Иммунолипосомы – новое средство доставки - hem

Иммунолипосомы – новое средство доставки лекарственных препаратов
А.Ю.Барышников, Н.А.Оборотов
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН,
Москва
В конце XIX века немецкий бактериолог Пауль Эрлих предложил термин "волшебная
пуля", подразумевающий химиопрепарат, который находит в организме и избирательно
убивает опухолевые клетки без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор
селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается
предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели
является
разработка
препаратов.
Липосомы
липосомальной
лекарственной
представляют
собой
формы
закрытые
противоопухолевых
сферические
пузырьки,
образованные из фосфолипидов, которые состоят из гидрофильной головки и
гидрофобного хвоста. В ходе образования липосом гидрофильные вещества обычно
попадают в срединное водное пространство пузырьков, а липофильные субстанции
встраиваются в фосфолипидный слой. Липосомы впервые описаны около 30 лет назад и
названы фосфолипидными сферулами. Вначале липосомы использовались как модельная
система при изучении биологических мембран, а затем – как средство доставки
лекарственных
исследования
препаратов,
в
этом
в
том
направлении
числе
и
привели
противоопухолевых.
к
созданию
Последующие
большого
количества
липосомальных форм, способных нести широкий спектр препаратов, некоторые из них
уже нашли клиническое применение. Липосомы существенным образом улучшили
терапевтическую эффективность противоопухолевых препаратов и снизили токсичность
по сравнению со свободными субстанциями [1, 2]. Однако не все цитостатики пригодны
для создания липосомальных лекарственных форм. Так, при включении метотрексата и
цитозара в липосомы их токсичность возрастает, тогда как при включении доксорубицина
–
снижается.
Недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном
введении и последующий захват клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС). Для
преодоления захвата липосом мононуклеарами РЭС ученые разработали липосомыневидимки. С этой целью в липидный слой липосом встраивают полиэтиленгликоль
(ПЭГ), что приводит к повышению осмотического давления вокруг липосом и
препятствует их сближению с клеткой. Эти везикулы называются пегилированными
липосомами, они являются невидимыми для клеток РЭС и долгое время циркулируют в
крови. Однако пегилированные липосомы имеют существенный недостаток – они также
плохо
накапливаются
в
опухоли.
Оригинальным направлением в липосомологии явилась разработка нового поколения
лекарственных препаратов – иммунолипосом. Иммунолипосомы представляют собой
липосомы, к которым прикреплены моноклональные антитела (МКА). МКА обеспечивают
специфическое связывание липосом с антигенпозитивными клетками, а липосомы несут
соответствующий гидрофобный или гидрофильный химиотерапевтический препарат.
В настоящее время различают три типа иммунолипосом: А, В и C [3]. В
иммунолипосомах типа А МКА ковалентно связаны с обычными липосомами
посредством короткого якоря. Тип B – это уже пегилированные липосомы, в которых
МКА также ковалентно связаны с ними посредством короткого якоря. Тип С (Pendant-type
PEG-immunoliposomes) – это стерически стабилизированные ПЭГ липосомы, в которых
МКА
С
прикреплены
помощью
к
липосом
типа
дистальному
А
было
терминальному
убедительно
концу
ПЭГ.
продемонстрировано,
что
иммунолипосомы более эффективно доставляют лекарства в клетки-мишени по
сравнению с обычными липосомами в тестах как in vitro, так и in vivo [4]. Однако
связывание иммунолипосом с клетками-мишенями in vivo было более сложным. Изучение
иммунолипосом in vivo показало, что прикрепление к липосомам антител усиливало их
захват мононуклеарами РЭС. Эффективность связывания иммунолипосом с клеткамимишенями
зависела
от
плотности
антител
на
поверхности
липосом.
Захват
иммунолипосом клетками РЭС и эндотелиальный барьер, разделяющий сосудистое русло
от опухолевой ткани, побудили исследователей к созданию нового типа липосом. Это
привело
к
удлиненным
конструированию
периодом
стерически
стабилизированных
циркуляции
иммунолипосом,
в
с
крови.
В первых работах по созданию долгоциркулируюших иммунолипосом к стерически
стабилизированным липосомам, содержащим фосфолипиды с модифицированными ПЭГ
головными группами, антитела были прикреплены через короткий гидрофильный якорь
близко к поверхности липосом (липосомы типа B) [5]. Эти липосомы сохраняли свойство
долговременной циркуляции, но взаимодействие с клетками-мишенями было угнетено по
тому же механизму, как и угнетение захвата мононуклеарами РЭС, т.е. из-за блокады ПЭГ
[6].
Позже МКА были прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ, связанным с
липосомами (липосомы типа С). Это привело к сохранению способности стерически
стабилизированных липосом специфически связываться с клеточной поверхностью
клеток-мишеней
и
быть
защищенными
от
захвата
мононуклеарами
РЭС
[7].
