2. материалы и методы исследования

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ИНСТИТУТ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
На правах рукописи
Пастушкова Людмила Ханифовна
ПРОТЕОМНЫЙ ПРОФИЛЬ МОЧИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА
В НОРМЕ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА
14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Консультанты:
Ларина Ирина Михайловна,
доктор медицинских наук, профессор, ГНЦ РФ - ИМБП РАН
Николаев Евгений Николаевич,
доктор физико-математических наук, профессор, ИБХФ РАН
2
Москва
2015
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………...…………………………
5
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………………………..
8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………………...
15
1.1. Строение, биосинтез и функции белков в организме человека ……...……………….
15
1.2. Обмен белков в организме здорового человека …………………………………...
20
1.2.1. Поступление извне ………………………………………………………………..
20
1.2.2. Распад белков в организме ……………………………………………………….
21
1.2.3. Выведение продуктов белкового обмена ………………………………………..
22
1.2.4. Синтез белка де ново и переаминирование ……………………………….…….
23
1.3. Процессы, которые участвуют в создании белковой композиции крови ………..…..
26
1.3.1. Секреция белков в кровь после их синтеза в тканях……………………………
26
1.3.2. Апоптоз, другие виды разрушения клеток ……………………………………...
27
1.3.3. Реабсорбция белков почками …………………………………………………….
28
1.3.4. Исследование белковой композиции биологических жидкостей человека до
развития протеомики на основе масспектрометрии
……………………………
1.4. Начало эры протеомики (изобретение МАЛДИ). Методы и возможности
(чувствительность, производительность) протеомики на основе
масспектрометрии
……………………………………………………………………………….
1.5. Организация HUPO и современное состояние по выявлению белков крови и мочи
человека
…………………………………………………………………………………………..
1.6. Ценность мочи как биоматериала для клинических и физиологических
исследований
……………………………………………………………………………………...
1.7. Анализ мочи протеомными методами ………………………………………………...
29
33
35
36
37
1.8. Изучение протеома мочи, его применением в клинике ……………………………..
39
1.9. Феноменология изменений в организме человека при действии реальных и
моделируемых на Земле факторов космического полета ……………………………
1.9.1. Длительные космические полеты ………………………………………………..
49
1.9.2. Адаптивные механизмы в условиях «cухой» иммерсии ……………………….
57
1.9.3. Антиортостатическая гипокинезия (АНОГ) …………………………………….
61
1.9.4. Длительная изоляция в гермообъеме ……………………………………………
63
1.10. Характеристика возрастных изменений физиологических систем организма ……..
65
1.10.1. Морфо-функциональные признаки старения почечной ткани ………………..
49
69
3
2.
1.10.2. Характеристика процессов старения отдельных тканей ……………………….
72
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ……………………………………..
77
2.1. Материалы исследования ……………………………………………………………
77
2.2. Объекты исследования ………………………………………………………………………..
78
2.3. Модельные эксперименты ……………………………………………………………..
79
2.3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев ………………………...
79
2.3.2. 520-суточная изоляция в гермообъеме …………………………………………..
79
2.3.3. 105-суточная изоляция в гермообъеме …………………………………………..
80
2.3.4. 21-суточная антиортостатическая гипокинезия ………………………………...
80
2.3.5. 5-суточная «сухая» иммерсия ………………………………………………….
81
2.3.6. Длительные космические полеты ………………………………………………..
81
2.4. Циклограмма сбора проб мочи ………………………………………………………..
81
2.5. Методы исследования ………………………………………………………………….
83
2.5.1. Подготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу …
83
2.5.2. Прямое профилирование образцов ………………………………………………
84
2.5.3. Хромато-масс-спектрометрический анализ ……………………………………..
85
2.5.4. Биоинформационные методы …………………………………………………….
85
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ …………………………..
87
3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Возрастные изменения ….
87
3.2. Постоянно присутствующие белки в мочездоровых людей ………………………..
93
3.3. Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковый
состав мочи ……………………………………………………………………………...
3.3.1. Определение списка белков, непосредственно связанных с различным
солепотреблением внутри эксперимента ………………………………………..
3.3.2. Анализ влияния различного уровня солепотребления на белковый состав
мочи в 105-суточной изоляции с помошью программы oposSOM ……………
3.3.2.1. Метод кластеризации - самоорганизующиеся карты…………………….
107
3.3.2.2. Анализ результатов ………………………………………………………...
118
3.3.2.2.1. Анализ результатов начального периода исследования ………..
119
3.3.2.2.2. Анализ результатов промежуточного периода исследования…
130
3.3.2.2.3. Анализ результатов заключительного периода исследования….
135
3.4. Анализ протеома мочи в АНОГ ……………………………………………………….
140
3.4.1. Постоянно присутствующие белки ……………………………………………...
141
3.4.2. Транзиторно присутствующие белки ……………………………………………
142
3.4.3. Тканевая представленность белков ……………………………………………..
