года жизни. Автор принимал непосредственное участие подборе,
отработке условий проведения молекулярно-генетических исследований методом
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Автором были
сформированы базы данных по каждому из направлений диссертационной
работы, проведены статистическая обработка полученных данных, обобщение и
интерпретация полученных результатов, сформулированы научно обоснованные
выводы,
а
также
рекомендации,
публикации.
положения,
написаны
текст
выносимые
диссертации
на
и
защиту,
и
практические
автореферата,
основные
15
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа, включая цели, задачи, научную новизну, предмет
исследования,
а
также
полученные
результаты,
соответствует
паспорту
специальности 14.01.21 – «Гематология и переливание крови», в том числе,
указанных в п.1 «Изучение кроветворения и состава крови в эксперименте и у
человека
…
с
использованием
морфологических,
гистохимических,
иммунологических, генетических, молекулярно-биологических, культуральных и
других методов исследований», в п. 3 «Этиопатогенетические механизмы
становления и развития наследственных и приобретенных болезней системы
крови с использованием морфологических, биохимических, иммунологических,
генетических,
молекулярно-биологических
и
других,
в
том
числе
экспериментальных, методов исследований»; п.4 «Диагностика и клиника
наследственных
и
приобретенных
патологических
состояний,
привлечением
широкого
болезней
возникающих
спектра
в
системы
крови,
экстремальных
лабораторных,
а
также
условиях,
клинических
с
и
инструментальных исследований, с использованием методов статистического
анализа и обобщения клинических данных».
16
Глава 1. ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Злокачественные новообразования у детей первого года жизни
По данным американской Программы по наблюдению, эпидемиологии и
отдаленным
результатам
онкологической
заболеваемости
и
смертности
(Surveillance, Epidemiology and End Results - SEER) онкологические заболевания у
детей первого года жизни составляют около 10% всех злокачественных
новообразований среди детей в возрасте младше 15 лет, а заболеваемость
находится на уровне 233 случая на 1 млн., в том числе 232 случая на 1 млн.
мальчиков и 234 случая на 1 млн. девочек (Рисунок 1) [191].
Рисунок
1.
Ежегодная
средняя
заболеваемость
злокачественными
новообразованиями детей обоих полов в возрасте от 0 до 15 лет в США,
рассчитанная SEER за период 1976-1984 и 1986-1994 годы. Дается по J. Gurney et
al. [191].
Дети первого года жизни — это единственная возрастная группа среди
17
детей, в которой девочки болеют с той же частотой, что и мальчики. Показана
неоднородность количества диагностируемых злокачественных новообразований
на протяжении первого года жизни. Начиная со второго полугодия, наблюдается
относительное увеличение заболеваемости лейкозами, на долю которых на 7-м
месяце жизни приходится более 13% от всех случаев лейкозов у детей младше 1
года, и только 6% случаев нейробластомы (Рисунок 2).
Рисунок
2.
Процентное
распределение
выявления
злокачественных
новообразований по месяцам в течение первого года. Приведены данные SEER за
период 1976-1984 и 1986-1994 годы. Дается по J. Gurney et al. [191].
Среди всех онкологических заболеваний у детей первого года жизни
лейкозы находятся на втором месте после нейробластомы [10,191,255]. Группа
лейкозов объединяет в себе несколько нозологий, наиболее частыми из которых
являются ОЛЛ и ОМЛ.
1.2. Пренатальное происхождение острых лейкозов у детей первого года жизни
Острые
лейкозы
(ОЛ)
—
группа
злокачественных
заболеваний
18
кроветворной ткани, характеризующихся поражением костного мозга незрелыми
кроветворными (бластными) клетками с вытеснением ими нормальных элементов
и инфильтрацией различных органов и тканей [11]. В ряде случаев ОЛ у детей
первого года жизни могут развиваться уже in utero [241,349]. Наиболее
типичными
ультразвуковыми
обнаруживаемые
во
время
признаками
врожденного
беременности
водянка,
лейкоза
являются
многоводие
и/или
гепатоспленомегалия плода [241], несколько реже применяются такие показатели
как повышение индекса пульсации в пупочной артерии с сопутствующим
снижением индекса пульсации средней мозговой артерии, локальные выпоты в
полость плевры, перикард, брюшинную полость [349]. В то же время необходимо
отметить, что сходные ультразвуковые признаки (водянка плода неимунной
природы и гепатоспленомегалия) могут являться признаками внутриутробной
инфекции [395]. Наиболее ранней датой, для которой имеется морфологическое
подтверждение диагноза ОЛ, является 30 неделя гестации [349].
H.Isaacs приводит описание 145 случаев перинатально диагностированных
ОЛ, которые были выявлены либо внутриутробно, либо в неонатальном периоде
[241]. Им было показано, что более половины случаев (81, 56%) приходилось на
ОМЛ, а в 9 случаях (6%) был выявлен острый бифенотипический лейкоз.
Соотношение мальчиков и девочек в описываемой группе составляло 1:1.
Характерными клиническими признаками данной группы пациентов являлись
гепатоспленомегалия,
частое
поражение
центральной
нервной
системы
(нейролейкоз), лейкемиды, высокий инициальный лейкоцитоз. 58% пациентов с
ОМЛ имели острый миеломонобластный и острый монобластный лейкозы (М4 и
М5 варианты по FAB классификации), а 18% — острый мегакариобластный
лейкоз (ОМЛ М7). Частота мертворождений у пациентов с ОЛ без синдрома
Дауна составила 3% (5 из 145 случаев), что несколько ниже, чем у 69 пациентов с
синдромом Дауна (включая транзиторный миелопролиферативный синдром), где
частота мертворождений была 7% (5 из 69 случаев).
Еще одним доказательством пренатального происхождения ОЛ является
сходство ОЛ, возникших у монозиготных близнецов в течение первого года
19
жизни. Это подтверждается наличием одинаковыми клональными перестройками
в
бластных
клетках,
исследовании,
а
выявленными
также
при
стандартном
аналогичными
цитогенетическом
молекулярно-генетическими
характеристиками химерных генов: идентичные точки разрыва в ДНК химерных
генов,
идентичные
индивидуальные
перестройки
генов
тяжелых
цепей
иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов (Ig и TCR) [227,256]. Считается,
что возможной причиной возникновения идентичных ОЛ у монозиготных
близнецов является наличие сосудистых анастомозов внутри монохорионической
плаценты [412], благодаря чему опухоль, возникнув во внутриутробном периоде у
одного плода, может диссеменировать во второй [87,468]. Однако описан также
случай возникновения ОЛ и у дихорионических близнецов на первом году жизни,
но, следует подчеркнуть, что в этом случае, при наличии идентичной
транслокации t(11;19)(q23;p13.3) с вовлечением в обоих случаях гена MLL, авторы
описали различающиеся перестройки гена IgH [98]. Также в пользу пренатального
происхождения ОЛ свидетельствует выявление идентичной нуклеотидной
последовательности химерного гена MLL-AF4 в опухолевых бластах пациента и
сухих пятнах его же пуповинной крови, взятых за несколько лет до клинического
дебюта ОЛ [63].
Характерной чертой ОЛ, который развивается в течение первого года жизни
у монозиготных близнецов, является близкая к 100% вероятность развития ОЛ у
второго близнеца из пары, в то время как у более старших детей эта величина
составляет примерно 10% [256]. В литературе приводятся лишь единичные
описания об отсутствии развития ОЛ в паре монозиготных близнецов, у одного из
которых поставлен диагноз ОЛ. Возможным объяснением этого феномена авторы
посчитали тяжелую вирус-индуцированную нейтропению, которая привела к
самопроизвольной редукции клона, несущего химерный ген MLL-MLLT1 [135]. В
то же время последний случай является еще одним подтверждением теории двух
последовательных генетических событий (двух «ударов»), предложенной А.
Кнудсоном
для
объяснения
новообразований [249].
механизмов
возникновения
злокачественных
20
1.3. Эпидемиология острых лейкозов у детей первого года жизни
По данным Автоматизированной информационной системы онкологических
заболеваний у детей (Automated Childhood Cancer Information System–ACCIS)
заболеваемость ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни, проживающих в
европейских странах, за период с 1988 по 1997 составила 30,3 на 1 млн. населения
[255]. Несколько более высокие показатели приводит Программа по наблюдению,
эпидемиологии и отдаленным результатам онкологической заболеваемости и
смертности: заболеваемость ОЛЛ и ОМЛ в США у детей младше 1 года по их
данным составила 32,0 на 1 млн. населения [191]. В то же время заболеваемость
ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни в Республике Беларусь, очень близка к
европейской: 30,0 на 1 млн. населения [10].
Несмотря на имеющиеся цифровые различия в уровнях заболеваемости
ОЛЛ и ОМЛ среди девочек и мальчиков первого года жизни между странами и
континентами
везде
показано
преобладание
среди
заболевших
девочек
[10,191,255]. Так, при ОЛЛ соотношение девочек и мальчиков колебалось от 1,04
в европейских странах [255] до 1,40 в США [191]. При ОМЛ получен несколько
меньший
разброс
данных:
соотношение
девочек
и
мальчиков
по
консолидированным европейским данным 1,13 [255], по американским — 1,26
[191].
К сожалению, аналогичных данных для Российской Федерации найти не
удалось, в силу того, что пациенты этой возрастной группы объединяются со
старшими детьми, и представляются в категории 0-4 года [5]. Используя данные
Всероссийской переписи населения 2010 года, согласно которой число детей
первого года жизни составляло 1 641 644 человек [3], и грубые показатели
заболеваемости,
приводимые
европейской
системой
Автоматизированной
информационной системой злокачественных новообразований у детей [255],
можно предположить, что ежегодно в РФ должно регистрироваться 27-28 случаев
ОЛЛ и 20-21 случай ОМЛ у детей исследуемой возрастной группы.
21
1.4. Острый лимфобластный лейкоз у детей первого года жизни
1.4.1. Клинико-лабораторные показатели
ОЛЛ у детей первого года жизни составляет по разным данным от 2,5 до 5%
всех случаев ОЛЛ у детей [41,190,348,373]. Наиболее распространенными
симптомами ОЛЛ в данной возрастной группе являются гепатоспленомегалия и
нейролейкоз, которые выявляются у детей первого года жизни достоверно более
часто, по сравнению с детьми других возрастных групп [41,69,89,348,357,373].
Среди лабораторных показателей следует выделить высокий инициальный
лейкоцитоз, CD10-негативный иммунофенотип бластных клеток c коэкспрессией
миелоидных (CD15, CD65) и нейральных (NG2) антигенов, а также и наличие
перестроек гена MLL [69,231].
Увеличение
экстрамедуллярной
печени
массы
и
селезенки
опухоли.
является
Показано,
что
следствием
частота
большой
выявления
гепатоспленомегалии достоверно выше у пациентов первого года жизни с ОЛЛ по
сравнению с детьми старше 1 года [41,89,373], и может достигать 73-81%
[58,238,373].
Несмотря
на
высокую
частоту
встречаемости,
у
гепатоспленомегалии не выявлено самостоятельного прогностического значения,
ни в самостоятельном виде [356], ни в качестве интегрального показателя [348],
впервые предложенного группой BFM в виде т.н. «Risikofaktor» («фактор риска
BFM») [37].
Инициальное поражение ЦНС опухолевыми бластами — нейролейкоз — по
данным разных исследовательских групп может выявляться в 9-24% случаев ОЛЛ
у
детей
первого
года
жизни
[33,58,90,237,238,335,348,357,396,456],
что
достоверно выше, чем у детей старше 1 года [41,89,357]. Интересно отметить, что
не было найдено взаимосвязи между нейролейкозом и уровнем инициального
лейкоцитоза [41]. Прогностическое значение нейролейкоза при ОЛЛ у детей
первого года неоднозначно. Так, в протоколах группы BFM [348], и Японской
группы по изучению ОЛЛ у детей первого года жизни — протоколы MLL-96 и
22
MLL-98 [335] — показана связь инициального нейролейкоза с неблагоприятным
прогнозом, в то же время, в протоколах консорциума Дана-Фарбер (DFCI) [237],
американских исследовательских групп CCG [58,456] и POG [238,445],
британской MRC [455], а также международном кооперативном протоколе
Interfant-99 [33] связи с прогнозом не было выявлено.
Гиперлейкоцитоз также является одним их характерных признаков ОЛЛ у
детей первого года жизни. Он может достигать величин более 1 млн×109/Л
[16,238]. От 62 до 69% случаев ОЛЛ у детей в возрасте младше 1 года протекают с
лейкоцитозом выше 50×109/Л [41,58,238,455,456], а 44-61% случаев — с
лейкоцитозом выше 100×109/Л [33,41,237,238,335,348,455]. По данным разных
исследовательских
групп
прогностическое
значение
порогового
уровня
инициального лейкоцитоза равного 100×109/Л неоднозначно. Это значение
оказалось прогностически значимым для пациентов, получавших терапию по
протоколам DFCI [237], CCG [41], но, в тоже время, оно находилось на границе
статистической значимости для протокола BFM [348]. Дальнейшие попытки
разграничить пациентов с различными исходами терапии привели к выделению
пороговых значений инициального уровня лейкоцитов равных 200×109/Л [455] и
даже 300×109/Л, причем на долю последнего приходится около четверти (19-29%)
случаев ОЛЛ у детей первого года жизни [69,335,396]. Однако и этот уровень
оказался прогностически незначим для пациентов, получавших терапию по
разработанным в Японии протоколам MLL-96 и MLL-98 [335].
Интерес представляет и тот факт, что уровень лейкоцитов у пациентов с
наличием перестроек гена MLL был достоверно выше по сравнению с
пациентами, у которых перестройки MLL отсутствуют [166,335]
Возраст на момент установления диагноза ОЛЛ также является важным
клиническим фактором риска. Традиционно пациентов первого года жизни
подразделяют либо
на 2
возрастные
группы
(0-6 мес.
и 6-12 мес.)
[16,224,237,238,348,396,455], либо на 3 (0-3 мес., 3-6 мес., 6-12 мес.) [58,335,456],
и в редких случаях — на 4 [445], что связано с существующим мнением о том, что
чем младше пациент, тем менее благоприятен его прогноз [91,373]. Косвенно это
23
подтверждается и тем фактом, что врожденные ОЛЛ, диагностируемые на
протяжении неонатального периода, имеют наименее благоприятный прогноз
[107,334]. В крупнейшем из опубликованных на сегодняшний день исследований
по лечению ОЛЛ у детей первого года жизни – Interfant-99 — пациентов также
разделяли на 4 группы по 3 мес. каждая [33]. Однако, даже при включении в
исследование 482 пациентов, авторы не смогли показать различия в прогнозе
между пациентами в возрасте 6-9 мес. и 9-12 мес. Более того, при выделении
факторов прогноза они рекомендовали традиционное деление — старше/младше 6
мес., подтвердив результаты ранее опубликованных исследований [41,348,455].
Необходимо
отметить,
что
ОЛЛ
у
детей
первого
года
жизни,
ассоциированный с перестройками гена MLL, диагностируется в более раннем
возрасте, чем MLL-негативный ОЛЛ [288]. Кроме этого, было показано, что
разделение по возрасту на группы старше и младше 6 мес., сохраняет свою
прогностическую значимость и при изолированной оценке исходов пациентов с
различными
видами
перестроек
гена
MLL
[91].
Сохраняет
ли
свою
прогностическую значимость возраст при отсутствии перестроек гена MLL до
конца неизвестно, так как существуют лишь единичные работы, оценивающие
исходы терапии в этой группе пациентов, и, более того, количество пациентов
младше 6 мес. в них очень низко [234].
Второй вопрос, связанный с возрастом — частота развития ОЛЛ в
зависимости
от
возраста.
В
относительно
небольших
по
численности
исследованиях были показаны колебания в обе стороны числа пациентов младше
и старше 6 мес.: в ряде из них преобладали пациенты младше 6 мес. [238], в ряде
— наоборот [16,41,237,396,445,456]. Однако в более крупных исследованиях
наблюдается
приблизительно
равное
распределение
пациентов
между
возрастными группами [33,335,348,455].
Далеко не все из приведенных выше инициальных клинико-лабораторных
характеристик ОЛЛ используются для разделения пациентов на группы риска
(Таблица 1).
Таблица 1- Критерии разделения пациентов первого года жизни по группам риска в различных протоколах терапии ОЛЛ
Группы риска
Протокол
терапии
Группа
Группа
Группа
Группа
стандартного риска
промежуточного риска
высокого риска
сверхвысо Ссылка
кого
риска
ALL-BFM 83
Фактор риска BFM
Фактор риска BFM
Фактор риска BFM ≥1,7 или >5%
<1,2
≥1,2 и <1,7
бластов в КМ на 40 день индукции
—
[80,106]
—
[80,106]
—
[396]
Хороший ответ на
и ALL-BFM
90
Плохой ответ на преднизолон2 или
риска BFM <0,8, нет
Хороший ответ на
>5% бластов в КМ на 33-й день
нейролейкоза, нет
преднизолон
индукции или ОНдЛ3 или
поражения
24
ALL-BFM 86
преднизолон1 и фактор
t(9;22)(q34;q11)
средостения, не-Т-ОЛЛ
Плохой ответ на преднизолон или
AIEOP
Отсутствие критериев
ALL-91
группы высокого риска
фактор риска BFM ≥1,7 или
—
нейролейкоз или транслокация
t(4;11)(q21;q23) или отсутствие
ремиссии после 6 недель индукции
Продолжение таблицы 1
Группы риска
Протокол
терапии
Группа
Группа
Группа
Группа
стандартного риска
промежуточного риска
высокого риска
сверхвысо Ссылка
кого
риска
Плохой ответ на преднизолон или
AIEOP
Отсутствие критериев
ALL-95
группы высокого риска
—
t(4;11)(q21;q23) или CD10(-)
иммунофенотип или отсутствие
—
[396]
EORTCCLCG 58831, Фактор риска BFM <1,2
58832
Не применимо для
DFCI 87-01
детей первого года
жизни
Не применимо
DFCI 91-01
для детей первого года
жизни
JILSG
Отсутствие перестроек
MLL96/MLL
гена MLL
98
Хороший ответ
Interfant-99
на преднизолон
25
ремиссии после 6 недель индукции
—
Фактор риска BFM ≥1,2
—
[224]
—
Не применимо
для детей первого года жизни
Младше
365 дней
[453]
—
Не применимо
для детей первого года жизни
Младше
365 дней
[222]
—
Перестройки гена MLL
—
[335]
Плохой ответ
на преднизолон
[33]
Продолжение таблицы 1
Группы риска
Протокол
терапии
Группа
Группа
Группа
Группа
стандартного риска
промежуточного риска
высокого риска
сверхвысо Ссылка
кого
риска
Interfant 06
—
[33]
—
[108]
Примечания
Для отнесения пациентов в группу стандартного риска необходимо наличие всех указанных признаков, в то время как
для групп промежуточного и высокого риска достаточно любого из перечисленных критериев, если не указано иное;
1
Хороший ответ на преднизолон — менее 1000 бластных клеток в 1 мкл периферической крови на 8-й день
преднизолоновой профазы;
2
Плохой ответ на преднизолон — более 1000 бластных клеток в 1 мкл периферической крови на 8-й день
преднизолоновой профазы;
3
ОНдЛ — острый недифференцированный лейкоз;
Здесь и далее аббревиатуры названий протоколов расшифрованы в списке сокращений и условных обозначений.
26
MLL-Baby
Перестройки гена MLL и возраст <6
Пациенты с
Отсутствие критериев
мес., в сочетании с плохим ответом
отсутствием перестроек групп стандартного и
на преднизолон и/или инициальным
гена MLL
высокого риска
лейкоцитозом >300×109/Л
Отсутствие критериев
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4 или
—
группы высокого
отсутствие ремиссии на 36 день
риска
индукции
27
В ряде протоколов, специально созданных для детей первого года жизни —
POG 8398, POG 8493, Interfant-99 — инициальные характеристики для
стратификации пациентов не использовались [33,238,445]. В протоколе Infant 92,
разработанном группой UK ALL, наличие нейролейкоза предусматривало
дополнительные интратекальные введения метотрексата [455]. В протоколах
MLL96 и MLL98, наличие любых перестроек гена MLL предусматривало более
интенсивную
терапию
с
обязательным
проведением
трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток [335].
1.4.2. Цитогенетические исследования
Наиболее типичными цитогенетическими аномалиями, выявляемыми при
ОЛЛ у детей первого года жизни, являются перестройки хромосомного района
11q23 c вовлечением гена MLL, которые, по разным данным, обнаруживаются в
60-80% случаев у пациентов исследуемой возрастной группы [33,90,231,306,335].
Другие генетические нарушения, характерные для ОЛЛ у детей старше 1
года, такие как транслокация t(9;22)(q34;q11) с образованием химерного гена
BCR-ABL1,
высокая
гипердиплоидия,
криптическая
транслокация
t(12;21)
(p13;q22), ведущая к образованию химерного гена ETV6-RUNX1, а также
транслокация t(1;19)(q23;p13.3)/TCF3-PBX1, выявляются у детей первого года
жизни крайне редко. Косвенно это подтверждается тем, что крупнейшее
кооперативное
исследование
Ph-позитивного
ОЛЛ
у
детей,
в
котором
представлены данные 326 пациентов в возрасте младше 18 лет, приводит данные
только об одном пациенте младше 1 года с наличием t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1
[338].
Транслокация t(1;19)(q23;p13) с образованием химерного гена TCF3-PBX1
выявляется несколько чаще. Показано, что в среднем это 1 случай на 100
пациентов с ОЛЛ в возрасте младше 365 дней [234,306]. Дополнительным
подтверждением низкой частоты встречаемости данной транслокации у детей
первого года жизни является тот факт, в работе проведенной группой
28
исследователей из Аргентины, собравших данные о 48 случаях транслокации
t(1;19)(q23;p13) при ОЛЛ у детей, было выявлено всего 3 пациента первого года
жизни [359], в то время как австрийские исследователи не обнаружили ни одного
случая данной транслокации у детей младше 1 года среди 31 пациента с
транслокацией t(1;19) [229].
Однозначно частоту выявления транслокации t(12;21)(p13;q22)/ETV6RUNX1 у детей первого года жизни оценить сложно в силу противоречивости
имеющихся данных. С одной стороны известно, что эта транслокация
чрезвычайно редка в данной возрастной группе: так, в работах D. Bhojwani et al. и
A.Borkhardt et al. не выявлено ни одного пациента младше 1 года среди 445 ETV6RUNX1-позитивных пациентов [151,228]. С другой стороны, M. Emerenciano et al.
обнаружили 4 позитивных случая среди 103 пациентов первого года жизни [306].
Поэтому данный вопрос требует дополнительного изучения.
Высокая гипердиплоидия обнаруживается у 5-7% пациентов с ОЛЛ первого
года жизни [90,306], что значительно ниже, чем у детей старше 1 года, где эта
величина составляет около 25% [68,388], а в ряде исследований достигает 38%
[354].
Гиподиплоидия (≤44 хромосом) — относительно редкое генетическое
явление при ОЛЛ у детей, связанное с неблагоприятным прогнозом. Специальных
исследований, посвященных частоте встречаемости гиподиплоидии у детей
первого года жизни, не проводилось. В рамках публикации группы Ponte di Legno,
объединившей данные крупнейших 11 исследовательских групп, среди 132
пациентов с гиподиплоидным кариотипом лейкозных клеток было обнаружено
всего 3 пациента младше 1 года [337]. Ни один из этих трех не имел крайне
прогностически
неблагоприятных
вариантов
гиподиплоидии
—
низкой
гиподиплоидии (30-39 хромосом) или окологаплоидного кариотипа (< 30
хромосом) [354].
Другие молекулярно-генетические характеристики, которые являются
независимыми прогностически неблагоприятными факторами у детей старше 1
года, в частности, внутрихромосомная амплификация 21 (iAMP21), химерный ген
29
P2RY8-CRLF2, делеции в гене IKAROS (IKZF1), «BCR-ABL1-подобный» профиль
экспрессии генов, при ОЛЛ у детей первого года жизни ранее описаны не были
[30,218,333,346,350,353].
В
заключение
необходимо
отметить,
что
чаще
всего
оценка
цитогенетических аберраций при ОЛЛ у детей первого года жизни проводилась
на ограниченных по количеству выборках пациентов, редко превышавших 100
человек, а в нашей стране подобные исследования не выполнялись.
1.4.3. Иммунофенотипическая характеристика
Так как большинство случаев ОЛЛ у детей первого года жизни
ассоциированы с перестройками гена MLL, на протяжении длительного времени
ведутся работы по поиску иммунологических маркеров, позволяющих с
достаточно высокой вероятностью прогнозировать наличие молекулярногенетических аберраций с вовлечением хромосомного района 11q23 и гена MLL.
В ранних и некоторых современных работах указывалось на достаточно
высокую
диагностическую
эффективность
отсутствия
экспрессии
CD10
[224,286,428], хотя BI-вариант ОЛЛ встречается и среди MLL-негативных
пациентов [231], а у части MLL-позитивных пациентов опухолевые клетки CD10положительны [231,286]. Также часто при наличии перестроек гена MLL
выявляется экспрессия миелоидных антигенов CD15 и CD65 и антигенов клетокпредшественников CD133 и CD99, однако данные маркеры специфичными не
считаются [105,231].
В 1996 г. F. Behm et al. описали экспрессию антигена NG2, распознаваемого
антителом 7.1, при MLL-позитивных ОЛ [211]. С тех пор неоднократно было
показано, что NG2 является очень специфичным MLL-ассоциированным
антигеном [105,126,159,207,211,231,365,465]. В работе L. De Zen et al. авторы при
помощи статистических методов исследовали применимость интенсивности
экспрессии и распределения популяции по экспрессии различных маркеров для
выявления пациентов с перестройками гена MLL. Ими было определено 13
30
антигенов, экспрессия которых позволяет разделить MLL-позитивных и MLLнегативных пациентов. Наибольшей диагностической эффективностью отличался
NG2. Также экспрессия 7 антигенов позволяла в группе MLL-позитивных
пациентов различить тех, у кого была обнаружена транслокация t(4;11)/MLL-AF4,
и тех, у кого определялись другие перестройки гена MLL. При этом наиболее
эффективно разделял данные группы пациентов NG2. Его экспрессия была
существенно выше у детей с t(4;11)/MLL-AF4. Кроме того, данный маркер
оказался единственным, применение которого позволяло четко отделить
различить все три группы пациентов
[105]. Позже этой же группой
исследователей на большой группе пациентов (n=1461) с ОЛЛ из В-линейных
предшественников было подтверждено диагностическое значение NG2 при
разделении MLL-позитивных и MLL-негативных ОЛЛ у детей [465]. Однако
необходимо отметить, что в оба исследования были включены все дети с ОЛЛ вне
зависимости от возраста, а целью данных работ было именно выявление различий
MLL-позитивных и MLL-негативных ОЛЛ.
На
сегодняшний
день
типичное
сочетание
экспрессии
антигенов
опухолевыми клетками при ОЛЛ, ассоциированном с перестройками гена MLL,
описано
достаточно
четко
в
большом
количестве
работ
[105,126,159,207,211,231,365,465]. Считается, что бласты в этом случае чаще
всего имеют фенотип CD19+CD45+CD10-CD22dimCD34+/-CD38+CD15+CD65+
CD20-NG2+. В то же время, опубликовано относительно немного работ,
посвященных иммунофенотипированию различных вариантов ОЛЛ у детей
первого года жизни, как имеющих MLL-перестройки, так и без них [231,365].
Обычно описывается иммунофенотип только MLL-позитивных пациентов, вне
зависимости от возраста [105,126,159,207,211,465]. В наиболее ранней работе,
опубликованной G. Basso et al. было показано, что среди детей первого года
жизни CD10-негативный иммунофенотип, а также коэкспрессия миелоидных
антигенов и CD7 чаще выявлялись в группе младше 6 месяцев [428]. Позже в
работе A. Borkhardt et al. была показана связь иммунофенотипа опухолевых
бластов и наличия перестроек гена MLL в данной возрастной группе [231].
31
Схожие результаты были получены и в наиболее крупном на сегодняшний день
исследовании в рамках группы Interfant [365].
В настоящее время иммунофенотип ОЛЛ в данной возрастной группе
считается
важным
прогностическим
фактором
[40,120,167,224,237,348,365,
428,455]. Однако чаще всего негативное прогностическое значение имеют
особенности фенотипа, ассоциированные с наличием перестроек гена MLL,
например, отсутствие CD10 или наличие NG2.
Одной из отличительных черт ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена
MLL, являются крайние гетерогенность и изменчивость иммунофенотипа
опухолевых клеток [8,232]. При этом опухолевая популяция на момент
диагностики может состоять из нескольких субпопуляций бластов с разным
иммунофенотипом, что существенно затруднит не только диагностику, но и
дальнейший мониторинг МОБ. Также были обнаружены существенные различия
иммунофенотипа опухолевых бластов при ОЛЛ у детей младше 1 года на момент
диагностики и при рецидиве [8,232]. Такие изменения встречаются и у детей
старше 1 года [95,103,104,407], но именно в исследуемой возрастной группе они
наиболее существенны.
Кроме того, в редких случаях при наличии перестроек гена MLL описано
так называемое «переключение линий», то есть развитие ОМЛ М5 в рецидиве,
тогда как на момент первичной диагностике был выявлен ОЛЛ [232,460]. При
этом было показано, что монобласты в этом случае относились к тому же клону,
что и лимфобласты во время дебюта заболевания [460]. В одном подобном случае
монобласты появились в КМ уже во время индукционной терапии. Однако у
другого пациента со сходной картиной КМ на 15-й день терапии в рецидиве вновь
был диагностирован ОЛЛ [232].
Таким образом, комплексная характеристика ОЛ у детей первого года
жизни с использованием данных иммунофенотипирования как при наличии
перестроек гена MLL, так и при их отсутствии встречается крайне редко [231,365],
а в нашей стране ранее не проводилась.
32
1.4.4. Результаты терапии
В настоящее время достигнуты значительные успехи в терапии ОЛЛ у
детей старше 1 года [6,15,83,109,262-272]. В то же время выживаемость пациентов
первого года жизни — значительно ниже [14,33,58,224,237,238,335,348,396,445,
455,456]. Несмотря на высокий уровень достижения клинико-гематологической
ремиссии
(в
среднем
94-95%)
[14,33,57,224,237,238,335,348,396,445,455],
сопоставимый с детьми старше 1 года [109,262-272], величина бессобытийной
выживаемости
(БСВ)
редко
[14,33,58,224,237,238,335,348,396,445,455,456].
В
превышает
45%
большинстве
протоколов
токсичность не являлась основной причиной смертей, на долю которой
приходилось около 4% [33,455], что сходно с данными, полученными у детей
старше 1 года — 2-3% [32].
Наиболее частой причиной неудачи терапии ОЛЛ у детей первого года
жизни являются рецидивы. При этом большая часть рецидивов развиваются
довольно рано. Медиана времени до развития рецидива 7-9 мес. [33,58,238,456].
Примерно три четверти пациентов быстро погибают от рецидива. Медиана
времени от рецидива до смерти составляет 4 месяца [33]. Суммарно из 1417
случаев ОЛЛ у детей первого года жизни в исследованиях различных групп было
выявлено 555 рецидивов (39,2%), наиболее частыми из которых являлись
костномозговые (367 случаев, 25,9%), реже были выявлены рецидивы с
изолированным поражением ЦНС (62 случая, 4,4%), комбинированные рецидивы
(35 случаев, 2,5%) и изолированные экстрамедуллярные рецидивы (22 случаев,
1,6%), в том числе 13 (0,9%) случаев рецидивов с изолированным поражением
яичек. Частота рецидивов с одновременным поражением и КМ, и ЦНС составляет
5,4%, но этот показатель рассчитан без учета крупнейшего из опубликованных
исследований — Interfant-99, где эти не данные не приводятся [33,58,138,224,
237,238, 335,348,396,445,455,456].
Различные исследовательские группы применяли разные подходы к
созданию терапевтических протоколов для лечения детей первого года жизни с
33
использованием высокодозного и низкодозированного метотрексата, различных
глюкокортикоидов
(преднизолон/дексаметазон)
и
антрациклинов
(циклофосфамид/ифосфамид), разных схем и дозировок L-аспарагиназы и
цитарабина (Ara-C) [14,33,58,108,224,237,238,335,348,396,445,455]. Результаты
лечения ОЛЛ у детей первого года жизни по различным химиотерапевтическим
протоколам терапии приведены в таблице 2.
Так, снижение интенсивности терапии вело к неудовлетворительным
результатам протоколов группы POG [238,445]. И, наоборот, чрезмерная
интенсификация, предпринятая в рамках протокола CCG-1953, привела к высокой
индукционной смертности и смертности в ремиссии [58]. В то же время
результаты
терапии
немецкой
группы
BFM
[348]
оказались
хорошо
воспроизводимы в протоколах, использующих схожую терапевтическую схему —
EORTC-CLCG 58831/58832 и AIEOP ALL-91/ALL-95 [224,396].
Необходимо отметить, что протоколы групп BFM, EORTC, AIEOP не
создавались специально для детей первого года жизни, а лишь применяли
стратегию использования блоков высокого риска, разработанную ранее для детей
всех возрастных групп [42]. Другой стратегии придерживалась исследовательская
группа, создавшая протокол Interfant-99. В рамках этого протокола не
использовались блоки высокого риска, аналогичные BFM. Вместо этого
использовался обычный протокол для лечения ОЛЛ (без облучения ЦНС, с
низкими дозами антрациклинов, и лишь ограниченное количество пациентов
получило трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток), дополненный
цитарабином в различных схемах и дозировках [33].
В
основе использования
цитарабина
лежала повышенная
in
vitro
чувствительность бластных клеток к этому препарату с одновременной
резистентностью к традиционно применяемым для лечения ОЛЛ L-аспарагиназе и
преднизолону [382] Чувствительность к цитарабину связывают с высокой
экспрессией белка hENT1 [133], который способствует проникновению препарата
через клеточную мембрану. Однако при использовании высоких доз цитарабина
возможно и его пассивное проникновение в клетку путем диффузии [345].
Таблица 2 - Результаты терапии детей первого года жизни с ОЛЛ (цитируется по R. Pieters [345] с дополнениями)
Протокол терапии
Количество
пациентов
Достигли
ремиссии,
n (%)
Рецидивы,
n (%)
Смерть
Время
в ремиссии, оценки,
n (%)
годы
БСВ,
ОВ,
%
%
Ссылка
75
67 (89)
16 (21)
7 (9)
8
54 ± 6
59 ± 6
[138]
DFCI 73-01/77-01/81-01
23
22 (96)
5 (22)
3 (13)
4
54±11
—1
[237]
JILSG MLL96/MLL98
102
97 (95)
21 (21)
9 (9)
5
50
61
[335]
Interfant-99
482
445 (92)
163 (34)
25 (5)
4
47±2,6
55,3±2,7
[33]
AIEOP ALL-91/ALL-95
52
46 (88)
15 (29)
7 (13)
5
45±13,5
—
[396]
ALL-BFM 83/86/90
105
100 (95)
49 (47)
4 (4)
6
43±5
48±6
[348]
EORTC-CLCG 58831, 58832
28
24 (86)
11 (39)
1 (4)
4
43±19
—
[224]
CCG-1953
115
85 (74)2
24 (21)
30 (26)
5
42±9
45±6
[58]
CCG-1883
135
131 (97)
74 (55)
5 (4)
4
39±4
51±4
[456]
CCG-107
99
93 (94)
59 (60)
2 (2)
4
33±5
45±5
[456]
MRC UKALL Infant 92
86
81 (94)
44 (51)
12 (14)
5
33±10
46±11
[455]
POG 8493
82
76 (93)
50 (61)
4 (5)
4
28±5
—
[445]
POG 8398
33
31 (94)
24 (73)
1 (3)
3
17±8
—
[238]
Примечания
1 - данные не приведены
2 - включая 10 смертей в индукции
34
MLL-Baby
35
Японская группа по изучению острых лейкозов у детей первого года жизни
в рамках двух последовательных протоколов MLL96 и MLL98 за счет
использования блоков интенсивной терапии в комбинации с трансплантацией
гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) добилась БСВ в общей группе равной
50,9% [335]. Однако оборотной стороной этого стала относительно высокая
токсичность в группе пациентов с перестройками гена MLL (n=80), в которой,
кроме 1 смерти в ремиссии было зафиксировано 8 смертей после проведения
ТГСК. В группе пациентов без перестроек гена MLL (n=22) смертей в ремиссии не
было, но и трансплантация в этой группе пациентов не применялась [335].
В целом, роль ТГСК в терапии ОЛЛ у детей первого года жизни
неоднозначна. С одной стороны, в рамках протокола Interfant-99 показан ряд
преимуществ этого метода у пациентов группы высокого риска [223]. С другой
стороны, показатели БСВ в ходе терапии по протоколам CCG-1953 (n=115) и
POG-9407 (n=74) не отличались у пациентов с перестройками гена MLL,
получивших только химиотерапию или химиотерапию вместе с ТГСК (БСВ
составила 48,8% и 48,7%, соответственно), вне зависимости от типа донора и
использования тотального облучения тела в кондиционировании [59].
Все вышеизложенное, с одной стороны, свидетельствует об отсутствии
новых терапевтических подходов в лечении ОЛЛ, которые могли бы заметно
повысить БСВ и ОВ пациентов в исследуемой возрастной группе, а с другой,
ведет к необходимости поиска новых маркеров, основанных на ответе
опухолевых клеток на интенсивную химиотерапию и предсказывающих прогноз
конкретного пациента. Одним из таких показателей может являться МОБ.
1.5. Острый миелоидный лейкоз у детей первого года жизни
1.5.1. Клинико-лабораторные показатели
На долю ОМЛ у детей первого года жизни приходится 7-13% от общего
числа случаев ОМЛ у детей [48,162,277,383,454]. Наиболее частыми клинико-
36
лабораторными признаками ОМЛ у детей первого года жизни являются
гепатоспленомегалия,
нейролейкоз,
относительно
высокий
инициальный
лейкоцитоз, перестройки 11q23/MLL. Несмотря на схожесть клинических
признаков с ОЛЛ, есть и существенные различия: частые случаи хлоромы, более
низкий уровень инициального лейкоцитоза, а также различающиеся частота и
спектр перестроек 11q23/MLL [233,344,373,378,383,472].
При ОМЛ у детей первого года жизни гепатоспленомегалия выявляется
более часто по сравнению с детьми старше 1 года, и составляет 36-41% и 17-21%
случаев, соответственно [48,162]. В то же время прогностического значения
данного симптома у детей первого года жизни с ОМЛ не выявлено
[90,162,344,355].
Частота выявления инициального нейролейкоза варьирует в диапазоне от 12
до 40% случаев ОМЛ у детей первого года жизни [48,162,309,355,383]. Возможно,
что отчасти столь большие различия в частоте выявления опухолевых бластов в
спинномозговой жидкости могут быть связаны с разными подходами к оценке,
т.н.
травматической
люмбальной
пункции
[131,363,374,452].
Одним
из
возможных объяснений частых случаев нейролейкоза у детей первого года жизни
с ОМЛ является более высокая, по сравнению с пациентами других возрастов,
частота встречаемости острого монобластного лейкоза, при котором опухолевые
монобласты способны проникать через цитоплазму эндотелиальных клеток
непосредственно в ткань головного мозга [413].
Одним из возможных следствий нейролейкоза является то, что у детей
первого года жизни, по сравнению с детьми старше 1 года, более часто возникают
ЦНС-рецидивы
[48,162].
Однако
при
проведении
соответствующей
противорецидивной терапии это не отражается ни на ОВ, ни на БСВ [48,162].
Важно отметить, что частота ЦНС-рецидивов зависит и от протокола
химиотерапии. Так, более высокая частота ЦНС-рецидивов при ОМЛ у детей
первого года жизни по сравнению с детьми старше 1 года показана для
протоколов терапии групп BFM, St Jude [48,162], в то время как группа MRC
37
выявила сходную частоту ЦНС-рецидивов у детей первого года жизни и более
старших детей [383].
ОМЛ у детей первого года жизни часто сопровождается наличием хлоромы
(гранулоцитарной саркомы) – солидной опухоли часто поражающей кожу,
морфологическим субстратом которой являются миелоидные бласты. Частота
выявления хлоромы у детей в исследуемой возрастной группе колеблется в
пределах 37-46% [48,189].
Как уже отмечалось ранее, еще одной характерной особенностью ОМЛ у
детей первого года жизни является гиперлейкоцитоз на момент первичной
диагностики. От 34% до 50% случаев ОМЛ в данной возрастной категории
сопровождаются инициальным лейкоцитозом более 50×109/Л [31,90,233,355], а в
25-28% случаев уровень лейкоцитов превышает 100×109/Л [90,162,383]. В отличие
от более старших детей, где низкий инициальный лейкоцитоз
является
прогностически благоприятным признаком, у детей первого года жизни такой
взаимосвязи не выявлено [355,383].
Ранее считалось, что возраст на момент установления диагноза ОМЛ у
детей первого года жизни является прогностически неблагоприятным фактором
[356]. Однако, в недавно опубликованном исследовании немецкой группы BFM,
объединившем в себе данные протоколов AML-BFM 98 и AML-BFM 2004,
включавшем 125 пациентов с ОМЛ младше 1 года, отсутствовали различия в ОВ,
БСВ, а также кумулятивной вероятности развития рецидивов между группами в
возрасте 0-3 мес., 4-6 мес., 7-9 мес., 10-12 мес. И более того, исходы терапии у 12
пациентов, которым диагноз ОМЛ был установлен в течение первого месяца
жизни (включая 7 человек с диагностированным ОМЛ в первые 4 дня жизни), не
отличались от остальных детей первого года жизни [162].
Показаны
существенные
различия
в
распространенности
цитоморфологических вариантов ОМЛ между пациентами первого года жизни и
более старшими детьми. У первых достоверно более часто выявляются острый
миеломонобластный
лейкоз
(М4
морфологический
вариант
по
FAB
классификации), острый монобластный лейкоз (М5 морфологический вариант по
38
FAB классификации) и острый мегакариобластный лейкоз (М7 морфологический
вариант по FAB классификации) [48,162,344,378,383].
Наиболее часто среди всех морфологических вариантов ОМЛ у детей
выявляется ОМЛ М5, на долю которого приходится, по данным разных авторов,
от 34 до 54% случаев, несколько реже выявляется ОМЛ М4 — 12-41% случаев, и
еще реже ОМЛ М7 — 8-23%. А суммарно на М4/М5 варианты приходится 5483% всех случаев ОМЛ у детей первого года жизни [31,48,162,233,383]. Особый
интерес к этим двум морфологическим вариантам связан еще и с тем, что они
ассоциированы с наличием перестроек 11q23/MLL. Подавляющее большинство
пациентов (70-93%) с перестройками 11q23/MLL имеют ОМЛ М4 или М5
[90,287,309].
Ранее отдельное диагностическое значение при ОМЛ М1 и М2 придавали
выявлению телец Ауэра [48,225] — палочковидным включениям красного цвета в
цитоплазме опухолевых клеток миелоидного ряда, выявляемые при окраске по
Лейшману. Однако в настоящее время при ОМЛ у детей это перестало быть
актуальным [162,260,261,342,385,414,454,457,458].
Также как и при ОЛЛ, далеко не все инициальные характеристики ОМЛ
используются
для
стратификации
пациентов.
Основные
терапевтические
протоколы основываются на делении пациентов на группы риска, исходя из
инициальных цитогенетических показателях вместе с цитоморфологическими
характеристиками опухолевых бластов, а также количестве бластных клеток в
костном мозге на момент окончания блока индукционной терапии (Таблица 3).
1.5.2. Цитогенетические исследования
Перестройки 11q23/MLL относятся к наиболее частым генетическим
нарушениям при ОМЛ у детей первого года жизни [69,378]. У детей старше 1 года
и
взрослых
их
обнаруживают
значительно
реже
[52,121,358].
Также
характерными для ОМЛ у детей первого года жизни являются транслокации
t(7;12)(q36;p13) и t(1;22)(p13;q13) [418,439].
39
Таблица 3 - Критерии разделения пациентов по группам риска в различных
протоколах терапии ОМЛ
Протокол
Группа
терапии стандартного риска
Группа
промежуточного
риска
Группа
высокого риска
Ссылка
моносомии 5 и 7,
del(5)(q), аномалии
UK MRC
AML12
t(8;21), t(15;17) и
inv(16) или ОМЛ
М3
Отсутствие
abn(3)(q),
критериев групп
комплексный
стандартного и
кариотип (5 и более
высокого риска
аномалий) или
[383]
>15% бластов в КМ
после индукции
ОМЛ М1 или ОМЛ
М2 при наличии
AML-
телец Ауэра, ОМЛ
BFM 98 и
М3, ОМЛ М4 с
AML-
эозинофилией,
BFM
t(15;17)/PML-RARA,
2004
t(8;21)/RUNX1-
Отсутствие
критериев группы
—
стандартного или >
45% бластов в КМ
[162]
на 15 день
индукции
RUNXT1, inv(16)/
CBFB/MYH11
Неслучайная транслокация t(1;22)(p13;q13), ведущая к образованию
химерного
гена
RBM15-MKL1,
является
типичной
для
острого
мегакариобластного лейкоза (ОМЛ М7) у детей первого года жизни и редко
выявляется у пациентов другого возраста [276,323]. В целом частота выявления
транслокации t(1;22)(p13;q13) при ОМЛ у детей составляет 1–4% [84,162,278], но
если учитывать только случаи ОМЛ, возникающие на первом году жизни, то эта
величина составляет 6–28% [259,439]. При ОМЛ М7 доля пациентов с t(1;22)
40
достигает 17% и 30-45% среди детей первого года жизни [193]. Транслокация
t(1;22) сочетается с низким инициальным лейкоцитозом, миелофиброзом и
экстрамедуллярными очагами [278,373,443]. В отличие от старших детей и
взрослых [119], в подавляющем большинстве случаев ОМЛ у детей первого года
жизни t(1;22) является единственной аномалией кариотипа лейкозных клеток
[323]. У пациентов с синдромом Дауна t(1;22) встречается крайне редко
[84,259,278,439,446].
Ранее эта хромосомная аномалия считалась маркером неблагоприятного
прогноза [278,323,443], однако позднее было показано, что дети первого года
жизни с ОМЛ М7 и наличием t(1;22) имеют более благоприятный прогноз по
сравнению с другими пациентами с ОМЛ М7. В целом, вероятность 5-летней БСВ
детей с ОМЛ М7 составляет 10-34% [44,67,102], в то время как при наличии
t(1;22)(p13;q13)/RBM15-MKL1 эта величина достигает 50% [44,119].
В настоящее время t(8;21) и inv(16) часто объединяют в группу CBF (corebinding factor)-лейкозов, из-за общности их патогенеза [405]. Известно, что самой
частой специфической аномалией кариотипа при ОМЛ у подростков и молодых
взрослых является транслокация t(8;21)(q22;q22) с образованием химерного гена
RUNX1-RUNX1T1 [121,276]. Среди пациентов в возрасте до 12 месяцев она
встречается чрезвычайно редко: группа BFM не выявила ни одного случая данной
транслокации среди 125 пациентов с ОМЛ первого года жизни [162].
Описываются лишь единичные случаи этой генетической аномалии у пациентов
младше 1 года [306]. В отличие от t(8;21) инверсия inv(16)(p13q22)/CBFB-MYH11
встречается при ОМЛ у детей первого года жизни чаще (3-4%) [162], но не
достигает частоты характерной для детей старше 1 года (5-9%) [121,358,393].
Транслокация t(7;12)(q36;p13) ведет к образованию химерного гена
HLXB9(MNX1)-ETV6. Данную транслокацию не всегда можно обнаружить при
проведении цитогенетического исследования, и для её выявления рекомендуется
применять метод FISH [165,202,203,216,417]. С его помощью было показано
существование различных точек разрыва как хромосомном районе 7q36, так и
12p13 [116,202]. Ряд исследователей ставит её на второе место по частоте
41
встречаемости после перестроек гена MLL при ОМЛ у детей первого года жизни
[203]. На долю t(7;12) приходится 4-18% случаев ОМЛ у детей младше 1 года
[162,158,203,417] Интересно отметить, что среди пациентов с наличием t(7;12),
представленных в литературе, не было детей старше 23 мес., а подавляющее
большинство составляли дети первого года жизни с ОМЛ [72,158,165,188,202,
203,216,301,321,417,418,447]. Описано лишь 4 случая выявления данной
транслокации при ОЛЛ [72,203,418], два из которых были Т-ОЛЛ [72,418], один
случай—при МДС, и еще один—при остром бифенотипическом лейкозе [447].
Характерными чертами ОМЛ с транслокацией t(7;12) являются более высокий
уровень тромбоцитов и CD34+ клеток по сравнению с пациентами, у которых
t(7;12) не была выявлена [203]. Также у пациентов с наличием t(7;12) выявлена
гиперэкспрессия гена HLXB9 [141,158,203,301,447]. Важно подчеркнуть, что в
ряде случаев экспрессия этого гена была также обнаружена в образцах пациентов
c ОМЛ и клеточных линиях, не имеющих данной транслокации [203,301], но не
выявлялась в образцах нормального костного мозга [301].
Очень часто данная транслокация сочетается с трисомией 19 хромосомы,
которая может быть как изолированной, так и сочетаться с трисомией 8
хромосомы,
которые,
как
считается,
ассоциированы
с неблагоприятным
прогнозом [417,418]. В целом, прогноз для группы пациентов с наличием t(7;12)
крайне неблагоприятный — медиана БСВ составила 9 мес. по сравнению с 31 мес.
для t(7;12)-негативных случаев. 3-летняя БСВ составила 0% и была достоверно
ниже, чем у пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL (58±4%), а также
пациентов, у которых как транслокация t(7;12), так и перестройки 11q23/MLL не
выявлены. Аналогичные данные получены и для ОВ [203]. К сожалению, оценить
значение t(7;12) без трисомий 8 и/или 19 не представляется возможным, так как из
5 ранее описанных случаев [165,216,301,417], исходы терапии были представлены
только у троих, двое из которых (пациент с МДС и пациент с ОМЛ М7)
находились на время публикации в полной продолжающейся ремиссии со
временем наблюдения 22 и 60 мес., соответственно [301,417], а третий погиб от
рецидива ОМЛ, развившегося через 50 мес. от начала терапии [417]. Это
42
позволило высказать гипотезу о том, что сама по себе транслокация t(7;12)
ассоциирована только с лейкозогенезом, а неблагоприятный прогноз связан с
дополнительными факторами, включая трисомии 8 и 19 хромосом, и, возможно,
мутациями в гене FLT3 [301].
Публикации последних лет отражают определенные противоречия в
вопросе о сложном (комплексном) кариотипе при ОМЛ, который у взрослых
больных имеет крайне неблагоприятное прогностическое значение [341]. Прежде
всего, нет единого определения комплексного кариотипа: неясно, сколько
аномалий и каких должны содержать клетки анеуплоидного клона, чтобы
кариотип подходил под это определение. По результатам исследования взрослых
пациентов с ОМЛ было предложено выделять два варианта сложного кариотипа:
типичный и атипичный [47,317]. Первый содержит 3 и более аномалии без t(8;21),
t(15;17) и inv(16). Обычно в его состав входят маркеры неблагоприятного
прогноза (один или более), такие как моносомия 5 и делеция длинного плеча этой
хромосомы, моносомия 7 и делеция длинного плеча хромосомы 7, перестройки
короткого плеча хромосомы 17. Случаи комплексного кариотипа без этих
аномалий относят к атипичным.
В работе C. von Neuhoff et al. [358], изучавших кариотип больных ОМЛ
моложе 18 лет, получавших терапию по протоколу AML-BFM 98 обязательными
критериями комплексного кариотипа было наличие не менее трех хромосомных
нарушений и отсутствие как прогностически благоприятных транслокаций, так и
перестроек гена MLL. С использованием этих критериев комплексный кариотип
выявлен у 35 (7,7%) из 454 детей с ОМЛ, которым было проведено
цитогенетическое исследование. У детей первого года жизни, получавших
терапию по протоколам AML-BFM 98 и AML-BFM 2004 комплексный кариотип
выявлялся гораздо чаще — у 14 (12,7%) из 110 пациентов с успешным
цитогенетическим
исследованием.
С
увеличением
возраста
происходило
снижение доли пациентов с комплексным кариотипом: так, в возрасте от 1 года до
2 эта величина составила 8,6%, а в интервале от 2 до 10 лет — 6,8% [162].
В
литературе
также
отсутствует
единое
мнение
по
вопросу
об
43
эффективности лечения ОМЛ детей с комплексным кариотипом. С одной
стороны, группа UK MRC не выявила определенного влияния комплексного
кариотипа на прогноз ОМЛ при терапии по протоколам AML 10 и AML 12 [121].
Однако этому противоречат данные о пациентах, лечившихся по протоколу AMLBFM 98: БСВ у детей с ОМЛ, имевших комплексный кариотип, была достоверно
ниже, чем во всей исследованной группе (33±8% и 48±2%, соответственно) [358].
Сходные данные были получены итальянской группой исследователей: в ходе
терапии по протоколу AIEOP AML 2002/01 8-летняя БСВ 27 пациентов с
комплексным
кариотипом,
под
которым
авторы
понимали
более
трех
структурных или числовых аномалий, составила 40±9,6%, что было статистически
значимо ниже, чем в остальной группе пациентов (n=455) — 56±2,6% [387].
В настоящее время на смену понятию комплексный кариотип пришел
термин моносомный кариотип, под которым понимают наличие, по меньшей
мере, двух аутосомных моносомий или одной аутосомной моносомии в сочетании
с, как минимум, одной структурной хромосомной аномалией, за исключением
маркеров благоприятного прогноза, а также моносомий половых хромосом
[313,343]. Наиболее часто обнаруживаемыми являются моносомии хромосом 7, 5,
17 и 18 [61]. В ряде работ было показано, что у взрослых пациентов моносомный
кариотип является более важным прогностически неблагоприятным фактором по
сравнению с комплексным кариотипом [150,313]. В то же время, приводятся
данные
о
возможном
комбинированном
использовании
моносомного
и
комплексного кариотипа для выделения максимально большой группы с наименее
благоприятным прогнозом [369].
У детей исследованию проблемы моносомного кариотипа посвящены лишь
единичные работы. В рамках протокола AIEOP AML 2002/01 было выявлено 10
(2,1%) пациентов с моносомным кариотипом из 482. Но необходимо отметить,
что в этом случае под моносомным кариотипом понимали только совместное
отсутствие 5 и 7 хромосом. В рамках этого протокола 8-летняя БСВ у пациентов с
моносомным кариотипом была достоверно ниже по сравнению с общей группой
(20±12,6% и 53±2,9%, соответственно). Важно отметить, что он сохранял свою
44
прогностическую значимость и при многофакторном анализе наряду с двумя
другими факторами риска: группой риска по протоколу и инициальным
лейкоцитозом более 100×109/Л [387]. Однако, из данных приводимых в данной
работе, непонятно были ли среди пациентов с моносомным кариотипом, дети
младше 1 года.
Косвенный ответ на этот вопрос дан в работе К. Manola et al. [114], в
которой представлены данные 15 пациентов с моносомным кариотипом. Медиана
возраста в исследуемой группе составила 11 лет, а диапазон 1,1-19 лет. Среди
пациентов было 10 мальчиков и 5 девочек. Моносомный кариотип был выявлен
среди всех морфологических вариантов ОМЛ, за исключением острого
миелоидного лейкоза с созреванием (ОМЛ М2) и острого промиелоцитарного
лейкоза (ОМЛ М3). Наибольшее количество пациентов (3 случая) имело острый
миеломонобластный лейкоз (ОМЛ М4). В целом, частота обнаружения данной
цитогенетической аномалии составила 12,1% (15 случаев из 124). Выявлены
заметные различия при делении пациентов на три возрастные группы. Из 16
пациентов младше двух лет моносомный кариотип выявлен в 31,2% (5 случаев); в
возрасте старше 2, но младше 14 лет частота выявления составила 14,0% (6 из 43
случаев); а возрастной группе 14-21 лет моносомный кариотип обнаружен у 6,2%
пациентов (4 из 65). Также необходимо подчеркнуть, что у 12 из 15 пациентов с
моносомным кариотипом был также диагностирован комплексный кариотип
[114].
В Российской Федерации целенаправленные исследования кариотипа
опухолевых бластов при ОМЛ у детей первого года жизни ранее не проводились.
1.5.3. Иммунофенотипическая характеристика
В настоящее время работ, посвященных иммунофенотипированию ОМЛ в
данной возрастной группе, нет. Более того, иммунофенотип не считается
значимым прогностическим фактором при ОМЛ у детей первого года жизни
[355]. Так как с перестройками гена MLL ассоциирована моноцитоидная
45
дифференцировка опухолевых бластов, часто выявляются антигены, характерные
для разных стадий развития моноцитов. Кроме того, неоднократно показана
экспрессия NG2 на опухолевых клетках и при ОМЛ, ассоциированном с
перестройками гена MLL [126,322,427]. В случае отсутствия аберраций региона
11q23 наиболее частым вариантом ОМЛ в данной возрастной группе является
ОМЛ М7 [163,344,383] с характерной экспрессией CD61, CD41, CD42a, но крайне
низкой экспрессий CD45.
1.5.4. Результаты терапии
В отличие от ОЛЛ для лечения ОМЛ у детей первого года жизни
специальные
химиотерапевтические
протоколы
не
разрабатывались,
а
использовались те же, что и для детей старше 1 года. К сожалению, в
большинстве опубликованных исследований, посвященных терапии ОМЛ
возрастная группа 0-12 мес. не выделяется, а представляется вместе с пациентами
в возрасте 12-24 мес., поэтому работ, посвященных целенаправленному изучению
ОМЛ у детей первого года жизни относительно немного.
Хотя большинство пациентов первого года жизни относят к группе
высокого риска [162], но исходы терапии у этих пациентов несколько лучше, чем
при ОЛЛ в данной возрастной группе [19,27,31,73,162,204,235,355,383,386].
Несмотря на высокий процент клинико-гематологических ремиссий, достигнутый
в рамках отдельных протоколов терапии — 91-92% [31,386], в популяционных
исследованиях эта величина гораздо ниже — 84-85% [27,162].
Также выявлены значительные колебания в БСВ и ОВ пациентов в
зависимости от типа протокола, длительности использования цитарабина, доли
пациентов, которым проведена трансплантация гемопоэтических стволовых
клеток [19,27,31,73,162,204,235,355,383,386], а также включения этопозида,
показавшего свою эффективность при остром монобластном лейкозе, который
является превалирующей морфологической формой ОМЛ у детей первого года
жизни [46,330]
46
В одном последних из опубликованных на сегодняшний день исследований
—AML-BFM-2004 — достигнут рубеж ОВ равный 75%, что стало возможным
благодаря невысокой токсичности, а также повышению эффективности второй
линии терапии при развитии резистентности или рецидива, включая проведение
трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Благодаря этому 5-летняя
выживаемость после рецидива составляла в этой группе 50% [162]. В то же время,
в рамках протокола AIEOP AML 2002/01 показатель ОВ, равный 73,7%, авторы
связывают с применением большинству (46 из 63) детей первого года жизни
трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [235].
Из-за отсутствия крупных рандомизированных исследований однозначно
оценить эффект ТГСК при ОМЛ у детей первого года жизни невозможно. Но
следует подчеркнуть, что применение аллогенной трансплантации повышало как
БСВ [31], так и ОВ [19,162], в то время как аутологичная трансплантация вела к
заметно более низким показателям выживаемости [19]. Для снижения негативных
последствий трансплантации также было рекомендовано избегать режимов
кондиционирования с использованием общего облучения тела [73,204].
В целом необходимо отметить, что результаты терапии ОМЛ у детей
первого года жизни несколько лучше, как по сравнению с группой в возрасте от 1
до 2 лет, так и c более старшими детьми [162,383,386]. Обобщенные данные по
результатам терапии приведены в таблице 4.
1.6. Структура и функции гена MLL
В хромосомном районе 11q23 протяженностью 10,8 млн. пар нуклеотидов
[181] располагаются около 420 генов. Среди них наиболее часто в процессы
лейкозогенеза при ОЛ вовлекается ген MLL (myeloid/lymphoid/mixed-lineage
leukemia) [99,214,448], состоящий из 37 экзонов (здесь и далее количество и
нумерация экзонов и интронов гена MLL дана по работе I. Nilson et al [156]). В
структуре белка MLL выделяют N- и С-терминальные фрагменты, которые
образуются при воздействии фермента таспазы [208] (Рисунок 3).
