(1,1 Мб)
advertisement
Д.А. ВАСИЛЬЕВ В.Ю. ЛУГОВЦЕВ УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ ВИРУСОЛОГИИ часть третья – ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ и ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ - УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ ВИРУСОЛОГИИ (часть третья – иммунологические и генетические методы) Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители: Д.А. ВАСИЛЬЕВ В.Ю. ЛУГОВЦЕВ УЛЬЯНОВСК 2005. 2 УДК 619 : 616 Д.А. ВАСИЛЬЕВ В.Ю ЛУГОВЦЕВ УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ ВИРУСОЛОГИИ ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ Данное учебное пособие подготовлено: д б н, профессором Васильевым Д.А. (Ульяновская государственная с-х академия) и DVM, PhD Луговцевым В.Ю (Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, Laboratory of Pediatric Respiratory Viral Diseases. Bethesda, MD 20892, USA) Цель издания – восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса ветеринарная вирусология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры. Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно – санитарной экспертизы для студентов факультета ветеринарной медицины. 3 Занятие 21. Радиоиммунологический анализ (РИА). (Материал подготовлен совместно с д в н, профессором Алтайского ГАУ Барышниковым П.И.) Цель занятия : ознакомится с РИА иприменяеммм в вирусологической практике. Радиоиммунологический анализ (РИА) - метод, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью радиоизотопной метки. Краткие теоретические сведения. Радиоиммунологический анализ произвел революцию в ряде областей медицины (эндокринология), оказал преобразующее влияние на развитие гематологии и фармакологии. Его разработчикам в 1977 г. была присуждена Нобелевская премия. В основе метода лежит применение антигенов и антител, меченых радионуклидами. Такая метка позволяет с помощью современных приборов выявить и количественно определить содержание исследуемого вещества в различных тканях и биологических субстратах. К преимуществам РИА относятся: высокая чувствительность – способность измерительной системы регистрировать минимальные количества веществ; высокая специфичность – способность системы измерять только одну, строго определенную субстанцию; надежность – способность определить истинное количество вещества; точность, характеризующая воспроизводимость получаемых результатов. По этим параметрам РИА значительно превосходит классические биологические методы определения – РА, РСК, РНГА и другие (Гринин А. и др., 1983 г., 1984 г.; Чард Т., 1981; Ткачева Г. А. и др. 1983). Следует отметить, что РИА имеет много общего с ИФА, а принципиальным отличием является индикаторная метка: вместо фермента используется изотоп. Основные принципы радиоиммуннологических методов разработаны в двух независимых научных центрах Нью-Йорка и Лондона. В 1960 году Yalow. R. и Bersols. опубликовали классическую работу по радиоиммунологическому определению содержания эндогенного инсулина в плазме крови человека, которая ознаменовала новый этап в области применения радионуклидов в биологии. Наибольшее распространение нашел метод РИА на твердофазных носителях, таких как целлюлоза, декстрин, полимеры и т. п. (Halonen P. et al., 1987, Moore, N. et al., 1982; Tevoarwerv Y. et al., 1980; Wide L.Porath. 1966.) Он был значительно упрощен и приобрел особую ценность, когда выяснилось, что в качестве твердой фазы для образования иммунных комплексов можно использовать обычные полистирол, поливинилхлорид и другие пластики, исходя из их сорбционной способности. Однако в каждом случае необходимо подбирать оптимальные условия постановки РИА, вследствие различия адсорбционных свойств разных партий используемых полимеров. Большое внимание уделяют автоматизации РИА, позволяющей не только сократить время анализа, но и повысить его чувствительность, специфичность, точность и воспроизводимость. Полная автоматизация была описана Ekins R. (1979 г.). Она включала не только обработку проб и подсчет результатов, но и оптимизацию процессов и параметров путем включения в систему компьютера. Более поздним подходом к автоматизации РИА являются разработки дискретных анализаторов и создание модульных систем, состоящих из нескольких модулей: разбавителя образцов, дозатора реагентов, фильтрации и другое (Bagschawa K. 1978 г.). Методом РИА проводится определение различных веществ в биологических субстратах, где он превосходит другие лабораторные методы в плане чувствительности, стоимости анализа, затрат времени и возможности автоматизации. 4 Он позволяет в ряде случаев определить компоненты тканевых экстрактов и жидкостей без их дополнительной очистки и выделения. По мнению А.Ф. Зыкина (1993), эта реакция в отличие от большинства применяемых иммунологических тестов дает возможность количественно определить содержание антигенов или антител в исследуемом образце. По данным указанного автора, в патологическом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды с помощью РИА можно в течение часов или минут выявить наличие возбудителя гепатита В, ботулинического и стафилококкового токсинов. Принцип метода. Иммунологический аспект С точки зрения взаимодействия антитела и антигена, метод РИА аналогичен серологическим реакциям, используемым в диагностике, и отличается от них способом индикации образования комплекса антиген-антитело. При появлении «чужеродного» антигена, иммунологически отличающегося от собственных антигенов, в организме активируются определенные популяции лейкоцитов, выполняющие две основные функции иммунной защиты: захват, разрушение и элиминация крупных чужеродных структур (например, бактерий и вирусов) и формирование иммунного ответа, в том числе, выработка антител против этого антигена. Антитела, вырабатываемые к какому-либо антигену, являются специфичными, причем антитела, специфичные к одной и той же антигенной детерминанте антигена обладают идентичной структурой связывающего центра. Вследствие того, что относительно крупные белковые антигены, как правило, имеют несколько различных антигенных детерминант, в организме при иммунном ответе образуется достаточно широкий спектр специфичностей антител, что и обусловливает гетерогенность (неоднородность) популяции антител в организме. Кроме того, гетерогенность обусловлена также и собственно структурой связывающего центра антител. Образно говоря, связывание антитела с антигеном можно описать феноменом «замка и ключа». Антитело – «замок» связывает своими специфическими участками (связывающими фрагментами, центрами) только те антигены – «ключ», которые соответствуют конфигурации «замка». Если конфигурация «замка» достаточно свободна, диапазон используемых «ключей» возрастает, специфичность антител понижается. С наличием такой гетерогенности антител связана их перекрестная реактивность, которая означает, что некоторые антитела, имеющие очень низкое сродство к вызывающему иммунный ответ антигену, способны также образовывать иммунные комплексы с другими (не родственными) антигенами, имеющими структурно подобные антигенные детерминанты. Таким образом, чем менее специфично антитело, тем больше вероятность перекрестной реакции. Большинство антител относятся к классу иммуноглобулинов «G», являющимися двухвалентными (имеющими два связывающих антиген центра). Это означает, что они способны взаимодействовать с двумя идентичными молекулами антигена. Антигены могут быть одно-, двух- или поливалентными (имеющими одну, две или более идентичных по структуре и специфичности антигенных детерминант). Валентность антител и антигенов определяет тип реакции, которая может происходить между ними в системе in vitro (в пробирках). Поливалентные антигены, соединяясь в комплексы с 2-х или поливалентными антителами, образуют полимолекулярные структуры, называемые приципитатами и агглютинатами. В случае, если существует избыток антител, образуемые комплексы, как правило, являются нерастворимыми. При классических реакциях РИА образуется растворимый комплекс. Химический аспект. Как уже указывалось, в РИА сочетается специфичность, свойственная реакциям антиген-антитело, с чувствительностью и достаточной простотой, которые дает применение радиоактивной метки. В наибольшей степени эти преимущества сочетаются в конкурентном РИА. Для проведения этого анализа необходимо иметь специфические антисыворотки и меченые антигены при выявлении 5 антигенов и специфические антигены и меченые радионуклидом антитела при выявлении антител. При выявлении антигенов метод основан на конкуренции определяемого немеченого антигена с известным количеством меченого антигена за ограниченное количество добавленных в систему специфических антител. При этом количество меченого антигена, который связывается в иммунных комплексах, обратно пропорционально количеству немеченого антигена, содержащегося в исследуемом материале. Оба конкурирующих взаимодействия представлены на следующей схеме: Аг * АтАг * Аг * 2 4 5 Ат 1 АтАг Аг Аг 3 6 7 1 – специфическое антитело 2 – меченый антиген. 3 – немеченый антиген. 4 – иммунный комплекс антитела 1 с меченым антигеном 5 – свободный меченый антиген. 6 – иммунный комплекс антитела немеченым антигеном 7 – свободный немеченый антиген. С. Берсон и Я. Ялоу (1968) пользовались отношением активности связанной метки к активности свободной метки – коэффициент В/F, чтобы выразить связывание меченого антигена как функцию концентрации исследуемого антигена. Согласно закону действия масс К[Aт][ Аг] = [Аг Ат], где К – константа равновесия, при условии равновесия отношение связанного антигена к свободному В/F = [Аг Ат] / [Аг], где В – связанный антиген, F – свободный антиген. При типичной радиоиммунологической процедуре концентрация свободного антигена и находящегося в равновесии антитела описывается уравнениями [Аг] = [Aгi – Aг Ат] и [Ат] = [Атi – Aг Ат], Агi и Атi – исходные концентрации компонентов. Отсюда истинное отношение связанного антитела к свободному антигену описывается: В / F = [Aг Ат] / [Агi – Аг Ат]. Для РИА используется меченый радионуклидом антиген, который ведет себя также как холодный, поэтому В*/F* = [Аг* Ат] / [Агi* – Аг*Ат], где Агi* – исходное количество меченого антигена, Аг* Ат – количество связанного с антителом меченого антигена. Источником радиоактивного Аг*Ат является Ат + Аг + Аг* = Аг*Ат + АгАт. Отсюда очевидно, что если концентрация немеченого Аг будет увеличена при постоянной концентрации меченого Аг*, то первый займет большее число связывающих мест антитела. Результатом этого, будет снижение концентрации связанного меченого антигена [Аг*Ат]. Следовательно, отношение В*/F* =[Аг*Ат] / [Агi* – Аг*Ат] должно уменьшаться по мере увеличения в реакционной смеси холодного антигена немеченого. Так как немеченый антиген получен от пациента, соотношение В*/F* отражает количество вещества присутствующего в изучаемой пробе. Изменение этого отношения максимально тогда, когда концентрация антигена мала по сравнению с 6 концентрацией антитела. При проведении РИА нельзя не учитывать следующие факторы. Специфичность метода может быть снижена из-за перекрестной реактивности антисывороток и гетерогенности антигена. Решающее значение при этом имеет способ получения антисывороток. В идеале хорошо было бы иметь моноспецифические антитела, но их технологически трудно получить. Для РИА считается достаточным 50 % связывание меченого антигена в отсутствии холодного антигена. Если константа равновесия является низкой, то количество антител, необходимых для адекватного связывания антигена, должно быть увеличено. Однако избыток свободных антител будет снижать действие холодного антигена в этой системе. Чувствительность данной системы будет низкой и в том случае, если меченый антиген будет иметь низкую удельную радиоактивность. В данной ситуации для достаточного связывания меченого антигена потребуется введение в систему большого количества антител. В растворе, где присутствуют антигены (Аг) и специфические антитела (Ат), между ними устанавливается динамическое равновесие (по закону действия масс). В выше указанной реакции это динамическое равновесие можно выразить формулой: Аг Ат К , АгАт где: К– константа ассоциации или константа равновесия; [Аг Ат]– концентрация комплекса антитела с антителом; [Аг]– концентрация свободного антигена; [Ат]– концентрация свободного антитела. За последние 25 лет метод РИА нашел широкое применение в различных областях медицины. В ветеринарии он только начинает внедряться. Его используют при диагностике бактериальных и вирусных инфекций, а также обнаружения белков, гормонов, специфических ферментов, раковых антигенов, лекарственных препаратов, антибиотиков, различных органических соединений, которые прежде либо вообще не удавалось определить, либо для их определения требовались весьма трудоемкие методы, не отличающиеся ни достаточной точностью, ни чувствительностью (Ткачева Г., 1983). Применение метода РИА позволило выявить антигенные различия у штаммов вируса бешенства, и тем самым было дано объяснение неудач применения антирабических вакцин в некоторых случаях. Такого же рода работы были проведены с вирусом гриппа, герпеса, кори, оспы, ящура и других. Все исследователи отмечают высокую чувствительность и специфичность его при выявлении антигенов в патологическом материале. Радиоактивные изотопы и методы метки В РИА большое значение имеет выбор радиоактивного изотопа в качестве маркера. Наиболее часто для этих целей используются изотопы 14С, 3Н (β – излучатели) и 125I (γ – излучатель). Для метки антител и белковых антигенов наиболее перспективными являются γ–излучатели, и в частности, 125J, несмотря на его более короткий период полураспада, чем у 14С и 3Н. Для регистрации мягкого β – излучения этих изотопов требуется более сложное и дорогое оборудование с жидкосцинтилляционной детекцией. Техника мечения β – излучателями является более трудоемкой и технически сложной (Tixhon C. 1978). Определение γ – излучения представляет собой значительно более простую и дешевую операцию. Она не требует подготовки образцов, что позволяет экономить время и реактивы (Чард.Т.,1981). 7 Необходимым условием для высокой чувствительности РИА является высокая специфическая радиоактивность меченого вещества (Бобров Ю., 1981; Tixhon C., 1978), что может быть достигнуто в основном при использовании изотопов с γ – излучением (Casley D.,1977). Выбор метода йодирования определяется природой и свойствами изучаемого белка и дальнейшим его использованием. Лактопероксидазный метод (Thorell J. et al., 1971) предпочтительнее, когда необходимо сохранить биологическую активность меченого белка при изучении его in vivo. Метод Bolfon A. et al. (1973) нужно применять в тех случаях, когда антиген не может быть помечен другими способами. Большинство белков и полипептидов может быть с успехом йодировано хлораминовым методом без потери их иммунологической специфичности (Hunter W. et al., 1962). Поэтому для РИА во всех случаях, где это возможно, необходимо применять метод метки йодом с использованием хлорамина – Т. Порядок приготовления и контроль радионуклидных конъюгатов заключается в следующем: 1. в коническую колбу вносят иммуноглобулины, растворенные в 0,05М ФБР рН 7,5 с концентрацией 10 мг/мл и добавляют радиоактивный йод (на 1 мг иммуноглобулинов кролика 1,5-3,2 мКи, крупного рогатого скота – 1,8-2,0 и протеина А – 5,0 мКи); 2. реакцию активизируют внесением 0,1-0,2 мг хлорамина–Т, смесь энергично встряхивают в течение 60-75 секунд при 20-22°C; реакцию останавливают добавлением по 0,2 мл (2 мг/мл) растворов метабисульфата натрия и йодистого калия; 3. смесь наносят на колонку (диаметр 1,6 см, длина 40 см) с сефадексом Г-25 или Г-50 и проводят гель-фильтрацию, используя в качестве элюирующего раствора 0,05М ФБР рН 7,5; выход белка контролируют торцовым счетчиком типа «Луч-А», йодированный белок выходит первым пиком. Полученные радионуклидные конъюгаты контролируют по удельной радиоактивности, проценту кислотонерастворимой фракции и степени йодирования. Удельную радиоактивность препаратов определяют на гамма-счетчике, а содержание белка – по методу Лоури. При этом пользуются соотношением: радиоактив ность удельная радиоактив ность белок , которая измеряется в имп./мин на 1 мг белка, либо, с учетом эффективности гаммасчетчика, в мКи на 1 мг белка. Для определения кислоторастворимой фракции брали 0,01 мл полученного конъюгата и помещали в пробирку, затем вносили 1 мл 1 % раствора БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки тщательно встряхивают и оставляют на час при 20-22°С. Смесь центрифугируют в течение 10 минут при 5 тыс. об./мин, измеряют радиоактивность в осадке и надосадочной жидкости. Процент кислотонерастворимой фракции вычисляют по формуле: n1 n2 100 % , где n1 n2 n1 – радиоактивность в пробирке с осадком; n2 – радиоактивность в пробирке с надосадочной жидкостью. Степень йодирования (СИ) определяли в используемом объеме меченого раствора по содержанию белка по Лоури и его радиоактивность по формуле: СИ А А1 I Б А I M , где A1 Б 127 – радиоактивность белка (имп./мин); – радиоактивность смеси (имп./мин); – количество взятого для метки йода (мкг); – количество белка в пробе (мкг); 8 М – молекулярная масса белка; 127 – молекулярная масса йода. При таком способе метки мы получали препараты с удельной радиоактивностью 2,0 мКи/мг, степень йодирования 2,5 атом/моль и 95 % меченого белка. Типы и техника постановки РИА В классическом варианте РИА используется конкурентный тип постановки реакции. В конкурентную среду вводят известное количество меченого антигена, который конкурирует с определяемым антигеном за места связывания специфических антител (Yalow R. et al.,1960). Основные недостатки конкурентных методов заключаются в том, что для каждого определяемого антигена необходимо разрабатывать методы маркировки и способы получения антигенов высокой степени очистки. В том случае если антиген трудно выделить в чистом виде или провести его метку, наиболее подходящими способами его обнаружения являются варианты с использованием меченых антител. Среди последних наибольшее распространение получил «сандвич» – метод. Исходя из результатов собственных исследований «сандвич» – вариант РИА ставили по следующей схеме: полистироловые пластины сенсибилизировали иммуноглобулинами в концентрации 20-25 мкг/мл в дистиллированной воде в течение 16-18 часов при 20-22°С; остаточные сорбционно-активные центры на полистироле пластин блокировали 1% раствором БСА в 0,02М ФБР рН 7,2 в течение 60 минут при 37°С; исследуемые пробы антигенов наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 и выдержали 60 мин. при 37°С; специфический конъюгат наслаивали в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 в рабочем разведении 200 тыс. имп/мин и выдержали 60 минут при 37°С. Все компоненты реакции использовали в объеме 0,1 мл. После каждого этапа (наслоения) пластину 3-х кратно отмывали физиологическим раствором рН 7,4 с 0,05 % твина 20. При постановке реакции использовали контроли: контроль конъюгата: в первый ряд лунок сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят физиологический раствор рН 7,4 с 0,05% твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание меченых иммуноглобулинов с сенсибилизированной пластиной; положительный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вносят стандартный специфический антиген; отрицательный контроль: в 2 лунки 2-го ряда сенсибилизированной пластины вместо антигена вносят питательный бульон. В качестве другого варианта РИА, особенно ценного в тех случаях, когда исследователь располагает лишь небольшим количеством антител, предложена непрямая методика, при которой используют антивидовые меченые антитела, направленные к иммуноглобулинам применяемой антисыворотки (Hales C. et al.,1975). Учет и оценка результатов РИА Важной стадией разработки РИА является учет и оценка результатов. Данный метод, как и ИФА, предполагает автоматический инструментальный учет, что исключает субъективность оценки и снижает практически до нуля возможность ошибочного толкования полученных результатов. Инструментальный учет результатов проводят просчетом лунок в колодце гамма-счетчика «Гамма-1». Исследуемая проба 9 считается положительной при превышении счета связанной радиоактивности опытных образцов со специфическим антигеном над контролями в 2,5 и более раз. Для визуального учета результатов РИА может быть использована авторадиография на рентгеновской пленке. Сущность этого процесса заключается в том, что на последнем этапе постановке реакции, после отмывания меченого препарата, под пластинку подкладывается свинцовый коллиматор с отверстиями и лист рентгеновской пленки любой марки. Смонтированная система тщательно изолируется от света и оставляется на экспозицию в течение 24-48 часов. Проявление пленки осуществляется согласно наставлению по ее применению, и сравниваются пятна затемнения от радиоактивного излучения положительных проб и контролей. Проба считается положительной при наличии интенсивно черной окраски. Для диагностики инфекционных болезней РИА не получил такого распространения, как ИФА. Причинами этого являются недостатки, очевидные еще на заре разработки всех многочисленных модификаций метода: 1. короткий срок «жизни» антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами, ограниченный периодом полураспада изотопа; 2. высокая стоимость разового определения, обусловленная стоимостью регистрирующей аппаратуры;1 3. отсутствие полевых вариантов регистрирующей аппаратуры, что делает невозможным использование РИА в лабораториях, ведущих широкие серологические обследования; 4. усиленные меры по технике безопасности, связанные с радиационным риском для персонала;2 5. риск загрязнения окружающей среды радиоактивными продуктами (Покровский В. и др.,1983). Занятие 22. Иммуноферментный анализ (ИФА) . (Материал подготовлен совместно с д в н, профессором Алтайского ГАУ Барышниковым П.