149
3.4.4. Процессы, связанные с регуляцией жидкостных объемов тела ……………….
154
110
115
115
4
3.4.5. Белки и процессы, связанные с функциями почек …………………………….
159
3.4.6. Белки и процессы, связанные с функциями ССС ………………………………
161
3.4.7. Белки и процессы, связанные с функциями костно-мышечной системой ……
163
3.5. Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы, водносолевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте с 5-суточной «сухой»
иммерсией ………………………………………………………………………………
3.5.1. Исследования водно-электролитного обмена в 5-суточной СИ ……………….
170
3.5.2. Исследование сердечно-сосудистой системы в 5-суточной СИ ……………….
177
3.5.3. Прямое профилирование сыворотки крови в 5-суточной СИ …………………
186
3.5.4. Белки, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе ……………..
190
3.5.5. Белки тканей почек и мочевыводящей системы ………………………………..
196
3.6. Выявление значимо представленных биологических процессов по составу
протеома мочи космонавтов на первые сутки после длительных космических
полетов ………………………………………………………………………………….
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ……………………………………………………………………………...
199
5. ВЫВОДЫ ……………………………………………………………………………………..
215
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………………………….
217
172
211
5
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ANP
- предсердный натрийуретический пептид.
А1М
- α1-микроглобулин
BNP
- мозговой натрийуретический пептид
BP
- биологические процессы
СО
- сердечный выброс
DBP
- диастолическое давление крови
1-DЕ
- одномерный электрофорез
2-DE
- двумерный электрофорез
EGF
- эпидермальный фактор роста.
ELISA
- иммуноферментный анализ
ENaC
- эпителиальные натриевые каналы
ESI
- электроспрейная ионизация
FGF
- фактор роста фибробластов
FT-ICR
- метод ионно-циклотронного резонанса c преобразованием Фурье
GO
- биологические процессы Gene Ontology
GSZ
- z-статистика перепредставленности набора генов.
HKUPP
- международный проект по изучению протеома мочи
HUPO
-международная научная организация «Протеом человека»
IPI-human
-международный индекс белка
LC
- жидкостная хроматография
LTQ-Orbitrap
- линейная ионная орбитальная ловушка
MALDI-TOF MS
- время-пролетная масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и
ионизацией с помощью матрицы
MF
- молекулярные функци
ММРs
- матриксные металлопротеиназы
MS/MS
- тандемная масс-спектрометрия
m/z
- отношение массы к заряду, Дальтон
NaCl
- хлорид натрия (соль)
NO
- оксид азота
6
PTMs
- посттрансляционные модификации белков
RBP
- ретинол-связывающий белок
SBP
- систолическое давление крови
SOM
- самоорганизующиеся карты
SV
- ударный объем
TIMPs
- тканевые металлопротеиназы
TPR
-общее периферическое сопротивление
VEGF
- рецепторы фактора роста эндотелия сосудов
АГ
- артериальная гипертензия
АД
- артериальное давление
АДГ
-антидиуретический гормон
АНОГ
- антиортостатическая гипокинезия
АПФ
-ангиотензинпревращающий фермент
АТФ
- аденозинтрифосфат
АФК
- активные формы кислорода
ВКМ
- внеклеточный матрикс
ВОЗ
- Всемирная Организация Здравоохранения
ВП
- восстановительный период
ВЭЖХ
- высокоэффективная жидкостная хроматография
ГАГ
- гликозаминогликаны
ГЛЖ
- гипертрофия левого желудочка
ГТФ
- гуанозинтрифосфат
ДНК
- дезоксирибонуклеиновая кислота
КП
- космический полет
ККС
- калликреин–кининовая система
ЛГ
- лютеинизирующий гормон
МВ
- молекулярный вес
МКС
- Международная космическая станция
ММСК
- мезенхимные стромальные клетки
ММП
- металлопротеиназы
НЭК
- наземный экспериментальный комплекс
ОАВ
- осмотически активные вещества
7
ОДНТ
- отрицательное давление на нижнюю половину тела
ОЦП
- объем циркулирующей плазмы
ПК
- проксимальный каналец нефрона
РААС
- ренин-ангиотензин-альдостероновая система
РНК
- рибонуклеиновая кислота.