Таблица 4 - Результаты терапии детей первого года жизни с ОМЛ (цитируется по E. Ishii et al. [380] с дополнениями)
Протокол терапии
Количество
Достигли
Рецидивы, Смерть в
пациентов ремиссии, %
%
Время
ремиссии,% оценки, годы
БСВ,
ОВ,
%
%
Ссылка
GETMON1
15
—
—
—
5
73
—
[204]
JILSG ANLL91
35
91
17
3
4
72
76
[31]
CCG2861/2891Химиотерапия
49
—
—
—
8
61
—
CCG 2861/2891 АллоТКМ
24
—
—
—
71
—
CCG 2861/2891 АутоТКМ
43
—
—
—
40
—
UK MRC AML10/122
57
89
25
8
5
59
65
[383]
NOPHO84/88
27
85
—
—
5
58
—
[27]
AIEOP AML 2002/01
63
82
31
4
8
AML-BFM 98/2004
120
85
33
3
5
47±5
66±4
[162]
FHCRC
40
—
—
—
5
38
—
[73]
St Jude AML80-91
28
—
—
—
5
32
—
[355]
UK MRC AML12
130
92
29
—
10
—
68
[386]
1 название протокола не приведено, дано название исследовательской группы
2 Данные по протоколу MRC AML 12 приведены частично.
54,6±6,1 73,7±5,7 [235]
47
Примечания
[19]
48
Рисунок 3. Схема строения гена и белка MLL. Масштаб не соблюден. (А).
Структура дикого типа гена MLL, включая основной регион разрыва (Mbcr)
протяженностью 7699 пар нуклеотидов, расположенный между 7 и 13 экзонами,
участвующий в образовании химерных генов. Цифры соответствуют нумерации
экзонов. Указан фрагмент между 1 и 14 экзонами, а также последний (37-й) экзон.
(Б). Структура белка MLL. Двумя стрелками указана зона расщепления белка
MLL под действием таспазы на N-концевой и С-концевой фрагменты, с
молекулярным весом 320 кДА и 180 кДА, соответственно. AT hooks — три AT
домена, обеспечивающих связывание ДНК. SNL-1 и SNL-2 — два субъядерных
домена, ответственных за присоединение MLL к объектам с субъядерной
локализацией. DNMT — ДНК-метилтрансферазный домен, распознающий
неметилированные CpG динуклеотиды, а также активирующий гистоновые
деацетилазы и поликомб-белки. PHD — четыре домена, вовлеченных в хроматинопосредованную регуляцию транскрипции, разделены Br — бромодоменом,
отвечающим за межбелковые взаимодействия. TAD — трансактивационный
домен
взаимодействует
с
CREB-связывающим
белком
и
участвует
в
ацетилировании гистонов H3 и H4 в белок-связывающих (гомеобоксных)
участках ДНК. SET домен обладает метилтрансферазной активностью и
метилирует гистоновый белок H3 в области промотора HOX.
Гомология гена MLL млекопитающих, в т.ч. человека, с геном, найденным у
49
Drosophila Trithorax [448], а также эксперименты на мышиных моделях и
клеточных линиях, дают возможность предположить, что в норме функции белка
MLL заключаются в модификации хроматина [51,187,326]. Однако это не
объясняло роль данного белка при ОЛ, потому что один из важнейших хроматинмодифицирующих компонентов белка MLL – SET домен, который через
гистоновую метилтрансферазу H3K4 регулирует кластер A генов HOX и ген
MEIS1, утрачивается при образовании химерного белка [442,448].
Позднее различными исследовательскими группами было показано, что в
этих
случаях
химерные
белки
с участием
MLL служат
препятствием
транскрипционной элонгации, что ведет к изменению экспрессии генов-мишеней
[22,29,50,284].
Как дикий тип белка MLL, так и химерные белки с его участием
связываются с хроматином путем образования комплекса между менином
(продуктом гена множественной эндокринной неоплазии 1, MEN1), фактором
роста, выделяемым эпителием хрусталика (lens epithelium-derived growth factor,
LEDGF/p75) и N-терминальной частью MLL [257,279,470]. Связывание этих
белков необходимо для развития MLL-позитивного ОЛ [240,430,470].
Относительно недавно в работе J. Huang et al. была определена
кристаллическая структура как свободной формы менина, так и в комплексе с
менин-связывающим доменом MLL. При этом MLL встраивается в глубокий
карман менина [438]. Интересно, что кристаллическая форма менина, связанного
с N-терминальным фрагментом MLL, содержит как менин-, так и LEDGFсвязывающие домены, что свидетельствует
в пользу того, что поверхность,
сформированная при взаимодействии менина и MLL, является площадкой для
присоединения LEDGF [438]. Белковая часть LEDGF окружает менинсвязывающий домен MLL.
LEDGF ингибирует рост, колониеобразование и экспрессию генов-мишеней
MLL как у мышей, так и в клетках человека с наличием перестроек гена MLL, но
не обладает такими эффектами в мышиных гемопоэтических клетках и клетках
человека без перестроек гена MLL. Более того, искусственно синтезированные
50
небольшие белковые молекулы идентичные различным частям LEDGF способны
конкурировать с LEDGF при его связывании с MLL, что открывает новые
терапевтические возможности для лечения пациентов с MLL-позитивными ОЛ
[221].
Еще одной мишенью для терапевтического воздействия является белок
DOT1L, который запускает метилирование оснований лизина в 79 положении в
гистоновом белке H3 (H3K79), что ведет к поддержанию транскрипции РНК
[140,192,403] и является принципиально важным для лейкозной трансформации
[122]. Данный механизм описан для химерных генов MLL-MLLT4 [258] и MLLMLLT10
[36].
DOT1L
[139,192,195,206,298,384],
наряду
с
бромодомен-
содержащими белками BRD3 и BRD4 [236,394] и компонентом поликомбподавляющего комплекса 1 CBX8 [75,199,424] являются необходимыми
факторами прогрессии ОЛ, ассоциированного с перестройками гена MLL.
Еще одним из описываемых механизмов реализации лейкозогенного
эффекта при MLL-позитивных ОЛ является лизин-специфичная деметилаза 1а
(KDM1A). W Harris et al. показали, что ингибирование экспрессии Kdm1a
снижает колониеобразование лейкозных клеток при MLL-MLLT3-позитивном
ОМЛ, замедляет прогрессию in vivo и повреждает профиль метилирования
гистоновых белков в локусах, связывающихся с MLL-MLLT3. Хотя блокирование
Kdm1a не оказывало влияния на колониеобразование нормальных миелоидных
предшественников,
оно
до
некоторой
степени
ингибировало
развитие
эритроидных предшественников [426]. Интересно, что утрата KDM1A приводила
к сниженной экспрессии генов, ассоциированных с реализацией потенциала
стволовых клеток MLL-позитивных ОЛ [122] и увеличивала количество ди- по
сравнению с триметилированной формой H3K4 в локусах присоединения MLLMLLT3 [426]. Всё это дало возможность авторам высказать предположение, что
KDM1A является компонентом аберрантного комплекса (включающего MLL и
белки-партнеры) отвечающего за элонгацию транскрипции и деметилирование
диметил-H3K4, что ведет к увеличению триметилированной формы H3K4 в
51
области промоторов генов, находящихся под контролем химерных генов с
участием MLL [426].
A. Wilkinson et al. установили роль гена RUNX1 в качестве прямой
транскрипционной мишени химерного гена MLL-AF4. Ими было показано, что
экспрессия
гена
RUNX1
необходима
для
колониеобразования
MLL-AF4-
позитивных клеток. Однако данный механизм не является универсальным, и для
клеток, несущих химерный ген MLL-MLLT3, он не работал. В рамках этой же
работы было показано, что RUNX1 функционирует как активатор транскрипции в
MLL-AF4-позитивных клетках [397].
Кроме
вышеуказанного,
большой
интерес
вызывает
негативное
прогностическое влияние высокой экспрессии гена Evi1 (ecotropic viral integration
site-1) у пациентов с MLL-позитивным ОМЛ [125]. При исследовании причинных
связей между функцией MLL-MLLT3 и экспрессией Evi1 было показано, что
MLL-MLLT3
ответственен
за
трансформацию
Evi1-экспрессирующих
гемопоэтических стволовых клеток с последующим поддержанием экспрессии
Evi1, но, в то же время, он не способен индуцировать экспрессию в Evi1негативных клетках гранулоцитарно-макрофагальных предшественников. Более
того экспрессия Evi1 способствует прогрессии MLL-позитивного ОМЛ [154]. Эти
результаты
подтвердили
ранее
опубликованные
данные
об
измененной
экспрессии Evi1 под воздействием MLL-MLLT1 [150]. В работе A. Krivtsov et al.
было показано, что индивидуальные клоны, образующиеся при трансформации
гемопоэтических стволовых клеток под воздействием MLL-MLLT3 более
эффективно вызывали развитие ОЛ, чем происходящие из гранулоцитарномакрофагальных предшественников. Более того, при исследовании профиля
экспрессии лейкемических стволовых клеток, происходящих из гемопоэтических
стволовых клеток, было найдено большое количество генов, ассоциированных с
неблагоприятным прогнозом ОМЛ, включая высокую экспрессию Evi1. И, как
следствие этого, развивавшиеся ОЛ были более резистентны к цитарабину и
доксорубицину, чем ОЛ, происходящие из гранулоцитарно-макрофагальных
предшественников [76].
52
Интересная
находка
продемонстрировали
что
была
сделана
S.
гемопоэтические
Horton
et
al.,
которые
клетки-предшественники
новорожденных более легко поддаются трансформации при воздействии MLLMLLT3, чем клетки, полученные из костного мозга взрослых. Первые были
способны развиваться как по миелоидной, так и по лимфоидной линиям и
индуцировать ОЛЛ in vivo, а также экспрессировали гены, ответственные за
неблагоприятный прогноз ОМЛ у детей и резистентность к доксорубицину, тогда
как вторые были ограничены только миелоидной линии и приводили к
иммортализации клеток, но не были способны вызывать лейкозы [297].
Еще одно современное направление исследований при MLL-позитивных ОЛ
— оценка профиля экспрессии микроРНК. МикроРНК – малые некодирующие
РНК, длина молекулы которых составляет 21-25 нуклеотидов [254]. В ряде
случаев микроРНК могут выполнять двоякую функцию. Например, индукция
экспрессии miR-196b под воздействием химерных белков с участием MLL
приводит к иммортализации [381]. Дальнейшая гиперэкспрессия miR-196b
замедляет развитие ОМЛ у первичных реципиентов лейкозных клеток, но
ускоряет при вторичной трансплантации. Разнонаправленный эффект (про- и
антилейкозогенный) объясняется одновременным подавлением экспрессии генов,
как способствующих развитию ОМЛ (Hoxa9 и Meis1), так и генов-супрессоров
(Fas) [282].
Также было показано, что экспрессия микроРНК let-7b снижена при MLLпозитивном ОЛЛ, вследствие гиперметилирования let-7b-регуляторных районов
под влиянием химерных белков с вовлечением MLL. А гиперэкспрессия let-7b,
наоборот, ведет к ингибированию роста лейкозных клеток, несущих перестройки
гена MLL при ОЛЛ [415]. Последние также способны блокировать экспрессию
ряда miR при ОМЛ. [71,283]. Так, экспрессия miR-150 была снижена при
большинстве форм ОМЛ, а химерные белки с участием MLL подавляют miR-150
путем индукции экспрессии гена MYC, что ведет к последующей активации
LIN28 — РНК-связывающего белка, который блокирует созревание miR-150.
Выявлено, что гиперэкспрессия miR-150, также как и let-7b, ведет к блоку роста
53
опухолевых клеток и прогрессии MLL-позитивного ОМЛ. Одним из возможных
механизмов этого является подавление экспрессии FLT3 и MYB [71]. Также при
ОМЛ, ассоциированном с перестройками гена MLL, снижена экспрессия miR-495.
А её гиперэкспрессия, проявляющаяся в ингибировании MLL-зависимого
лейкозогенеза, реализуется путем угнетения экспрессии MEIS1 и PBX3 [283].
Еще одна интересная работа, посвященная изучению микроРНК при MLLAF4-позитивном ОЛЛ у детей первого года жизни проведена D. Stumpel et al.,
которые акцентировали свое внимание на степени метилирования микроРНК.
Было выявлено 11 зрелых микроРНК, активность которых была снижена из-за
гиперметилирования CpG-островков. В их число вошли miR-101, miR-10а, miR148а, miR-152, miR-200а, miR-200b, miR-424, miR-429, miR-432, miR-486 и miR503. Наибольший интерес из этой группы представляла miR-152, у которой в
качестве потенциальных генов-мишеней выступали как MLL, так и ДНКметилтрансферза 1 (DNMT1). Более того, высокая степень метилирования CpGостровков miR-152 была взаимосвязана с неблагоприятным исходом MLL-AFпозитивного ОЛЛ у детей первого года жизни [213].
Важно отметить, что исследование профиля экспрессии генов в клетках
MLL-позитивных ОЛ показали, что это совершенно особый тип лейкоза,
отличный как от ОЛЛ, так и от ОМЛ [292,293]. Этот тип ОЛ несет отдельные
генетические характеристики как ОЛЛ, так и ОМЛ, что позволило сделать
предположение о единой природе возникновения MLL-позитивных ОЛ [292].
Кроме того, профили экспрессии генов при ОЛЛ у детей первого года жизни,
независимо от изменений гена MLL, имеют больше сходства между собой, чем с
профилями экспрессии генов у детей с ОЛЛ старше 1 года [174].
1.7. Перестройки гена MLL
1.7.1. Механизм действия химерных генов с участием MLL
Ген MLL играет важную роль в процессах лейкозогенеза путем слияния с
54
большим количеством генов-партнеров, что ведет к образованию новых, не
существовавших в здоровом организме, химерных генов и синтезу с них
химерных белков. Перестройки с вовлечением района 11q23 и участием гена MLL
встречаются примерно в 10% всех случаев ОЛЛ и в 3% случаев ОМЛ [52,60].
Наиболее частыми химерными генами при ОЛ у детей и взрослых являются
MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-ELL, MLL-MLLT4.
Суммарно на их долю приходится 85% всех перестроек гена MLL [289,320,433].
Механизм реализации действия химерных генов частично был описан в
разделе «Ген MLL». Здесь приведены лишь некоторые дополнения. Белки AF4,
MLLT1, MLLT3 и MLLT10 взаимодействуют друг с другом в белковом
комплексе, который влияет на транскрипционное удлинение. AF4 является
стыковочной платформой для MLLT1 или MLLT3, которые через MLLT10
связываются с DOT1L [70,423]. Последний запускает метилирование оснований
лизина в 79 положении в гистоновом белке H3 (H3K79), что необходимо для
поддержания транскрипции РНК [195,471]. AF4 связываясь с N-терминальной
частью
P-TEFb-киназы,
способствует
фосфорилированию
крупнейшей
субъединицы РНК-полимеразы II, что ведет к переходу РНК-полимеразы А в
РНК-полимеразу Е и началу транскрипции генов [429]. Образование химерных
белков MLL-AF4, AF4-MLL, MLL-MLLT3, MLL-MLLT1, MLL-MLLT10 и MLLMLLT4 сопровождается усиленным метилированием H3K79, что является одним
из механизмов, предложенных для объяснения патогенеза MLL-позитивных ОЛ у
детей и взрослых [192]. В то же время усиление метилирования H3K4 было
показано только для случаев с наличием реципрокного гена AF4-MLL, который
был способен вызывать BI-ОЛЛ у мышей [421]. Таким образом, большинство
химерных белков с вовлечением MLL имеют сходный механизм реализации
лейкозогенного эффекта [433].
В большинстве случаев наряду с химерным геном, который образуется при
соединении 3’-части гена-партнера с 5’-частью гена MLL, выявляется и обратный
(т.н. реципрокный) ген, возникающий при присоединении 5’-фрагмента генапартнера к 3’-фрагменту MLL. Кроме этого 3’-фрагмент MLL может соединяться с
55
хромосомными участками, которые не несут информацию о генах, либо
образовывать соединение с геном-партнером вне рамки считывания, и, казалось
бы, в этих случаях транскрипт не должен образовываться [433]. Однако, было
показано, что начиная с границы между 11 интроном и 12 экзоном, 3’-часть MLL
самодостаточна для синтеза собственной мРНК, которая затем транслируется в
укороченную форму белка MLL, обозначаемую MLL* [449]. В этом случае старткодон находится в 18 экзоне гена MLL, что приводит к тому, что белок MLL*,
начинается с бромодомена MLL и заканчивается SET-доменом. Также как и MLL
дикого типа, MLL* расщепляется таспазой на два фрагмента, но меньшего
размера. MLL*-N-терминальный фрагмент, размером 97 кДа, теряет свойства,
присущие N-терминальной части MLL дикого типа, в то время, MLL*-Стерминальный фрагмент сохраняет способность к метилированию H3K4 [449].
Также реципрокные гены могут реализовывать свой эффект через RUNX1,
который, как было показано A. Wilkinson et al., способен формировать комплекс
не только с С-терминальным фрагментом дикого типа белка MLL, но и с
реципрокным химерным белком AF4-MLL [397]. Это служит подтверждением
ранее опубликованных данных о независимой от MLL-AF4 роли реципрокного
белка AF4-MLL в развитии t(4;11)-позитивного ОЛЛ [239,421]. В пользу
значимости реципрокного белка говорят и экспериментальные данные M.
Emerenciano et al., продемонстрировавшие, что реципрокный белок NEBL-MLL,
обладает гораздо более значительной способностью активировать рост клеток,
чем MLL-NEBL [168].
1.7.2. Спектр перестроек 11q23/MLL
В крупнейшем из опубликованных на сегодняшний день исследований
были собраны данные о 1590 пациентах, включая 558 детей первого года жизни, с
различными перестройками гена MLL (Рисунок 4) [433].
На
сегодняшний
день
выявлено
и
на
молекулярном
уровне
охарактеризовано 79 химерных генов с участием MLL, еще 35 транслокаций с
56
вовлечением
хромосомного
района
11q23
были
охарактеризованы
при
проведении цитогенетического исследования, но ген-партнер MLL в этих случаях
пока не выявлен [433]. Несмотря на разнообразие описанных химерных генов,
большинство из них было выявлено только в единичных случаях, а наиболее
частыми генами-партнерами MLL являются AF4, MLLT1, MLLT3, MLLT10, ELL,
MLLT4 (даны в порядке убывания частоты выявления).
Рисунок 4. Спектр перестроек гена MLL в зависимости от типа ОЛ и возраста.
Представлены данные для детей первого года жизни (n=558), детей в возрасте от 1
до 18 лет (n=416) лет и взрослых (от 19 лет) (n=616). Дается по C. Meyer et al.
[433].
Суммарно они встречаются более чем в 80% всех случаев MLL-позитивных
57
ОЛ у детей и взрослых [433]. Более того, выявлены значительные отличия между
различными возрастными группами. Так, например, у взрослых пациентов с ОЛЛ
доминирующим является химерный ген MLL-AF4, на долю которого приходится
более 80% от всех случаев. В то же время у детей первого года жизни и детей
старше 1 года он выявляется менее чем в половине случаев. Обратная тенденция
выявлена для химерного гена MLL-MLLT3, который обнаруживается у 17-18%
детей с ОЛЛ и менее чем в 2% случаев ОЛЛ у взрослых. В то же время при ОМЛ
у взрослых пациентов почти в четверти случаев выявлены частичные тандемные
повторы в гене MLL (MLL-PTD), которые у детей были найдены только в 1%
случаев, и не выявлялись в возрасте младше 1 года [433].
Интересные
наблюдения
были
сделаны
по
взаимосвязи
между
перестройками гена MLL и генов Ig/TCR при ОЛЛ у детей первого года жизни
[219]. В этой группе MLL-позитивные пациенты по сравнению с MLLнегативными достоверно чаще имели неполные перестройки гена IGH (DH-JH) и
реже полные перестройки IGH (VH-DH-JH), IGK-Kde. Неполные перестройки гена
IGH (DH-JH) с большей частотой выявлялись у детей первого года жизни с
наличием химерного гена MLL-AF4 по сравнению с MLL-MLLT1, MLL-MLLT3 и
другими перестройками MLL. В то время как полные перестройки IGH (VH-DH-JH)
в подавляющем количестве выявлялись у пациентов с MLL-MLLT3. Также у них
чаще выявлялись перестройки IGK (Vκ-Jκ, Kde), IGL, TCRB (Dβ-Jβ) и Vδ2-Jα по
сравнению с MLL-AF4-позитивными и MLL-MLLT1-позитивными пациентами.
Олигоклональность в локусе IGH с большей частотой и в большей степени
выявлялась у пациентов с наличием химерных генов MLL-AF4 и MLL-MLLT1, в то
время как олигоклональность в локусе TCRD была более типична для MLLMLLT3-позитивных пациентов. Таким образом, пациенты с наличием химерных
генов MLL-AF4 и MLL-MLLT1 имели более незрелые перестройки гена Ig и менее
частые перестройки гена TCR. И, наоборот, для пациентов, у которых был
выявлен химерный ген MLL-MLLT3, были характерны более зрелые перестройки
Ig и более часто обнаруживались перестройки гена TCR, что сближало их как с
MLL-негативными пациентами в возрасте младше 1 года, так и с ОЛЛ у детей
58
старше года. Исключениее составляли только перестройки TCRG, которые крайне
редко выявлялись у детей первого года жизни [219].
Наиболее часто выявляемой транслокацией с участием хромосомного
района 11q23 является t(4;11)(q21;q23), которая ведет к образованию химерного
гена MLL-AF4 [442]. Участники
Европейской рабочей группы по изучению
перестроек 11q23, собравшие сведения о 183 пациентах разного возраста с данной
транслокацией, включая 63 детей первого года жизни, показали, что t(4;11) или её
варианты как единственная цитогенетическая аномалия были выявлены в 70%
случаев в общей когорте пациентов и в 79% случаев среди детей первого года
жизни. Частота дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) у детей младше 6
мес. составила 22% (10 случаев из 46), а в возрасте 6-11 мес. — 18% (3 случая из
17). Наиболее частыми ДХА являлись дополнительная копия X хромосомы,
обнаруженная в 19 случаях, в т.ч. в 10 — у лиц женского пола, и в 9 — у
мужского; изохромосома 7 i(7)(q10), выявленная в 8 случаях; а также трисомии
хромосомы 8 (n=5), хромосомы 1 (n=4); хромосомы 21 (n=4). Дополнительная
копия деривата 4 хромосомы с транслокацией t(4;11) была найдена в 3 случаях, в
то время как дополнительные копии der(11) не были обнаружены. Наиболее часто
ДХА были несбалансированными и затрагивали хромосомные районы 1p36, 1q21,
7q10, 11p15, 12p13, 17p11 и 17p10. При этом зафиксировано как увеличение
хромосомного материала (gain) 1q, 7q, 8, и X, так и делеции 7p и 17p.
Комплексные варианты транслокации t(4;11) были выявлены в 5 случаях [196]. К
сожалению, авторы не приводят количество и тип ДХА, приходившееся на
различные возрастные группы. Кроме того в свой анализ они включили 10
пациентов со вторичным ОЛ, что также осложняет интерпретацию полученных
ими данных. Косвенный ответ, свидетельствующий в пользу того, что
выявленные ДХА, скорее всего, были выявлены у пациентов старше 1 года,
можно получить из более поздних работ, в которых, с использованием биочипов
по исследованию однонуклеотидных полиморфизмов (SNP array) было показано,
что при MLL-позитивном ОЛЛ в среднем на 1 пациента приходится от 0,2 [137] до
1,0 [183] фрагментарных нарушений числа копий ДНК (DNA copy-number
59
abnormalities), ведущих к несбалансированным хромосомным аномалиям. Что
было значительно ниже по сравнению с детьми старше 1 года с ОЛЛ из Влинейных предшественников (4,2-6,6) [183,205].
В работе С.-H. Pui et al. объединившей данные 11 крупнейших
исследовательских групп по лечению ОЛ у детей за период с 1983 по 1995 годы,
было показано, что среди пациентов с ОЛЛ и наличием транслокации t(4;11) дети
первого года жизни имели наименее благоприятный прогноз. 5-летняя БСВ в этой
группе составила 19±3%, что было достоверно ниже, чем у детей старше 1 года
(42±5%). Наименее благоприятный прогноз пациентов с наличием t(4;11)
(q21;q23)/MLL-AF4 был связан с плохим ответом на преднизолон (более 1000
бластных клеток в 1 мл периферической крови на 8 день профазы), и однимединственным интратекальным введением метотрексата. Пациенты младше трех
месяцев имели наихудший прогноз по сравнению с детьми в возрасте от 3 до 12
месяцев (БСВ 5±5% и 23±4%, соответственно). Авторами не было найдено
доказательств того факта, что ТГСК от любого типа донора улучшает прогноз
этой группы пациентов [91]. Иной вывод о прогностической значимости ТГСК
был сделан исследователями из группы Interfant, которые показали преимущество
этого метода при сочетании перестроек гена MLL с другими прогностически
неблагоприятными факторами (возраст на момент установления диагноза менее 6
мес., инициальный лейкоцитоз более 300*109/Л и/или плохой ответ на
преднизолон) [223]. Однако авторы не указали, какое количество из 37 MLLпозитивных пациентов, перенесших трансплантацию, имели t(4;11)(q21;q23)/MLLAF4.
Изредка (<1% случаев) данный химерный ген выявляют и при ОМЛ у детей
первого года жизни [433], но из-за малого количества наблюдений оценить его
вклад в прогноз невозможно [162,373].
Транслокация t(11;19)(q23;p13.3) с образованием химерного гена MLLMLLT1 [448] является второй по частоте выявления у детей первого года жизни с
ОЛЛ. На её долю приходится около 20% от всех MLL-позитивных случаев при
ОЛЛ в этой возрастной группе. Также она является второй по частоте у взрослых
60
пациентов с ОЛЛ, где относительная частота обнаружения составляет 10% от
общего числа перестроек гена MLL. Кроме того, изредка химерный ген MLLMLLT1 находят при ОМЛ у детей и взрослых (4-5% от MLL-позитивных) [433].
Участники Европейской рабочей группы по изучению перестроек 11q23
приводят данные о 32 пациентах с транслокацией t(11;19)(q23;p13.3), включая 13
детей первого года жизни. Из числа последних в 11 случаях был выявлен ОЛЛ, и
по одному случаю приходилось на ОМЛ и острый бифенотипический лейкоз. У
детей первого года жизни ДХА выявлены у 1 пациента с ОМЛ (трисомия
хромосомы 8 в сочетании с дополнительной копией деривата 19 хромосомы,
несущей транслокацию t(11;19)) и 2 с ОЛЛ (трисомия Х хромосомы и вовлечение
der(11)t(11;19) во вторую транслокацию с образованием der(2)t(2;11)(q33;q13)
t(11;19)(q23;p13.3)).
Еще
в
одном
случае
была
выявлена
комплексная
транслокация с вовлечением трех хромосом t(11;18;19)(q23;q22;p13.3) [444].
Интересно подчеркнуть, что в отличие от транслокации t(11;19)(q23;p13.1),
большинство случаев которой выявлялось при помощи R-бендинга, для
обнаружения t(11;19)(q23;p13.3) с успехом применялся стандартный GTG вариант
окраски, что связывают со схожестью хромосомных полос расположенных
дистальнее 19p13 [118].
C.-H. Pui et al. показали, что у детей первого года жизни выявление
t(11;19)(q23;p13.3)/MLL-MLLT1 было сопряжено с достоверно более низкой
выживаемостью по сравнению с детьми старше 1 года (БСВ 26±8% и 64±12%,
соответственно).
Интересно,
что
пациенты
с
Т-линейным
ОЛЛ
и
t(11;19)(q23;p13.3)/MLL-MLLT1 имели лучший прогноз, по сравнению с ОЛЛ из
B-линейных предшественников. Но необходимо подчеркнуть, что только 1 из 8
пациентов с Т-ОЛЛ в данной работе был младше 1 года [91]. Сходные данные о
более благоприятном прогнозе при t(11;19)-позитивном Т-ОЛЛ были получены и
другими исследователями, но только 1 из 18 опубликованных случаев приходился
на ребенка младше 1 года [82,118,444].
Транслокация t(9;11)(p22;q23) ведет к образованию химерного гена MLLMLLT3 [182]. В рамках Европейской рабочей группы по изучению перестроек
61
11q23 были собраны данные о 125 случаях ОЛ с t(9;11)(p22;q23), включая 17 у
детей первого года жизни. У детей младше 1 года t(9;11) как единственная
цитогенетическая аномалия была выявлена в 8 случаях, в 3 она сочеталась с
трисомией хромосомы 8 (все ОМЛ), в 2 случаях были выявлены комплексные
транслокации с вовлечением 1q25 (ОЛЛ) и 9p13 (ОМЛ) [198].
В отличие от транслокаций t(4;11) и t(11;19), возраст младше 1 года не был
связан с неблагоприятным прогнозом у детей с ОЛЛ и t(9;11). 5-летняя БСВ у
детей первого года жизни составила 38±15%, а у детей старше 1 года — 46±14%.
Также не было выявлено различий в выживаемости у детей младше и старше 6
мес. [91]. Еще одно отличие от t(4;11) и t(11;19) состоит в том, что у детей
первого года t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 примерно в равной пропорции
выявляется как при ОЛЛ (≈17%), так и при ОМЛ (≈22%) [433].
J. Martinez-Climent et al. одними из первых установили относительно
благоприятный прогноз пациентов с ОМЛ и транслокацией t(9;11) [35]. Позднее
этот факт нашел свое подтверждение в работе J. Rubnitz et al., в которой было
показано, что дети с ОМЛ и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 (n=23) имели наиболее
благоприятный прогноз (БСВ 64,9±11,1%) среди всех цитогенетических подгрупп
(n=272). Когда же для более детального анализа были взяты только пациенты с
острым монобластным лейкозом (ОМЛ М5), то БСВ в группе с наличием
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 (n=21) составила 71±11%, а при её отсутствии (n=42)
— 26±8% [161]. Необходимо подчеркнуть, что в этот анализ включались дети
всех возрастов, а из 23 пациентов с t(9;11) было 6 детей первого года жизни. Из
этого числа 5 пациентов находились в полной продолжающейся ремиссии, и
только у 1 зафиксирована вторичная опухоль. Медиана времени наблюдения
составила 11,1 лет (диапазон 0,6-17,4 лет). Однако в последующем данные о
благоприятной
прогностической
роли
данной
транслокации
не
были
воспроизведены ни в ходе других исследований у детей первого года жизни
[31,162], ни в рамках кооперативного исследования, объединившего данные 756
детей с MLL-позитивным ОМЛ младше 18 лет [325].
Транслокация t(10;11)(p12;q23) и один из её вариантов инсерция
62
ins(10;11)(p12;q23q21) ведут к образованию химерного гена MLL-MLLT10 [24].
Европейская рабочая группа по изучению перестроек 11q23 собрала данные о 20
пациентах с этой транслокацией, в т.ч. о 6 детях первого года жизни, у четверых
из них был диагностирован ОМЛ М5. Также в этой возрастной группе выявлено
по 1 случаю BI-ОЛЛ и Т-ОЛЛ. Интересно, что из 6 пациентов младше 1 года
пятеро были женского пола. Основываясь на данных цитогенетического
исследования, авторы смогли выделить 4 различных механизма, приводящих к
образованию этой хромосомной аномалии. В 7 из 20 случаев была выявлена
реципрокная транслокация — t(10;11)(p11–13;q23). 12 пациентов имели инверсию
хромосомного
района
11q13–11q23
либо
инвертированного участка 11q в район
в
сочетании
с
транслокацией
10p12 (8 случаев), либо со вставкой
inv(11)(q) в 10p (4 случая). У одного пациента выявлена противоположная
ситуация, при которой инвертированный участок 10p12–15 был вставлен в 11q23.
ДХА выявлены в 11 случаях из 20 [440]. Позднее с использованием методов FISH
и ОТ-ПЦР было показано, что в ряде случаев транслокация t(10;11) является
криптической [450].
При ОМЛ с возрастом происходит снижение доли этой транслокации среди
перестроек 11q23/MLL. Так, если у детей первого года жизни она выявляется в
≈25% от числа MLL-позитивных случаев, то у детей старше 1 года — в 20%, а у
взрослых — менее чем в 10%. На долю MLL-MLLT10 приходится также около 5%
среди MLL-позитивных ОЛЛ у детей первого года жизни. Показано, что дети с
ОМЛ и t(10;11)(p22;q23)/MLL-MLLT10 имеют наименее благоприятный прогноз
среди
всех
остальных
перестроек
t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4.
Из
12
гена
MLL,
случаев
в
за
10
исключением
были
лишь
зафиксированы
неблагоприятные события, причем 8 пациентов погибли [325].
Наряду с описанными выше часто встречающимися перестройками
11q23/MLL существует большое число редких транслокаций с вовлечением
хромосомного района 11q23. Характеристика ряда из них приведена ниже.
Химерный ген MLL-EPS15 впервые описан O. Bernard et al. в 1994 г. [25]. В
основе образования данного химерного гена лежит реципрокная транслокация
63
t(1;11)(p32;q23).
Ген EPS15 (AF1P, AF-1P, MLLT5) располагающийся в хромосомном регионе
1р32, кодирует один из рецепторов эпидермального фактора роста, отвечающий
за эндоцитоз данного белка. Ген имеет протяженность 165 тысяч п.н., состоит из
25 экзонов и кодирует белок, состоящий из 896 аминокислот с молекулярным
весом 98656 Да [178]. Транскрипция гена осуществляется в теломерном
направлении. Описано 10 транскриптных вариантов, образующихся вследствие
альтернативного сплайсинга, однако только 4 из них кодируют белок [146]. У
человека наиболее высокая экспрессия гена EPS15 выявлена в Т- и В-лимфоцитах,
моноцитах и лимфобластах [21]. Белок EPS15, как участник сигнального пути
рецептора
эпидермального
фактора
роста
(EGFR),
регулирует
рост
и
пролиферацию клеток. Структура белка EPS15 приведена на рисунке 5.
Рисунок 5. Структура EPS15. В структуре данного белка выделяют: 1. Три Nконцевых EPS15-гомологичных домена (EH1, EH2, EH3), которые необходимы
для присоединения к цитоплазматической мембране путем взаимодействия с
белками и прямого связывания с фосфолипидами; 2. Биспиральный домен (ССD),
ответственный
за
гомо-
и
гетеродимеризацию;
3.
Аспартат-пролин-
фенилаланиновые повторы (DPF), которые могут связываться с α-субъединицей
адаптерного белка AP-2; С-концевой фрагмент представлен двумя убиквитинсвязывающими мотивами (UIM), которые необходимы для убиквитинилирования
EGFR. Схема дана по A. Salcini et al, C. Parachoniak et al. [149,340].
Известно, что существует 2 альтернативных механизма активации
онкогенного потенциала белка MLL [200,403]. Первый, более универсальный
механизм, связан с воздействием на мотив белка-партнера MLL различных
внешних факторов, что ведет к последующему неконтролируемому синтезу белка.
64
Данный механизм реализуется в том случае, если белок-партнер локализуется в
ядре клетки. Второй механизм, предложенный для MLL-EPS15 и ряда других
химерных белков с участием MLL, локализующихся в цитоплазме —
двуспиральная
олигомеризация
функциональных
доменов
белка
EPS15,
приводящая к лейкозогенной трансформации белка MLL, что, в свою очередь,
ведет к увеличенной способности клеток к самообновлению. Было показано, что
при ОЛ действие химерного белка опосредуется через гены семейства HOX
[62,88,175,293], однако, по отношению к ОЛЛ данная точка зрения разделяется не
всеми авторами [461].
В крупнейшем цитогенетическом on-line ресурсе — Базе данных
хромосомных аберраций и химерных генов F. Mitelman приводятся данные о 32
пациентах с транслокацией t(1;11)(p32;q23) [285]. Такие же цифры представлены
в обзорной статье J.-L. Huret [212]. К сожалению, в этих источниках не разделены
сведения о пациентах с первичными (n=20) и вторичными ОЛ (n=12), что
затрудняет детальную оценку случаев de novo ОЛ. Участники Европейской
рабочей группы по изучению перестроек 11q23 собрали информацию о 7
пациентах с транслокацией t(1;11)(p32;q23), включая одного пациента со
вторичным ОМЛ [420].
Прогностическое значение t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15 трудно оценить,
как в силу небольшого числа наблюдений, так и гетерогенности терапевтических
подходов, использовавшихся у данной группы пациентов. J.-L. Huret при ОЛЛ
выявил достоверно более низкие показатели БСВ и ОВ у пациентов мужского
пола по сравнению с женским [212].
Транслокация t(2;11)(q12;q23) ведет к образованию химерного гена MLLAFF3. Ген AFF3 (2q11.2-q12) относится к семейству AF4/AFF3/FMR2 генов,
получившему свое название за высокий процент гомологии с геном AF4. Разные
фрагменты гена AFF3 имеют от 32 до 82% гомологии с геном AF4 [157,275]. Ген
AFF3 кодирует одноименный белок с молекулярным весом 133476 Дa, состоящий
из 1226 аминокислот. Белок AFF3 локализуется в ядрах лимфоидных клеток и
является транскрипционным фактором, который важен для развития лимфоидной
65
ткани [176]. In vitro AFF3 способен связываться с двуцепочечной ДНК. Структура
белка AFF3 представлена на рисунке 6.
Рисунок 6. Структура белка AFF3 и его схематическое сравнение с белками AF4 и
FMR2. В каждом из этих трех белков выделяют N-концевой гомологичный домен
(NHD), AF4/AFF3/FMR2-гомологичный домен (ALF), трансактивационный домен
(TAD),
последовательность
с
ядерной
локализацией
(NLS),
С-концевой
гомологичный домен (CHD). Цифрами указан процент гомологии с белком AF4.
Стрелка указывает зону слияния с белком MLL. Схема дана по I. Nilson et al.,
A.von Bergh et al., C. Ma et al. [157,252,275].
Химерный ген MLL-AFF3 был выявлен всего в трех случаях ОЛЛ у детей,
причем два пациента были младше 1 года [252,329], а третий — в возрасте двух
лет [170]. Во всех трех случаях был обнаружен химерный транскрипт, который
образовался при слиянии 10-го экзона гена MLL c 6- м экзоном гена AFF3 (e10e6)
[170,252,329], однако у двух пациентов были выявлены и дополнительные
варианты: e9e6 [252], e10e7, e11e6, e11e7, e11e8 [170], что было связано с
альтернативным сплайсингом. В двух случаях была определена геномная точка
разрыва, локализовавшаяся в интроне 6 гена AFF3 [433].
Транслокация t(2;11)(p21;q23) — это одна из немногих транслокаций для
которых на сегодняшний день не найдено гена-партнера MLL, локализованного в
хромосомном районе 2p21 [433]. В литературе описано более 30 случаев
66
транслокации
t(2;11)(p21;q23),
причем,
только
у
взрослых
пациентов
[17,18,38,78,124,290,316,318,319,379,420,451] Примерно с равной частотой эта
хромосомная аномалия наблюдается при МДС и ОМЛ. Выявлено только по 1
случаю ОЛЛ [379] и острого бифенотипического лейкоза [124]. Часто данная
транслокация сочетается с делецией del(5q), характерной для МДС [18,38,316].
Изредка такое сочетание хромосомных перестроек наблюдается и при ОМЛ
[17,420,451]. У пациентов с наличием t(2;11) выявлена гетерогенность точек
разрыва внутри региона 11q23 [290,318], а вовлечение гена MLL методами FISH и
гибридизации по Саузерну доказано только у небольшой части пациентов
[290,379].
Было высказано предположение, что в тех случаях, когда t(2;11) является
единственной выявленной аберрацией, она чаще сопровождается перестройкой
гена MLL, в то время как в случаях с наличием del(5q) и возникновением t(2;11)
как вторичного цитогенетического события ген MLL не задействован [319]. В то
же время данная гипотеза разделяется не всеми авторами [318]. В MLLнегативных
случаях
при
инвертированной ПЦР
помощи
методов
FISH,
длинной
и
длинной
(ДИ-ПЦР) выявить ген, участвующий в данной
транслокации не удалось, однако, было показано, что точки разрыва в
хромосомном районе 11q23 хорошо кластеризуются и располагаются теломернее
гена MLL [318].
Транслокация t(X;11)(q24;q23) ведет к образованию химерного гена MLLSEPT6 [54]. Ген SEPT6 локализуется в длинном плече Х хромосомы в районе
Xq24 и кодирует белок септин 6 состоящий из 434 аминокислот с молекулярной
массой 49717 Да [148,180]. SEPT6 относится к группе септинов, в которую, кроме
него, входят еще 12 генов [160,194]. Септины являются эволюционно
консервативной группой ГТФ-связывающих и филламент-образующих белков,
которые относятся к суперсемейству P-петлевых ГТФаз [194]. Септины
участвуют в контроле фундаментальных свойств клетки - полярности формы и
процессов деления, а также в экзо- и эндоцитозе. Септин 6 реализует свою
функцию по организации актинового цитоскелета и деления клеток при
67
гетеромеризации с септином 2 [180]. Описано 11 вариантов транскриптов, 8 из
которых кодируют белок [148]. Структура белка септин 6 приведена на рис 7.
Рисунок 7. Структура септинов 6 и 9. Регион, богатый пролином (PRD), регион с
преобладанием основных аминокислот (PB), ГТФ-связывающий домен или Pпетля (GBD), биспиральный домен (ССD) . Стрелкой указаны места слияния при
образовании химерных белков MLL-SEPT6 и MLL-SEPT9. Схема дана по G. Hall
et al. [194].
Транслокация
t(X;11)(q24;q23)
и
её
разновидность
инсерция
ins(X;11)(q24;q23) могут быть субмикроскопическими и не выявляться при
стандартном цитогенетическом исследовании, что было ранее показано в 6 из 14
случаев, представленных в литературе [54,79,304,307,401]. Частота обнаружения
химерного гена MLL-SEPT6 составляет примерно 4% при ОМЛ у детей [433],
причем 8 из 14 описанных в литературе случаев были выявлены у детей в
возрасте младше 1 года [54,79,295,299,300,304,305,307,401,469]. В 5 из них был
выявлен
цитоморфологический
вариант
ОМЛ
М4
[54,79,300,305].
При
проведении трансплантации костного мозга прогноз у данной категории
пациентов
относительно
благоприятный
[54,79,295,299,300,304,305,307,401,
420,469].
Показано, что химерный ген MLL-SEPT6 может локализоваться как на
деривате Х хромосомы [54,300,401], так и деривате хромосомы 11 [304]. Описано
68
несколько механизмов образования данного химерного гена, что связано с
различной ориентацией генов MLL и SEPT6. В первом, и наиболее типичном
случае, химерный ген образуется при инверсии хромосомного района 11q23,
содержащего 5’-конец гена MLL, с последующей реципрокной транслокацией с
хромосомным районом Xq24 [300,401]. В ряде случаев этот механизм реализуется
с вовлечением в транслокацию третьей партнерской хромосомы [300]. Второй
вариант образования MLL-SEPT6 — инверсия района Xq24 с 3’-концом SEPT6, а
затем реципрокная транслокация с участием 11q23. Третий механизм связан со
вставкой инвертированного хромосомного района 11q23 с 5’-концом MLL в Xq24
[54,401]. Четвертый механизм образования MLL-SEPT6 был выявлен только у
одного пациента, у которого была обнаружена инсерция инвертированного
хромосомного района Xq24, содержащего 3’-конец гена SEPT6, в 11q23 [304].
У пациентов с наличием MLL-SEPT6 наиболее частыми точками слияния в
РНК гена MLL были 10 и 11 экзоны, которые суммарно выявлены у 13 из 14
пациентов
[54,79,295,300,304,305,307,401,469].
Единственным
исключением
являлся пациент, у которого химерный транскрипт был образован 12-м экзоном
гена MLL и 2-м экзоном гена SEPT6 [299]. Кроме 2-го экзона других точек
слияния в гене SEPT6 не выявлено [305]. В 6 случаях кроме основного химерного
транскрипта выявлялись еще и дополнительные, образующиеся вследствие
альтернативного
сплайсинга
[295,305,307,401],
причем,
в
3-х
случаях
альтернативный сплайсинг приводил к образованию химерных транскриптов, с
которых невозможен синтез белка [305].
Определение точки разрыва в геномной ДНК, проведенное C. Meyer et al
[320] показало, что чаще всего зоной разрыва в гене MLL являлся 11-й интрон, в
котором локализовались разрывы в 4 случаях из 9. В 3 случаях точка разрыва
находилась в 10-м интроне, и в двух — в 9-м. А в гене SEPT6 единственной зоной
разрыва являлся интрон 1 [305,320].
Комплексный
характер
генетической
перестройки,
связанный
с
вовлечением ДНК вне генов MLL и SEPT6, был подтвержден в ходе ДИ-ПЦР у 4-х
пациентов из 7. В двух случаях в образовании химерного гена также участвовали
69
некодирующие участки Х хромосомы; в третьем случае, кроме некодирующих
участков Х хромосомы, был выявлен еще один химерный ген MLL-MEF2C, с
которого не способен синтезироваться белок; в четвертом случае в образовании
химерного гена принимал участие некодирующий участок хромосомного района
11q23, расположенный в непосредственной близости от 3’-конца гена MLL [320].
Транслокация t(11;17)(q23;q25) ведет к образованию химерного гена MLLSEPT9. Ген SEPT9 располагается на длинном плече 17 хромосомы в регионе
17q25 и кодирует белок септин 9, состоящий из 586 аминокислот с молекулярной
массой 65401 Да. Также как и SEPT6, данный ген принадлежит к группе септинов,
обладая схожими функциями [194]. Структура белка септин 9 приведена на
рисунке 7.
Химерный ген MLL-SEPT9 описывается преимущественно у взрослых
пациентов и чаще при de novo ОМЛ М5 [34,49,100,123,171,307], реже при
вторичном ОМЛ [332] и МДС [55]. При ОМЛ у детей первого года жизни данный
химерный ген был описан лишь однажды у пациентки в возрасте 4 мес. с ОМЛ
М5,
у
которой
транслокация
t(11;17)(q23;q25)
была
единственной
цитогенетической аномалией [49].
Ранее точка слияния в химерном транскрипте MLL-SEPT9 была определена
всего у 11 пациентов [34,49,55,100,123,144,171,307,332]. Наиболее часто
химерный транскрипт образовывался при соединении 8-го экзона гена MLL и 3-го
экзона гена SEPT9 (e8e3). Данный вариант был выявлен у 6 пациентов с ОМЛ,
включая двух пациентов с вторичным ОМЛ, и четырех — c de novo ОМЛ
[49,100,307,332]. В число последних входил и пациент первого года жизни [49].
На втором и третьем по частоте месте располагаются варианты химерных
транскриптов e8e2 (3 случая ОМЛ) [34,100,144] и e7e2 (по 1 случаю МДС и ОМЛ)
[55,307]. Еще у двух пациентов с ОМЛ было выявлено по 2 типа химерных
транскрипта одновременно e8e2/e8e3 и e8e2/e9e2, которые, скорее всего, возникли
вследствие альтернативного сплайсинга [144,160]. В отличие от образования
химерного гена MLL-SEPT6, когда альтернативный сплайсинг затрагивает только
ген MLL и никогда SEPT6 [305], в данном случае выявлена противоположная
70
ситуация, механизм которой до конца не ясен, однако, возможной причиной этого
является существование большого количества изоформ транскрипта дикого типа
SEPT9 [160,185,370]. На уровне геномной ДНК наиболее часто разрывы описаны
в 1-м интроне гена SEPT9 [320].
Кроме представленных выше SEPT6 и SEPT9 в образовании химерных
генов с вовлечением MLL принимают участие и другие гены семейства септинов,
например, SEPT2 [400]. Химерные белки с участием MLL и септинов, всегда
имеют в своем составе практически полный белок септина с ГТФ-связывающим
доменом и биспиральным мотивом, что позволило высказать предположение о
сходном механизме лейкозогенеза для всей группы септинов [307], вероятнее
всего реализующимся путем олигомеризации септинов или взаимодействия с
другими белками [34].
Транслокация t(11;19)(q23;p13) с образованием химерного гена MLLMYO1F впервые описана в 2002 году [462]. На сегодняшний день известно, что в
регионе 19p13 располагается 5 генов-партнеров MLL, включая ELL (19p13.1),
MLLT1 (19p13.3), H3GL1 (19p13.3), ACER1 (19p13.3) и MYO1F (19p13.3–p13.2)
[433]. Как и другие цитоплазматические белки-партнеры MLL, для перехода в
функционально активную форму химерный белок
MLL-MYO1F должен
димеризоваться, что ведет к последующей клеточной трансформации [403].
Ген MYO1F (19p13.2–p13.3) относится I классу нетипичных миозинов, и
кодирует одноименный белок состоящий из 1098 аминокислот с молекулярной
массой 124844 Дa, который преимущественно экспрессируется в цитоплазме
клеток иммунной системы: натуральных киллерах, макрофагах, дендритных
клетках. Значительный уровень экспрессии MYO1F выявлен также в селезенке,
лимфоузлах, тимусе. Данный белок отвечает за подвижность клеток иммунной
системы и формирование неспецифической резистентности организма против
инфекционных агентов [302]. Структура белка MYO1F приведена на рисунке 8.
Описан всего один вариант транскрипта данного гена.
В доступной нам литературе встретилось описание трех случаев с наличием
химерного гена MLL-MYO1F и только у детей первого года жизни с ОМЛ
71
[435,441,462]. Возможно, такая низкая частота объясняется тем, что далеко не у
всех пациентов с выявленной транслокацией t(11;19)(q23;p13) проводится
определение типа химерного гена, а, возможно, соответствует реальной частоте
встречаемости данной аберрации. В двух из трех опубликованных случаев с
наличием MLL-MYO1F наблюдался цитоморфологический вариант ОМЛ М5а
[435,441].
Рисунок 8. Структура белка MYO1F. N-концевой двигательный домен, в составе
которого выделяют АТФ-связывающий (ATP) и актин-связывающий (Ab)
регионы, IQ мотив — место связывания с легкими цепями, два концевых
гомологичных домена (TH1, TH2), отвечающие за взаимодействия с мембранами
и С-концевой SH3 домен. Стрелкой указана зона слияния при образовании
химерного белка MLL-MYO1F. Схема дана по M. Krendel et al. [250].
Судя по всему, транслокация t(11;19)(q23;p13), ведущая к образованию
MLL-MYOF1, в ряде случаев может являться криптической. Так, в работе L. Lo
Nigro
et
al.
данный
химерный
ген
была
выявлен
у
пациента
с
субмикроскопической транслокацией между тремя хромосомами [462]. Еще в
одном случае у пациента был выявлен комплексный кариотип с вовлечением 7,
11, 19 и 22 хромосом: 46,XX,der(7)t(7;19)(q11;p13),der(11)t(7;11)(q11;q23),
del(19)(p13), der(22)t(11;22)(q23;p13) [435]. В третьем из описанных в литературе
случаев t(11;19) являлась единственной цитогенетической аномалией [441].
Местом разрыва в ДНК гена MLL при образовании химерного гена MLLMYO1F являлся 10-й интрон, а соответствующий химерный транскрипт
образовался при слиянии 10-го экзона гена MLL и 2-го экзона гена MYO1F, что
72
было выявлено во всех ранее описанных случаях [435,441,462].
Транслокация t(1;11)(q21;q23) ведет к образованию химерного гена MLLMLLT11 [26]. В гене MLLT11 выделяют два экзона, и выявлен только 1
транскриптный вариант MLLT11 длиной 4072 п.н., который кодирует белок,
состоящий из 90 аминокислот, с молекулярной массой 10061 Дa [147,179].
Биологическое значение белка MLLT11 до конца не изучено. Его
гиперэкспрессия была выявлена при ОМЛ у детей [143] и взрослых [142], МДС
[230], злокачественных опухолях щитовидной железы [463]. Также было
показано, что индукция
синтеза MLLT11 происходит при
воздействии
бенз(о)пирена на эпителиальные клетки молочной железы [248]. Кроме того, было
высказано предположение, что MLLT11 является медиатором метастазирования
при раке молочной железы [172]. Для ОМЛ у детей и МДС было показано, что
гиперэкспрессия
данного
гена
является
независимым
прогностически
неблагоприятным фактором, однако является ли она суррогатным маркером или
ген MLLT11 каким-то образом участвует в процессах лейкозогенеза на
сегодняшний день неизвестно [143,230].
Из 67 случаев обнаружения транслокации t(1;11)(q21;q23), представленных
в литературе, 11 (16,4%) было выявлено детей первого года жизни [26,57,85,161,
167,296,314,320,325,420]. У детей t(1;11)(q21;q23) чаще была представлена в
качестве единственной сбалансированной хромосомной аномалии (40 случаев из
60). В тоже время у взрослых пациентов преобладало сочетание t(1;11) с
различными структурными и количественными ДХА (4 случая из 7) [420]. В
подавляющем большинстве случаев (61 из 67) эта транслокация выявлялась при
de novo ОМЛ, кроме этого описано 4 случая ОЛЛ, включая 2 случая вторичного
ОЛЛ и 1 случай вторичного ОМЛ [26,57,85,161,167,296,308,314,320,325,420].
Среди детей первого года жизни, у которых была найдена транслокация
t(1;11)(q21;q23) единственным морфологическим вариантом являлся ОМЛ
[26,57,85,167,296,420].
В рамках кооперативного исследования прогностической значимости
различных перестроек 11q23/MLL при ОМЛ у детей было показано, что дети с
73
наличием данной хромосомной аномалии (n=25) имели наилучший прогноз среди
всех MLL-позитивных ОМЛ (n=756). Величина ОВ составила 100%, а БСВ —
92±5%. При этом медиана возраста пациентов, у которых была обнаружена
t(1;11)(q21;q23) была 1,3 года [325].
Структура химерного транскрипта MLL-MLLT11 описана в 16 случаях, в т.ч.
в 15 случаях у детей (включая пациентов первого года жизни) и у 1 взрослого.
Было выявлено два типа химерных транскриптов: e9e2 и e10e2, которые
выявлялись
как
изолированно,
так
и,
в
ряде
случаев,
совместно
[26,57,296,308,314]. Местом разрыва в ДНК гена MLL при образовании химерного
гена MLL-MLLT11 являются 9-й (61,5%) и 10-й интроны (38,5%) [433].
Кроме образования различных химерных генов, ген MLL может вовлекаться
и в другие генетические аберрации, например, к таковым можно отнести
частичные тандемные повторы (MLL-PTD), образующиеся внутри рамки
считывания (Рисунок 9).
Рисунок 9. Схема MLL-PTD (А). Структура гена MLL c частичным тандемным
повтором фрагмента между 2 и 9 интронами гена MLL (выделен зеленым цветом).
Стрелками указаны места разрывов в гене MLL (Б).
Структура белка MLL, содержащего частичный тандемный повтор 2-9 интронов и
соответствующих экзонов, что приводит к повтору части N-концевого фрагмента
(выделено зеленым цветом), содержащей AT hooks, SNL-1, SNL-2, DNMT.
Стрелками указана зона повтора.
74
В образование MLL-PTD вовлекаются фрагменты гена MLL, обладающие
высокой степенью гомологии: наиболее часто — интроны 2-9, реже — 2-10, 2-11,
4-9,4-11,3-8 [320]. Считается, что MLL-PTD способствует димеризации Nконцевого фрагмента белка MLL, что в дальнейшем ведет к дисрегуляции генов
семейства HOX [200,291] — универсальному механизму реализации действия
химерных генов с участием MLL, запускающему лейкемическую трансформацию
[134]. Однако, несмотря на схожий механизм действия, оценка профиля
экспрессии на биочипах высокой плотности показала различную биологическую
природу MLL-PTD и перестроек 11q23/MLL [173].
Частота обнаружения MLL-PTD при ОМЛ варьирует в широком диапазоне
— от 0,9 до 13% [79,173,274,419], что связывают как с различиями в стартовом
материале для исследования (ДНК/РНК), так и в методе выявления (обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), длинная ПЦР,
множественная
лигазно-зависимая
амплификация
зондов-MLPA)
[274].
В
работах, проведенных на кДНК, частота выявления MLL-PTD при ОМЛ у детей
достигала 10-13% [173,419]. В то же время в ходе мультиплексной ПЦР, где в
качестве стартового материала применялась геномная ДНК, L. Shih et al.
обнаружили MLL-PTD всего в 0,9% случаев [79]. Несколько выше была частота
данной аберрации в работе B. Balgobind et al., где также в качестве исходного
материала использовалась ДНК из бластных клеток пациентов с ОМЛ, а при
применении технологии MLPA, частота выявления MLL-PTD составила 2,5%
[274]. Прямая сравнительная характеристика различных методов детекции MLLPTD показала более высокую частоту их обнаружения в кДНК. При этом MLLPTD были обнаружены и в гемопоэтических стволовых клетках здоровых доноров
при использовании высокочувствительной технологии «гнездной» ПЦР, в то
время как при блот-гибридизации по Саузерну эти изменения не выявлялись.
[398]. При сравнении данных ОТ-ПЦР и MLPA было показано, что MLPA выявила
MLL-PTD у 7 из 276 обследованных пациентов (2,5%), а в ходе ОТ-ПЦР было
обнаружено еще 6 дополнительных случаев, которые при проведении MLPA были
MLL-PTD-негативными. Более того, во всех этих 6 случаях MLL-PTD сочетались с
75
перестройками гена MLL [274]. В то же время ранее было показано, что MLL-PTD
исключают наличие других перестроек 11q23/MLL и часто сочетаются с
нормальным кариотипом [173,274,347,419] или трисомией по 11 паре хромосом
[101,459].
В заключение следует отметить, что на сегодняшний день остаются
нерешенными вопросы о частоте встречаемости и спектре перестроек 11q23/MLL,
особенно с учетом редких генов-партнеров MLL, их взаимосвязи с возрастом,
механизмах формирования химерных генов с участием MLL.
1.7.3. Прогностическое значение перестроек 11q23/MLL
Практически все исследовательские группы сходятся на том, что наличие
любых перестроек 11q23/MLL значительно ухудшает прогноз ОЛЛ у детей
первого года жизни [33,58,310,335,392]. В то же время существует мнение о
неравнозначной прогностической роли различных аномалий 11q23/MLL при ОЛЛ
у детей исследуемой возрастной категории. Традиционно считается, что наиболее
неблагоприятной является транслокация t(4;11)/MLL-AF4, в то время как прогноз
для пациентов с t(11;19)/MLL-MLLT1 и t(9;11)/MLL-MLLT3 – несколько лучше
[336]. С другой стороны, в рамках протоколов CCG-1953 и Interfant-99 пациенты
с любой из вышеперечисленных транслокаций имели сходную величину БСВ
[33,58].
Не менее противоречивые данные получены и для ОМЛ. С одной стороны,
показана различная прогностическая значимость отдельных транслокаций:
неблагоприятная
роль
t(10;11)
и
t(6;11)
и,
наоборот,
благоприятная
t(1;11)(q21;q23) [325]. С другой стороны, при изолированной оценке исходов
терапии у детей первого года жизни, а также от 1 года до 2-х и от 2-х до 10-и
наличие и тип перестроек 11q23/MLL не влияли на прогноз при терапии по
протоколам AML-BFM 98 и AML-BFM 2004 [162].
Еще одним важным прогностическим фактором, тесно связанным с
перестройками 11q23/MLL при ОМЛ являются ДХА. Пациенты, у которых было
76
выявлено сочетание перестроек 11q23/MLL с определенными структурными и/или
количественными хромосомными нарушениями имели более низкую БСВ и более
высокий кумулятивный риск развития рецидива по сравнению с пациентами без
ДХА. Структурные ДХА в сочетании с перестройками 11q23/MLL также являются
маркерами плохого прогноза [362].
Все это подчеркивает необходимость дальнейшего накопления данных о
связи конкретных перестроек с исходами ОЛ у детей первого года жизни.
1.7.4. Методы выявления перестроек 11q23/MLL
Наиболее частыми методами выявления перестроек 11q23/MLL являются
цитогенетическое
исследование
клеток
лейкозного
клона,
метод
FISH,
гибридизация по Саузерну, различные виды ПЦР. Каждый из этих методов
обладает своими преимуществами и недостатками, и поэтому наиболее
рациональным является их сочетанное применение.
Так цитогенетическое исследование позволяет выявить практически любую
транслокацию с вовлечением хромосомного района 11q23, охарактеризовать
дополнительные к 11q23 хромосомные аномалии, но, в то же время, этот метод
обладает
относительно
невысокой
чувствительностью
(10-1-10-2),
низкой
разрешающей способностью, и не способен выявлять небольшие по размеру
хромосомные аберрации размером менее 10 млн. пар нуклеотидов [53,210], а
также скрытые (криптические) варианты транслокаций [113,115,289,450]. Кроме
этого цитогенетический метод чрезвычайно зависим от способности опухолевого
клона к делению in vitro [464]. При цитогенетическом исследовании транслокации
с вовлечением хромосомного района 11q23 выявляются с частотой от 43% до 66%
при ОЛЛ у детей первого года жизни [81,90,117,231], в то время как при
использовании FISH или гибридизации по Саузерну перестройки гена MLL
обнаруживаются в 73-79% случаев у пациентов исследуемой возрастной группы
[33,335]. Последние два метода используют универсальный зонд, который в
случае FISH дополнительно метится флуоресцентным красителем, что позволяет
77
выявлять практически любую перестройку с участием гена MLL. Оба этих метода
не зависят от митотической активности клеток опухолевого клона, однако, они не
способны дать информацию о гене-партнере MLL. Еще одним недостатком
гибридизации по Саузерну является её трудоёмкость.