Сравнение эффективности специфического связывания и захвата мононуклеарами РЭС
этих трех типов иммунолипосом, проведенное K.Maruyama [3] на модели МКА 34А
против поверхностного эпителия легких, показало, что 42,5% липосом типа А
накапливаются в легких, а в крови и печени выявляется небольшое количество. При
введении липосом типа С специфически связываются 56,6% от введенной дозы липосом.
В крови и печени накапливалось меньше препарата (7%), чем при инъекции липосом типа
А. Липосомы типа B показали низкий уровень специфического связывания и около 60%
препарата от введенной дозы долго циркулировало в крови. Таким образом, наиболее
перспективными
являются
липосомы
типа
С.
В настоящее время для ковалентного прикрепления МКА к терминальным концам ПЭГ,
с целью получения стабильной связи антител с ПЭГ, используют три метода, т.е.
связывание через серу (thiother) [7], амидные группировки (amide) [3] и гидразоны
(hidrazone)
[8].
К антителам, используемым в конструировании иммунолипосом, предъявляют
определенные требования. МКА должны сохранить свою специфичность при конъюгации
с липосомами, иметь афинность, достаточную для связывания низкой концентрации
иммунолипосом, обладать низкой иммуногенностью. С этой целью используют
гуманизированные МКА, для удаления мышиного белка, а также Fab' фрагменты антител
для удаления фрагментов Fc. Антитела должны эффективно интернализовываться
клетками-мишенями путем эндоцитоза, обладать биологической активностью и усиливать
противоопухолевый ответ. МКА должны быть технологичны в производстве и иметь
достаточный
срок
хранения
[9].
К антигену, являющемуся мишенью для иммунолипосом, также имеются определенные
требования. Он должен сильно и гомогенно экспрессироваться в опухолевой ткани, быть
жизненно важным для опухолевой клетки и не исчезать с клеточной поверхности.
Антиген должен минимально слущиваться с поверхности опухолевой клетки для
избежания связывания иммунолипосом с растворимым антигеном или усиления клиренса.
Комплекс антиген–иммунолипосома должен пиницитироваться в опухолевую клетку.
Связь антител с липосомами должна быть стабильной в крови. Якорь не должен
связываться с распознающим местом на молекуле антител и быть иммуногенен, должен
быть нетоксичен и избегать опсонизации, не должен влиять на препарат в липосоме,
стабильность
липосомной
мембраны
и
оказывать
стерическое
препятствие.
Эффективное связывание иммунолипосом с клетками-мишенями происходит лишь
тогда, когда мишени находятся в сосудистом пространстве или когда иммунолипосомы
проходят сквозь слабую сосудистую стенку. В литературе рассматриваются два
анатомических подхода. Первый – это уже существующие внутрисосудистые места, такие
как поверхностный эндотелий сосудов, клетки крови или тромбы. Второй – менее
доступные места, такие как солидные опухоли, места инфекции или воспаления, в
которых сосудистые структуры слабы [3]. Доказано, что капиллярная проницаемость
эндотелиального барьера во вновь васкулиризируемых опухолях значительно выше, чем в
нормальных тканях. Нормальные ткани выстланы нефенестрированным сосудистым
эндотелием, и прохождение макромолекул или липосом в ткань затруднено. Кроме того, в
опухолевой ткани практически отсутствует дренирование лимфатической системой,
поэтому макромолекулы и липосомы накапливаются в опухолевой ткани и остаются там
длительное время. Несколькими методами в различных опухолевых моделях на мышах
было убедительно доказано, что липосомы диаметром 100–200 нм проходят через
сосудистую
стенку
и
накапливаются
в
опухолевой
ткани.
Большое значение имеет соотношение антител к липидам в иммунолипосоме. Так, при
весовом
соотношении
1:50
к
одной
липосоме
присоединялось
24
молекулы
моноклональных антител, а при соотношении 1:1 – 935 молекул антител. Специфическое
накопление иммунолипосом, конструированных при соотношении 1:50, было 3% от
введенной дозы, а созданных при соотношении компонентов 1:1 – 60% от введенной дозы
иммунолипосом. Захват иммунолипосом клетками печени снижался с 50% от введенной
дозы для липосом с низким содержанием антител до 12% для липосом с высоким
содержанием антител. При этом захват иммунолипосом, содержащих низкое количество
антител, не отличался от захвата обычных липосом. Иммунолипосомы, которые не
связались с клетками-мишенями при первых нескольких пассажах через опухолевые
капилляры,
накапливались
в
печени
и
селезенке
[3].