мРНК
- матричная рибонуклеиновая кислота
РФ
- Российская Федерация
СИ
- «сухая» иммерсия
СКФ
- скорость клубочковой фильтрации
СНС
- симпатическая нервная система
ССЗ
- сердечно-сосудистые заболевания
ССС
- сердечно-сосудистая система
ЧСС
- частота сердечных сокращений
ЭКГ
- электрокардиография
8
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В настоящее время одним из интенсивно развивающихся направлений системной
биологии является протеомика, изучающая белковый состав клеток, тканей, биологических
жидкостей,
организмов
с
использованием
высокопроизводительных
методов
масс-
спектрометрии [Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Mischak
H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2013]. Протеомика
появилась в результате постепенного развития и усложнения классических методов
исследования белков, начиная с гравиметрических и фотометрических до диск-электрофореза,
градиентного и двумерного электрофореза. В настоящее время достаточно уверенно поддаются
идентификации до 15,5 тысяч белков человека [Court M. et al., 2011; Marimuthu A. et al., 2011;
Bensimon A., Heck A.J.R., Aebersold R., 2012]. Известно, что все функции в организме
осуществляют белки, что справедливо и для адаптации, которая осуществляется путем
изменения спектра и количества работающих белков, которые формируют мультибелковые
комплексы, с одной стороны, и сложные функциональные и динамичные сети, с другой
[Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., 2009; Naylor S., Chen J.Y., 2010; Bose B.,
2013]. Организация в функциональные модули отражает сложность и разнообразие протеома на
субклеточном, клеточном и органном уровне. Белки, синтезируемые в различных типах клеток,
имеют значительное представительство в биологических жидкостях организма человека, таких
как кровь, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха [Hiemstra T.F. et al., 2011; Metzger J. et
al., 2013]. Состав этих сред может дать представление о механизмах адаптационных перестроек
функций, что имеет громадное фундаментальное значение для физиологии, поскольку
вскрывает пути приспособления сложной системы, которой является живой организм,
поддерживающий постоянство состава внутренней среды, и осуществляющий активный поиск
наиболее оптимального и устойчивого состояния, к необычному и никогда не встречавшемуся в
эволюции биосферы Земли фактору - невесомости [Нефедов В.П., Ясайтис А.А., Новосельцев
В.Н., 1991; Наточин Ю.В., 2008].
Экстремальные условия представляют собой один из немногих способов, позволяющих
вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека, для распознавания механизмов
поддержания постоянства состава внутренней среды и сохранения резервов здоровья,
адаптивного потенциала организма [Балаховский И.С., Наточин Ю.В., 1973; Григорьев А.И.,
9
Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Носков В.Б., 2013; Leach Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin
Yu.V., 1998; Norsk P. et al., 2000; Drummer C. et al., 2000; Kotovskaya A.R., Fomina G.A., 2013].
Список методов (условий), этически дозволенных и доступных для воздействий на здорового
человека, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короткий и включает в себя
физические нагрузки, использование фармпрепаратов, манипуляции с питанием [Ларина И.М.,
Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Edwards L.M. et al., 2012; Titze J. et al.,
2014] или директивные изменения в солепотреблении [Titze J. et al., 2002], функциональные
нагрузочные пробы [Носков В.Б., 2013], экологические исследования, включая воздействие
экстремальныx температур, гипербарии и гипоксии и, наконец, космический полет [Газенко
О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998;
Оганов В.Б., 2003; Корнилова Л.Н., Алехина М.И., Темникова В.В. с соавт., 2006; Фомина Г.А.,
Котовская А.Р., 2008; Kozlovskaya I.B. et al., 1988; Leach-Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin
Y.V. 1998; Oganov V.S. et al., 2010].
В связи с современными аналитическими возможностями и фундаментальными научными
запросами гравитационной физиологии возникает интерес к изучению белкового состава мочи,
поскольку моча, как одна из биологических жидкостей организма человека, представляет собой
привлекательный материал для использования в клинической диагностике и для теоретических
исследований [Ларина И.М, с соавт. 2012; Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou
A., 2011; Metzger J. et al., 2012]. Возможность многократного, самостоятельного (без помощи
медперсонала) и не обременительного, неинвазивного сбора представительного для протеомики
биологического материала, каковым является моча, принципиально важно в космической
физиологии. Недостатками мочи, как источника данных о белковом составе внеклеточной
жидкости, является низкая концентрация в ней белков, что выдвигает дополнительные
требования к чувствительности аналитических методов [Николаев Е.Н., 2007; Nagaraj N. et al.,
2012], высокая вариабельность белкового состава [Образцова О.А., 2013], обусловленная
функциями почки по поддержанию водно-электролитного гомеостаза, а также предполагаемая
трудность интерпретации результатов, полученных при исследовании данного биоматериала от
здорового человека.
Протеомика достигла наиболее впечатляющих успехов в плане практического применения
ее достижений именно в области исследований протеома мочи [He J.C. et al., 2012]. Проект
Human Kidney и Urine Proteome Project (HKUPP) (http://eurokup.org) был инициирован в 2005
году в рамках HUPO для содействия протеомным исследованиям в области нефрологии,
понимания функции и патогенеза заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития
теоретических исследованиях в этой области [Vlahou A. et al., 2009; He J.C. et al. 2012; Zoidakis
J. et al., 2012].
10
Факторы космического полета вызывают адаптивные изменения во всех физиологических
системах организма человека [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1990; Баевский Р.М. и
др., 2000; Оганов В.Б., 2003; Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Котовская
А.Р. 2008; Носков В.Б., 2013]. Это отражается на качественном и количественном составе
белков, которые участвуют в адаптивных реакциях. Очевидно, что белки, изменение уровня
которых наблюдается в экстремальных условиях, не могут рассматриваться как потенциальные
биомаркеры развития заболеваний, поскольку они участвуют в естественном молекулярном
ответе организма в процессе адаптации к изменению условий жизнедеятельности [Пахарукова
Н.А., 2010; Трифонова О.П., 2011; Киреев К.С., 2013; Образцова О.А., 2013; Mischak H. et al.,
2011; Metzger J. et al., 2012].