Метод FISH является высокоэффективным способом скрининга на наличие
перестроек гена MLL [20,127,376,379,399]. Для этой цели разработан ряд
коммерческих наборов зондов, одни из которых предназначены только для
выявления перестройки гена MLL без верификации гена-партнера, другие
позволяют определять наличие наиболее частых химерных генов с участием MLL
и генов-партнеров, третьи позволяют оценивать имеющиеся хромосомные
перестройки (хромосомоспецифические или цельнохромосомные зонды). При
использовании зондов первого и второго из описанных типов перестройки гена
MLL могут быть выявлены не только в клетках на стадии метафазы, но и в
интерфазных ядрах бластов. Также было показано, что при исследовании методом
FISH, кроме стандартного распределения флуоресцентных сигналов, у части
пациентов выявляются перестройки MLL с одновременной делецией 3’-конца гена
MLL. Приводимые в литературе данные о частоте встречаемости этих делеций
крайне неоднородны: от 8% до 28% [20,23,39,201,294,376,379,399]. Более того,
частота делеций 3’-конца гена MLL у детей первого года жизни остается до конца
неизвестной, так как все авторы проводили оценку перестроек гена MLL в
смешанных группах, включающих как детей, так и взрослых.
Также для выявления наиболее распространенных перестроек MLL хорошо
зарекомендовал себя метод ОТ-ПЦР с детекцией методом электрофореза, а также
его разновидность — ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), при которой
происходит
амплификация
с
одновременной
детекцией
интенсивности
флуоресцентного сигнала. Плюсами этого метода являются относительная
простота и высокая скорость выполнения, минусами — ограниченный репертуар
перестроек. Чаще всего детектируется только лишь MLL-AF4 [303,411], либо три
самых распространенных химерных транскрипта MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLLMLLT3 [246]. Реже используются подходы, основанные либо на выявлении
78
методом мультиплексной ОТ-ПЦР 10 химерных транскриптов с участием MLL,
включая MLL-FOXO4, MLL-MLLT11, MLL-EPS15, MLL-AF4, MLL-MLLT4, MLLMLLT3, MLL-MLLT10, MLL-MLLT6, MLL-ELL, MLL-MLLT1 совместно с MLL-PTD
[314,315], либо с использованием гидрогелевых биочипов низкой плотности
[1,93]. Но даже из вышеперечисленного перечня перестроек гена MLL условия
проведения ПЦР-РВ описаны лишь для ограниченного количества химерных
транскриптов [246,409]. Еще один немаловажный аспект при исследовании
перестроек гена MLL методом ОТ-ПЦР - существование большого количества
транскриптных вариантов, которые при использовании одной и той же пары
праймеров могут давать ампликоны различной длины, что заметно усложняет
интерпретацию получаемых результатов. Например, для химерного транскрипта
MLL-AF4 предполагается существование не менее 12 комбинаций, образующихся
при слиянии различных экзонов генов MLL и AF4, а для MLL-MLLT10 таких
вариантов может быть 18, для MLL-MLLT3 и MLL-ELL – по 8 [315].
Еще одним методом, использующимся для выявления перестроек гена MLL,
является ДИ-ПЦР. ДИ-ПЦР имеет ряд преимуществ перед другими молекулярногенетическими методами диагностики перестроек гена MLL. Во-первых, это
высокая точность, хорошая воспроизводимость; во-вторых, это выявление
практически любой перестройки гена MLL, вне зависимости от механизма её
образования; в-третьих, ДИ-ПЦР дает точное картирование зоны слияния двух
генов; в-четвертых, данный метод позволяет однозначно охарактеризовать геныпартнеры MLL, участвующие в образовании прямого и реципрокного химерного
генов [132,289]. Необходимо подчеркнуть, что из описанных на сегодняшний
день 79 генов-партнеров MLL 34 были впервые охарактеризованы при
использовании ДИ-ПЦР [433].
На основании данных ДИ-ПЦР были выделены несколько механизмов
образования химерных генов (Рисунок 10), наиболее частым из которых является
реципрокная
транслокация,
при
которой
две
хромосомы
обмениваются
участками, что приводит к образованию прямого химерного гена и его
реципрокного варианта. Второй по распространенности механизм — инсерция
79
фрагмента хромосомного района 11q23 в другую хромосому или наоборот [320].
Показано, что большинство генов имеют только один возможный механизм
образования химерного гена, хотя имеются и исключения. Так, гены-партнеры,
транскрибируемые в теломерном направлении могут образовывать химерные
гены с участием MLL путем реципрокных транслокаций, транс-сплайсинга
(spliced fusion) или делеций 11q. Гены, транскрипция которых идет в
центромерном направлении, могут образовывать химерные гены только путем
инсерций 1 и 2 типа или инверсии (Рисунок 11).
Рисунок 10. Различные механизмы образования химерных генов. rCTL реципрокная хромосомная транслокация, происходящая при наличии двух точек
разрывов в двухцепочечной ДНК (2 DSBs); Del — делеции и Inv — инверсии
также происходят при наличии двух точек разрыва; 3W-CTL — комплексная
транслокация с участием трех хромосом возможна только при наличии трех точек
разрыва в двухцепочечной ДНК (3 DSBs); CTL+Δ — транслокация в сочетании с
делецией, для её реализации также необходимо наличие трех разрывов ДНК; Ins 1
— инсерция 1 типа, при которой часть 11 хромосомы, включающая в себя ген
MLL, встраивается в партнерскую; Ins 2 — инсерция 2 типа, характеризующаяся
тем что ген-партнер вместе с хромосомой на которой он расположен встраивается
в ген MLL; сCTL — комплексная транслокация с участием не менее чем четырех
хромосом возможна только при наличии четырех и более (хромотрипсис) точек
разрыва в двухцепочечной ДНК. Схема дана по C.Meyer et al. [320].
Перестройки гена MLL, затрагивающие только 11 хромосому, могут
образоваться только при наличии двух независимых разрывов двухцепочечной
80
ДНК (инверсии, делеции) Так, например, химерные гены с участием AP2A2,
BTBD18, BUD13, C2CD3, LOC100131626, MAML2, NRIP3, PICALM или PRPF19
образуются путем инверсии фрагментов 11p или 11q. И, наоборот, делеции 11
хромосомы
ведут
к
тому,
что
5’-часть
гена
MLL
соединяется
с
нижерасположенным геном-партнером, среди которых ARHGEF12, BCL9L, CBL и
CEP164 [320,433].
Рисунок 11. Типы генов-партнеров и механизмы образования химерных генов с
участием MLL. Серым цветом выделены гены, которые упомянуты в разделе
«Реципрокные транслокации» Схема дана по C.Meyer et al. [433].
Особый интерес вызывает группа, в которой химерные гены образуются
путем транс-сплайсинга [320,406,433]. При этом точка разрыва в ДНК находится
за пределами гена-партнера, т.е. перед его началом (выше, 3’). А для синтеза
функционирующей
транскрипция
мРНК
происходила
с
химерного
одновременно
транскрипта
со
необходимо,
сплайсингом, при
чтобы
котором
последний по отношению к точке разрыва экзон гена MLL (находящийся 5’),
соединяется с любым, за исключением первого, экзоном гена-партнера [406].
Такой механизм описывается как для ряда редких генов-партнеров MLL, включая
81
DCPS, ZFYVE19, CT45A2 (для которых он является единственным), так и для AF4,
EPS15, MLLT3, MLLT1, ELL, MYO1F, SEPT5 [320,433] (для которых основным
механизмом образования химерного гена является реципрокная транслокация).
Для MLL-MLLT1 такой механизм выявлен примерно в половине всех случаев
[406], и примерно в 30% случаев для MLL-EPS15 [320]. При наличии MLL-AF4,
MLL-MLLT3, MLL-SEPT5 транс-сплайсинг встречается очень редко [433].
Известно, что при образовании химерных генов с участием MLL чаще всего
разрыв в ДНК происходит в основном регионе разрыва (major breakpoint cluster
region) гена MLL протяженностью 7699 пар нуклеотидов, расположенном между 7
и 13 экзонами [45,132,339]. Причем подавляющее большинство точек разрыва
(94%) локализуется между 9 и 12 экзонами [289]. Определение точки разрыва в
ДНК гена MLL находит свое применение как для исследования биологии ОЛ,
ассоциированных с перестройками гена MLL [64,65,320,433], так и для создания
индивидуальных для каждого пациента условий мониторирования минимальной
остаточной болезни (МОБ) [312,364]. На основании выявления структуры
химерного гена и мониторинга МОБ можно оценивать динамику различных
лейкозных клонов и сравнивать их количество при развитии MLL-позитивного de
novo ОЛ, а также при рецидиве и вторичном ОМЛ [111]. Также было показано,
что пациенты с MLL-позитивным ОЛ, у которых точка разрыва находилась в 11
интроне гена MLL, имели достоверно более низкую вероятность БСВ [422].
Еще одним новым и достаточно перспективным методом для выявления
перестроек гена MLL является секвенирование нового (следующего) поколения
[128].
1.8. Прогностическое значение ответа опухолевых клеток на интенсивную
химиотерапию. Определение минимальной остаточной болезни при остром
лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни
Ответ на терапию ОЛЛ уже в течение длительного времени используется
как один из важнейших факторов прогноза и стратификации пациентов по
82
группам риска.
Первым показателем, который начал применяться для оценки ответа на
терапию ОЛЛ, было абсолютное количество бластных клеток в периферической
крови на 8-й день монотерапии преднизолоном. Величина БСВ у пациентов,
лечившиеся по протоколу ALL-BFM 83 и имевших более 1000 бластных клеток в
1 мкл периферической крови (т.н. «плохой ответ на преднизолон») была
достоверно ниже, чем у детей, имевших «хороший ответ» на преднизолон (47% и
76%, соответственно) [110]. Начиная с этого времени, абсолютное количество
бластных клеток в периферической крови на 8-й день терапии стало широко
использоваться во всех последующих протоколах, использующих в качестве
базисного стероидного препарата преднизолон [33,391]. В группе детей первого
года жизни, включенных в исследование группы BFM, было показано, что две
трети рецидивов развились в группе пациентов, которые имели плохой ответ на
преднизолон, и только одна треть рецидивов — у пациентов с хорошим ответом
[348].
Еще
одним
методом,
помогающим
оценивать
степень
редукции
опухолевого клона, является определение МОБ, под которой понимают
сохранение в организме пациента опухолевых клеток в количествах, не
распознаваемых стандартными цитологическими методами. Для определения
МОБ при ОЛЛ применяются такие высокочувствительные методы диагностики,
как ПЦР и многоцветная проточная цитометрия [9,74,94,95,96,280,360,361,364,
365,366,390,410,416].
Большое количество усилий было приложено для стандартизации всех
этапов количественного анализа при определении специфических для каждого
больного перестроек генов иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов
(TCR) методом ПЦР. Это дало возможность определить требования к количеству
вносимого
в
реакцию
материала,
сформулировать
такие
понятия
как
«чувствительность», «количественный диапазон», «МОБ-позитивность», «МОБнегативность»,
а
также
«положительный
образец,
не
поддающийся
количественной оценке» [56], разработать алгоритмы данного вида лабораторной
83
диагностики в условиях проведения многоцентровых исследований [331].
Данный метод широко применяется при мониторинге МОБ у детей и
взрослых с ОЛЛ в европейских странах [96,280,364,366,410]. На основании
данных,
получаемых
при
мониторинге
МОБ,
уже
сегодня
проводится
стратификация пациентов с ОЛЛ, получающих терапию по многим современным
протоколам [94,95,164,253,280,281,311]. Он также хорошо себя зарекомендовал не
только при de novo ОЛЛ, но и при рецидивах ОЛЛ [367,368].
Длительное отслеживание эффективности терапии путем оценки наличия и
величины МОБ стало важной особенностью протокола Interfant-99 [364]. В
исследование о прогностической роли МОБ в рамках Interfant-99 было включено
99 из 478 детей. Исследование МОБ проводилось путем количественного анализа
индивидуальных перестроек Ig/TCR методом ПЦР-РВ. У 83 пациентов (84%) был
выявлен по меньшей мене один маркер для оценки МОБ с количественным
диапазоном ≤10-4. В 11 случаях был найден маркер с количественным диапазоном
5×10-4, и в 5 — с диапазоном ≥10-3. Исходя из этого, результаты последних 16
пациентов принимались во внимание, только при получении позитивных
результатов в рамках количественного диапазона [364].
Количество МОБ-позитивных пациентов, а также величина МОБ снижались
при продолжающемся лечении по протоколу Interfant-99. По окончании
индукционной терапии — точка наблюдения (ТН) 2— около 40% пациентов
имели высокую (от 10-3 до 10-2) или очень высокую величину МОБ (≥10-2). В то
время как после консолидации (ТН3) примерно половина пациентов достигла
МОБ-негативности. В более поздние ТН МОБ выявлялась лишь у небольшого
количества пациентов, и чаще величина МОБ была ниже 10-4. Пациенты с
наличием перестроек гена MLL имели более медленный клиренс МОБ, по
сравнению с MLL-негативными пациентами [364].
Группировка пациентов по величине МОБ в ТН 2 дала возможность
разделить пациентов с различными исходами терапии [364]. Противоположные
данные были получены в исследовании A. Li et al., проводивших мониторинг
МОБ у пациентов, получавших терапию по протоколу DFCI ALL 95-01. ТН сразу
84
после индукции не являлась дискриминирующей [136]. Возможными причинами
этого могут служить как различия в интенсивности индукционной части
протоколов DFCI ALL 95-01 и Interfant-99, так и выбор A. Li et al лишь одного
гена IgH в качестве маркера. Следующая ТН в протоколе Interfant-99 – ТН3 —
после консолидации. МОБ в этой ТН позволила определить пациентов с высоким
риском развития рецидива. Все пациенты, имевшие в этой ТН величину МОБ ≥
10-4 рецидивировали [364]. Авторами был предложен еще один вариант
использования данных МОБ — совместное использование данных МОБ в ТН2 и
ТН3. 14 пациентов (26%), у которых величина МОБ в ТН3 ≥10-4 были отнесены
группу высокого риска. Безболезненная выживаемость в этой группе составила
0%. 24 пациента (44%), у которых в обеих ТН величина МОБ была <10-4,
отнесены в группу низкого риска. В этой группе зафиксировано 3 рецидива. Все
остальные пациенты (n=16, 30%) были отнесены к промежуточной группе риска,
в которой безболезненная выживаемость составила 69%. Интересно отметить, что
в группе высокого риска не было ни одного пациента без перестроек гена MLL, в
то время как в группе низкого риска таковых оказалось 9 человек. Также важно
подчеркнуть, что разделение пациентов, исходя из данных МОБ, не было связано
со стратификацией по инициальным группам риска, а эти методы выделяют
разные когорты пациентов [364].
Из недостатков определения МОБ методом выявления индивидуальных
перестроек Ig/TCR следует отметить то, что проведение такого исследования
технически сложно и растянуто по времени [74,130,410,416], что затрудняет его
использование для решения клинических задач в условиях нашей страны.
Еще одним подходом для мониторинга МОБ является использование
сиквенса зоны разрыва в MLL и гене-партнере [132] для создания пациентспецифичной тест-системы с оценкой методом ПЦР-РВ [184,312,364]. К
преимуществам данного метода следует отнести возможность абсолютного
подсчета МОБ (по сравнению с использованием РНК), а также прямую
взаимосвязь между количеством химерного гена с участием MLL и опухолевых
клеток лейкозного клона (по сравнению с перестройками генов Ig/TCR).
85
В целом последовательность выполнения и интерпретации результатов
очень близка к тому, что было предложено Европейской рабочей группы по
изучению МОБ при ОЛЛ (ESG-MRD-ALL, в настоящее время — EuroMRD) для
перестроек Ig/TCR [56]. На первом этапе проводится скрининг на наличие
перестроек
11q23/MLL
любым
доступным
способом
(цитогенетическое
исследование, ОТ-ПЦР, FISH, гибридизация по Саузерну). После этого геномная
ДНК исследуется методом ДИ-ПЦР для выявления индивидуальной для каждого
пациента точки разрыва в гене MLL и гене-партнере. Затем, исходя из сиквенса
зоны слияния, подбирается комбинация праймеров и флуоресцентных зондов,
которая затем тестируется методом ПЦР-РВ на 10-кратных разведениях ДНК
пациента, полученной в ходе диагностики до начала химиотерапии. Для создания
калибровочной кривой, а также оценки чувствительности и количественного
диапазона используются разведения исходной ДНК смесью ДНК здоровых
добровольцев/доноров в соотношении
от 10-1 до 10-5. При получении
удовлетворительных данных (количественный диапазон не менее 10-4) данная
комбинация праймеров, и флуоресцентных зондов используется вместе с 10кратными разведениями исходной ДНК для количественного анализа [56,312].
Данный подход технически выполним, и позволил с успехом проводить
мониторинг МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни [364] и взрослых с
наличием
перестроек
определения
МОБ
MLL
по
[312].
Проведенный
пациент-специфичным
сравнительный
перестройкам
анализ
Ig/TCR
и
индивидуальной структуре зоны разрыва в ДНК при образовании химерного гена
c участием MLL показал хорошую степень сопоставимости двух методов. В
анализ было включено 149 маркеров-мишеней для Ig/TCR и 49 для MLL.
Количественный диапазон ≤10-4 был достигнут для 74 (52%) Ig/TCR маркеров и
для 35 (71%) MLL маркеров. При этом чувствительности ≤10-4 достигли 134 (94%)
Ig/TCR маркера и 47 (96%) MLL маркеров. У 40 пациентов и Ig/TCR, и MLL
маркеры были использованы для оценки МОБ [364].
В этом случае под конкордантностью понимали менее чем трехкратные
различия между двумя методами. Таким образом, в 80 из 123 образцов (65%)
86
были получены конкордантные результаты, в 23 (19%) — дискордантные, в 8
(7%) — оба маркера были за пределами количественного диапазона, и в 15 (12%)
МОБ была определена только по 1 маркеру, в то время как второй являлся
«позитивным, но не поддающимся количественной оценке». Авторы утверждают,
что различия, зафиксированные в 19% дискордантных образцов в большей
степени связаны с незначительными колебаниями выше и ниже количественного
диапазона, нежели с реальными расхождениями. В 6 образцах (5%) величина
МОБ, полученная при анализе перестроек Ig/TCR была незначительно выше, чем
данные, полученные с использованием MLL (диапазон различий 3,5-5,7 раз). И,
наоборот, в 14 образцах (11%) МОБ, полученная при анализе MLL, была
значительно выше, чем при применении Ig/TCR маркеров (диапазон различий 3,9410 000 раз) [364], что, скорее всего, связано с тем, что используемый Ig/TCR
маркер происходил из одного из опухолевых субклонов [219].
Различия в полученных результатах связаны с тем, что перестройки гена
MLL связаны с процессами лейкозогенеза, и с большой долей вероятности
присутствуют во всех лейкозных клетках, в то время как для перестроек Ig/TCR, и
в первую очередь гена IgH, характерна олигоклональность, т.е они выявляются
только в части (субклоне) лейкозных клеток [219]. Таким образом, использование
MLL маркеров имело значительные преимущества, и было рекомендовано для
использования в первой пинии диагностики МОБ у детей первого года жизни с
ОЛЛ [364]. Также в пользу MLL маркеров говорит тот факт, что количественный
диапазон ≤10-4 был достигнут в 70% их применения, и только в половине случаев
использования Ig/TCR маркеров.
Третьим
из
существующих
методов
мониторинга
МОБ
является
применение ОТ-ПЦР и/или ПЦР-РВ для выявления химерных транскриптов. Этот
метод дает хорошую возможность контролировать МОБ у пациентов первого года
жизни, так как перестройки гена MLL встречаются у большинства пациентов этой
возрастной группы [33,58,68,69,190,310,335], а данный метод молекулярной
диагностики
является
стандартизованным,
легко
воспроизводимым
и
относительно быстро выполнимым [152,409,411]. Более того, ОТ-ПЦР позволяет
87
получать результаты определения МОБ, сопоставимые с результатами выявления
перестроек генов Ig/TCR [375,377].
Химерные транскрипты, выявляемые методом ОТ-ПЦР, или величина МОБ,
определяемая при проведении ПЦР-РВ, используется в качестве фактора ответа
относительно редко. Одной из причин этого является то, что химерные гены
встречаются в среднем только у 40% пациентов с ОЛЛ [130]. Однако, в случаях
выявления химерных транскриптов, они являются высокочувствительными (10-410-6) и стабильными маркерами [416]. Поэтому, данный вариант мониторинга
МОБ нашел свое применение в группах, выделенных именно по наличию
конкретного химерного гена. Так в работе L. Elia et al. при выявлении химерных
транскриптов MLL-AF4 методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ у 17 взрослых пациентов с
ОЛЛ
было
показано,
что
у
пациентов
достигших
МОБ-негативности
кумулятивная вероятность развития рецидива была ниже, чем у тех, кто оставался
MLL-AF4-позитивным (44% и 88% соответственно) [389]. Позднее этой же
группой исследователей был проведен анализ 12 случаев ОЛЛ, включая 1
пациента младше 1 года и 3-х — старше 1 года, с наличием химерного
транскрипта MLL-MLLT1. Интересно, что у 5 пациентов в этой группе, включая
пациента первого года жизни, получавшего терапию по протоколу Interfant-99,
было выявлено длительное персистирование химерного транскрипта MLL-MLLT1,
а также повторное его выявление после достижения МОБ-негативности без
последующего развития клинико-гематологического рецидива [92].
Все это свидетельствует в пользу того, что определение МОБ путем
выявления химерных транскриптов с участием MLL должно быть использовано в
таргетных группах, каковой являются дети первого года жизни, как для
получения новых данных о биологии опухоли, так и для оценки клинической
значимости этого метода.
Несмотря на то, что проточная цитометрия уже достаточно давно является
широко распространенным методом мониторинга МОБ при ОЛ, ее применение у
детей первого года жизни зачастую затруднено. Основными сложностями
использования этого метода в данной возрастной группе являются упомянутые
88
ранее особенности иммунофенотипа опухолевых клеток при наличии перестроек
гена MLL, а также крайняя нестабильность экспрессии антигенов во время
терапии [105,231]. Кроме того, чаще всего описываются только алгоритмы оценки
МОБ у детей с CD10-позитивными В-линейными ОЛЛ, в то время как у детей
первого года жизни преобладают CD10-негативные варианты. По-прежнему не
решен вопрос о целесообразности использования для выявления МОБ так
называемых MLL-ассоциированных антигенов, таких как CD15, CD65 и, прежде
всего, NG2. Показано, что NG2 не экспрессируется на предполагаемых
лейкемических стволовых клетках при ОЛЛ, ассоциированном с перестройками
гена MLL [251].
Результаты определения МОБ методом проточной цитометрии при ОЛЛ у
детей первого года жизни на данный момент представлены лишь в одной
публикации группы Interfant, в которой исследовался 51 пациент, получавший
терапию по протоколам Interfant-99 и Interfant-06 в рамках итальянской группы
AIEOP. МОБ определяли на 15-й и 33-й дни индукционной терапии. По
результатам иммунофенотипирования на 15-й день пациенты были разделены на
две группы: группа стандартного риска (МОБ<0,1%) и группа высокого риска
(МОБ≥1%). Эти группы существенно различались как по БСВ (77,9±11,3% и
32,0±8,5% соответственно), так и по кумулятивной вероятности развития
рецидива (14,9±10,2% и 58,0±8,8% соответственно). Результаты определения
МОБ на момент окончания индукционной терапии (день 33) не добавили
дополнительной прогностически важной информации к данным, полученным в
более ранней ТН (день 15). В отличие от определения МОБ методом ПЦР, в
протоколах группы Interfant проточную цитометрию возможно применять для
выделения группы низкого риска, а не высокого. Так как в рамках протокола
Interfant-06 единственным критерием группы низкого риска является отсутствие
перестроек
гена
MLL,
в
многовариантном
анализе
была
сопоставлена
применимость низкого уровня МОБ на 15-й день терапии и MLL-негативного
генотипа
для
выделения
пациентов
с
благоприятным
прогнозом.
В
многофакторном анализе ни один из этих параметров не остался независимым
89
прогностическим фактором, что отчасти может быть связано с относительно
небольшим размером исследуемой группы. Авторами работы был сделан вывод о
том, что определение МОБ методом проточной цитометрии на 15-й день терапии
может быть с успехом использовано в комбинации с другими прогностическими
факторами для стратификации пациентов [215].
Сравнительная характеристика различных методов определения МОБ
приведена в таблице 5.
В заключение необходимо отметить, что в доступной нам литературе не
встретилось данных о выявлении МОБ у детей первого года жизни с применением
частых и редких химерных транскриптов с участием MLL, также ранее не
выполнялась оценка сопоставимости результатов обнаружения МОБ методами
проточной цитометрии и выявлением химерных транскриптов методом ОТ-ПЦР,
не исследовалась прогностическая роль выявления химерных транскриптов при
ОЛЛ у детей первого года жизни в костном мозге и периферической крови.
Дополнительный интерес к этой проблеме связан еще и тем, что в Российской
Федерации используется оригинальный протокол для ведения пациентов первого
года жизни с ОЛЛ [108], а ранее было показано, что для каждого протокола
терапии существуют собственные наиболее оптимальные ТН МОБ, позволяющие
прогнозировать исходы терапии [410].
Таблица 5 - Характеристика различных методов, применяемых для определения МОБ у пациентов с ОЛЛ (приводится
по M. Bruegemann et al [410] и T. Szczepanski [416] с изменениями)
Показатель
Чувствительность
Количественный
диапазон
Определение перестроек генов Ig
Определение химерных
Многоцветная
и TCR методом ПЦР
транскриптов методом ОТ-ПЦР
проточная цитометрия
-4
10 -10
-5
10-2-10-4
 Высокая чувствительность
метода
10 -10
-6
Не определен
 Высокая чувствительность
10-4-10-5 (Зависит от
количества вносимых клеток)
Варьирует в различных
исследованиях
 Применимость для
 Высокая степень стандартизации  Стабильность мишени во
подавляющего большинства
 Доказанная надежность при
пациентов с ОЛЛ
время курса терапии
использовании в качестве
 Быстрота
 Быстрота
стратификационного критерия
 Относительная простота
 Возможность количественной
 Применимость для
подавляющего большинства
пациентов с ОЛЛ
 Исходный материал (ДНК) —
стабилен при транспортировке
выполнения
оценки результата
 Источник дополнительной
информации о нормальных и
опухолевых клетках
 Метод стандартизован
90
Преимущества
-4
Продолжение таблицы 5
Показатель
Определение перестроек генов Ig
Определение химерных
Многоцветная
и TCR методом ПЦР
транскриптов методом ОТ-ПЦР
проточная цитометрия
 Большая длительность
 Возможная нестабильность
выбранных маркеров (феномен
клональной эволюции)
 Для проведения теста требуется
метода
пациентов (40-45%)
 Полная стандартизация
 Изменение иммунофенотипа
во время терапии
 В-линейная регенерация
проведена только для BCR-
может затруднять проведение
ABL; для остальных
анализа
большое количество знаний и
химерных генов разработаны  Низкая клеточность во время
опыта
только условия проведения
и после индукции может
ОТ-ПЦР
затруднять проведение
 Существует риск ложнопозитивных результатов
вследствие контаминации
 Исходный материал (РНК) —
мало стабилен при
транспортировке
анализа
 Для проведения теста
требуется большое
количество знаний и опыта
91
Недостатки
 Применимо только у части
Продолжение таблицы 5
Показатель
Определение перестроек генов Ig
Определение химерных
Многоцветная
и TCR методом ПЦР
транскриптов методом ОТ-ПЦР
проточная цитометрия
 BCR-ABL (5-8% детей и 3035% взрослых с ОЛЛ из Bлинейных предшественников)
 TCF3-PBX1 (1-2% детей и
взрослых с ОЛЛ из B90-95%
линейных предшественников)
 Перестройки MLL (70-80%
детей <1 года; 3-5% детей >1
года; 5-7% взрослых)
 ETV6-RUNX1 (20-25% детей с
ОЛЛ из B-линейных
предшественников)
Зависит от количества
одновременно определяемых
маркеров
92
Применимость
>95%
93
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика пациентов
В работе проанализированы данные 254 пациентов в возрасте от 1 до 365
дней с установленным диагнозом ОЛ, получавшие терапию в 31 клинике
Российской Федерации и Республики Беларусь в период с 08.06.1999 по
24.03.2013: ОДКБ им. П. Г. Выжлецова, г. Архангельск (n=1); Московский
областной онкологический диспансер, г. Балашиха (n=9); ОДКБ, г. Белгород
(n=1); ОДКБ, г. Благовещенск (n=2); ОДКБ, г. Воронеж (n=2); РНПЦ
радиационной медицины, г. Гомель (n=1); ОДКБ №1, г. Екатеринбург (n=45);
Кировский НИИ гематологии и переливания крови, г. Киров (n=5); КДКБ, г.
Краснодар (n=3); ОДБ, г. Липецк (n=1); РНПЦ детской онкологии, гематологии и
иммунологии, г. Минск (n=21); НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им.
Н.Н. Блохина (n=15); Морозовская ДГКБ, г. Москва (n=24); РДКБ, г. Москва
(n=48); ФНКЦ ДГОИ, г. Москва (n=15); Мурманская ДГБ, г. Мурманск (n=1);
ОДКБ, г. Нижневартовск (n=1); ОДКБ, г. Нижний Новгород (n=4); ДГКБ №4, г.
Новокузнецк
(n=3);
Оренбургский
областной
онкологический
диспансер,
Оренбург (n=4); КДКБ, г. Пермь (n=8); КДКБ, г. Петропавловск-Камчатский
(n=1); ОДБ, г. Ростов-на-Дону (n=4); ДГКБ № 1 им. Н.Н. Ивановой, Самара (n=3);
ДГБ
№1,
г.Санкт-Петербург
(n=13);
Институт
детской
гематологии
и
трансплантологии имени Р.М. Горбачевой, г.Санкт-Петербург (n=5); ОДКБ, г
Тула (n=1), РДКБ, г. Чебоксары (n=4); ОДКБ, г. Челябинск (n=5); КДКБ, г.
Хабаровск (n=3); ОДКБ, г. Ярославль (n=1). Все пациенты получали терапию по
одному из следующих химиотерапевтических протоколов: MLL-Baby (n=102),
ALL-BFM 90 (n=3), ALL-MB 91 (n=2), ALL-BFM 95 (n=3), ALLIC-BFM 2002
(n=3), ALL-MB-2002 (n=28), ALL-MB-2008 (n=6), CoALL (n=1), Interfant-99 (n=2),
Interfant-06 (n=1), AML-BFM 98 (n=9), AML-BFM 2004 (n=18), ОМЛ-ММ 2000
(n=9), ОМЛ-ММ 2006 (n=8), НИИ ДОГ ОМЛ 2007(n=10). Различные варианты
94
непрограммной терапии проведены у 16 пациентов. Шестеро погибли до начала
лечения. У 27 пациентов данные о проводившейся терапии отсутствовали.
Всего в исследование было включено 109 (42,9%) мальчиков и 145 (57,1%)
девочек; медиана возраста составила 6,8 мес. (диапазон 0,1-11,9). ОЛЛ был
выявлен у 172 пациентов, ОМЛ — у 75, острый недифференцированный лейкоз
(ОНдЛ) — у 4, острый билинейный лейкоз (ОБлЛ)
— у 2, острый
бифенотипический лейкоз (ОБфЛ) — у 1. Последние три варианта ОЛ были
отнесены нами в группу «другие варианты ОЛ» и в дальнейшем рассматривались
совместно.
Среди пациентов с ОЛЛ было 67 (39,0%) мальчиков и 105 (61,0%) девочек с
медианой возраста 6,6 мес. (диапазон 0,1-11,9). Количество мальчиков и девочек с
ОМЛ было примерно равным: 38 (50,7%) и 37 (49,3%), соответственно. И они
были несколько старше, чем пациенты с ОЛЛ: медиана возраста 7,0 мес.
(диапазон 0,3-11,9). Среди детей с другими вариантами ОЛ было 4 мальчика и 3
девочки. Медиана возраста составила 6,7 мес. (диапазон 3,5-11,8). Данные
иммунофенотипирования
были
известны
у
169
пациентов
с
ОЛЛ,
морфологический вариант по FAB-классификации — у 68 пациентов с ОМЛ.
Пациенты с синдромом Дауна (n=3) в анализ не включались.
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга и периферической
крови, взятых до начала терапии, проведено 176 пациентам, в том числе 107 с
диагнозом ОЛЛ, 63 с ОМЛ, 6 пациентам с другими вариантами ОЛ.
Цитогенетический анализ и исследование методом FISH выполнялись в 9
лабораториях: лаборатория молекулярной биологии ОДКБ №1 г. Екатеринбурга
(n=70); лаборатория цитогенетики и молекулярной генетики ФНКЦ ДГОИ им. Д.
Рогачева (n=36); лаборатория цитогенетики РОНЦ им. Н.Н. Блохина (n=27);
лаборатория молекулярно-генетических исследований РНПЦ детской онкологии,
гематологии и иммунологии (n=22); лаборатория цитогенетики и диагностики
генетических заболеваний Института детской гематологии и трансплантологии
им. Р.М. Горбачевой (n=8); лаборатория цитогенетики Кировского НИИ
гематологии и трансфузиологии (n=5); лаборатория молекулярной генетики
95
Российского
НИИ
гематологии
и
трансфузиологии
(n=3);
лаборатория
цитогенетики Пермской КДКБ (n=3); лаборатории цитогенетики ОДБ г. Ростована-Дону (n=2).
Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследованных разными
методами приведено в таблице 6.
Таблица 6 - Количество пациентов первого года жизни с ОЛ, обследованных
разными методами
Количество пациентов (обследованных образцов)
Диагностический метод
ОЛЛ
ОМЛ
Другие ОЛ
Всего
(n=172)
(n=75)
(n=7)
(n=254)
Инициальная диагностика
Цитогенетика
107
63
6
176
FISH
78
44
4
126
ОТ-ПЦР
153
51
5
209
Иммунофенотипирование
169
75
7
251
Секвенирование
51
17
—
68
ДИ-ПЦР
52
19
1
72
Мониторинг МОБ
ПЦР-РВ КМ
74 (491)
10 (43)
—
84 (554)
ПЦР-РВ ПК
53 / (142)
—
—
53 (142)
Проточная цитометрия
71 / (458)
—
3 (13)
74 (471)
При исследовании иммунофенотипа опухолевых клеток результаты,
полученные у детей первого года жизни, сравнивались с 427 пациентами старше 1
года, включая 371 пациента с ОЛЛ, 49 с ОМЛ, 1 с ОБлЛ, 4 с ОБфЛ, 2 с ОНдЛ.
Сопоставимость результатов определения МОБ методами проточной
цитометрии и ОТ-ПЦР оценивали в 401 образце костного мозга, взятом от 61
пациента с В-линейными ОЛЛ и различными перестройками гена MLL. В анализ
96
были включены данные 37 пациентов, у которых был выявлен химерный
транскрипт MLL-AF4, 8 — с наличием MLL-MLLT1, 13 с химерным транскриптом
MLL-MLLT3 и 3 с наличием MLL-EPS15.
Исследование
методом
секвенирования
для
выявления
структуры
химерного транскрипта было выполнено у 51 пациента с ОЛЛ и 17 с ОМЛ
Длинная инвертированная ПЦР (ДИ-ПЦР) (long-distance inverse PCR, LDIPCR) была проведена 72 пациентам с ОЛ, включая 29 с наличием химерного гена
MLL-AF4 (28 случаев ОЛЛ и 1 ОМЛ), 14 с MLL-MLLT3 (по 7 ОЛЛ и ОМЛ), 12 с
MLL-MLLT1 (все ОЛЛ), 4 с MLL-EPS15 (все ОЛЛ), 1 с MLL-AFF3 (ОЛЛ), 6 с MLLMLLT10 (5 ОМЛ и 1 ОНдЛ), по 2 c MLL-MLLT11 и MLL-MYO1F (все ОМЛ) и по
одному с MLL-SEPT6 и MLL-SEPT9 (все ОМЛ).
В исследование по выявлению транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH
было включено 8 пациентов с MLL-негативным ОМЛ, а также 1 пациент с острым
бифенотипическим лейкозом. Медиана возраста составила 8,7 мес. (диапазон 5,211,7). В исследуемой группе было 2 мальчика и 6 девочек.
В исследование по оценке прогностической значимости МОБ в костном
мозге (КМ) было включено 39 пациентов с ОЛЛ и установленным типом
перестроек гена MLL, включенных в протокол MLL-Baby с сентября 2003 г. по
июнь 2011 г. Данный протокол терапии разработан Л.Г. Фечиной для лечения
детей первого года жизни с ОЛЛ [108]. Схема протокола с указанием ТН, в
которые проводилось определение МОБ, приведена на рисунке 12.
В исследуемой группе было 12 мальчиков (31%) и 27 девочек (69%),
медиана возраста составила 4,4 мес. (диапазон 0,1-11,8). У 20 пациентов (51%)
был выявлен химерный транскрипт MLL-AF4, по 5 пациентов (по 13%) имели
MLL-MLLT1, MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10, у 4 пациентов (10%) был обнаружен
химерный транскрипт MLL-EPS15.
Для оценки прогностической роли выявления МОБ в периферической крови
(ПК) было проведено исследование 142 парных образцов (КМ и ПК) от 53
пациентов c различными перестройками гена MLL, получавших терапию по
протоколу MLL-Baby.
97
Рисунок 12. Схема протокола MLL-Baby с указанием точек наблюдения (ТН)
определения МОБ.
2.2. Методы обследования пациентов
Диагноз ОЛЛ устанавливался на основании стандартных морфологических
показателей [371] и данных иммунофенотипирования согласно критериям группы
EGIL [220,372], ОМЛ – на основании морфологических критериев ФранкоАмерикано-Британской (FAB) классификации [371], а ОНдЛ, ОБфЛ и ОБлЛ — по
данным иммунофенотипирования.
2.2.1. Иммунофенотипирование
Иммунофенотипирование
опухолевых
клеток
в
костном
мозге
производилось методом 4-10-цветной проточной цитометрии на приборах «FACS
Canto», «FACS Canto II» и «FACS Aria» (Becton & Dickinson (BD), США). Для
98
иммунофенотипирования
применялись
первичномеченные
моноклональные
антитела (Таблица 7).
Таблица 7 - Использованные моноклональные антитела
Флуорохром
FITC
Моноклональное антитело
CD19, CD10, CD58, CD581, CD45, CD38, CD22, CD33, TdT,
Kappa, IgM, CD99, CD15
CD10, CD20, CD45, CD19, CD58, CD11a, CD34, CD38, CD22,
PE
TdT, CD79a, Lambda, CD33, CD13, CD1332, NG21
PerCP
CD45, CD19, CD20, CD34
PerCP-Cy5.5
CD19, CD20, CD38, CD33, CD79a
PE-TexasRed
CD341
PE-Cy7
CD10, CD34, CD38, CD13
APC
CD19, CD20, CD45, CD10, CD117, TdT, CD79a, CD22, CD38, IgM
APC-Cy7
CD19, CD20, CD45
AmCyan
CD45
Примечания
Все антитела, если это не указано специально, произведены BD (США).
1— антитела производства «Beckman Coulter» (США);
2— антитело производства «Miltenyi Biotec» (Германия);
Результаты
иммунофенотипирования
оценивались
при
помощи
программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD, США). Популяцию считали
позитивной по тому или иному маркеру, если 20% и более клеток
экспрессировали
исследуемый
антиген.
Результат
определения
МОБ
рассчитывали в виде процентного содержания опухолевых клеток среди всех
ядросодержащих клеток костного мозга.
Для определения экспрессии NG2 применяли антитело 7.1-PE (Beckman
Coulter, США). Для сравнений уровней экспрессии NG2 на разных этапах терапии
99
использовали
значения
средней
интенсивности
флюоресценции
(Mean
Fluorescence Intensity, MFI). Для сравнения данных экспрессии, полученных на
разных приборах, MFI пересчитывали в количество молекул эквивалентного
растворимого флуорохрома (MESF) при помощи калибровочных частиц «Quanti
Brite» (BD, США), содержащих известное количество молекул PE.
2.2.2. Цитогенетическое исследование
При проведении цитогенетического исследования применялась техника
приготовления «прямых препаратов» или краткосрочное культивирование клеток
(24, 48 часов). Дифференциальную окраску хромосом на G-полосы проводили
красителем Гимза после предварительной обработки препаратов трипсином. В
большинстве случаев анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Анализ
хромосом выполняли в соответствии с международной номенклатурой хромосом
человека, принятой на момент выполнения стандартного цитогенетического
исследования [242-245]. В ходе данной работы все кариотипы были повторно
оценены с учетом рекомендаций ISCN 2013 [245].
Дополнительными
хромосомными
аберрациями
(ДХА)
считали
все
клональные аномалии, сочетавшиеся с перестройками 11q23/MLL [362]. Кариотип
считали комплексным, если у пациентов с ОМЛ каждая клетка лейкозного клона
содержала не менее трех хромосомных изменений, включая перестройки района
11q23 [436,467].
В настоящее время
в употреблении одновременно находятся как
традиционные названия генов, так и их современные аналоги, рекомендованные
комитетом по номенклатуре генов HUGO (HGNC) [209]. В дальнейшем в ходе
работы будет использована только современная номенклатура. В таблице 8
приведены названия наиболее распространенных химерных генов и химерных
транскриптов, а также их соответствие различным транслокациям.
Таблица 8 — Соответствие химерных генов и химерных транскриптов различным
транслокациям
100
Химерный ген/транскрипт
Транслокация
Современный вариант (HGNC)
Старый вариант
MLL-AF4
—*
t(4;11)(q21;q23)
MLL-MLLT1
MLL-ENL
t(11;19)(q23;p13.3)
MLL-MLLT3
MLL-AF9
t(9;11)(p22;q23)
MLL-MLLT4
MLL-AF6
t(6;11)(q27;q23)
MLL-MLLT6
MLL-AF17
t(11;17)(q23;q21)
MLL-MLLT10
MLL-AF10
t(10;11)(p12;q23)
MLL-MLLT11
MLL-AF1q
t(1;11)(q21;q23)
MLL-AFF3
MLL-LAF4
t(2;11)(q12;q23)
MLL-EPS15
MLL-AF1p
t(1;11)(p32;q23)
MLL-ELL
—*
t(11;19)(q23;p13.1)
MLL-SEPT9
—*
t(11;17)(q23;q25)
MLL-SEPT6
—*
t(X;11)(q24;q23)
MLL-FOXO4
MLL-AFX
t(X;11)(q13;q23)
MLL-MYO1F
—*
t(11;19)(q23;p13)
ETV6-RUNX1
TEL-AML1
t(12;21)(p13;q22)
TCF3-PBX1
E2A-PBX1
t(1;19)(q23;p13)
STIL-TAL1
SIL-TAL
RUNX1-RUNX1T1
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22)
Примечание: * — здесь и далее — название не менялось
2.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ
Для выявления перестроек гена MLL методом FISH был использован
двухцветный ДНК-зонд Vysis LSI MLL Dual Color, Break Apart Rearrangement
Probe (Abbott Molecular, США), который состоит из двух частей, меченных
различными флуоресцентными красителями: 5’-фрагмент окрашен Spectrum
Green, 3’-фрагмент — Spectrum Orange с небольшой зоной перекрывания в 7
101
экзоне MLL (Рисунок 13).
Рисунок 13. Схема флуоресцентного ДНК-зонда для выявления перестроек гена
MLL, использованного в данной работе. 5’-часть зонда окрашена Spectrum Green
(прямоугольники черного цвета), 3’-часть—Spectrum Orange (прямоугольники
белого цвета) с зоной перекрывания в 7 экзоне MLL (прямоугольники серого
цвета); (а)—идеограмма 11 хромосомы; (б)—фрагмент локуса 11q23 с указанием
генов,
перекрывающихся
ДНК-зондом.
Цифры
на
шкале
(тысячи
пар
нуклеотидов) соответствуют координатам генов на хромосоме. Цифрами внутри
черного и белого прямоугольников указана протяженность 5’- и 3’-частей ДНКзонда (тысячи пар нуклеотидов); (в) — Схема гена MLL, включая основной
регион разрыва (Mbcr) в гене MLL протяженностью 7699 пар нуклеотидов,
расположенный между 7 и 13 экзонами. Цифры соответствуют нумерации
экзонов.
102
В нормальных клетках две части зонда располагаются вместе, что дает 2
желтых совмещенных (сливных) сигнала, которые обозначаются как «2F». В
случае стандартной (типичной) перестройки гена MLL выявляются 1 красный, 1
зеленый и 1 желтый совмещенный (сливной) сигналы (1R1G1F). В ряде случаев
наряду с перестройкой гена MLL одновременно могут наблюдаться делеции
данного гена, располагающиеся дистальнее (3’) по отношению к зоне перекрытия
двух частей зонда, что приводит к исчезновению красного сигнала (1G1F).
У 27 пациентов дополнительно проведено исследование с использованием
цельнохромосомных зондов для полного окрашивания 1, 2, 4, 10, 11, 15 хромосом
— XCP 1 FITC, XCP 2 FITC, XCP 4 FITC, XCP 10 FITC, XCP 11 Texas Red, XCP
15 FITC, соответственно (все Metasystems, Германия). Все методики выполнялись
согласно инструкциям производителей.
Для выявления транслокации t(7;12)(q36;p12) методом FISH по нашему
заказу
компанией
Metasystems
(Германия)
был
разработан
трехцветный
флуоресцентный зонд, состоящий из (1) зонда на точку разрыва в хромосомном
районе
12p13
флуоресцентным
центромерная
красителем,
часть
которого,
расположена
меченная
проксимальнее
гена
оранжевым
ETV6,
а
теломерная, меченная зеленым флуоресцентным красителем, — дистальнее гена
ETV6 с небольшой зоной перекрытия самого гена; (2) двух последовательностей,
меченных
голубым
флуоресцентным
красителем
(Aqua),
фланкирующих
нуклеотидную последовательность гена HLXB9 в хромосомном районе 7q36
(Рисунок 14).
2.2.4. Обратно-транскриптазная ПЦР
Для проведения анализа методом ОТ-ПЦР срок доставки материала в
лабораторию варьировал от 0 до 48 часов. ОТ-ПЦР проводилась в двух
модификациях. В 147 случаях лейкоциты и бластные клетки выделяли из
костного мозга путем лизиса в 0,84% растворе хлорида аммония, после чего
проводили подсчет ядросодержащих клеток на гематологическом анализаторе
103
KX-21 (Sysmex, Япония).
Рисунок 14. Схема трехцветного флуоресцентного зонда, использованного для
выявления t(7;12)(q36;p12).
В работу брали 5106 ядерных клеток. Для выделения РНК использовали
TRIreagent (Molecular Research Center, США) в количестве 1 мл. Полученную РНК
обрабатывали
ДНК-азой
I
(Fermentas,
Латвия)
согласно
инструкции
производителя. 1 мкг РНК переводили в комплементарную ДНК (кДНК) в ходе
реакции обратной транскрипции, которая проходила при 37С в течение 60 минут
с использованием MML-V обратной транскриптазы (Promega, Германия) и смеси
случайных нонамеров (Синтол, Россия). В ПЦР брали кДНК в количестве
эквивалентном 100 нг РНК. Для проведения ПЦР использовали 1 ед. ДиаТакполимеразы (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) и амплификатор «GeneAmp PCR
system 9700 Gold» (Applied Biosystems, США). Все исследования проводили
методом двухстадийной, т.н. гнездной ПЦР, при этом после проведения
амплификации (ПЦР-1) 1 мкл ПЦР-продукта переносили в смесь реактивов для
второго раунда ПЦР (ПЦР-2), которая отличалась лишь комбинацией праймеров,
104
и повторно проводили амплификацию. Для химерных транскриптов MLL-MLLT1,
MLL-MLLT3, MLL-MYO1F использовался т.н. полугнездный вариант проведения
ОТ-ПЦР, при котором в ПЦР-1 и ПЦР-2 вносили один и тот же праймер,
комплементарный
гену-партнеру
Нуклеотидная
MLL.
последовательность
праймеров для выявления MLL-AF4 взята из работы A. Borkhardt et al. [303], для
MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11– из работы N. Pallisgaard et al. [315]. Изза вариабельности зон слияния в химерном транскрипте MLL-MLLT10 для его
выявления
методом
ОТ-ПЦР
использовали
мультиплексный
вариант.
Комбинации всех использовавшихся праймеров и зондов приведены в таблице 9.
Детекцию проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном
геле в присутствии бромистого этидия с последующим фотодокументированием
при помощи системы визуализации GelDoc XR 2000 (Bio-rad, США).
Чувствительность
ОТ-ПЦР,
которую
оценивали
методом
лимитирующих
разведений клеточных культур RS4;11, MV4-11 и THP-1, составила 510-5.
При отсутствии выявления наиболее широко распространенных химерных
транскриптов (MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-EPS15,
MLL-MLLT11, MLL-MLLT4) и наличии достаточного количества материала (n=48)
дополнительно проводили исследование методом ОТ-ПЦР с использованием
набора
HemaVision
(DNA Diagnostic
A/S, Дания) согласно инструкции
производителя с целью обнаружения редких химерных транскриптов MLL-ELL,
MLL-FOXO4, MLL-MLLT6. Данный анализ
выполняли в два этапа, согласно
инструкции производителя, c применением TaqF ДНК-полимеразы (ЦНИИ
Эпидемиологии, Россия). На первом этапе из полученной ранее кДНК ставили 8
мультиплексных ПЦР-реакций. При получении положительного результата в
одной из пробирок в ходе первого этапа, кДНК повторно вносится в гнездные
моноплексные реакции. Результат расценивали как позитивный, если на обоих
этапах
ПЦР
совпадающего
обнаруживалось
наличие
по
ожидаемым.
размеру
с
специфического
Результат
ПЦР-продукта,
расценивали
как
отрицательный, если в ходе первого этапа ПЦР не было выявлено продуктов
амплификации, и во всех пробирках присутствовала полоса внутреннего контроля
105
размером 911 п.н. Детекцию проводили методом горизонтального электрофореза
в 2% агарозном геле.
У 62 пациентов перестройки гена MLL и другие химерные транскрипты
выявлялись и мониторировались при помощи наборов «ЛК-Биочип» (БиочипИМБ, Москва) согласно инструкции производителя. При этом РНК выделяли из
лейкоцитов костного мозга больных лейкозом с помощью набора RNeasy Mini Kit
(Qiagen, США). Выделенную РНК в количество 2 мкг инкубировали при 70С в
течение 5 мин со смесью кДНК-праймеров, специфичных для указанных
транслокаций и для контрольного гена ABL. Затем проводили обратную
транскрипцию при 37С в течение 90 минут с использованием MML-V обратной
транскриптазы (Силекс, Россия). Далее, полученную кДНК использовали в
мультиплексных ПЦР в два этапа. В 25 мкл ПЦР-смеси первого этапа вносили 1
мкл образца, полученного в реакции обратной транскрипции. Использовали
фермент Taq-полимераза (Силекс, Россия). В ПЦР-смесь стандартного состава
(Силекс, Россия) добавляли праймеры, специфичные для анализируемых
химерных транскриптов и для контрольного гена ABL по 20 пмоль каждого. Всю
смесь нагревали при 94С в течение 3 мин, затем проводили 25 циклов
амплификации по следующей схеме: 94С, 30 с; 60С, 30 с; 72С, 1 мин. В 25 мкл
ПЦР-смеси второго этапа вносили 2 мкл продукта первого раунда ПЦР. Состав
ПЦР-смеси и условия ПЦР были те же, с той разницей, что на втором этапе один
из праймеров в каждой паре содержал флуоресцентную метку, и концентрация
немеченого праймера была в 5 раз ниже, чем меченого. Полученные на второй
стадии мультиплексной ПЦР флуоресцентно меченые образцы использовали для
гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом до 40 мкл
состояла из 20% формамида («Serva», США), 5-кратного буфера SSPE (Salinesodium-phosphate-EDTA) («Promega», США) и амплификата общим объемом 22
мкл. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°С (5 мин), быстро
охлаждали на льду (1 мин), наносили на биочип и оставляли на ночь при 37°С.
Далее биочип отмывали в 1-кратном SSPE буфере в течение 10 мин при
106
комнатной температуре и высушивали. Регистрацию флуоресцентного сигнала
проводили с помощью портативного анализатора биочипов (Биочип-ИМБ,
Москва). Автоматический анализ изображения проводили с помощью программы
ImageWare (Биочип-ИМБ, Москва). Чувствительность набора «ЛК-Биочип» для
выявления перестроек гена MLL составила 110-4.
Спектр исследованных химерных транскриптов определялся как типом ОЛ,
так и линейной принадлежностью бластных клеток. Пациентам с ОЛЛ из Влинейных предшественников проводили исследование следующих химерных
транскриптов BCR-ABL1, ETV6-RUNX1, TCF3-PBX1, а также определение
перестроек гена MLL, включая MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4,
MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-EPS15. При Т-линейных ОЛЛ исследовали
наличие
химерных
транскриптов
BCR-ABL,
STIL-TAL1,
а
также
всех
вышеуказанных перестроек гена MLL. У пациентов с ОМЛ определяли наличие
BCR-ABL1, RUNX1-RUNXT1, CBFB-MYH11, PML-RARa а также вышеуказанных
перестроек гена MLL, а при их отсутствии дополнительно определяли экспрессию
MLL-ELL, MLL-MLLT6, MLL-FOXO4 с использованием набора HemaVision (DNA
Diagnostic A/S, Дания). В случаях ОНдЛ, ОБфЛ или ОБлЛ использовали
комбинацию всех вышеуказанных маркеров.
2.2.5. Секвенирование
Полученные в ходе гнездной ОТ-ПЦР ампликоны очищали при помощи
набора «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» (Promega, Германия).
Секвенирующую
реакцию
проводили
с
применением
праймеров,
использовавшихся во втором раунде гнездной ОТ-ПЦР и набора «BigDye
Terminator 3.1» (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя.
Секвенирование поводили в двух направлениях на генетическом анализаторе ABI
Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Анализ полученных данных проводили
путем
сравнения
референсными [327].
полученных
нуклеотидных
последовательностей
с
107
2.2.6. Длинная инвертированная ПЦР
Для проведения ДИ-ПЦР в качестве исходного материала использовали
геномную ДНК в количестве 1 мкг, выделенную из лейкоцитов и бластных клеток
костного мозга, взятого в момент установления диагноза. ДНК обрабатывали
экзонуклеазой рестрикции BamHI, а затем лигировали в присутствии Т4 ДНКлигазы при +16С в течение ночи для образования циркулярной молекулы ДНК.
Затем 1/10 объема (≈100 нг) лигированной ДНК вносили в 4 различные пробирки
для проведения ДИ-ПЦР, содержащие праймеры, комлементарные участкам
основной
зоны
разрыва
в
ДНК
гена
Полученные
MLL.
ампликоны
фракционировали в 0,8% агарозном геле. При получении ходе электрофореза
специфических полос, отличных от дикого типа MLL, их экстрагировали из геля и
секвенировали по Сэнгеру с целью определения индивидуальной для каждого
пациента точки разрыва в MLL и гене-партнере. При отсутствии специфических
продуктов электрофореза проводили второй этап ДИ-ПЦР, при котором
использовались комбинации праймеров, комлементарные реципрокному аллелю
гена MLL.
2.2.7. Определение минимальной остаточной болезни в кДНК методом ПЦР в
режиме реального времени
При наличии перестроек гена MLL в диагностическом материале,
выявленных в ходе ОТ-ПЦР, выполняли ПЦР-РВ для количественной оценки
химерного транскрипта как в диагностическом образце, так и во всех доступных
образцах, полученных в ходе терапии. ПЦР-РВ проведена 84 пациентам. Для
выявления
химерных
транскриптов
MLL-AF4,
MLL-MLLT1,
MLL-MLLT3
нуклеотидная последовательность праймеров и флуоресцентных зондов была
взята из работы M. Jansen et al. [246]. Для большинства других химерных
транскриптов с участием гена MLL — MLL-EPS15, MLL-MLLT11, MLL-MLLT10,
MLL-MYO1F — использовались комбинации праймеров и зондов к гену MLL,
108
взятых из работы M. Jansen et al [246], с праймерами комплементарными
основным зонам разрыва исследуемых генов-партнеров, которые были подобраны
с использованием программного обеспечения «Clone Manager Suite 7.0» (Scientific
& Educational Software, США) (Таблица 9). В силу вариабельности зон слияния в
химерных транскриптах MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10 при
их выявлении методом ПЦР-РВ использовался мультиплексный вариант.
Нуклеотидная
последовательность
праймеров
и
флуоресцентных
зондов,
использовавшихся для выявления и мониторинга перестроек гена MLL приведена
в таблице 9. ПЦР-РВ выполнялась на приборе iQ5 (Bio-Rad, США).
Чувствительность ПЦР-РВ, оценивавшаяся методом лимитирующих разведений
клеточных культур RS4;11, MV4-11 и THP-1, составила 110-4.
Для оценки специфичности подобранной комбинации праймеров и зондов
для определения MLL-EPS15, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-MYO1F методом
ПЦР-РВ их тестировали как на всех позитивных образцах пациентов, так и на 30
образцах пациентов без исследуемой перестройки гена MLL и MLL-негативных
пациентов. В случае появления кривой амплификации в заведомо негативном
образце данная комбинация праймеров и зондов далее не использовалась.
В качестве калибраторов для ПЦР-РВ использовались плазмиды, несущие
фрагменты генов MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLLMLLT4, ABL (все Ipsogen, Франция), MLL-EPS15 (Лаборатория генной инженерии
ГНЦ РАМН). Для оценки качества получаемой калибровочной кривой она должна
была соответствовать критериям, предложенным консорциумом «Европа против
рака»: 1) кривая амплификации должна иметь типичную форму; 2) угол наклона
калибровочной кривой (Slope) должен находиться в диапазоне 3,30±0,35; 3)
различия в величине пороговых циклов между повторами с одинаковой
концентрацией не должны превышать 1; 4) чувствительность должна быть не
менее 10 молекул в реакции [409]. В дальнейший анализ брались образцы, в
которых экспрессия контрольного гена ABL, превышала 104 копий. Для
количественной оценки величины МОБ на основании данных, полученных в
ПЦР-РВ, использовалась методика расчета, также рекомендованная группой
109
«Европа против рака» (Формула 1), основанная на отношении величин экспрессии
химерного (ХГ) и нормального генов (НГ) в конкретной точке наблюдения (ТН) и
на момент установления диагноза (DS) [152]:
(1)
Для исключения случайных ошибок все образцы пациентов с перестройками
гена MLL, идентифицированными методом ПЦР исследовалась параллельно как
ОТ-ПЦР, так и ПЦР-РВ.
2.2.8. Определение минимальной остаточной болезни путем выявления химерных
генов с участием MLL в геномной ДНК методом ПЦР в режиме реального
времени
Для мониторирования МОБ с использованием геномной ДНК комбинацию
праймеров и зондов подбирали с использованием программного обеспечения
«Clone Manager Suite 7.0» (Scientific & Educational Software, США), исходя из
структуры зоны слияния генов MLL и EPS15, индивидуальной для каждого
пациента. Нуклеотидная последовательность праймеров и зондов приведена в
таблице 9 Условия проведения ПЦР и интерпретация результатов ПЦР-РВ
соответстовали рекомендациям Европейской рабочей группы по изучению МОБ
при ОЛЛ ESG-MRD-ALL [56] c дополнениями T. Burmeister et al. [312]. Для
создания
калибровочной
количественного
кривой,
диапазона
для
а
также
каждого
оценки
из
чувствительности
пациентов
с
и
MLL-EPS15
использовалась его собственная ДНК, выделенная из костного мозга, взятого до
начала терапии, которую разводили смесью ДНК 10 здоровых добровольцев в
соотношении от 10-1 до 10-5. В реакцию вносили 600 нг ДНК. Под
количественным диапазоном понимали наибольшее разведение ДНК, которое
110
удовлетворяло
следующим
критериями:
1.
характерная
форма
кривой
амплификации; 2. значения пороговых циклов (Ct) всех трех повторов не менее
чем на 3,0 меньше чем Ct смеси ДНК, использованной для разведений. 3. ΔСt трех
повторов не превышает 1,5; 4. ΔСt двух последовательных 10-кратных разведений
укладывается в диапазон 2,5-4,5, а ΔСt двух последовательных 2-кратных
разведений укладывается в диапазон 0,5-1,5. Под чувствительностью понимали
наибольшее разведение, которое удовлетворяло следующим показателям: 1.
характерная форма кривой амплификации; 2. как минимум, один из трех повторов
должен быть позитивным; ΔСt значения не имеет. 3. наибольший Ct должен быть
не менее чем на 1,0 меньше чем Ct смеси ДНК, использованной для разведений. 4.
Наибольший Ct должен быть менее чем 20 циклов больше чем неразведенный
образец (в тех случаях, когда используется неразведенный первичный образец).