Специфическая доставка противоопухолевых препаратов с помощью иммунолипосом
способствовала лучшей терапевтической эффективности и снижению токсичности по
сравнению с обычными липосомами [1]. Это было убедительно продемонстрировано на
моделях солидных опухолей у мышей [10] на ксенотрансплантатах человеческой Bклеточной
лимфомы
у
голых
мышей
[8].
К настоящему времени описано несколько препаратов иммунолипосом, потенциально
перспективных для применения в онкологической практике. Они направлены против
клеток, экспрессирующих антигены CD71 (рецептор трансферрина), Her2/neu (рецептор
эпидермального фактора роста) [11], HLA-DR (антигены гистосовместимости II класса)
[12,
13],
CD19
В-клеточной
(обще-В-клеточный
лимфомы)
маркер)
[8],
[14]
LL2
(антиген
и
др.
Кроме того, иммунолипосомы стали применять для создания иммуномагнетиков с
целью фракционирования CD34-положительных стволовых клеток человека [15], для
создания
иммунодиагностикумов
[16]
и
т.д.
Таким образом, иммунолипосомы могут воплотить идею Пауля Эрлиха о "волшебной
пуле", избирательно находить и убивать опухолевую клетку, не повреждая окружающие
ткани и не оказывая токсического действия на организм больного. Но следует учесть, что
иммунолипосомы – это технологически очень сложная система доставки лекарственных
препаратов, зависящая от многих составляющих ее компонентов. Однако бурное развитие
биотехнологии вселяет надежду на то, что иммунолипосомы дойдут до клиники.
Литература.
1. Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited: Science. 1995; 267: 1275–6.
2. Harrington K.L., Lewanski C.R., Stewart S.W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of
cancer/Part.2: Clinical development. Clin Oncol 2000; 12: 16–24.
3. Maruyama К. In vivo targeting by liposomes. Biol Pharm Bull 2000; 23: 791–9.
4. Wright S., Huang L. Advanced Drug Delivery Rev 1989; 3: 343–40.
5. Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. et al. Targeted accumulation of polyethylene glycolcoated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium. FASEB J 1992; 6: 2716–9.
6. Torchilin V.P., Papisov M.I., Bogdanov A.A. et al. Molecular mechanissm of liposome and
immunoliposome steric protection with poly(ethylene glycol) in "Stealth Liposomes". D.Lasic,
F.Martin (Eds), P.51-62. CRC Press<Boca Raton. FL. 1995.
7. Alien T.M., Brandeis E., Hansen C.B. et al. A new strategy for attachment of antibodies to
sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells. Biochim Biophys
Acta 1995; 1237: 99–108.
8. Lopes de Menezes D.E., Pilarski L.M., Belch A.R., Alien T.M. Selective targeting of
immunoliposomal doxorobicin against human multiple myeloma in vitro and ex vivo. Biochim
Biophys Acta 2000; 1466 (1-2): 205–20.
9. Kirpotin D., Park J.W., Hong K. et al. Sterically stadilized anti-HER2 immunoliposomes:
desin and targeting to human breast cancer cells in vitro. Biochemistry 1997; 36: 66–75.
10. Park J.W., Hong K., Kirpotin D.B., Papahandjopoulos C.C., Benz C.C. Adv Pharmacol 1997;
40: 399–435.
11. Papahadjopoulos D., Kilpotin D.B., Park J.W., Hong K., Yi Shao, Shalaby R., Colbern G.,
Benz C.C. Targeting of drugs to solid tumors using anti-HER2 immunoliposomes. J Liposome
Research 1998; 8 (4): 425–42.
12. Dufresne I., Desormeaux A., Bestman-Smith J., Gourde P., Tremblay M.J., Bergeron M.G.
Targeting lymph nodes with liposomes bearing anti-HLA-GR Fab' fragments. Biochim Biophys
Acta 1999; 1421 (2): 284–94.
13. Bestman-Smith J., Gourde P., Desormeaux A., Tremblay M.J, Bergeron M.G. Sterically
stabilized liposomes bearing anti-HLA-DR antibodies for targeting the primary cellular
reservoirs of HIV-1. Biochim Biophys Acta 2000; 1468 (1-2); 161–74.
14. Lundberg B.B., Griffiths G., Hansen H.J. Specific binding of sterically stabilized anti-B-cell
immunoliposomes and cytotoxicity of entrapped doxorubicin. Int J Pharm 2000; 205 (1-2): 101–
8.
15. Merrcadal M., Domingo J.C., Petriz J., Garcia J., de Madariaga M.A. Preparation of
immunoliposomes bearing poly(ethylene glycol)-coupied monoclonal antibody linked via a
clevable disulfide bond for ex vivo applications. Biochim Biophis Acta 2000; 1509: 299–310.
16. Park S., Durst R.A Immunoliposoine sandwich assay for the detection of Escherichia coli
0157:H7. Anal Biochem 2000; 280 (1): 151–8.