Анализ белков с использованием различных биохимических методов, выполнявшийся
ранее в космической биологии и медицине не давал возможности прямого сравнения
результатов в виду различной чувствительности и специфичности методов. Список из
исследованных белков в крови конкретного космонавта редко достигал 50 параметров [Попова
И.А. с соавт., 1988; Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999; Ларина И.М., 2003; Millet C. et al.,
2001]. Это является существенным ограничением при изучении механизмов изменения
функций, поскольку большинство функций организма человека осуществляются значительно
бòльшим числом белков. В свою очередь, это не позволяло получить и проанализировать
целостную картину происходящих изменений. Современные протеомные методы дают
возможность определять сотни белков за один хромато-масс-спектрометрический анализ с
высокой точностью, специфичностью и чувствительностью [Nagaraj N. et al., 2012; RodríguezSuárez E. et al., 2014], что позволяет получить данные, пригодные для непосредственного
сопоставления друг с другом и создать картину изменений композиции белков при воздействии
факторов космического полета. Для понимания того, как формируются физиологические
реакции
на
различные
воздействия,
необходимо
перебросить
концептуальные
и
функциональные мостики от генетики к белкам, от белков к клеткам, далее к органам, и
системам в организме [Hester R.L., Iliescu R., Summers R., Coleman T.G., 2011].
Таким образом, значение новых методов современной системной биологии имеет
теоретический и прикладной аспекты, так как, основываясь на понимании физиологической
адаптации здорового человека в экстремальных условиях, дают возможность разработать
эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий
космического полета на организм человека.
Цель и задачи исследования
11
Целью данной работы являлась характеристика протеома мочи здорового человека в
норме и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета для выявления
и валидации биомаркеров адаптивных процессов.
В ходе работы решались следующие задачи:
- исследовать протеом мочи здорового человека (мужчин в возрасте от 19 до 54 лет);
- изучить возрастные особенности протеома мочи здоровых добровольцев;
- идентифицировать постоянную и вариабельную части протеома мочи здорового человека в
нормальных условиях жизнедеятельности;
- изучить вариабельность белковой композиции мочи в зависимости от уровня
солепотребления в диапазоне нормы потребления соли в РФ;
- изучить характер адаптивных перестроек протеома мочи при воздействии различных
факторов космического полета;
- исследовать характер адаптивных перестроек протеома мочи в острый период
реадаптации после длительных космических полетов;
- адаптировать современные биоинформационные технологии для построения сетей
молекулярных взаимодействий, на основании данных по протеому мочи здорового
человека.
Научная новизна
С помощью высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-массспектрометрии, впервые охарактеризован протеом мочи здоровых добровольцев в возрасте от
19 до 54 лет, отобранных специальной врачебно-экспертной комиссией. Анализ протеома мочи
позволил изучить и выявить возрастные особенности здоровых добровольцев.
Впервые показано, что белки, которые являются постоянными в протеоме мочи
здорового человека, при его исследовании в течение длительного промежутка времени (530
суток), по своим молекулярным функциям и биологическим процессам, в которых они
участвуют, имеют низкую функциональную связанность между собой.
Впервые показано, что протеом мочи может служить индикатором различных
физиологических состояний организма здорового человека. В проведенных исследованиях
проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность белкового состава мочи
здорового человека.
Впервые установлено, что состояние многих физиологических систем здоровых молодых
мужчин, изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормального
суточного потребления соли в РФ (4-12г/сут.).
12
Анализ белковой композиции мочи впервые позволил выявить белки, принимающие
участие как в период острой адаптации к антиортостатической гипокинезии, а также в
восстановительный период после завершения эксперимента.
Впервые идентифицированы белки, которые демонстрируют ассоциативную связь с
функциями выделительной системы и чувствительностью к иммерсионному воздействию, что
подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные
периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.
Биоинформационными методами анализа, а также методом ручной аннотации белков и
биологических процессов, впервые удалось связать хорошо известные и документированные
ранее факты и физиологические особенности состояния космонавтов на первые сутки после
завершения полетов, с выявленными в моче белками, участниками различных процессов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Практическая значимость работы заключается в идентификации белков, определении
тканей, процессов, характеризующих протеом мочи здорового человека. Характерные
изменения протеома мочи, обусловленные возрастными особенностями метаболизма и его
регуляции, следует учитывать в клинически-ориентированных исследованиях протеома мочи, а
также при поиске фармакологических мишеней для терапии.