При получении удовлетворительных данных (количественный диапазон не
менее
10-4)
данная
комбинация
праймеров,
и
флуоресцентных
зондов
использовалась вместе с 10-кратными разведениями исходной ДНК для
количественного анализа [56,312].
Величина МОБ была рассчитана как среднее значение числа копий трех
повторов каждого образца при следующих условиях: 1. отсутствие амплификации
в отрицательном контроле (смесь ДНК, использованная для создания разведений)
или превышение величины порогового цикла в образце пациента более чем на 3,0
порогового цикла в отрицательном контроле; 2. Разброс значений порогового
цикла контрольного гена NAGK в двух повторах одного образца не превышает
1,5; 3. Коэффициент корреляции (R2) калибровочной кривой выше 0,95; 4. Угол
наклона калибровочной кривой укладывается в диапазон от -3,0 до -4,5.
Таблица 9 - Использованные праймеры и олигонуклеотидные зонды
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
Прямой праймер
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Обратный праймер
aag cca aca ccc ttc cag ta
EPS15
3
201-182
Зонд
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер ПЦР 1 gga tac ctt tgc cat ctg tgt c
EPS15
4
294-273
Обратный праймер ПЦР 2 tgt cgg cta aat ccc aaa tct
EPS15
3-4
276-256
MLL
8
3940-3960
MLLT11
2
1175-1151
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT11
Прямой праймер
cgc ctc agc cac cta cta cag
Обратный праймер
aga gag aag tct tgg cct tag agc a
Зонд
HEX-cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct – BHQ1
MLL
8
3964-3992
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер ПЦР 1 gct tga gag gga aga caa tga g
MLLT11
2
1211-1190
Обратный праймер ПЦР 2 tgc tgg caa tgg gag ctc tc
MLLT11
2
1129-1110
111
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-EPS15
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
Прямой праймер 1
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Прямой праймер 2
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Зонд 1
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Зонд 2
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Обратный праймер 1
agg tcg tct tcg agc atg ga
AF4
7-8
1687-1668
Обратный праймер 2
gcg gcc atg aat ggg tc
AF4
5
1512-1496
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер ПЦР 1 gtc act gag ctg aag gtc gtc t
AF4
8
1700-1669
Обратный праймер ПЦР 2 agc atg gat gac gtt cct tgc tga
AF4
7-8
1675-1652
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT3
Прямой праймер 1
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Прямой праймер 2
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Обратный праймер 1
tca cga tct gct gca gaa tgt
MLLT3
10-11
1841-1821
Обратный праймер 2
tgg cag gac tgg gtt gtt c
MLLT3
6
1406-1388
112
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-AF4
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
MLLT3
5
715-695
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT3(продолжение)
Обратный праймер 3
gct gct gct gct ggt atg aat
Зонд 1
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Зонд 2
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер
cgt gat gta ggg gtg aag aag cag
MLLT3
8
1652-1629
113
ОТПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT1
Прямой праймер 1
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Прямой праймер 2
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Обратный праймер 1
gga gtt gga cgg gct tga c
MLLT1
7
1301-1283
Обратный праймер 2
tgg gct tct tgc gca gtt
MLLT1
2
234-217
Зонд 1
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Зонд 2
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
MLLT1
2
309-287
Химерный транскрипт MLL-MLLT1 (продолжение)
ОТ-ПЦР
Обратный праймер
ccacgaagtgctggatgtcacat
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер
ccacgaagtgctggatgtcacat
MLLT1
2
309-287
ОТ-ПЦР
Прямой праймер 1
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Прямой праймер 2
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Обратный праймер 1
aac tgc tgt tgc ctg gtt gat
MLLT10
18
2512-2492
Обратный праймер 2
ttc cac tag agg tgt gtg cag ag
MLLT10
10
1261-1239
Обратный праймер 3
ggc aaa ctg agc gca tgt tac
MLLT10
7
870-850
Зонд 1
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Зонд 2
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Прямой праймер 1 ПЦР 1
ccg cct cag cca cct act ac
MLL
8
3939-3958
Прямой праймер 2 ПЦР 1
agc act ctc tcc aat ggc aat agt
MLL
10
4164-4187
Прямой праймер 1 ПЦР 2
gga ccg cca aga aaa gaa gt
MLL
8
3960-3979
114
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT10
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
MLL
10
4205-4228
Обратный праймер 1 ПЦР1 ctg ttc tat gct ggc tgc tac tg
MLLT10
18
2550-2528
Обратный праймер 2 ПЦР1 ttg ccc tct gac cct cta gtc t
MLLT10
10
1295-1274
Обратный праймер 3 ПЦР1 tgg aca tta tcg gca cca tta c
MLLT10
7
914-893
Обратный праймер 1 ПЦР2 aac tgc tgt tgc ctg gtt gat
MLLT10
18
2512-2492
Обратный праймер 2 ПЦР2 ttc cac tag agg tgt gtg cag ag
MLLT10
10
1261-1239
Обратный праймер 3 ПЦР2 ggc aaa ctg agc gca tgt tac
MLLT10
7
870-850
MLL
9
4037-4056
MLLT4
1-2
265-246
Химерный транскрипт MLL-MLLT10 (продолжение)
ОТ-ПЦР
Прямой праймер 2 ПЦР 2
agc aga tgg agt cca cag gat cag
ПЦР-РВ
ОТ-ПЦР
Прямой праймер
tcc aga gca gag caa aca ga
Обратный праймер
tcc atg gaa ctc caa atc ct
Зонд
ROX -gcc caa gta tcc ctg taa aac aaa aac caa–BHQ2
MLL
9
4072-4101
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер ПЦР 1 tcc aat tca gtt gta caa cta gag g
MLLT4
3
495-470
Обратный праймер ПЦР 2 cca atc ttc ttt ctc cgc tga cat g
MLLT4
2-3
455-431
115
Химерный транскрипт MLL-MLLT4
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
Прямой праймер
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Обратный праймер
aat ggc gtc ttc ggt gat ctg
MYO1F
2
237-217
MLL
8
3964-3992
Зонд
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ctBHQ1
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер
aat ggc gtc ttc ggt gat ctg
MYO1F
2
237-217
MLL
8
3940-3960
MLLT11
2
1175-1151
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MLLT11
Прямой праймер
cgc ctc agc cac cta cta cag
Обратный праймер
aga gag aag tct tgg cct tag agc a
Зонд
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер
aga gag aag tct tgg cct tag agc a
MLLT11
2
1175-1151
116
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-MYO1F
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
Прямой праймер 1
cgc ctc agc cac cta cta cag
MLL
8
3940-3960
Прямой праймер 2
agg aga atg cag gca ctt tga
MLL
10
4135-4155
Зонд 1
HEX -cgc caa gaa aag aag ttc cca aaa cca ct-BHQ1
MLL
8
3964-3992
Зонд 2
ROX-cat cct cag cac tct ctc caa tgg caa ta-BHQ2
MLL
10
4157-4185
Обратный праймер 1
acg tgc cgt cct tag cac tc
ELL
6
847-828
Обратный праймер 2
ttc ccc atg act gga gac ata c
ELL
3-4
387-366
Прямой праймер ПЦР 1
ctg aat cca aac agg cca cca ctc
MLL
8
3865-3888
Прямой праймер ПЦР 2
ggt ctc cca gcc agc act ggt c
MLL
8
3914-3935
Обратный праймер 1
acg tgc cgt cct tag cac tc
ELL
6
847-828
Обратный праймер 2
ttc ccc atg act gga gac ata c
ELL
3-4
387-366
Прямой праймер
agc tcc ggg tct tag gct at
ABL
3
263-282
Обратный праймер
tag ttg ctt ggg acc cag cc
ABL
3
357-328
Зонд
FAM-cca ttt ttg gtt tgg gct tca cac cat t- BHQ-1
ABL
3
323-296
ПЦР-РВ
Контрольный ген ABL (кДНК)
117
ОТ-ПЦР
ПЦР-РВ
Химерный транскрипт MLL-ELL
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
ОТПЦР
Контрольный ген ABL (кДНК) (продолжение)
Прямой праймер
cgg cca gta gca tct gac ttt g
ABL
2
94-115
Обратный праймер
cct tgg cca ttt ttg gtt tgg
ABL
3
329-309
ПЦР-РВ
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента №2
Прямой праймер
gca gca gtt att ttt gga ctc att ga
MLL
—
—
Обратный праймер
gat ctt tgt gac aga gca agt ctt ta
EPS15
—
—
Зонд
FAM-tga tta cgc tta cag tta cat gaa ccc aca cat-BHQ1
EPS15
—
—
MLL
—
—
EPS15
—
—
MLL
—
—
MLL
—
—
ПЦР-РВ
Прямой праймер
tcc ctg ttt aaa cca gct aaa gaa atg t
Обратный праймер
tca agt gta att taa aac aaa cac cat ttc c
Зонд
FAM-tgc tac tct aat agc aga ttc ctt cct aaa atc tBHQ1
118
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента №3
ПЦР-РВ
Химерный ген MLL-EPS15 у пациента №4
Прямой праймер
agt ggg cat gta gag gta ag
Обратный праймер
gca gga gga ttg gtt gag
EPS15
—
—
Зонд
FAM-tgc act cta gcc tgg gca aca gag tga ga-BHQ1
EPS15
—
—
Продолжение таблицы 9
Название
Нуклеотидная последовательность (5’-3’)
Ген
Экзон
Локализация
ПЦР-РВ
Контрольный ген NAGK (ДНК)
Прямой праймер
tgg gca gac aca tcg tag ca
NAGK
—
—
Обратный праймер
cac ctt cac tcc cac ctc aac
NAGK
—
—
Зонд
ROX-tgt tgc ccg aga ttg acc cgg t-BHQ-2
NAGK
—
—
Примечания
Нуклеотидная последовательность и нумерация экзонов гена MLL дана согласно I. Nilson et al. [156];
гена MLLT11— согласно NM_006818.3;
гена MLLT3 — согласно NM_004529.2;
гена MLLT10 — согласно NM_004641.3;
гена MLLT4 — согласно NM_001207008.1;
гена EPS15 — согласно NM_001981.2;
гена MYO1F — согласно NM_012335.3;
гена ABL — согласно NM_005157.4.
Расшифровка аббревиатур флуоресцентных красителей и гасителей флуоресценции приведена в Списке сокращений и
условных обозначений
119
гена AF4 — согласно NM_005935.2;
120
2.3. Статистическая обработка полученных данных
Для
статистической
обработки
данных
использовали
обеспечение «SPSS 17.0», «STATISTICA 8.0», «R-statistics» и
программное
«Analyse-it». В
зависимости от величины групп пациентов при сравнении по качественным
признакам использовался точный критерий Фишера, либо критерий χ2 с
поправкой Йетса. При сравнении двух групп пациентов по количественным
признакам использовали критерий Манна-Уитни, при одновременном сравнении
нескольких групп — критерий Крускала-Уоллиса. Для выявления порогового
уровня с наибольшей диагностической эффективностью разделяющей образцы
пациентов был использован метод характеристических кривых (receiver operator
characteristic, ROC-кривых) [328,473].
С целью прогнозирования наличия перестроек гена MLL для каждого
иммунологического маркера рассчитывали диагностическую чувствительность,
специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного
результатов, а также общую диагностическую эффективность теста [466].
Результаты терапии оценивались по кривым БСВ, построенным по методу
Каплана-Майера [247], а также по кумулятивной вероятности развития рецидива.
Для сравнения кривых использовались непараметрические log-rank критерий и
критерий
Грея,
соответственно.
Расчет
отношения
опасности
с
95%
доверительным интервалом (ДИ) был проведен по методу Кокса [112] в
однофакторной
и
многофакторной
достоверными при р0,05.
моделях.
Все
различия
считались
121
Глава 3. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ
ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
3.1. Цитогенетическая характеристика острого лимфобластного лейкоза
У 26 из 107 пациентов (24,3%) с ОЛЛ при цитогенетическом исследовании
были обнаружены только клетки с нормальным кариотипом, еще в четырех
случаях при нормальном кариотипе лейкозного клона методами ПЦР и FISH были
выявлены различные перестройки гена MLL и в одном случае (Т-ОЛЛ) –
химерный ген STIL-TAL1. Клоновые изменения кариотипа, не включавшие
перестройки района 11q23 у пациентов с ОЛЛ, представлены в таблице 10. Высокая
гипердиплоидия, являющаяся одной из наиболее распространенных хромосомных
аномалий при ОЛЛ у детей старше 1 года, в исследуемой группе была обнаружена
только у 2 (1,9%) пациентов с BII-ОЛЛ. Причем в одном случае, кроме трисомий
в клетках с высокой гипердиплоидией обнаружена структурная перестройка в
хромосоме 8 (№5 в таблице 10). Клон гиподиплоидных клеток обнаружен у 1
(0,9%) пациента - мальчика с BII-ОЛЛ (№1 в таблице 10). В этом случае
моносомии 6 и 9 сочетались с транслокацией t(7;10)(p22;p12). Других нарушений,
включая перестройки гена MLL, у данных пациентов не было. Характерная для Bлинейных ОЛЛ транслокация t(1;19)(q23;p13)/ TCF3-PBX1 были выявлены в 1
случае (0,9%) у пациента с BII-ОЛЛ. Еще у одного пациента с BII-ОЛЛ был
обнаружен
химерный
транскрипт
BCR-ABL1,
однако,
цитогенетическое
исследование в этом случае не проводилось.
Клоны клеток с тремя и более хромосомными аномалиями (сложный
кариотип) наблюдались у 7 из 107 (6,5%) больных ОЛЛ, у которых было
проведено детальное цитогенетическое исследование (Таблица 11). При этом в 4х случаях в число изменений кариотипа входили транслокации с вовлечением
района 11q23.
Таблица 10 - Клоновые изменения кариотипа, не включавшие перестройки района 11q23 у пациентов с ОЛЛ
№ Пол
Возраст
(мес.)
ИФТ1
Кариотип клеток лейкозного клона
м
9,9
BII-ОЛЛ
2
м
10,1
BIII-ОЛЛ 46,XY,der(19)t(1;19)(q23;p13)[8]/46,XY[7]
3
ж
11,4
BIII-ОЛЛ
4
м
0,1
BIII-ОЛЛ 47,XY,del(5)(p13),+mar
5
ж
10,0
BII-ОЛЛ
6
м
11,8
BII-ОЛЛ
7
ж
6,1
BII-ОЛЛ
8
ж
2,4
BII-ОЛЛ
9
м
4,3
BII-ОЛЛ
44,XY,-6; t(7;10)(p22;p12),-9
46,XX,add(7)(q22)[6]/ 46,XX,dic(1;10)(p11;q26)[3] /
46,XX,add(10)(q24)[3] /46,XX [4].
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
Н.О2.
TCF3-PBX1
Н.О.
nuc ish
(MLL×2) [100]
—3
nuc ish 11q23
(MLL×2)[30]
—
—
54,XX,+3,+4,+der(8),+10,+14,+17 or +18,+19,+21,+21[8]
Н.О.
—
46,XY[8]/ >55,XXY[3]
Н.О.
—
46,XX,inv(10)(p11q24),t(11;17)(p15;q?21),del(12)(q13q15)[12
]/46,XX,idem,add(19)(p13)[4]/46,XX[4]
50,XX,+8,+22,+ace,+mar(ring)[14]/47,XX,+mar(ring)
[6]/46,XX[1]
46,XY,add(14)(q32) [11]
—
Н.О.
Н.О.
nuc ish 11q23
(MLL×2)[50]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[100]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[100]
122
1
Результат
Продолжение таблицы 10
№ Пол
10
ж
Возраст
(мес.)
9,9
ИФТ
Кариотип клеток лейкозного клона
TIV-ОЛЛ 46,XX, del(11p) [15]
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
Н.О.
nuc ish 11q23
(MLL×2)[100]
Примечания (здесь и далее):
1 ИФТ – иммунофенотип
2 «Н.О». – исследованные химерные транскрипты не обнаружены. Спектр исследованных химерных транскриптов
определялся линейной принадлежностью бластных клеток (подробнее см. «Материалы и методы»).
123
3 «—» исследование не проведено
Таблица 11 - Сложный кариотип у пациентов с ОЛЛ
№ Пол
Возраст
(мес.)
ИФТ
Кариотип клеток лейкозного клона
ж
10,0
BII-ОЛЛ 54,XX,+3,+4,+der(8),+10,+14,+17 or +18,+19,+21,+21[8]
2
ж
6,1
BII-ОЛЛ
3
ж
2,4
BII-ОЛЛ
4
м
5,6
BIII-ОЛЛ 46,XY,+7,t(11;19)(q23;p13),-21[9 ]/46,XY[5]
5
ж
2,8
BI-ОЛЛ
6
ж
3,3
BI-ОЛЛ
7
ж
1,6
BIII-ОЛЛ
46,XX,inv(10)(p11q24),t(11;17)(p15;q?21),del(12)(q13q15)[12]
/46,XX,idem,add(19)(p13)[4]/46,XX[4]
50,XX,+8,+22,+ace,+mar(ring)[14]/47,XX,+mar(ring) [6]/
46,XX[1]
47,XX, del(2)(q33),t(4;11)(q21;q23),+22[19]/46,XX[1]
46,ХХ, del(1)(p31),der(2),t(4;11)(q21;q23),-9,+mar[3]/
47,XX, idem,+der(2)[3]
46,XX,inv(14)(q11q32),t(11;19)(q23;p13)[17]/
46,XX, inv(3)(p12.1p21),t(11;19)(q23;p13),inv(14)(q11;q32)[3]
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
Н.О.
—
—
Н.О.
nuc ish 11q23
(MLL×2)[50]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[100]
MLL-MLLT1
MLLr1
MLL-AF4
MLLr
MLL-AF4
MLLr
MLL-MLLT1
–
Примечания (здесь и далее):
1 MLLr —перестройка гена MLL, выявленная методом FISH с зондом LSI MLL Dual Color Break Apart Rearrangement
Probe
№№ 1-3 также были представлены в табл. 10 под №№ 5,7 и 8, соответственно
124
1
Результат
125
Только 5 из 172 (2,9%) пациентов был установлен Т-линейный ОЛЛ. Из этого
числа информативное цитогенетическое исследование проведено в 3-х случаях. При
этом в 1 случае выявлен нормальный кариотип, у одной пациентки — делеция
короткого плеча 11 хромосомы, а в третьем случае при нормальном кариотипе
лейкозных клеток методом ПЦР обнаружен химерный ген STIL-TAL1.
Обобщенные результаты цитогенетического и молекулярно-генетических
исследований представлены в таблице 12.
Таблица 12 - Цитогенетические подгруппы ОЛЛ у детей первого года жизни
Цитогенетическая аберрация
Проведено цитогенетическое исследование
Количество
%
пациентов
107
100
Нормальный кариотип
26
24,3
Высокая гипердиплоидия (n=51-65)
2
1,9
Гиподиплоидия (n≤44)
1
0,9
t(1;19)(q23;p13)/TCF3-PBX1
1
0,9
t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1
1
0,9
t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1
—
—
Транслокации с вовлечением 11q23
641
59,8
Сложный кариотип2
7
6,5
del(1)(p)/STIL-TAL1
1
0,9
Другие
4
3,7
Примечания:
1 - Количество и доля пациентов даны без учета данных ОТ-ПЦР и FISH
2 - Под сложным кариотипом понимали клоны клеток с тремя и более
хромосомными аномалиями. В 4-х случаях в число изменений кариотипа входили
транслокации с вовлечением района 11q23;
Известно, что для В-линейных ОЛЛ у детей старше 1 года характерны
126
высокая гипердиплоидия и криптическая транслокация t(12;21)(p13;q22) с
образованием химерного гена ETV6-RUNX1. Реже выявляются перестройки,
ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, такие как транслокации района
11q23/MLL и t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1, внутрихромосомная амплификация 21
(iAMP21), гиподиплоидия или окологаплоидия, а также утраты 13q и перестройки
17p [354].
Среди
исследованных
нами
172
детей
с
ОЛЛ
из
В-линейных
предшественников в возрасте младше 1 года выявлено лишь два случая с высокой
гипердиплоидией и по одному случаю с транслокациями t(1;19)(q23;p13)/TCF3PBX1, t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1 и гиподиплоидией. Транслокации с участием
хромосомного района12p13, вовлекающие ген ETV6, не были обнаружены ни
цитогенетически, ни при использовании ОТ-ПЦР.
Таким образом, хромосомные аберрации, характерные для детей старше 1
года, редко выявляются у детей первого года жизни; в исследуемой группе
превалируют перестройки 11q23/MLL.
3.2. Перестройки 11q23/MLL при остром лимфобластном лейкозе
В исследуемой группе перестройки 11q23/MLL выявлены у 113 из 172
пациентов, что составило 65,7%. Результаты цитогенетических и молекулярногенетических исследований представлены в таблице 13. Самой частой в
исследуемой группе была транслокация t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4, несколько
реже выявлялись транслокации t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1, и t(9;11)(p22;q23)/
MLL-MLLT3. Другие перестройки гена MLL наблюдались значительно реже. В 1
случае (0,9%) при отсутствии метафаз методом FISH на интерфазных ядрах была
выявлена перестройка гена MLL, однако идентифицировать ген-партнер не
удалось.
Кроме этого, в исследованной группе выявлены такие относительно редко
встречающиеся химерные гены как MLL-EPS15 и MLL-AFF3. Последний был
верифицирован только при проведении ДИ-ПЦР.
127
Таблица 13 - Относительная частота выявления перестроек 11q23/MLL при ОЛЛ у
детей первого года жизни (n=172)
Количество
Тип перестройки 11q23/MLL
пациентов
Всего выявлено перестроек 11q23/MLL
%
113
100
t(4;11)(q21;q23) / MLL-AF4
66
58,4
t(11;19)(q23;p13) / MLL-MLLT1
22
19,5
t(9;11)(p22;q23) / MLL-MLLT3
12
10,6
t(10;11)(p12;q23) / MLL-MLLT10
5
4,4
t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15
6
5,3
t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3
1
0,9
Неизвестный ген-партнер MLL
1
0,9
У 11 пациентов отмечены сочетания транслокаций t(1;11)(p32;q23) (1
случай),
t(4;11)(q21;q23)
(7
случаев),
t(9;11)(p22;q23)
(1
случай)
или
t(11;19)(q23;p13) (2 случая) c различными неповторяющимися хромосомными
изменениями (Таблица 14). Из их числа следует отметить два случая трисомии 8,
которые были выявлены в сочетании с транслокациями t(1;11)(p32;q23) и
t(4;11)(q21;q23) (№№ 6 и 9 в таблице 14, соответственно).
Для исследования взаимосвязи между перестройками 11q23/MLL и
возрастом пациентов все случаи ОЛЛ у детей первого года жизни были разделены
на 6 возрастных групп (Таблица 15).
Пик обнаружения перестроек 11q23/MLL приходился на возраст 4,1-6,0 мес.,
где частота их выявления достигала 91,3%. Лишь незначительно ниже были
показатели в возрастной группе 2,1-4,0 мес. (86,5%). Начиная со второго
полугодия жизни, происходило постепенное снижение доли пациентов, у которых
выявлялись перестройки 11q23/MLL.
Таблица 14 - Сочетание перестроек района 11q23 с другими аномалиями кариотипа у пациентов с ОЛЛ
№ Пол
Возраст
(мес.)
ИФТ
Кариотип клеток лейкозного клона
46,XX,inv(14)(q11q32),t(11;19)(q23;p13)[17]/
1
ж
1,6
BIII-ОЛЛ 46,XX, inv(3)(p12.1p21),t(11;19)(q23;p13),
inv(14)(q11;q32)[3]
2
ж
2,9
BI-ОЛЛ
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
MLLMLLT1
46,XX,t(4;11)(q21;q23),der(9)[9]/46,ХХ,t(4;11)
MLL-
(q21;q23),der(5)[2]/46,XX, der(5),add(7p)[1]
AF4
–
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[90]/ (MLL×2)[10]
3
ж
3,3
BI-ОЛЛ
46,ХХ, del(1)(p31),der(2),t(4;11)(q21;q23),-
MLL-
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)[65]
9,+mar[3]/47,XX, idem,+der(2)[3]
AF4
/ (5’MLL×2)(3’MLL×3)(5’MLLsep
3’MLL×1)[22]/(MLL×2) [13]
4
5
6
м
ж
м
9,7
2,8
7,0
BI-ОЛЛ
BI-ОЛЛ
BI-ОЛЛ
46 XY,t(4;17)(q25;q11),ins(11;4)(q23;q21q25)[9]/
MLL-
nuc ish 11q23
46,XY[1]
AF4
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
47,XX,del(2)(q33),t(4;11)(q21;q23),+22[19]/
MLL-
46,XX[1]
AF4
47,XY,t(1;11)(p32;q23),+8 [11]
–
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[90]/ (MLL×2) [10]
–
128
nuc ish 11q23
Продолжение таблицы 14
№ Пол
7
8
ж
м
(мес.)
11,7
8,1
3,9
ИФТ
BIII-ОЛЛ
BI-ОЛЛ
BI-ОЛЛ
Кариотип клеток лейкозного клона
46,XY,t(9;11)(p22;q23)[3]/46,XY,t(9;11)(p22;q23),
der(10)add(10p)[4]/46,XY[3]
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
MLLMLLT3
46,XX,t(4;11)(q21;q23),
MLL-
der(7,10)?t(7;10)(q22;p15) [11]
AF4
47,XY, t(4;11)(q21;q23)+8 [11]
MLLAF4
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[76]/ (MLL×2) [24]
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[85]/ (MLL×2) [15]
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[195]/ (MLL×2) [5]
nuc ish 11q23
10
м
5,6
BIII-ОЛЛ 46,XY,+7,t(11;19)(q23;p13),-21[9 ]/46,XY[5]
MLL-
(5’MLL×2)(3’MLL×2)
MLLT1
(5’MLLsep3’MLL×1)[14]/
(MLL×2)[86]
11
ж
11,6
BI-ОЛЛ
46,XX,t(4;11)(q21;q23),i(7)(q11) [11]
MLLAF4
nuc ish 11q23
(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)
[198]/ (MLL×2)[2]
129
9
м
Возраст
130
Таблица 15 - Количество пациентов с ОЛЛ и различными перестройками
11q23/MLL в зависимости от возраста
Возраст, мес.
Тип перестройки
11q23/MLL
t(4;11)(q21;q23)/
MLL-AF4
t(11;19)(q23;p13)/
MLL-MLLT1
t(9;11)(p22;q23)/
MLL-MLLT3
t(10;11)(p12;q23)/
MLL-MLLT10
t(1;11)(p32;q23)/
MLL-EPS15
t(2;11)(q12;q23)/
MLL-AFF3
Неизвестный генпартнер
Всего 11q23/MLL (+)
Перестройки
11q23/MLL не
выявлены
Итого
0,1-2,0
2,1-4,0
4,1-6,0
6,1-8,0
8,1-10,0 10,0-11.9
9
20
12
9
6
10
4
10
5
2
—
1
1
—
1
4
3
3
—
—
1
2
2
—
1
1
2
1
1
—
—
1
—
—
—
—
—
—
—
—
1
—
15
32
21
18
13
14
(78,9)
(86,5)
(91,3)
(72,0)
(43,3)
(36,8)
4
5
2
7
17
24
(21,1)
(13,5)
(8,7)
(28,0)
(56,7)
(63,2)
19
37
23
25
30
38
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
Примечание. Здесь и далее в таблицах — указаны абсолютные величины, и в
скобках — проценты.
Такая динамика была характерна для наиболее частых перестроек
131
11q23/MLL — t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 и t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1. Обратная
тенденция
наблюдалась
t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
для
и
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3.
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1
Транслокации
наиболее
часто
зафиксированы у детей в возрасте 2,1-4,0 мес. (54,1% и 27,0%, соответственно).
Подавляющее большинство пациентов с транслокациями t(10;11)(p12;q23)/MLLMLLT10 (4 случая из 5) и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 (10 случаев из 12) были
старше 6 мес. Случаи с наличием t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 практически
равномерно представлены во всех возрастных группах.
При разделении пациентов на 2 группы – старше и младше 6 мес. –
выявлено, что в возрасте младше 6 месяцев перестройки 11q23/MLL были
обнаружены достоверно чаще (68 из 79 случаев, 86,1%) по сравнению с
пациентами в возрасте от 6 до 12 месяцев (45 из 93 случаев, 48,4%) (р<0,001).
Статистически значимые различия сохранялись для t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
(51,9% и 26,9%, соответственно) (p=0,001), и t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 (24,1%
и 3,2%, соответственно) (р<0,001).
Исследование методом секвенирования для выявления структуры химерных
транскриптов с участием MLL было выполнено у 51 пациента, включая 26 человек
с наличием химерного транскрипта MLL-AF4, 14 случаев MLL-MLLT1, 7 – MLLMLLT3, 4 – MLL-EPS15. В результате нами выявлено 9 транскриптных вариантов
химерного гена MLL-AF4, 5 транскриптных вариантов — MLL-MLLT3, 3 — MLLMLLT1, 2 — MLL-EPS15. Среди транскриптов MLL-AF4 наиболее часто был
обнаружен вариант со слиянием 11-го экзона гена MLL и 4 экзона гена AF4
(e11e4) – в 8 случаях из 26 (30,8%). Реже выявлялись химерные транскрипты
e10e4 (23,1%), е9е4 (19,2%), e11e5 (7,7%). Среди 5 транскриптных вариантов
химерного гена MLL-MLLT3 преобладал e11e6, обнаруженный в 3 случаях из 7,
еще 4 варианта — е9е6, е10е5, е10е6 и е11е5 — были выявлены по 1 разу.
Меньшим разнообразием отличались химерные транскрипты MLL-MLLT1 и MLLEPS15. Из 14 пациентов с MLL-MLLT1 7 имели вариант с местами слияния в 11-м
экзоне гена MLL и 2-м экзоне MLLT1, 6 — вариант е10е2 и двое — е9е2. Поровну
распределись пациенты с наличием химерного транскрипта с MLL-EPS15: у 2
132
был выявлен вариант e10e2, еще у двоих – е11е2 (Рисунок 15). На рисунке 15 для
всех генов-партнеров приведены номера референсных последовательностей
(NM) нормальных транскриптов, праймеры для проведения гнездной ОТ-ПЦР
схематически представлены в виде черных прямоугольников; цифры внутри
черных прямоугольников соответствуют местам начала и конца праймера по
отношению к нормальной мРНК соответствующего транскрипта; цифры под
схематическим изображением экзонов соответствуют месту началу экзона.
Суммарно наиболее частой точкой слияния в гене MLL являлся 11-й экзон, на
долю которого приходилось 24 случая (47,0%), 10-й экзон участвовал в
образовании химерных транскриптов в 16 случаях (31,4%), 9-й — в 10 (19,6%).
При сравнении полученных нами результатов с ранее опубликованными
данными было показано, что выявленная нами частота встречаемости перестроек
11q23/MLL (65,7%) была несколько ниже, чем в международном исследовании
Interfant 99, в котором перестройки 11q23/MLL были зарегистрированы в 79%
случаев [33], а также в двух последовательных исследованиях MLL96 и MLL98,
где частота обнаружения перестроек гена 11q23/MLL составила 78% [335]. В
тоже время наши результаты соответствуют данным, полученным в разное время
в Бразилии – 58,1% [306], Германии – 65,9%, [231], Великобритании – 66,0%
[90], США – 68,7% [58]. Отчасти полученные различия могут быть связаны с
тем, что ряд обследованных нами пациентов, у которых перестройки 11q23/MLL
не были выявлены, обследованы только каким-то одним методом (только
цитогенетика, n=7; только ОТ-ПЦР, n=15), что в силу разных причин
(криптические транслокации, сложный механизм образования химерного гена,
редкий ген-партнер MLL) не позволило выявить весь возможный репертуар
перестроек 11q23/MLL. При этом следует отметить, что большинство пациентов,
включенных в исследование Interfant-99, были обследованы методом FISH [33], а
всем пациентам, получавшим терапию по протоколам MLL96 и MLL98,
проводилось исследование методом гибридизации по Саузерну [335]. Но даже в
группе, обследованной нами с использованием метода FISH, перестройки гена
MLL были выявлены только в 73,1% случаев.
133
Рисунок 15. Выявленные типы химерных транскриптов при ОЛЛ. Белые
прямоугольники – экзоны гена MLL, серые – экзоны генов-партнеров.
134
Сравнение относительной частоты выявления различных перестроек
11q23/MLL показало, что наиболее часто в исследованной нами группе
встречались
t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
и
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1,
что
совпадает с ранее опубликованными данными [33,58,90,231,306,335]. В то же
время
данные
литературы
по
частоте
встречаемости
транслокации
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 противоречивы: ряд исследователей ставят на её
третье место по частоте обнаружения у детей первого года жизни с ОЛЛ (11,215,6%) [33,58], в то же время в работе C.-H. Pui et a.l при анализе данных 11
кооперативных групп по лечению ОЛЛ у детей младше 12 мес. данная
транслокация была выявлена только в 3,7% случаев от общего числа перестроек
11q23/MLL [91]. В нашем исследовании t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 встретилась
у 12 пациентов (10,6%).
Несколько чаще, чем это описывалось ранее (5,3% по сравнению с 2,3-3,0%)
[91,433] нам встретилась реципрокная транслокация t(1;11)(p32;q23), ведущая к
образованию
химерного
гена
MLL-EPS15.
Следует
отметить,
что
t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 примерно с одинаковой частотой (2-3%) описывается
у детей как при ОЛЛ, так и при ОМЛ [320,420]. Однако в описываемой нами
группе пациентов она была обнаружена только при ОЛЛ.
Сходные с нашими данные по относительной частоте выявленных
перестроек гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни были получены M.
Jansen et al [219], которые использовали метод ДИ-ПЦР. Из 124 обследованных
пациентов перестройки гена MLL были выявлены у 98 (79%). Из этого числа в 51
(52%) случае был выявлен химерный ген MLL-AF4, в 22 (22%) — MLL-MLLT1, в
11 (11%) — MLL-MLL3. У 12 пациентов (12%) были выявлены другие
перестройки гена MLL, включая 3 случая MLL-MLLT10, 2 случая MLL-EPS15 и по
1 случаю EEFSEC (SELB), SEPT9 (MSF), AFF3. В 4 случаях ген-партнер MLL
определить не удалось. Авторы также показали, что частота выявления
перестроек гена MLL снижалась с возрастом [219].
По нашим данным частота выявления перестроек 11q23/MLL отличалась у
детей младше и старше 6 мес. Перестройки 11q23/MLL достоверно чаще
135
выявлялись у детей младше 6 мес. (р<0,001); при этом пик приходился на
возрастную группу 4-6 мес., где эта величина достигла 91,3%. Описанное в
отдельных работах преобладание частоты выявления перестроек гена MLL у детей
в первые три месяца жизни по сравнению с более старшим детьми первого года
жизни [306] не нашло подтверждения в нашей работе.
Большая вариабельность точек разрыва в гене MLL и генах-партнерах
значительно усложняет выявление отдельных перестроек и использование их в
качестве мишеней для мониторинга МОБ. В связи с этим важно определять
структуру химерных транскриптов для последующего адекватного качественного
и количественного анализа МОБ методом ПЦР-РВ. Известно, что, в отличие от
взрослых пациентов с ОЛЛ, у детей первого года жизни наиболее частой зоной
слияния в гене MLL является экзон 11, на долю которого приходится до половины
всех случаев перестроек гена MLL [320]. У обследованных нами пациентов с ОЛЛ
это было выявлено в 25 из 51 случаев (49,0%). Кроме того, для MLL-AF4, MLLMLLT3, MLL-MLLT1, MLL-EPS15 нами выявлено несколько вариантов химерных
транскриптов. При этом, если в MLLT1 и EPS15 точка слияния в гене-партнере
была постоянной (экзон 2 во всех случаях), то в AF4 было выявлено 3 точки
слияния – экзон 4 (20 случаев), экзон 5 (4 случая) и экзон 6 (2 случая).
3.3. Цитогенетическая характеристика острого миелоидного лейкоза
Цитогенетический анализ был проведен у 63 из 75 больных ОМЛ (Таблица
16). В 6 случаях (9,5%) были обнаружены только метафазы с нормальным
кариотипом, кроме этого у 3 пациентов с нормальным кариотипом лейкозных
клеток при использовании ОТ-ПЦР был выявлен химерный транскрипт MLLMLL10. Не было выявлено ни одного случая со специфическими транслокациями
t(8;21)(q22;q22) и t(15;17)(q22;q11). Инверсия inv(16)(p13q22), наблюдалась у трех
девочек с ОМЛ М2, ОМЛ М4 и ОМЛ М5. В первом случае inv(16) сочеталась с
трисомией 22 хромосомы, во втором была представлена как единственная
аномалия, а в третьем были выявлены трисомии 19 и 22 и маркер del(12)(p).
136
Последний при проведении исследования методом FISH оказался вовлечен в
транслокацию t(7;12)(q36;p13). Транслокация t(7;12) была выявлена у одной
пациентки с трисомией 19 хромосомы.
Таблица 16 - Цитогенетические подгруппы ОМЛ у детей первого года жизни
Цитогенетическая аберрация
Проведено цитогенетическое исследование
Количество
пациентов
%
63
100
Нормальный кариотип
6
9,5
t(8;21)(q22;q22)
—
—
t(15;17)(q22;q11)
—
—
inv(16)(p13q22)
3
4,8
281
44,4
t(1;22)(p13;q13)
5
7,9
t(7;12)(q36;p12)2
3
4,8
Комплексный кариотип (11q23(+))3
10
15,9
Комплексный кариотип (11q23(-))4
5
7,9
Другие
8
12,7
Транслокации с вовлечением 11q23
Примечания:
1 - Количество пациентов дано без учета данных ОТ-ПЦР и FISH;
2 - Выявлена при помощи FISH;
3 - В данном случае под комплексным кариотипом понимали клоны клеток с
тремя и более хромосомными аномалиями, включая перестройки 11q23/MLL без
маркеров благоприятного прогноза;
4 - Классический вариант комплексного кариотипа.
В 12 случаях лейкозные клетки содержали клональные хромосомные
нарушения, не затрагивающие район 11q23 (Таблица 17), среди которых были как
редкие аномалии, так и характерные для ОМЛ, такие как del(3)(q26), add(5q), -7,
137
add(7q), del(7q), del(20q),+21.
Среди всех пациентов, которым проводилось стандартное цитогенетическое
исследование, частота комплексного кариотипа составила 15,9 % (10 случаев из
63), включая 5 случаев из 34 (14,7%) у пациентов с перестройками 11q23/MLL
(№№ 6-10 в таблице 18) и 5 из 29 (17,2%) у пациентов без перестроек 11q23/MLL.
Последняя группу включала в себя одного пациента, у которого наряду с
конституциональной inv(5)(p13q13), присутствовали 4 маркерных хромосомы,
одной из которых, вероятно, являлась add(7p), а остальные идентифицировать не
удалось (№2 в таблице 18). Еще 4 случая у MLL-негативных пациентов по
особенностям хромосомных изменений соответствуют определению типичного
сложного кариотипа, характерного для ОМЛ взрослых пациентов (№№ 1, 3-5 в
таблице 18). Среди обследованных нами 75 пациентов с диагнозом ОМЛ в
возрасте до 12 месяцев выявить транслокацию t(8;21) не удалось, так же, как и
другую специфическую транслокацию, ассоциированную с благоприятным
прогнозом, – t(15;17)(q22;q21). Эти результаты подтверждаются данными
литературы о характерных изменениях кариотипа при ОМЛ у детей первого года
жизни. [2,162,382], однако есть отдельные работы, в которых сообщается о том,
что изредка при ОМЛ у детей исследуемой возрастной группы находят
транслокации t(8;21) и t(15;17) [306]. Третий маркер благоприятного прогноза при
ОМЛ - inv16(p13q22) – был обнаружен нами у трех пациентов, причем в одном
случае inv16 сочеталась с транслокацией t(7;12)(q36;p12). Двое пациентов с
изолированной inv16 живы и находятся в полной продолжающейся ремиссии,
длительность которой составляет от 63 и 129 мес. Пациент с сочетанием inv16 и
t(7;12)(q36;p12) погиб через 10 мес. от начала терапии.
У 5 пациентов с мегакариобластным ОЛ была обнаружена транслокация
t(1;22)(p13;q13), специфичная для варианта ОМЛ М7 и встречающаяся в
основном у детей первого года жизни. Во всех случаях t(1;22) была единственной
аномалией кариотипа. У 2 из 3 наших пациентов с известными исходами терапия
была
эффективной:
они
живы
и
продолжают
продолжающейся ремиссии длительностью 22 и 39 мес.
находиться
в
полной
Таблица 17 - Клоновые изменения кариотипа, не включавшие перестройки района 11q23 у пациентов с ОМЛ
№ Пол
Возраст
(мес.)
Кариотип клеток лейкозного клона
FAB
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
Н.О.
–
–
–
1
м
2,7
M7
2
ж
10,0
М0
3
ж
3,2
M0
47,XX,del(7)(q32),+17 [11]
Н.О.
4
ж
8,0
М4
47,XX,t(5;7)(q12;p22),+21 [8]
Н.О.
–
5
ж
9,9
—
46,ХХ, t(10;11)(p11-15(?);q13);del(20)(q11)[5]/46,ХХ [10]
Н.О.
–
6
м
6,3
М7
Н.О.
–
7
ж
10,8
М7
Н.О.
–
8
м
8,5
М7
47,XY,-7,+der(7)r(7)(p22q31?),der(8)del(8q22),+19 [10]
Н.О.
–
9
ж
9,4
М4
46,XX,del(6)(q11-q12),t(6;11)(q21;p15) [39], 46,XX [5]
Н.О.
46,XY,t(7;11)(p12;p15)
46,XX,del(3)(q26),add(7)(p22),add(7)(q32),
t(8;11)(q22;q12),del(14), t(22;?)(q;?)[13]/46,XX[2]
/46,XY,inv(5)(p13q13)c [2]
51,XX,+2,t(4;14)(p11;q31),+6, (7;22)(p15;q13),+10,+19,
+21[3]
(MLL×2) [100]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[50]
138
42~49,XY,-4,inv(5)(p13q13)c,?add(7p),+3mar[9]
nuc ish 11q23
Продолжение таблицы 17
№ Пол
10
м
Возраст
(мес.)
4,0
FAB
М1
Кариотип клеток лейкозного клона
45,XY,-7[11]
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
Н.О.
43~50,XY,der(3)del(3)(p14),del(3)(q22),der(5)t(5;13)(q35;q2
11
м
5,6
М7
1),del(10)(p12)[14],+19[9],der(16)t(15;16)(q22;q24)[8],+Y[4]
Н.О.
,del(12)(p12)[3],+del(15)(q22)[2][cp14]/46,XY[3]
ж
9,2
М5
46,XX,t(7;10)(q11;q11),del(11)(q23) [20]
—
(MLL×2)[50]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[50]
—
139
12
nuc ish 11q23
Таблица 18 - Комплексный кариотип у пациентов с ОМЛ
№ Пол
Возраст
(мес.)
FAB
Кариотип клеток лейкозного клона
Результат
Данные
ОТ-ПЦР
FISH
–
–
Н.О.
–
46,XX,del(3)(q26),add(7)(p22),add(7)(q32), t(8;11)(q22;q12),del(14),
1
ж
10,0
М0
2
м
6,3
М7
3
ж
10,8
М7
51,XX,+2,t(4;14)(p11;q31),+6, (7;22)(p15;q13),+10,+19, +21[3]
Н.О.
–
4
м
8,5
М7
47,XY,-7,+der(7)r(7)(p22q31?),der(8)del(8q22),+19 [10]
Н.О.
–
t(22;?)(q;?)[13]/46,XX[2]
42~49,XY,-4,inv(5)(p13q13)c,?add(7p),+3mar[9] /
46,XY,inv(5)(p13q13)c[2]
5
м
5,6
М7
Н.О.
del(10)(p12)[14],+19[9],der(16)t(15;16)(q22;q24)[8],+Y[4],
del(12)(p12)[3],+del(15)(q22)[2][cp14]/46,XY[3]
nuc ish 11q23
(MLL×2)[50]
6
м
2,2
М2
46,XY,del(1)(p13),add(4)(p16),add(11)(q23)[7]/46,XY[7]
MLL-MYO1F
MLLr
7
м
8,0
М5
45,XY,-10,der(11)t(10;11)(p?;q?11), der(16)t(11;16)(q11;p13) [41]/
MLL-MLLT10
MLLr
8
ж
2,1
М5
49,ХХ,+8,+8,der(10)t(10;11;12)(p12;q23q13;q15), -11,-12,+3 mar[14]
—
—
9
м
4,4
М5
—
MLLr
10
м
10,5
М5
MLL-MLLT3
MLLr
46,XY,t(2;7)(q33;q32)[10]/53,XY,t(2;7)(q33;q32),+6,+8,
t(9;11)(p22;q23),+der(9)t(9;11),+19,+20,+21,+22[10]
46~48,XY,t(9;11)(p21;q23),i(12q), -13, +1~3r[cp21]
Примечание: №№ 1-5 также были представлены в таблице 17 под №№ 2,6-8 и 11, соответственно;
140
43~50,XY,der(3)del(3)(p14),del(3)(q22),der(5)t(5;13)(q35;q21),
141
3.4 Выявление транслокации t(7;12)(q36;p12)
Известно, что транслокация t(7;12)(q36;p12) во многих случаях является
криптической, и при цитогенетическом исследовании она может не выявляться
[216]. В то же время было показано, что она является самой частой хромосомной
аномалией, выявляемой при ОМЛ у детей первого года жизни с отсутствием
перестроек MLL [203]. Более того, ранее было выявлена неблагоприятная
прогностическая роль этой транслокации [417,418]. Это послужило основанием
для разработки диагностического подхода, позволяющего выявлять любые формы
транслокации t(7;12)(q36;p12), включая её криптические варианты.
Использование нового трехцветного зонда для FISH позволило выявить
транслокацию t(7;12) в 4 случаях, включая три случая MLL-негативного ОМЛ, и
один случай ОБфЛ, когда клетки лейкозного клона содержали делеции del(7)(q11)
и del(12)(p13). Интересно отметить, что все позитивные случаи выявлены у
девочек, и в трех из четырех случаев цитогенетически определялась трисомия 19
хромосомы. Взаимосвязи с FAB-вариантом не прослеживалось (Таблица 19).
Для оценки специфичности флуоресцентного зонда был использованы
цитогенетические препараты 5 пациентов с ОМЛ исследуемой возрастной
группы, включая 2 случая с нормальным кариотипом, и 3 — со случайными
цитогенетическим аберрациями.
При
использовании
флуоресцентных
t(7;12)(q36;p12)
сигналов,
будет
трехцветного
зонда
нормальное
распределение
соответствующее
отсутствию
транслокации
следующим:
на
каждой
12-й
хромосоме
должен
располагаться 1 оранжевый сигнал (О) от центромерной и 1 зеленый (G) от
теломерной частей зонда, комплементарных хромосомному району 12p13; на
каждой 7 хромосоме — по 2 голубых сигнала (B), гибридизующихся по обе
стороны от гена HLXB9 (MNX1) в 7q36. Аналогичная картина будет и при
исследовании интерфазных ядер (Рисунок 16). Всего в исследуемой группе нами
выявлено 4 различных комбинации флуоресцентных сигналов, две из которых
соответствуют отсутствию транслокации (2O+G/2B и 1O+G/2B), две другие —
142
различным вариантам транслокации t(7;12)(q36;p12), но ключевым в этих случаях
является совместное расположение голубого сигнала c комбинацией зеленого и
оранжевого (Таблица 19).
Рисунок 16. Распределение флуоресцентных сигналов 2O+G/2B, соответствующее
отсутствию транслокации t(7;12).
Таблица 19 - Результаты использования трехцветного флуоресцентного зонда для
выявления транслокации t(7;12)
Распределение
№ FAB
Кариотип
флуоресцентных
Данные
начальный
сигналов на
FISH
хромосомах
48,XX,+19,+22,
1 М5 inv(16)(p13;q22),
del(12)(p12-13?)
7 (N) – B
der(7) – B+G
12 (N) – O+G
Уточненный
кариотип с учетом
результатов FISH
48,XX,+19+22,
t(7;12) +
t(7;12)(q36;p13),
inv(16)(p13q22)
Der(12) – O+G+B
7 (N) – B
2 М7
47,XX,+19
[14]der(7) – B+G
/idem, add(7q) [4] 12 (N) – O+G
Der(12) – O+G+B
t(7;12) +
47,XX,+19/idem,
t(7;12) (q36;p13), +mar
143
Продолжение таблицы 19
Распределение
№ FAB
Кариотип
флуоресцентных
Данные
начальный
сигналов на
FISH
хромосомах
Уточненный
кариотип с учетом
результатов FISH
7 (N) – B
3 М0 47,XX,+19 [20]
der(7) – B+G
12 (N) – O+G
t(7;12) +
48,XX,+19,
t(7;12)(q36;p13)
Der(12) – O+B
4
ОБ
фЛ
46,XX,del(7)(q11),
del(12) (p13) ish
ETV6 mv
7 (N) – B
der(7) – G
t(7;12) +
12 (N) – O+G
del(7)(q)
Der(12) – O+G+B
46,XX,der(7)t(7;12)
(q11;p13)del(7)
(q11q36)
7 (N) - B
5 Mx 47,XY,+6 [11]
7 (N) - B
12 (N) - 1O+G
t(7;12) del(12)(p13)
47,XY,+6
Del(12)(p13)
47,XY,+6,-10,-21, 7 (N) - B
6 M7
add(10p),del(3q),
7 (N) - B
del(6q),der(19),
12 (N) - 1O+G
der(19),+2 mar
Del(12)(p13)
47,XY,+6,-10,-21,
t(7;12) -
add(10p),del(3q),
del(12)(p13) del(6q),der(19),
der(19),+2 mar
7 (N) - B
7 M5 46,XX
7 (N) - B
12 (N) - 1O+G
t(7;12) -
46,XX
t(7;12) -
46,XX
12 (N) - 1O+G
7 (N) - B
8 Mx 46,XX
7 (N) - B
12 (N) - 1O+G
12 (N) - 1O+G
144
Продолжение таблицы 19
Распределение
№ FAB
Кариотип
флуоресцентных
Данные
начальный
сигналов на
FISH
хромосомах
Уточненный
кариотип с учетом
результатов FISH
7 (N) - B
9 М1
46,XX,t(5;6)(q31;q 7 (N) - B
15-16)
12 (N) - 1O+G
t(7;12) -
46,XX,t(5;6)(q31;q1516)
12 (N) - 1O+G
Примечание. «Мх» - FAB-вариант неизвестен;
У двух пациентов (№№ 5 и 6 в таблице 19) нами было выявлено только по
одному красному и зеленому сигналу при наличии двух голубых. Так как по
данным цитогенетического исследования у данных пациентов присутствовали обе
хромосомы 12, и они были неизмененные, то это было расценено как
внутрихромосомная делеция 12p13 с возможным вовлечением гена ETV6.
Основываясь на результатах исследования методом FISH, была показана
гетерогенность точек разрыва в хромосомном районе 7q36. В трех случаях (№№
1-3 в таблице 19) точка разрыва располагалась непосредственно в гене HLXB9.
При этом голубой сигнал был найден на трех хромосомах — на неизмененной 7
хромосоме, деривате 7 и деривате 12. У одного пациента (№4 в таблице 19) точка
разрыва в хромосомном районе 7q36 локализовалась проксимальнее гена HLXB9.
Это привело к тому, что зеленый сигнал находился на деривате 7 хромосомы, а
голубой — дистальнее комбинации зеленого и оранжевого — на деривате 12
хромосомы. Также в этом случае была выявлена делеция длинного плеча 7
хромосомы del(7)(q11q36) (Рисунок 17 а, б).
В регионе 12p13 точки разрыва локализовались внутри зоны, окрашенной
зеленой флуоресцентным красителем, и это мог быть как фрагмент гена ETV6, так
и рядом расположенные участки хромосомы. При этом в двух случаях (№№ 1-2 в
таблице 19) было отмечено расщепление зеленого флуоресцентного сигнала,
145
который в этих случаях был расположен на трех хромосомах — на интактной 12-й
хромосоме, деривате 12 хромосомы и деривате 7 хромосомы (Рисунок 17 в, г).
При отсутствии расщепления сигналов визуализировалось два зеленых сигнала,
расположенных на деривате 7-й хромосомы, и неизмененной 12-й.
Рисунок 17. Результаты исследования методом FISH и схема распределения
флуоресцентных сигналов пациентов с различными точками разрыва в 7q36 при
образовании t(7;12) в случаях №4 (а, б) и №2 (в,г) (нумерация дана по таблице 19).
В случае №4 голубой сигнал располагался на неизмененной хромосоме 7, зеленый
сигнал — на укороченном деривате 7 хромосомы, зеленый и оранжевый сигналы
на неизмененной хромосоме 12, голубой, зеленый и оранжевый — на деривате 12
(а,б). У двух пациентов (№№1-2 в таблице 19) отличие состояло в том, что на
деривате хромосомы 7 присутствовали и голубой и зеленый сигналы (в,г).
146
Оценить
прогностическое
значение
этой
транслокации
на
столь
ограниченном количестве наблюдений невозможно. Две пациентки (№№ 3,4 в
таблице 19) живы и находятся в полной продолжающейся ремиссии со сроками
наблюдения 6 и 33мес, соответственно. Пациентка №1 погибла в ремиссии после
ТГСК через 10 мес. от начала терапии. У пациентки №2 развился рецидив через
13 мес. от начала терапии, смерть в ремиссии от инфекции наступила через 20
мес.
Мы также оценили экспрессию CD34 и СD117 у пациентов с транслокацией
t(7;12). Для сравнения была использована группа из 31 пациента с ОМЛ в
возрасте младше 12 мес., включая 15 пациентов с перестройками гена MLL и 16
без таковых. Было показано, что экспрессия CD34, но не CD117, достоверно чаще
выявлялась у пациентов при наличии t(7;12) (Таблица 20). Различия для СD34
становились более значимыми в том случае, когда группа пациентов с t(7;12)
сравнивалась с MLL-позитивным ОМЛ (p=0,009).
Таблица 20 - Экспрессия антигенов CD34 и CD117 опухолевыми бластами
Показатель
Количество пациентов, опухолевые
бласты которых экспрессируют CD34
Количество пациентов, опухолевые
бласты которых экспрессируют CD117
t(7;12)
t(7;12) не
обнаружена
обнаружена
(n=4)
(n=31)
4
10
p=0,019
4
14
p=0,104
p
Таким образом, на основании полученных нами результатов и данных
литературы был сформулирован алгоритм выявления t(7;12), который приведен на
рисунке 18.
Подводя итог данного раздела, следует отметить, что нами была
продемонстрирована
возможность
выявления
криптической
транслокации
147
t(7;12)(q36;p13) путем использования трехцветного флуоресцентного зонда,
который показал свою высокую эффективность. Наличие различных комбинаций
флуоресцентных сигналов свидетельствует о гетерогенности точек разрыва в
хромосомном районе 7q36 и существовании различных механизмов образования
химерного гена HLXB9(MNX1)-ETV6. У пациентов с наличием транслокации
t(7;12) опухолевые бласты достоверно чаще имеют менее зрелый иммунофенотип
по сравнению со случаями ОМЛ без данной транслокации.
Рисунок 18. Алгоритм выявления транслокации t(7;12)(q36;p13) методом FISH
при ОЛ у детей первого года жизни. *Другие типы ОЛ — ОБфЛ, ОНдЛ, ОБлЛ;
**ОТ-ПЦР—ОТ-ПЦР с выявлением максимально возможного спектра перестроек
гена MLL.
3.5. Перестройки 11q23/MLL при остром миелоидном лейкозе
В исследованной группе перестройки 11q23/MLL выявлены у 42 из 75
пациентов (56,0%). Результаты цитогенетических и молекулярно-генетических
исследований представлены в таблице 21. Наиболее часто в исследуемой группе
пациентов
выявлялись
транслокации
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3
и
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 (по 28,6% каждая). Нами было выявлено 3
пациента с инсерцией ins(10;11)(p12;q23q21), которая является одним из
148
вариантов транслокации t(10;11)(p12;q23) и также ведет к образованию химерного
гена MLL-MLLT10. Поэтому в рамках данной работы мы объединили 3 случая
ins(10;11)(p12;q23q21) вместе с 9 случаями t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10.
Таблица 21 — Относительная частота выявления перестроек 11q23/MLL при ОМЛ
у детей первого года жизни (n=75)
Тип перестройки 11q23/MLL
Количество
%
пациентов
Всего выявлено перестроек 11q23/MLL
42
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3
12
28,6
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10
12
28,6
t(1;11)(q21;q23)/MLL-MLLT11
2
4,8
t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
2
4,8
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MYO1F
2
4,8
t(11;19)(q23;p13)/MLL-ELL
1
2,4
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1
1
2,4
t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4
1
2,4
t(11;17)(q23;q25)/MLL-SEPT9
1
2,4
t(X;11)(q24;q23)/MLL-SEPT6
1
2,4
MLL-PTD
1
2,4
Неизвестный ген-партнер MLL
5
11,9
Помимо этого, при ОМЛ у детей первого года жизни нам выявлен большой
спектр других перестроек 11q23/MLL, однако они наблюдались
значительно
реже. В 5 случаях (11,9%) методом FISH на интерфазных ядрах была выявлена
перестройка гена MLL, однако идентифицировать ген-партнер не удалось.
Для исследования взаимосвязи между типом перестроек 11q23/MLL и
возрастом пациентов все случаи ОМЛ у детей первого года жизни были
разделены на 6 групп (Таблица 22).
149
Таблица 22 - Количество пациентов с ОМЛ и различными перестройками
11q23/MLL в зависимости от возраста
Возраст, мес.
Тип перестройки
11q23/MLL
t(9;11)(p22;q23)/
MLL-MLLT3
t(10;11)(p12;q23)/
MLL-MLLT10
t(1;11)(q21;q23)/
MLL-MLLT11
t(4;11)(q21;q23)/
MLL-AF4
t(11;19)(q23;p13)/
MLL-MYO1F
t(11;19)(q23;p13.1)/
MLL-ELL
t(11;19)(q23;p13.3)/
MLL-MLLT1
t(6;11)(q27;q23)/
MLL-MLLT4
t(11;17)(q23;q25)/
MLL-SEPT9
t(X;11)(q24;q23)/
MLL-SEPT6
MLL-PTD
Неизвестный
ген-партнер MLL
Всего 11q23/MLL (+)
0,1-2,0
2,1-4,0
4,1-6,0
6,1-8,0
8,1-10,0 10,0-11,9
2
—
1
2
—
7
2
3
—
2
2
3
1
—
2
—
—
—
1
—
—
—
—
1
—
2
—
—
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
1
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
1
—
1
—
—
—
—
—
1
—
—
1
1
2
8
6
4
6
5
13
(66,7%) (46,2%) (57,1%) (60,0%) (38,5%) (65,0%)
150
Продолжение таблицы 22
Возраст, мес.
Тип перестройки
11q23/MLL
Перестройки 11q23/
MLL не выявлены
Итого
0,1-2,0
2,1-4,0
4,1-6,0
6,1-8,0
4
7
3
4
(33,3%)
8,1-10,0 10,0-11,9
8
7
(53,8%) (42,9%) (40,0%) (61,5%) (35,0%)
12
13
7
10
13
20
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
Перестройки 11q23/MLL чаще всего встречались в возрастных группе 0,12,0 мес. — 66,7% случаев и 10,1-11,9 мес. — 65,0%. Наименьшая частота
отмечена в группе 8,1-10,0 мес. — 38,5%. Транслокация t(10;11)(p12;q23)/MLLMLLT10 была представлена практически во всех возрастных группах. Девять из
12 пациентов с наличием транслокации t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3 были старше
6 мес. (p=0,216). При разделении пациентов на 2 группы – старше и младше 6 мес.
– различий в частоте встречаемости перестроек 11q23/MLL не выявлено (p=0,843).
Цитоморфологическое исследование костного мозга было выполнено у 68
пациентов (89,3%), в том числе у 40 с перестройками 11q23/MLL и у 28 – без них
(Таблица 23).
