Сytogenetic analysis and stability of human bone marrow MSCs

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ EX VIVO В РАЗЛИЧНЫХ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Е.Ю. Осипова, лаборатория стволовых клеток и клеточных технологий, д.м.н.
Т.В. Шаманская, отделение регистра стволовых клеток, к.м.н.
Б.Б. Пурбуева, лаборатория стволовых клеток и клеточных технологий, к.м.н.
Т.А. Астрелина, заместитель директора по медицинской части, д.м.н.
М.В. Яковлева, директор, к.м.н.
ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы»,
Москва
Введение. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга человека имеют
большой потенциал для использования в клинике в качестве самостоятельной или
вспомогательной клеточной терапии. Иммуномодулирующие свойства МСК позволяют
использовать их в качестве дополнительной клеточной терапии для снижения реакции
«трансплантат против хозяина», кроме того, котрансплантация МСК способствует более
быстрому приживлению трансплантата гемопоэтических стволовых клеток. Интерес к
клиническому использованию МСК связан с тем, что их легко выделить из костного мозга или
других тканей, а культивирование и введение клеток пациенту не вызывает ни технических, ни
этических проблем. Вместе с тем, безопасность введения культур МСК в плане их возможной
генетической и онкогенной трансформации не доказана.
Результаты исследований генетической стабильности культур МСК, предназначенных
для трансплантации противоречивы. Показано, что МСК из костного мозга остаются
генетически стабильными на протяжении длительного культивирования. Другие авторы
указывают на возможность спонтанной трансформации МСК, выделенных из костного мозга и
жировой ткани, что доказывается индукцией и формированием опухолей из этих клеток у
животных in vivo.
Целью работы было исследование генетической стабильности (кариотипа и частоты
анеуплоидии) в культурах МСК костного мозга человека при длительном культивировании ex
vivo.
Методы: Материалом исследования служил костный мозг здоровых доноров (n=70),
забранный в целях аллогенной трансплантации пациентам с гематологическими заболеваниями,
находившимся на лечении в Федеральном центре детской гематологии, онкологии и
иммунологии Росздрава. Мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга,
высаживались во флаконы в среде ДМЕМ с добавлением 10% ЭТС. Через 1-3 суток
неприлипшие клетки удалялись со сменой среды, через 14 дней клетки снимали с пластика с
помощью трипсина-ЭДТА и затем пассировали каждые 7 дней до окончания культивирования.
Определение поверхностных маркеров клеток проводили с использованием следующей панели
антител: CD14, CD19, CD31, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD133 и HLA-DR.
Для определения параметров генетической стабильности проводили комплексную оценку
частоты анеуплоидии в интерфазных ядрах и кариотипа МСК, культуры содержащие более 10%
клеток с одной хромосомной патологией, относили к клонообразующим.
Фиксацию МСК для цитогенетического анализа проводили на 2-3-й день после
последнего пассажа в соответствии со стандартным протоколом. Цитогенетические препараты
для кариотипирования готовили методом G-окраски. Для каждой культуры МСК анализировали
не менее 15 метафаз. Для проведения интерфазного FISH-анализа использовали центромер-
специфичные ДНК-зонды на хромосомы X (DXZ1), Y (DYZ3), 6 (D6Z1), 8 (D8Z1), 11 (D11Z1)
(Abbott, Vysis). В каждой культуре анализировали 500-1000 интерфазных ядер.
Определение иммунофенотипа и цитогенетическое исследование проводили дважды: на
2-4 и 10-12 пассажах.
Результаты. После культивирования в течение 3-4 пассажей на МСК костного мозга
наблюдалась высокая экспрессия (>80%) маркеров: CD90, CD105, CD73. Менее 5%
стромальных клеток несли маркеры: CD45, CD34, CD19, CD45. При увеличении срока
культивирования МСК до 10-12 пассажа снижалось количество клеток, экспрессирующих CD90,
из культур исчезали примеси гемопоэтических клеток и моноцитов. Анализ иммунофенотипа
показал, что все культуры, как на ранних, так и на поздних пассажах можно отнести к МСК.
При культивировании с животной сывороткой или без клетки несли поверхностные
маркеры характерные для МСК: CD44, CD73, CD105 и другие. Загрязнение гемопоэтическими
клетками было менее выражено при экспансии в бессывороточной среде как на ранних, так и на
поздних пассажах.
Во всех культурах МСК кариотип клеток был нормальным - 46,ХУ или 46,XX и
оставался стабильным в течении экспансии. Частота дисомии по хромосомам 6 и 8 составляла
98%, трисомии – 0,9% и не менялась при культивировании. Частота моносомии по половым
хромосомам в культурах МСК была выше, чем частота трисомии (p0,05). Частота анеуплоидии
в культурах МСК не менялась при длительном культивировании ex vivo. С помощью FISHанализа были выявлены 3 культуры МСК с абнормальными кленами (1 с трисомией 8, и 2 с
моносомией Х). Эти клоны были обнаружены уже на ранних пассажах и сохранялись до
поздних этапов культивирования. Источниками клонов могли быть аномальные клетки костного
мозга здоровых доноров, для которых не был запущен механизм апоптоза in vivo, или же
аберрантные клетки, возникшие in vitro в процессе выделения из костного мозга и на ранних
этапах культивирования МСК.
В нашем исследовании была изучена возможность культивирования МСК на различных
средах. Ограничением настоящего исследования является небольшое количество образцов,
которое не позволило получить статистически значимого различия в числе полученных при
культивировании клеток. Тем не менее, была отмечена тенденция к меньшему числу прироста
МСК при культивировании их на средах не содержащих животной сыворотки. Вместе с тем, как
следует из приведенного выше международного опыта, бессывороточные среды могут быть
использованы для
культивировании МСК и получения адекватных количеств клеток,
необходимых для применения в клинической практике.
Заключение. В большинстве исследованных нами культур МСК кариотип и уровень
анеуплоидии не менялись даже после длительного культивирования. В части культур уже на
ранних пассажах выявлены клоны с аномальным кариотипом. Применение таких культур в
клинике может привести к отдаленным последствиям клеточной терапии. Дальнейшие
исследования в этой области позволят создать методические подходы для быстрой комплексной
оценки генетической стабильности клеточных трансплантатов, выявления и характеристики
аномальных клонов с возможными онкогенными свойствами до их клинического применения.
Необходимо проведение дальнейших исследований, которые позволят определить место
бессывороточных сред в протоколах ex vivo экспансии МСК, в том числе и для клинического
применения.