Практическая значимость работы заключается в выявлении белков, которые могут
представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме
здорового человека при действии факторов космического полета, а также использоваться как
стандарты при определении концентрации других белков в моче.
Полученные данные об изменениях протеома мочи в контролируемых условиях
существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния
различного уровня приема соли (6–12 г/сутки) на организм человека.
Результаты исследования показателей, характеризующих протеомную композицию мочи
при действии факторов космического полета, дают более полное представление о механизмах
адаптации физиологических систем организма человека в острый период адаптации к земной
гравитации.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1.
Протеом мочи здорового человека, при изучении его высокотехнологическими
методами на основе хромато-масс-спектрометрии, отличается вариабельностью,
связанной как с возрастными особенностями метаболизма, так и с уровнем
двигательной активности и характером рациона питания.
13
2.
Анализ протеома мочи здорового человека в условиях действия на организм различных
факторов выявляет сотни белков-участников адаптивных процессов, большинство из
которых в этой связи ранее не изучалось.
3.
Биоинформационные методы анализа позволяют верифицировать белковый состав
образцов мочи через известные биохимические процессы и физиологические
особенности состояния человека, как при наземном моделировании эффектов, так и при
исследовании космонавтов после завершения полетов.
4.
Данные протеома мочи, наряду с построением и анализом молекулярных сетей с
участием выявляемых белков, предоставляют гипотезы о новых механизмах адаптации
организма здорового человека.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены и обсуждены на следующих
конференциях: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в
рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы», 25-27 ноября 2009 г., Москва; French-Russian-Belorussian Conference: Neurovascular
impairment induced byen vironmenta lconditions: molecular, cellular and functionalapproach. –
French-Russianconference, AngersUniversity, France, 10 – 14 March 2010; 31stAnnual International
Gravitation PhysiologyMeeting: Trieste, Italy, 13 – 18 June, 2010; IV Всероссийской конференциишколе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения»,
Звенигород, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», 8 – 12 августа 2011,
Петрозаводск; 2-ой Международной научно-практической конференции "Постгеномные
методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика.
Биоинформатика", Новосибирск, 2011; 10th HUPO World congress, Geneva, Switzerland,
September 4 – 7, 2011; Космическом форуме 2011, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А.
Гагарина, 18 – 19 октября в Звездном городке; Международном симпозиуме, посвященном
итогам выполнения проекта «МАРС-500», Москва, 23-25 апреля 2012; 33th Annual International
Society for Gravitational Physiology Meeting, «Life in Space for Life on Earth», Aberdeen - United
Kingdom, 18-22 June 2012; Proteomic Forum Berlin, Germany, 17 – 21 March, 201311th Annual
World Congress HUPO, Boston, Massachusetts, USA, September 9-13, 2012; в Докладах III
международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в
биологии, лабораторной и клинической медицине», в Казани, 22-24 ноября 2012; 8th International
Conference on «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» BGRS/SB2012, Novosibirsk, Russia June 25-29, 2012; 12th Annual World Congress HUPO, Yokohama, Japan,
14
September 14-19, 2013; «Human in space symposium» Cologne, Germany, July, 2013; FrenchRussian Conference «Head out water immersion symposium & Baroreflex and heart rate variability»
Angers, France 28-30 April, 2014; The Ninth International Conference on Bioinformatics оf Genjme
Regulation and Structure/Systems Biology, Novosibirsk, Russia, June 23-28, 2014; 13th Human
Proteome Organization World Congress, October 5-8, Madrid, 2014.
По теме диссертации опубликовано 34 печатных работ, в том числе, 22 статьи в журналах
из перечня Высшей Аттестационной Комиссии при Министерстве образования и науки
Российской Федерации.
Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология»
Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 23.12. 2014 г.
Связь работы с научными программами
Работа выполнена при поддержке программ ФФМ и Президиума РАН и Роскосмоса, а
также грантов президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» и РФФИ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 303 страницах и состоит из списка сокращений, введения,
обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 6 глав результатов
исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 325
отечественных и 686 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и
20 рисунками, 3 графиками, 1 схемой.
15
1.1.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Строение, биосинтез и функции белков в организме человека
Понимание биохимических процессов, которые составляют жизнь, требует не только
знания генетической «инструкции», закодированной в геноме, но и белков, метаболических
субстратов, участвующих в этих процессах [Angel Т.Е. et al., 2012]. В последние годы выявлено
множество новых аспектов функционирования белков, как регуляторов биологических
процессов – не только обмена веществ, роста и развития, но и как участников системы
коммуникаций, которые объединяют биологические молекулы, органеллы, клетки, ткани,
органы в единую управляемую систему [Степанов В.М., 2002; Hester R.L., Iliescu R., Summers
R., Coleman T.G., 2011].