Таблица 23 - Количество пациентов с ОМЛ и различными перестройками
11q23/MLL в зависимости от FAB-варианта
Морфологические варианты ОМЛ
Тип перестройки
11q23/MLL
t(9;11)(p22;q23)/
MLL-MLLT3
t(10;11)(p12;q23)/
MLL-MLLT10
t(1;11)(q21;q23)/
MLL-MLLT11
М0
М1
М2
М4
М5
М7
Мх
—
—
—
1
9
1
1
—
1
—
1
10
—
—
—
—
2
—
1
—
—
151
Продолжение таблицы 23
Морфологические варианты ОМЛ
Тип перестройки
11q23/MLL
t(4;11)(q21;q23)/
MLL-AF4
t(11;19)(q23;p13)/
MLL-MYO1F
t(11;19)(q23;p13.1)/
MLL-ELL
t(11;19)(q23;p13.3)/
MLL-MLLT1
t(6;11)(q27;q23)/
MLL-MLLT4
t(11;17)(q23;q25)/
MLL-SEPT9
t(X;11)(q24;q23)/
MLL-SEPT6
MLL-PTD
Неизвестный ген-партнер
MLL
Всего 11q23/MLL (+)
Перестройки 11q23/MLL
не выявлены
М0
М1
М2
М4
М5
М7
Мх
1
—
—
1
—
—
—
—
—
2
—
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
1
3
—
1
1
1
4
7
26
1
2
(7,7)
(28,6)
12
5
(33,3) (25,0) (66,7) (70,0) (81,3)
2
3
2
3
6
(66,7) (75,0) (33,3) (30,0) (18,7) (93,2) (71,4)
Итого
3
4
6
10
32
13
7
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
(100)
Интересно, что ни в одном из 68 случаев не были диагностированы
морфологические варианты ОМЛ М3 или ОМЛ М6. У большинства 11q23/MLL-
152
позитивных пациентов был выявлен острый монобластный лейкоз (М5
морфологический вариант по FAB-классификации (26 человек, 61,9%), включая
10 из 12 пациентов с наличием t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 и 9 из 12 пациентов
с транслокацией t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3. У 7 (16,7%) пациентов с
перестройками 11q23/MLL был диагностирован острый миеломонобластный
лейкоз (М4 морфологический вариант по FAB), острый миелобластный с
признаками созревания (М2 морфологический вариант по FAB) – у 4 (9,5%).
Также было выявлено по 1 случаю (2,4%) острого миелобластного лейкоза с
минимальной дифференцировкой (М0 морфологический вариант по FAB),
острого миелобластного лейкоза без признаков созревания (М1 морфологический
вариант по FAB) и острого мегакариобластного лейкоза (М7 морфологический
вариант по FAB).
Суммарно на долю М4 и М5 вариантов приходилось 78,5% всех случаев
MLL-позитивного ОМЛ в исследуемой группе. В группе пациентов без перестроек
11q23/MLL преобладающим морфологическим вариантом был М7 – 12 (36,4%)
пациентов, М5 был выявлен у 6 человек (18,2%), М1 и М4 – по 3 (9,1%), М2 и М0
– по 2 (6,1%).
Таким образом, у пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL ОМЛ М5
диагностировался достоверно чаще (р<0,001), а М7 – значительно реже (р<0,001),
по сравнению с группой пациентов, у которых перестройки 11q23/MLL не были
обнаружены.
Существенных
различий
в
частоте
встречаемости
других
цитологических вариантов ОМЛ между сравниваемыми группами не обнаружено.
ДХА были выявлены у 10 из 34 пациентов (29,4%) с наличием перестроек
11q23/MLL и информативным цитогенетическим исследованием (Таблица 24). В
трех случаях обнаружены только количественные ДХА (№№ 1,3,10 в таблице 24),
в двух — только структурные (№№ 2,8 в табл. 24); в 5 случаях — сочетание
количественных и структурных. Наиболее частыми количественными ДХА
являлись дополнительные хромосомы 8 (3 случая), 6 и 19 (по 2 случая), а также
моносомия 10 (2 случая). Однако из-за небольшого числа наблюдений однозначно
оценить прогностическое значение ДХА и комплексного кариотипа невозможно.
Таблица 24 - Клинико-лабораторная характеристика пациентов с дополнительными хромосомными аномалиями и
перестройками 11q23/MLL
№ Пол
Возраст
(мес.)
FAB
Кариотип
Результат Компл.
FISH
Достиж.
кариотип ремиссии
Исходы терапии
Рецидив через 12,9 мес. от
1
ж
11,9
М4
47,XX,t(9;11)(p22;q23), +19[13]
MLLr*
Нет
Да
начала терапии Пациент
жив после ТГСК со сроком
наблюдения 10,2 мес.
м
2,2
М2
3
м
10,9
—
46,XY,del(1)(p13),add(4)(p16),
add(11)(q23)[7]/46,XY[7]
48,XY,+8,+8[20] /
50, XY,+Y,+8,+8,+9[2]
MLLr
Да
Нет
MLLr
Нет
—
м
8,0
М5
(p?;q?11),der(16)t(11;16)(q11;p13)
MLLr
Да
Да
[41]/46,XY [3]
5
ж
2,1
М5
49,ХХ,+8,+8,der(10)t(10;11;12)(p1
2;q23q13;q15), -11,-12,+3 mar[14]
1,8 мес. от начала терапии
—
Рецидив через 5,1 мес. от
45,XY,-10,der(11)t(10;11)
4
Смерть в индукции через
начала терапии. Смерть от
рецидива в сроке
наблюдения 8,2 мес.
MLLr
Да
Да
Пациент жив в ремиссии,
срок наблюдения 59,8 мес.
153
2
Продолжение таблицы 24
№ Пол
Возраст
FAB
(мес.)
Кариотип
Результат Компл. Достиж.
FISH кариотип ремиссии
Отсутствие ответа на
46,XY,t(2;7)(q33;q32)[10]/53,XY,
6
м
4,4
М5
t(2;7)(q33;q32),+6,+8,t(9;11)(p22;q
MLLr
Да
Нет
7
м
10,5
М5
м
0,8
М5
9
ж
9,6
М5
46XY,der(11)t(1;11)(q21;q23),
t(11;16)(p15;p13.1)[11]
47,XX,r(10),+der(11)t(10;11)
(?q21;q13)[9]
Рецидив через 12,0 мес.
MLLr
Да
Да
Пациент жив со сроком
наблюдения 17,3 мес.
MLLr
Нет
Нет
MLLr
Нет
Да
Отсутствие ответа на терапию. Смерть через 3,3 мес.
Пациент жив после ТГСК со
сроком наблюдения 9,0 мес.
Рецидив через 2,8 мес. от
начала терапии, ТГСК через
10 м
7,7
М4
47,XY,+6,der(11)t(10;11)(q26;q23)
?[20]
MLLr
Нет
Да
8,6 мес. Рецидив через 2,9
мес. после ТГСК. Смерть от
рецидива через 12,7 мес. от
начала терапии
154
8
-13, +1~3r[cp21]
терапию, пациент жив со
сроком наблюдения 4,2 мес.
23),+der(9)t(9;11),+19,+20,+21,+22
46~48,XY,t(9;11)(p21;q23),i(12q),
Исходы терапии
155
Но следует отметить, что из 9 пациентов с известными исходами терапии в
полной продолжающейся ремиссии находятся только двое (включая 1 пациента с
комплексным
кариотипом),
причем
одному
из
них
была
проведена
трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в первой ремиссии. В этой
группе выявлено 4 рецидива, у 2 пациентов отсутствовал ответ на проводимую
терапию, а 1 погиб в индукции.
Структура химерного транскрипта была определена нами у 17 пациентов,
включая 7 случаев с наличием MLL-MLLT3, также 7 - MLL-MLLT10, 2 случая MLL-MLLT11, 1 случай MLL-AF4. Было выявлено по 4 транскриптных варианта
MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10 и 1 — MLL-MLLT11. У единственного пациента с
наличием MLL-AF4 химерный транскрипт образовался при слиянии 11 экзона
гена MLL с 5 экзоном AF4 (e9e5). Этот же тип химерного транскрипта MLL-AF4
был выявлен у 2 из 26 пациентов с ОЛЛ. У пациентов с MLL-MLLT3 преобладал
вариант e11e6, обнаруженный в 4 из 7 случаев. Выявлено по 1 случаю
транскриптных вариантов е9е5, е9е6, е10е6, Все они, за исключением е10е6,
встречались и в группе пациентов с MLL-MLLT3-позитивным ОЛЛ, а
доминирующий вариант e11e6 был самым частым и среди пациентов с ОЛЛ.
Среди пациентов с наличием MLL-MLLT10 было выявлено по 2 случая химерных
транскриптов е8е15, е9е9, e9е10 и 1 случай e9e4. Оба пациента, у которых был
найден MLL-MLLT11, имели транскриптный вариант е9е2. Суммарно, наиболее
частой зоной слияния при образовании химерных транскриптов у пациентов с
ОМЛ был 9-й экзон гена MLL (10 случаев из 17). А среди генов-партнеров MLL
наиболее разнообразна была локализация зон слияния в гене MLLT10 (Рисунок
19).
Полученная в нашей работе частота выявления перестроек 11q23/MLL
составила 56,0%, что сходно с ранее опубликованными данными — 56-66%
[85,162,287]. Неожиданным явилось относительно высокая частота выявления
транслокации t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10, которая чаще всего располагается
на втором месте после t(9;11) [85,162]. Отчасти это может быть объяснено
относительно небольшой выборкой пациентов.
156
Рисунок 19. Выявленные типы химерных транскриптов при ОМЛ. Локализация
точек слияния в гене MLL и генах-партнерах у 17 пациентов.
157
Особый интерес представляет выявление у детей первого года жизни с ОМЛ
редких или нетипичных для данной возрастной группы транслокаций/геновпартнеров MLL. К редким можно отнести обнаруженные нами химерные гены
MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9, к нетипичным — t(6;11)(q27;q23)/MLLMLLT4.
Ранее
было
показано,
что
ДХА
имеют
большое
значение
для
прогнозирования исходов ОМЛ с перестройками 11q23/MLL. Пациенты, у
которых было выявлено сочетание перестроек 11q23/MLL с определенными
структурными и/или количественными хромосомными нарушениями имели более
низкую БСВ и более высокий кумулятивный риск развития рецидива по
сравнению с пациентами без ДХА. Среди количественных ДХА E. Coenen et al.
[362] выделяют трисомию 8, ассоциированную с благоприятным прогнозом, а
также
трисомию
19,
которая,
наоборот,
является
прогностически
неблагоприятной. Структурные ДХА в сочетании с перестройками 11q23/MLL
также являются маркерами плохого прогноза [362]. Нами ДХА были выявлены у
трети пациентов с ОМЛ и информативным цитогенетическим исследованием
(29,4%), и обнаружена тенденция к неблагоприятному исходу заболевания у этой
группы пациентов.
Отдельно нами был изучен вопрос о сложном (комплексном) кариотипе при
ОМЛ у детей первого года жизни. Этот тип нарушений у взрослых больных имеет
крайне неблагоприятное прогностическое значение [341]. В настоящее время
большинство авторов считают кариотип клеток лейкозного клона комплексным,
если он содержит не менее 3 цитогенетических аномалий. В «классическом»
варианте термин комплексный кариотип исключал перестройки 11q23 [341].
Однако, в настоящее время многие авторы [121,362,436] включают перестройки
11q23/MLL в число аномалий, которые формируют комплексный кариотип. В
работе Е. Флейшман и соавт. было показано, что частота случаев ОМЛ с
комплексным кариотипом оказалась самой высокой у детей в возрасте 0-2 года
(27,3%), значительно превосходя этот показатель у детей в других возрастных
группах (3,3%- 5,4%) и даже у пожилых людей (8,1%-12,7%) [12]. Очевидно,
158
причиной отмеченных различий является, во-первых, более высокая частота
перестроек хромосомного района 11q23 при ОМЛ детей младшего возраста, и, вовторых, нестабильность кариотипа, приводящая к тому, что перестройки 11q23
нередко
сочетаются
с
несколькими
цитогенетическими
аномалиями
одновременно.
Мы также относили к комплексному кариотипу все случаи с тремя и более
хромосомными нарушениями, включая перестройки района 11q23. В результате
комплексный кариотип был выявлен с относительно высокой частотой (14,7%) у
пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL.
3.6. Цитогенетическая характеристика других вариантов острого лейкоза
Выявлено 3 пациента с ОНдЛ и нормальным кариотипом, причем в одном
из этих случаев методом ОТ-ПЦР был выявлен химерный транскрипт MLLMLLT3. Лейкозные клетки одной пациентки с ОБфЛ содержали делеции
del(7)(q11)
и
что
del(12)(p13),
позволило
предположить
нам
наличие
t(7;12)(q36;p12), которая позднее была верифицирована методом FISH.
3.7. Перестройки 11q23/MLL при других вариантах острого лейкоза
В этой группе перестройки 11q23/MLL были выявлены у 4 из 7 пациентов. В
одном случае у пациента с острым недиффенцированным лейкозом и нормальным
кариотипом лейкозных клеток методом ОТ-ПЦР был выявлен химерный
транскрипт
MLL-MLLT3.
В
другом,
также
у
пациента
с
острым
недиффенцированным лейкозом при отсутствии метафаз был выявлен химерный
транскрипт MLL-MLLT10. Кроме того, транслокации с участием 11q23
наблюдались еще у двух пациентов с острым билинейным лейкозом:
t(4;11)(q21;q23) и t(11;15)(q23;q22). В трех случаях пациентам с перестройками
11q23/MLL проведено исследование методом FISH, подтвердившее результаты
159
цитогенетического анализа и/или ОТ-ПЦР. У пациента с острым билинейным
лейкозом и t(11;15) была выявлена ДХА в виде трисомии 8 хромосомы.
Отсутствие доступного материала не позволило верифицировать ген-партнер
MLL, располагающийся на 15-й хромосоме
3.8. Использование метода флуоресцентной гибридизации in situ для выявления
перестроек гена MLL
При использовании метода FISH перестройки гена MLL были выявлены у 92
из 126 обследованных пациентов (73,0%), в том числе, в 57 из 78 случаев ОЛЛ
(73,1%) и в 33 из 44 случаев ОМЛ (75,0%), а также у 1 пациента с ОБлЛ и у 1 с
ОНдЛ. Одновременно с этим информативное цитогенетическое исследование
проведено у 96 из 126 пациентов (76,2%) с ОЛ, при этом транслокации с
вовлечением хромосомного района 11q23 выявлены у 60 (62,5%). Из 30 случаев,
когда не было получено метафаз (23 ОЛЛ, 6 ОМЛ, 1 ОНдЛ), в 25 – наличие
перестройки гена MLL подтверждено методом FISH, а в 23 случаях был также
верифицирован ген-партнер методами ОТ-ПЦР и ДИ-ПЦР. В 1 случае ОТ-ПЦР не
проводилась, еще в 1 — перестройка гена MLL была выявлена при применении
FISH, но из-за отсутствия достаточного количества материала верифицировать
ген-партнер методом ДИ-ПЦР не удалось; при этом наличие наиболее частых
химерных транскриптов, таких как MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLLMLLT4, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-EPS15, MLL-ELL было исключено в
ходе ОТ-ПЦР. В 5 из 30 неинформативных случаев перестройки гена MLL не
были обнаружены.
Несмотря на более частое обнаружение перестроек гена MLL методом FISH,
по сравнению с транслокациями хромосомного района 11q23, выявляемыми
цитогенетически, достоверных различий в эффективности этих методов не
найдено (p=0,127), но следует подчеркнуть, что неинформативные результаты
цитогенетических исследований (n=30) в расчет не включались. В то же время
следует
отметить,
что
нами
не
зафиксировано
ни
одного
случая
160
неинформативного исследования методом FISH.
В 7 случаях (3 ОЛЛ и 4 ОМЛ) при стандартном цитогенетическом
исследовании транслокаций с вовлечением района 11q23 выявлено не было,
однако применение метода FISH позволило обнаружить перестройки гена MLL
(Таблица 25). При этом у трех пациентов (№№ 1-3 в таблице 25) обнаружены
только клетки с нормальным кариотипом, в одном случае (№5 в таблице 25)
имела место тетрасомия 8, и еще у троих найдены структурные изменения (№№,
4,6,7 в таблице 25) которые не затрагивали хромосомный район 11q23. При
применении ОТ-ПЦР в этой группе пациентов было выявлено по 2 случая с MLLMLLT3 и MLL-MLLT10, наличие которых было также подтверждено в ходе ДИПЦР. Использование ДИ-ПЦР помогло установить еще два редких химерных гена
— MLL-AFF3, MLL-MYO1F. У пациента №5 отсутствие доступного генетического
материала не позволило провести ни ОТ-ПЦР, ни ДИ-ПЦР и ген-партнер MLL
остался не верифицированным.
У одного пациента и цитогенетическое исследование, и FISH согласованно
не выявили перестройки 11q23/MLL, тем не менее, её наличие было подтверждено
в ходе ОТ-ПЦР и ДИ-ПЦР. В этом случае при нормальном кариотипе клеток
лейкозного клона и отсутствии перестроек гена MLL по данным FISH, методами
ДИ-ПЦР и ОТ-ПЦР был выявлен химерный ген MLL-MLLT10 с точками разрыва в
интроне 9 гена MLL и интроне 3 гена MLLT10, что привело к образованию
соответствующего химерного транскрипта e9e4.
При исследовании методом FISH в 85 случаях (92,4%) было выявлено
стандартное распределение флуоресцентных сигналов, типичное для перестройки
гена MLL (1R1G1F). В 7 случаях (7,6%) дополнительно была обнаружена делеция
3’-конца данного гена (1G1F) (Таблица 26), в том числе 1 случай - с дупликацией
и 1 случай - с трипликацией 5’-конца гена MLL (2G1F и 3G1F, соответственно)
(№№ 6 и 7 в таблице 26).
Делеция 3’-конца гена MLL примерно с равной частотой выявлялась у
пациентов с ОЛЛ — 7,0% (4 случая из 57) и ОМЛ — 6,1% (2 случая из 33)
(p=0,639). Седьмой пациент с делецией 3’-конца гена MLL имел ОНдЛ.
Таблица 25 - Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических исследований пациентов, у которых
перестройки локуса 11q23 не были выявлены при стандартном цитогенетическом анализе
№ Пол
Возраст ИФТ/FAB
(мес.)
вариант
Кариотип клеток
лейкозного клона
Результат FISH
Химерный
ген
1
ж
11,6
BII-ОЛЛ 46,XX[20]
nuc ish 11q23(5’MLL×2,3’MLL×1)[45]/(MLL×2)[55] MLL-MLLT3
2
ж
11,9
ОМЛ М1 46,XY[11]
nuc ish 11q23 (5’MLL×3,3’MLL×1)[83]/ (MLL×2)[17] MLL-MLLT10
nuc ish 11q23 (5’MLL×2,3’MLL×2)
3
ж
2,4
B-I ОЛЛ 46,XX[11]
(5’MLLsep3’MLL×1) [90]/(MLL×2)[10]
ish ins(2;11)(?q11;q23q23)(5 MLL mv,3 MLL st)
м
10,1
BII-ОЛЛ
5
ж
10,9
Мх
6
м
2,2
М2
46,XX,t(9;?)(p21;?) [2]/
46,XX [12]
48,XY,+8,+8[20] /
50, XY,+Y,+8,+8,+9[2]
46,XY,del(1)(p13),add(4)
(p16),add(11)(q23)[7]
45,XY,-10,der(11)
7
м
8,0
М5а
t(10;11)(p?;q?11),der(16)
t(11;16) (q11;p13) [41]
nuc ish 11q23 (MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)[10]/
(MLL×2)[15]
nuc ish 11q23 (MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)[70]/
(MLL×2)[30]
CEP164-MLL
MLL-MLLT3
—
nuc ish 11q23 (5’MLL×2,3’MLL×2)
MLL-19p13.3
(5’MLLsep3’MLL×1)[72]/(MLL×2)[28]
MCL1-MLL
nuc ish 11q23 (5’MLL×4,3’MLL×2)(5’MLLcon
3’MLL×2) [80]/(MLL×2)[20]
MLL-MLLT10
161
4
MLL- AFF3
Таблица 26 - Данные цитогенетического и молекулярно-генетических исследований пациентов c сочетанием перестроек
11q23 и 3’ делеции гена MLL
№ Пол
Возраст
(мес.)
ИФТ /
FAB
вариант
Результат FISH
Кариотип клеток
Комбинация
лейкозного клона флуоресцентных
сигналов
Интерпретация
результата
Точка
Химерный разрыва разрыва
ген
nuc ish 11q23
1
м
3,5
B-II ОЛЛ
—
1G1F
(5’MLL×2,3’MLL×1)/
MLL-AF4
[99] (MLL×2)[1]
2
ж
9,8
B-I ОЛЛ
(q21;q23)
nuc ish 11q23
1G1F
[10]/46,XX[17]
(5’MLL×2,3’MLL×1)
[94]/ (MLL×2)[6]
nuc ish 11q23
31
ж
11,6
B-II ОЛЛ
46,XX[20]
1G1F
(5’MLL×2,3’MLL×1)
[45]/ (MLL×2)[55]
nuc ish 11q23
4
м
7,7
B-III ОЛЛ —
MLL-AF4
1G1F
(5’MLL×2,3’MLL×1)
[61]/ (MLL×2)[39]
MLL-
в гене
в гене-
MLL
партнере
Интрон Интрон
11
4
Экзон
Интрон
11
3
Интрон Интрон
MLLT3
11
5
MLL-
Экзон
Интрон
MLLT3
10
3
162
46,XX,t(4;11)
Точка
Продолжение таблицы 26
№ Пол
Возраст
(мес.)
ИФТ /
FAB
вариант
Результат FISH
Кариотип клеток
Комбинация
лейкозного клона флуоресцентных
сигналов
4
м
7,7
B-III
ОЛЛ
1G1F
ж
6,8
М4
q23) [5]. ish der(9)
(wcp11+, ABL+)
(5’MLL×2,3’MLL×1)[6
(5’MLL×2,3’MLL×1)[9
8]/ (MLL×2)[2]
nuc ish 11q23
61
м
11,9
М1
46,XY[11]
2G1F
(5’MLL×3,3’MLL×1)[8
3]/ (MLL×2)[17]
nuc ish 11q23
7
м
11,5
ОНдЛ
—
3G1F
в гене
в гене-
MLL
партнере
MLL-
Экзон
Интрон
MLLT3
10
3
результата
nuc ish 11q23
1G1F
ген
(5’MLL×4,3’MLL×1)
[13]/(MLL×2)[87]
Примечание: 1- также приведены в табл. 25 под №№ 1 и 2, соответственно
MLLMLLT3
MLLMLLT10
MLLMLLT10
Интрон Интрон
9
4
Интрон Интрон
8
14
Интрон Интрон
11
4
163
5
Интерпретация
1]/ (MLL×2)[39]
46,XX,t(9;11)(p21;
Точка
Химерный разрыва разрыва
nuc ish 11q23
—
Точка
164
На рисунке 20 приведены результаты цитогенетического анализа и данные
FISH в группах пациентов с различным распределением флуоресцентных
сигналов
Рисунок 20. Результаты исследования методом FISH пациентов с различными
вариантами распределения флуоресцентных сигналов.
165
Стандартное распределение флуоресцентных сигналов в интерфазных
ядрах, характерное для перестройки гена MLL (1R1G1F) представлено на рисунке
20а. Рисунок 20б отражает стандартное распределение флуоресцентных сигналов
(1R1G1F) в метафазной пластинке. Рисунок 20в является примером, на котором
показана 3’ делеция гена MLL (распределение флуоресцентных сигналов —
1G1F). На рисунке 20г представлена перестройка гена MLL c сочетанием делеции
3’-конца MLL и дупликации 5’-MLL в интерфазных ядрах (2G1F), а на рисунке
20д — перестройка гена MLL c сочетанием делеции 3’-конца гена MLL и
трипликации 5’-конца гена MLL в интерфазных ядрах (3G1F). Использование
цельнохромосомных зондов к 10-й (метка - FITC) и 11-й (метка-TexasRed)
хромосомам выявило криптическую транслокацию t(10;11)(p12;q23) у пациента с
делецией 3’-конца MLL и трипликацией 5’-конца MLL (Рисунок 20е).
Процентное содержание бластных клеток, несущих перестройки гена MLL
со стандартным распределением флуоресцентных сигналов достоверно не
отличалось от аналогичного значения у пациентов с делецией 3’-конца гена MLL.
Медиана в первой группе составила 97% (диапазон 22-100%), во второй — 83%
(диапазон 13-99%) (p=0,206).
У всех 7 пациентов с нестандартным распределением флуоресцентных
сигналов был определен тип химерного гена, а также локализация точки разрыва
в ДНК гена MLL. Было выявлено 3 случая MLL-MLLT3 и по 2 случая MLL-AF4 и
MLL-MLLT10. Нами не было найдено взаимосвязи между наличием 3’ делеций
MLL и локализацией точки разрыва в гене MLL (Таблица 27).
В
42,2%
случаев
у
пациентов
со
стандартным
распределением
флуоресцентных сигналов, и у 42,9% пациентов, у которых перестройки гена MLL
сочетались с делецией 3’ конца MLL, точка разрыва в ДНК гена MLL
локализовалась в 11 интроне. Относительно равномерно в обеих группах
выявлялись точки разрыва на протяжении от интрона 8 до экзона 10. Интересно
отметить, что ни у одного из 7 пациентов с делецией 3’ конца MLL не выявлена
точка разрыва в интроне 10, который находится на втором по частоте месте у
пациентов со стандартным распределением флуоресцентных сигналов 16 случаев
166
из 64. Ни в одном случае у пациентов с 3’ делецией MLL нам не удалось
обнаружить реципрокный ген методом ДИ-ПЦР, что подтвердило факт, что 3’
фрагмент MLL делетирован, а не интегрирован в геном, например, путем
криптической инсерции.
Таблица 27 - Локализация точек разрыва в ДНК гена MLL в зависимости от типа
распределения флуоресцентных сигналов
Локализация
Количество пациентов
точки разрыва
Стандартное распределение
3’ делеция
в гене MLL
флуоресцентных сигналов (n=64)
гена MLL (n=7)
Интрон 8
1
1
0,189
Интрон 9
12
1
1,000
Интрон 10
16
0
0,337
Экзон 10
1
1
0,189
Интрон 11
27
3
1,000
Экзон 11
3
1
0,346
Другие
4
0
1,000
p
Оценка кумулятивной частоты развития рецидивов 7 пациентов с наличием
3’ делеции по сравнению с 64 пациентами со стандартным распределением
флуоресцентных сигналов показала, что достоверных различий между группами
не найдено (0,48±0,05 и 0,57±0,01 соответственно, p=0,489). Медиана наблюдения
составила 20 мес. (диапазон 3-84).
Описание случаев сложных перестроек гена MLL, выявленных нами при
использовании метода FISH у детей первого года жизни с ОЛ, приведено на
рисунке 21.
167
Рисунок 21. Данные стандартного цитогенетического исследования и FISH трех
случаев со сложными цитогенетическими перестройками с вовлечением гена MLL
Объяснение в тексте.
168
Так, в частности, у пациентки c BI-ОЛЛ и нормальным кариотипом методом
FISH была выявлена инсерция 5'-конца гена MLL в 2q11, которая привела к
образованию химерного гена MLL-AFF3 (Рисунок 21а). На рисунке 21б показаны
две перестройки длинного плеча 4 хромосомы с участием 11 и 17 хромосом и
формированием химерного гена MLL-AF4 у пациента с BI-ОЛЛ. Кариотип в
данном случае — 46,XY, ins(11;4)(q23;q21q25),t(4;17)(q25;q11)[9]/46,XY[1]. Еще в
одном случае у пациента с ОМЛ М5а обнаружена сложная перестройка 11
хромосомы, которая привела к двум несбалансированным транслокациям с
образованием дериватной 11 хромосомы с дупликацией 5’-конца и делецией 3’конца MLL гена на измененной хромосоме и деривате 16 хромосомы со вставкой
гена MLL в измененную хромосому. Кариотип: 45,XY,-10,der(11)t(10;11)(p?;q?11),
der(16)t(11;16)(q11;p13)[41] (рисунок 21в).
Нами получены данные о различной частоте выявления транслокаций 11q23
при стандартном хромосомном анализе и перестроек гена MLL при использовании
метода FISH. Как уже было отмечено ранее, при цитогенетическом исследовании
транслокации с вовлечением хромосомного района 11q23 выявляются с частотой
от 43% до 66% при ОЛЛ у детей первого года жизни [81,90,117,231], в то время
как при использовании FISH частота выявления может достигать в 79% случаев в
данной группе пациентов [33].
Сходные данные о большей частоте выявления перестроек гена MLL при
применении молекулярно-генетических методов получены и при ОМЛ у детей
первого года жизни [31, 85].
Расхождения между данными цитогенетики и FISH зафиксированы нами у 7
пациентов, у которых генетические изменения удалось обнаружить с помощью
FISH, но они остались «незамеченными» при хромосомном анализе, в т.ч. по 2
случая MLL-MLLT3 и MLL-MLLT10. Нельзя исключить, что в этих случаях имели
место
инсерции
субмикроскопических
фрагментов из какой-либо одной
партнерской хромосомы в другую, как это уже было описано в литературе
[113,197,450]. Другие механизмы образования криптических транслокаций в
литературе не приводятся. Однако необходимо учитывать еще один важный
169
момент. Возможность выявления аномального клона клеток при стандартном
цитогенетическом анализе существенно повышается при увеличении количества
кариотипированных метафазных пластинок, а также при исследовании клеточных
популяций не на одном сроке культивирования, а на двух-трех. В отдельных
наших
наблюдениях,
где
хромосомный
анализ
оказался
«недостаточно
чувствительным», к сожалению, удалось исследовать не более чем 8-12 метафаз.
Нельзя исключить, что в этих случаях были не субмикроскопические
перестройки, а транслокации, которые можно было бы увидеть, если бы удалось
провести полноценный хромосомный анализ.
В
доступной
нам
литературе
не
встретилось
ни
одной
работы,
целенаправленно изучающей частоту встречаемости делеций 3’-конца гена MLL
при ОЛ у детей первого года жизни. Чаще всего приводятся данные из
смешанных групп, в которых объединяются результаты исследования детей
первого года жизни с детьми старше 1 года, и даже взрослыми [20,23,217,294].
Такой подход небезупречен, так как он не дает представления о частоте
встречаемости исследуемого феномена в группе детей первого года жизни. В
рамках данной работы показано, что частота выявления перестроек гена MLL с
делецией 3’-конца гена MLL составляет 7,6% от числа всех перестроек гена MLL,
выявляемых методом FISH. Более того, мы показали, что эта величина не зависит
от типа ОЛ, и приблизительно в равной пропорции встречается как при ОМЛ, так
и при ОЛЛ. Также нами был выявлен 1 пациент с ОНдЛ, опухолевые клетки
которого несли сочетание перестройки гена MLL и делецией 3’-конца данного
гена.
В литературе отсутствует единое мнение о распространенности делеций 3’конца гена MLL. Так, делеции 3’-конца гена MLL были найдены в 15-16% случаев
в тех работах, где частота встречаемости оценивалась в смешанных группах
пациентов с ОМЛ и ОЛЛ [352,376]. Однако в этих статьях не говорится о возрасте
обследованных пациентов. Более низкая частота 3’-делеций MLL приводится в
работе A. Pais et al., где у пациентов с ОМЛ и ОЛЛ в возрасте от 1 мес. до 23 лет,
она составила 9% [217]. В то же время при исследовании пациентов с наличием
170
транслокации t(4;11)(q21;q23) делеции 3’-конца гена MLL выявлены в 13%
случаев [23]. А в работах, выполненных в начале 1990-х годов, частота
встречаемости была значительно выше и достигала 28% [39,201]. Причиной столь
значительных расхождений, скорее всего, является различия в технологических
подходах к обнаружению делеций.
Также в литературе приводятся неоднозначные данные о сочетанном
выявлении делеций 3’-конца гена MLL при использовании метода FISH и
del(11)(q23) при цитогенетическом исследовании. Так K. Barber et al. выявили
такую комбинацию у 4 из 12 обследованных пациентов с наличием 3’ делеции
гена MLL, но только двое из них были младше 2 лет [294]. В исследовании A. Pais
et al. два пациента (возраст 7 и 21 лет) с делецией 3’-конца гена MLL имели и
del(11)(q23) [217]. В то же время ни в одном из 3 наших случаев с
информативным хромосомным анализом у пациентов с делецией 3’-конца гена
MLL del(11)(q23) не была обнаружена. Однако небольшое число наблюдений в
нашей работе не позволяет дать четкий ответ на вопрос о связи делеций 3’-конца
гена MLL, выявляемых методом FISH, и del(11)(q23).
Известно,
что
группа
делеций
района
11q23
является
довольно
гетерогенной. При этом разрывы 11 хромосомы могут происходить как внутри
гена MLL, так и за его пределами [43,197]. Участники Европейской рабочей
группы по изучению перестроек 11q23 собрали информацию о 27 пациентах с
ОЛЛ и 16 пациентах с ОМЛ, у которых были обнаружены делеции del(11)(q23).
Из этого числа молекулярно-генетические исследования (ОТ-ПЦР, FISH,
гибридизация по Саузерну) были проведены 14 пациентам, и только в 10 случаях
было подтверждено наличие перестроек гена MLL. Причем в 1 случае делеция
11q23
маскировала
скрытую
(криптическую)
транслокацию
t(4;11)
с
образованием химерного гена MLL-AF4 [197]. В то же время в работе S.
Raimondi et al при исследовании методом гибридизации по Саузерну 11
пациентов c ОЛЛ и del(11)(q23) не было выявлено ни одного случая с
перестройками гена MLL [43].
Нами не было обнаружено случаев изолированной делеции 3’-конца гена
171
MLL. В то время как К. Barber et al. описали 2 подобных случая, причем в
обоих отсутствие перестроек гена MLL подтверждалось данными гибридизации
по Саузерну [294]. У всех обследованных нами пациентов делеции 3’-конца
гена MLL сочетались с различными перестройками, которые вели к
образованию химерных генов с участием MLL.
Нами не было выявлено случаев одновременного присутствия 2 и более
опухолевых клонов, один из которых имел бы стандартное распределение
флуоресцентных сигналов (1R1G1F), а другой — делецию 3’-конца гена MLL.
Во всех 7 случаях клон бластных клеток с перестройкой MLL и делецией 3’конца гена MLL был единственным, встречавшимся в количестве от 13% до
99% среди всех клеток костного мозга, исследованных методом FISH. Кроме
этого, необходимо отметить, что, несмотря на относительно большое
количество
работ, посвященных
обнаружению
делеций
3’-конца
MLL,
количество пациентов в каждой из них редко превышало 40 человек, и, более
того, ни в одной из них не исследовалась группа детей первого года жизни с
ОЛ
Попытка провести кластеризацию точек разрыва в ДНК гена MLL в
зависимости от типа распределения флуоресцентных сигналов не позволила
выделить какой-то отдельный регион, равно как и связать нестандартное
распределение флуоресцентных сигналов с каким-то отдельным химерным
геном или группой генов. Более того, не было найдено какого-либо общего
механизма
образования
химерного
гена
в
группе
с
нестандартным
распределением флуоресцентных сигналов. Общим для всех случаев делеций
3’-конца MLL являлось отсутствие реципрокного гена.
Отсутствие связи между типом распределения флуоресцентных сигналов
и исходом заболевания в нашем исследовании связано, скорее всего, с тем, что
делеции 3’-конца гена MLL не являлись изолированным генетическим
событием, а происходили на фоне наличия перестроек гена MLL, которые сами
по себе являются прогностически неблагоприятным фактором.
172
3.9. Структура химерных генов с участием MLL и ее взаимосвязь с клиниколабораторными характеристиками острых лейкозов
В исследование было включено 72 пациента с ОЛ.
При ОЛЛ у детей первого года жизни наиболее часто точка разрыва в
ДНК гена MLL локализовалась в 11-м интроне — 25 из 52 случаев (48,1%). При
этом наибольшей вариабельностью обладал химерный ген MLL-AF4: только в
11 из 28 (39,3%) случаев место разрыва в ДНК гена MLL было расположено в
интроне 11, в 6 (21,4%) — в 9-м интроне, по 4 (14,3%) случая приходилось на
10-й интрон и 11-й экзон. Также в исследуемой группе пациентов были
выявлены такие относительно редкие локализации как 7-й и 12-й интроны.
Наиболее стабильно точки разрыва локализовались при образовании химерного
гена MLL-MLLT1: в 8 из 12 (66,7%) случаев местом слияния выступал 11-й
интрон гена MLL.
При ОМЛ у детей исследуемой группы самым частым местом, в котором
происходили разрывы в ДНК гена MLL, являлся 9-й интрон — 8 из 19 (42,1%)
случаев. При этом наиболее стабильную локализацию имели точки разрыва при
образовании химерного гена MLL-MLLT10: 4 случая из 5 (80,0%) — в 9-м
интроне, а наиболее гетерогенную — при наличии химерного гена MLL-MLLT3.
В последнем случае примерно равное количество приходилось на 9 и 11
интроны. Распределение точек разрыва в ДНК гена MLL в зависимости от типа
гена-партнера приведено в таблице 28.
Нами не было выявлено взаимосвязи между локализацией точки разрыва
в гене MLL и типом гена-партнера, а также полом пациентов и уровнем
инициального лейкоцитоза (p>0,05) В тоже время пациенты с ОЛЛ, у которых
точка разрыва располагалась в 11-м интроне гена MLL, были достоверно младше
по сравнению со всеми остальными (p=0,025), а также теми, у кого точка разрыва
находилось интроне 9 (p=0,017). Для ОМЛ подобной ассоциации возраста и
локализации точек разрыва не выявлено (Таблица 29).
Таблица 28 – Локализация точек разрыва в ДНК гена MLL
Ген-партнер
Ген MLL
Интрон 7 Интрон 8 Интрон 9 Экзон 10 Интрон 10 Экзон 11 Интрон 11 Экзон 12 Интрон 12
Острый лимфобластный лейкоз (n=52)
AF4 (n=28)
1
6
1
MLLT1 (n=12)
4
4
11
4
8
1
4
EPS15 (n=4)
2
2
AFF3 (n=1)
1
MLLT3 (n=7)
1
—
6
2
12
4
25
1
1
Острый миелоидный лейкоз (n=19)
AF4 (n=1)
1
MLLT3 (n=7)
MLLT10 (n=5)
2
1
MLLT11 (n=2)
1
4
2
MYO1F (n=2)
2
SEPT6 (n=1)
1
SEPT9 (n=1)
1
3
1
1
173
Всего ОЛЛ
1
1
Продолжение таблицы 28
Ген-партнер
Всего ОМЛ
Ген MLL
Интрон 7 Интрон 8 Интрон 9 Экзон 10 Интрон 10 Экзон 11 Интрон 11 Экзон 12 Интрон 12
—
2
8
—
4
—
4
1
—
Острый недифференцированный лейкоз (n=1)
MLLT10 (n=1)
1
Всего ОНдЛ
—
—
—
—
—
—
1
—
—
ИТОГО
1
2
14
2
16
4
30
2
1
174
175
Таблица 29 - Связь возраста с локализацией точек разрыва в ДНК гена MLL у
пациентов с ОЛЛ и ОМЛ
Локализация точек
разрыва
Острый лимфобластный
Острый миелоидный
лейкоз
лейкоз
в ДНК гена MLL
Медиана Диапазон
Все пациенты
3,6
0,03-11,9
3,0
0,03-11,6
5,6
Интрон 9
Интрон 10
Интрон 11
Все остальные кроме
интрона 11
Все остальные кроме
интрона 9
p1
Медиана Диапазон
p2
8,0
0,8-11,9
—
10,8
6,1-11,0
0,109
0,7-11,9
0,025
—
—
—
6,6
3,1-11,9
0,017
5,8
0,8-11,2
—
4,2
0,7-9,2
0,324
6,8
2,2-11,9
0,570
—
—
—
9,3
2,2-11,9
0,114
Примечания:
1 - p рассчитано по отношению к пациентам с ОЛЛ, у которых точка разрыва в
ДНК гена MLL располагалась в интроне 11;
2 - p рассчитано по отношению к пациентам с ОМЛ, у которых точка разрыва в
ДНК гена MLL располагалась в интроне 9.
Наиболее частым механизмом образования химерных генов являлась
реципрокная
транслокация,
при
которой
две
хромосомы
обмениваются
участками, что приводит к образованию прямого химерного гена и его
реципрокного варианта. Такой механизм был выявлен в 53 (73,6%) случаях. У 6
(11,1%) пациентов были найдены инсерции фрагмента хромосомного района
11q23 в другую хромосому или наоборот. Подобным образом происходило
образование химерных генов MLL-MLLT10, MLL-AFF3, MLL-SEPT6. Третий
механизм—образование химерного гена путем транс-сплайсинга—выявлен в
11(15,3%) случаях. Данный механизм был обнаружен в большинстве случаев (9 из
176
12) образования химерного гена MLL-MLLT1, а также у пациентов наличием MLLMYO1F и MLL-EPS15. (Таблица 30). При этом точки разрыва располагались на
расстоянии от 0,7 до 25,4 тысяч пар нуклеотидов от 1 экзона гена-партнера MLL
Таблица 30 - Механизмы образования химерных генов в исследованной группе
пациентов
Химерный ген (количество
Реципрокная
случаев)
транслокация
Инсерция
Транссплайсинг
MLL-AF4 (n=29)
29
—
—
MLLT1 (n=12)
3
—
9
MLLT3 (n=14)
14
—
—
MLLT10 (n=6)
—
5
—
EPS15 (n=4)
3
—
1
MLLT11 (n=2)
2
—
—
MYO1F (n=2)
1
—
1
AFF3 (n=1)
—
1
—
SEPT6 (n=1)
—
1
—
SEPT9 (n=1)
1
—
—
53
8
11
ИТОГО
Ниже приведено два примера образования химерного гена путем транссплайсинга. В первом случае, у пациента с наличием химерного транскрипта
MLL-EPS15 выявлено слияние 10-го интрона гена MLL с некодирующей ДНК в
хромосомном районе 1p32 на расстоянии 1676 пар нуклеотидов от 1 экзона гена
EPS15. В этом случае химерный транскрипт был образован при соединении 10-го
экзона гена MLL со 2-м экзоном гена EPS15 (Рисунок 22).
Во втором случае, при исследовании методом ДИ-ПЦР выявлено слияние
10-го интрона гена MLL с некодирующей ДНК в 19p13.3 на расстоянии 693 пары
нуклеотидов от 1-го экзона гена MYO1F. Однако в РНК это привело к
177
образованию полноценного химерного транскрипта MLL-MYO1F e9e2 (Рисунок
23).
Рисунок 22. (а) Нуклеотидная последовательность зоны слияния гена MLL
(выделен черным цветом) и хромосомного района 1p32 (выделен серым),
полученные при проведении ДИ-ПЦР. Подчеркиванием отмечен 10-й экзон гена
MLL. Двумя • выделена тринуклеотидная вставка. (б) Результат секвенирования
химерного транскрипта у этого же пациента выявил слияние экзона 10 гена MLL c
экзоном 2 гена EPS15.
С учетом механизмов образования как прямого, так и реципрокного генов,
178
мы выделили 5 случаев комплексных транслокаций с участием трех хромосом
(№№ 2-6 в таблице 31), и 1 случай сочетания инсерции c интерстициальной
делецией 11 хромосомы (№1 в таблице 31).
Как видно, в части случаев комплексный механизм с вовлечением трех
хромосом
можно
предполагать,
исходя
из
данных
стандартного
цитогенетического исследования (№№ 2,3,4,5 в таблице 31), но, в тоже время, в
ряде случаев (№№ 1,6 в таблице 31) перестройка 11q23 являлась криптической.
Рисунок 23. (а) Нуклеотидная последовательность зоны слияния гена MLL
(выделен черным цветом) и хромосомного района 19p13.3 (выделен серым),
полученные
при
проведении
ДИ-ПЦР.
Серым
курсивом
выделена
5’-
нетранслируемая область (5’-UTR) гена MYO1F, подчеркиванием отмечен 1-й
экзон гена MYO1F. Двумя • выделена тринуклеотидная вставка. (б) Структура
зоны слияния химерного транскрипта MLL-MYO1F
179
Таблица 31 - Сложные механизмы перестроек гена MLL по данным ДИ-ПЦР
№ Тип ОЛ
1
2
3
4
5
6
BIОЛЛ
BI-
Кариотип клеток лейкозного клона
46,XX[11]
47,XX,del(2)(q33),t(4;11)
ОЛЛ (q21;q23),+22[19]/46,XX [1]
BIОЛЛ
BI-
46,XX,t(2;19;11)(p11;p13.3;q23)
46,XX,der(1,3,11)t(3;4)(p21;p16)t(4;11)
ОЛЛ (q21;q23) [6]/ 46,XX[4]
ОМЛ
М2
ОМЛ
М4
46,XY,der(1)add(1)(p32),del(1)(q12),
add(4)(p16),der(11)add(11)(p13)add(11)
(q23)[12]/46,XY[7]
46,XY,t(2;11)(p21;q23)[20]
Примечание. РТ- реципрокная транслокация;
Химерный ген /
Механизм
Локализация
реципрокный ген
образования
гена-партнера
MLL интрон 10-AFF3 интрон 6
Инсерция
2q11.2-q12
CEP164 интрон 28-MLL интрон 10
Внутрихромосом
ная делеция
11q23.3
MLL интрон 11-AF4 интрон 3
РТ1
4q21
2q21.2-MLL интрон 10
РТ
—
MLL интрон 11-MLLT1 интрон 1
РТ
19p13.3
DNAH6 интрон 71 -MLL интрон 11
РТ
2p11.2
MLL интрон 9–AF4 интрон 4
РТ
4q21
DCPA1 интрон 6-MLL интрон 9
РТ
3p21.1
MLL интрон 10- 19p13.3
Транс-сплайсинг
—
3´-UTR MCL1-MLL интрон 10
РТ
1q21
MLL интрон 10 – SEPT6 интрон 2
Инсерция
Xq24
2p21 – MLL интрон 10
РТ
—
180
Реципрокные гены, которые участвовали в образовании комплексных
транслокаций:
DNAH6,
DCPA1,
MCL1,
а
также
некодирующие
последовательности ДНК, расположенные в хромосомных районах 2q21.2 и 2p21.
Мы также оценили расположение точек разрыва в генах-партнерах MLL. За
исключением описанных выше случаев транс-сплайсинга, выявлено по 3 случая
локализации точек разрыва в генах MLLT1 и EPS15 в пределах 1 интрона. У обоих
обследованных пациентов с наличием химерного гена MLL-MLLT1 в гене MLLT11
точка разрыва также располагалась в 1 интроне. В гене MLLT3 у 12 пациентов (по
6 ОЛЛ и ОМЛ) точки разрыва были расположены в 5 интроне и у двух (по 1 ОЛЛ
и ОМЛ) — в 4 интроне. В гене AF4 основная зона разрывов включала в себя
интроны 3 (19 случаев), 4 (6 случаев, включая 1 с ОМЛ), 5 (2 случая). Также нами
выявлено по 1 случаю локализации точки разрыва в интронах 6 и 10. В гене
MLLT10 нами было обнаружено три зоны разрывов: 3-й интрон (1 случай), 8-й
интрон (3 случая, включая 1 ОНдЛ) и 9-й интрон (1 случай).
Прогностическая оценка локализации точки разрыва в 11 интроне
проведена у 31 пациента с ОЛЛ, получавшего терапию по протоколу MLL-Baby.
Кумулятивная вероятность развития рецидива у пациентов с точкой разрыва в 11
интроне гена MLL (n=18)
оказалось выше (0,85±0,01), чем в тех случаях, в
которых точка разрыва лежала между 8 и 11 экзонами, включительно (n=13)
(0,57±0,02), однако различия не достигли статистической значимости (p=0,261).
Медиана наблюдения составила 30 мес. (диапазон 6-42 мес.).
Исследование
методом
ДИ-ПЦР
является
универсальным
методом,
позволяющим выявлять практически любую перестройку с участием гена MLL,
включая и реципрокные гены. Необходимо отметить, что такие редкие химерные
гены как MLL-AFF3, MLL-MYO1F, MLL-SEPT6, MLL-SEPT9 не были обнаружены
нами на этапе первичной диагностики с использованием цитогенетики, ОТ-ПЦР и
FISH, а впервые были выявлены только после проведения ДИ-ПЦР. Важно также
подчеркнуть, что ДИ-ПЦР помогла в двух случаях верифицировать наличие
редких вариантов химерного гена MLL-AF4. В первом случае у мальчика в
возрасте 2,5 мес. с диагнозом ОЛЛ при отсутствии метафаз методом FISH была
181
выявлена перестройка гена MLL, а проведенное исследование методом ОТ-ПЦР
не выявило ни одного химерного транскрипта. При выполнении ДИ-ПЦР было
показано, что в этом случае точка разрыва локализовалась в 7-м интроне гена
MLL, в то время как использовавшиеся праймеры для гена MLL в ОТ-ПЦР
комплементарны 8-му экзону. В рамках крупнейшего на сегодняшний день
исследования аналогичная локализация точки разрыва была описана только в 2 из
600 (0,3%) случаев [433]. Во втором случае у пациентки в возрасте 8,1 мес. с
диагнозом
ОЛЛ
и
кариотипом
лейкозного
клона
46,XX,t(4;11)(q21;q23),
der(7;10)?t(7;10)(q22;p15), было подозрение на то, что в образование химерного
гена вовлечен не только MLL и AF4, но и еще какой-то третий ген, так как при
ОТ-ПЦР химерный транскрипт MLL-AF4 не был выявлен. ДИ-ПЦР показала, что
механизм образования химерного гена в этом случае — это обычная реципрокная
транслокация, но точка разрыва в гене AF4 лежит в 10-м интроне за пределами
покрытия использовавшихся праймеров, которые комплементарны 8-му экзону.
Такая ситуация описана всего в 7 из 600 случаев (1,2%) с наличием MLL-AF4
[433].
У взрослых пациентов с ОЛЛ локализация точек разрыва в гене MLL при
формировании химерного гена MLL-AF4 отличалась от полученной нами. В 40%
случаев точка разрыва локализовалась в 9-м интроне MLL, в 34% — 10 интроне и
24% — в 11-м интроне [433], который по нашим данным был самым частым при
ОЛЛ у детей первого года жизни. Преобладание точек разрыва в 9-м интроне гена
MLL было выявлено и в других работах, исследовавших MLL-позитивный ОЛЛ у
взрослых [434]. В то же время распределение точек разрыва в гене AF4 не было
связано с возрастом, и было идентичным у детей первого года жизни, детей
старше 1 года и взрослых [64]. Для других генов-партнеров MLL подобных
исследований в доступной нам литературе не встретилось.
Выявленное нами бимодальное распределение точек разрыва в гене MLL
при ОМЛ у детей первого года жизни очень сходно с картиной, описанной у
взрослых пациентов с ОМЛ [320].
Ранее на основании данных ДИ-ПЦР были выделены несколько механизмов
182
образования химерных генов, наиболее частым из которых является реципрокная
транслокация [320]. Это становится возможным при наличии двух точек разрыва
в двухцепочечной ДНК. Делеции и инверсии также происходят при наличии двух
точек разрыва в ДНК. Комплексные транслокации с участием трех хромосом
возможны только при наличии трех точек разрыва в двухцепочечной ДНК. Также
описаны варианты, при которых комплексная транслокация сочетается с
делецией; для реализации этого механизма также необходимо наличие трех
разрывов в двухцепочечной ДНК. Выделяют инсерции 1 типа, при которой часть
11 хромосомы, включающая в себя ген MLL, встраивается в партнерскую, а также
инсерции 2 типа, характеризующаяся тем, что ген-партнер, вместе с хромосомой,
на которой он расположен, встраивается в ген MLL. Самым сложным механизмом
является комплексная транслокация с участием не менее чем четырех хромосом,
которая возможна только при наличии четырех и более (хромотрипсис) точек
разрыва в двухцепочечной ДНК [320].
Нами найден первый случай транс-сплайсинга у пациента с химерным
геном MLL-MYO1F. Также интересно отметить, что из 12 описанных нами
случаев MLL-MLLT1 подобный механизм выявлен в 9. Возможно, что его
реальная частота у детей первого года жизни с MLL-MLLT1-позитивным ОЛЛ
несколько выше, чем приводится в литературе [406].
В работе M. Emerenciano et al. был проведен анализ исходов терапии
пациентов с MLL-позитивными ОЛ в зависимости от локализации точки разрыва.
Авторам удалось показать негативное прогностическое значение локализации
точки разрыва в 11-м интроне гена MLL при ОЛ у детей возрасте младше 24 мес.
по сравнению с пациентами, у которых точка разрыва находилась в 8-м, 9-м, 10-м
интронах и 10-м экзоне [422]. Одно из возможных объяснений, которое приводят
авторы — различная структура PHD домена гена MLL, что в случае с
локализацией точки разрыва в 11-м интроне приводит к повышенной
стабильности химерного белка или потере его способности переключаться в
направлении репрессии транскрипции [422,433].
Мы не смогли подтвердить неблагоприятное прогностическое значение
183
точки разрыва в 11-м интроне гена MLL. Возможной причиной полученных
различий являются как разные терапевтические стратегии, так и отличающийся
поло-возрастной состав пациентов: 30 девочек и 14 мальчиков в возрасте младше
12 мес. в нашей работе; 10 девочек и 20 мальчиков возрасте до 24 мес. в работе M.
Emerenciano et al. [422]. Еще одним объяснением различий могут служить
различия в диагнозе: все пациенты, включенные в данную работу, имели ОЛЛ и
получали терапию по протоколу MLL-Baby, в то время как в работе M.
Emerenciano et al. это была смешанная группа из 20 пациентов с ОЛЛ и 10 с ОМЛ.
184
Глава 4. ДИАГНОСТИКА РЕДКИХ ПЕРЕСТРОЕК 11q23/MLL ПРИ ОСТРЫХ
ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
4.1. Транслокация t(11;19)(q23;p13) / MLL-MYO1F
Пациент 1. Мальчик 3,7 мес. с диагнозом острый миелобластный лейкоз с
признаками созревания (М2 морфологический вариант по FAB). При стандартном
цитогенетическом исследовании была выявлена транслокация t(11;19)(q23;p13).
Использование метода FISH подтвердило наличие перестройки гена MLL, однако
при проведении ОТ-ПЦР химерные транскрипты MLL-ELL и MLL-MLLT1 не были
обнаружены. При проведении ДИ-ПЦР был обнаружен химерный ген MLLMYO1F. При этом точка разрыва локализовалась в интроне 10 гена MLL и интроне
1 гена MYO1F (Рисунок 24). Пациент получает терапию по протоколу НИИ ДОГ2007, жив и находится в первой продолжающейся ремиссии с периодом
наблюдения 14,1 мес.
Пациент 2. Мальчик 2,2 мес. c М2 вариантом ОМЛ и комплексным
кариотипом
46,XY,der(1)add(1)(p32)del(1)(q12),add(4)(p16),der(11)add(11)(p13)
add(11)(q23), у которого методом FISH в интерфазных ядрах была выявлена
перестройка гена MLL. При этом наиболее распространенные химерные
транскрипты с участием MLL не были обнаружены при проведении гнездной ОТПЦР и мультиплексной ОТ-ПЦР. Получал терапию по протоколу НИИ ДОГ-2007.
Больной погиб через 1,8 мес. от начала лечения.
В ходе ДИ-ПЦР была выявлена комплексная транслокация с вовлечением
трех хромосом: 10-й интрон гена MLL соединился с участком хромосомного
района 19p13.3, находящимся на расстоянии 693 нуклеотидов от 1-го экзона гена
MYO1F (Рисунок 25а), а также с 3’-нетранслируемой последовательностью гена
MCL1 (Рисунок 25б). На основании локализации точек разрыва в геномной ДНК
были подобраны праймеры для проведения ОТ-ПЦР, которые схематически
представлены на рисунке 25в в виде черных прямоугольников.
185
Рисунок 24. Результаты стандартного цитогенетического исследования, FISH и ДИ-ПЦР у пациента 1 с наличием
химерного гена MLL-MYO1F. (а) — Транслокация t(11;19)(q23;p13), выявленная при цитогенетическом исследовании;
(б) — стандартное распределение сигналов в метафазной пластинке, характерное для перестройки гена MLL; (в) —
нуклеотидная последовательность зоны слияния генов MLL и MYO1F с образованием соответствующего химерного гена,
выявленная при проведении ДИ-ПЦР; Здесь и далее черным цветом выделены фрагменты гена MLL, красным цветом
— фрагменты генов-партнеров, в данном случае — часть интрона 1 гена MYO1F.
186
Рисунок 25. Результаты молекулярно-генетических исследований у пациента с
MLL-MYO1F.Объяснение в тексте
187
Цифры внутри черных прямоугольников соответствуют местам начала и конца
праймера по отношению к нормальной мРНК соответствующего транскрипта.
Цифры под схематическим изображением экзонов соответствуют началу экзона.
При проведении полугнездной ОТ-ПЦР (для ПЦР-1 и ПЦР-2 был использован
общий праймер, комплементарный участку 2-го экзона гена MYO1F) был выявлен
химерный
транскрипт
размером
422
пары
нуклеотидов
(Рисунок
25г).
Секвенирование химерного транскрипта показало, он образовался при слиянии
10-го экзона гена MLL со 2-м экзоном гена MYO1F (Рисунок 25д). В последующем
в ходе ПЦР-РВ было подтверждено наличие химерного транскрипта MLL-MYO1F
(Рисунок 25е). Данный механизм получил название транс-сплайсинга.
Схемы реципрокной и комплексной транслокаций представлены на рисунке
26.
Рисунок 26. Схемы реципрокной и комплексной транслокаций у пациентов с
наличием MLL-MYO1F.
(а) — схема образования химерного гена вследствие реципрокной транслокации у
пациента 1. (б) — комплексная транслокация с участием хромосом 1, 11 и 19 у
пациента 2. *Данный химерный ген не идентифицирован.
Следует отметить, что оба случая, в которых была выявлена транслокация
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MYOF1 относились к морфологическому варианту ОМЛ
188
М2, который редко сочетается с перестройками гена MLL. Ранее было показано,
что на долю ОМЛ М2 приходится 4-5% от числа всех 11q23/MLL-позитивных
случаев [121,358,425]. В двух из трех ранее опубликованных случаев с MLLMYO1F наблюдался М5а вариант ОМЛ [435,441].
4.2. Транслокации t(2;11)(p21;q23) и t(X;11)(q24;q23) / MLL-SEPT6
Мальчик 9,9 мес. с диагнозом острый миеломонобластный лейкоз (М4
морфологический
вариант
по
FAB
классификации).
При
стандартном
цитогенетическом исследовании во всех проанализированных клетках лейкозного
клона выявлена единственная цитогенетическая аномалия — транслокация
t(2;11)(p21;q23). Применение метода FISH показало наличие перестройки гена
MLL. При исследовании методом ДИ-ПЦР выявлено 2 химерных гена: прямой,
образованный при слиянии 10 интрона MLL со 2-м интроном SEPT6, и
реципрокный, вследствие слияния некодирующего участка хромосомного района
2p21 с 10-м интроном гена MLL (Рисунок 27). Пациент получал терапию по
протоколу ОМЛ ММ-2000 и погиб во время индукционной терапии через 1 мес.
после её начала.
Таким образом, исходя из совокупности данных, полученных в ходе
цитогенетического и молекулярно-генетических исследований, в данном случае
имеет место комплексная, частично криптическая транслокация с вовлечением
хромосомных районов 2p21, 11q23 и Xq24 и образованием в дополнение к
прямому химерному гену MLL-SEPT6 — реципрокного 2p21-MLL. При этом
химерный ген MLL-SEPT6 образовался вследствие инсерции. В силу отсутствия
доступного генетического материала нам не удалось провести исследование
структуры химерного транскрипта, а также мониторинг МОБ.
Согласно представленным в литературе данным, определение структуры
зоны слияния в ДНК химерного гена MLL-SEPT6 было ранее проведено 9
пациентам. При этом было показано, что чаще всего зоной разрыва в гене MLL
является интрон 11, в котором локализовались разрывы в 4-х из 9 описанных
189
ранее случаев. В 3-х случаях точка разрыва находилась в интроне 10, и в двух — в
интроне 9. А в гене SEPT6 единственной зоной разрыва являлся интрон 1 [305,
320]. В описываемом нами случае структура химерного гена была нетипична для
MLL-SEPT6, так как он образовался при слиянии 10-го интрона гена MLL со 2-м
интроном гена SEPT6.
Рисунок 27. (а) — Транслокация t(2;11)(p21;q23), выявленная при проведении
стандартного цитогенетического исследования; (б) — стандартное распределение
сигналов в интерфазном ядре, характерное для перестройки гена MLL; (в) —
нуклеотидная последовательность зоны слияния генов MLL и SEPT6, выявленная
при проведении ДИ—ПЦР; (г) — структура зоны слияния между хромосомным
районом 2p21 и интроном 10 гена MLL. Синим цветом и двумя • выделена
тетрануклеотидная вставка.
190
4.3. Транслокация t(11;17)(q23;q25) / MLL-SEPT9
Мальчик 7,2 мес. с диагнозом острый миеломонобластный лейкоз (М4 по
FAB классификации). При проведении стандартного цитогенетического анализа
была выявлена транслокация t(11;17)(q23;q25) (Рисунок 28а). В то же время
данные,
полученные
при
проведении
исследования
методом
FISH,
свидетельствуют о более сложном характере перестройки у данного пациента и
вовлечении в транслокацию длинного плеча 16 хромосомы. Использование
метода FISH с зондом для гена MLL показало стандартное распределение
сигналов, характерное для перестройки гена MLL. При дополнительном
использовании зондов для генов p53 (17p13.1) и CBFB (16q22) было выявлено
перемещение гена CBFB на длинное плечо 17 хромосомы с образованием der(17),
а 3’-MLL – на 16q22 с образованием der(16) (Рисунок 28б). Таким образом,
итоговый вариант кариотипа лейкозных клеток может быть представлен как
t(11;16;17)(q23;q22;q25). В ходе ДИ-ПЦР было показано, что химерный ген
образовался при слиянии интрона 8 гена MLL с интроном 1 гена SEPT9 (рис. 28в).