И.) Цель занятия: ознакомится с различными вариантами ИФА, применяемимы в вирусологической практике. Краткие теоретические сведения. Иммуноферментный анализ (ИФА) (синонимы: иммуноэнзимный метод, реакция энзим-меченых антител, ELISA-тест) – группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген-антитело с помощью субстрата, который расцепляется ферментом с появлением окрашивания. Иммуноферментный анализ – направление иммунохимии, разрабатывающее способы определения различных физиологически активных веществ с использованием ферментов в качестве маркеров антигенов и антител. Сочетание высокой специфичности антител и каталитической активности ферментов позволило создать универсальный метод для определения широкого класса соединений в диапазоне концентраций 10–1 до 10–12 г/мл. Впервые этот метод был разработан в 1966 году Nacaue R., Pierce, а также Avraineos S., Uriel I. для обнаружения внутри клеток различных антигенов и антител. До 1971 года ИФА использовали преимущественно в гистологических исследованиях для определения мест локализации антигенов в срезах тканей различных органов. В начале 70-х годов основное внимание исследователей было направлено на разработку методов ИФА для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. Современные методы количественного анализа А.Ф. Зыкин (1993) считает, что поскольку стоимость счетчика радиоактивности (основного прибора, необходимого для РИА) не превышает стоимости люминесцентного микроскопа, то эта причина несущественна. 2 В тех лабораториях, что не проводят метку, радиационная опасность сведена к минимуму. 1 10 подразделяются на две группы, принципиально отличающиеся способом отделения связавшегося с антителами (антигеном) ферментного конъюгата от свободного. В основе первой группы методов, объединенных под названием «гомогенный ИФА», лежит процесс ингибирования ферментативной активности конъюгата при взаимодействии с растворимыми антителами. Анализ в этом случае происходит без участия твердой фазы. Однако методы гомогенного ИФА используются, как правило, только для определения низкомолекулярных антигенов: стероидных гормонов, токсинов, гаптенов и лекарственных препаратов в биологических жидкостях. В основе второй группы методов, получивших название «твердофазный ИФА» или «гетерогенный ИФА», лежит разделение компонентов реакции с использованием антител (антигенов), иммобилизованных на нерастворимом носителе. Методы этой группы в настоящее время получили наибольшее практическое применение в серологической диагностике инфекционных болезней благодаря своей чувствительности, специфичности, быстроте постановки и автоматизации учета. В иммунологическом аспекте ИФА идентичен РИА, и все рассуждения о специфичности образования иммунных комплексов, влиянии гетерогенности препаратов антител и валентности антигенов на специфичность и эффективность РИА в равной степени справедливы и для ИФА В основе метода лежит присоединение растворимых антигенов или антител к твердой фазе с сохранением иммунологической активности и применение фермента в качестве маркера иммунологической реакции, происходящей на твердой фазе. Фермент в данном случае служит маркером иммунной реакции и позволяет наблюдать ее визуально или инструментально. Иммобилизацию можно провести путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, которые разработаны для получения иммобилизированных препаратов ферментов. Но наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров, предложенный шведскими учеными. Белок в этом случае связан с поверхностью носителя менее прочно, чем при ковалентной иммобилизации, но простота разделения иммунных комплексов и не связавшихся антител (антигенов) обеспечила быстрое распространение этой модификации ИФА. В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест (энзимсвязанный иммуносорбентный метод) или твердофазный метод ИФА. Следует отметить, что все варианты количественных иммуноанализов с использованием меченых антител обладают следующими преимуществами по сравнению с другими вариантами: антиген не подвергается метке и, следовательно, нет опасности его повреждения или изменения физико-химических свойств; молекулы антител более стабильны и лучше антигенов сохраняют свою активность при мечении; имеется возможность определения антигенов, которые с трудом поддаются метке или которые трудно получить в чистом виде; в результате использования избытка меченых антител потенциально может наблюдаться более высокая чувствительность и специфичность, так как из гетерогенной популяции антител в первую очередь будут реагировать молекулы, обладающие высоким сродством к антигену (Орлов А., 1981). Основными направлениями применения ИФА являются: ранняя диагностика инфекционных болезней; проведение массовых эпизоотологических обследований в целях своевременной профилактики животных от ряда инфекционных заболеваний, наносящих значительный ущерб животноводству; 11 определение иммунологического статуса у животных и изучение эффективности применения вакцин; контроль качества биопрепаратов и соблюдение норм на предприятиях биологической промышленности. Использование ИФА в диагностике инфекционных болезней. ИФА эффективно применяется для лабораторной диагностики сравнительно большого круга инфекционных болезней. При этом, используя различные модификации метода, можно одновременно проводить обнаружение антигенов и антител, что значительно повышает результативность исследования. В литературе накопились многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении ИФА при выявлении антител и антигенов в отношении почти всех из известных групп вирусов и бактерий, вызывающих заболевания животных: инфекционный бурсит кур (Джавадов Э., и другие,1993), инфекционный ринотрахеит крупого рогатого скота (Кузнецов В. и др.,1991), вирусная диарея (Красочко П. и др., 1991), болезнь Ауески (Мищенко В. и др.,1994), бешенство (Сазонова Э. и др.,1991), болезнь Ньюкасла (Cилаева Н. и др., 1991), инфекционный ларинготрахеит (Atiduk C. et al.,1989) и многих других. В настоящее время ИФА разработан при бруцеллезе, столбняке, сальмонеллезе, паратуберкулезе, лептоспирозе и практически при всех, имеющих эпизоотологическое и экономическое значение, вирусных болезнях сельскохозяйственных животных. Достаточно много работ опубликовано по обнаружению специфических антител в сыворотке крови при микоплазменных инфекциях сельскохозяйственных животных. Большинство авторов отмечают простоту постановки, экономичность и быстроту получения ответа при использовании ИФА, результаты которого коррелируют со многими общепринятыми серологическими методами (РНГА, РДП, РА, ВИЭОФ), но превосходят их по чувствительности, сохраняя при этом высокую специфичность. Компоненты реакции, условия их приготовления и применения Буферные растворы 0,02М фосфатный буферный раствор (ФБР), рН 7,2 (5,155 г Na2HPO4*12H2O и 0,761 г KH2PO4 растворяют в 1 литре дистиллированной воды); 0,05М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6 (0,795 г Na2CO3 и 1,465 г NaHCO3 в 500 мл дистиллированной воды); МФБР рН 7,4 с 0,5 % твина 20 (8,0 г NaCl, 0,2 г KH2PO4 и 2,9 г Na2HPO4 и 0,8 мл твина 20 растворяют в 1 литре дистиллированной воды); Физиологический раствор рН 7,3 с 0,05% твина 20 (на 1 литр физиологического раствора добавляют 0,8 мл твина 20); Барбиталовый буфер рН 7,4 (125,5 г NaCl, 15,3 г Na-5,5-диэтилбарбитурата, 51,9 мл 1H раствора HCl, 1,53 г MgCl2*6H2O и 0,492 г CaCl2*6H2O растворяют в 3 литрах дистиллированной воды) 0,001М ацетатный буфер рН 4,3 – 4,4 (0,136 г CH3COONa*3H2O растворяют в 1 литре дистиллированной воды и подкисляют ледяной уксусной кислотой до указанного значения рН). Реактивы. Субстрат: 5-аминосалициловая кислота (5-АС). 5-АС растворяют в горячей дистиллированной воде (70°C) в концентрации 0,8 мг/мл, охлаждают до 20-22°С и доводят рН до 6 0,1N раствором едкого натра (NaOH); 30%-ный раствор перекиси водорода (Н2О2): хранят при +4°С в склянке из темного стекла; 12 Субстратная смесь: готовят непосредственно перед добавлением в лунки пластин смешиванием растворов 5-АС и 30%-ного раствора Н2О2 (к 20 мл 5-АС добавляют 0,020 мл 30 %-ного Н2О2); 1N раствор едкого натра (NaOH): 10г NaOH растворяют в 250 мл дистиллированной воды; 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА): 1г БСА растворяют в 100 мл 0,02М ФБР, рН 7,2; 0,1М раствор периодата натрия (NаIO4): 53,5 мг NаIO4 растворяют непосредственно перед применением в 2,5 мл дистиллированной воды; Раствор борогидрида натрия (NaBH4): 20 мг NaBH4 растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Оборудование. Для приготовления необходимых ингредиентов и постановки ИФА используется следующее основное оборудование: автоматические пипетки с регулируемым объемом модели Р-20, Р-200, Р-1000 и Р-5000 (фирма Gilson, Франция); автоматические пипетки с постоянным объемом модели F-10 – F-100 (фирма Gilson, Франция); 4-8-12 канальные автоматические пипетки с постоянным и регулируемым объемом модели 50 – 200 (фирма Flow Laboratories, Англия); спектрофотометр типа Titertek Multiskan (фирма Flow Laboratories, Англия); система для жидкостной хроматографии (фирма Pharmacia-LKB, Швеция); прибор для электрофореза модель GS-411 (фирма, Pharmacia-LKB, Швеция); холодильник, термостат, рН-метр (Россия); лабораторная посуда. Твердая фаза. Для твердофазного ИФА используется множество различных носителей, к которым сорбционно или, реже, ковалентно присоединяются соответствующие антигены и антитела. В ранних работах носителями служили частицы сефарозы, целлюлозы, биогель, латекс, пористое стекло, силохромы и другие. Наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции на поверхности полистирольных пластин с 96 лунками. Количество адсорбированного вещества при этом зависит от многих факторов: природы и дозы сенситина, рН, времени сенсибилизации, температуры инкубации. Удобно заранее заготовить панели с адсорбированным на них белком и хранить их в холодильнике до употребления. Можно также длительно сохранять сенсибилизированные панели при – 70°С. На сегодняшний день широко используются полистироловые пластины зарубежных фирм (Cooke, Dynateck; Linbro; Flow и другие), ленин-градского завода «Медполимер» и производства ВНИИ медтехники. При получении новой партии пластин необходимо проверять их сорбционную емкость. Для этого отбирают несколько и в каждую лунку вносят по 0,2 мл 5-кратных разведений нормальных бычьих иммуноглобулинов (от 10 до 1000 мкг/мл). После инкубации в течении 16 часов при температуре 20-22°С и последующего отмывания в лунки на 20 минут вносят по 0,2 мл 1%-ного раствора овальбумина. Затем пластины отмывают и добавляют рабочее разведение антивидового (антибычьего) пероксидазного конъюгата на 50 минут при 37°С. Если при данных сенсибилизирующих дозах иммуноглобулинов оптическая плотность после добавления субстрата составляет 13 примерно 1,0, то считают, что сорбционная емкость этих пластин удовлетворительная. При этом разброс показателей параллельных образцов не должен превышать 10 %. Фермент. Ферменты представляют собой очень удобные метки потому, что их каталитические свойства позволяют действовать им в качестве усилителей, т. к. одна молекула фермента может способствовать образованию более 1·105 молекул продукта каталитической реакции в минуту (Johuson K. et al., 1980). Выбор фермента-метки диктуется не только свойствами самого фермента и условиями опыта, но также склонностью автора, выбирающего наиболее доступный и подходящий для себя фермент. Фермент, выбираемый для метки антител, должен соответствовать следующим нескольким требованиям: быть относительно дешевым; хорошо растворяться в воде; сохранять стабильную активность; иметь свободные реакционно-способные группы (например, –NH2, -COOH, или –SH) для связывания с иммунологически активной молекулой. Для постановки ИФА различными авторами наиболее часто использовались такие ферменты как пероксидаза, щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, галактозидаза, глюкозооксидаза и другие. Нельзя рекомендовать какой-либо один фермент; у каждого есть свои недостатки и достоинства, поэтому выбор фермента зависит не только от перечисленных выше качеств, но и конкретных целей и способов исследования. Наиболее часто используют в ИФА пероксидазу, которая широко дос-тупна и не так дорога, как другие ферменты, стабильна при хранении. Пе-роксидаза является гликопротеидом (Мол. масса 40000), содержит 18% углеводов. Углеводная часть ее не проявляет энзиматической активности и поэтому может служить местом для прикрепления к ней белков (8 точек). Препараты пероксидазы производят ряд зарубежных фирм (Serva, ФРГ; Fluka, Швейцария), налажен также выпуск отечественной пероксида-зы. Ферменты этих фирм, как и препарат отечественного производства, являются высокоочищенными, высокоактивными и их можно непосредственно использовать в работе. Субстрат. Выбор субстрата для выявления активности связанного фермента в системе «антигенантитело» зависит от вида фермента-метки, так как реакция фермента с субстратом весьма специфична. Кроме того, желательно использовать субстраты, позволяющие проводить визуальный и инструментальный учет реакции. С этой точки зрения, наиболее подходящи, так называемые, хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Для выявления активности пероксидазы в твердофазном ИФА в качестве субстрата чаще всего используют 5-аминосалициловую кислоту, образующую интенсивное коричневое окрашивание, орто-фенилендиамин, дающий оранжево-желтое окрашивание, и ABTS, дающий окраску цвета морской волны. Для выявления активности щелочной фосфатазы и (b-галактозидазы используется исключительно нитрофенил-фосфаты и нитрофенил-галактозиды, соответственно. Для повышения чувствительности ИФА предложен субстрат, дающий при расщеплении продукт, обладающий способностью к флюоресценции (Prouovost E et al.,1981). В этом случае, даже минимальная степень преобразования субстрата может быть зарегистрирована высокочувствительным прибором – флюориметром. Выделение иммуноглобулинов и методы контроля их чистоты, активности и специфичности 14 Сыворотка, полученная от животных, помимо широкого набора антител содержит и «балластные» белки, способные адсорбироваться на твердом носителе, мешать связыванию антител и значительно снижать чувствительность и специфичность реакции. Во избежании этого исходную антисыворотку очищают с помощью 2 – 3-кратного осаждения сульфатом аммония, полиэтиленгликолем (Berqquist N. et al., 1970) или каприловой кислотой (Steiubuch W. et al.,1969) с последующим фракционированием белков гельфильтрацией (Остерман Л.,1985). В своей повседневной работе для получения иммуноглобулинов из сыворотки кролика и крупного рогатого скота предварительно выделяли гамма-глобулиновую фракцию белка: из кроличьей антивидовой сыворотки 3-х кратным высаливанием сульфатом аммония при 35 % -ном насыщении, а из сыворотки крупного рогатого скота – 2-х кратным высаливанием при 45 %-ном насыщении. 15 – 20 мл раствора высаленных глобулинов (30-40 мг/мл) вносили в колонку (диаметр 2,6 см, длина 100 см) с Ультрогелем АсА-34 для выделения иммуноглобулинов класса G методом двукратной гельфильтрации. В качестве элюирующего раствора использовали 0,25 М раствор NaCl на 0,01М ФБР, рН 8,0, при скорости элюции 30 мл/час. Выход белка их колонки регистрировали на проточном спектрофотометре (иммуноглобулины G содержатся во фракциях второго пика, которые объединяют: концентрируют высаливанием и вновь подвергают гельфильтрации). После второго цикла гельфильтрации получали один пик белка. Полученый материал концентрировали сульфатом аммония при 50 % насыщении и диализовали против дистиллированной воды в течение 2-х суток, сменяя воду не менее 4-6 раз. Степень освобождения от ионов сульфата контролировали 10 % -ным раствором BaCl2. Активность препаратов иммуноглобулинов из кроличьей антисыворотки проверяли в РДП (не ниже 1:64), а из специфической сыворотки крупного рогатого скота – в непрямом методе ИФА (не ниже 1:1600) чистоту фракций контролировали при помощи иммуноэлектрофореза (ИЭФ). Техника постановки распространенных вариантов ИФА Известно значительное число модификаций постановки ИФА в зависимости от природы определяемых веществ и целей исследования. Все методы ИФА подразделяются на две основные группы: гомогенные и гетерогенные методы ИФА. Первые характеризуются тем, что вся совокупность иммунологических и ферментативных реакций происходит в единой смеси всех используемых компонентов реакции без их разделения и удаления промежуточных продуктов и не прореагировавших компонентов. Для вторых характерно проведение анализа на твердой фазе в виде последовательных стадий, причем после каждой стадии происходит отмывка твердой фазы и, соответственно, удаление промежуточных продуктов и избытка не прореагировавших компонентов. Необходимо отметить, что гомогенные методы анализа очень сложны в отработке оптимальных условий их проведения и используются практически только для определения низкомолекулярных гормонов, метаболитов и лекарственных веществ. Гетерогенные же методы ИФА более просты и воспроизводимы и поэтому стали широко использоваться для качественного и количественного выявления высокомолекулярных веществ и получили широкое распространение в диагностике инфекционных болезней человека и животных. Наиболее простыми и часто употребляемыми в диагностике вариантами твердофазного ИФА для определения антител и антигенов являются: непрямой метод и метод ингибирования – для выявления антител; метод «двойных» антител (сандвич) для выявления антигенов. 