Изучение первичной структуры белка, полученной из генома, явно недостаточно, чтобы
объяснить различие их биологических функций. Считается, что человеческий геном, включает
в себя 27 000 генов, общее количество белков в организме человека оценивается более, чем в
миллион, что связано с альтернативным сплайсингом матричной рибонуклеиновой кислоты
(мРНК). Изоформы могут иметь различные биологические функции [Stastna M., Van Eyk J.E.,
2012]. Видовая и индивидуальная специфичность набора белков в конкретном организме
определяет особенности его строения и функционирования [Северин Е.С., 2013]. За счет
внутримолекулярных взаимодействий белки образуют определенную пространственную
структуру, или «конформацию белков» [Calamini B., Morimoto R.I., 2012]. Различают 4 уровня
структурной организации белков [Zhou X., Wang E., 2013]. Двадцать L-аминокислот-мономеров
в ходе трансляции встраиваются в полипептидную цепь, и играют ключевую роль в регуляции
синтеза белка [Chan T.M. et al., 2012; Wang W. et al., 2013]. Линейную последовательность
аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют первичной структурой белка [Paris
G., Ramseyer C., Enescu M., 2014]. В результате реакции посттрансляционной модификации
некоторые из них превращаются в другие аминокислотные остатки, обеспечивая важную роль в
широком диапазоне биологических процессов [Mann M., Jensen O.N., 2003; Kakizawa S., 2013].
Большинство из индивидуальных белков организма человека имеет важное общебиологическое
и медицинское значение [Jain A.P., Pundir S., Sharma A., 2013; Slutzki M. et al., 2013]. Многие
генетические болезни являются результатом нарушения аминокислотной последовательности
белков [Barrowman J. et al., 2012]. Вторичная структура белка - пространственная, образуется в
результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав
пептидного остова [Lee C.K., Yeo K.J., Hwang E., Cheong H.K., 2013]. Пептидные цепи могут
приобретать регулярные структуры двух типов: L – спираль и В-структуру. L-спиральная
16
структура – это наиболее устойчивая конформация пептидного остова, имеющая минимум
свободной энергии [Boersma M.D. et al., 2012]. B-структура формируется за счет образования
множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной
полипептидной цепи [Yamamoto A. et al., 2000]. Как L – спираль и В-структура встречаются в
глобулярных и фибриллярных белках [Tu X., Palczewski K., 2012]. Третичная структура белка трехмерная пространственная структура, образуется за счет взаимодействий между радикалами
аминокислот, расположенными на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной
цепи [Ohue M. et al., 2013]. Третичную структуру некоторых белков стабилизируют
дисульфидные связи [Wei W. et al., 2012]. Гидрофобные радикалы аминокислот стремятся к
объединению внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков, между ними
возникают гидрофобные взаимодействия, а также силы Ванн дер Ваальса между близко
прилегающими друг к другу связями, формируя гидрофобное ядро [Priyakumar U.D., 2012;
Vugmeyster L., Do T., Ostrovsky D., Fu R., 2014]. Все гидрофильные группы радикалов
аминокислот, оказавшиеся внутри гидрофобного ядра, взаимодействуют друг с другом с
помощью ионных и водородных связей [Seddon A.M., Curnow P., Booth P.J., 2004]. Белки
мембран имеют обратное устройство: гидрофильные радикалы аминокислот расположены
внутри белка, а гидрофобные аминокислоты локализованы на поверхности молекулы и
контактируют с неполярным окружением [Smith S.M., 2011]. Радикалы аминокислот в каждом
случае занимают наиболее выгодное биоэнергетическое положение. Конформация белка может
меняться при изменении химической и физической среды, а также при взаимодействии белка с
другими молекулами [Tan C., Li W., Wang W., 2013]. Потеря нативной конформации
сопровождается
утратой
специфической
функции
белков,
денатурацией.
Плотная
пространственная структура нативного белка при денатурации резко увеличивается в размерах
и становится легко доступной для расщепления пептидных связей протеолитическими
ферментами [Bhuyan A.K., 2010]. Существуют белки, состоящие из двух и более
полипептидных цепей, после формирования трехмерной структуры каждой. Они объединяются
с помощью взаимодействий, которые участвовали в образовании третичной структуры.
Количество
и
взаиморасположение
полипептидных
цепей
в
пространстве
называют
четвертичной структурой белков [Veenhoff L.M., Heuberger E.H., Poolman B., 2002]. Процесс
сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру получил
название «фолдинг белков», это самопроизвольный процесс, при котором белок стремится
принять в данных условиях конформацию с наименьшей свободной энергией [Sekhar A., Lam
H.N., Cavagnero S., 2012]. Изменение условий окружающей среды или изменений первичной
структуры могут привести к изменению его конформации и функции [Fan J., Pavletich N.P.,
2012].