Пациент жив, получает терапию по протоколу НИИ ДОГ-2007 и находится
в первой полной продолжающейся ремиссии с периодом наблюдения 22,6 мес.
Механизмом образования химерного гена у данного пациента была реципрокная
транслокация.
Описанный нами пациент является вторым из представленных в литературе
случаев выявления данной транслокации в возрастной категории младше 1 года
[433]. Точки разрывов в ДНК генов MLL и SEPT9 — типичны для этого
химерного гена [320], также как и ассоциация с М4 морфологическим вариантом
ОМЛ.
4.4. Частичный тандемный повтор в гене MLL (MLL-PTD)
Девочка 0,7 мес. с диагнозом острый монобластный лейкоз (М5
морфологический вариант по FAB).
191
Рисунок 28. Результаты (а) цитогенетического исследования, (б) FISH и (в) ДИПЦР у пациента, у которого был обнаружен химерный ген MLL-SEPT9.
192
При
проведении
цитогенетического
исследования
костного
мозга
и
периферической крови количественных и структурных аномалий не выявлено. В
ходе ОТ-ПЦР с использованием набора «MLL-биочип» (Биочип-ИМБ, Москва)
был выявлен MLL-PTD.Наличие наиболее частых химерных генов, характерных
для острых лейкозов, таких как MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4,
MLL-MLLT10, BCR-ABL, ETV6-RUNX, TCF3-PBX1, RUNX-RUNXT1, CBFB-MYH11,
PML-RARa было исключено в ходе ОТ-ПЦР. Пациентка получала терапию по
протоколу ОМЛ-ММ 2000. Клинико-гематологическая ремиссия была не
достигнута. Смерть наступила вследствие прогрессии заболевания через 6,1 мес.
от начала терапии. В нашем случае MLL-PTD была выявлена при проведении ОТПЦР из кДНК, а отсутствие доступного материала не позволило провести
исследование геномной ДНК. Данный случай представляет интерес еще и по той
причине, что в доступной нам литературе не было описано ни одного случая
выявления MLL-PTD при ОМЛ у детей младше 1 года. У детей MLL-PTD чаще
ассоциированы с морфологически незрелыми формами ОМЛ (М0, М1) [79,274],
однако в нашем случае имел место М5 морфологический вариант ОМЛ. В то же
время необходимо отметить, что у взрослых пациентов с ОМЛ связи между
наличием MLL-PTD и FАB-вариантом не выявлено [432].
4.5. Транслокация t(2;11)(q12;q23) / MLL-AFF3
Девочка, 2,3 мес. с диагнозом BI-ОЛЛ и нормальным кариотипом
лейкозных клеток. В ходе ОТ-ПЦР химерные транскрипты с участием MLL не
были обнаружены. При проведении исследования методом FISH выявлена
инсерция 5'-конца гена MLL в 2q11. ДИ-ПЦР показала наличие 2-х химерных
генов с участием MLL: прямого MLL-AFF3 (интрон 10-интрон 6) и реципрокного
CEP164-MLL (интрон 28-интрон 10) (Рисунок 29). Пациент получает терапию по
протоколу MLL-Baby, жив и находится в первой продолжающейся ремиссии со
сроком наблюдения 23 мес. У описанного нами пациента механизм образования
химерного
гена
–
сочетание
субмикроскопической
инверсии
внутри
193
хромосомного района 11q23 со вставкой фрагмента 11q23 в 2q11q12 (Рисунок 30).
Рисунок 30. Механизм образования химерного гена у пациента с наличием MLLAFF3. Пунктиром выделен инвертированный участок 11 хромосомы
Структура
химерного
гена
MLL-AFF3
сходна
с
описанной
ранее
[170,252,329]. Реципрокный ген в данном случае образован при слиянии 28-го
интрона гена CEP164 c 10-м интроном MLL.
Известно, что ген CEP164 (11q23.3) отвечает за синтез центросомного белка
164 кДА. Описано 15 изоформ транскрипта дикого типа CEP164, но только 7 из
них кодируют белок [145]. Основной транскрипт кодирует белок с молекулярной
массой 164314 Да, состоящий из 1460 аминокислот. Кроме участия в образовании
веретена
деления
центросомный
белок
играет
определенную
роль
в
восстановлении клеток после повреждающего действия ультрафиолетового
облучения [177]. В зависимости от фазы клеточного цикла центросомный белок
может локализоваться как в ядре, так и в цитоплазме
(б) — нуклеотидная последовательность зоны слияния в генах MLL и AFF3, выявленная при помощи ДИ-ПЦР (в) —
Реципрокный ген, образовавшийся вследствие инверсии 11q23, при слиянии интрона 28 гена CEP164 интрона 10 гена
MLL; Синим цветом и двумя • обозначены одно- и тринуклеотидные вставки
194
Рисунок 29. (а) — у пациентки с нормальным кариотипом методом FISH выявлена инсерция 5'-конца гена MLL в 2q11.
195
4.6. Транслокация t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15
В исследование было включено 6 пациентов с наличием транслокации
t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15. Их инициальные характеристики представлены
в
таблице 32. Из этого числа исследование методом ОТ-ПЦР проведено 5 пациентам
(№№ 1, 3-6 в таблице 32). Пример выявления транслокации t(1;11)(p32;q23) и
соответствующего химерного транскрипта MLL-EPS15 приведен на рисунке 31.
Рисунок 31. Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических методов
исследования. (а) Частичная кариограмма пациента с наличием t(1;11)(p32;q23);
(б) Результаты скрининговой (слева) и подтверждающей (справа) ОТ-ПЦР с
использованием набора
HemaVision
у пациента с наличием химерного
транскрипта MLL-EPS15. K- — негативный контроль. Также на каждой
электрофореграмме присутствует ДНК-маркер размерности ПЦР-продуктов (М);
(в) Результат исследования методом FISH в интерфазных ядрах, характерный для
перестройки гена MLL; (г) Данные FISH c применением цельнохромосомных
зондов к 1 и 11 хромосомам, свидетельствующие о наличии транслокации t(1;11).
Таблица 32 - Клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОЛ и наличием t(1;11)(p32;q23) / MLL-EPS15
№ Пол Возраст
1
2
м
ж
5 мес.
7 мес.
9 мес.
(109/л)
430
НД
91
лейкозного клона
46,XX,t(1;11)
(p32;q23)[11]
47,XY,t(1;11)
(p32;q23),+8[11]
46,XX,t(1;11)
(p32;q23)[11]
Вид ОЛ
FISH
BI-ОЛЛ
—
м
1 день
212
(p32;q23)[13]/
НД
—
6
ж
ж
3 мес.
4 мес.
49
300
—
46,XX,t(1;11)
(p32;q23)[11]
транскрипт
—
—
терапии
Пациент жив в ремиссии;
срок наблюдения 39 мес.
—
—
терапию, смерть через 2
мес. от начала лечения
BI-ОЛЛ
MLLr
BI-ОЛЛ
MLLr
46,XY[1]
5
ген
Исход
Отсутствие ответа на
46,XY,t(1;11)
4
Химерный Химерный
BI-ОЛЛ
BI-ОЛЛ
MLLr
MLLr
интрон 10
экзон 10 –
Пациент жив в ремиссии;
–интрон 1
экзон 2
срок наблюдения 64 мес.
интрон 11
экзон 11 –
–интрон 1
экзон 2
интрон 11
экзон 11 –
–интрон 1
экзон 2
интрон 10
экзон 10 –
Пациент жив в ремиссии;
– 1p32
экзон 2
срок наблюдения 20 мес.
Рецидив в сроке 18 мес.,
смерть от рецидива через 28
мес. от начала терапии
Рецидив в сроке 7 мес.,
смерть от рецидива через 9
мес. от начала терапии
196
3
ж
Лейкоциты Кариотип клеток
197
Выявлено два типа химерных транскриптов (Рисунок 15). У пациентов №1 и №2 в
таблице 32 инициально было проведено только цитогенетическое исследование,
выявившее наличие транслокации t(1;11). У пациента №1 молекулярный
мониторинг был начат через 5,5 мес от начала терапии, и с этого времени,
пациент находился в молекулярной ремиссии: химерный транскрипт ни разу не
был обнаружен. Из-за отсутствия доступного материала у пациента №2 методом
исследование методом ОТ-ПЦР не проведено. Наиболее частым механизмом
образования химерного гена являлась реципрокная транслокация, в одном случае
(у пациента № 6) — транс-сплайсинг.
Ранее было показано, что транслокация t(1;11)(p32;q23) чаще выявляется у
лиц женского пола [212,420]. Также необходимо отметить, что для пациентов с
наличием t(1;11)(p32;q23) характерны общие черты всех MLL-позитивных ОЛ:
доминирование
CD10-негативного
иммунофенотипа,
частый
инициальный
гиперлейкоцитоз [69,344,378,472]. Целенаправленное исследование структуры
химерного гена MLL-EPS15 было выполнено лишь однажды: C. Meyer et al.
приводят собственные данные о 13 пациентах, включая 12 случаев ОЛ у детей
[320]. Точка разрыва в гене EPS15 у обследованных нами пациентов
локализовалась либо в интроне 1, на долю которого приходится около 30% всех
случаев формирования химерного гена MLL-EPS15, либо в некодирующей
последовательности ДНК в хромосомном районе 1p32 в непосредственной
близости от 5’-конца гена MLL [320]. В последнем случае механизмом
образования химерных генов являлся транс-сплайсинг [406]. В гене MLL точки
разрыва у обследованных нами пациентов располагаются в 10-м и 11-м интронах,
последний является наиболее частой локализацией при ОЛЛ у детей первого года
жизни [289, 433].
4.7. Транслокация t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10
Транслокация t(10;11)(p12;q23) и/или химерный ген MLL-MLLT10 были
выявлены у 18 пациентов, в том числе, в 5 случаях ОЛЛ, 12 случаях ОМЛ и 1
198
случае ОНдЛ. Их этого числа цитогенетическое исследование было проведено 11
пациентам (1 случай ОЛЛ и 10 случаев ОМЛ). При этом у трех пациентов (все
ОМЛ) были найдены только клетки с нормальным кариотипом. В то же время
исследование методом ОТ-ПЦР позволило выявить химерный транскрипт MLLMLLT10.
В силу высокой вариабельности точек зон слияния как в гене MLL, так и
MLLT10 всем пациентам на первом этапе проводился мультиплексный вариант
ОТ-ПЦР с использованием всех праймеров, указанных в таблице 9. При
получении позитивного результата на втором этапе ставилось 6 моноплексных
реакций. Данная стратегия позволила обнаружить химерный транскрипт MLLMLLT10 в 16 случаях. Методом секвенирования было выявлено 4 типа химерных
транскриптов (Рисунок 19). ДИ-ПЦР подтвердила, что механизмом образования
данного химерного гена во всех случаях являлась инсерция.
Несмотря на то, что транслокация t(10;11)(p12;q23) выявляется как при
ОЛЛ, так и при ОМЛ, зоны разрыва при различных типах ОЛ в ДНК отличаются:
при ОЛЛ преобладает 11-й интрон, в то время как для ОМЛ более характерна
локализация в 9-м интроне [433].
4.8. Транслокация t(1;11)(q21;q23) / MLL-MLLT11
Транслокация t(1;11)(q21;q23) с образованием химерного гена MLL-MLLT11
была выявлена нами у двух пациентов с диагнозом ОМЛ, данные о которых
приведены в таблице 33 Использование метода ОТ-ПЦР в обоих случаях
позволило выявить идентичный тип химерного транскрипта e9e2, что нашло свое
подтверждение и при проведении ДИ-ПЦР. Данный химерный ген образовался
вследствие реципрокной транслокации. Проведенный мониторинг МОБ показал,
что у обоих пациентов длительное время сохранялся химерный транскрипт MLLMLLT11,
а
молекулярная
ремиссия
достигнутая
пациентом
№2
была
кратковременной (< 5 мес.) (Рисунок 32), что в дальнейшем привело к развитию
гематологического рецидива.
199
Таблица 33 - Клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОМЛ и
наличием t(1;11)(q21;q23)/MLL-MLLT11
Показатель
Пол
Возраст, мес.
Тип ОЛ
FAB вариант
Пациент 1
Пациент 2
мужской
женский
0,8
4,7
ОМЛ
ОМЛ
М5
М2
Кариотип клеток
46,XY,der(11)t(1;11)(q21;q23),
лейкозного клона
t(11;16)(p15;p13.1)
46,XX,t(1;11)(q22;q23)
Результат FISH
MLLr
MLLr
Химерный ген
интрон 9 – интрон 1
интрон 9 – интрон 1
экзон 9 – экзон 2
экзон 9 – экзон 2
Химерный
транскрипт
Рецидив через 25 мес.
Исходы терапии
Отсутствие ответа на
от начала терапии (8
терапию. Смерть через 3,3
мес. после окончания
мес. от начала лечения
поддерживающей
терапии)
Примечание.
При указании структуры химерного гена и транскрипта первым указаны интроны и
экзоны гена MLL, затем — гена-партнера
Неблагоприятные исходы терапии у обоих наших пациентов противоречат
ранее полученным данным о том, что данная транслокация является абсолютно
благоприятным прогностическим фактором, при которой 5-летняя БСВ достигает
92% (2 неблагоприятных события в группе из 24 пациентов), а ОВ — 100% [325].
Однако, следует отметить, что вышеупомянутой работе дети с ОМЛ были
несколько старше – медиана возраста составила 1,3 года. Возможно именно этим
объясняется причина различий в исходах терапии.
200
Рисунок 32. Мониторинг МОБ у пациента №2 с наличием химерного транскрипта
MLL-MLLT11. Верхняя кривая - динамика МОБ, нижняя – чувствительность. В
тех точках, где кривые чувствительности и МОБ сходились, пациент становился
МОБ-негативным.
Таким образом, описанные в данной главе перестройки гена MLL
дополняют и расширяют информацию о клинико-лабораторых характеристиках
пациентов с редко встречающимися перестройками гена MLL. Также было
показано, что многие из них были выявлены только при проведении ДИ-ПЦР, что
свидетельствуют о необходимости использования всего арсенала методов для
верификации каждого конкретного случая перестройки 11q23/MLL.
201
Глава 5. ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТРЫХ
ЛЕЙКОЗОВ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ
5.1. Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза
У детей первого года жизни ОЛЛ был выявлен реже по сравнению с
пациентами старше 1 года (67,3% и 86,9% соответственно, р<0,001).
Распределение иммунологических вариантов ОЛЛ у пациентов первого года
жизни (n=169) и более старших детей (n=371) также было различно. В
исследуемой группе доминировал BI-ОЛЛ, который был выявлен чаще, чем у
пациентов старше 1 года (53,8% и 3,2% соответственно, р<0,001), в то время
как BII-ОЛЛ у детей первого года жизни встречался значительно реже (28,4% и
77,9%, соответственно, р<0,001). Иммунологический вариант BIII-ОЛЛ был
обнаружен у 14,2%, что было достоверно чаще, чем в возрастной категории
старше 1 года — 1,3% (р<0,001). Для Т-линейных ОЛЛ зафиксирована
противоположная картина: у детей первого года жизни они были найдены реже
(3,0% и 14,6%, соответственно, р<0,001). Для BIV-ОЛЛ значимых различий
обнаружено не было (р=0,156).
Детальные результаты иммунофенотипирования опухолевых клеток
пациентов с ОЛЛ первого года жизни представлены в таблице 34. У 57 из 66
пациентов (86,4%) с наличием транслокации t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 был
обнаружен иммунологический вариант BI-ОЛЛ. Значительно реже у пациентов
с данной хромосомной аберрацией выявлялись BII- и BIII-варианты (7,6% и
6,1%, соответственно).
Половина пациентов (11 человек) у которых выявлялась транслокация
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1 имела BI-ОЛЛ, 6 человек (27,3%) — BIII-ОЛЛ, а
четверо (18,2%) – BII-ОЛЛ. Схожая тенденция выявлена и для транслокации
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3: у 5 пациентов из 12 (41,7%) был диагностирован
BI-ОЛЛ, у 4 (33,3%) — BIII-ОЛЛ, у 3 (25%) — BII-ОЛЛ. Все пациенты с
наличием
транслокаций
t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15,
t(2;11)(q12;q23)/MLL-
202
AFF3, t(10;11)(p12;q23)/ MLL-MLLT10 имели BI-ОЛЛ или BIII-ОЛЛ. У
пациентов с отсутствием перестроек 11q23/MLL в большинстве случаев (60,1%)
зафиксирован BII-ОЛЛ.
Таблица 34 - Количество пациентов с различными иммунологическими
вариантами ОЛЛ и наличием перестроек 11q23/MLL
Иммунофенотип
Тип перестройки
11q23/MLL
(число пациентов)
t(4;11)(q21;q23)/
MLL-AF4 (n=66)
t(11;19)(q23;p13)/
MLL-MLLT1(n=22)
t(9;11)(p22;q23)/
MLL-MLLT3 (n=12)
t(10;11)(p12;q23)/
MLL-MLLT10 (n=5)
t(1;11)(p32;q23)/
MLL-EPS15 (n=6)
t(2;11)(q12;q23)/MLLAFF3 (n=1)
Неизвестный генпартнер MLL (n=1)
Всего 11q23/MLL (+)
(n=113)
Перестройки 11q23/
BI-ОЛЛ BII-ОЛЛ BIII-ОЛЛ
ОЛЛ
Т-ОЛЛ
Нет
данных
57
5
4
—
—
—
11
4
6
—
—
1
5
3
4
—
—
—
2
—
3
—
—
—
6
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
1
—
—
—
—
—
83
12
17
(91,2)
(24,5)
(70,8)
—
—
8
35
7
2
5
MLL не выявлены(n=59) (8,8%)
Итого
BIV-
(74,5%) (29,2%) (100%)
1
(33,3)
2
(28,0%) (66,7%)
91
48
24
2
5
3
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
(100%)
203
Иммунофенотипы ОЛЛ из В-линейных предшественников существенно
отличались внутри исследуемой группы в зависимости от наличия перестроек
11q23/MLL. У пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL BI-ОЛЛ и BIII-ОЛЛ
встречались достоверно чаще по сравнению с BII-ОЛЛ (p<0,001 в обоих случаях).
У пациентов с Т-линейным ОЛЛ, а также BIV-ОЛЛ перестройки 11q23/MLL не
выявлены.
Кроме того, при BII-ОЛЛ у пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL
опухолевая популяция чаще всего была гетерогенна по экспрессии CD10, в то
время как у MLL-негативных пациентов данный антиген экспрессировался
преимущественно гомогенно (медиана доли позитивных клеток 49,4%, диапазон
20,4-99,9%; и медиана 96,7%, диапазон 54,2-99,9% соответственно, p<0,001).
Были выявлены также различия в количестве MLL-позитивных и MLL-негативных
пациентов, опухолевые клетки которых экспрессировали CD10, CD20, CD45,
CD133, CD15, CD65, NG2. Кроме того, доля CD22-позитивных клеток была ниже
у детей с перестройками 11q23/MLL (медиана 86,1%, диапазон 20,2-99,9% и
медиана 99,9%, диапазон 63,4-99,9% соответственно, р=0,004).
Отсутствие экспрессии CD10 и CD20, а также высокая экспрессия CD45,
CD15, CD65, CD133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток
при наличии перестроек 11q23/MLL.
Диагностическая
эффективность
выявления
экспрессии
NG2
для
прогнозирования наличия перестроек 11q23/MLL оказалась наиболее высокой
(90,6%), в то время как для остальных маркеров она была значительно ниже.
CD10, предлагаемый некоторыми авторами для разграничения пациентов с
наличием и отсутствием перестроек 11q23/MLL, показал диагностическую
эффективность ниже (76,4%), чем у NG2, CD45 (81,9%) и CD20 (81,2%). Еще
ниже диагностическая эффективность была у экспрессии CD133 (76,5%), CD15
(67,7%), CD65 (53,7%).
В работах различных исследовательских групп было показано, что при ОЛЛ
существуют иммунофенотипические различия и внутри группы с наличием
перестроек 11q23/MLL, в зависимости от типа химерного гена. В нашем
204
исследовании экспрессия CD34, CD15 и CD65, а также отсутствие экспрессии
CD10, были более характерны для пациентов с наличием MLL-AF4. В то же
время, различия в количественной экспрессии NG2, выраженной в единицах
MESF, не достигли статистической достоверности.
5.2. Иммунофенотипическая характеристика острого миелоидного лейкоза
У детей первого года жизни ОМЛ был выявлен чаще (29,9% и 11,5%
соответственно, р<0,001) по сравнению с пациентами старше 1 года (n=75 и 49,
соотвественно). Для ОБфЛ, ОБлЛ и ОНдЛ значимых различий обнаружено не
было (р=0,744, р=0,644, р=0,277, соответственно).
Иммунофенотипы ОМЛ существенно различались в зависимости от
наличия/отсутствия перестроек гена MLL. Отсутствие экспрессии CD61, а также
высокая экспрессия CD11b, CD99, CD15, CD65, CD4, CD133 и NG2
характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек
гена MLL.
Диагностическая
эффективность
выявления
экспрессии
CD11b
для
прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой
(95,0%), в то время как диагностическая эффективность остальных маркеров была
ниже, включая NG2 (89,7%), CD65 (83,3%), CD15 (80,6%), CD99 (78,3%), CD133 и
CD4 (по 75,0%), отсутствие экспрессии CD61 (71,9%). Так как экспрессия CD15,
CD65, CD133 и NG2 характерна для наличия перестроек 11q23/MLL и при ОЛЛ,
можно говорить о том, что ОЛЛ и ОМЛ у детей первого года жизни с наличием
перестроек гена MLL имеют ряд общих особенностей иммунофенотипа.
Среди пациентов с ОМЛ без перестроек гена MLL наиболее часто
встречался острый мегакариобластный лейкоз с характерной экспрессией CD61.
Интересно отметить, что среди пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL
группы был выявлен один случай ОМЛ М7. Этот случай является нетипичным,
поскольку при данном варианте ОМЛ перестройки гена MLL обнаруживаются
относительно редко. Однако и при ОМЛ М7 эффективность CD11b и NG2 для
205
прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась очень высока.
Высокая эффективность прогнозирования наличия любых перестроек гена
MLL с помощью определения экспрессии NG2 (при ОЛЛ) и NG2 и/или CD11b
(при ОМЛ) обусловливает необходимость применения данных антигенов при
первичном иммунофенотипировании ОЛЛ у детей первого года жизни. При
обнаружении
экспрессии опухолевыми
клетками
этих
маркеров следует
проводить более углубленный поиск перестроек 11q23/MLL при помощи
мультиплексной ОТ-ПЦР, ДИ-ПЦР и FISH, а не ограничиваться стандартным
определением нескольких наиболее частыx химерных генов.
5.3. Возможность использования экспрессии NG2 в качестве маркера для
мониторинга минимальной остаточной болезни
Известно, что NG2 является специфическим маркером, ассоциированным с
перестройками гена MLL [105,126,159,207,211,231,365,465]. Однако, несмотря на
этот факт, в большинстве исследованных нами случаев отмечалась гетерогенная
экспрессия данного антигена с наличием значительной популяции NG2негативных клеток. Кроме того, как экспрессия NG2, так и доля NG2положительных клеток существенно снижались во время лечения, а при рецидиве
у части пациентов все опухолевые клетки были NG2-негативны (Рисунок 33).
Определенное на разных этапах терапии количество CD19(+)NG2(+)клеток, оказалось достоверно ниже (р<0,001) величин МОБ, выявленных в тех же
образцах при помощи 6-8-цветной проточной цитометрии. Несмотря на то, что во
время индукционной терапии экспрессия NG2 не отличалась от инициальной,
даже на 15-й и 36-й дни терапии количество остаточных бластов, определенное
только при помощи NG2 оказалось также достоверно ниже (р=0,001).
Таким образом, NG2 нельзя использовать как единственный маркер для
выделения опухолевых клеток при мониторинге МОБ методом проточной
цитометрии. Тем не менее, в комбинации с другими антигенами NG2 может
использоваться для определения МОБ, но не для выделения популяции
206
опухолевых
клеток,
а
для
дополнительной
характеристики
популяций,
выделенных по другим маркерам.
p = 0,002
p = 0,009
Рисунок 33. Экспрессия NG2 (a) и доля NG2-позитивных клеток (б) в образцах
костного мозга у пациентов исследуемой группы (n=15), взятых на момент
диагностики (Д) (n=12), во время индукционной терапии (ИТ) (n=15), во время
консолидации/интенсификации (К/И) (n=18), при рецидиве (Р) (n=6) и во время
терапии рецидива (ТР) (n=14). На графиках для каждого этапа терапии показаны
медиана (■), межквартильный интервал (▓), а также 1-й (┴) и 99-й (┬) процентили.
207
Глава 6. ДИАГНОСТИКА МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ
6.1. Определение минимальной остаточной болезни методом ПЦР в режиме
реального времени у пациентов с наличием химерных гена и транскрипта MLLEPS15
Для проведения количественного мониторинга МОБ нами была создана
комбинация флуоресцентных зондов, праймеров и плазмиды, несущей фрагмент
химерного транскрипта MLL-EPS15.
На основании 10-кратных разведений плазмиды (Рисунок 34а) была
получена калибровочная кривая (Рисунок 34б), использовавшаяся для расчетов
количества химерного транскрипта MLL-EPS15 у всех пациентов, у которых
имелся доступный для исследования материал (№№ 1, 3-6 в таблице 32).
Аналитические характеристики калибровочной кривой приведены в таблице 35.
Таблица 35 - Аналитические характеристики полученных калибровочных кривых
Пациенты
Коэффициент
Угол наклона
корреляции (R2)
кривой (Slope)
Точка пересечения
с осью ординат (Yintercept)
ПЦР-РВ химерного транскрипта
№№1, 3-6
0,999
-3,356
38,790
ПЦР-РВ химерного гена в ДНК
Пациент № 3
0,990
-3,323
25,602
Пациент № 4
0,992
-2,987
21,987
Пациент № 5
0,996
-3,244
21,491
Примечание. Нумерация пациентов дана в соответствии с их порядковыми
номерами в таблице. 32
химерного транскрипта MLL-EPS15 в кДНК пациентов. (а) 10-кратные разведения плазмиды, несущей фрагмент
транскрипта MLL-EPS15. (б) Калибровочная кривая, полученная на основании 10-кратных разведений плазмиды с
аналитическими характеристиками. (в) Чувствительность созданной комбинации праймеров и зонда методом 10кратных лимитирующих разведений составила 110-5. Одно из разведений 10-6 лежит за пределом линейности, во втором
— амплификация отсутствует.
208
Рисунок 34. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего проведения количественного анализа
209
Специфичность
комбинации
зондов
и
праймеров
была
проверена
исследованием 15 пациентов с ОЛ и нормальным кариотипом и 15 пациентов с
ОЛ и другими химерными транскриптами с участием MLL, в том числе 6 — с
MLL-AF4, 5 — с MLL-MLLT1, 2 — с MLL-MLLT4, 1 — с MLL-MLLT3, 1 — с MLLMLLT10. Ни в одном случае неспецифических реакций не выявлено. При
разведении РНК, выделенной из исходного образца костного мозга пациента № 3
из табл. 32, смесью РНК 10 пациентов без онкогематологических заболеваний
была определена чувствительность системы, созданной для выявления MLLEPS15 методом ПЦР-РВ. Она составила 110-5. (Рисунок 34в.).
Мониторинг МОБ путем качественного и количественного определения
химерного транскрипта MLL-EPS15 проведен 5 пациентам (№№ 1, 3-6 в таблице
35).
Во время проведения первого курса консолидации ремиссии (ТН4 в
протоколе
MLL-Baby)
пациенты
№3-5
(Рисунок
35а)
достигли
МОБ-
негативности, однако двое из них позднее рецидивировали (№№ 4,5) (Рисунок
35б). Пациент №6 достиг МОБ-негативности во время проведения третьего курса
консолидации ремиссии, и находится в полной продолжающейся ремиссии (ППР)
со сроком наблюдения 20 мес. (Рисунок 35в). У пациента №1 мониторинг МОБ
начал проводиться через 5,5 мес. от начала терапии.
Для исключения случайных ошибок, одновременно с ПЦР в этом случае
проводилось исследование методом FISH. Химерный транскрипт MLL-EPS15
методом ПЦР и перестройки гена MLL методом FISH ни разу не определялись.
Для пациентов №№ 3,4 и 5 проведено также определение МОБ методом
ПЦР-РВ с количественной оценкой химерного гена в геномной ДНК. Параметры
калибровочных
кривых,
полученные
при
использовании
индивидуально
подобранных комбинаций флуоресцетных зондов и праймеров, приведены в
таблице 35. Все значения укладываются в диапазоны, рекомендованные рабочей
группой ESG-MRD-ALL [56] с дополнениями T. Burmeister et al. [312] (Рисунок
36).
210
Рисунок 35. Результаты мониторинга МОБ в кДНК пациентов №3 (а), №5 (б), №6
(в). Нумерация дана в соответствии с номерами в таблице 32. На всех графиках
верхняя кривая - величина МОБ, нижняя — чувствительность, рассчитанные
согласно рекомендациям консорциума «Европа против рака» [152]. В тех точках,
где кривые чувствительности и МОБ сходились, пациент становился МОБнегативным.
211
Рисунок 36. Получение и оценка калибровочной кривой для последующего
проведения количественного анализа химерного гена MLL-EPS15 в геномной
ДНК пациента №4. (а) 10-кратные разведения ДНК пациента, взятой до лечения в
смеси ДНК от 10 пациентов без онкогематологических заболеваний. (б)
Калибровочная кривая, полученная на основании 10-кртаных разведений с
аналитическими характеристиками. (в) Амплификация контрольного гена NAGK
во всех образцах, использовавшихся для получения калибровочной кривой.
212
Пример определения абсолютного количества MLL-EPS15 в геномной ДНК у
пациента № 4 приведен на рисунке 37.
Рисунок 37. Динамика количества химерного гена MLL-EPS15 в геномной ДНК у
пациента №4. Два значения, лежащие ниже предела чувствительности, являются
негативными.
Сравнение результатов качественного определения МОБ в кДНК и геномной
ДНК у пациентов с наличием MLL-EPS15 проведено в 23 образцах, полученных от
пациентов №№ 3-5. В 21 из них (91,3%) были получены идентичные результаты
(Рисунок 38).
Рисунок 38. Сравнение результатов определения МОБ в кДНК и геномной ДНК.
В двух случаях МОБ была выявлена только в кДНК, но не геномной ДНК,
213
что, скорее всего, связано с более высокой чувствительностью методики по
определению химерного транскрипта. Несмотря на различные величины МОБ,
получаемые при использовании различных подходов для мониторирования MLLEPS15, нами была выявлена сходная кинетика МОБ при исследовании геномной
ДНК и кДНК (Рисунок 39).
Рисунок 39. Кинетика МОБ, определенной в кДНК и ДНК у пациента №5.
Жирными горизонтальными линиями указаны пределы чувствительности в ДНК и
кДНК, соответственно.
Кроме этого, используя вышеописанный подход для создания и отработки
условий проведения ПЦР-РВ для определения химерных транскриптов с
вовлечением гена MLL, нами были подобраны условия для проведения ПЦР-РВ у
пациентов с наличием химерных транскриптов MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLLMYO1F. Алгоритм мониторинга МОБ у пациентов с редкими
типами
транскриптов приведен на рисунке 40. Единственное отличие состояло в том, что
из-за потенциальных различий в структуре химерного транскрипта MLL-MLLT10
мы использовали мультиплексный вариант ПЦР-РВ, при котором использовалось
два праймера и два зонда, комлементарные 8 и 10 экзонам гена MLL, вместе с
214
тремя праймерами, комплементарными 7, 10 и 18 экзонам гена MLLT10. В гене
MLLT11 последовательность праймеров была локализована в начале 2 экзона.
Таким образом, мы смогли провести мониторинг МОБ у 8 пациентов с наличием
химерного транскрипта MLL-MLLT10, 3 — с MLL-MLLT11 и 1 – с MLL-MYO1F.
Рисунок 40. Алгоритм мониторинга МОБ у пациентов с редкими типами
транскриптов. *ОТ-ПЦР — ОТ-ПЦР с выявлением максимально возможного
спектра перестроек гена MLL. Критерии «Европа против рака» оценивающие
качество калибровочной кривой [409], приведены в главе «Материалы и методы»
Технически определение МОБ может быть проведено различными
методами. Довольно часто для оценки
МОБ используется количественное
определение индивидуальных клональных перестроек генов TCR и Ig методом
количественной ПЦР-РВ со строго специфичными для каждого пациента
праймерами и зондом. Однако ранее было показано, что, по сравнению со
старшими детьми, у детей первого года этот метод имеет ограниченное
215
применение вследствие того, что в данной группе пациентов перестройки Ig/TCR
встречаются реже и часто являются олигоклональными [219,273]. Альтернативой
может служить мониторинг МОБ путем определения химерного гена в геномной
ДНК методом ПЦР-РВ. Для этого необходимо предварительно определить
индивидуальную для каждого пациента точку слияния гена MLL и гена-партнера
и, исходя из сиквенса зоны слияния двух генов, подобрать комбинацию
праймеров и зонда [56,312]. Проведенное ранее сопоставление показало хорошее
совпадение результатов с данными МОБ, получаемыми при использовании
Ig/TCR [364]. Наконец, в качестве мишени для оценки МОБ можно использовать
химерный транскрипт в мРНК (кДНК), детектируемый методом ПЦР-РВ
[246,409]. Нами в качестве основного метода для мониторирования МОБ у
пациентов с наличием MLL-EPS15 были выбраны ПЦР с определением
соответствующего химерного гена в геномной ДНК и химерного транскрипта в
мРНК/кДНК. Наш выбор связан с тем, что и химерные гены, и химерные
транскрипты представляют собой стабильные мишени для определения МОБ
[409,411,416], патогенетически связанные с развитием ОЛ, так как они
выявляются исключительно в опухолевых клетках. Полученные нами результаты
свидетельствуют о хорошей сопоставимости методов.
6.2. Сравнительный анализ результатов диагностики минимальной остаточной
болезни методами проточной цитометрии и обратно-транскриптазной ПЦР у
детей первого года жизни c острым лимфобластным лейкозом и перестройками
11q23/MLL
Качественная сопоставимость результатов проточной цитометрии и ОТПЦР в 401 образце КМ составила 87,0%. При этом в 50 образцах МОБ была
обнаружена только в ходе ПЦР, и лишь в 2 – только проточной цитометрией.
Сопоставимость результатов была достоверно ниже в образцах, взятых на этапе
индукционной терапии (78,6%; n=131) по сравнению с образцами этапов
консолидации/интенсификации (n=209; 90,4%) и терапии рецидива (n=61; 93,4%)
216
(p=0,002). В то же время не выявлено значимых различий между тремя ТН во
время индукционной терапии (p=0,098) (Рисунок 41).
Рисунок 41. Сопоставимость выявления МОБ на разных этапах терапии.
Образцы пациентов с наличием химерного транскрипта MLL-MLLT3 имели
наименьшие показатели сопоставимости данных проточной цитометрии и ОТПЦР по сравнению с теми, у которых выявлялись MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLLEPS15 (p<0,001) (Рисунок 42). Наличие в образце нормальных B-линейных
предшественников (ВП) не влияло на сопоставимость результатов (p=0,838).
Несмотря на то, что прямое количественное сопоставление результатов
определения МОБ двумя данными методами невозможно, кинетика величины
МОБ во время терапии сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие
этого, у пациентов, у которых определяется химерный транскрипт с вовлечением
MLL, возможно одновременное применение данных методов. Во время
индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда
217
необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать
данные проточной цитометрии. В то же время, в последующих ТН достаточно
только качественного определения МОБ, поэтому целесообразнее использовать
результаты определения химерных транскриптов методом ОТ-ПЦР вследствие
более высокой чувствительности метода.
Рисунок 42. Сопоставимость выявления МОБ у пациентов с различными типами
химерных транскриптов, а также в зависимости от наличия нормальных Влинейных предшественников (ВП*).
6.3. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в костном
мозге, выявленной методами обратно-транскриптазной ПЦР и ПЦР в режиме
реального времени, при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года
жизни, получающих лечение по протоколу MLL-Baby
Диагностика МОБ выполнялась методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ. МОБ была
обнаружена обоими методами в 120 из 182 обследованных образцов, в то время
218
как негативный результат при использовании как ОТ-ПЦР, так и ПЦР-РВ был
зафиксирован в 57 случаях. В 4 образцах МОБ была выявлена только методом
ОТ-ПЦР, в 1 – только ПЦР-РВ. Общая сходимость двух методов составила 97,3%.
Во всех 5 дискордантных образцах уровень экспрессии гена ABL, используемого
для нормализации, был выше порогового значения 1,00×104 копий;
медиана
составила 7,38×104 копий (диапазон 3,12×104 – 1,18×105), что исключает низкое
качество исходного материала как причину расхождений. Тем не менее, образцы с
дискордантными результатами не были взяты в дальнейший анализ.
Мы оценили количество МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов в
различных ТН. Все пациенты были МОБ-позитивны в ТН1. Затем происходило
постепенно нарастание доли МОБ-негативных пациентов: с 8% в ТН2 до 67% в
ТН5 (Рисунок 43а). При разделении пациентов на группы высокого (Рисунок 43б)
и промежуточного риска (Рисунок 43в) согласно критериям протокола MLL-Baby,
выявленная тенденция сохранялась, за исключением того, что в ТН5 ни у одного
из пациентов группы промежуточного риска МОБ не была выявлена.
Результаты сравнения величин БСВ и кумулятивной вероятности развития
рецидива, полученные при разделении пациентов на группы в зависимости от
выявления МОБ в ТН2, ТН3, ТН4, ТН5 приведены на рисунке 44. Наиболее
ранней ТН, для которой были получены достоверные различия в исходах терапии
между группами МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов, являлась ТН4.
В этой точке наблюдения БСВ в группе МОБ-негативных пациентов была
достоверно выше, а кумулятивная вероятность развития рецидива достоверно
ниже, чем у пациентов, у которых зафиксировано наличие МОБ. БСВ составила
0,79±0,09 и 0,13±0,11, а кумулятивная вероятность развития рецидива – 0,20±0,01
и 0,85±0,03 соответственно (p=0,001 в обоих случаях) (Рисунок 44в). Выявление
МОБ в следующей ТН – ТН5 также было связано с неблагоприятным прогнозом:
БСВ для группы МОБ-негативных пациентов была достоверно выше, чем для
МОБ-позитивных
(0,80±0,08
и
0,14±0,12,
соответственно,
p=0,006);
а
кумулятивная вероятность рецидива у МОБ-негативных пациентов была
существенно ниже, по сравнению с МОБ-позитивными (0,19±0,01 и 0,86±0,02,
219
соответственно, p=0,005) (Рисунок 44г).
Рисунок 43. Количество образцов, в которых была выявлена МОБ (показаны
черным цветом) и в которых МОБ не была обнаружена (показаны белым цветом)
в ТН1-ТН5 с указанием количества пациентов. (а) – все пациенты; (б) – пациенты
группы высокого риска согласно критериям протокола MLL-Baby; (в) – пациенты
группы промежуточного риска.
220
Рисунок 44. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива пациентов в
зависимости от выявления МОБ в четырех последовательных точках наблюдения.
(а)–ТН2; (б)–ТН3; (в)–ТН4; (г) – ТН5
221
Далее
мы
оценили
прогностическое
значение
последовательного
качественного выявления МОБ в ТН4 и ТН5 (Рисунок 45).
Рисунок 45. Оценка прогностического значения последовательного качественного
выявления МОБ в ТН3, ТН4 и ТН5. Объяснения в тексте. КВР — кумулятивная
вероятность развития рецидива
Из 22 МОБ-позитивных в ТН3 пациентов, которым также проводилось
определение наличия МОБ в ТН4 и ТН5, кумулятивная вероятность развития
рецидива в группе пациентов, сохранявших МОБ-позитивность в ТН4, составила
0,86±0,02, что было статистически значимо выше, по сравнению с группой, у
которой ТН4 МОБ не была выявлена (0,33±0,03) (p=0,009). Из 11 пациентов,
МОБ-позитивных в ТН4, 8 сохраняли МОБ-позитивный статус и в ТН5, в то
время как, только у 3 из них в данной ТН МОБ перестала обнаруживаться.
Кумулятивная вероятность развития рецидива в первой и второй группах
статистически значимо не различалась (0,85±0,03 и 0,67±0,27 соответственно,
p=0,570). Таким образом, выявление МОБ в ТН5 не имеет преимуществ и не дает
дополнительных данных по сравнению с ТН4, поэтому ТН4 была выбрана нами в
качестве основной
ТН
для
качественного
определения
МОБ
с
целью
прогнозирования исходов терапии при лечении по протоколу MLL-Baby.
Характеристика пациентов, МОБ-позитивных и МОБ-негативных в ТН4,
представлена в таблице 36. Группы пациентов статистически значимо не
222
отличались между собой по возрасту, полу, инициальным характеристикам ОЛЛ,
а также показателям ответа на терапию
Таблица 36 - Характеристика пациентов в зависимости от выявления МОБ в ТН4
МОБ-негативные
МОБ-позитивные
пациенты
пациенты
21
12
Мужской
8
4
Женский
13
8
Младше 6 мес.
10
9
Старше 6 мес.
11
3
100
14
6
≥100
7
6
Есть
6
1
Нет
15
9
CD10(-)cytμ(-)
14
7
CD10(-/+)cytμ(-)
2
5
CD10(-)cytμ(+)
5
–
MLL-AF4
9
9
MLL-MLLT1
3
2
MLL-MLLT3
2
–
MLL-MLLT10
4
–
MLL-EPS15
3
1
Показатель
Количество пациентов
p
Пол
0,999
Возраст, мес.
0,160
Инициальный лейкоцитоз, 109/Л
0,465
Инициальное поражение ЦНС1
0,379
Иммунофенотип
0,030
Перестройки гена MLL
0,156
223
Продолжение таблицы 36
Показатель
МОБ-негативные
МОБ-позитивные
пациенты
пациенты
p
Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии
Да
19
10
Нет
2
2
М1
17
10
М2
4
2
М3
–
–
0,610
Статус костного мозга на день 15
0,999
Клинико-гематологическая ремиссия на день 36
Достигнута
21
12
Не достигнута
–
–
–
Группа риска по протоколу MLL-Baby
Промежуточный риск
12
3
Высокий риск
9
9
0,145
Примечание - у 2-х пациентов из группы МОБ-позитивных отсутствовали данные
по оценке поражения ЦНС
Оценка влияния различных факторов на развитие рецидивов показала, что
такие показатели как наличие химерного транскрипта MLL-AF4, инициальное
поражение ЦНС, инициальный лейкоцитоз выше 100×109/Л, количество бластов в
1 мкл периферической крови на 8 день терапии более 1000 и ряд других,
оказались статистически незначимыми, а прогностически неблагоприятными
факторами в исследуемой группе пациентов, являлись сохранение МОБпозитивности в ТН4 (p=0,003) и возраст младше 6 мес. (p=0,001). При сравнении
этих параметров в многофакторной модели единственным независимым
прогностическим фактором осталось сохранение МОБ-позитивности в ТН4
(p=0,044) (Таблица 37).
224
Таблица 37 - Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение
рецидивов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по
протоколу MLL-Baby с учетом МОБ в ТН4
анализ
анализ
События
Многофакторный
Пациенты
Однофакторный
ОО
Старше 6 мес.
14
1
1
Младше 6 мес.
19
11
10,559
CD10(-/+)cytμ(-)
7
5
1
CD10(-)cytμ(-)
21
7
0,792
CD10(-)cytμ(+)
5
0
—
—
Нет
15
4
1
—
Есть
18
8
1,899
Показатель
95%
ДИ
p
ОО
95%
ДИ
p
Возраст
—
1
1,361- 0,001
81,903
6,171
—
0,728- 0,095
52,277
Иммунофенотип
—
0,359-
0,560
—
0,571- 0,302
—
1,745
Наличие MLL-AF4
6,316
Инициальный лейкоцитоз, ×109/Л
100
20
7
1
≥100
13
5
1,252
—
0,396- 0,704
—
3,960
Инициальное поражение ЦНС
Нет
24
7
1
Есть
7
4
2,316
—
0,669- 0,193
8,018
—
225
События
Показатель
Пациенты
Продолжение таблицы 37
Однофакторный
Многофакторный
анализ
анализ
ОО
95%
ДИ
p
ОО
95%
ДИ
p
Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии
Да
29
9
1
Нет
4
3
2,087
Отсутствие
21
4
1
Наличие
12
8
6,761
—
—
0,563- 0,268
7,734
Выявление МОБ в ТН4
Также
была
проанализирована
—
1,934- 0,003
23,638
возможность
1
3,771
1,033- 0,044
13,674
использования
данных
количественного анализа уровня МОБ методом ПЦР-РВ в ТН2 и ТН3.
Известно, что в большинстве протоколов терапии, использующих величину
МОБ для стратификации пациентов по группам риска, принята шкала оценки
МОБ кратная 10 [130,280,410]. Принимая это во внимание, а также то, что
методом анализа характеристических кривых (ROC-кривых) было выявлено, что
пороговым уровнем МОБ в ТН3, наиболее эффективно разделяющим группы
пациентов с различным исходом заболевания, является величина равная 0,332%
(Рисунок 46), которая близка к значению 0,1%, нами было принято решение
использовать именно величину 0,1% в качестве пороговой, и по отношению к ней
разделить пациентов с разным уровнем МОБ в ТН3.
Данная диагностическая модель позволила с высокой долей достоверности
прогнозировать исходы терапии по протоколу MLL-Baby. Пациенты, имевшие
величину МОБ в ТН3 более 0,1% (n=7) имели достоверно более низкую БСВ и
более высокую кумулятивную вероятность развития рецидива по сравнению с
226
пациентами, у которых МОБ была ниже 0,1% (n=21) (p=0,011 и p=0,017,
соответственно) (Рисунок 47).
Рисунок 46. ROC-кривая с указанием порогового уровня. Объяснение в тексте.
Рисунок 47. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива пациентов с
величиной МОБ в ТН3 более и менее 0,1%.
Затем мы провели одно- и многофакторный анализ в данной группе
пациентов с целью поиска факторов, влияющих на развитие рецидивов (Таблица
38).
227
Таблица 38 - Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение
рецидивов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по
протоколу MLL-Baby с учетом величины МОБ в ТН3
анализ
анализ
События
Многофакторный
Пациенты
Однофакторный
ОО
Старше 6 мес.
13
1
1
Младше 6 мес.
15
9
8,606
CD10(-/+)cytμ(-)
6
4
1
CD10(-)cytμ(-)
18
6
0,435
CD10(-)cytμ(+)
4
0
—
—
Нет
14
3
1
—
Есть
14
7
2,347
Показатель
95%
ДИ
p
ОО
95%
ДИ
p
Возраст
—
1
1,088- 0,041
68,073
5,614
—
0,661- 0,114
47,657
Иммунофенотип
—
0,118-
0,435
—
0,606- 0,217
—
1,599
Наличие MLL-AF4
9,093
Инициальный лейкоцитоз, ×109/Л
100
19
6
1
≥100
9
4
1,961
—
0,549- 0,300
—
7,006
Инициальное поражение ЦНС
Нет
20
6
1
Есть
6
3
2,260
—
0,552- 0,257
9,248
—
228
События
Показатель
Пациенты
Продолжение таблицы 38
Однофакторный
Многофакторный
анализ
анализ
ОО
95%
p
ДИ
ОО
95%
ДИ
p
Количество бластов < 1000/мкл на 8-й день терапии
Да
26
9
1
Нет
2
1
1,726
Менее 0,1%
21
5
1
Более 0,1%
7
5
7,059
—
—
0,218- 0,605
13,695
Величина МОБ в ТН3
—
—
1
1,976- 0,003
25,225
4,250
1,159- 0,029
15,585
Возраст младше 6 мес. и величина МОБ в ТН3 выше 0,1% были двумя
статистически
значимыми
прогностически
неблагоприятными
факторами
(p=0,041 и p=0,003, соответственно), однако в многофакторной модели только
величина МОБ в ТН3 выше 0,1% сохранила свою значимость (p=0,029).
Для определения какой из параметров вносит наибольший вклад в
неблагоприятный прогноз заболевания было проведено сравнение степени
влияния наличия МОБ в ТН4 и величины МОБ выше 0,1% в ТН3 на риск развития
рецидива (Таблица 39).
Основываясь на величине отношения опасности, было показано, что ни
один из этих факторов не имеет преимущества перед другим. Отчасти это может
быть связано с небольшим размером исследуемых групп, отчасти —возможной
взаимной компенсацией сравниваемых параметров. Так как все 7 пациентов,
имевших в ТН3 величину МОБ более 0,1% были также МОБ-позитивны в ТН4, и
наоборот, из 21 пациента, имевших величину ТН3 величину МОБ менее 0,1% 18
были МОБ-негативны в ТН4 (Таблица 40).
229
Таблица 39 - Сравнение прогностической значимости выявления МОБ в ТН4 и
Однофакторный
Многофакторный
анализ
анализ
События
Пациенты
величины МОБ в ТН3 более 0,1% в модели пропорционального риска Кокса
ОО
Отсутствие
18
3
1
Наличие
10
7
7,547
Менее 0,1%
21
5
1
Более 0,1%
7
5
7,059
Показатель
95%
p
ДИ
ОО
95%
ДИ
p
Выявление МОБ в ТН4
—
1
1,907- 0,004
29,840
4,570
—
0,753- 0,099
27,741
Величина МОБ в ТН3
—
1
1,976- 0,003
25,225
2,274
—
0,433- 0,332
11,948
Таблица 40 - Связь величины МОБ в ТН3 с выявлением МОБ в ТН4 (в скобках
приведено количество рецидивов)
Результат определения МОБ в ТН4
Результат определения
МОБ ТН3
МОБ (+)
МОБ (-)
Всего
МОБ < 0,1%
3 (2)
18 (3)
21 (5)
МОБ > 0,1%
7 (5)
0
7 (5)
10 (7)
18 (3)
28 (10)
Всего
6.4. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни в
периферической крови, выявленной методом ПЦР в режиме реального времени,
при остром лимфобластном лейкозе у детей первого года жизни, получающих
лечение по протоколу MLL-Baby
На первом этапе была проведена оценка выявления МОБ в 142 образцах
230
ПК по сравнению с парными образцами КМ, взятыми в идентичные ТН
протокола MLL-Baby. Общая сопоставимость результатов качественного
выявления МОБ в КМ и ПК составила 84,5%. При этом во всех 22 (15,5%)
дискордантных образцах МОБ была выявлена в КМ, но не в ПК (Рисунок 48).
Минимальная сопоставимость зафиксирована в ТН3 и ТН5 (77,3% и
76,2%, соответственно), максимальная – в ТН4 и ТН7 (92,5% и 100%,
соответственно) (Таблица 41).
Важно подчеркнуть, что величина абсолютной экспрессии гена ABL,
использованного для нормализации, достоверно не различалась в образцах ПК
и КМ; в ПК медиана числа копий ABL составила 4,95*104 (диапазон 1,30*10 3 –
1,40*106), в КМ — 4,85*104 копий (диапазон 1,08*10 3 – 3,45*106) (p=0,760).
Рисунок 48. Сопоставимость результатов определения МОБ в КМ и ПК.
Горизонтальная и вертикальная пунктирные линии отграничивают негативные
образцы от позитивных. Цифрами указано количество образцов.
231
Таблица 41 - Сопоставимость выявления МОБ в КМ и ПК в различные ТН
протокола MLL-Baby
Точка наблюдения
Число образцов
Сопоставимость, %
TН1
19
89,5
TН2
31
80,6
TН3
22
77,3
TН4
26
92,3
TН5
21
76,2
TН6
16
87,5
TН7
7
100
На втором этапе была проведена оценка прогностической значимости
выявления МОБ в ПК в различные ТН (Таблица 42). Единственной ТН, для
которой были выявлены различия в исходах терапии между МОБ-позитивными и
МОБ-негативными пациентами была ТН6.
Таблица 42 - Прогностическое значение наличия МОБ в ПК в различные ТН
Бессобытийная
ТН
выживаемость
(стандартная ошибка)
МОБ(+)
МОБ (-)
TН2
0,15 (0,12)
0,50 (0,25)
TН3
0,16 (0,15)
TН4
Кумулятивная
p
вероятность рецидива
(стандартная ошибка)
p
МОБ(+)
МОБ (-)
0,433
0,70 (0,09)
0,51 (0,02)
0,460
0,42 (0,10)
0,467
0,83 (0,04)
0,62 (0,04)
0,502
0,20 (0,17)
0,51 (0,18)
0,499
0,80 (0,05)
0,50 (0,03)
0,481
TН5
0
0,57 (0,24)
0,098
0,66 (0,13)
0,42 (0,09)
0,091
TН6
0
0,44 (0,14)
0,056
0,88 (0,11)
0,25 (0,13)
0,030
Примечание: ТН1 и ТН7 были исключены из анализа по следующим причинам: в
ТН1 все образцы были МОБ(+), в ТН7 было 7 образцов
232
Затем мы оценили прогностическое значение наличия МОБ в ТН6 в ПК по
сравнению с МОБ, определенной в ТН4 в КМ. При этом было показано, что
использование ПК в ТН6 не дает дополнительных преимуществ, так как исходы
терапии определенные по данным этой ТН, практически полностью дублируют
результаты, полученные в КМ в ТН4 (Рисунок 49).
Рисунок 49. Оценка прогностического значения выявления МОБ в ПК в ТН6 по
сравнению с КМ в ТН4.
Следовательно наличие МОБ в ПК на различных этапах терапии не
показало самостоятельной прогностической значимости, а выявленные различия
не были связаны с чувствительностью метода, определяемой по величине
абсолютной экспрессии гена ABL, а, скорее всего, отражали реальное
распределение опухолевых клеток в различных компартментах. Использование
ПК вместо КМ для мониторирования МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни
нецелесообразно.
Таким образом, нами был проведен анализ прогностической значимости
мониторинга МОБ путем выявления и количественной оценки экспрессии
химерных генов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек
гена MLL, получающих терапию по протоколу MLL-Baby. Определение химерных
233
транскриптов для мониторинга МОБ у пациентов с ОЛЛ используется только в
отдельных группах, когда химерные транскрипты выявляются у всех или у
подавляющего большинства пациентов: например при Ph-позитивном ОЛЛ, ОЛЛ
у детей первого года жизни. Это позволило не только оценить прогностическое
значение
определения
МОБ
путем
выявления
химерных
транскриптов
[28,153,186], но и найти ряд закономерностей в их кинетике [402,404]. Так
выявление химерных транскриптов на поздних этапах терапии связано с
неблагоприятным прогнозом ОЛЛ [28,402].
Главными
недостатками
применения
химерных
транскриптов
для
мониторинга МОБ, упоминаемыми в литературе, является ограниченное число
случаев ОЛЛ с наличием химерных генов (не более 30-40%), нестабильность
РНК, а также риск получения ложно-позитивных результатов вследствие
контаминации
организацией
[130,410,416].
работы
профилактическим
в
Последнее
ПЦР-лаборатории,
использованием
легко
устранимо
её
физических
зональным
и
корректной
делением
химических
и
методов,
разрушающих нуклеиновые кислоты [7].
Существовавшие ранее опасения о риске получения ложно-негативных
результатов, из-за высокой вероятности деградации РНК, например, при
длительной транспортировке, преодолеваются использованием стабилизирующих
растворов, позволяющих сохранять РНК в течение продолжительного времени
[66,226,408]. Еще одним фактором, помогающим исключить ложно-негативные
результаты, является исследование целостности РНК с помощью гельэлектрофореза
или
микроструйных
чипов
[437].
Более
того,
согласно
рекомендациям MIQE-консорциума, определение целостности РНК является
обязательным условием всех последующих исследований с использованием РНК
[431]. Мы в своей работе придерживались этих рекомендаций. Также важным
параметром, позволяющим оценивать качество материала, вносимого в ПЦР,
является оценка уровня экспрессии контрольных генов, проводящаяся методом
ПЦР в режиме реального времени [152]. Исходя из вышеизложенного, в рамках
данной работы оценивались только те образцы, в которых экспрессия
234
контрольного гена ABL была более 1*104 копий.
Сверхчувствительные методы, позволившие выявить у здоровых людей ряд
химерных генов (чаще всего ETV6-RUNX1, реже BCR-ABL1, перестройки MLL) и
описанные в отдельных работах [86,97,129,169], не применимы для практики, а
возможными объяснениями подобным находкам могут быть, в том числе,
неспецифичность реакции или технические погрешности в ходе ПЦР и FISH
[77,324,351]. Поэтому, можно считать, что любое выявление химерных
транскриптов в ходе мониторинга МОБ в рутинной лабораторной практике
свидетельствует о наличии того или иного количества опухолевых клеток,
являющихся материальным субстратом МОБ.
Проведенное
в
рамках
данной
работы
сопоставление
результатов
качественного выявления МОБ в ходе ОТ-ПЦР и количественного при помощи
ПЦР-РВ в КМ показало высокий уровень сходимости (97,3%). И если 4 из 5
дискордантных результата могут быть связаны с большей чувствительностью
гнездной ОТ-ПЦР, то в 1 случае, когда МОБ была выявлена только в ходе ПЦРРВ, но не в гнёздной ОТ-ПЦР, однозначного объяснения расхождению
результатов нет. Приемлемый уровень экспрессии гена ABL, используемого для
нормализации, исключал недостаточное количество материала, вносимого в ПЦРреакцию как возможную причину расхождений. Технические ошибки также
маловероятны, так как анализ был повторен несколько раз с неизменным
результатом. Наличие ингибиторов ПЦР сказалось бы на результатах обеих ПЦР
– ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ. Тем не менее, во избежание неадекватной оценки
результатов все 5 образцов, в которых были получены дискордантные данные,
были исключены из анализа.
В то же время, говоря о высокой степени сходимости результатов двух
методов, необходимо отметить, что подавляющее большинство образцов (162 из
182) было исследовано в одной лаборатории, а постановки ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ
проводилось из одной и той же кДНК.
В ходе нашей работы, было показано, что величина МОБ более 0,1% в ТН3
и любое наличие МОБ в ТН4 в КМ связаны с высокой вероятностью развития
235
рецидива. Нам не удалось выявить, какой из этих показателей является наиболее
важным. Отчасти это может быть связано с небольшим размером исследуемых
групп, отчасти с возможной взаимной компенсацией этих параметров. Так как все
7 пациентов, имевших в ТН3 величину МОБ более 0,1% были также МОБпозитивны в ТН4, и наоборот, из 21 пациента, имевших величину ТН3 величину
МОБ менее 0,1% 18 были МОБ-негативны в ТН4.
При необходимости сделать выбор, какой из параметров предпочесть:
количественная оценка МОБ в ТН3 или качественная в ТН4 следует учитывать,
что в условиях многоцентрового исследования ряд лабораторий в силу своего
оснащения не могут проводить количественную оценку по методологии «Европа
против рака» [409], использованной в данной работе. Более того, использование
данных количественного анализа, получаемых методов ПЦР-РВ, требует
длительного этапа оценки межлабораторной воспроизводимости результатов. Еще
одним недостатком использования данных количественной оценки величины
МОБ в ТН3 является отсутствие прямой связи между экспрессией гена, то есть
уровнем химерных транскриптов и количеством бластных клеток в костном мозге
[410,416], что осложняет использование выявления химерных транскриптов для
количественной оценки ответа на терапию. Однако это не распространяется на
анализ качественных результатов. Ранее была выявлена высокая качественная
сопоставимость результатов определения МОБ методом ОТ-ПЦР и определения
перестроек Ig/TCR [375,377]. Исходя из вышеизложенного, нам представляется
более целесообразным рекомендовать проводить учет качественного выявления
МОБ в ТН4 в КМ для прогнозирования исходов терапии по протоколу MLL-Baby.
На основании полученных данных, нами был сформулирован алгоритм
комплексной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года
жизни на основании сочетанного применения различных методов клинической
лабораторной диагностики (Рисунок 50). Данная схема включила в себя
алгоритмы по выявлению транслокации t(7;12)(q36;p13) методом FISH, а также по
мониторингу МОБ у пациентов с редкими типами химерных транскриптов с
участием MLL.