15 Сенсибилизация специфическим стандартным антигеном Добавление исследуемой сыворотки Е Е Добавление антивидового конъюгата Е Е Е Добавление субстрата Е Е Специфический антиген Е Исследуемая сыворотка Е Антивидовой конъюгат Субстрат Рис. 1. Рис 1. Непрямой метод Непрямой метод. Данный вариант ИФА проводят с использованием антивидовых конъюгатов. Наиболее распространенными антивидовыми коньюгатами являются меченые ферментом антитела кролика, иммунизированного глобулинами других видов млекопитающих (например, крупного рогатого скота), меченые антитела осла, иммунизированного иммуноглобулинами кролика и т. д. Данный подход позволяет решить проблемы серодиагностики заболеваний животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА. Непрямой твердофазный метод ИФА ставили по следующей схеме (рис.1): пластины сенсибилизировали в течение 16 – 18 часов при 20 – 22°С специфическим антигеном в концентрации 15-20 мкг/мл в 0,05М карбонатном буфере рН 9,6; не связанные адсорбционно активные центры на полистироле пластин блокировали 1% раствором БСА на 0,02М ФБР рН 7,2 с 0,05 % твина 20 при инкубировании в течении 45 минут при 37°С; исследуемые сыворотки в последовательных разведениях на ФБР-твин вносили в лунки, сенсибилизированные антигеном; антивидовой конъюгат вносили в лунки в рабочем разведении 1:1000 – 1:2000 в ФБР рН 7,4 с 0,05 твина 20, инкубировали в течение 45 минут при 37°С; вносили субстратную смесь и выдерживали пластины при 20-22°С в течение 30 минут для визуального или инструментального учета. Все компоненты реакции вносили в объеме 0,2 мл. После каждого этапа (внесения реактантов в лунки) пластины отмывали физиологическим раствором рН 7,3 с 0,05 % 16 твина 20. Для этого лунки заполняли этим раствором, встряхивали и содержимое выливали, повторяли отмывание до 3-х раз. При постановке реакции использовали контроли: контроль субстрата: в I-й ряд сенсибилизированной пластины вносили только субстратную смесь, в промежуточные этапы – ФБР рН с 0,05% твина 20. Субстратный контроль использовали в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра; контроль коньюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо сыворотки вносили ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль коньюгата выявляет неспецифическое связывание коньюгата с антигеном; положительный контроль: положительную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении 1:400 в ФБР рН с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины; отрицательный контроль: нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении 1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины (Барышников П.,1995). Твердофазный «сандвич»–вариант ИФА. Этот вариант ИФА является крайне распространенным для определения антигенов, обладающих более чем одной распознаваемой антителами детерминантой. В процессе анализа антиген как бы «зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода «сандвич». Это название теперь используется практически во всей литературе на правах официального термина. Данный вариант ИФА ставили по следующей схеме (рис.2): полистироловые пластины сенсибилизируют в течении 16-18 часов при 20-22°С иммуноглобулинами в концентрации 5-10 мкг/лунку в 0,05-0,1 М карбонатном буфере рН 9,0-9,5; наслаивают 1% раствор БСА на 0,02М ФБР рН7,2 выдерживают в течение 45 минут при 37°С; исследуемые пробы антигенов наслаивают в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина-20, выдерживают 45 минут при 37°С; наслаивают конъюгат в рабочем разведении 1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20, выдерживают 45 минут при 37°С; вносят субстратную смесь и пластины выдерживают при 20-22°С в течение 15-20 минут для визуального и инструментального учета. Все компоненты реакции вносят в объеме 0,2 мл. После каждого этапа пластины отмывают физиологическим раствором рН 7,3 с 0,05% твина 20. Для этого лунки заполняют этим раствором, встряхивают и выливают содержимое, затем вновь повторяют отмывание до 3-х раз. При постановке реакции использовали контроли: контроль субстрата: в 1-й ряд сенсибилизированной пластины вносят только субстратную смесь, в промежуточные этапы ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20.Субстратный контроль используется в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра; контроль конъюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо антигена, вносят ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание конъюгата с сенсибилизированной пластиной; положительный контроль: специфический антиген в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 вносят в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины. Основным достоинством «сандвич» – варианта является высокая чувствительность, превышающая возможности других схем твердофазного ИФА. Эффективность 17 образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело и концентрации компонентов. При данной величине константы связывания и крайне низких концентрациях антигена рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования специфических комплексов за счет использования избытка иммобилизированных и меченых ферментом антител. Ограничением применения «сандвич»- варианта ИФА является невозможность определения моновалентных антигенов – стероидных гормонов, лекарств, пестицидов и т.д. (Дзантиев Б.,1985). Сенсибилизация специфическими иммуноглобулинами Добавление искомого антигена Е Е Добавление специфического конъюгата Е Е Е Добавление субстрата Е Е Специфические иммуноглобулины Е Искомый антиген Е Специфический конъюгат Субстрат Рис. 2. Рис. 2 Твердофазный «сандвич»–вариант ИФА. Метод ингибирования ИФА. Данный вариант ИФА также используется для выявления специфических антител в сыворотке крови больных животных, особенно при использовании антительных реагентов, приготовленных на основе моноклональных антител. Его выполнение не требует дополнительных компонентов, а используют те же, которые применяют при постановке «сандвич» -варианта ИФА. Тем самым, использование этого варианта ИФА имеет значение в том плане, что применение одних и тех же компонентов для реализации 2-х целей должно повысить универсальность и эффективность реакции, а также снизить стоимость анализа. Метод ингибирования ИФА ставили по следующей схеме (рис. 3): полистироловые пластины сенсибилизировали в течении 16-18 часов при 20-22°С иммуноглобулинами в концентрации 5-10 мкг/лунку в 0,05-0,1М карбонатном буфере рН 9,0-9,5; наслаивали 1% раствор БСА на 0,02М ФБР рН 7,2, выдерживали 45 минут при 37°С; 18 Сенсибилизация специфическими иммуноглобулинами Добавление специфичного антигена Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Добавление исследуемой сыворотки и специфического конъюгата Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е Добавление субстрата Е Специфические иммуноглобулины Е Е Специфический конъюгат Исследуемая сыворотка Субстрат Специфический антиген Рис. 3. Рис 3. Метод ингибирования ИФА. специфический антиген наслаивали в разведении 1:40 в ФБР рН 7,4 с твином 20, выдерживали 45 минут при 37°С; исследуемые пробы сывороток наслаивали в разведении с 1:10 до 1:1280 в ФБР рН 7,4 с твином 20, выдерживали 45 минут при 37°С; наслаивали конъюгат в рабочем разведении 1:200 в ФБР рН 7,4 с твином 20, выдерживали 45 минут при 37°С; вносили субстратную смесь, выдерживали при 20-22°С в течение 20 минут для визуального и инструментального учета. Все компоненты реакции используются в объеме 0,2 мл. После каждого этапа пластину 3-х кратно отмывали физиологическим раствором рН 7,2 с 0,05 % твина 20, как было указано для дугих вариантов ИФА. При постановке реакции использовали контроли: контроль субстрата: в 1-й ряд сенсибилизированной пластины вносили только субстратную смесь, а вместо других компонентов – ФБР рН 7,4 с твином 20. Субстратный контроль используется в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра; контроль конъюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо антигена и сывороток вносили ФБР рН 7,4 с твином 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание конъюгата с сенсибилизированной пластиной; 19 положительный контроль: специфическую сыворотку крупного рогатого скота в разведении 1:10 в ФБР рН 7,4 с твином 20 вносили в 2 лунки 3 ряда сенсибилизированной пластины; отрицательный контроль: нормальную сыворотку крупного рогатого скота в разведении 2: 10 в ФБР рН 7,4 с твином 20 вносили в 2 лунки 3 ряда сенсибилизированной пластины. Учет и оценка результатов ИФА Учет результатов ИФА проводят визуально по интенсивности окраски в разведениях исследуемой пробы или при помощи регистрирующих приборов. Визуальный учет результатов прост и удобен при исследовании проб, содержащих антитела или антигены в высокой концентрации. При этом реакцию оценивали положительно при наличии интенсивной коричневой окраски. (В методе ингибирования ИФА, в отличие от других, отрицательные сыворотки дают интенсивное окрашивание, а сыворотки имеющие антитела – не окрашиваются. Это объясняется тем, что отрицательные сыворотки не взаимодействуют с антигеном (нет антител) и он тем самым сохраняет свободные валентности для связывания с конъюгатом, а это позднее выявляется субстратом. В свою очередь сыворотки, имеющие антитела, реагируют с антигеном и у него не остается свободных валентностей для взаимодействия с конъюгатом, а как следствие – отсутствие окрашивания.) Для более точного (объективного) измерения применяют регистрирующие приборы – спектрофотометры, которые одновременно позволяют определить концентрацию в пробе материала по заранее построенной стандартной кривой в зависимости от оптической плотности пробы. В данном случае реакцию оценивают положительно при оптической плотности исследуемой пробы в 2 и более раза превосходящей плотность отрицательного контроля. Принцип учета и оценка результатов в методе ингибирования ИФА аналогичный, с той лишь разницей, что исследуемая проба считается положительной, если имеет оптическую плотность в 2 и более раза ниже оптической плотности отрицательного контроля. Инструментальный учет результатов удобно проводить на сканирующем спектрофотометре типа Titertek Multiskan, который позволяет быстро оценивать цветную реакцию в лунках полистироловых панелей. Он распечатывает замеренные с высокой точностью значения оптической плотности и позволяет применять светофильтры с разной длинной волны в зависимости от цвета продукта ферментативной реакции. Другие варианты и модификации ИФА В целях повышения чувствительности, ускорения постановки и учета реакции были разработаны и предложены еще несколько усовершенствованных модификаций ИФА: энзимрадиоиммунный анализ: Основан на комбинации иммуноферментного и радиоиммунного анализов; что позволяет повысить чувствительность реакции в 1000 и более раз (Harris C.et al.,1979); иммуноферментный флуоресцентный метод: предполагает использование флуорогенного субстрата, что повышает чувствительность реакции в 10-100 раз, обладает лучшими экономическими показателями (Crum I.et al.,1980; Von Aert A. et al.,1984); термометрическая модификация: основана на измерении температуры, возникающей в процессе взаимодействия фермента с субстратом, продолжительность анализа при этом сокращается до 10 минут, а чувствительность достигает 10–10 моль (Muttia Sou B.,etal.,1977); Следует отметить, что упомянутые методы, а также и некоторые другие, довольно трудоемки в техническом отношении, далеки от автоматизации и поэтому не смогут составить конкуренцию обычным модификациям ИФА для целей экспресс – диагностики. 20 Детальное описание и схемы постановки многочисленных методов твердофазного ИФА приведены в книге «Иммуноферментный анализ» под ред. Т.Т.Нго и Г.Ленхоффа, М., Мир, 1988. Dot–ИФА. Метод точечного иммуноферментного анализа В последние годы преобладает стремление к снижению стоимости диагностических процедур и использованию метода не требующего дорогого оборудования. В связи с этим разработан более простой и достаточно дешевый вариант ИФА. Такую модификацию назвали dot-ИФА (dot-Elisa-точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dotИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют легко различимые цветные пятна, в результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Белый цвет подложки вокруг пятен помогает контролировать реакции неспецифического связывания (или неспецифической адсорбции). Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течении многих лет без потери интенсивности окраски. Кроме того, простота постановки и малые расходы антигена и других компонентов, необходимых для проведения реакции, позволяет ее использовать в полевых или домашних условиях. В таблице даны сравнительные показатели dot-ИФА и ИФА (М. Pappas,1988). Сравнительная характеристика dot-ИФА и ИФА. Показатели, характеристики dot-ИФА ИФА 2 ч. 3 – 6 ч. Число этапов постановки 3 4–5 Число промывок 3 3 0,05 – 0,1 1–2 Специальная подготовка персонала нет да Применяемость в полевых условиях да нет Необходимость фотометра нет да Возможность непрерывной регистрации да нет Продолжительность Цена анализа (USD) Принцип метода аналогичен с ИФА. Поэтому остановимся на особенностях постановки реакции. Антигены В dot-ИФА можно применять различные типы антигенов, как виде живых вирусов и бактерий, так и полученные в результате разрушения бактерий или вирусов. Для уменьшения потерь антигенов на стадии промывки детергентом связанные белковые антигены можно фиксировать ковалентно с помощью глютарового альдегида. Данная методика постановки реакции способствует сохранению антигенности препаратов и позволяет проводить большее количество анализов с ограниченным количеством антигена. Антиген наносят на твердую подложку в объеме от 0,1 до 3 мкл. Удобнее пользоваться стеклянными гамильтоновскими шприцами объемом до 10 мкл и ценой деления 0,1 мкл. При использовании солюбилизированных антигенов лучше использовать мембраны с малым диаметром пор, так как на них белки связываются в основном с поверхностью. При применении целых клеток простейших, размером 5 – 10 мкм, величина пор не играет большой роли. 21 Схема постановки Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены, так и антитела. Все стадии инкубации и промывки выполняются при комнатной температуре. В начале диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором. Для этого лучше всего подходит 3-5% раствор очищенного бычьего сыво-роточного альбумина в триэтаноламиновом буферном растворе (БСА-СТБ), но можно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1 %-й раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе NaCl (СФБ) при обнаружении антител. 50 мкл сыворотки пациента в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске, антитела связываются с антигеном, сорбированном на диске. Далее диск трехкратно промывают в растворе детергента. Для этого можно использовать 0,05%ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, который является мягким неионным поверхностно активным веществом. Используют и 0,05 % раствор твин 20 в солевом растворе трис-HCl. После промывания диски инкубируют с 50 мкл конъюгата афинно очищенных антивидовых антител с ферментом. При данном иммуноанализе широко используют конъюгаты антител с пероксидазой,так как молекулы этого фермента меньше по размерам молекул щелочной фосфатазы и их избыток легче вымывается из пор нитроцеллюлозной мембраны. Но нельзя забывать, что пероксидаза инактивируется азидом натрия, часто используемым в качестве консерванта, а также ароматическими хлорсодержащими углеводородами присутствующими в деионизированной воде, если для ее получения использовали полистирольные смолы. Конъюгаты с щелочной фосфатазой в меньшей степени подвержены действию различных веществ, но из-за большого размера молекулы фермента они дают более высокий фоновый сигнал. После того как провели отмывку несвязавшегося материала добавляют хромогенный субстрат, дающий нерастворимый продукт ферментативной реакции. При окислении субстрата ферментом в присутствии перекиси водорода образуется четко окрашенное пятно. При использовании пероксидазы в качестве субстрата используют 4-хлор-1-нафтол (4ХН), дающий голубую окраску пятен, или диаминобензидин, образующий коричневое окрашивание. При применении щелочной фосфатазы в dot-ИФА применяют 5-бром-4-хлориндолил3-фосфат (БХИФ), образующий голубое пятно. Во всех случаях интенсивность окраски пропорциональна количеству связавшихся антител. При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, после чего проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и затем с конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом. Последний способ дает более четкую положительную реакцию даже при минимальной концентрации антигена. В двухсайтовом dot-ИФА при определении антигенов вначале на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются этими антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность,так как при промывании удаляются несвязавшиеся, мешающие определению, антигены. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т.(1993) приводят следующую схему постановки dot-ИФА, используемую для диагностики сапа, мелоидоза, чумы, туляремии. Определяемый антиген, разведенный 0,1М трис-HСl буфером, наносят в объеме 2 мкл на нитроцеллюлозный мембранный фильтр (НМФ) (размеры пор 0,22-0,45 мкм, использовали мембраны фирм «Millipor»(США), «Schleicher-Schull» (ФРГ), «Synpor» (Чехия)), антиген инкубировали на фильтре при 56°С в течение 30 мин. Затем наносили 5 % раствор БСА и помещали в термостат на 30 мин. при 37°С. Фильтр дважды по 5 мин промывали раствором 0,15М NaCl c твином 20 в кювете на аппарате для встряхивания. После этого НЦМ заливали иммунопероксидазным конъюгатом (ИПК) в рабочем 22 разведении, инкубировали 30-60 мин.