Для
многих
белков,
имеющих
высокую
молекулярную
массу
и
сложную
17
пространственную структуру, фолдинг (процесс спонтанного сворачивания полипептидной
цепи в уникальную нативную пространственную структуру) протекает при участии
специальной группы белков, шаперонов [Zagouri F. et al., 2012]. Фолдинг протекает в цистернах
эндоплазматического ретикулума, некоторые растворимые в воде белки могут агрегировать,
образуя в клетках фибриллярные отложения, амилоид, при этом нарушается структура и
функции клеток, наблюдаются дегенеративные изменения [Kříž Z., Klusák J., Krištofíková Z.,
Koča J., 2013].
До настоящего времени не существует единой и стройной классификации, учитывающей
различные параметры белков, в основе, как правило, лежит один признак. Белки можно
квалифицировать: по форме молекул (глобулярные или фибриллярные); по химическому
строению
(наличие
или
отсутствие
небелковой
части);
по
молекулярной
массе
(низкомолекулярные, высокомолекулярные); по выполняемым функциям (транспортные,
защитные, структурные и т.д.); по локализации в клетке (ядерные, цитоплазменные,
лизосомальные); по локазизации в организме (белки крови, печени, сердца); белки
синтезирующие с постоянной скоростью, белки, синтез которых может усиливаться при
воздействии факторов среды; по продолжительности функционирования в клетке; по схожим
участкам
первичной
структуры
и
родственным
функциям.
Многие
белки,
кроме
полипептидных цепей, содержат в составе небелковую часть, присоединенную к белку слабыми
или ковалентными связями. Как правило, небелковая часть представлена ионами металлов,
органическими молекулами с низкой или высокой молекулярной массой, такие белки принято
называют сложными [Weston L.A., Bauer K.M., Hummon A.B., 2013]. Простетической группой
могут быть веществами различной природы. Белки, соединенные с гемом - гемопротеины
[Venanzi M., Cianfanelli S., Palleschi A., 2013], соединенные с остатками фосфорной кислоты фосфопротеины [Dalton L.E. et al., 2012], с углеводными остатками - гликопротеины [Krainer
F.W. et al., 2013], функционирующие в комплексе с липидами - липопротеинами, с металлами металлопротеинами [King J.D. et al., 2013]. По признаку сходства выполняемых белками
функций их можно разделить на большие группы. Ферменты - специализированные белки,
ускоряющие течение химических реакций, играют важнейшую роль во всех процессах
жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма [Кришталик Л.И., 2012;
Ernst A. et al., 2013]. Благодаря ферментам в клетке скорости химических реакций возрастают в
миллионы раз. К 2013 году было описано более 5 000 разных ферментов. Различным физикохимическим аспектам ферментативных процессов посвящены многие обзоры [Chapple S.J.,
Cheng X., Mann G.E., 2013; Ergin V., Erdogan M., Karasu C., Menevse A., 2013; Kakizawa S.,
2013]. Так, трипсин разрушает в белках пептидные связи, образованные карбоксильной группой
основных аминокислот - аргинина или лизина [Buczek O., Krowarsch D., Otlewski J., 2002]. К
18
регуляторным белкам относят большую группу белковых гормонов, участвующих в
поддержании
постоянства
внутренней
среды
организма,
которые
воздействуют
на
специфические клетки-мишени. Сигнальные молекулы (гормоны, медиаторы) действуют на
внутриклеточные процессы через взаимодействие со специфическими белками - рецепторами
[Rosenbaum D.M. et al., 2011]. Рецепторный белок - это тот незаменимый винтик, без которого
не могут работать сложнейшие сигнальные системы нашего организма. Например, если в
палочках
сетчатки
содержится
недостаточно
родопсина,
светочувствительность
глаза
снижается: ухудшается зрение [Sammons J.D., Gross A.K., 2013]. Многие белки крови участвуют
в переносе лигандов из одного органа к другому, так, альбумин переносит жирные кислоты и
билирубин [Ha C.E., Bhagavan N.V., 2013], а гемоглобин эритроцитов участвует в переносе
кислородаот легких к тканям [Tripette J. et al., 2009]. Транспортные белки участвуют также в
переносе гидрофильных веществ через гидрофобные мембраны [Hicke L., Dunn R., 2003]. Один
из
наиболее
изученных
белков,
осуществляющих
активный
транспорт
-
Na+/K+-
аденозинтрифосфатаза [Edwards I.J., еt al., 2013]. Некоторые белки, расположенные
определенным образом в тканях придают им форму, создают опору, определяют механические
свойства данной ткани. Например, главным компонентом хрящей и сухожилий является
фибриллярный белок коллаген, имеющий высокую прочность [Chen P., Cescon M., Megighian
A., BonaldoP., 2014]. Структурный белок эластин обеспечивает определенным тканям свойство
растягиваться во всех направлениях [Uitto J., 2008]. Некоторые белки (иммуноглобулины)
обладают способностью узнавать и связывать чужеродные молекулы, вирусные частицы и
бактерии, в результате чего происходит их нейтрализация [Schroeder H.W.Jr., Cavacini L., 2010].