236
Рисунок 50. Алгоритм комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года жизни на
основании инициальных характеристик опухолевых бластов. * ОТ-ПЦР проводится в два этапа, в зависимости от частоты
встречаемости отдельных перестроек гена MLL: У пациентов с ОЛЛ 1-й этап: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3; 2-й этап:
MLL-EPS15, MLL-MLLT10. У пациентов с ОМЛ 1-й этап: MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-ELL; 2-й этап:
MLL-AF4, MLL-MLLT4, MLL-MYO1F, MLL-FOXO4. MLL-SEPT6, MLL-SEPT9. ** FISH t(7;12) проводится пациентам с ОМЛ
237
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложенная нами система определения МОБ на основании инициальных
характеристик
опухолевых
бластов
показала
свою
эффективность
для
прогнозирования исходов лечения детей первого года жизни с ОЛЛ, включенных
в
российское
мультицентровое
исследование
MLL-Baby.
На
основании
полученных результатов представляется целесообразным рестратифицировать
пациентов исходя из сохранения МОБ в точке наблюдения 4 протокола MLLBaby: для пациентов промежуточной группы риска – перевод на рукав высокого
риска протокола, для пациентов высокой группы риска – поиск альтернативных
способов достижения молекулярной ремиссии с последующим проведением
трансплантации костного мозга.
Кроме того разработанный алгоритм комплексной диагностики (в который,
кроме стандартной цитогенетики и иммунофенотипирования были включены
методы FISH и различные варианты ПЦР) и мониторинга МОБ позволяет
выявлять подавляющее большинство генетических аберраций при ОЛ у детей
первого
года
жизни,
избегать
диагностических
ошибок,
корректно
интерпретировать получаемые результаты. Это, в свою очередь, дает возможность
оценить инициальные факторы риска (вариант ОЛ, тип перестройки 11q23/MLL,
наличие транслокации t(7;12)).
В ходе данной работы нами было показано, что аномалии кариотипа,
характерные для ОЛ детей старших возрастных групп, редко встречаются у детей
первого года жизни. Среди пациентов с ОЛЛ нами обнаружены лишь единичные
случаи высокой гипер- и гиподиплоидии, транслокаций t(9;22)(q34;q11)/BCRABL1 и t(1;19)(q23;p13)/TCF3-PBX1, а криптическая транслокация t(12;21)
(p13;q22)/ETV6-RUNX1 не была выявлена ни в одном случае как цитогенетически,
так и методом ОТ-ПЦР. Нормальный кариотип зафиксирован у четверти (24,6%)
пациентов с ОЛЛ, а перестройки хромосомного района 11q23 с вовлечением гена
MLL были выявлены в 113 из 172 случаев (65,7%). Исследование относительной
частоты встречаемости перестроек 11q23/MLL показало, что при ОЛЛ наиболее
238
частыми аберрациями были t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4, t(11;19)(q23;p13)/MLLMLLT1 и t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3. Важно подчеркнуть, что наряду с ними
были обнаружены и относительно редкие химерные гены, такие как MLL-EPS15 и
MLL-AFF3. Наиболее часто перестройки 11q23/MLL обнаружены в возрастной
группе от 4,1 до 6,0 мес., в которой частота их выявления достигла 91,3%, а
наиболее редко (36,8%) – у пациентов в возрасте 10,1-11,9 мес. В возрасте младше
6 месяцев перестройки 11q23/MLL были выявлены достоверно чаще, чем в группе
пациентов от 6 до 12 месяцев. При исследовании структуры химерных
транскриптов выявлено, что наиболее часто точка слияния располагалась в 11
экзоне
гена
MLL,
а
наибольшей
вариабельностью
обладали
химерные
транскрипты MLL-AF4 и MLL-MLLT10. Существование большого количества
различных
транскриптных
вариантов
потенциально
может
осложнять
диагностику методом ОТ-ПЦР, и часто требует дополнительной верификации
методом секвенирования.
При ОМЛ у детей первого года жизни было обнаружено 3 случая (4,8%)
inv16(p13q22), в то время другие маркеры благоприятного прогноза —
t(15;17)(q22;q21)/PML-RARa и t(8;21)(q22;q22)/RUNX1-RUNXT1 — не были
найдены. Комплексный кариотип выявлен у 10 пациентов (15,9%), включая 5
случаев с наличием перестроек 11q23/MLL. Нормальный кариотип клеток
лейкозного клона имели 9,5% пациентов. Для MLL-негативных ОМЛ (n=35)
характерными
являлись
транслокации
t(1;22)(p13;q13)
и
t(7;12)(q36;p12),
выявленные нами в 5 и 3 случаях, соответственно. Среди детей первого года
жизни с ОМЛ частота выявления перестроек 11q23/MLL составила 56,0%.
Самыми
частыми
перестройками
были
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3
и
t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10. Кроме этого были обнаружены редкие и
нетипичные для данной возрастной группы перестройки 11q23/MLL. К первым
следует отнести t(11;19)(q23;p13)/MLL-MYO1F, t(11;17)(q23;q25)/MLL-SEPT9,
t(X;11)(q24;q23)/MLL-SEPT6, ко вторым — t(6;11)(q27;q23)/MLL-MLLT4 и MLLPTD. Большинство редких перестроек были диагностированы только при
проведении ДИ-ПЦР, что свидетельствует о необходимости использования всего
239
арсенала лабораторных методов для верификации каждого конкретного случая
перестройки 11q23/MLL. При ОМЛ перестройки 11q23/MLL встречались
приблизительно с равной частотой у детей младше и старше 6 мес. В группе
пациентов
с
перестройками
11q23/MLL
достоверно
чаще
наблюдался
морфологический вариант ОМЛ М5, и достоверно реже ОМЛ М7, чем в группе
пациентов, у которых перестройки 11q23/MLL не были обнаружены. ДХА при
ОМЛ с перестройками района 11q23/MLL встречались в 29,4% случаев,
комплексный кариотип — в 14,7%. При исследовании химерных транскриптов
было выявлено, что наиболее часто точка слияния располагалась в 9 экзоне гена
MLL, а наибольшей вариабельностью обладали химерные транскрипты MLLMLLT3 и MLL-MLLT10.
Применение метода FISH показало, что частота выявления перестроек гена
MLL при ОЛ у детей первого года жизни составляет 73,0%. Среди всех перестроек
гена MLL перестройки с сочетанной делецией 3’-конца MLL выявлены в 7,6%
случаев. Они не связаны с какой-то определенной локализацией точек разрыва в
ДНК гена MLL, а также видом гена-партнера MLL. Прогноз пациентов с 3’делецией гена MLL и пациентов с перестройками гена MLL со стандартным
распределением флуоресцентных сигналов не различался.
Использование метода ДИ-ПЦР дало возможность установить, что наиболее
частой зоной разрыва в ДНК гена MLL при ОЛЛ являлся 11-й интрон (48,1%), при
ОМЛ — 9-й интрон (42,1%). При ОЛЛ пациенты, у которых точка разрыва
располагалась в 11-м интроне, были достоверно младше всех остальных. Зоны
разрыва в генах-партнерах MLL чаще всего затрагивают один или два интрона, за
исключением генов AF4 и MLLT10, в которых основные зоны разрывов более
протяженные. Нами установлены различные механизмы образования химерных
генов с участием MLL, наиболее частым из которых были реципрокные
транслокации, реже — транс-сплайсинг и инсерции.
Использование специально разработанного трехцветного зонда для FISH
позволило верифицировать 4 случая t(7;12)(q36;p12) с образованием химерного
гена HLXB9-ETV6, ни в одном из которых данная транслокация не выявлялась
240
цитогенетически. Выявлено 4 типа комбинации флуоресцентных сигналов, два из
которых
соответствуют
различным
механизмам
образования
данной
транслокации. В соответствии с разработанным нами алгоритмом исследование
методом FISH для выявления транслокации t(7;12)(q36;p12) следует проводить во
всех случаях MLL-негативных ОМЛ у детей первого года жизни.
Иммунофенотип ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей первого
года жизни существенно различается в зависимости от наличия или отсутствия
перестроек 11q23/MLL. BI- и BIII-варианты ОЛЛ встречались значительно чаще у
пациентов с наличием перестроек 11q23/MLL, по сравнению с BII-ОЛЛ.
Экспрессия NG2, CD45, CD133, CD15, а также отсутствие экспрессии CD10,
CD20 позволяли прогнозировать наличие какой-либо перестройки 11q23/MLL,
при этом наибольшей диагностической эффективностью обладало наличие
экспрессии NG2. Экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов
с наличием химерного гена MLL-AF4.
При ОМЛ отсутствие экспрессии CD61, а также высокая экспрессия CD11b,
CD99, CD15, CD133 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток
при наличии перестроек 11q23/MLL. Диагностическая эффективность выявления
экспрессии CD11b для прогнозирования наличия перестроек 11q23/MLL оказалась
наиболее высокой.
При сравнении результатов выявления МОБ методами ОТ-ПЦР и
проточной цитометрии было показано, что качественная сопоставимость двух
методов составила 87,1%; она была ниже в образцах, взятых на этапе
индукционной
терапии
по
сравнению
с
образцами
этапов
консолидации/интенсификации и противорецидивной терапии. Наличие в образце
нормальных B-линейных предшественников не влияло на сопоставимость
результатов.
На примере MLL-EPS15 нами показан механизм подбора условий для
успешного мониторирования МОБ при наличии редких вариантов химерных
транскриптов с участием гена MLL (MLL-MLLT10, MLL-MLLT11, MLL-MYO1F),
которые ранее не были описаны в литературе. Кроме того использование в
241
качестве исходного материала геномной ДНК для мониторирования МОБ может
представлять собой альтернативу применения менее стабильной РНК.
Нами предложен подход по использованию химерных транскриптов с
участием MLL в качестве мишеней для мониторинга МОБ методами ОТ-ПЦР и
ПЦР-РВ, который легко может быть реализован при ОЛ у пациентов первого года
жизни, так как большинство из них имеют перестройки 11q23/MLL. На основании
результатов мониторинга химерных транскриптов в костном мозге мы оценили
прогностическое значение МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни,
получающих терапию по протоколу MLL-Baby. Величина МОБ более 0,1% в ТН3
и любое сохранение МОБ в ТН4 в костном мозге являлись равнозначно важными
прогностическими факторами, ассоциированными с неблагоприятным прогнозом,
и, следовательно, могут быть использованы для оптимизации лечения пациентов
первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу MLL-Baby. В то
же время использование периферической крови для мониторинга МОБ не
показало самостоятельной прогностической значимости, несмотря на высокую
качественную сопоставимость с результатами выявления МОБ в костном мозге.
242
ВЫВОДЫ
1. При ОЛ у детей первого года жизни наиболее часто выявляются
перестройки 11q23/MLL (65,7% при ОЛЛ и 56,0% при ОМЛ). Аномалии
кариотипа, характерные для ОЛ детей старших возрастных групп, редко
встречаются у детей первого года жизни (3,7% случаев при ОЛЛ и 4,8% случаев
при ОМЛ).
2. У пациентов с ОЛЛ в возрасте младше 6 месяцев перестройки
11q23/MLL встречаются достоверно чаще по сравнению с пациентами в возрасте
от 6 до 12 месяцев (86,1% и 48,4%, соответственно). Для ОМЛ подобной
взаимосвязи не выявлено.
3. Установлена взаимосвязь между структурой химерных генов с участием
MLL и видом острого лейкоза, а также возрастом пациентов. В исследованной
группе пациентов с ОЛЛ наиболее частой зоной разрыва в ДНК гена MLL
является 11-й интрон (48,1% случаев), а при ОМЛ — 9-й интрон (42,1% случаев).
Дети с ОЛЛ, у которых точка разрыва находится в 11-м интроне гена MLL, были
достоверно младше всех остальных. Для ОМЛ подобной взаимосвязи не найдено.
4. Применение
метода
FISH
с
использованием
трехцветного
флуоресцентного зонда позволяет верифицировать транслокацию t(7;12)(q36;p13)
и
демонстрирует существование различных механизмов, ведущих к её
формированию.
5. При ОЛЛ у детей первого года жизни отсутствие экспрессии CD10 и
CD20, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 дают возможность
прогнозировать
наличие
перестроек
11q23/MLL.
При
этом
наибольшей
диагностической эффективностью обладает NG2 — 90,6%, для CD45 этот
показатель составляет 81,9%, CD20—81,2%, CD133—76,5%, CD15—67,7%,
CD65—53,7%. При ОМЛ в данной возрастной группе с наличием перестроек
11q23/MLL ассоциированы экспрессия NG2, CD99, CD133, CD15, CD11b и
отсутствие экспрессии CD61. Диагностическая эффективность использования
CD11b составляет 95,0%, NG2—89,7%, CD65—83,3%, CD15—80,6%, CD99—
243
78,3%, CD133 и CD4—по 75,0%, CD61—71,9%.
6. Для определения минимальной остаточной болезни методом проточной
цитометрии при ОЛЛ у детей первого года жизни NG2 необходимо использовать
в комплексе с другими маркерами, так как его экспрессия, а также доля NG2положительных клеток достоверно снижается во время терапии.
7. Результаты определения МОБ при ОЛЛ у детей первого года жизни
методами проточной цитометрии и ОТ-ПЦР имеют высокую качественную
сопоставимость (87,0%).
8. При ОЛЛ у детей первого года жизни, получающих терапию по
протоколу MLL-Baby, величина минимальной остаточной болезни в КМ более
0,1% в ТН3 и любое сохранение МОБ в КМ в ТН4 - наиболее важные параметры,
связанные с развитием рецидивов.
9. Выявление МОБ в ПК на различных этапах терапии по протоколу MLLBaby не обладает самостоятельной прогностической значимостью, несмотря на
высокую качественную сопоставимость выявления МОБ в ПК и КМ (84,5%).
244
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При диагностике ОЛ у детей первого года жизни для поиска маркеров
для последующего определения минимальной остаточной болезни целесообразно
проведение комплекса лабораторных исследований, в который, наряду со
стандартным
цитогенетическим
анализом
и
иммунофенотипированием,
рекомендуется включать FISH и различные варианты ПЦР.
2. При выявлении MLL-ассоциированного иммунофенотипа рекомендуется
прицельный поиск перестроек 11q23/MLL всеми возможными методами.
3. У детей первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек 11q23/MLL
определение
минимальной
остаточной
болезни
рекомендуется
проводить
методами проточной цитометрии или обратно-транскриптазной ПЦР; при
отсутствии перестроек 11q23/MLL — только методом проточной цитометрии.
4. Учитывая неблагоприятный прогноз пациентов с ОМЛ и наличием
транслокации t(7;12)(q36;p13), а также высокую частоту криптических вариантов
этой транслокации, всем детям первого года жизни с ОМЛ при отсутствии
перестроек 11q23/MLL следует проводить выявление этой транслокации методом
FISH с использованием трехцветного флуоресцентного зонда.
5. У детей первого года жизни с ОЛ при отрицательных результатах
определения наиболее частых перестроек 11q23/MLL: (t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4,
t(11;19)(q23;p13)/MLL-MLLT1,
t(9;11)(p22;q23)/MLL-MLLT3)
целесообразно
применять разработанные нами условия выявления и мониторинга редких
перестроек гена MLL методом ПЦР в режиме реального времени.
245
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Использование предложенного алгоритма у детей первого года жизни для
инициальной диагностики и определения МОБ дает возможность надежно
выявлять перестройки 11q23/MLL, в том числе редкие, ранее неописанные, что
позволяет развивать знания о биологии опухолевого процесса и, тем самым,
совершенствовать терапию. Полученные в работе данные создают предпосылки
для детального изучения роли МОБ при ОМЛ.
Эффективность разработанного диагностического метода у детей первого
года жизни позволяет считать перспективным его использование для улучшения
результатов лечения ОЛ у пациентов различных возрастных групп.
246
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
БСВ — бессобытийная выживаемость
ДГБ — детская городская больница
ДГКБ — детская городская клиническая больница
ДИ-ПЦР — длинная инвертированная полимеразная цепная реакция
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
КДКБ — детская краевая клиническая больница
кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
КМ — костный мозг
ОБфЛ — острый бифенотипический лейкоз
ОВ — общая выживаемость
ОДБ — областная детская больница
ОДКБ — областная детская клиническая больница
ОЛ — острый лейкоз
ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз
ОМЛ — острый миелоидный лейкоз
ОНдЛ — острый недифференцированный лейкоз
ОТ — реакция обратной транскрипции
ОТ-ПЦР — обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального
времени
п.н. — пара нуклеотидов
РДКБ — Российская детская клиническая больница
РНПЦ — Республиканский научно-практический центр
РНК — рибонуклеиновая кислота
РОНЦ — Российский онкологический научный центр
ПК — периферическая кровь
ТГСК — трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
247
ТН — точка наблюдения
ХГ — химерный ген
ФНКЦ ДГОИ — Федеральный научно-клинический центр детской гематологи,
онкологии и иммунологии
ЦНС — центральная нервная система
AIEOP — исследовательская группа Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia
Pediatrica
BFM — исследовательская группа Berlin-Frankfurt-Munster
BHQ1 — гаситель флуоресценции Black Hole 1
BHQ2 — гаситель флуоресценции Black Hole 2
CCG — исследовательская группа Children’s Cancer Group;
CD — кластер дифференцировки
DFCI — исследовательская группа Dana-Farber Cancer Institute
EORTC-CLCG — исследовательская группа European Organization for Research
and Treatment of Cancer - Children’s Leukemia Cooperative Group
FHCRC – трансплантационный центр Fred Hutchinson Cancer Research Center
FAB
—
франко-американо-британская
классификация
морфологических
вариантов острых лейкозов
FAM — флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин
FITC — флуоресцентный краситель флуоресцеин изотиоцианат
FISH — флуоресцентная гибридизация in situ
GETMON — исследовательская группа Groupo Español de Trasplante de Médula
Osea en Niños
HEX — флуоресцентный краситель 6-гексахлорфлуоресцеин
JILSG — исследовательская группа Japan Infant Leukemia Study Group
POG — исследовательская группа Pediatric Oncology Group
MRC-UKALL — исследовательская группа Medical Research Council United
Kingdom ALL
NOPHO – исследовательская группа Nordic Pediatric Hematology Oncology
ROC —анализ характеристических кривых
248
ROX – флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин
St Jude — исследовательская группа St Jude Children’s Research Hospital
TexasRed — флуоресцентный краситель техасский красный
3´-UTR — 3´-нетранслируемый участок гена
5´-UTR — 5´-нетранслируемый участок гена
249
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1
Анализ хромосомных транслокаций с участием гена MLL методом
гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами / О.Н. Митяева [и др.]
// Мол. Биол.—2004.—Том 38, N 3.—С.449-456.
2
Возрастные
особенности
цитогенетических
изменений
при
острых
миелоидных лейкозах / Е.В. Флейшман [и др.] // Онкогематология.—
2007.—№4.—С.12-16.
3
Всероссийская перепись населения 2010. Том 2. Возрастно-половой состав
и
состояние
в
браке
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.gks.ru/free_doc/new_site/perepis2010/croc/perepis_itogi1612.htm
(дата обращения 02.02.2014)
4
Долгосрочные
результаты
комбинированного
лечения
острого
промиелоцитарного лейкоза у детей и подростков с использованием геннонаправленной терапии / Е.В. Самочатова [и др.] // Терапевтический
архив.—2007.—Т.79, № 7.—С.26-30.
5
Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и
смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.:
ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. 2012. —
260с.
6
Карачунский А.И. Эволюция лечения острого лимфобластного лейкоза у
детей: критическое использование мирового опыта в России / А.И.
Карачунский
А.И.,
Ю.В.
Румянцева,
А.Г.
Румянцев
//
Вопросы
гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии.—2011.—Т.10,
№2.—С.15-31.
7
Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых
кислот
при
работе
с
материалом,
содержащим
микроорганизмы I - IV групп патогенности / Методические указания МУ
1.3.2569-09.—М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав
250
потребителей и благополучия человека, 2009.—28с.
8
Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при Bлинейных
острых
лимфобластных
лейкозах
методом
проточной
цитометрии у детей первого года жизни. / А.М. Попов [и др.]// Детская
Онкология.—2008.—№2.—С.32-35.
9
Прогностическое
значение
минимальной
остаточной
болезни
для
безрецидивной выживаемости детей с острым лимфобластным лейкозом на
протоколе ОЛЛ-МБ-2002 (однофакторный и многофакторный анализ) /
Н.Н. Савва [и др.] // Онкогематология.—2009.—№2.—С.17-21.
10
Савва Н.Н. Злокачественные новообразования у детей Республики
Беларусь: Заболеваемость, выживаемость, смертность и паллиативная
помощь / Н.Н. Савва, А.А. Зборовская, О.В. Алейникова. — Минск: ГУ
РНМБ, 2008.—184с.
11
Савченко В. Г. Острые лейкозы // В.Г. Савченко, E.Н. Паровичникова. В
кн.: Клиническая онкогематология: Руководство для врачей // М.А.
Волкова (ред.). М.: Медицина; 2001.— С.156—208.
12
Сложные аномалии кариотипа при остром миелоидном лейкозе детей / Е.В.
Флейшман [и др.]// Вестник РАМН.—2008.—№5.—С.3-7.
13
Шнейдер М.М. Эффективность риск-адаптированной терапии острого
миелоидного лейкоза у детей с использованием режимов интенсивного
тайминга и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: автореф.
дис. … доктора мед. наук: 14.00.09, 14.00.29 / Шнейдер Мария Марковна.
— М, 2008. — 57с.
14
Шориков Е. В. Результаты программного лечения острого лимфобластного
лейкоза у детей первого года жизни: автореф. дис. ... канд. мед. наук:
14.00.09, 14.00.29 / Шориков Егор Валерьевич.—М, 2005.—34с.
15
Эффективность протокола ALL-МВ-2002 у детей с острым лимфобластным
лейкозом / Ю.В. Румянцева [и др.] // Терапевтический архив.—2010.—Т.82,
№ 7.—С.11-19.
251
16
11q23/MLL rearrangement confers a poor prognosis in infants with acute
lymphoblastic leukemia / C.-H. Pui [et al.] // J Clin Oncol.—1994.—Vol.12, N
5.—P.909-915.
17
5q- and t(2;11) in a patient with M2 acute non-lymphocytic leukemia. Case
report / N. Testoni [et al.] // Haematologica.—1989.—Vol.74, N 6.—P.595–599.
18
A 2p;11q chromosome translocation in dysmyelopoietic preleukemia / M. Feder
[et al.] // Cancer Genet Cytogenet.— 1985.—Vol.15, N 1-2.—P.143–150.
19
A comparison of allogeneic bone marrow transplantation, autologous bone
marrow transplantation, and aggressive chemotherapy in children with acute
myeloid leukemia in remission: a report from the Children’s Cancer Group / W.
Woods [et al.] // Blood.—2001.—Vol.97, N 1.—P.56–62.
20
A DNA probe combination for improved detection of MLL/11q23 breakpoints
by double-color interphase-FISH in acute leukemias / A. von Bergh [et al.] //
Genes Chromosomes and Cancer.— 2000.—Vol.28, N 1.—P.14–22.
21
A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes / A. Su [et
al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.—2004.— Vol.101, N 16.— P.6062–6067.
22
A higher-order complex containing AF4 and ENL family proteins with P-TEFb
facilitates oncogenic and physiologic MLL-dependent transcription / A.
Yokoyama [et al.] // Cancer Cell.—2010.—Vol.17, N 2.—P.198–212.
23
A highly specific and sensitive fluorescence in situ hybridization assay for the
detection of t(4;11)(q21;q23) and concurrent submicroscopic deletions in acute
leukaemias / M. König [et al.] // British Journal of Haematology.—2002.—Vol
116, N 4.—P.758-764.
24
A novel class of zinc finger/leucine zipper genes identified from the molecular
cloning of the t(10;11) translocation in acute leukemia / T. Chaplin [et al.] //
Blood.—1995.—Vol.85, N 6.—P.1435-1441.
25
A novel gene, AF-1p, fused to HRX in t(1;11)(p32;q23), is not related to AF-4,
AF-9 nor ENL / O. Bernard [et al.] // Oncogene.— 1994.—Vol.9, N 4. —
P.1039-1045.
252
26
A novel gene, AF1q, fused to MLL in t(1;11) (q21;q23), is specifically expressed
in leukemic and immature hematopoietic cells / W. Tse [et al.] // Blood.—
1995.—Vol.85, N 3.—P.650-656.
27
A population-based study of 272 children with acute myeloid leukaemia treated
on two consecutive protocols with different intensity: best outcome in girls,
infants, and children with Down’s syndrome / S. Lie [et al.] // Br. J. Haematol.—
1996.—Vol.94, N 1.—P.82–88.
28
A prospective study of residual-disease monitoring of the ALL1/AF4 transcript
in patients with t(4;11) acute lymphoblastic leukemia / G. Cimino [et al.] //
Blood.—2000.—Vol.95, N 1.—P.96-101.
29
A role for the MLL fusion partner ENL in transcriptional elongation and
chromatin modification / D. Mueller [et al.] // Blood.—2007.—Vol.110, N 13.—
P.4445–4454.
30
A subtype of childhood acute lymphoblastic leukaemia with poor treatment
outcome: a genome-wide classification study / M. Den Boer [et al.] // Lancet
Oncol.—2009.—Vol.10, N 2.—P.125-134.
31
A superior outcome of infant acute myeloid leukemia with intensive
chemotherapy: results of the Japan Infant Leukemia Study Group / H. Kawasaki
[et al.] // Blood.—2001.—Vol.98, N 13.—P.3589–3594.
32
A systematic review of studies on psychosocial late effects of childhood cancer:
structures of society and methodological pitfalls may challenge the conclusions /
L. Lund [et al.] // Pediatr Blood Cancer.—2011.—Vol.56, N 4.—P.532-543.
33
A treatment protocol for infants younger than 1 year with acute lymphoblastic
leukaemia (Interfant-99): an observational study and a multicentre randomised
trial / R. Pieters [et al.] // Lancet.—2007.—Vol. 370.—P.240-250.
34
A variant-type MLL/SEPT9 fusion transcript in adult de novo acute monocytic
leukemia (M5b) with t(11;17)(q23;q25) / T. Kurosu [et al.] // Int. J Hematol.—
2008.—Vol.88, N 2.—P.192-196.
253
35
Abnormalities of chromosome band 11q23 and the MLL gene in pediatric
myelomonocytic and monoblastic leukemias. Identification of the t(9;11) as an
indicator of long survival / J. Martinez-Climent [et al.] // J Pediatr Hematol
Oncol.—1995.—Vol.17, N 4—P.277–283.
36
Abrogation of MLL-AF10 and CALM-AF10-mediated transformation through
genetic
inactivation
or
pharmacological
inhibition
of
the
H3K79
methyltransferase Dot1l / L. Chen [et al.] // Leukemia.—2013.—Vol.27, N 4.—
P.813-822.
37
Abschaetzung der Tumorzellmasse bei der akuten lymphoblastischen Leuka¨mie
im Kindesalter: Prognostische Bedeutung und praktische Anwendung / H.-J.
Langermann [et al.] // Klin Padiatr.—1982.—Vol.194.—P.209-213.
38
Acquired idiopathic sideroblastic anemia: a new chromosomal abnormality / P.
Schulman [et al.] // Cancer Genet Cytogenet.—1983.—Vol.9, N 4.—P.341–345.
39
Acute leukemias of different lineages have similar MLL gene fusions encoding
related chimeric proteins resulting from chromosomal translocation / J. Corral [et
al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—1993.—Vol.90, N 18.—P.8538-8542.
40
Acute lymphoblastic leukaemia in infancy: experience in MRC UKALL trials.
Report from the Medical Research Council Working Party on Childhood
Leukaemia / J. Chessells [et al.] // Leukemia.—1994.—Vol.8, N 8.—P.12751279.
41
Acute lymphoblastic leukemia in infants less than one year of age: a cumulative
experience of the Children's Cancer Study Group / G. Reaman [et al.] // J Clin
Oncol. —1985. —Vol.3, N 11. —P.1513-1521.
42
Acute lymphoblastic leukemia: treatment results in three BFM studies (1970–
1981) / H. Riehm [et al.] // In: S. Murphy, J. Gilbert (eds). Leukemia Research:
Advances in Cell Biology and Treatment. Amsterdam: Elsevier Science
Publishing, 1983.—P.251–263.
43
Acute lymphoblastic leukemias with deletion of 11q23 or a novel inversion
(11)(p13q23) lack MLL gene rearrangements and have favorable clinical features
254
/ S. Raimondi [et al.] // Blood.—1995.—Vol.86, N 5.—P.1881–1886.
44
Acute megakaryoblastic leukemia in children and adolescents, excluding Down's
syndrome: improved outcome with intensified induction treatment / D. Reinhardt
[et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 8.—P.1495–1496.
45
Acute mixed-lineage leukemia t(4;11)(q21;q23) generates an MLL-AF4 fusion
product / P. Domer [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—1993.—Vol.90, N 16.—
P.7884-7888.
46
Acute monocytic leukemia in children: response to VP-16-213 as a single agent /
A. Nishikawa [et al.] // Cancer.—1987.—Vol.60, N 9.—P.2146–2149.
47
Acute myeloid leukemia with a complex aberrant karyotype is a distinct
biological entity characterized by genomic imbalances and a specific gene
expression profile / C. Schoch [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—2005.—
Vol.43, N 3.—P.227-238.
48
Acute nonlymphoblastic leukemia in infants: clinical presentation and outcome /
C.-H. Pui [et al.] // J Clin Oncol.—1988.—Vol.6, N 6.—P1008-1013.
49
AF17q25, a putative septin family gene, fuses the MLL gene in acute myeloid
leukemia with t(11;17)(q23;q25) / T. Taki [et al.] // Cancer Res.— 1999.—
Vol.59, N 17.—P.4261–4265.
50
AFF4, a component of the ELL/P-TEFb elongation complex and a shared
subunit of MLL chimeras, can link transcription elongation to leukemia / C. Lin
[et al.] // Mol Cell.—2010.—Vol.37, N 3.—P.429–437.
51
Altered Hox expression and segmental identity in Mll-mutant mice / B. Yu [et
al.] // Nature.—1995.—Vol.378.—P.505–508.
52
AML with 11q23/MLL abnormalities as defined by the WHO classification:
incidence, partner chromosomes, FAB subtype, age distribution, and prognostic
impact in an unselected series of 1897 cytogenetically analyzed AML cases / C.
Schoch [et al.] // Blood.—2003.—Vol.102, N 7.—P.2395–2402.
255
53
Amplified, lost, and fused genes in 11q23-25 amplicon in acute myeloid
leukemia, an array-CGH study / A. Tyybäkinoja [et al.] // Genes Chromosomes
Cancer.—2006.—Vol.45, N 3.—P.257-264.
54
An ins(X;11)(q24;q23) fuses the MLL and the Septin 6/KIAA0128 gene in an
infant with AML-M2 / A. Borkhardt [et al.] // Gene Chromosomes Cancer.—
2001.—Vol.32, N 1.—P.82–88.
55
An MLL-SEPT9 fusion and t(11;17)(q23;q25) associated with de novo
myelodysplastic syndrome / L. Kreuziger [et al.] // Leuk Res.—2007.—Vol.31,
N 8.—P.1145-1148.
56
Analysis of minimal residual disease by Ig/TCR gene rearrangements: guidelines
for interpretation of real-time quantitative PCR data / V. van der Velden [et al.] //
Leukemia.—2007.—Vol.21, N 4.—Р.604-611.
57
Analysis of MLL-derived transcripts in infant acute monocytic leukemia with a
complex translocation (1;11;4)(q21;q23;p16) / C. So [et al.] // Cancer Genet
Cytogenet.—2000.—Vol.117, N 1.—P.24–27.
58
Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report
on CCG 1953 from the Children’s Oncology Group / J. Hilden [et al.] //
Blood.—2006.—Vol.108, N 2.—P.441-451.
59
Analysis of the role of hematopoietic stem-cell transplantation in infants with
acute lymphoblastic leukemia in first remission and MLL gene rearrangements: a
report from the Children’s Oncology Group / Z. Dreyer [et al.] // J Clin Oncol.—
2011.—Vol.29, N 2.—P.214-222.
60
Armstrong S. Molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia / S.
Armstrong, A. Look // J Clin Oncol.—2005.—Vol.23, N 26.—P.6306-6315.
61
Autosomal monosomies among 24262 consecutive cytogenetic studies:
prevalence, chromosomal distribution and clinicopathologic correlates of sole
abnormalities / S. Raza [et al.] // Am J Hematol.—2011.—Vol.86, N 4.—P.353356.
256
62
Ayton P. Transformation of myeloid progenitors by MLL oncoproteins is
dependent on Hoxa7 and Hoxa9 / P. Ayton, M. Cleary // Genes and
Development.—2003.—Vol.17, N 18.—P.2298–2307.
63
Backtracking leukemia to birth: identification of clonotypic gene fusion
sequences in neonatal blood spots / K. Gale [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—
1997.—Vol.94, N 25.—P.13950–13954.
64
Biased distribution of chromosomal breakpoints involving the MLL gene in
infants versus children and adults with t(4;11) ALL / M. Reichel [et al.] //
Oncogene.—2001.—Vol.20, N 23.—P.2900–2907.
65
Bimodal distribution of genomic MLL breakpoints in infant acute lymphoblastic
leukemia treatment / R. Jung [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 4.—P.903907.
66
Biological stability of RNA isolated from RNAlater-treated brain tumor and
neuroblastoma xenografts / M. Grotzer [et al.] // Med Pediatr Oncol.—2000.—
Vol.34, N 6.—P.438-442.
67
Biology and outcome of childhood acute megakaryoblastic leukemia: a single
institution's experience / U. Athale [et al.] // Blood.—2001.—Vol.97, N 12.—
P.3727–3732.
68
Biology, risk stratification, and therapy of pediatric acute leukemias: an update /
C.-H. Pui [et al.] // J Clin Oncol.—2011.—Vol.29, N 5.—P.551-565
69
Biological and therapeutic aspects of infant leukemia / A. Biondi [et al.] //
Blood.—2000. —Vol.96, N 1.—P.24-33.
70
Bitoun E. The mixed-lineage leukemia fusion partner AF4 stimulates RNA
polymerase II transcriptional elongation and mediates coordinated chromatin
remodeling / E. Bitoun, P. Oliver, K. Davies // Hum Mol Genet.—2007.—
Vol.16, N 1.—P.192-206.
71
Blockade of miR-150 maturation by MLL-fusion/MYC/LIN-28 is required for
MLL-associated leukemia / X. Jiang [et al.] // Cancer Cell.—2012.—Vol.22, N
4.—P.524–535.
257
72
Bone marrow karyotypes of children with non-lymphocytic leukemia / A.
Hagemeijer [et al.] // Pediatr. Res.—1979.—Vol.13, N 11.—P.1247–1254.
73
Bone marrow transplantation for children less than 2 years of age with acute
myelogenous leukemia or myelodysplastic syndromes / A. Woolfrey [et al.] //
Blood.—1998.—Vol.92, N 10.—P.3546–3556.
74
Campana D. Minimal residual disease studies in acute leukaemia / D. Campana //
Am. J. Clin. Pathol.—2004.—Vol.122, Suppl.—Р.S47-S57.
75
CBX8, a polycomb group protein, is essential for MLL-AF9-induced
leukemogenesis / J. Tan [et al.] // Cancer Cell.—2011.—Vol.20, N 5.—P.563–
575.
76
Cell of origin determines clinically relevant subtypes of MLL-rearranged AML /
A. Krivtsov [et al.] // Leukemia.—2013.—Vol.27, N 4.—P.852-860.
77
Challenges and pitfalls in the mapping of the natural history of t(12;21)–positive
childhood ALL / K. Schmiegelow [et al.] // Blood.—2011—Vol.117, N 1.—
P.370-371.
78
Chapelle A. de la. Translocation (2;11)(p21;q23) in acute non-lymphocytic
leukaemia: a non-random association / A. de la Chapelle, S. Knuutila, E. Elonen
// Scand J Haematol.— 1986.—Vol.45, Suppl.—P.91–97.
79
Characterization of fusion partner genes in 114 patients with de novo acute
myeloid leukemia and MLL rearrangement / L. Shih [et al.] // Leukemia.—
2006.—Vol. 20, N 2.—P.218–223.
80
Chemotherapy in 998 unselected childhood acute lymphoblastic leukemia
patients. Results and conclusions of the multicenter trial ALL-BFM 86 / A.
Reiter [et al.] // Blood.—1994.—Vol. 84, N 9.—P.3122-3133.
81
Childhood acute lymphoblastic leukemia with chromosomal breakpoints at
11q23 / S. Raimondi [et al.] // Blood.—1989.—Vol.73, N 6.—P.1627-1634.
82
Childhood acute lymphoblastic leukemia with the MLL-ENL fusion and
t(11;19)(q23;p13.3) translocation / J. Rubnitz [et al.] // J Clin Oncol.—1999.—
Vol.17, N 1.—P.191–196.
258
83
Childhood acute lymphoblastic leukemia: 12 years of experience, using a BerlinFrankfurt-Münster approach, in a Greek center / M. Ampatzidou [et al.] // Leuk
Lymphoma.—2015.—Vol.56, N 1.—P.251-255.
84
Chromosomal abnormalities in 478 children with acute myeloid leukemia:
clinical characteristics and treatment outcome in a cooperative pediatric
oncology group study-POG 8821 / S. Raimondi [et al.] // Blood.—1999.—
Vol.94, N 11.—P.3707–3716.
85
Chromosome abnormalities and MLL rearrangements in acute myeloid leukemia
of infants / N. Satake [et al.] // Leukemia.—1999.—Vol.13, N 7.—P.1013–1017.
86
Chromosome translocations and covert leukaemic clones are generated during
normal fetal development / H. Mori [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—2002.—
Vol.99. N 12.— P.8242-8247.
87
Clarkson B. Possible explanation of the high concordance for acute leukaemia in
monozygotic twins / B. Clarkson, E. Boyse // Lancet.—1971.—Vol.1.—P.699701.
88
Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute
lymphoblastic leukemia by gene expression profiling / E. Yeoh [et al.] // Cancer
Cell.—2002— Vol.1, N 2.—P.133-143.
89
Clinical and biologic features predict a poor prognosis in acute lymphoid
leukemias in infants: a Pediatric Oncology Group Study // W. Crist [et al.] //
Blood. —1986. —Vol.67, N 1.—P.135-140.
90
Clinical features, cytogenetics and outcome in acute lymphoblastic and myeloid
leukaemia of infancy: report from the MRC Childhood Leukaemia working party
/ J. Chessells [et al.] // Leukemia.—2002.—Vol.16, N 5.—P.776-784.
91
Clinical heterogeneity in childhood acute lymphoblastic leukemia with 11q23
rearrangements / C.-H. Pui [et al.] // Leukemia.—2003.—Vol.17, N 4.—P.700706.
92
Clinical outcome and monitoring of minimal residual disease in patients with
acute lymphoblastic leukemia expressing the MLL/ENL fusion gene / L. Elia [et
259
al.] // Am J Hematol.—2011.—Vol.86, N 12.—P.993-997.
93
Clinical screening of gene rearrangements in childhood leukemia by using a
multiplex polymerase chain reaction-microarray approach / T. Nasedkina [et al.]
// Clin Cancer Res.—2003.— Vol.9, N 15.—P.5620-5629.
94
Clinical significance of low levels of minimal residual disease at the end of
remission induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia / P. Stow
[et al.] // Blood.—2010.—Vol.115, N 23.—P.4657–4563.
95
Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute
lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a
Children’s Oncology Group study / M. Borowitz [et al.] // Blood.—2008.—
Vol.111, N 12.—Р.5477-5485.
96
Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute
lymphoblastic leukemia. European Organization for Research and Treatment of
Cancer-Childhood Leukemia Cooperative Group / H. Cavé [et al.] // N Engl J
Med.—1998.—Vol.339, N 9.—P.591-598.
97
Clinical significance of MLL-AF4 fusion transcript expression in the absence of
a cytogenetically detectable t(4;11)(q21;q23) chromosomal translocation / F.
Uckun [et al.] // Blood.—1998.—Vol.92, N 3.—P. 810-821.
98
Clonal, nonconstitutional rearrangements of the MLL gene in infant twins with
acute lymphoblastic leukemia: in utero chromosome rearrangement of 11q23 / H.
Gill Super [et al.] // Blood.—1994.—Vol.83, N 3.—P.641-644.
99
Cloning of ALL-1, the locus involved in leukemias with the t(4;11)(q21;q23),
t(9;11)(p22;q23), and t(11;19)(q23;p13) chromosome translocations / G. Cimino
[et al.] // Cancer Res.—1991.—Vol.51, N 24.—P.6712–6714.
100 Coexistence of alternative MLL-SEPT9 fusion transcripts in an acute myeloid
leukemia with t(11;17)(q23;q25) / J. Santos [et al.] // Cancer Genetics and
Cytogenetics.—2010.—Vol.197, N 1.—P.60-64.
260
101 Comparative analysis of MLL partial tandem duplication and FLT3 internal
tandem duplication mutations in 956 adult patients with acute myeloid leukemia /
C. Steudel [et al.] // Gene Chromosome Cancer.—2003.—Vol.37, N 3.—P.237–
251.
102 Comparison of childhood myelodysplastic syndrome, AML FAB M6 or M7,
CCG 2891: report from the Children's Oncology Group / D. Barnard [et al.] //
Pediatr Blood Cancer.—2007.—Vol.49, N 1.—P.17–22.
103 Comparison of diagnostic and relapse flow cytometry phenotypes in childhood
acute lymphoblastic leukemia: implications for residual disease detection: a
report from the Children’s Oncology Group / M. Borowitz [et al.] // Cytometry
Part B.—2005.—Vol.68B, N 1.—Р.18-24.
104 Comparison of the immunophenotype of patients with B lineage acute
lymphoblastic leukemia at diagnosis and relapse / Y. Liu [et al.] // Zhonghua Xue
Ye Xue Za Zhi.—2006.—Vol.27, N 5.—Р.335-338.
105 Computational analysis of flow cytometry antigen expression profiles in
childhood acute lymphoblastic leukemia: an MLL/AF4 identification / L. de Zen
[et al.] // Leukemia.—2003.—Vol.17, N 8.—Р.1557-1565.
106 Concept and interim result of the ALL-BFM 90 therapy study in treatment of
acute lymphoblastic leukemia in children and adolescents: the significance of
initial therapy response in blood and bone marrow / M. Schrappe [et al.] // Klin
Padiatr.—1994.—Vol.206, N 4.—P.208-221.
107 Congenital leukemia: the Dutch experience and review of the literature / D.
Bresters [et al.] // Br J Haematol.—2002.—Vol.117, N 3.—P.513-524.
108 Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome in
infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone / L.
Fechina [et al.] // Blood.—2007.—Vol.110, N 11.—P.832А.—Abstract 2828.
109 Cooperative study group for childhood acute lymphoblastic leukaemia
(COALL): long-term results of trials 82,85,89,92 and 97 / G. Escherich [et al.] //
Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.298-308.
261
110 Corticosteroid-dependent reduction of leukocyte count in blood as a prognostic
factor in acute lymphoblastic leukemia in childhood (therapy study ALL-BFM
83) / H. Riehm [et al.] // Klin. Padiatr.—1987.—Vol.199, N 3.—P.151-160.
111 Covert preleukemia driven by MLL gene fusion / J. Zuna [et al.] // Genes
Chromosomes Cancer.—2009.—Vol.48, N 1.—P.98-107.
112 Cox D. Regression models and life-tables / D. Cox // Journal of the Royal
Statistical Society. Series B.—1972.—Vol.34.—P.187-220.
113 Cryptic ins(4;11)(q21;q23q23) detected by fluorescence in situ hybridization: a
variant of t(4;11)(q21;q23) in an infant with a precursor B-cell acute
lymphoblastic leukemia report of a second case / C. Tirado [et al.] // Cancer
Genetics and Cytogenetics.—2007.—Vol.174, N 2.—P.166-169.
114 Cytogenetic abnormalities and monosomal karyotypes in children and
adolescents
with
acute
myeloid
leukemia:
correlations
with
clinical
characteristics and outcome / K. Manola [et al.] // Cancer Genet.—2013.—
Vol.206, N 3.—P.63-72.
115 Cytogenetic and FISH studies of a single center consecutive series of 152
childhood acute lymphoblastic leukemias / P. Andreasson [et al.] // Eur. J.
Haematol.—2000.—Vol.65, N 1.—P.40–51.
116 Cytogenetic and molecular heterogeneity of 7q36/12p13 rearrangements in
childhood AML / H. Simmons [et al.] // Leukemia.—2002.—Vol.16, N 12.—
P.2408–2416.
117 Cytogenetic features of infants less than 12 months of age at diagnosis of acute
lymphoblastic leukemia: impact of the 11q23 breakpoint on outcome: a report of
the Childrens Cancer Group / N. Heerema [et al.] // Blood.—1994.—Vol.83, N
8.—P.2274–2284.
118 Cytogenetic heterogeneity in t(11;19) acute leukemia: clinical, hematological and
cytogenetic analyses of 48 patients updated published cases and 16 new
observations / J.-L. Huret [et al.] // Leukemia.—1993.—Vol.7, N 2.—P.152–160.
262
119 Cytogenetic profile of childhood and adult megakaryoblastic leukemia (M7): a
study of the Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique (GFCH) / N.
Dastugue [et al.] // Blood.—2002.—Vol.100, N 2.—P.618–626.
120 Cytogenetic studies of infant acute lymphoblastic leukemia: poor prognosis of
infants with t(4;11) - a report of the Children's Cancer Group / N. Heerema [et
al.] // Leukemia.—1999.—Vol.13, N 5.—P.679-686.
121 Cytogenetics of childhood acute myeloid leukemia: United Kingdom Medical
Research Council Treatment trials AML 10 and 12 / C. Harrison [et al.] // J. Clin.
Oncol.—2010.—Vol.28, N 16— P.2674-2681.
122 de Boer J. In focus: MLL-rearranged leukemia / J. de Boer, V. WalfVorderwülbecke, O. Williams // Leukemia.—2013.—Vol.27, N 6.—P.12241228.
123 De novo acute myeloid leukemia associated with t(11;17)(q23;q25) and MLLSEPT9 rearrangement in an elderly patient: a case study and review of the
literature / S. Lee [et al.] // Acta Haematol.—2011.—Vol.126, N 4.—P.195-198.
124 Del(5q) in acute lymphoblastic leukemia with biphenotypic and early progenitor
phenotype / C. Theodossiou [et al.] // Cancer Genetics and Cytogenetics.—
1992.—Vol.63, N 2.—P.89–94.
125 Deregulated expression of EVI1 defines a poor prognostic subset of MLLrearranged acute myeloid leukemias: a study of the German-Austrian Acute
Myeloid Leukemia Study Group and the Dutch-Belgian-Swiss HOVON/SAKK
Cooperative Group / S. Gröschel [et al.] // J Clin Oncol.—2013.—Vol.31, N 1.—
P.95–103.
126 Detection of acute leukemia cells with mixed lineage leukemia (MLL) gene
rearrangements by flow cytometry using monoclonal antibody 7.1/ C. Wuchter
[et al.] // Leukemia.—2000.—Vol.14, N 7.—Р.1232-1238.
127 Detection of cryptic MLL insertions using a commercial dual-color fluorescence
in situ hybridization probe / M. Dyson [et al.] // Cancer Genetics and
Cytogenetics.—2003.—Vol.147, N 1.—P.81–83.
263
128 Detection of gene rearrangements in targeted clinical next-generation sequencing
/ H. Abel [et al.] // J Mol Diagn.—2014.—Vol.16, N 4.—P.405-417.
129 Detection of major BCR-ABL gene expression at a very low level in blood cells
of some healthy individuals / C. Biernaux [et al.] // Blood.—1995.—Vol.86, N
8.—P.3118-3122.
130 Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time
quantitative PCR: principles, approaches, and laboratory aspects / V. van der
Velden [et al.] // Leukemia.—2003.—Vol.17, N 6.—P.1013-1034.
131 Diagnostic cerebrospinal fluid examination in children with acute lymphoblastic
leukemia: significance of low leukocyte counts with blasts or traumatic lumbar
puncture / B. Bürger [et al.] // J. Clin. Oncol.—2003.—Vol.21, N 2.—P.184–
188.
132 Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown
partner genes / C. Meyer [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—2005.—Vol.102,
N. 2.—P.449–454.
133 Differential mRNA expression of Ara-C–metabolizing enzymes explains Ara-C
sensitivity in MLL gene-rearranged infant acute lymphoblastic leukemia / R.
Stam [et al.] // Blood.—2003.—Vol.101, N 4.—P.1270–1276.
134 Dimerization of MLL fusion proteins immortalizes hematopoietic cells / M.
Martin [et al.] // Cancer Cell.— 2003.—Vol.4, N 3.—P.197–207.
135 Discordance of MLL-rearranged (MLL-R) infant acute lymphoblastic leukemia in
monozygotic twins with spontaneous clearance of preleukemic clone in
unaffected twin / M. Chuk [et al.] // Blood.—2009.—Vol.113, N 26.—P.66916694.
136 Distinctive IGH gene segment usage and minimal residual disease detection in
infant acute lymphoblastic leukaemias / A. Li [et al.] // Br J Haematol.—2005.—
Vol.131, N 2.—P.185-192.
137 DNA copy-number abnormalities do not occur in infant ALL with t(4;11)/MLLAF4 / M. Bardini [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 1.—P.169-176.
264
138 Does ATRA confirm to play a role in the better relapse free survival of infants
with acute lymphoblastic leukemia? // L. Fechina [et al.] // Blood.—2011.—
Vol.118, N 21.—Abstract 1515.
139 DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated
leukemogenesis / A. Nguyen [et al.] // Blood.—2011.—Vol.117, N 25.—
P.6912–6922.
140 DOT1L/KMT4 recruitment and H3K79 methylation are ubiquitously coupled
with gene transcription in mammalian cells / D. Steger [et al.] // Mol Cell Biol.—
2008.—Vol.28, N 8.—P.2825-2839.
141 Ectopic expression of the HLXB9 gene is associated with an altered nuclear
position in t(7;12) leukemias / E. Ballabio [et al.] // Leukemia.—2009.—Vol.23,
N 6.—P.1179–1182.
142 Elevated AF1q expression is a poor prognostic marker for adult acute myeloid
leukemia patients with normal cytogenetics / C. Strunk [et al.] // Am J
Hematol.—2009.—Vol.84, N 5.—P.308-309.
143 Elevated expression of the AF1q gene, an MLL fusion partner, is an independent
adverse prognostic factor in pediatric acute myeloid leukemia / W. Tse [et al.] //
Blood.—2004.—Vol.104, N 10.—P.3058–3063.
144 Emergence of two unrelated clones in acute myeloid leukemia with MLL-SEPT9
fusion transcript / H. Saito [et al.] // Cancer Genetics and Cytogenetics.—
2010.—Vol.201, N 2.—P.111–115.
145 Ensemble genome browser 75: Homo sapiens – Summary – Gene: CEP164
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000110274;
r=11:117185273-117283984 (дата обращения 21.12.2013).
146 Ensemble genome browser 75: Homo sapiens – Summary – Gene: EPS15
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000085832;
r=1:51819935-51985000 (дата обращения 12.12.2013).
265
147 Ensemble genome browser 75: Homo sapiens – Summary – Gene: MLLT11
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Splice?g=ENSG00000213190;r=1
:151030234-151040970;t=ENST00000368921 (дата обращения 21.12.2013).
148 Ensemble genome browser 75: Homo sapiens – Summary – Gene: SEPT6
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?g=ENSG00000125354;
r=X:118749687-118827333 (дата обращения 14.12.2013).
149 Epidermal growth factor pathway substrate 15, Eps15 / A. Salcini [et al.] //
International Journal of Biochemistry and Cell Biology.—1999.—Vol.31, N 8.—
P.805-809.
150 Estey E. Acute myeloid leukemia: 2013 update on risk-stratification and
management / E. Estey // Am J Hematol.—2013.—Vol.88, N 4.—P.318-327.
151 ETV6-RUNX1-positive childhood acute lymphoblastic leukemia: improved
outcome with contemporary therapy / D. Bhojwani [et al.] // Leukemia.—
2012.—Vol.26, N 2.—P.265-270.
152 Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease
detection in leukemic patients using ‘real-time’ quantitative reverse-transcriptase
polymerase chain reaction (RQ-PCR)–a Europe Against Cancer Program / E.
Beillard [et al.] // Leukemia.—2003.—Vol.17. N 12.—P. 2474-2486.
153 Evaluation of minimal residual disease (MRD) by quantification of TEL-AML1
transcripts is a powerful prognostic tool in children with t(12;21) positive acute
lymphoblastic leukemia (ALL) / J.-M. Cayuela [et al.] // Blood.—2004.—
Vol.104, N 11.—Abstract 322.
154 Evi-1 is a transcriptional target of mixed-lineage leukemia oncoproteins in
hematopoietic stem cells / S. Arai [et al.] // Blood.—2011.—Vol.117, N 23.—
P.6304–6314.
155 EVI1 is critical for the pathogenesis of a subset of MLL-AF9-rearranged AMLs /
E. Bindels [et al.] // Blood.—2012.—Vol.119, N 24.—P.5838–5849.
266
156 Exon/intron structure of ALL1 (MLL) gene involved in translocations to
chromosomal region 11q23 and acute leukemias / I. Nilson [et al.] // British
Journal of Haematology.—1996.—Vol.94, N 4.— P.966-972.
157 Exon/intron structure of the human AF-4 gene, a member of the AF-4/LAF4/FMR-2 gene family coding for a nuclear protein with structural alterations in
acute leukaemia / I. Nilson I [et al.] // British Journal of Haematology.—1997.—
Vol.98, N 1.—P.157-169.
158 Expression of cell-cell interacting genes distinguishes HLXB9/TEL from MLLpositive childhood acute myeloid leukemia / S. Wildenhain [et al.] //
Leukemia.—2010.—Vol. 24, N 9.—P.1657–1660.
159 Expression of the human homologue of rat NG2 in adult acute lymphoblastic
leukemia: close association with MLL rearrangements and a CD10-/CD24/CD65s+/CD15+ B-cell immunophenotype / S. Schwartz [et al.] // Leukemia.—
2003.—Vol.17, N 8.—Р.1589-1595.
160 Expression pattern of the septin gene family in acute myeloid leukemias with and
without MLL-SEPT fusion genes / J. Santos [et al.] // Leuk Res.—2010.—
Vol.34, N 5.—P.651-621.
161 Favorable impact of the t(9;11) in childhood acute myeloid leukemia / J. Rubnitz
[et al.] // J Clin Oncol.—2002.—Vol.20, N 9.—P.2302-2309.
162 Favorable outcome in infants with AML after intensive first- and second-line
treatment: an AML-BFM study group report / U. Creutzig [et al.] // Leukemia.—
2012.—Vol.26, N 4.—P.654–661.
163 Felix C. Leukemia in infants / C. Felix, B. Lange // Oncologist.—1999.—Vol.4,
N 3.—P.225-240.
164 Flow cytometry and IgH/TCR quantitative PCR for minimal residual disease
quantitation in acute lymphoblastic leukemia: a French multicenter prospective
study on behalf of the FRALLE, EORTC and GRAALL / R. Garand [et al.] //
Leukemia.—2013.—Vol.27, N 2.—P.370-376.
267
165 Fluorescence in situ hybridization characterization of new translocations
involving TEL (ETV6) in a wide spectrum of hematologic malignancies / I.
Wlodarska [et al.] // Blood.—1998.—Vol.91, N 4.—P.1399–1406.
166 Forestier E. The incidence peaks of the childhood acute leukemias reflect
specific cytogenetic aberrations / E. Forestier, K. Schmiegelow // J Pediatr
Hematol Oncol.—2006.—Vol.28 N 8.—P.486-495.
167 Frequency and clinical significance of the MLL gene rearrangements in infant
acute leukemia / T. Taki [et al.] // Leukemia.—1996.—Vol.10, N 8.—P.13031307.
168 Functional analysis of the two reciprocal fusion genes MLL-NEBL and NEBLMLL reveal their oncogenic potential / M. Emerenciano [et al.] // Cancer Lett.—
2013.—Vol.332, N 1.—P.30–34.
169 Fusion genes in cord blood / M. Greaves [et al.] // Blood.—2011—Vol.117, N
1.—P.369-370.
170 Fusion of an AF4-related gene, LAF4, to MLL in childhood acute lymphoblastic
leukemia with t(2;11)(q11;q23) / M. Hiwatari [et al.] // Oncogene.—2003.—
Vol.22, N 18.—P.2851-2855.
171 Fusion of MLL and MSF in adult de novo acute myelomonocytic leukemia (M4)
with t(11;17)(q23;q25) / K. Yamamoto [et al.] // Int. J Hematol.—2002.—
Vol.75, N 5.—P.503-507.
172 Gene expression profile analysis of an isogenic tumour metastasis model reveals
a functional role for oncogene AF1Q in breast cancer metastasis / D. Li [et al.] //
Eur J Cancer.—2006.—Vol.42, N 18.—P.3274–3286.
173 Gene expression profiling of pediatric acute myelogenous leukemia / M. Ross [et
al.] // Blood.—2004.—Vol.104, N 12.—P.3679–3687.
174 Gene expression profiling–based dissection of MLL translocated and MLL
germline acute lymphoblastic leukemia in infants / R. Stam [et al.] // Blood.—
2010.—Vol.115, N 14.—P.2835-2844.
268
175 Gene expression signatures in MLL-rearranged T-lineage and B-precursor acute
leukemias: dominance of HOX dysregulation / A. Ferrando [et al.] // Blood.—
2003.—Vol.102, N 1.—P.262-268.
176 GeneCards - AF4/FMR2 Family, Member 3 (AFF3) gene [Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.genecards.org/cgi-
bin/carddisp.pl?gene=AFF3 (дата обращения 01.10.2013).
177 GeneCards – Centrosomal Protein 164kDa (CEP164) gene [Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.genecards.org/cgi-
bin/carddisp.pl?gene=CEP164 (дата обращения 02.12.2013).
178 GeneCards - Epidermal Growth Factor Receptor Pathway Substrate 15 (EPS15)
gene [Электронный ресурс] // Режим доступа: http://www.genecards.org/cgibin/carddisp.pl?gene=EPS15 (дата обращения 12.12.2013).
179 GeneCards – Myeloid/Lymphoid Or Mixed-Lineage Leukemia (Trithorax
Homolog, Drosophila); Translocated To, 11 (MLLT11) gene [Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://www.genecards.org/cgi-
bin/carddisp.pl?gene=MLLT11 (дата обращения 01.12.2013).
180 GeneCards – Septin 6 (SEPT6) gene [Электронный ресурс] // Режим доступа:
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SEPT6 (дата обращения
02.12.2013).
181 GeneLoc: Display cytogenetic boundaries [Электронный ресурс] // Режим
доступа:
http://genecards.weizmann.ac.il/geneloc-bin/display_bands.pl (дата
обращения 15.12.2013).
182 Genes on chromosomes 4, 9, and 19 involved in 11q23 abnormalities in acute
leukemia share sequence homology and/or common motifs / T. Nakamura [et al.]
// Proc Natl Acad Sci USA.—1993.—Vol.90, N 10.—P.4631-4635.
183 Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia /
C. Mullighan [et al.] // Nature.—2007.—Vol.446.—P.758–764.
184 Genomic DNA of leukemic patients: target for clinical diagnosis of MLL
rearrangements / C. Meyer [et al.] // Biotechnol J.—2006.—Vol.1, N 6.—P.656-
269
663.
185 Genomic organization, complex splicing pattern and expression of a human
septin gene on chromosome 17q25.3 / M. McIlhatton [et al.] //Oncogene.—
2001.—Vol.20, N 41.—P.5930–5939.
186 Good correlation between RT-PCR analysis and relapse in Philadelphia (Ph1)positive acute lymphoblastic leukemia (ALL) / C. Preudhomme [et al.] //
Leukemia.—1997.—Vol.11, N 2.—P.294–298.
187 Gould A. Functions of mammalian polycomb group and trithorax group related
genes / A. Gould // Curr Opin Genet Dev.—1997.—Vol.7, N 4.—P.488–494.
188 Graft versus leukemia effect after haploidentical HSCT in a MLL-negative infant
AML with HLXB9/ETV6 rearrangement / J. Hauer [et al.] // Pediatr. Blood
Cancer.—2008.—Vol.50, N 4.—P.921–923.
189 Granulocytic sarcoma in MLL-positive infant acute myelogenous leukemia:
fluorescence in situ hybridization study of childhood acute myelogenous
leukemia for detecting MLL rearrangement / K. Park [et al.] // Am J Pathol.—
2001.—Vol.159, N 6.—P.2011-2016.
190 Greaves M. Infant leukemia biology, aetiology and treatment / M. Greaves //
Leukemia. —1996. —Vol.10, N 2. —P.372-377.
191 Gurney J. Cancer among infants. / J. Gurney, M. Smith, J. Ross // Cancer
Incidence and Survival among Children and Adolescents: United States SEER
Program 1975-1995 / eds. L. Ries, M. Smith, J. Gurney, M. Linet, T. Tamra, J.
Young, G. Bunin.— Bethesda, 1999.—P.149-156.
192 H3K79 methylation profiles define murine and human MLL-AF4 leukemias / A.
Krivtsov [et al.] // Cancer Cell.—2008.—Vol.14, N 5.—P.355-368.