при 37°С. Заключительное промывание проводили четырех-пятикратно по пять минут. Далее для проведения реакции НЦМ погружали в рабочий раствор субстрата на 10-15 мин. и проводили учет. При положительном результате на НЦМ проявлялись коричневые точки (пятна), в отрицательном варианте поверхность была бесцветна. Для определения антител использовали следующую схему. На МЦМ наносили взвесь микроорганизмов в концентрации 108, оставляли на 18 часов при температуре +7°С, подсушивали, обрабатывали БСА, отмывали, а потом исследуемую сыворотку наносили на мембрану. Фильтр (НЦМ) двукратно промывали, погружали в антивидовой пероксидазный конъюгат на 1 час при 37°С, четырехкратно промывали и погружали в раствор субстрата с последующим учетом реакции. По наблюдениям авторов специфичность данного метода не уступает классическому ИФА, а чувствительность ниже только на один порядок. Чувствительность, специфичность метода. Хорошие результаты в этом направлении впервые были продемонстрированы при диагностике висцерального лейшманиоза у людей. Специфические антитела в пробе выявляли в количестве от 0,1 нг и выше (Pappas M., 1983). Специфичность метода составила 98 %. Перекрестные реакции с 9 вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, схожими по клинике с лейшманиозом, отсутствовали. Показатели воспроизводимости результатов при использовании dot-ИФА была чуть выше по сравнению с обычным ИФА и значительно лучше, чем при использовании РСК. Сравнительные исследования показали, что чувствительность и специфичность dot-ИФА и ИФА равноценна. Специфичность и чувствительность метода практически не зависели от сроков хранения сенсибилизированной мембраны. Если мембраны с нанесенными антигенами хранились при комнатой температуре (22°C) в течение 60 дней, то наблюдали снижение титра на 2 разведения. При хранении при температуре 4°С (холодильник бытовой) понижение титра на 1 разведение наблюдали через 3 дня. Хранение при –20°С даже через 270 дней не приводило к уменьшению их реакционной способности. Подвергли проверке и конъюгированные с пероксидазой антитела и субстраты, хранившиеся при 4°С до 28 дней. Указанные условия и сроки хранения не приводили к снижению титра. Кроме того, титры в dot-ИФА не изменяются и после нескольких циклов замораживания – размораживания контрольной сыворотки. Оборудование Для данного метода предложено использовать 96 луночные микропланшеты, в дно лунок которых вплавлены пористые нитроцеллюлозные мембраны. Papas et al. предложили применять полоски нитроцеллюлозных мембран на пластиковой подложке (дипстики). Их удобнее использовать в полевых условиях. Однако необходимо учитывать, что полоски легко ло-маются и очень не прочны. Поэтому предложено, чтобы эти нитроцеллю-лоидные фильтры после нанесения антигена наклеивали на гибкие пластиковые полоски. Сейчас используют мультиантигенные дипстики – с четырьмя разными антигенами. Экспериментально доказано, что этот вид дипстиков обладает диагностической чувствительностью. Третий вид экспериментального оформления dotИФА разработан специально для экспресс-диагностики. Антиген наносится на непрозрачные пластиковые карточки в виде точек расположенных так же, как и на обычном микротитровальном планшете. Эту карточку можно обрезать, если использовано небольшое количество проб. Результаты dot-ИФА на карточках в 97 % случаев согласуется с результатами анализа при использовании коммерческого набора. Таким образом, основным преимуществом dot-ИФА является возможность его использования в различных условиях и для различных количеств исследуемых образцов. Все модификации этого метода отличаются экономичым расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием, наборы очень компактны. По-видимому, в ближайшее время этот метод найдет широкое применение. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо 23 1. Ознакомить студентов с наборами для проведения РИА, ИФА. 2. Обнаружить и идентифицировать вирусспецифический антиген с помощью иммунопероксидазной реакции. 3. Провести учет реакции. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация наборов для проведения ИФА; постановки и учета ИФА. 4. Самостоятельная работа студентов. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию Методические указания Время данного занятия целесообразно распределить так, чтобы студенты смогли провести самостоятельную работу. Для ее проведения желательно взять препарат-отпечаток, иммунную сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, антивидовой противовирусный конъюгат и субстрат. Вопросы домашнего задания 1. Вирусы европейской и африканской чумы свиней. ЗАНЯТИЕ 23. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ. (Материалы подготовленны совместно с зав лабораторией ВНИИВВиМ Малоголовкиным С.) Цель занятия: изучить суть использования моноклональных антител Краткие теоретические сведения Вторая половина двадцатого века характеризуется появлением в человеческой цивилизации нового, доселе отсутствующего, фактора получившего название научно технической революции. В данное понятие входит и биологическая революция, имея в виду довольно широкий круг открытий в области молекулярной генетики, цитологии, иммунологии и т.д. Однако кардинальным событием последней четверти нашего столетия стало то, что экспериментальные работы в разных областях биологии привели к развитию качественно нового направления – гибридомной технологии. Работы по созданию гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МАт), были сделаны не на «пустом» месте. О возможности возникновения гибридов между соматическими клетками в организме животных и человека, например при вирусных и бактериальных болезнях, знали еще задолго до открытия гибридомной технологии. В 1960 году Барски с сотрудниками сообщили о выделении линии гибридных клеток в культуре ткани. Гибридная клетка – это клетка, образовавшаяся при слиянии двух или большего числа соматических клеток, в результате которого происходит обобществление клеточных мембран, цитоплазмы и, главное, хромосомных аппаратов – носителей генетической программы жизнедеятельности клеток. Уникальность данного феномена состоит в том, что гибридные клетки оказываются не «уродами», неспособными к нормальной жизнедеятельности, а наоборот, они унаследуют и объединяют в себе свойства обеих родительских клеток, в том числе способность к делению и специфическим биосинтезам. Хронология основных событий, последовавших за первой работой по выделению гибридных клеток в культуре тканей, прекрасно представлена в книге Н.Рингерца и Р.Сэвиджа, опубликованной в Нью-Йорке в 1976 г. и переведенной на русский язык в 1979 г. Исследования различных гибридных клеток животных и растений сделали неоценимый вклад во многие области биологии, особенно генетики. Достаточно отметить такие достижения, как картирование генов в хромосомах человека и обнаружение ряда фундаментальных закономерностей фенотипического выражения (экспрессии) генов в соматических клетках. Тем не менее, о гибридных клетках, как о методологическом направлении биотехнологии, стали думать и писать тогда, когда в качестве одного из партнеров для гибридизации стали использовать иммунокомпетентные клетки, т.е. 24 лимфоциты, а в качестве второго – бесконечно пролиферирующие опухолевые клетки, как бы «увековечивающие» продуктивную деятельность лимфоцитов. Первые сообщения о гибридных клетках, продуцирующих антитела к известным антигенам, были сделаны в 1969 году С. Синковицем из отдела клинической вирусологии и иммунологии университета в Техасе. В своих исследованиях автор наблюдал спонтанное образование гибридных клеток между лимфоцитами и плазматическими клетками лейкозных мышей. Эти гибридные клетки неограниченно делились и продуцировали антитела к антигенам вируса лейкоза мышей. В 1971 году Б.Мохит опубликовал в журналах «PNAS» и «Science» работы по продукции иммуноглобулинов в клетках-гибридах между клетками миеломы и лимфомы мышей. Однако ни один из этих авторов не пришел к выводу о возможности целенаправленного получения линий гибридных клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности. Поэтому гибридомы как метод получения моноклональных антител открыли именно Г.Келер и Ц.Мильштейн, работавшие в то время в лаборатории молекулярной генетики иммуноглобулинов в Кембридже. В их работе «Длительно живущие культуры гибридных клеток, секретирующие антитела предопределенной специфичности», опубликованной в «Nature» в 1975г., показан тот уровень обобщения идеи, который необходим и достаточен для начала нового направления в науке и народном хозяйстве – иммунобиотехнологии и, в частности, гибридомной технологии. Суть их открытия одновременно является сутью метода гибридомной технологии. Авторы применили существовавший уже метод гибридизации соматических клеток к иммуноцитам. Они слили лимфоциты от иммунизированной эритроцитами барана мыши с сингенной и гистогенетически близкородственной опухолевой клеткой перевиваемой in vitro плазмоцитомы. В результате получились жизнеспособные гибридные клетки, которые неограниченно делились как один из родителей и продуцировали специфические антитела как второй из родителей. Такие искусственно созданные специализированные линии клеток назвали гибридомами. От опухолевой клетки гибридомы наследуют способность спонтанно размножаться, начиная от одной единственной клетки. Поэтому гибридомные клетки могут быть физически разделены in vitro по одной, каждая из которых, делясь митозом, превращается в клон – популяцию генетически идентичных клеток. Антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, стали называть моноклональными (МАт) за их происхождение. Понятие моноклональности существовало в иммунологии давно. Идея о клонально-селекционной организации иммунной системы была сформулирована еще Ф. Бернетом. Основным положением этой идеи было то, что одна клетка иммунной системы продуцирует антитела только против одного антигена, т.е. иммунная система клонирована по антигену. Блестящим экспериментальным подтверждением клонально-селекционной теории иммунитета и явился метод получения моноклональных антител. Моноклональность гибридомных антител (т.е. физическая моноклональность) в подавляющем большинстве случаев совпадает с моноклональностью в понимании Бернета (антитела, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, все одинаковы). Предложенный английскими исследователями метод создания гибридом был взят на вооружение во всех странах мира, где есть экспериментальная биология. Гибридомная технология, ставшая основой создания МАт, буквально пропитала теоретическую и прикладную иммунологию, проникла во многие разделы вирусологии, микробиологии и медицины. В настоящее время создана, можно сказать, гибридомная промышленность, и на рынок поступают сотни вариантов МАт. Гибридомная технология является не только примером быстрого внедрения науки в практику, но и примером продолжающегося одновременного развития фундаментальных научных исследований, причем на качественно новом уровне, так как гибридомы – наиболее эффективный и мощный инструмент современной биологической науки. 25 Глоссарий терминов используемых в гибридомной технологии Асцит Скопление жидкости в брюшной полости, в данной работе подразумевается как источник большого количества наработанных макроорганизмом МАт. Гибридная клетка Клетка, образовавшаяся при слиянии двух или нескольких соматических клеток под воздействием биологических, химических и физических факторов Гибридома Гибридная клетка, полученная путем слияния иммунного лимфоцита и миеломной клетки и секретирующая моноклональные антитела определенной специфичности Детергенты Вещества способные денатурировать белки, лизировать клетки, элиминировать плазмидные ДНК. Клон Популяция генетически идентичных клеток, имеющих своим предшественником одну единственную клетку и, следовательно, обладающих едиными физико-химическими и биологическими свойствами. Моноклональное Антитело, продуцируемые одним клоном гибридных клеток, антитело иммуноглобулиновая молекула которого направлена против одного узкого (эпитопа) участка антигена Антигенная детерминанта или эпитоп Участок на молекуле антигена, представляющий собой структуру в 10-15 аминокислотных остатков Сайт Последовательность пар оснований ДНК в гене Супернатант Жидкость собирающаяся над осадком после центрифугирования Паратоп Участок на молекуле моноклонального иммуноглобулина, связывающийся с определенной антигенной детерминантой, т.е. участок, комплементарный эпитопу на молекуле антигена Основные принципы получения моноклональных антител. В основу метода наработки МАт положена способность нормальных плазматических клеток иммунного организма сохранять продукцию антител после слияния с перевиваемыми опухолевыми клетками. В результате образуется популяция гибридных клеток (гибридом), которой родительские селезеночные клетки передали способность вырабатывать специфические антитела, а родительские миеломные – способность к неограниченному росту и индукции асцитных и солидных опухолей. В настоящее время предложено несколько модификаций метода получения гибридом, но все они сводятся в целом к проведению следующих этапов (рис.1): иммунизация животных; слияние иммунных лимфоцитов животных с миеломными клетками; селекция гибридных клеток; наращивание клонов и скрининг их на способность продуцировать специфические антитела; клонирование гибридом и наращивание клонов гибридом в культуре и организме сингенных мышей; изучение свойств полученных МАт. 26 Иммунизация линии BALB/c мышей Культура клеток мышиной миеломы Sp2/0 ГГФРТ- Ig- ГГФРТ+ Ig+ Слияние в ПЭГ Селекция гибридных клеток в среде ГАТ РТГА, НМФА, ИФА, РИА и др. Определение наличия в культуральной антител жидкости Клонирование антителопродуцирующи позитивных гхибридов Определение наличия в культуральной антител жидкости Наращивание гибридом BALB/c Культивирование Криоконсервация гибридных клеток и хранение МА - 10 мкг/мл Индукция асцитных опухолей МА - 10 мкг/мл Рис.1. Схема получения М Ат Большое значение при получении гибридом придается опухолевой линии клеток – одному из партнеров, участвующему в гибридизации, – которая должна отвечать определенным требованиям. Существует ряд критериев для выбора опухолевой линии клеток в качестве партнера для слияния. Во-первых, природа клеток должна быть такова, чтобы объединение их хромосом с хромосомами нормальных лимфоцитов не сопровождалось дисфункциональными расстройствами биосинтеза антител. Этому требованию лучше всего удовлетворяют генетически (т.е. сингенные) и эпигенетически (т.е. клетки того же типа тканевой дифференцировки) родственные клетки. Для В-лимфоцитов таковыми являются плазмацитомы (миеломы), а для Тлимфоцитов – Т-лимфомы. Во-вторых, они должны легко расти в культуре in vitro, иметь время генерации около 12 часов и, по возможности, пролиферировать на минимальных питательных средах. В-третьих, желательно, чтобы опухолевые клетки-партнеры были способны расти в брюшной полости сингенных животных, обеспечивая по этому признаку хорошую наследственность гибридным клеткам в плане получения асцитов, как источника больших количеств МАт. В-четвертых, они должны обладать высокой гибридизуемостью, обеспечивая частоту гибридизации около 10–2 (т.е. каждая сотая клетка из общей смеси должна давать жизнеспособный гибрид). И, наконец, опухолевые клетки должны быть мутантны по определенным генам, контролирующим экспрессию жизненно-необходимых ферментов, 27 для того, чтобы опухолевый партнер по гибридизации наверняка погибал на специальных селективных средах и не маскировал рост гибридов. Наиболее широко используемый метаболический дефект – отсутствие фермента гипоксантин-гуанини-фосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ). В клетках млекопитающих существует два пути синтеза нуклеотидов – основной, при котором нуклеотиды синтезируются de novo из аминокислот и углеводов, и запасной, так называемый метаболический шунт, для которого характерно использование предшественников пуринов – гипоксантина и тимидина. Синтез нуклеотидов по второму пути может происходить лишь в том случае, когда в клетках присутствует фермент ГГФРТ. Этот фермент обеспечивает включение в ДНК и РНК и таких антиметаболитов, как 8-азагуанин или 6-тиогуанин, что приводит клетку к гибели. Поэтому, если опухолевые клетки культивировать на среде, содержащей 8-азагуанин, то смогут выжить только мутанты, у которых отсутствует функционально активная ГГФРТ. Этот простой прием широко используется для получения опухолевых клеточных линий – партнеров для гибридизации. Клетки таких линий способны расти, синтезируя свои нуклеотиды de novo из углеводов и аминокислот. Аналог фолиевой кислоты аминоптерин блокирует синтез de novo. Однако клетки, имеющие ГГФРТ и его субстраты – гипоксантин и тимидин, сохраняют жизнеспособность в присутствии аминоптерина. Поэтому гибридные клетки, вобравшие в себя геном нормального лимфоцита, содержащий нормальный ген ГГФРТ, выживают в отличие от родительских опухолевых клеток на селективной среде, содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (НАТ). Второй партнер по гибридизации – лимфоциты, как правило, в культуре не размножаются и отмирают через 7-14 дней. В настоящее время существует множество различных типов маркированных (дефектных по ГГФРТ) миеломных линий клеток лабораторных животных (мышь, крыса) и человека. Наиболее широкое распространение получили мышиные миеломы в основном генотипа ВАLB/с (табл. 2). Большинство из них являются субклонами давно известной миеломной линии Р3-Х63. В 1978 г. Г. Келер с сотрудниками получили несекретирующую иммуноглобулины линию NS1/1Ag4.1, а Шульман с сотрудниками из гибридного клона Sp 2/HLGK, секретирующего МАт к эритроцитам барана, получили линию Sp 2/0-Ag 14.1, обладающую повышенной гибридизуемостью и пролиферативной активностью. В 1979 году исследователями из ФРГ получена миеломная линия P3-X63-Ag8.653, ставшей одной из самых популярных в мире линий, используемых для гибридизаций. В 1983 г. сотрудниками фирмы «Nunclon» Таггортом и Сальмофом получена миелома FOX-NY. Эта линия является дефектной по двум ферментам: ГГФРТ и АФРТ (аденинфосфорибозилтрансфераза), поэтому при слиянии со спленоцитами от Робертсоновских мышей RB (8.12), у которых активный локус тяжелой цепи IgG на 12-й хромосоме и селективный локус ферментного маркера АФРТ на восьмой генетически связаны, дальнейшая селекция может проводиться как на среде НАТ, так и на среде, содержащей азасерин, который блокирует синтез пуринов de novo в клетках, дефектных по АФРТ. Причем гибридомы, полученные селекцией по АФРТ, более стабильны и в 100% случаев являются антителопродуцентами, поскольку несекретирующие антител гибриды, погибают в селективной среде в связи с транслокацией 8 и 12 хромосом. Правильный выбор и подготовка опухолевой линии клеток для слияния является безусловно ответственным моментом, однако подготовка иммунных лимфоцитов – второго партнера по гибридизации имеет не менее важное значение при получении МАт. 28 . Миеломные линии, используемые для получения гибридом Клеточная линия Общепринято е обозначение Авторы Мышиные линии P3-X63-Ag 8 X 63 Келер, Мильштейн, 1975 г. FOX-NY FOX Таггарт, 1983 г. NS-1/Ag 4.1 NS-1 Келер, 1978 г. Sp 2/0 – Ag 14.1 Sp 2/0 Шульман, 1978 г. X63-Ag 8.653 X 653 Керней, 1979 г. Крысиные линии JR 938 F JR Безин, 1983 г. RCY3. Ag 1.2.3 Y3 Галфрэ, 1979 г. Методы иммунизации при получении гибридом. Иммунизацию при получении гибридом проводят с целью выработки у животного – донора спленоцитов, увеличивающейся популяции В-лимфоцитов, продуцирующих антигенспецифичные иммуноглобулины. При этом В-лимфоциты, как один из партнеров для получения гибридом, должны быть способны к слиянию с плазмацитомными клетками и находиться в стадии неполной дифференциировки в зрелые плазматические клетки. Поэтому все процедуры гибридизации предусматривают взятие лимфоцитов у иммунизированного животного в первые шесть дней после введения последней дозы антигена. Лимфоциты многих видов животных способны при слиянии с клетками мышиной миеломы образуют жизнеспособные антителосекретирующие гибридомы, однако использование в качестве источника лимфоцитов мышей линии ВАLb/с открывает гораздо большие перспективы, так как гибридомы «мышь-мышь» более стабильны и секретируют больше антител, чем межвидовые гибриды. Кроме того, мышиные миеломные линии, используемые в качестве партнера при слиянии, несут антигены гистосовместимости BALb/с. Образующиеся в результате слияния с мышиными спленоцитами гибридомы при этом имеют только BALb/c – антигены гистосовместимости, что позволяет выращивать их в брюшной полости мышей этой линии. При этом продукция антител гибридомами превышает продукцию in vitro более, чем в 1000 раз. Для иммунизации мышей необязательно использовать высокоочищенные антигены, поскольку каждая полученная гибридома будет продуцировать антитела лишь к одной антигенной детерминанте (эпитопу). В принципе возможно получение специфических гибридом и без иммунизации: получив несколько сотен гибридов из лимфоцитов интактной мыши, почти наверняка можно обнаружить хотя бы одну гибридому, МАт которой будут связываться с определенным произвольно взятым антигеном. Однако, при таком подходе эффективность гибридизации (процент гибридом, продуцирующих специфические антитела, от общего числа гибридом) – минимальна. С другой стороны показано, что обычные схемы гипериммунизаций, принятые для получения сывороточных иммуноглобулинов, не всегда оптимальны для получения высокой специфической эффективности гибридизации. Существует два основных способа иммунизации при получении гибридом: иммунизация in vivo и иммунизация in vitro. Удовлетворительной считается средняя специфическая эффективность гибридизации, равная 10-15%. Она достигается, например, 29 всего при двукратном введении животным небольших доз белковых антигенов в сопровождении адъюванта Фрейнда с интервалом, превышающим время прохождения пика первичного ответа. Многие исследователи при получении гибридом применяют различные схемы иммунизации, пытаясь повысить количество клеток, образующих антитела и увеличить, в конечном итоге, выход антигенспецифичных гибридом. Обычно это делают, иммунизируя ряд животных и выбирая клетки селезенки тех мышей, у которых самый высокий титр антител. Однако, не смотря на повышение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных мышей, не всегда удается существенно повысить эффективность гибридизации. Помимо повышения активности сывороточных антител, предлагаемые методы иммунизации должны давать и хороший абсолютный выход соответствующей селезеночной популяции. В качестве иммуногенов при получении гибридом к вирусным антигенам обычно используют лизаты зараженных клеток, нативные препараты очищенного вируса, высокоочищенный вирус, обработанный детергентами или ультрафиолетом, а также вирусные белки, химически модифицированные и синтетические полипептиды. В последнее время стали интенсивно разрабатываться методы иммунизации in vitro. Особое значение придается иммунизации in vitro в целях получения гибридом на основе лимфоцитов человека, в силу императивного запрета на иммунизацию in vivo. На сегодняшний день опубликован целый ряд работ, в которых достаточно подробно описаны методические подходы по иммунизации спленоцитов in vitro и получению на их основе гибридом. Анализ данных по иммунизации спленоцитов in vitro показывает, что данный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с иммунизацией мышей in vivo. Это, во-первых, сокращение сроков иммунизации до четырех – пяти суток. Во-вторых, непосредственный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, минуя все барьеры живого организма, что имеет большое значение для слабых иммуногенов. Втретьих, метод дает возможность контролировать эффективность иммунного ответа. Однако, несмотря на преимущества, иммунизация in vitro имеет ряд недостатков технического плана, которые сдерживают широкое внедрение этого метода в практику. В частности, нужна качественная культуральная среда и посуда, необходимо добавление в культуральную среду биологически активных иммунофакторов, а также необходима стерильность используемого антигена. Поэтому, многие исследователи изыскивают другие методы введения антигена, которые позволяют сократить сроки иммунизации, не снижая при этом выход гибридом заданной специфичности. В этом плане заслуживает внимание внутриселезеночная инъекция антигена, разработанная Spitz M. et al., а затем взятая на вооружение и другими исследователями, которые с успехом применили ее при получении МАт к различным вирусным антигенам. Внутриселезеночная иммунизация не снижает выход вирусспецифических клонов по сравнению с традиционными методами иммунизации, но, как правило, наблюдается образование гибридом, секретирующих МАт к поверхностным антигенам. Тем не менее внутриселезеночная иммунизация не всегда дает высокую эффективность гибридизации и, кроме того, возникает вопрос о стабильности антителопродукции гибридными клетками. Следовательно, при целенаправленном получении МАт к определенному белку необходимо отдавать предпочтение той иммунизации, которая способствовала бы оптимальному выходу нужных клонов. Методы гибридизации. Основные элементы стратегии и тактики. Методы гибридизации иммунных спленоцитов с миеломными клетками бывают биологические (с помощью вирусов типа Сендай), химические (с помощью веществ типа лизолецитина или полиэтиленгликоля) и физические (с помощью электрического поля). Гибридизация с помощью вируса Сендай не всегда дает положительные результаты. Некоторые вторы объясняют это тем, что не все клетки мышиной миеломы имеют рецепторы для данного вируса (Кеннет, 1983). 30 Поскольку мембраны клеток заряжены и электропроводны, то, понятно, были предприняты попытки, оказавшиеся весьма удачными, вызвать гибридизацию клеток посредством воздействия внешним электрическим или магнитным полем. Эффективность электрогибридизации, как правило, на один – два порядка выше, чем гибридизация биологическими и химическими методами. Технология электрогибридизации позволяет проводить процесс под визуальным контролем через микроскоп и сразу отделять гибридные клетки от неслившихся, что исключает необходимость метаболической селекции. Однако, данный метод требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала. Поэтому наибольшее распространение в настоящее время получили методы гибридизации с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой от 1000 до 6000. Первое сообщение о том, что ПЭГ повышает частоту слияния прикрепленных клеточных линий сделали Дэвидсон Р. и Геральд П. в 1976 году. В последующем другие исследователи применили этот метод для клеток миеломы и селезенки. При использовании данного метода частота гибридизации составляет обычно один гибрид на каждые 2105 клеток селезенки. Данная эффективность гибридизации считается вполне удовлетворительной для сильных иммуногенов, но служит серьезным препятствием для слабых иммуногенов. Это хорошо показано в работе Кеннет (1983) в отношении специфичности МАт к 33-галлотипу Н-2в, который является слабым иммуногеном. Автору в своих исследованиях не удалось получить ни одного стабильного гибрида. Поэтому многие исследователи изыскивают методы и способы гибридизации, чтобы повысить частоту образования гибридов, особенно в отношении слабых иммуногенов. Увеличение частоты образования гибридных клеток пытались решить, изменяя концентрацию ПЭГ, значения рН во время слияния, соотношение селезеночных и миеломных клеток, используя различные партии сывороток и типы питательной среды, тимоциты и другие подкормки, а также разные варианты посева слившихся клеток. Однако, до настоящего времени ни одна из вышеперечисленных попыток, путем манипулирования различных переменных, не привела к существенному повышению абсолютного выхода получаемых гибридов на иммунизированную селезенку. В работах Игнатьевой Г.А. с соавторами, 1989 г., Хаитова с соавторами, 1987 г. и ряда зарубежных авторов описаны различные процедуры гибридизации, которые способствуют получению более легко воспроизводимых результатов. Тем не менее, вопрос о преимуществах той или иной модификации остается открытым. После гибридизации, через 7-14 дней, в лунках вырастают колонии гибридных клеток и возникает необходимость тестирования супернатантов на наличие специфических антител. В зависимости от целей, поставленных исследователями, тестирование может проводиться различными иммунологическими тестами, в том числе, РТГА, НМФА, РСК, РДП. Однако, многие МАт, в отличие от поликлональных сывороток, активны лишь в некоторых серологических реакциях. Это может быть связано как с эпитопной специфичностью МАт, так и с их изотипом, то есть с антигеннезависимыми свойствами молекул МАт. Поэтому при скрининге предпочтительнее использовать методы, основанные на выявлении непосредственного взаимодействия антител с антигеном, а не на выявлении последствий этого взаимодействия (связывание комплемента, агглютинации и т.п.). Наиболее широкое распространение получил иммуноферметный анализ (ИФА), обладающий нанограммовой чувствительностью, максимальной специфичностью и позволяющий обрабатывать сотни проб объемом не более 100 мкл за рабочий день. Реже используется метод иммунофлюорометрического анализа и радиоиммунологического анализа. Идентифицированные гибридомы клонируют. Следует подчеркнуть, что клонирование является тем этапом гибридомной технологии, который лимитирует пропускную способность всего метода. Поэтому очень важно тщательно провести скрининг, отобрать необходимые гибридомы и, во избежание перерастание 31 антителопродуцирующих клеток клетками, потерявшими способность секретировать антитела, как можно скорее провести клонирование. Широко используется два методических подхода: клонирование методом предельных (лимитирующих) разведений и клонирование в полужидком агаре. В первом случае готовят разведения в ростовой среде, содержащей 1-3 клетки на 0,5 мл и рассаживают по 100 мкл в лунки 96-луночных пластин, либо клетки рассеивают из расчета одна клетка на лунку. При клонировании в полужидком агаре гибридные клетки вносят в 0,5% раствор агара, приготовленный на культуральной среде. Клетки при этом способе обычно вносят в агар из расчета 20-40 клеток на лунку 24-х луночной пластины. Через 7-10 дней образовавшиеся клоны переносят в лунки 96-луночных пластин, контролируя все действия на микроскопе. Сформировавшуюся популяцию клеток после клонирования тестируют. При первом клонировании гибридом-продуцентов наблюдается расщепление клонов по способности продуцировать специфические антитела. Одной из основных причин нестабильности гибридом считают элиминацию хромосом, несущих иммуноглобулиновые гены. Однако возможны и иные механизмы (как генотипические, так и фенотипические), в силу которых гибридные клетки перестают синтезировать иммуноглобулины. Позитивные клоны после тестирования подвергаются реклонированию. При повторном тестировании количество позитивных клонов может уменьшиться за счет выявления менее стабильных клонов. Для получения достаточно стабильной линии гибридных клеток требуется 2-3 (иногда больше) клонирования. При таком подходе после второго-третьего клонирования число позитивных клонов оказывается близким к 100%. Для поддержания стабильности линии на достаточно высоком уровне при длительном пассировании в культуре, после пассирования на мышах и при больших сроках хранения клонов в криоконсервированном состоянии необходимо проводить клонирование не реже одного раза в три месяца. После клонирования гибридные клетки могут быть выращены в культуре в значительном количестве. Как правило, концентрация антител в культуральной жидкости достигает 10-100 мкг/мл. Рост гибридом в организме экспериментальных животных (мышей) обеспечивает продукцию МАт на один-два порядка выше. Для культивирования гибридных клеток in vivo и для получения асцитической жидкости, содержащей МАт, мышам, предварительно праймированным пристаном (2,6,10,14 – тетраметилпентадекан) или неполным адъювантом Фрейнда, вводят внутрибрюшинно гибридные клетки в дозе 2-4107 на животное. Асциты формируются на 7-14 сутки после инокуляции клеток. Полученные МАт подвергаются тщательному анализу с целью определения их свойств и дальнейшего практического использования. Таким образом, технология получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, состоит из множества важных этапов, правильное и качественное выполнение которых обеспечивает успех работы и достижение поставленных целей (схема 1). На сегодняшний день далеко не все теоретические и технические проблемы создания гибридом решены. Особенно важным является решение вопроса о потери хромосом гибридными клетками. Метод моноклональных антител и его практическое использование в диагностике. Применение метода гибридом и МАт в биологических и медицинских исследованиях вызвало взрывной рост информации и замену наших представлений о структуре вирусов и антител, функции отдельных компонентов вириона (антигена) в развитии иммунных реакций, о структуре и роли различных типов антител в нейтрализации вирусов, о механизмах нейтрализации и т. д. Неудивительно, что все больше и больше исследований проводится с использованием МАт. За последнюю четверть двадцатого века технология получения МАт совершила молниеносный скачок от чисто теоретического направления исследований до биотехнологических компаний по их производству. В своей лекции, посвященной присуждению Нобелевской премии, К. Мильштейн сказал, что быстрое развитие биотехнологии обусловлено использованием биологических 32 механизмов, связанных со способностью иммунной системы генерировать около 106 – 109 различных антител, при очень небольшом количестве генов, контролирующих этот процесс. Основные элементы стратегии и тактики получения гибридом и МАт Оптимальное состояние популяции клеток-партнеров для успешной гибридизации Для опухолевых клеток – логарифмическая фаза роста, для иммуноцитов – пик бласттрансформации. Клетки в момент гибридизации и после нее весьма нестабильны. Поэтому все процедуры во время гибридизации стараются провод-ить как можно осторожнее В настоящее время наиболее успешно применяется метаболическая селекция на среде НАТ Селекция гибридных клеток, продуцирующих МАт, от непродуцирующих мутантов Строгий контроль за соотношением уровня пролиферации клеток в культуре и количеством продукта в супернатанте. Реклонирование Цель – отбор продуцирующих, относительно стабильных во времени клонов Наращивание гибридом и получение Мат in vitro и in vivo Концентрация Мат, синтезируемых гибридомой in vivo на 1-2 порядка выше, чем in vitro Криоконсервация гибридных клеток Надежное хранение гибридом и их продуктов (–70° … –196°С) Гибридизация миеломных клеток с иммуноцитами Селекция гибридных клеток Клонирование гибридных клеток Технически этот вопрос решился именно путем гибридизации В-лимфоцитов, секретирующих антитела, с перевиваемыми миеломными клетками, обладающими неограниченной потенцией роста. Соединение этих свойств в одной гибридной клетке дало биологам метод получения «биологически чистых реактивов», которые явились уникальным инструментом познания структуры и функции не только антигенов и антител, но и самих клеток, их продуцирующих. Новый этап развития биотехнологии, связанный с внедрением гибридом и МАт, охарактеризовал себя созданием новых концепций о структуре и функциях изучаемых объектов. Какие же новые концепции превнесены в вирусологию и иммунологию с внедрением метода МАт? 1. Метод МАт обеспечил изучение антигенной структуры микроорганизмов в нативном виде, в их естественной локализации и в их активном функциональном состоянии. Такой возможности не могли представить исследователям ни биохимические 33 методы, ни методы молекулярной биологии, ни генной инженерии. Перечисленные методы требуют для изучения структуры компонентов биологических объектов (вириона), в частности, их локализации, предварительной обработки физическими и химическими факторами, что, как правило, приводит к различного рода повреждениям активных группировок или конформационным изменениям рецепторов. Следовательно, результаты таких взаимодействий не всегда можно контролировать, а учитываемый эффект может быть искажен. Например, при выделении полипептидов детергентами, часть полипептидов денатурирует и их нельзя выявить доступными методами. В отличие от этого, выделение полипептидов с помощью МАт, где происходит специфическое связывание антигена с антителом, последующая элюция не приводит к повреждению структуры антигена. Повреждение или изменение структуры биологических веществ наблюдали при выделении гемагглютинина вируса гриппа ( в мономерной форме) при конструировании химической вакцины, в результате чего антигенная активность его снижалась на 2-3 порядка. Такое же явление исследователи наблюдали при синтезе гаммаглобулинов и интерферона. 2. Метод МАт позволил выявлять активные группы, участки на молекуле антигенов (детерминанты), взаимодействующие с антителами, а также изучить характер этих взаимодействий в количественных соотношениях, т.е. сопоставлять биологические реакции с химическими и расшифровать молекулярные механизмы этих реакций. Использование МАт, обладающих строгой эпитопной специфичностью (комплементарностью к определенному антигенному участку), дает возможность изучить тонкие структурные изменения антигенных детерминант в процессе эволюции и проводить эпитопное картирование вирусных белков. В частности, с помощью МАт на молекуле нуклеопротеина вируса гриппа А птиц (ВГП) установлено наличие трех антигенных сайтов, имеющихся у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа А птиц (рис.2). В тоже время, антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1С6, имеется практически у всех исследованных штаммов вируса гриппа птиц, лошадей, свиней и человека, за исключением штамма A/equin/Miami/1/63 (H3N8), тогда как антигенная детерминанта, выявляемая МАт 1F8, 5C10, 5E4 и 5F12, имеется лишь у вирусов гриппа птиц и лошадей. Эти исследования позволили сделать предположение о реассортации антигенных детерминант между штаммами ВГП и гриппа лошадей. Данные последних лет, полученные с помощью МАт, показывают, что такого рода реас сортация может наблюдаться также между вирусами гриппа птиц и человека. 1С6 5E4 1F8 5C10 2B7 5F1 2 NP Рис 5.Схематическое изображение расположения антигенных детерминант на молекуле нуклеопротеина ВГП. Изучение структуры антигенных детерминант повысило уровень исследований в иммунологии до молекулярного уровня. Высокая специфичность МАт, на уровне химических реактивов, позволила дифференцировать различия в структуре по отдельным 34 аминокислотам, дала возможность вести секвенирование белкового и нуклеиновых компонентов микроорганизмов, клеток животных и далее вести отбор желаемых клонов вируса. Так с помощью МАт были секвенированы клоны вируса бешенства с высокой нейровирулентностью, идентифицированы штаммы вируса бешенства различного происхождения по зонам, выделены клоны вирусов герпеса, венесуэльского энцефаломиелита и др., обладающие высокой иммуногенностью. 3. С помощью МАт были расшифрованы механизмы защитных реакций in vitro и in vivo, что позволило создать новые концепции по функционированию и реализации защитных механизмов. Изучение вопросов по взаимодействию МАт с вирусами, определение валентности антител и роль этого феномена в вирусной нейтрализации позволило создать гипотезу многоударного механизма нейтрализации. Эта гипотеза получила в последующем экспериментальное подтверждение и тем самым была развеяна догма об одноударном механизме нейтрализации. 4. Разработка метода МАт дала совершенно новое направление в создании защитных препаратов, основанное на изучении структуры идиотипических МАт и механизмов идиотип-антиидиотип взаимодействий. При этом антиидиотипические МАт могут быть использованы в качестве иммунизирующего агента, т.