193 Haas O. Cytogenetic abnormalities associated with childhood acute myeloblastic
leukemia / O. Haas, M. Kronberger, L. Mayerhofer // Recent Results Cancer Res
1993.—Vol.131.—P.103–112.
194 Hall P. The pathobiology of the septin gene family / P. Hall, S. Russell // J
Pathol.—2004.—Vol.204, N 4.—P.489-505.
270
195 hDOT1L links histone methylation to leukemogenesis / Y. Okada [et al.] //
Cell.—2005.—Vol.121, N 2.—P.167–178.
196 Hematologic malignancies with t(4;11)(q21;q23) - a cytogenetic, morphologic,
immunophenotypic and clinical study of 183 cases. European 11q23 Workshop
participants / B. Johansson [et al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 5.—P.779787.
197 Hematological malignancies with a deletion of 11q23: cytogenetic and clinical
aspects / J. Harbott [et al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 5.—P.823–827.
198 Hematological malignancies with t(9;11)(p21-22;q23)-a laboratory and clinical
study of 125 cases. European 11q23 Workshop participants / G. Swansbury [et
al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 5.—P.792-800.
199 Hemenway C. The polycomb protein MPc3 interacts with AF9, an MLL fusion
partner in t(9;11)(p22;q23) acute leukemias / C. Hemenway, A. de Erkenez, G.
Gould // Oncogene.—2001.—Vol.20, N 29.—P.3798–3805.
200 Hess J. MLL: a histone methyltransferase disrupted in leukemia / J. Hess //
Trends in Molecular Medicine.—2004.—Vol.10, N 10.—P.500-507.
201 Heterogeneity of breakpoints of 11q23 rearrangements in hematologic
malignancies identified with fluorescence in situ hybridization / H. Kobayashi [et
al.] // Blood.—1993.—Vol.82, N 2—P.547-551.
202 Heterogeneity of the 7q36 breakpoints in the t(7;12) involving ETV6 in infant
leukemia / S. Tosi [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—2003.—Vol.38, N
2.—P.191–200.
203 High incidence of t(7;12)(q36;p13) in infant AML but not in infant ALL, with a
dismal outcome and ectopic expression of HLXB9 / A. von Bergh [et al.] //
Genes Chromosomes Cancer.— 2006.—Vol.45, N 8.—P.731–739.
204 High survival rate in infant acute leukemia treated with early high-dose
chemotherapy and stem-cell support. Groupo Español de Trasplante de Médula
Osea en Niños / F. Marco [et al.] // J. Clin. Oncol.—2000.—Vol.18, N 18.—
P.3256–3261.
271
205 High-resolution genomic profiling of childhood ALL reveals novel recurrent
genetic lesions affecting pathways involved in lymphocyte differentiation and
cell cycle progression / R. Kuiper [et al.] // Leukemia.—2007.—Vol.21, N 6.—
P.1258–1266.
206 Histone H3 lysine 79 methyltransferase Dot1 is required for immortalization by
MLL oncogenes / M. Chang [et al.] // Cancer Res.—2010.—Vol.70, N 24.—
P.10234–10242.
207 Hrusak O. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias /
O. Hrusak, A. Porwit-MacDonald // Leukemia.—2002.—Vol.16, N 7.—P.12331258.
208 Hsieh J. Taspase1: a threonine aspartase required for cleavage of MLL and
proper HOX gene expression / J. Hsieh, E. Cheng, S. Korsmeyer // Cell.—
2003.—Vol.115, N 3.—P.293–303.
209 HUGO gene nomenclature committee [Электронный ресурс] // Режим
доступа: www.genenames.org (дата обращения 03.02.2014).
210 Human chromosomal bands nested structure high-definition map and molecular
basis / M. Costantini [et al.] // Chromosoma.—2007.—Vol.116, N 1.—P.29–40.
211 Human homologue of the rat chondroitin sulfate proteoglycan, NG2, detected by
monoclonal antibody 7.1, identifies childhood acute lymphoblastic leukemias
with t(4;11)(q21;q23) or t(11;19)(q23;p13) and MLL gene rearrangements / F.
Behm [et al.] // Blood.—1996.—Vol.87, N 3.—P.1134-1139.
212 Huret J.-L. t(1;11)(p32;q23) / J.-L. Huret // Atlas Genet Cytogenet Oncol
Haematol (September 2010), [Электронный ресурс] // Режим доступа:
http://AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/t0111p32q23ID1046.html
(дата
обращения 14.01.2014).
213 Hypermethylation of specific microRNA genes in MLL-rearranged infant acute
lymphoblastic leukemia: major matters at a micro scale / D. Stumpel [et al.] //
Leukemia.—2011.—Vol.25, N 3.—P.429-439.
272
214 Identification of a gene, MLL, that spans the breakpoint in 11q23 translocations
associated with human leukemias / S. Ziemin-van der Poel [et al.] // Proc Natl
Acad Sci USA.—1991.—Vol.88, N 23.—P.10735–10739.
215 Identification of low risk group in infants with acute lymphoblastic leukemia by
flow cytometric minimal residual disease measurement at day 15 of Interfant-99
and Interfant-06 protocols treatment / A. Popov [et al.] // Blood.—2013.—
Vol.122, N 21.—Abstract 1333.
216 Identification of new partner chromosomes involved in fusions with the ETV6
(TEL) gene in hematologic malignancies / S. Tosi [et al.] // Genes Chromosomes
Cancer.—1998.—Vol.21, N 3.—P.223–229.
217 Identification of various MLL gene aberrations that lead to MLL gene mutation
in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) and infants with acute
leukemia / A. Pais [et al.] // Leukemia Research.—2005.—Vol.29, N 5.—P.517–
526.
218 IKZF1 deletion is an independent predictor of outcome in pediatric acute
lymphoblastic leukemia treated according to the ALL-BFM 2000 protocol / P.
Dörge [et al.] // Haematologica.—2013.— Vol.98, N 3.—P.428-432.
219 Immunobiological diversity in infant acute lymphoblastic leukemia is related to
the occurrence and type of MLL gene rearrangement / M. Jansen [et al.] //
Leukemia.—2007.—Vol.21, N 4.—Р. 633-641.
220 Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a
consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10 / M.-C.
Béné [et al.] // Leukemia.—2011.—Vol.25, N 4.—P.567-574.
221 Impairing MLL-fusion gene mediated transformation by dissecting critical
interactions with the lens epithelium-derived growth factor (LEDGF/p75) / H.
Méreau [et al.] // Leukemia.—2013.—Vol.27, N 6.—P.1245-1253.
222 Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: results of
Dana-Farber Consortium Protocol 91-01 / L. Silverman [et al.] // Blood.—
2001.—Vol.97, N 5.—P.1211-1218.
273
223 Improved outcome with hematopoietic stem cell transplantation in a poor
prognostic subgroup of infants with mixed-lineage-leukemia (MLL)-rearranged
acute lymphoblastic leukemia: results from the Interfant-99 Study / G. Mann [et
al.] // Blood.—2010.—Vol.116, N 15.—P.2644-2650.
224 Improved survival for acute lymphoblastic leukaemia in infancy: the experience
of EORTC-Childhood Leukaemia Cooperative Group / A. Ferster [et al.] // Br J
Haematol.—1994.—Vol.86, N 2.—P.284–290.
225 Improved treatment results in childhood acute myelogenous leukemia: a report of
the German cooperative study AML-BFM-78 / U. Creutzig [et al.] // Blood.—
1985.—Vol.65, N 2.—P.298–304.
226 Improvement of molecular monitoring of residual disease in leukemias by
bedside RNA stabilization / M. Müller [et al.] // Leukemia.—2002.—Vol.16, N
12.—P.2395–2399.
227 In utero rearrangements in the trithorax-related oncogene in infant leukaemias /
A. Ford [et al.] // Nature.—1993.—Vol.363.—P.358–360.
228 Incidence and clinical relevance of TEL/AML1 fusion genes in children with
acute lymphoblastic leukemia enrolled in the German and Italian multicenter
therapy trials. Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica and the
Berlin-Frankfurt-Münster Study Group / A. Borkhardt [et al.] // Blood.—1997.—
Vol. 90, N 2.—P.571-577.
229 Incidence and outcome of TCF3-PBX1-positive acute lymphoblastic leukemia in
Austrian children / L. Kager [et al.] // Haematologica.—2007.—Vol.92, N 11.—
P.1561-1564.
230 Increased AF1q gene expression in high-risk myelodysplastic syndrome / W. Tse
[et al.] // Br J Haematol.—2005.—Vol.128, N 2.—P.218–220.
231 Infant
acute
lymphoblastic
leukemia
-
combined
cytogenetic,
immunophenotypical and molecular analysis of 77 cases / A. Borkhardt [et al.] //
Leukemia.—2002.—Vol.16, N 9.—P.1685-1690.
274
232 Infant B-Cell precursor acute lymphoblastic leukemia: comparison of
immunophenotypes at diagnosis and relapse / A. Popov [et al.] // Cytometry Part
A.—Proceedings of the XXIX National Conference of the Italian Society of
Cytometry GIC.—2011.—Vol.79A, N 12.—P.1052.
233 Infant leukemia in Japan: clinical and biological analysis of 48 cases / E. Ishii [et
al.] // Med Pediatr Oncol.—1991.—Vol.19, N 1.—P.28-32.
234 Infants with acute lymphoblastic leukemia and a germline MLL gene are highly
curable with use of chemotherapy alone: results from the Japan Infant Leukemia
Study Group / J. Nagayama [et al.] // Blood.—2006.—Vol.107, N 12.—P.46634665.
235 Infants with acute myeloid leukemia treated according to the Associazione
Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica 2002/01 protocol have an outcome
comparable to that of older children / R. Masetti [et al.] // Haematologica.—
2014.—Vol.99, N 8.—e127-e129.
236 Inhibition of BET recruitment to chromatin as an effective treatment for MLLfusion leukemia / M. Dawson [et al.] // Nature.—2011.—Vol.478.—P.529–533.
237 Intensified therapy for infants with acute lymphoblastic leukemia: results from
the Dana-Farber Cancer Institute Consortium / L. Silverman [et al.] // Cancer.—
1997.—Vol.80, N 12.—P.2285-2295.
238 Intensive alternating drug pairs after remission induction for treatment of infants
with acute lymphoblastic leukemia: A Pediatric Oncology Group pilot study / S.
Lauer [et al.] //J Pediatr Hematol Oncol.—1998.—Vol.20, N 3.—P.229-233.
239 Interaction of AF4 wild-type and AF4-MLL fusion protein with SIAH proteins:
indication for t(4;11) pathobiology? / A. Bursen [et al.] // Oncogene.—2004.—
Vol.23. N 37.—P.6237–6249.
240 Interaction of MLL amino terminal sequences with menin is required for
transformation / C. Caslini [et al.] // Cancer Res.—2007.—Vol.67, N 15.—
P.7275–7283.
241 Isaacs H. Jr. Fetal and neonatal leukemia / H. Isaacs Jr // J Pediatr Hematol
275
Oncol.—2003.—Vol.25, N 5.—P.348-361.
242 ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature
(1995) / Ed. F. Mitelman.—Basel: Karger.—1995.—117p.
243 ISCN 2005: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature
(2005) / Eds: L. Shaffer, N. Tommerup— Basel: Karger.—2005.—130p.
244 ISCN 2009: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature
(2009) / Eds: L. Schaffer, M. Slovak, L. Campbell—Basel: Karger.—2009.—
138p.
245 ISCN 2013: An International System For Human Cytogenetic Nomenclature
(2013) / Eds: L. Schaffer, J. McGovan-Jordan, M. Schmid—Basel: Karger.—
2013—140p.
246 Jansen M. Efficient and easy detection of MLL-AF4, MLL-AF9 and MLL-ENL
fusion gene transcripts by multiplex real-time quantitative RT-PCR in TaqMan
and LightCycler / M. Jansen, V. van der Velden, J. van Dongen // Leukemia.—
2005.—Vol.19, N 11.—P.2016–2016.
247 Kaplan E. Non-parametric estimation from incomplete observations / E. Kaplan,
P. Meier // Journal of American Statistic Assoc.—1958.—Vol.53.—P.457–481.
248 Keshava C. Transcriptional signatures of environmentally relevant exposures in
normal human mammary epithelial cells: benzo[a]pyrene / C. Keshava, D.
Whipkey, A. Weston //Cancer Lett.—2005.—Vol.221, N 2.—P.201–211.
249 Knudson A. Stem cell regulation, tissue ontogeny, and oncogenic events / A.
Knudson // Semin Cancer Biol.—1992.—Vol.3, N 3.—P.99-106.
250 Krendel M. Myosins: tails (and heads) of functional diversity / M. Krendel, M.
Mooseker // Physiology (Bethesda).—2005.—Vol.20.—P.239-251.
251 Lack of expression of the chondroitin sulphate proteoglycan neuron-glial antigen
2
on
candidate
stem
cell
population
in
pediatric
acute
myeloid
leukemia/abn(11q23) and lymphoblastic leukemia/t(4;11) / J. Neudenberger [et
al.] // Br. J. Haematol.—2006.—Vol.133, N 3.—Р.337-344.
252 LAF4, an AF4-related gene, is fused to MLL in infant acute lymphoblastic
276
leukemia / A. von Bergh [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—2002.—
Vol.35, N 1.—P.92-96.
253 Late MRD response determines relapse risk overall and in subsets of childhood
T-cell ALL: results of the AIEOP-BFM-ALL 2000 study / M. Schrappe [et al.] //
Blood.—2011.—Vol.118, N 8.—P.2077–2084.
254 Lawrie C. MicroRNAs and haematology: small molecules, big function/ C.
Lawrie // British Journal of Haemotology.—2007.—Vol.137, N 6.—P.503-512.
255 Leukaemia incidence and survival in children and adolescents in Europe during
1978–1997. Report from the Automated Childhood Cancer Information System
project / J. Coebergh [et al.] // European journal of cancer.—2006.—Vol.42, N
13.—P.2019–2036.
256 Leukemia in twins: lessons in natural history / M. Greaves [et al.] // Blood.—
2003.—Vol.102, N 7.—P.2321-2333.
257 Leukemia proto-oncoprotein MLL forms a SET1-like histone methyltransferase
complex with menin to regulate Hox gene expression / A. Yokoyama [et al.] //
Mol Cell Biol.—2004.—Vol.24, N 13.—P.5639–5649.
258 Leukemic transformation by the MLL-AF6 fusion oncogene requires the H3K79
methyltransferase Dot1l / A. Deshpande [et al.] // Blood.—2013.—Vol.121, N
13.—P.2533–2541.
259 Lion T. Acute megakaryocytic leukemia with the t(1;22)(p13;q13) / T. Lion, O.
Haas // Leuk Lymphoma.—1993.—Vol.11, N 1-2.—P.15-20.
260 Long-term results in children with AML: NOPHO-AML Study Group – report of
three consecutive trials / S. Lie [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—
P.2090–2100.
261 Long-term results of children with acute myeloid leukemia: a report of three
consecutive Phase III trials by the Children’s Cancer Group: CCG 251, CCG 213
and CCG 2891 / F. Smith [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—P.2054–
2062.
262 Long-term results of Dana-Farber Cancer Institute ALL Consortium protocols
277
for children with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia (1985–2000) /
L. Silverman [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.320-334.
263 Long-term results of Dutch Childhood Oncology Group studies for children with
acute lymphoblastic leukemia from 1984 to 2004 / W. Kamps [et al.] //
Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.309-319.
264 Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic
leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000 / A.
Möricke [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.265-284.
265 Long-term results of NOPHO ALL-92 and ALL-2000 studies of childhood acute
lymphoblastic leukemia / K. Schmiegelow [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24,
N 2.—P.345-354.
266 Long-term results of St Jude Total Therapy Studies 11, 12, 13A, 13B, and 14 for
childhood acute lymphoblastic leukemia // C.-H. Pui [et al.] // Leukemia.—
2010.—Vol.24, N 2.—P.371-382.
267 Long-term results of Taiwan Pediatric Oncology Group studies 1997 and 2002
for childhood acute lymphoblastic leukemia / D.-C. Liang [et al.] // Leukemia.—
2010.—Vol.24, N 2.—P.397-405
268 Long-term results of the children's cancer group studies for childhood acute
lymphoblastic leukemia 1983–2002: A Children's Oncology Group Report / P.
Gaynon [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.285-297.
269 Long-term results of the Italian Association of Pediatric Hematology and
Oncology (AIEOP) Studies 82, 87, 88, 91 and 95 for childhood acute
lymphoblastic leukemia / V. Conter [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N
2.—P.255-264.
270 Long-term results of the Japanese Childhood Cancer and Leukemia Study Group
studies 811, 841, 874 and 911 on childhood acute lymphoblastic leukemia / M.
[et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.335-344.
271 Long-term results of the pediatric oncology group studies for childhood acute
lymphoblastic leukemia 1984–2001: a report from the Children's Oncology
278
Group / W. Salzer [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 2.—P.355-370.
272 Long-term results of Tokyo Children's Cancer Study Group trials for childhood
acute lymphoblastic leukemia, 1984–1999 / M. Tsuchida [et al.] // Leukemia.—
2010.—Vol.24, N 2.—P.383-396.
273 Low frequency of clonotypic Ig and T-cell receptor gene rearrangements in
t(4;11) infant acute lymphoblastic leukaemia and its implication for the detection
of minimal residual disease / M. Peham [et al.] // British Journal of
Haematology.—2002.—Vol.117, N 2.—P.315–321.
274 Low frequency of MLL-partial tandem duplications in paediatric acute myeloid
leukaemia using MLPA as a novel DNA screenings technique / B. Balgobind [et
al.] // European Journal of Cancer.—2010.—Vol.46, N 10.—P.1892–1899.
275 Ma C. LAF-4 encodes a lymphoid nuclear protein with transactivation potential
that is homologous to AF-4, the gene fused to MLL in t(4;11) leukemias / C. Ma,
L. Staudt // Blood.—1996.—Vol.87.—P.734-745.
276 Manola K. Cytogenetics of pediatric acute myeloid leukemia / K. Manola //
European Journal of Haematology.—2009.—Vol.83, N 5.—P.391–405.
277 Marked improvements in outcome with chemotherapy alone in paediatric acute
myeloid leukemia: results of the United Kingdom Medical Research Council’s
10th AML trial. MRC Childhood Leukaemia Working Party / R. Stevens [et al.] //
Br J Haematol.—1998.—Vol.101, N 1.—P.130–140.
278 Martinez-Climent J. Chromosomal rearrangements in childhood acute myeloid
leukemia and myelodysplastic syndromes / J. Martinez-Climent, J. Garcia-Conde
// J. Pediatr. Hematol. Oncol.—1999.—Vol.21, N 2.—P.91–102.
279 Menin and MLL cooperatively regulate expression of cyclin-dependent kinase
inhibitors / T. Milne [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—2005.—Vol.102, N
3.—P.749–754.
280 Minimal residual disease-directed risk stratification using real-time quantitative
PCR analysis of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in the
international multicenter trial AIEOP-BFM ALL 2000 for childhood acute
279
lymphoblastic leukemia / T. Flohr [et al.] // Leukemia.—2008.—Vol.22 N 4.—
Р.771 -782.
281 Minimal residual disease–guided treatment deintensification for children with
acute lymphoblastic leukemia: results from the Malaysia-Singapore acute
lymphoblastic leukemia 2003 study / A. Yeoh [et al.] // Journal of Clinical
Oncology.—2012.—Vol.30, N 19.—P.2384-2392.
282 miR-196b directly targets both HOXA9/MEIS1 oncogenes and FAS tumor
suppressor in MLL-rearranged leukaemia / Z. Li [et al.] // Nature
Communications.—2012.—Vol.2.—Article 688.
283 MiR-495 is a tumor-suppressor microRNA down-regulated in MLL-rearranged
leukemia / X. Jiang [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—2012.—Vol.109, N
47.—P.19397–19402.
284 Misguided transcriptional elongation causes mixed lineage leukemia / D. Mueller
[et al.] // PLoS Biol.—2009.—Vol.7, N 11.—e1000249.
285 Mitelman F. Mitelman database of chromosome aberrations and gene fusions in
cancer (2014) / F. Mitelman, B. Johansson, F. Mertens [Электронный ресурс] //
Режим
доступа:
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman
(дата
обращения 14.01.2014).
286 Mixed Lineage Leukemia – rearranged childhood pro-B and CD10-negative preB acute lymphoblastic leukemia constitute a distinct clinical entity / A.
Attarbaschi, [et al.] // Clin. Cancer Res.—2006.—Vol.12, N 10.—P.2988-2994.
287 MLL gene rearrangement, cytogenetic 11q23 abnormalities, and expression of
the NG2 molecule in infant acute myeloid leukemia / J. Hilden [et al.] //
Blood.—1997.—Vol.89, N 10.—P.3801–3805.
288 MLL gene rearrangements in infant leukemia vary with age at diagnosis and
selected demographic factors: a Children’s Oncology Group (COG) study / T.
Sam [et al.] // Pediatr Blood Cancer.—2012.—Vol.58, N 6.—P.836–839.
289 MLL genomic breakpoint distribution within the breakpoint cluster region in de
novo leukemia in children / C. Felix [et al.] // J. Pediatr. Hematol. Oncol.—
280
1998.—Vol.20, N 4.— P.299-308.
290 MLL is involved in a t(2;11)(p21;q23) in a patient with acute myeloblastic
leukemia / E. Fleischman [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—1999.—
Vol.24, N 2.—P.151–155.
291 MLL partial tandem duplication induces aberrant Hox expression in vivo via
specific epigenetic alterations / A. Dorrance [et al.] // J Clin Invest.—2006.—
Vol. 116, N 10.—P.2707–2716.
292 MLL rearrangements in pediatric acute lymphoblastic and myeloblastic
leukemias: MLL specific and lineage specific signatures / A. Zangrando [et al.] //
BMC Med Genomics.—2009—Vol.2.—Article 36.
293 MLL translocations specify a distinct gene expression expression profile that
distinguishes a unique leukemia / S. Armstrong [et al.] // Nature Genet.—
2002.—Vol.30, N 1.—P.41-47.
294 MLL translocations with concurrent 3’ deletions: interpretation of FISH results /
K. Barber [et al.] // Genes Chromosomes and Cancer.—2004.—Vol.41, N 3.—
P.266–271.
295 MLL/SEPTIN6 chimeric transcript from inv ins(X;11)(q24;q23q13) in acute
monocytic leukemia: report of a case and review of the literature / H Kim [et al.]
// Genes Chromosomes Cancer.—2003.—Vol.38, N 1.—P.8–11.
296 MLL-AF1q fusion resulting from t(1;11) in acute leukemia / M. Busson-Le
Coniat [et al.] // Leukemia.—1999.—Vol.13, N 2.—P.302–306.
297 MLL-AF9-mediated immortalization of human hematopoietic cells along
different lineages changes during ontogeny / S. Horton [et al.] // Leukemia.—
2013.—Vol.27, N 5.—P.1116-26.
298 MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by
DOT1L / K. Bernt [et al.] // Cancer Cell.—2011.—Vol.20, N 1.—P.66–78.
299 MLL–SEPT6 fusion transcript with a novel sequence in an infant with acute
myeloid leukemia / S. Kadkol [et al.] // Cancer Genetics and Cytogenetics.—
2006.—Vol.168, N 2.—P.162–167.
281
300 MLL-SEPTIN6 fusion recurs in novel translocation of chromosomes 3, X, and
11 in infant acute myelomonocytic leukaemia and in t(X;11) in infant acute
myeloid leukaemia, and MLLgenomic breakpoint in complex MLL-SEPTIN6
rearrangement is a DNA topoisomerase II cleavage site / D. Slater [et al.] //
Oncogene.— 2002.—Vol. 21, N 30.—P.4706 – 4714.
301 MNX1-ETV6 fusion gene in an megakaryoblastic leukemia and expression of the
MNX1 gene in leukemia and normal B cell lines / T. Taketani [et al.] // Cancer
Genet. Cytogenet.—2008.—Vol.186, N 2.—P.115–119.
302 Modulation of cell adhesion and motility in the immune system by Myo1f / S.
Kim [et al.] // Science.—2006.—Vol.314.—P.136–139.
303 Molecular analysis of MLL/AF4 recombination in infant acute lymphoblastic
leukemia / A. Borkhardt [et al.]// Leukemia.—1994.—Vol.8, N 4.—P.549-553.
304 Molecular analysis of t(X;11)(q24;q23) in an infant with AML-M4 / J. Fu [et al.]
// Genes Chromosomes Cancer.—2003.—Vol.38, N 3.—P.253–259.
305 Molecular characterization of the MLL-SEPT6 fusion gene in acute myeloid
leukemia: identification of novel fusion transcripts and cloning of genomic
breakpoint junctions / N. Cerveira [et al.] // Haematologica.—2008.—Vol. 93.—
P.1076–1078.
306 Molecular cytogenetic findings of acute leukemia included in the Brazilian
Collaborative Study Group of Infant acute leukemia / M. Emerenciano [et al.]
//Pediatr Blood Cancer.—2006.—Vol.47, N 5.—P.549-554.
307 Molecular dissection of t(11;17) in acute myeloid leukemia reveals a variety of
gene fusions with heterogeneous fusion transcripts and multiple splice variants /
S. Strehl [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.— 2006.—Vol.45, N 11.—
P.1041–1049.
308 Molecular identification of a new splicing variant of the MLL-MLLT11 fusion
transcript in an adult with acute myeloid leukemia and t(1;11)(q21;q23) / S. Lee
[et al.]// Acta Haematol.—2012.—Vol.128, N 3.—P.131-138.
282
309 Molecular rearrangements of the MLL gene are present in most cases of infant
acute myeloid leukemia and are strongly correlated with monocytic or
myelomonocytic phenotypes / P. Sorensen [et al.] / J Clin Invest.—1994.—
Vol.93, N 1.—P.429-437.
310 Molecular rearrangements on chromosome 11q23 predominate in infant acute
lymphoblastic leukemia and are associated with specific biologic variables and
poor outcome / C.-S. Chen [et al.]// Blood.—1993.—Vol. 81, N 9.—P.23862393.
311 Molecular response to treatment redefines all prognostic factors in children and
adolescents with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia: results in 3184
patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study / V. Conter [et al.]// Blood.—
2010.—Vol.115, N 16.—P.3206-3214.
312 Monitoring minimal residual disease by quantification of genomic chromosomal
breakpoint sequences in acute leukemias with MLL aberrations / T. Burmeister
[et al.] // Leukemia.—2006.—Vol.20, N 3.—P.451-457.
313 Monosomal karyotype in acute myeloid leukemia: a better indicator of poor
prognosis than a complex karyotype / D. Breems [et al.] // J Clin Oncol.—
2008.—Vol.26, N 29.—P.4791-4797.
314 Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction screening in childhood
acute myeloblastic leukemia / S. Strehl [et al.] // Blood 2001.—Vol.97. N 3.—
P.805–808.
315 Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous
screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia /
N. Pallisgaard [et al.] // Blood.—1998.—Vol.92, N 2.—P.574-588.
316 Musilova J. Chromosome study of 85 patients with myelodysplastic syndrome /
J. Musilova, K. Michalova // Cancer Genetics and Cytogenetics.—1988.—
Vol.33, N 1.—P.39–50.
317 Mutations of the TP53 gene in acute myeloid leukemia are strongly associated
with a complex aberrant karyotype / C. Haferlach [et al.] // Leukemia.—2008.—
283
Vol.22, N 8.—P.1539-1541.
318 Myeloid cell differentiation arrest by miR-125b-1 in myelodysplasic syndrome
and acute myeloid leukemia with the t(2;11)(p21;q23) translocation / M.
Bousquet [et al.] // Journal of Experimental Medicine.— 2002.—Vol.205, N
11.—P. 2499-2506.
319 New complex t(2;11;17)(p21;q23;q11), a variant form of t(2;11), associated with
del(5)(q23q32) in myelodysplastic syndrome-derived acute myeloblastic
leukemia / K. Yamamoto [et al.] // Cancer Genetics and Cytogenetics.—2002.—
Vol.137, N 2.—P.119–123.
320 New insights to the MLL recombinome of acute leukemias / C. Meyer [et al.] //
Leukemia.—2009.—Vol.23, N 8.—P.1490-1499.
321 New structural chromosomal rearrangements in congenital leukemia / S. Heim
[et al.] // Leukemia.—1987.—Vol.1 N 1.—P.16–23.
322 NG2 expression in MLL rearranged acute myeloid leukaemia is restricted to
monoblastic cases / L. Mauvieux [et al.] // Br. J. Haematol.—1999.—Vol.107, N
3.—Р.674-676.
323 Nineteen cases of the t(1;22)(p13;q13) acute megakaryblastic leukaemia of
infants/children and a review of 39 cases: report from a t(1;22) study group / J.
Bernstein [et al.] // Leukemia.—2000.—Vol.14, N 14.— P.216-218.
324 No evidence for MLL/AF4 expression in normal cord blood samples / J. Trka [et
al.] // Blood.—1999—Vol.93, N 3.—P.1106-1107.
325 Novel prognostic subgroups in childhood 11q23/MLL-rearranged acute myeloid
leukemia: results of an international retrospective study / B. Balgobind [et al.] //
Blood.—2009.—Vol.114, N 12.—P.2489-2496.
326 Nuclear punctate distribution of ALL-1 is conferred by distinct elements at the N
terminus of the protein / T. Yano [et al.] // Proc Natl Acad Sci USA.—1997.—
Vol.94, N 14.—P.7286–7291.
284
327 Nucleotide Blast: Search nucleotide databases using a nucleotide query
[Электронный
ресурс]
//
Режим
доступа:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRA
MS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_
LOC=blasthome (дата обращения 21.12.2010).
328 Obuchowski N. ROC analysis / N. Obuchowski // Am. J. Roentgenol.—2005.—
Vol.184, N 2.—P.364-372.
329 Occurrence of an MLL/LAF4 fusion gene caused by the insertion
ins(11;2)(q23;q11.2q11.2) in an infant with acute lymphoblastic leukemia / J.
Bruch [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—2003.—Vol.37, N 1.—P.106109.
330 Odom L. Acute monoblastic leukemia in infancy and early childhood: successful
treatment with an epipodophyllotoxin / L. Odom, E. Gordon // Blood.—1984.—
Vol.64, N 4.—P.875–882.
331 Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood
acute lymphoblastic leukemia in a multi-center setting / V. van der Velden [et
al.] // Leukemia.—2007.—Vol.21, N 4.—Р.706-713.
332 Osaka M. (MLL septin-like fusion), a fusion partner gene of MLL, in a therapyrelated acute myeloid leukemia with a t(11;17)(q23;q25) / M. Osaka, J. Rowley,
N. Le-Zeleznik // Proc Natl Acad Sci USA.—1999.—Vol.96, N 11.—P.64286499.
333 Outcome modeling with CRLF2, IKZF1, JAK, and minimal residual disease in
pediatric acute lymphoblastic leukemia: a Children's Oncology Group study / I.
Chen [et al.] // Blood.—2012.—Vol.119, N 15.—P.3512-3522.
334 Outcome of congenital acute lymphoblastic leukemia treated on the Interfant-99
protocol / M. van der Linden [et al.] // Blood.—2009.—Vol.114, N 18.—P.37643768
285
335 Outcome of risk-based therapy for infant acute lymphoblastic leukemia with or
without an MLL gene rearrangement, with emphasis on late effects: a final report
of two consecutive studies, MLL96 and MLL98, of the Japan Infant Leukemia
Study Group / D. Tomizawa [et al.] // Leukemia.—2007.—Vol.22, N 11.—
P.2258-2263.
336 Outcome of treatment in childhood acute lymphoblastic leukaemia with
rearrangements of the 11q23 chromosomal region / C.-H. Pui [et al.] // Lancet.—
2002.—Vol.359.—P.1909–1915
337 Outcome of treatment in children with hypodiploid acute lymphoblastic leukemia
/ J. Nachman [et al.] // Blood.—2007.—Vol.110, N 4.—P.1112-1115.
338 Outcome of treatment in children with Philadelphia chromosome-positive acute
lymphoblastic leukemia / M. Aricò [et al.] // N Engl J Med.—2000.—Vol.342, N
14.—P.998-1006.
339 Panhandle polymerase chain reaction amplifies MLL genomic translocation
breakpoint involving unknown partner gene / C. Felix [et al.] // Blood.—1997.—
Vol.90, N 12.—P.4679-4686.
340 Parachoniak C. Distinct Recruitment of Eps15 via its coiled-coil domain is
required for efficient down-regulation of the MET receptor tyrosine kinase / C.
Parachoniak, M. Park // Journal of Biological Chemistry.—2009.—Vol.284, N
13.—P.8382–8394.
341 Patients with de novo acute myeloid leukemia and complex karyotype
aberrations show a poor prognosis despite intensive treatment: a study of 90
patients / C. Schoch [et al.] // Br. J. Haematol.—2001.—Vol.112, N 1.—P. 118126.
342 Pediatric Oncology Group (POG) studies of acute myeloid leukemia (AML): a
review of four consecutive childhood AML trials conducted between 1981 and
2000 / Y. Ravindranath [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—P.2101–
2116.
286
343 Perdigão J. Monosomal karyotype (MK) in myeloid malignancies / J. Perdigão,
M Gomes da Silva // Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.—2011.—Vol.15,
N
10.—P.890-891
[Электронный
ресурс]
//
Режим
http://AtlasGeneticsOncology.org/Anomalies/MonoKaryoID1574.html
доступа:
(дата
обращения 07.03.2014)
344 Pieters R. Biology and treatment of infant leukemias / R. Pieters. in: Treatment
of acute leukemias: new directions for clinical research // Ed C.-H. Pui. Totowa:
Humana Press, 2003.—P.61-73.
345 Pieters R. Infant acute lymphoblastic leukemia: Lessons learned and future
directions / R. Pieters // Curr Hematol Malig Rep.—2009.—Vol.4. N 3.—P.167174.
346 Poor prognosis for P2RY8-CRLF2 fusion but not for CRLF2 over-expression in
children with intermediate risk B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia /
C. Palmi [et al.] // Leukemia.—2012.—Vol.26, N 10.—P.2245-2253.
347 Population-based age-specific incidences of cytogenetic subgroups of acute
myeloid leukemia / U. Bacher [et al.] // Haematologica.—2005.—Vol.90, N
11.—P.1502–1510.
348 Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant
acute lymphoblastic leukemia / M. Dördelmann [et al.] // Blood. – 1999. –
Vol.94, N 4. – P. 1209–1217.
349 Prenatal findings in congenital leukemia: a case report / Y. Sato [et al.] // Fetal
Diagn Ther.—2011.—Vol.29, N 4.—P.325–330.
350 Presence of the P2RY8-CRLF2 rearrangement is associated with a poor
prognosis in non-high-risk precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia in
children treated according to the ALL-BFM 2000 protocol / G. Cario [et al.] //
Blood.—2010.—Vol.115, N 26.—P.5393-5397.
351 Prevalence of t(12;21)[ETV6-RUNX1]–positive cells in healthy neonates / U.
Lausten-Thomsen [et al.] // Blood.—2011—Vol.117, N 1.—P.186-189.
287
352 Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied
by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis / E.
Kolomietz [et al.] // Blood.—2001.—Vol. 97, N 11.—P.3581-3588.
353 Prognosis of children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) and
intrachromosomal amplification of chromosome 21 (iAMP21) / A. Moorman [et
al.] // Blood.— 2007.—Vol.109, N 6.—P.2327-2330.
354 Prognostic effect of chromosomal abnormalities in childhood B-cell precursor
acute lymphoblastic leukaemia: results from the UK Medical Research Council
ALL97/99 randomised trial / A. Moorman [et al.] // Lancet Oncol.—2010.—
Vol.11, N 5.—P.429-438.
355 Prognostic factors in infants with acute myeloid leukemia / C.-H. Pui [et al.] //
Leukemia.—2000.—Vol.14, N 4.—P.684–687.
356 Prognostic factors in the acute lymphoid and myeloid leukemias of infants / C.H. Pui [et al.] //Leukemia.—1996.—Vol.10, N 6.—P.952-956.
357 Prognostic impact of age in children and adolescents with acute lymphoblastic
leukemia: data from the trials ALL-BFM 86, 90, and 95 / A. Möricke [et al.] //
Klin Padiatr. —2005. —Vol.217, N 6. —P.310-320.
358 Prognostic impact of specific chromosomal aberrations in a large group of
pediatric patients with acute myeloid leukemia treated uniformly according to
trial AML-BFM 98 / C. von Neuhoff [et al.] // J. Clin. Oncol.—2010.—Vol.28,
N 16.—P.2682-2689.
359 Prognostic impact of t(1;19)/TCF3-PBX1 in childhood acute lymphoblastic
leukemia in the context of Berlin-Frankfurt-Münster-based protocols / M. Felice
[et al.] // Leuk Lymphoma.—2011.—Vol.52, N 7.—P.1215-1221.
360 Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow
cytometry in childhood acute lymphoblastic leukaemia / E. Coustan-Smith [et
al.] // Blood.—2002.—Vol.100, N 1.—Р.52-58.
361 Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual
disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia / M. Dworzak [et
288
al.] // Blood.—2002.—Vol.99, N 6.—Р.1952-1958.
362 Prognostic significance of additional cytogenetic aberrations in 733 de novo
pediatric 11q23/MLL-rearranged AML patients: results of an international study
/ E. Coenen [et al.] // Blood.—2011, N 26.—Vol.117, N 26.—P.7102–7111.
363 Prognostic significance of blasts in the cerebrospinal fluid without pleiocytosis
or a traumatic lumbar puncture in children with acute lymphoblastic leukemia:
experience of the Dutch Childhood Oncology Group / D. te Loo [et al.] // J. Clin.
Oncol.—2006.—Vol.24, N 15.—P.2332–2336.
364 Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute
lymphoblastic leukemia treated within the Interfant-99 protocol / V. van der
Velden [et al.] // Leukemia.—2009.—Vol.23, N6.—P.1073-1079.
365 Prognostic value of immunophenotype in infant ALL – results of the
INTERFANT’99 study / T. Szczepanski [et al.] // Blood.—2010.—Vol.116, N
22.—Abstract 2700.
366 Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia in
childhood / J. van Dongen [et al.] // Lancet.—1998.—Vol.352.—Р.1731-1738.
367 Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute
lymphoblastic leukaemia / C. Eckert [et al.] // Lancet.—2001.—Vol.358.—
P.1239-1241
368 Prognostic value of minimal residual disease quantification before allogeneic
stem-cell transplantation in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia:
the ALL-REZ BFM Study Group / P. Bader [et al.] // J Clin Oncol.—2009.—
Vol.27, N 3.—P.377-384.
369 Prognostic value of monosomal karyotype in comparison to complex aberrant
karyotype in acute myeloid leukemia: a study on 824 cases with aberrant
karyotype / C. Haferlach [et al.] // Blood.—2012.—Vol.119, N 9.—P.2122-2125.
370 Properties of SEPT9 isoforms and the requirement for GTP binding / C.
Robertson [et al.] // J Pathol.—2004.—Vol.203, N 1.—P. 519–527.
289
371 Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British
(FAB) co-operative group / J. Bennett [et al.] // Br. J. Haematol.—1976—
Vol.33, N 4.—P.451–458.
372 Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European
Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL) / M.-C.
Bene [et al.] // Leukemia.—1995.—Vol.9, N 10.—P.1783-1786.
373 Pui C.-H. Biology and treatment of infant leukemia / C.-H. Pui, J. Kane, W. Crist
// Leukemia. —1995. —Vol.9, N 5.—P.762-769.
374 Pui C.-H. Central nervous system disease in acute lymphoblastic leukemia:
prophylaxis and treatment / C.-H. Pui // Hematology: Am. Soc. Hematol. Educ.
Program.—2006.—Р.142–146.
375 Quantification of fusion transcript reveals a subgroup with distinct biological
properties and predicts relapse in BCR/ABL-positive ALL: implications for
residual disease monitoring / M. Zaliova [et al.] // Leukemia.—2009.—Vol.23, N
5.—P.944-951.
376 Rapid and sensitive detection of all types of MLL gene translocations with a
single FISH probe set / M. van der Burg [et al.] // Leukemia.—1999.—Vol.13, N
12.—P.2107-2113.
377 Real-time quantification of TEL-AML1 fusion transcripts for MRD detection in
relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Comparison with antigen
receptor-based MRD quantification methods / T. Taube [et al.] // Leuk Res.—
2004.—Vol.28, N 7.—P.699-706.
378 Reaman G. Biology and treatment of infant leukemias / G. Reaman. in:
Treatment of acute leukemias: new directions for clinical research // Ed C.-H.
Pui. Totowa: Humana Press, 2003.—P.75-83.
379 Rearrangement of the MLL gene in acute lymphoblastic and acute myeloid
leukemias with 11q23 chromosomal translocations / M. Thirman [et al.] // New
Engl J Med.—1993.—Vol.329, N 13.—P.909–914.
380 Recent advances in the treatment of infant acute myeloid leukemia / E. Ishii [et
290
al.] // Leuk Lymphoma.—2003.—Vol.44, N 5.—P.741-748.
381 Regulation of mir-196b by MLL and its overexpression by MLL fusions
contributes to immortalization / R. Popovic [et al.] // Blood.—2009.—Vol.113,
N 14.—P.3314–3322.
382 Relation between age, immunophenotype and in vitro drug resistance in 395
children with acute lymphoblastic leukemia - implications for treatment of
infants / R. Pieters [et al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 9.—P.1344-1348.
383 Relationships between age at diagnosis, clinical features, and outcome of therapy
in children treated in the Medical Research Council AML 10 and 12 trials for
acute myeloid leukemia / D. Webb [et al.] // Blood.—2001.—Vol.98, N 6.—
P.1714-1720.
384 Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by
MLL translocation / S. Jo [et al.] // Blood.—2011.—Vol.117, N 18.—P.4759–
4768.
385 Results of 58872 and 58921 trials in acute myeloblastic leukemia and relative
value of chemotherapy vs allogeneic bone marrow transplantation in first
complete remission: the EORTC Children Leukemia Group report / N. EntzWerle [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—P.2072–2081.
386 Results of a randomized trial in children with Acute Myeloid Leukaemia:
medical research council AML12 trial / B. Gibson [et al.] // Br J Haematol.—
2011.—Vol.155, N 3.—P.366-376.
387 Results of the AIEOP AML 2002/01 multicenter prospective trial for the
treatment of children with acute myeloid leukemia / A. Pession [et al.] //
Blood.—2013.—Vol.122, N 2.—P.170-178.
388 Results of the Dana-Farber cancer institute ALL consortium protocol 95-01 for
children with acute lymphoblastic leukemia / A. Moghrabi [et al.] // Blood.—
2007.—Vol.109, N 3.—P.896-904.
291
389 Retrospective comparison of qualitative and quantitative reverse transcriptase
polymerase chain reaction in diagnosing and monitoring the ALL1-AF4 fusion
transcript in patients with acute lymphoblastic leukaemia / L. Elia [et al.] //
Leukemia.—2004.—Vol.18, N 11.—P.1824-1830.
390 Risk of relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia is predicted by flow
cytometric measurement of residual disease on day 15 bone marrow / G. Basso
[et al.] // J. Clin. Oncol.—2009.—Vol.27, N 31.—P.5168-5174.
391 Risk-adjusted therapy of acute lymphoblastic leukemia can decrease treatment
burden and improve survival: Treatment results of 2169 unselected pediatric and
adolescent patients enrolled in the trial ALL-BFM 95 / A. Möricke [et al.] //
Blood.—2008.—Vol.111, N 9.—P.4477–4489.
392 Risk-directed treatment of infant acute lymphoblastic leukaemia based on early
assessment of MLL gene status: results of the Japan Infant Leukaemia Study
(MLL96) / K. Isoyama [et al.] // British Journal of Haematology.—2002.—
Vol.118, N 4.—P.999–1010.
393 Risk-stratified therapy and the intensive use of cytarabine improves the outcome
in childhood acute myeloid leukemia: the AML99 trial from the Japanese
Childhood AML Cooperative Study Group / I. Tsukimoto [et al.] // J Clin
Oncol.—2009.—Vol.27, N 24.—P.4007-4013.
394 RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukemia /
J. Zuber [et al.] // Nature.—2011.—Vol.478.—P.524–528.
395 Robertson M. Prenatal diagnosis of congenital leukemia in a fetus at 25 weeks’
gestation with Down syndrome: case report and review of the literature / M.
Robertson, G. de Jong, E. Mansvelt // Ultrasound Obstet Gynecol.—2003.—
Vol.21, N 5.—P.486–489.
396 Role of treatment intensification in infants with acute lymphoblastic leukemia:
results of two consecutive AIEOP studies / A. Biondi [et al.] // Haematologica.—
2006.— Vol.91, N 4.—P.534-537.
292
397 RUNX1 is a key target in t(4;11) leukemias that contributes to gene activation
through an AF4-MLL complex interaction / A. Wilkinson [et al.] // Cell Rep.—
2013.—Vol.3, N 1.—P.116–127.
398 Screening for MLL tandem duplication in 387 unselected patients with AML
identify a prognostically unfavorable subset of AML / S. Schnittger [et al.]/
Leukemia.—2000.—Vol.14, N 5.—P.796–804.
399 Sensitivity of FISH in detection of MLL translocations / G. Cuthbert [et al.] //
Genes Chromosomes and Cancer.—2000.—Vol.29, N 2.—P.180–185.
400 SEPT2 is a new fusion partner of MLL in acute myeloid leukemia with
t(2;11)(q37;q23) / N. Cerveira [et al.] //Oncogene.—2006.—Vol.25, N45 .—
P.6147–6152.
401 SEPTIN6, a human homologue to mouseSeptin6, is fused to MLL in infant acute
myeloid leukemia with complex chromosomal abnormalities involving 11q23
and Xq24 / R. Ono [et al.] // Cancer Res.— 2002.—Vol.62, N 2.—P.333–337.
402 Significant reduction of the hybrid BCR/ABL transcripts after induction and
consolidation therapy is a powerful predictor of treatment response in adult
Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia / F. Pane [et al.] //
Leukemia.—2005.—Vol.19, N 4.—P.628–635.
403 Slany R. The molecular biology of mixed lineage leukemia / R. Slany //
Haematologica.—2009.—Vol.94, N 7.—P.984-993.
404 Slower molecular response to treatment predicts poor outcome in patients with
TEL/AML1 positive acute lymphoblastic leukemia: prospective real-time
quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction study / J. Madzo [et
al.] // Cancer.—2003.—Vol.97, N 1.—P.105-113.
405 Speck N. Core-binding factors in haematopoiesis and leukaemia / N. Speck, D.
Gilliland // Nat Rev Cancer.—2002.—Vol.2, N 7.—P.502-513.
406 Spliced MLL fusions: a novel mechanism to generate functional chimeric MLLMLLT1 transcripts in t(11;19)(q23;p13.3) leukemia / С. Meyer [et al.] //
Leukemia.—2007.—Vol.21, N 3.—P.588-590.
293
407 Stability
of
leukemia-associated
immunophenotypes
in
precursor
B-
lymphoblastic leukemia/lymphoma: a single institution experience / W. Chen [et
al.] // Am. J. Clin. Pathol.—2007.—Vol.127, N 1.—P.39-46.
408 Stabilization of mRNA expression in whole blood samples / L. Rainen [et al.] //
Clinical Chemistry.—2002.—Vol.48, N 11.—P.1883-1890.
409 Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse
transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual
disease detection in leukemia – A Europe Against Cancer Program / J. Gabert [et
al.] // Leukemia.—2003.—Vol. 17, N 12.—P.2318–2357.
410 Standardized MRD quantification in European ALL trials: proceedings of the
second international symposium on MRD assessment in Kiel, Germany, 18–20
September 2008 / M. Brüggemann [et al.] // Leukemia.—2010.—Vol.24, N 3.—
P.521–535
411 Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome
aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease / J. van
Dongen [et al.] // Leukemia.—1999.—Vol.13, N 12.—P.1901-1918.
412 Strong S. The Placenta in Twin Pregnancy / S. Strong, G. Corney // Oxford:
Pergamon Press, 1967.—107p.
413 Structure and function of the blood-brain barrier / N. Abbott [et al.] // Neurobiol
Dis.—2010.—Vol.37, N 1.—P.13–25.
414 Successive clinical trials for childhood acute myeloid leukemia at St Jude
Children’s Research Hospital, from 1980 to 2000 / R. Ribeiro [et al.] //
Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—P.2125–2129.
415 Suppression of the let-7b microRNA pathway by DNA hypermethylation in
infant acute lymphoblastic leukemia with MLL gene rearrangements / M. Nishi
[et al.] Leukemia.—2013.—Vol.27, N 2.—P.389-397.
416 Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute
lymphoblastic leukaemia / T. Szczepanski // Leukemia.—2007.—Vol.21, N 4.—
Р.622-626.
294
417 t(7;12)(q36;p13) and t(7;12)(q32;p13)—translocations involving ETV6 in
children 18 months of age or younger with myeloid disorders / R. Slater [et al.] //
Leukemia.—2001.—Vol.15, N 6.—P.915–920.
418 t(7;12)(q36;p13), a new recurrent translocation involving ETV6 in infant
leukemia / S. Tosi [et al.] // Genes Chromosomes Cancer.—2000.—Vol.29, N
4.—P.325–332.
419 Tandem duplications of MLL and FLT3 are correlated with poor prognoses in
pediatric acute myeloid leukemia: a study of the Japanese childhood AML
Cooperative Study Group / A. Shimada [et al.] // Pediatr Blood Cancer.—
2008.—Vol.50, N 2.—P.264–269.
420 Ten novel 11q23 chromosomal partner sites / C. Harrison [et al.] // Leukemia.—
1998.—Vol.12, N 5.—P.811-822.
421 The AF4-MLL fusion protein is capable of inducing ALL in mice without
requirement of MLL-AF4 / A. Bursen [et al.] // Blood.—2010.—Vol.115, N
17.—P.3570–3579.
422 The distribution of MLL breakpoints correlates with outcome in infant acute
leukaemia / M. Emerenciano [et al.] // Br J Haematol.—2013.—Vol.161, N 2.—
P.224-236.
423 The eleven-nineteen-leukemia protein ENL connects nuclear MLL fusion
partners with chromatin / D. Zeisig [et al.] // Oncogene.—2005.—Vol.24, N
35.—P.5525-5532.
424 The ENL moiety of the childhood leukemia-associated MLL-ENL oncoprotein
recruits human polycomb 3 / M. Garcia-Cuellar [et al.] // Oncogene.—2001.—
Vol.20, N 4.—P.411–419.
425 The heterogeneity of pediatric MLL-rearranged acute myeloid leukemia / B.
Balgobind [et al.]// Leukemia.—2011.—Vol.25, N 8. —P.1237-1248.
426 The histone demethylase KDM1A sustains the oncogenic potential of MLL-AF9
leukemia stem cells / W. Harris [et al.] // Cancer Cell.—2012.—Vol.21, N 4.—
P.473–487.
295
427 The human homologue of rat NG2, a chondroitin sulphate proteoglycan, is not
expressed on the cell surface of normal hematopoietic cells but is expressed by
acute myeloid leukemia blasts from poor-prognosis patients with abnormalities
of chromosome band 11q23 / F. Smith [et al.] // Blood.—1996.—Vol.87, N 3.—
Р.1123-1133.
428 The immunophenotype in infant acute lymphoblastic leukaemia: correlation with
clinical outcome. An Italian multicentre study (AIEOP) / G. Basso [et al.] // Br.
J. Haematol.—1992.—Vol.81, N 2.—P.184-191.
429 The leukemogenic AF4-MLL fusion protein causes P-TEFb kinase activation
and altered epigenetic signatures / A. Benedikt [et al.] // Leukemia.—2011.—
Vol.25, N 1.—P.135-144.
430 The menin tumor suppressor protein is an essential oncogenic cofactor for MLLassociated leukemogenesis / A. Yokoyama, [et al.] // Cell.—2005.—Vol.123, N
2.—P.207–218.
431 The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative realtime PCR experiments / S. Bustin [et al.] // Clinical Chemistry.—2009.—Vol.55,
N 4.— P. 611–622.
432 The MLL partial tandem duplication in acute myeloid leukaemia / J. Basecke [et
al.] // British Journal of Haematology.—2006.—Vol.135, N 4.—P.438-449.
433 The MLL recombinome of acute leukemias in 2013 / C. Meyer [et al.] //
Leukemia.—2013.—Vol.27, N 11.—P.2165-2176.
434 The MLL recombinome of adult CD10-negative B-cell precursor acute
lymphoblastic leukemia: results from the GMALL study group / T. Burmeister
[et al.] // Blood.—2009.—Vol.113, N 17.—P.4011-4015.
435 The MYO1F, unconventional myosin type 1F, gene is fused to MLL in infant
acute monocytic leukemia with a complex translocation involving chromosomes
7, 11, 19 and 22 / T. Taki [et al.] // Oncogene.—2005.—Vol.24, N 33.—P.5191–
5197.
296
436 The prognostic significance of cytogenetic aberrations in childhood acute
myeloid leukaemia. A study of the Swiss Paediatric Oncology Group (SPOG) /
D. Betts [et al.] // Eur J Haematol.—2007.—Vol.78, N 6.—P.468-476.
437 The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA
measurements / A. Schroeder [et al.] // BMC Mol Biol.— 2006.—Vol.7.—
Article 3.
438 The same pocket in menin binds both MLL and JUND but has opposite effects
on transcription / J. Huang [et al.] // Nature.—2012.—Vol.482.—P.542–546.
439 The t(1;22)(p13;q13) is non-random and restricted to infants with acute
megakaryoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group Study / A. Carroll [et
al.] // Blood.—1991.—Vol.78, N 3.—P.748–752.
440 The t(10;11)(p12;q23) translocation in acute leukaemia: a cytogenetic and
clinical study of 20 patients. European 11q23 Workshop participants / D.
Lillington [et al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 5.—P.801-804.
441 The t(11;19)(q23;p13) fusing MLL with MYO1F is recurrent in infant acute
myeloid leukemias / F. Duhoux [et al.] //Leuk Res.—2011.—Vol.35, N 9.—
e171-172.
442 The t(4;11) chromosome translocation of human acute leukemias fuses the ALL1 gene, related to Drosophila trithorax, to the AF-4 gene / Y. Gu [et al.] // Cell.—
1992.—Vol.71, N 4.—P.701–708.
443 The translocation t(1;22)(p13;q13) is a nonrandom marker specifically associated
with acute megakaryocytic leukemia in young children / T. Lion [et al.] //
Blood.—1992.—Vol.79, N 12.—P.3325-3330.
444 The translocations, t(11;19)(q23;p13.1) and t(11;19)(q23;p13.3): a cytogenetic
and clinical profile of 53 patients. European 11q23 Workshop participants / A.
Moorman [et al.] // Leukemia.—1998.—Vol.12, N 5.—P.805-810.
445 Therapeutic trial for infant acute lymphoblastic leukemia: the Pediatric Oncology
Group experience (POG 8493) / L. Frankel [et al.] // J Pediatr Hematol Oncol.—
1997.—Vol.19, N 1.—P.35-42.
297
446 Therapy of childhood acute myelogenous leukemias / J. Vormoor [et al.] // Ann
Hematol.—1996.—Vol.73, N 1.–P.11-24.
447 Three-way complex translocations in infant acute myeloid leukemia with
t(7;12)(q36;p13): The incidence and correlation of a HLXB9 overexpression / J.
Park [et al.] // Cancer Genet. Cytogenet.—2009.—Vol.191, N 2.—P.102–105.
448 Tkachuk D. Involvement of a homolog of Drosophila tritorax by 11q23
chromosomal translocations in acute leukemias / D. Tkachuk, S. Kohler, M.
Cleary // Cell.—1992.—Vol.71, N 4.—P.691-700.
449 Transcription linked to recombination: a gene-internal promoter coincides with
the recombination hot spot II of the human MLL gene / S. Scharf [et al.] //
Oncogene.—2007.—Vol.26 N 10.—P.1361-1371.
450 Translocation (10;11)(p12;q23) in childhood acute myeloid leukemia: incidence
and complex mechanism / I. Stasevich [et al.] // Cancer Genetics and
Cytogenetics.—2006.—Vol.169, N 2.—P. 114-120.
451 Translocation 2;11 and other significant chromosome changes in acute
monoblastic leukemia (M5) with clonal evolution: sequential clinical and
cytogenetic studies / C.-D. De Lozier-Blanchet [et al.] // Cancer Genetics and
Cytogenetics.—1985.—Vol.16, N 2.—P.95–102.
452 Traumatic lumbar puncture at diagnosis adversely affects outcome in childhood
acute lymphoblastic leukemia / A. Gajjar [et al.] // Blood.—2000.—Vol.96, N
10.—P.3381–3384.
453 Treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia: results of Dana-Farber
ALL Consortium Protocol 87-01 / J. LeClerc [et al.] // J Clin Oncol.—2002.—
Vol.20, N 1.—P.237-246.
454 Treatment of childhood acute myeloblastic leukemia: dose intensification
improves outcome and maintenance therapy is of no benefit – multicenter studies
of the French LAME (Leucémie Aiguë Myéloblastique Enfant) Cooperative
Group / Y. Perel [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N 12.—P.2082–2089.
455 Treatment of infants with lymphoblastic leukaemia: results of the UK Infant
298
Protocols 1987-1999 / J. Chessells [et al.] // Br J Haematol.—2002.—Vol.117,
N2.—P.306-314.
456 Treatment outcome and prognostic factors for infants with acute lymphoblastic
leukemia treated on two consecutive trials of the Children’s Cancer Group / G.
Reaman [et al.] // J Clin Oncol.—1999.—Vol.17, N 2.—P.445-455.
457 Treatment strategies and long-term results in paediatric patients treated in four
consecutive AML-BFM trials / U. Creutzig [et al.] // Leukemia.—2005.—
Vol.19, N 12.—P.2030–2042.
458 Treatment strategy and long-term results in paediatric patients treated in
consecutive UK AML trials / B. Gibson [et al.] // Leukemia.—2005.—Vol.19, N
12.—P.2130–2138
459 Trisomy 11 in myeloid malignancies is associated with internal tandem
duplication of both MLL and FLT3 genes / G. Rege-Cambrin [et al.] //
Haematologica.—2005.—Vol.90, N 2.—P.262-264.
460 Two consecutive immunophenotypic switches in a child with MLL-rearranged
acute lymphoblastic leukemia / G. Germano [et al.]// Haematologica.—2006.—
Vol.91, N2.—e29-e31.
461 Two independent gene signatures in pediatric t(4;11) acute lymphoblastic
leukemia patients / L. Trentin [et al.] // European Journal of Haematology.—
2009.—Vol.83, N 5.—P.406–419.
462 Two partner genes of MLL and additional heterogeneity in t(11;19)(q23;p13)
translocations / L. Lo Nigro [et al.] //Blood.—2002.—Vol.100, N 21.—P.531a.
—Abstract 2080
463 Two-step differential expression analysis reveals a new set of genes involved in
thyroid oncocytic tumors / C. Jacques [et al.] // J Clin Endocrinol Metab.—
2005.—Vol.90, N 4.—P.2314–2320.
464 Use of single nucleotide polymorphism array technology to improve the
identification of chromosomal lesions in leukemia / I. Iacobucci [et al.] // Curr
Cancer Drug Targets.—2013.—Vol.13, N 7.—P.791-810.
299
465 Validation of NG2 in identifying BP-ALL patients with MLL-rearrangements
using qualitative and quantitative flow cytometry: a prospective study / A.
Zangrando [et al.] // Leukemia.—2008.—Vol.22, N 4.—Р.858-861.
466 Weinstein S. Clinical evaluation of diagnostic tests / S. Weinstein., N.
Obuchowski, M. Lieber // Am. J. Roentgenol.—2005.—Vol. 184.—Р.14-19.
467 WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues /
Editors: S. Swerdlow., E. Campo, N. Harris, et al.—Lyon: IARC.—2008.—
439p.
468 Wolman I. Parallel responses to chemotherapy in identical twin infants with
concordant leukemia / I. Wolman // J Pediatr.—1962.—Vol.60.—P.91-96.
469 X chromosome insertion in the MLL gene in a case of childhood acute
myeloblastic leukemia / B. Arnaud [et al.] // Cancer Genetics and
Cytogenetics.—2004.—Vol.152, N 2.—P.149–152.
470 Yokoyama A. Menin critically links MLL proteins with LEDGF on
cancerassociated target genes / A. Yokoyama, M. Cleary // Cancer Cell.—
2008.—Vol.14, N 1.—P.36–46.
471 Zhang Y. Transcription regulation by histone methylation: interplay between
different covalent modifications of the core histone tails / Y. Zhang, D. Reinberg
// Genes Dev.—2001.—Vol.15, N 18.—P.2343-2360.
472 Zweidler-McKay P. The ABCs of infant leukemia // P. Zweidler-McKay, J.
Hilden // Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care.—2008.—Vol.38, N 3.—P.7894.
473 Zweig M. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental
evaluation tool in clinical medicine / M. Zweig, G. Campbell // Clinical
Chemistry.—1993.—Vol.39, N 4.—P.561-577.