е. антигена. В этом направлении уже получены положительные результаты. На модельных животных было показано, что антиидиотипические антитела, несущие «внутренние образы» антигена могут быть использованы в качестве вакцин против инфекционных агентов (Alain L., 1991, Yasmin Th., 1989, Hariharan K.,1991). Более того, антиидиотипические МАт позволили провести углубленный анализ структурно-функциональных взаимоотношений между рецепторами клеток и активными сайтами антигенов. Примером данного направления могут служить многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей, в которых показано получение антиидиотипических МАт к альфа-интерферону человека. Эти антиидиотипические МАт имитировали биологические свойства альфа-интерферона человека. В частности, они обладали антивирусной активностью в отношении некоторых РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Данные антиидиотипические МАт с «внутренним образом» альфа-интерферона , меченные флуорохромом или ферментами могут, быть использованы в качестве маркеров для индикации рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток человека для альфа-интерферона. 5. Метод МАт обеспечил развитие новых направлений биотехнологии при наработке биопрепаратов различного назначения – это МАт для изготовления диагностических и защитных препаратов, киллерных и хелперных клеток определенной специфичности, клеток синтезирующих гормоны роста, вещества, стимулирующие вегетативные процессы и т. д. Особенно бурное развитие и широкое распространение получили МАт используемые для целей диагностики. В настоящее время как за рубежом, так и в нашей стране разработано множество тест-систем на основе МАт для диагностики инфекционных болезней животных и человека различной этиологии. Благодаря строгой эпитопной специфичности и высокой чувствительности МАт потеснили ранее используемые методы идентификации возбудителей на основе поликлональных антител и успешно вписались в общую схему диагностики ряда вирусных и бактериальных инфекций. Использование МАт в серологических реакциях сделало возможным проводить дифференциацию близкородственных вирусов, в отличие от сывороточных антител, которые не всегда позволяют надежно идентифицировать возбудитель и могут обладать перекрестной реактивностью со сходными по антигенной структуре вирусами. Например, вирусы эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО), болезни Ибараки и катаральной лихорадки овец (КЛО) антигенно родственны между собой, то антитела, вырабатываемые животными в ответ на инфицирование хотя бы одним из них, перекрестно реагируют при лабораторном тестировании с другим вирусом, даже если 35 иммунизация проводится высоко очищенным вирусным препаратом. Следовательно, для постановки точного диагноза необходимо тщательно идентифицировать изолированный вирус. Именно МАт к различным антигенным детерминантам этих вирусов позволили решить эту проблему. Разработанная на основе МАт к антигенам вирусов ЭГБО, КЛО и болезни Ибараки диагностическая тест-система позволила дифференцировать эти близкородственные в антигенном отношении вирусы. Кроме того, высокая чувствительность метода ИФА на основе МАт сделала возможным обнаружение вируса КЛО непосредственно в крови больных животных и сократить сроки диагностических исследований. Тем самым это еще раз подтверждает необходимость применения методов на основе МАт в общей схеме диагностики вирусных болезней в качестве сигнальных экспрес-методов. Совершенствование гибридомной технологии и достигнутые успехи в получении продуктов моноклонов в настоящее время привели к созданию нового вида гибридом, названных квадромами, которые секретируют биспецифические МАт (би-МАт), которые оказались весьма перспективными для использования в различных областях иммунохимии, иммунодиагностики и иммунотерапии. Квадромы, полученные путем слияния клеток линий двух гибридом с продукцией моноспецифических MАт к различным антигенным детерминантам, синтезируют иммуноглобулиновые молекулы с двумя активными центрами, направленными к разным антигенам (биспецифические МАт) (рис 3.). На современном этапе развития иммунологии и онкологии всесторонне изучаются возможности использования би-МАт в качестве эффективного инструмента в противоопухолевой иммунотерапии. В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов клеточной цитотоксичности и разработке на основе этих исследований подходов к лечению больных злокачественными новообразованиями и вирусными инфекциями. В ряде экспериментальных работ показано практическое применение би-МАт в диагностике и терапии различного рода патологий человека и животных, а также при скрининге, анализе и мониторинге субстанций биологического происхождения. би-МАт ПХ Аг Аг Рис.6 Схема применения би-МАт в ИФА для одноэтапного выявления антигена. Таким образом, успехи, достигнутые гибридомной технологией, наглядно свидетельствуют о том, что применение МАт позволило выйти на качественно новый уровень исследований в области ветеринарной медицины и вирусологии. Моноклональные антитела на сегодняшний день представляют собой мощный инструмент для изучения антигенных взаимоотношений, при изучении взаимодействия вирусов с клетками, вопросов иммуногенеза и механизма защитных реакций, а также эффективный инструмент для изготовления диагностических и защитных препаратов, отличающихся высокой чувствительностью, специфичностью и технологичностью. 36 ЗАНЯТИЕ 24. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ АНТИТЕЛ \ ИММУНОБЛОТИНГ\ В настоящее время электрофорез является одним из основных методов изучения белков. Электрофорез препаратов очищенных вирионов позволил определить их белковый и полипептидный состав. В сочетании с обработкой детергентами и другими химическими веществами изучается структурная организация вирионов. Стало возможным эффективно контролировать процессы очистки вирусов или отдельных вирусспецифических антигенов, изучать динамику и кинетику синтеза полипептидов, механизмы действия ингибиторов, различных антивирусных соединений, молекулярные фенотипы мутантов и вариантов. Применение радиомаркированных предшественников глико-, сульфофосфопротеинов, жирных кислот позволяет идентифицировать интересующие группы белков. В совокупности с методом иммунопреципитации определяются вирусспецифические белки в зараженных клетках, те из них, которые экспрессируются на мембранах; устанавливается специфичность моноклональных антител, вирусспецифических белков, синтезируемых генноинженерными или химическими способами; контролируется иммунный ответ животных на различные антигенные препараты. Для определения полипептидной специфичности антител используют методы радиоиммунопреципитации или иммуноблотинга. При этом следует учитывать, что радиоиммунопреципитацией выявляются антитела к конформационным и линейным детерминантам нативных белков, тогда как иммуноблотингом - только к линейным детерминантам полипептидов. Для разделения полипептидов используют метод диск-электрофореза в присутствии ионного детергента ДСН по Laemmli. При диск-электрофорезе используются буферы с различными рН, что создает прерывистые градиенты электрического потенциала и рН. Система включает крупнопористый концентрирующий гель с низким рН, расположенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким рН. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позволяет получить хорошее разделение при использовании относительно больших объемов разведенных белковых растворов. Под действием ДСН в сочетании с восстановителем (2-меркаптоэтанол) и прогревом при 100 °С все белки денатурируются и разделяются на отдельные полипептидные цепи. Так как при электрофорезе в ПААГ с ДСН свободная подвижность комплексов белок - ДСН почти постоянна, молекулярные размеры таких комплексов можно определять по графику зависимости относительной подвижности от логарифма молекулярной массы. Регистрацию полос белков, маркированных 14С, 35S, 125I, осуществляют методом авторадиографии, а 3Н - флюорографии. Перед авторадиографией белков, меченных 14С и 35 S; для исключения потерь энергии -частиц при контакте с фотопленкой гели высушивают. Для регистрации тритированных полипептидов флюорографией в гель вводят сцинтиллятор, свечение которого под действием радиоактивно меченного продукта регистрируется как и при авторадиографии наложенной на высушенный гель рентгеновской фотопленкой. В качестве примера предлагаются методики определения спектров полипептидной специфичности антител в сыворотках вакцинированных собак. Методика Приготовление радиоактивно меченых белков. Двухсуточную культуру клеток CV-1, выращенную в клинских матрасах, заражают ВЧС, штамм ВНИИВВиМ-88, с множественностью 0.01 ТЦД50/клетка. Через двое суток культивирования вносят 14Суксуснокислый натрий в конечной концентрации 2.5 МБк/см3. Через 4 суток после инфицирования в момент развития синцитиев клетки механически снимают с монослоя и 37 дважды отмывают ФБР, осаждая при 1500 g в течение 20 мин. После однократного замораживания-оттаивания клетки лизируют 1% тритоном Х-100 в 0.02 М трис-НСl буфере с рН 7.4 в 1:100 от исходного объема. Лизат центрифугируют при 50 000 g 20 мин и хранят при минус 70 C. Иммунопреципитацию проводят следующим образом. По 0.1 см3 протеин Асефарозы, уравновешенной в лизирующем буфере с добавлением 1мМ фенилметилсульфонилфторида, инкубируют с 0.2 см3 исследуемых сывороток собак в течение 2 ч при (20-25) С. Затем шестикратно отмывают лизирующим буфером, и инкубируют с (0.1-0.2) см3 радиоактивно меченого антигена в течение 18 ч при 4 С. После шестикратной отмывки сорбент суспендируют в 0.2 см3 буфера для электрофореза, кипяят на водяной бане 5 мин и элюированные полипептиды электрофоретически разделяют в 10% ПААГ. Электрофорез. Готовят растворы: 30% Т, 2.7% С (58.4 г акриламида + 1.6 г N,N'- метилен -бис-акриламида + Н2О до 200 см3); четырехкратный буфер разделяющего геля - 1.5 М Трис-НСl c рН 8.8 (36.3 г Трис + Н2О до 200 см3, рН доводят соляной кислотой); четырехкратный буфер концентрирующего геля - 0.5 М Трис-НCl c рН 6.8 (3.0 г Трис + Н2О до 50 см3, рН доводят соляной кислотой); 10%-ный раствор ДСН (50 г ДСН + Н2О до 500 см3); инициатор - 10%-ный раствор персульфата аммония (0.1 г персульфата аммония + Н2О до 1 см3); N,N,N',N'-тетраметилендиамин (ТЕМЭД); промывочный раствор разделяющего геля - 0.375 М Трис-НCl c рН 8.8 + 0.1% ДСН (25 см3 1.5 М Трис-НCl + 1 мл 10%-ного раствора ДСН + Н2О до 100 мл); двукратный буфер для проб - 0.125 М Трис-НСl c рН 6.8 + 4% ДСН + 20% глицерина + 10% 2-меркаптоэтанола (2.5 см3 1.5 М раствора Трис-НСl с рН 8.8 + 4.0 см3 10%-ного раствора ДСН + 2.0 см3 глицерина + 1.0 мл 2-меркаптоэтанола + 0.04 см3 бромфенолового синего + Н2О до 10 см3); электродный буфер - 0.025 М Трис c рН 8.3 + 0.192 М глицина + 0.1%-ный ДСН (12 г Трис + 57.6 г глицина + 40 см3 10%-ного раствора ДСН + Н2О до 4.0 дм3); изобутанол; фиксирующий раствор - 12.5%-ный раствор трихлоруксусной (ТХУ) кислоты (125 г ТХУ + Н2О до 1,0 дм3). Компоненты для разных гелей Компонент Для концентДля разделярирующего геля ющего геля 3 Раствор мономеров 2.66 см 20 см3 Четырехкратный буфер 15 см3 разделяющего геля Четырехкратный буфер 5.0 см3 концентрирующего геля 10%-ный раствор ДСН 0.2 см3 0.б см3 3 Н2О 12.2 см 24.1 см3 Инициатор 0.1 см3 0.3 см3 3 ТЕМЭД 0.01 см 0.02 см3 Концентрирующий (4% Т, 2.7%С) и разделяющий (10% Т, 2.7% С) гели готовят по данным таблицы 4. Для приготовления разделяющего геля смешивают указанные количества растворов мономеров, буфера, ДСН, воды, инициатора, смесь деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к вакуумному насосу, добавляют 0.05 см3 ТЕМЭД. Смесь заливают между стеклами для формирования пластин геля. Сверху наслаивают 1 см3 изобутанола. Через 30-40 мин (после окончания процесса полимеризации) изобутанол сливают и трижды промывают край разделяющего геля промывочным раствором. Остатки раствора удаляют полосками фильтровальной бумаги. Концентрирующий гель готовят аналогичным образом, наслаивают на разделяющий гель между стеклами и вставляют шаблон в виде "гребешка". После завершения 38 полимеризации (30-40 мин) шаблон вынимают, а камеру помещают в аппарат электрофореза. Исследуемые образцы вносят в "карманы". Электроды соединяют с источником тока, анод подключают к нижнему резервуару с электродным буфером, катод - к верхнему. Электрофорез проводят при постоянном токе (20-30 мА на гель размером 12х19х0.2 см) до тех пор, пока свидетель - бромфеноловый синий не дойдет до нижней границы геля (3-4 ч). Получение радиоавтографов. Гели с разделенными полипептидами для высушивания переносят на смоченную водой фильтровальную бумагу, укладывают бумажным слоем на пористую пластинку и помещают в аппарат для сушки. В случае отсутствия последнего пористую пластинку с гелем укладывают на перфорированную металлическую пластинку, помещают в полиэтиленовый мешок и присоединяют к вакуумному насосу. При подогревании под лампой гель высыхает за 6-8 ч. Пластинка геля становится тонкой, твердеет и в виде гладкой пленки остается на бумаге. Более простой способ высушивания геля состоит в следующем. Гель на стеклянной пластинке плотно покрывают целлофаном, края которого фиксируют, заливая агаром или парафином, и оставляют на несколько суток при комнатной температуре. Высушенные пластины геля хранят под прессом для предотвращения скручивания и другой деформации. Для получения радиоавтографов на гелевую пластинку накладывают медицинскую рентгеновскую пленку, помещают между двумя стеклянными пластинками и фиксируют зажимами. Экспонируют при комнатной температуре в течение срока, определяемого опытным путем. Полипептиды, радиоактивность которых в смеси составляет (20-50)х103 имп/мин, надежно регистрируются за 24-48 ч. После этого пленку проявляют 6-8 мин и закрепляют 5-10 мин в соответствующих растворах. Для флюорографии гель перед высушиванием фиксируют в 12.5%-ном растворе ТХУ при комнатной температуре 30 мин. Наиболее простой и экономичный способ флюорографии состоит в использовании в качестве сцинтиллятора салицилата натрия, преимущество которого в его водорастворимости. Гель вымачивают в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30-60 мин при комнатной температуре. В качестве сцинтиллятора применяют также дифенилоксазол. Для импрегнирования этим сцинтиллятором гель вымачивают в течение 1.5 ч в двух сменах ледяной уксусной кислоты, помещают на 1.5 ч в 3-4 объема 20%-ного дифенилоксазола в уксусной кислоте, затем промывают водой. Гель при этом становится белым и непрозрачным. После высушивания гелевую пластинку экспонируют с рентгеновской пленкой при минус 70 °С. Рентгеновскую фотопленку РТ-1 или РТ-2 проявляют в (2.5 г метола + 72.0 г сульфита натрия безводного + 8.8 г гидрохинона + 48.0 г натрия углекислого безводного + 4.0 г калия бромистого + Н2О до 1.0 л); фиксируют в (260.0 г тиосульфата натрия + 50.0 г хлористого аммония + 17.0 г метабисульфита натрия + Н2О до 1.0 л). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм. Иммуноблотинг. Образцы белков зараженных ВЧС клеток готовят аналогично радиоактивно меченым белкам, но без внесения радиомаркированных предшественников. 2 мг/см3 белков в растворе буферов с низкой молярностью (0.01-0.02 М) и нейтральным рН смешивают с буфером для проб в соотношении 1:1 и инкубируют в кипящей бане 2-5 мин. Электрофоретическое разделение полипептидов проводят как описано выше. Электроперенос полипептидов из полиакрилам геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляют по методу Kyhse-Anderson. Сборку транс-единицы выполняют в аппарате для электропереноса, в котором графитные электроды фиксируют в пластмассовых рамках, по схеме, представленной на рис.4. Размеры листков из фильтровальной бумаги делают на 2-3 мм меньше размеров геля. В процессе сборки транс-единицы тщательно удаляют воздушные пузырьки между слоями. Электроперенос осуществляют при 0.8 mA/см2 в течение 40-60 мин при 20 ОС. Качество переноса и его завершенность каждый 39 раз контролируют путем окрашивания полоски НЦМ с 1-2 треками с маркерами молекулярной массы 0.5.% амидочерным. Иммуноблотинг осуществляют следующим образом. Свободные после электропереноса полипептидов места связывания на НЦМ забивают 5% бычьим сывороточным альбумином на отмывочном буфере (0.02 М трис-НСl, рН 7.2-7.4, 0.05 % твин-20, 0.15 М NaCl ), затем НЦМ инкубируют 2 ч при 37 С с соответствующей антисывороткой в разведении 1:20-1:30, шестикратно ополаскивают в отмывочном буфере и заливают рабочим разведением конъюгата протеина А с пероксидазой хрена в отмывочном буфере. Через 2 ч НЦМ шестикратно отмывают и инкубируют с раствором субстрата ( 10 мг о-дианизидина, 0.07 см3 30% Н2О2 в 40 мл 0.05 М трис-НСl с рН 7.2 ). Учет результатов проводят визуально, регистрируя темные полосы на треках электрофореграмм. В том случае, если исследуемые образцы характеризуются низкой концентрацией белка, перед электрофорезом их необходимо концентрировать. Для этого применяют лиофилизацию, вакуумный диализ, диализ против высокомолекулярного гидрофильного материала (сефадекс G-100, G-200, декстран Т70), осаждение 10%-ной трихлоруксусной кислотой, ацетоном, сульфатом аммония. 1 2 А В C D E 3 1 Рис.7. Сборка транс-единицы в аппарате для электропереноса. (1) Графитовые электроды (( и ) фиксированные на пластиковой основе); (2) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.040 М -амино-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% ( объем/объем ) метаноле, рН 9.4; (3) - шесть слоев фильтровальной бумаги, пропитанной в 0.3 М трис/20% ( объем/объем ) метаноле, рН10.4. Транс-единица: (А) диализная мембрана; (В) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.040 М 6 амно-n-капроновой кислоте/0.025 М трис/20% (объем/объем) метаноле, рН9.4; (С) полиакриламидный гель; (D) - нитроцеллюлозная мембрана; (Е) - три слоя фильтровальной бумаги, пропитанных в 0.025 М трис/20% ( объем/объем ) метанола, рН 10.4. Занятие 25. Полимеразная цепная реакция, её возможности в диагностике инфекций. (Материал подготовлен совместно с д б н, профессором, зав лабораторие ВГНКИ Обуховым И.Л.) Цель занятия: изучить суть использования метода ПЦР Краткие теоретические сведения В настоящее время максимально ранняя диагностика возбудителей инфекций является важнейшим принципом контроля за их распространением. Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний животных и птиц представляет собой одну из наиболее важных задач ветеринарной бактериологии и вирусологии. Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом 40 методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярнобиологическими методами. В каждом случае характер и сложность диагностических приемов зависят от биологии возбудителя инфекции. В отличие от растений и животных микроорганизмы как правило лишены отличительных морфологических и поведенческих свойств, позволяющих определять их принадлежность к определенным таксонам. Поэтому для идентификации патогенных микроорганизмов широко привлекаются биохимические, серологические и молекулярно-генетические подходы. Биохимический анализ выделенного возбудителя в большинстве случаев дает возможность правильно установить родовую или видовую его принадлежность. Однако существенным недостатком данного подхода является требование предварительного выделения возбудителя в виде чистой культуры. Некультивируемость микроорганизмов - главная причина, по которой культуральный метод все более и более теряет свои позиции по мере появления альтернативных подходов. При этом под некультивируемостью мы понимаем как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться из-за широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Помимо этого, для многих возбудителей культуральный метод представляет собой трудоемкую, длительную и дорогостоящую процедуру. В то же время традиционные серологические тесты: РСК, РДП, РГА, а порой и наиболее перспективные методы диагностики - иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ), оказываются фактически неэффективными или принципиально неприемлемыми для выявления инфекционных возбудителей по причине, главным образом, их низкой чувствительности. Поэтому в последнее время все большее распространение получают новейшие методы диагностики, основанные на обнаружении в исследуемых клинических образцах специфических нуклеотидных последовательностей генома микроорганизмов. Генодиагностика — это комплекс методов, которые позволяют обнаруживать гены или последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для определения вида возбудителя инфекционного заболевания. Генодиагностика — относительно новый раздел диагностики, возникший гораздо позже методов, основанных на микробиологических и иммунологических принципах. Поэтому возможности и области применения этого метода еще не так широко известны микробиологам и эпизоотологам. В связи с этим целью данного обзора является рассмотрение как современного состояния генодиагностики, так и областей ее применения. Это, по нашему мнению, позволит показать, что генодиагностика возникла не для того, чтобы потеснить имеющиеся микробиологические и иммунологические методы, а, наоборот, чтобы дополнить их, позволяя решать те задачи диагностики инфекционных заболеваний, которые ранее были не доступны классическим методам. Создание всего нового, в том числе и новых методов диагностики, возможно только на основе фундаментальных разработок. Становление и совершенствование генодиагностики тому яркий пример. Начиная с 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что основной принцип, лежащий в основе всего живого – принцип комплементарности. Однонитевая цепь ДНК для образования двунитевого комплекса взаимодействует с цепью ДНК, обладающей комплементарной последовательностью. С этих пор данный принцип стал широко и успешно использоваться для решения различных, более частных проблем, в том числе и для диагностики патогенных микроорганизмов. 41 До конца 80-х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой генодиагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, которую использовали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд должен быть специфичным по отношению к ДНК тестируемого микроорганизма, а также желательно быть частью гена, кодирующего синтез одного из факторов патогенности. При использовании молекулярного зонда, удовлетворяющего этим требованиям, можно не только идентифицировать микроорганизм, но и давать заключение о его вирулентном потенциале и эпидемиологической значимости, что особенно важно при исследовании микроорганизмов, выделяемых из объектов внешней среды. Использование молекулярного зондирования позволило в значительной степени изменить ряд представлений о диагностике инфекционных заболеваний. Было доказано, что тестирование генов факторов патогенности во многих случаях более информативный подход по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, таких как определение серотипа, фаготипа, способности агглютинироваться в присутствии специфических сывороток, которые далеко не всегда отражают корреляционные связи с вирулентностью исследуемого микроба. Однако метод генодиагностики, основанный на реакции гибридизации ДНК с ДНК, не отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать 10 4-105 мишеней (это могут быть бактериальные клетки, вирусные частицы или очищенная нуклеиновая кислота) в пробе. В связи с этим данный подход является мало информативным при диагностике тех инфекционных состоянии, при которых концентрация микробов ниже порога чувствительности метода, а сами микробы в силу тех или иных причин не размножаются в лабораторных условиях. С такими ситуациями микробиологам приходиться сталкиваться повсеместно: например при диагностике хронических инфекционных состоянии, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов. Те же трудности приходится преодолевать при идентификации практически всех внутриклеточных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, требующих для своего культивирования или очень сложных питательных сред, или же клеточных, или тканевых культур.) Следующим шагом фундаментальной науки — молекулярной биологии гена — было создание способа исследования, получившего название полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего не только преодолевать вышеперечисленные трудности, но и открывающего новые возможности при лечении и эпидемиологическом анализе инфекционных заболеваний. Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К. Мullis, получившим за это Нобелевскую премию в 1993 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм копирования таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 нуклеотидов, называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где п — число циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар между 5'-концами праймеров. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. 42 Построение новых ДНК нитей из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов осуществляет фермент термостабильная ДНК-полимераза, называемая Таq-полимеразой. Процесс амплификации заключается в повторении циклов амплификации, состоящих из денатурации ДНК (1 мин), отжига праймеров (1—2 мин) и построения фрагмента (1—2 мин). В результате 30—35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации. Таким образом, ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах — процессу биологической амплификации, при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105—106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микробов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды или семейства микроорганизмов. Но в то же время ПЦР имеет принципиальное преимущество перед культуральными методами. Диагностические потенции ПЦР не ограничены способностью микроба расти на искусственных средах или в культуре клеток. Поэтому основное преимущество ПЦР перед культуральными методами состоит не в высокой чувствительности ПЦР-метода (так как чувствительность этих методов сопоставима), а в способности идентифицировать и определять свойства тех микроорганизмов, которых не удается по тем или иным причинам размножать в лабораторных условиях. Здесь уместно отметить, что идентификационные тест-системы, основанные на ПЦР, разрабатываются для микроорганизмов с известными к данному моменту последовательностями ДНК в интересующих генах. Наивысшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроба или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалом влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает полимеразная цепная реакция (ПЦР) в основе которой лежит многократное повторение циклов удвоения (амплификация) специфического участка нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода - очень высокая чувствительность: в результате амплификации концентрация специфической олигонуклеотидной последовательности в реакционной пробе возрастает в десятки миллионов раз. За последние 10 лет достигнут значительный прогресс в изучении молекулярной основы наследственных болезней и в их диагностике с помощью молекулярного анализа ДНК- В первую очередь это относится к болезням, которые вызваны мутацией в одном гене (моногенным). Каждый год увеличивается список наследственных болезней, которые могут быть выявлены методами анализа последовательности нуклеиновых оснований хромосомной ДНК. Появилась возможность с помощью исследования образцов ДНК поставить диагноз наследственного заболевания еще до появления клинических симптомов или в пренатальный период. Это позволяет выявить носителей мутантного гена при аутосомнорецессивных болезнях, а также распознать фенотипически сходные, но генетически различные заболевания . В настоящее время расширяется сфера применения этих методов. Помимо диагностики болезней с установленным типом наследования, они начинают 43 использоваться для изучения и мультифакториальных заболеваний (коронарная болезнь сердца, сахарный диабет, опухоли и др.), а также для идентификации личности, установления отцовства и др. Особую диагностическую ценность ДНК-анализ приобретает при тех наследственных болезнях, при которых неизвестен биохимический дефект, лежащий в их основе, и которые поэтому не могут быть выявлены традиционными методами лабораторной диагностики. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень).Ключом к расширению клинического применения достижений современной молекулярной генетики являются не только разработка методов рекомбинантной ДНК, но и значительное упрощение технологии проведения ДНКанализа, повышение чувствительности, быстроты и надежности методов с их 44 последующей автоматизацией. Остановимся теперь более подробно на основных этапах технологии анализа. Получение и хранение ДНК. Геномную ДНК выделяют с помощью многоступенчатых методов из тканей, содержащих ядерные клетки, в том числе из лимфоцитов периферической крови, лимфобластоидных клеточных линий, а также из амниоцитов и ворсин хориона плода, полученных путем биопсии. Кровь для исследования берут в количестве около 10мл с антикоагулянтом: цитратом, глюкозоцитратным раствором (глюгициром) или ЭДТА. В большинстве лабораторий ДНК выделяют из взятых образцов в тот же день, но их можно и хранить при температуре —20°С . Первым этапом анализа ДНК является ее экстракция из тканей по стандартному методу. Клетки крови (или ворсин хориона) гемолизируют, обрабатывают протеиназой К в течение ночи 45 для расщепления белков, экстрагируют сопутствующие вещества фенолом и хлороформом и осаждают нуклеиновые кислоты этанолом. Методы экстракции ДНК постоянно совершенствуются, разрабатываются различные модификации, направленные на ускорение и повышение эффективности методов, а также использование менее вредных для исследователя реактивов. Количество и чистота препарата ДНК оцениваются спектрофотометрически. Экстрагированная ДНК стабильна и может храниться неопределенно долгое время. Это имеет большое значение, так как образцы от людей с генетическими заболеваниями могут быть собраны и сохранены для будущих сопоставлений при обследовании других членов семьи, а также для проведения повторных исследований после получения ДНК-проб нового поколения. Обычно образцы ДНК дублируются и хранятся раздельно в двух морозильниках. Хранение ДНК обеспечивает возможность ДНК-диагностики в семьях, в которых пожилые или страдавшие наследственными заболеваниями родственники умерли до того, как стало возможным предсказательное тестирование. В случаях, когда пораженные родственники уже умерли и ДНК лейкоцитов недоступна для анализа, оказалось возможным использовать замороженную ткань мозга, взятую на аутопсии. Для радиоизотопного анализа по Саузерну обычно требуется 5—10 мкг геномной ДНК, что составляет около 2-10–18 мол. Такое количество ДНК присутствует приблизительно в 106 ядерных клеток, которые могут быть выделены менее чем из 1 мл крови, а в случае пренатальной диагностики — из биоптата ворсин хориона или из амниоцитов. Еще меньшее, крайне незначительное количество ДНК необходимо в тех случаях, когда анализу предшествует амплификация (умножение) участка ДНК-мишени с помощью недавно разработанного метода, использующего повторные циклы полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной клетки используют простое кипячение, замораживание—оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода, как правило, диктуется природой микроба, а точнее природой его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, классическую процедуру фенольнохлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и в первую очередь от ингибиторов Таq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании нуклеосорбентов. Подготовка материала с применением нуклеосорбента занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может гарантировать удаление возможных ингибиторов. Зная возможности и преимущества этого метода, сформулируем те направления исследований в инфекционной патологии, в решении которых ПЦР начинает играть ведущую роль: — диагностика хронических инфекционных состояний, обусловленных персистенцией бактерий или вирусов, — наиболее очевидная область применения ПЦР в диагностических целях; — ПЦР — незаменимый инструмент при идентификации и молекулярногенетических исследованиях практически всех внутриклеточных и мембранных паразитов, таких как вирусы, риккетсии, хламидии, микоплазмы; — ПЦР является наиболее эффективным способом выявления и изучения возбудителей сапронозов, которые, находясь во внешней среде в "некультивируемом" состоянии, способны там сохраняться, переживая неблагоприятные внешние условия в межэпидемические периоды; 46 — ПЦР позволяет проводить определение антибиотикорезистентности у медленно растущих и труднокультивируемых бактерий; — технология ПЦР коренным образом изменила способы маркирования штаммов для целей эпидемиологического анализа, тем самым расширив его возможности. Теперь обратимся к конкретным примерам, которые показывают, как технология ПЦР позволяет решать перечисленные выше задачи. На настоящий момент преимущество ПЦР-анализа перед "золотым стандартом" (так красиво называют культуральный метод выявления бактерий и вирусов) состоит в следующем: 1) более высокая частота обнаружения микроба, превышающая культуральный метод на 6— 7%. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма; 2) время, необходимое для обнаружения микроба культуральным методом, составляет около 4-6 сут., тогда как при использовании ПЦР через 4—5 ч; 3) использование технологии ПЦР позволяет проводить определение инфекционного агента в образцах, взятых неинвазивным путем. Одной из наиболее интересных сфер приложения ПЦР в эпидемиологии является использование этой технологии для мониторинга объектов внешней среды. Помимо решения чисто прикладных задач (усовершенствование методик обнаружения возбудителей в пробах воды, почвы и т. д.) в этой области, ПЦР является важным инструментом для получения фундаментальной информации о способах поддержания жизнеспособности микроорганизмов вне связи с организмом животного или человека. За последние 5—7 лет накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о способности многих видов патогенных бактерий переходить в так называемое некультивируемое состояние. Формирование некультивируемых форм бактерий сопровождается глубокими перестройками метаболизма и изменением морфологии бактериальной клетки. В результате клетки бактерий, сохраняя жизнеспособность, перестают делиться и, будучи перенесены на плотную питательную среду, не формируют колоний. Однако переход в некультивируемое состояние не является необратимым, и под воздействием изменяющихся условий внешней среды некультивируемые клетки бактерий могут восстанавливать способность к пролиферации. Очевидно, что некультивируемые формы бактерий нельзя выявить традиционными микробиологическими приемами, включающими посевы из исследуемых образцов на плотные питательные среды. Микроскопия с использованием витальных красителей в данном случае может служить лишь инструментом изучения формирования некультивируемых форм в лабораторном эксперименте. Показано, что переходить в некультивируемое состояние могут возбудители многих заболеваний человека. Переход в некультивируемое состояние представляет собой способ поддержания жизнеспособности в неоптимальных для активного роста условиях. Эта способность обнаруживается в первую очередь у патогенных бактерий—сапрофитов. Диагностика заболеваний, вызванных многими из подобных инфекционных агентов, успешно обеспечивается традиционными методами. Однако единственным в настоящее время методическим подходом, способным доказать присутствие в образце некультивируемых форм возбудителя, является ПЦР. При использовании такого подхода продемонстрировано, что эндемичность ряда природных очагов объясняется способностью возбудителей сапронозов сохраняться в объектах внешней среды в некультивируемом состоянии. Это положение, по нашему мнению, чрезвычайно важно для всей системы эпизоотоологического надзора, так как дает возможность, используя технологию ПЦР, выявлять потенциально опасные штаммы возбудителей сапронозов раньше, чем они попали в человеческую популяцию и вызвали эпидемиологическое осложнение. Большое значение приобретает метод ПЦР при контроле продуктов питания. Таким образом, технология ПЦР является мощным инструментом, обеспечивающим 47 возможность фундаментального изучения хронических инфекционных процессов и экологии возбудителей инфекционных заболеваний. ПЦР — это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходную в 108 раз. При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующие участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразы. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют "ампликоном". В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n, где n — число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции — фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. Процесс амплификации идет эффективно, если использовать термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus (Tag). К достоинствам указанной полимеразы относится то, что нет необходимости ее замены после каждого цикла, а также сравнительно высокий температурный оптимум детерминируемой ею реакции (70— 75°С). Праймеры для ПЦР обычно имеют длину, как правило, около 20 нуклеотидов. Рассмотрим основные характеристики ПЦР-анализа. Надежность — защищенность анализа от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Ложноположительный результат анализа является следствием заражения образца или реактивов ДНК исследуемого образца или, что бывает чаще, амплификатом. В связи с этим необходимо пространственное разделение диагностической лаборатории как минимум на три блока: в одном из них проводить приготовления ДНК-образца, в другом — постановку амплификации и в третьем — электрофорез и индикацию. Перенос реактивов и оборудования между блоками должен быть исключен. Достаточным контролем является отсутствие сигнала для образца с заведомо отсутствующей ДНК исследуемого образца. Ложноотрицательный результат может быть вызван тривиальными причинами: недостаточной чувствительностью реакции, ошибками оператора в выделении ДНК и проведении амплификации и др. Поэтому в каждой серии анализов присутствует положительный контроль — образец с заведомо присутствующей матрицей для данных праймеров, например хромосомная ДНК искомого возбудителя инфекции. Кроме того, причиной ложноотрицательного результата может быть присутствие в образце ингибиторов реакции. При использовании всех указанных контролей, надежного оборудования и жестко стандартизованных реактивов метод ПЦР высоконадежен. Чувствительность анализа характеризуется очень низкой концентрацией клеток или вирусных частиц в пробе, дающей положительный результат анализа, и определяется эффективностью методики выделения ДНК возбудителя, чувствительностью собственно ПЦР и чувствительностью выбранного метода индикации. Метод выделения ДНК должен быть еще дешевым и простым. ПЦР при оптимальных условиях крайне чувствительна: в модельной системе в сочетании с блотгибридизацией с радиоактивно меченным ДНК-зондом удается зарегистрировать 3—5 копий генома цитомегаловируса в пробе. Достигаются оптимальные условия подбором температурно-временного режима, концентрации ионов магния, праймеров и фермента в реакционной смеси, применением при необходимости "горячего старта" — добавления фермента в реакционную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК. Достигнуть предельно высокой чувствительности при самых простых методах индикации позволяет и четырехпраймерная амплификация 48 (ЧПА). ЧПА реализует принцип "русской матрешки": вначале пара "внешних" праймеров запускает синтез первого ампликона, затем после нескольких циклов пара праймеров, комплементарных внутренним последовательностям первого ампликона, запускает синтез второго, меньшей длины. В модельных системах при диагностике цитомегаловируса ЧПА в сочетании с электрофорезом в ПААГ и окрашиванием бромистым этидием дает возможность уверенно регистрировать порядка 10 геномов в пробе. Предел чувствительности ПЦР-диагностикума инфекционных заболеваний (при условии использования 100 мкл клинического образца) в 100—1000 возбудителей в 1 мл. Такой чувствительности могут достигать только культуральные методы диагностики. Важным параметром является избирательность анализа — способность диагностикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения возможности ПЦР-диагно-стикумов уникальны: соответствующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорганизмов. Уникальность метода обусловлена тем, что он обладает самой высокой чувствительностью и специфичностью, превосходящими получаемые культуральным методом. Учитывая продолжительность и трудоемкость процедуры выращивания культуры клеток (до месяцев), преимущества ПЦР (5—8 ч) очевидны. Специалистами фирмы проведена сравнительная оценка эффективности метода ПЦР по сравнению с традиционными методами, показаны преимущества и ограничения применения метода в клинической практике. Так, проведено сравнение результатов ПЦР-анализа и нерадиоизотопного гибридизационного анализа клинических образцов на содержание хламидия трахоматис и уреаплазма уреалитикум с использованием в качестве метки комплексов платины и показано хорошее совпадение результатов, полученных указанными методами ДНК-диагностики. Исследованиями в ряде ведущих лабораторий мира на примере обнаружения в биологических пробах хламидия трахоматис показано, что методом ПЦР или лигазной цепной реакции определяют на 10—20% больше положительных проб, чем культуральным методом или подтверждающими некультуральными методиками. Методом ПЦР в клиническом материале (соскоб клеток эпителия) нами обнаружено наличие двух биоваров уреаплазма уреалитикум. Важным параметром является избирательность анализа — способность диагностикума выявлять возбудителей инфекции конкретного вида на фоне любых других микроорганизмов, вирусов и клеток организма хозяина. С этой точки зрения возможности ПЦРдиагностикумов уникальны: соответствующим образом выбранная последовательность ДНК мишени (выбор праймеров) позволяет в зависимости от целей диагностикума выявлять вид и отдельные штаммы микроорганизмов. Забор материала. Как правило, это соскоб эпителиальных клеток со слизистой цервикального канала или уретры, могут использоваться слюна, выделения, моча, у детей — соскоб с миндалин. Собранный биоматериал желательно сразу использовать для анализа. Хранить биоматериал можно при —20°С не более 0,5 мес. Соскоб из цервикального канала желательно брать в середине менструального цикла. У лиц, принимающих антибиотики, уросептики, наркотические вещества, взятие биологического материала для анализа следует производить через 14 сут после их отмены. ЗАО "ВСМ" производит набор лабораторных изделий и поставляет "под ключ" диагностические центры для ПЦР-диагностики, обеспечивает гарантийное и постгарантийное обслуживание оборудования, проводит обучение методу. Минимальный набор состоит из следующих приборов: 1. Термостат, программмируемый для проведения ПЦР-анализа "ВСМ" (рекомендован к применению в медицинской практике Минздравом РФ), — прибор для проведения амплификации (умножения) детектируемого участка генома возбудителя 49 заболеваний. Прибор рассчитан на одновременный анализ 24 образцов (из которых один положительный и один отрицательный контроль) клинического материала. 2. Термостат 2Т001 ("ВСМ") — предназначен для термостатирования биологических проб. 3. Настольная миницентрифуга (Элми) — предназначена для подготовки проб исследуемого клинического материала. Обеспечивает максимальную частоту вращения ротора 14 000 об/мин. 4. Микроцентрифуга-вортекс МВ01 ("ВСМ") — предназначена для низкооборотного центрифугирования и ресуспендирования биологических проб. 5. Источник питания низковольтный "ИП-01" ("ВСМ") — предназначен для серийного анализа биологических образцов при помощи электрофореза при двух фиксированных значениях напряжения. 6. Камера для электрофореза КЭ-01 ("ВСМ") — предназначена для проведения исследования биомедицинских проб методом электрофореза в агарозном геле. 7. Трансиллюминатор ТР-01 ("ВСМ") — источник ультрафиолетового излучения, предназначен для исследования люминесцирующих следов в жидкостях и гелях. В состав набора входят микродозаторы, подставки и коробочки для пробирок типа Эппендорф. Возможно комплектование диагностических центров любым отечественным и зарубежным оборудованием, программируемый термостат может снабжаться стабилизатором, а трансиллюминатор фотоаппаратом или монитором, компьютером для архивации результатов. ЗАО "ВСМ" обеспечит Ваших специалистов необходимыми методическими материалами, проводит консультирование по лицензированию и интерпретации полученных результатов. Одной из основных задач мы видим в пропаганде возможностей метода, внедрение его в сегодняшних непростых условиях в медицинскую практику. В России и странах СНГ уже работают десятки лабораторий, поставленных ЗАО "ВСМ". Суммируя преимущества использования тест-систем на основе метода ПЦР, необходимо отметить: 1. Метод позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. 2. Для диагностики практически всех известных в настоящее время заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно отличающиеся для разных инфекций наборы реактивов, что обусловлено химическим сродством нуклеиновых кислот. Появляется возможность создания для многих биологических жидкостей и возбудителей создания универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК и постановки реакции. 3. Отпадает необходимость в средах, клеточных культурах, узкой специализации медицинского персонала. ПЦР-диагностикумы дают возможность избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. 4. Возможен анализ серонегативных пациентов на самых ранних стадиях инфекционного процесса, когда лечение наиболее эффективно. 5. Легко определяются патогенные возбудители, для которых не разработаны или затруднены методы культивирования, а также для персистирующих форм патогенных бактерий. 6. Метод позволяет поставить надежный диагноз в течение рабочего дня, т. е. за 6—8 ч. 7. Метод обладает высокой чувствительностью (до 1—5 копий возбудителя в пробе) и специфичностью (различают серологические штаммы). 8. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы: обычно несколько микролитров. 9. Возможна одновременная диагностика нескольких возбудителей заболеваний в одной пробе. 50 10. Стоимость одного анализа при использовании отечественных приборов и реактивов сопоставима со стоимостью одного анализа иммуноферментным методом. В настоящее время ученые разных стран мира прилагают усилия для дальнейшего развития метода ПЦР: упрощения и автоматизации анализа, возможности синтеза больших фрагментов нуклеиновых кислот, расширения приложений метода. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) имеет крайне высокую аналитическую чувствительность и позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы на любом филогенетическом уровне. Это обусловило его широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний с/х животных. В то же время высокая 'чувствительность метода при неправильном его использовании может привести к снижению специфичности ПЦР-анализа. Главной проблемой здесь является случайный перенос (контаминация) следовых количеств ДНК активной в ПЦР (специфических продуктов амплификации ДНК - «ампликонов», положительного контрольного образца, ДНК клинического образца, содержащего возбудитель) в реакционную пробирку, не содержащую возбудитель и как следствие появление ложноположительных результатов ПЦР. Сотрудники практической ПЦР-лаборатории в своей работе сталкиваются с двумя основными видами контаминации: 1) перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов; 2) контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации. Необходимо также указать еще на две, часто встречающиеся, Причины контаминации. Одна из них связана с тем, что вблизи или даже в самом помещении, предназначенном для ПЦР, производится параллельная микробиологическая диагностика одноименных возбудителей инфекций или оба вида анализа выполняются одними и теми же сотрудниками. При этом контаминирущим материалом может стать ДНК, получаемых в больших количествах в процессе микробиологического наращивания возбудителей. В научно-исследовательских учреждениях, занятых в разработке ПЦР-методик или организациях производящих ПЦР-тест-системы к вышеперечисленным источникам контаминации, может добавится контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты генов мишеней для ПЦР, изготовляемых в качестве положительных контрольных образцов. Среди всех вариантов контаминации наиболее часто встречающимся является контаминация «ампликонами» посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или поверхности кожи сотрудников лаборатории, что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Как правило, выявление ; источника контаминации представляет, собой трудоемкую задачу, требующую- затрат времени и средств. Накопленный к настоящему моменту опыт работы ведущих лабораторий ПЦРдигностики инфекций позволяет сформулировать основные требования к планировке помещений и правила проведения самих анализов. Строгое соблюдение данных требований значительно снижает риск контаминации и получения ложноположительных результатов. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦРдиагностичвских лабораторий 51 1). Лаборатория должна быть разделена на зоны или комнаты для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат: - ПЦР-помещение, где выделяются Зона 1 - для проведения обработки клинических образцов и Зона 2 - для приготовления реакционной ПЦР-смеси и внесения выделенных проб ДНК (при наличии условий Зону 1 и Зону 2 рекомендуется организовать в разных комнатах); - в ПЦР-помещений запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. - пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; - в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. 2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от ПЦР-помещений. 3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в ПЦРпомещения. 4). Обработка клинических образцов должна производиться в ламинарном шкафу или настольном ПЦР-боксе, снабженном ультрафиолетовыми лампами. 5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: ПЦРпомещений к пост-ПЦР-помещению. 6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящиеся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку. 7). Следует однократно использовать перчатки как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР. 8). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси. 9). Целесообразно использовать наконечники для автоматических пипеток аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку. 10). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов. 11). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов. 12). Не следует использовать водяные бани, так как заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источников контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты. 13). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп, работа должна проводиться с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами 1-II групп патогенности)" и "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", М.,1980. 14). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте: - каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, дезинфицирующий раствор и 52 т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы. - при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя). - следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы с целью борьбы с пылью. 15). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей которые диагностируются данной лаборатории. 16). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение. Требования к проведению ПЦР-анализа Обработка клинических образцов 1). Забор клинических образцов необходимо производить только одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробив предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщател промытые дистиллированной водой и прокаленные. 2). Работать только в одноразовых перчатках. 3). Необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматичес пипеток с аэрозольным барьером. 4). Обязательно менять наконечники при перехода от одной пробы к другой 5). Использованные пробирки и наконечники повторно не используются, должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с раствором соляной кислоты. Постановка ПЦР 1). Работать только в одноразовых перчатках. 2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все прс включая контрольные, и затём - раскапывать ее по пробиркам. 3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемов/ одноразовые наконечники. 4). В каждый данный момент работать только, с одной пробиркой. 5). Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно примеь • отрицательные и положительные контроли в соответствии с методическ указаниями или инструкцией по применению диагностических наборов. 6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавлятьс реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьеро! последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкое 1 М раствором НС1. Детекция продуктов амплификации 1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной ком» сотрудником лаборатории. 3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), •должны находиться только в этой комнате и не должны попадать в ПЦР-помещения. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией 1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 45 мин. до начала работы и в течение 45 мин. после окончания работы. 53 2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 М НС1, 10% типохлоритом натрия или 10% хлорной известью). Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции. Список сокращений и специфических терминов ПЦР – полимеразная цепная реакция дцРНК – двухцепочечная РНК дцДНК – двухцепочечная ДНК ИФА (ЭЛИСА) – иммуноферментный анализ ИБ – иммуноблотинг ИФ – иммунофлюоресцентный анализ HPLC – жидкостная хромотография высокого давления ОП ПЦР – обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией ПДРФ – полиморфизм длин фрагментов рестрикции РН – реакция нейтрализации Э/Фв ПААГ – электрофорез в полиакриламидном геле НК – нуклеиновые кислоты ГА – гибридизационный анализ Тад – термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquqticus "Горячий старт" – добавление фермента в реакционную смесь, уже прогретую до температуры плавления ДНК ЧПА – четырехпраймерная амплификация "Затравка" – два олигонуклеотидных праймера фланкирующих участок ДНК, специфический для определяемого возбудителя, длиной около 20 нуклеотидов "Ампликон" – амплифицированный (захваченный) участок с помощью специфических праймеров "Золотой стандарт" – культуральный метод выявления инфекционного агента, бактерий, вирусов, простейших и т.д. ВГС – вирус гепатита С Биот – отпечаток фрагмента ДНК, перенесенный с геля на мембрану Инсерт-ДНК – проба, выделенная путем расщепления ее рестриктазой, чтобы высвободить необходимую последовательность внедренного фрагмента Информативность – гетерозиготность по маркеру Термоциклер - устройство, позволяющее одновременно применять метод ПЦР, для 48 проб, увеличивая количество индивидуальных ДНК-сегментов в миллион раз в течение 4 часов. Полимераза Кленова – фрагмент ДНК-полимеразы IE.coli, имеющий оптимум синтетической активности при 37С. ТТ-ДНК – полимераза, выделенная из Termus Termophilus, обладает сходными свойствами с Тад-полимеразой Паттерн – картина амплифицированованной ДНК в геле Тох+ - токсигенные штаммы н.п – нуклеотидные пары "Гнездовая ПЦР" – модифицированный метод ПЦР, позволяющий избежать стадии ДНК-гибридизации при подтверждении специфичности полученного продукта ПЦР. 54 Литература. Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г., Болтовская М.Н. Гибридомы и моноклональные антитела в биотехнологии и медицине/ Биотехнология.- 1989, 20: 138 Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа: Пер. с англ./ Под ред. Кеннета Р.Г., Маккерна Т.Д., Бехтол К.Б. – М.: «Медицина», 1983. – 416.: Петров Р.В. Иммунология. – М., «Медицина», 1982 Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М., Мир, 1979. Новые методы иммуноанализа. Под редакцией У.П. Коллинза. М. «Мир.» 1991. Гринин А., Рыбаков С., Радиоиммунологический анализ. –М. Энергоатомиздат., 1984., с 3. Ткачева Г., Балабокин М., Ларичева И. Радиоиммунохимичские методы исследования. – М. Медицина, 1983, с. 72 -75. Чард Т. Радиоиммунологические методы. –М., 1981. Иммунологические методы, под редакцией Фримеля, –М., 1975, с.432 – 434. Ванеева Л., Цветкова Н. Иммуноферментный метод, его настоящее и будущее.// Иммунология.,1980, №2, с. 13-19. Воллер А., Бидуелл Д. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. /Теория и практика// Бюлл. ВОЗ, 1977, т.53, N:1, с. 38-48. Гаврилова Е. Гомогенный иммуноферментный анализ – новое направление иммунохимии //Ж. Всес. хим. о-ва., 1982, т. 27, N:4, с.450-457. Дзантиев Б., Егоров А. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа, //Ж. Всес. хим. о-ва, 1982,Т. 27, N:4, с.442-449. Дзантиев Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа.// Бюлл. ВИЭВ, 1985,с. 10-22. Иммуноферментный анализ. //М., Мир, 1988. Манолов А. Твердофазные радиоиммунные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //ЖМЭИ, 1985, N:4, с.100-107. Коромыслов Г., Авилов В. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии // Бюлл. ВИЕВ, 1985, вып. 58, с. 6-9. Покровский В., Ермолин Г., Шабалина С. Настоящее и будущее иммуно-ферментных методов исследования в инфекционной патологии //Ж. микроб., эпидем. и иммунологии, 1983, N:8, с.3-7. Орлов А. Характеристика иммуноферментного метода и оценка его возможностей с позиций экспресс-диагностики // Препараты для экспрес-с-диагностики, Л., 1981, с. 55-59. Яковлев А., Зыкин Л.Ф., Рыбкин В. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов.,1990. Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т. Очерки по лабораторной диагностике опасных инфекций. Саратов, 1993, с.7-29. 55 56