Защитными свойствами обладают белки свертывающей системы крови, к примеру, фибриноген
и тромбин [van Ryn J. et al., 2010]. Некоторые белки наделяют клетку способностью либо
сокращаться, либо передвигаться. К таким белкам относятся актин и миозин - фибрилярные
белки, участвующие в сокращении скелетных мышц, тубулин, из которого построены
микротрубочки [Schappi J.M., Krbanjevic A., Rasenick M.M., 2013].
Белки, имеющие гомологичные участки полипептидной цепи, сходную конформацию и
родственные функции, выделяют в семейство родственных белков. К семейству родственных
белков относят сериновые протеазы, мишенью которых являются специфические пептидные
связи в белках; для них характерно наличие в активном центре остатков Сер 195, Гис57, Асп
102 [Доброгорская Я.И., Немухин А.В., 2003], а так же высокая гомология их пространственных
структур.
Так,
пищеварительные
сериновые
протеазы
участвуют
в
переваривании
денатурированных пищевых белков, к ним относят трипсин, химотрипсин [Замолодчикова Т.С.,
2013]. Сериновые протеазы участвуют в активации каскада белков свертывания крови, белков
системы комплемента, образования белковых гормонов [Diaz J. et al., 2012; Perry A.J. et al.,
19
2013]. В работе иммунной системы огромную роль играют белки, относящиеся к
суперсимейству иммуноглобулинов, которое включает в себя: семейство иммуноглобулинов,
семейство Т-клеточных антигенраспознающих рецепторов и белки главного комплекса
гистосовместимости 1 и 2 классов, а также семейство адгезивных белков. Основным критерием
включения белков считается доменная организация, достоверная гомология аминокислотных
последовательностей и пространственных структур отдельных доменов [Yap E.H, Yu X.M. et
al., 2013; Rosche T., Almo S., Fiser A., 2014]. Изофункциональные белки - это семейство белков,
выполняющих почти одинаковую или близкую функцию, но небольшие особенности строения
и функционирования некоторых членов этого семейства могут иметь важное физиологическое
значение, к примеру, изоформы гемоглобина [Damsgaard C., Storz J.F., Hoffmann F.G., Fago A.,
2013]. К изобелкам относят множество изоформ структурного белка коллагена [Cutrona M.B. et
al., 2013].
Фонд свободных аминокислот организма – только 35 г., большая часть аминокислот
входит в состав белков, доля которых в массе всех тканей организма человека нормального
телосложения составляет примерно 15 кг. Специальной формы депонирования аминокислот
нет, их резервом служат все функциональные и структурные белки тканей, преимущественно
белки мышц, поскольку мышечная ткань является самой крупной тканью организма [Preiss L. et
al., 2013]. Основным источником аминокислот организма служат белки пищи. В сутки, при
белковом голодании, в организме расходуется 25 г собственных белков тканей, минимальное
количество белка в пище, необходимое для поддержания азотистого равновесия - 30-50 г/сутки.
При средней физической нагрузке взрослый человек должен получать 100-120 грамм белков в
сутки. Безбелковое питание (продолжительное) вызывает серьезные нарушения обмена и
неизбежно заканчивается гибелью организма. Поскольку, человек в ходе эволюции утратил
способность синтезировать de novo почти половину из 20 аминокислот, входящих в состав его
собственных белков, те аминокислоты, синтез которых сложен и неэкономичен для организма,
выгоднее получать с пищей, называются незаменимые аминокислоты. К ним относятся
фенилаланин, метионин, треонин, триптофан, валин, лизин, лейцин, изолейцин [ChurchwardVenne T.A. et al., 2012]. Аргинин и гистидин у взрослого человека образуются в достаточных
количествах [Зилва Дж.Ф., Пэннелл П.Р., Березов Т.Т., 1988], их называют частично
заменимыми. Тирозин и цистеин - условно заменимые, так как для их синтеза необходимы
незаменимые аминокислоты; так, тирозин синтезируется из фенилаланина [Daubner S.C., Le T.,
Wang S., 2011], а для образования цистеина необходим атом серы метионина [Fu J. et al., 2014].
Остальные аминокислоты легко синтезируются в клетках и называются заменимыми. К ним
относят глицин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутаминовую кислоту, глутамин, серин,
пролин, аланин [Churchward-Venne T.A., Burd N.A., Phillips S.M., 2012].
20
1.2. Обмен белков в организме здорового человека
1.2.1. Поступление извне
При средней физической нагрузке взрослый человека должен потреблять 100-120 г белков
в сутки [Millward D.J., 2012]. Для поддержания азотистого равновесия достаточно употреблять
30-50 г белков в сутки [Wolfe R.R., Miller S.L., Miller K.B., 2008], однако такое количество не
обеспечивает сохранение работоспособности и здоровья человека. В организме распад белков
протекает непрерывно и зависит от характера питания. Отрицательный азотистый баланс
отмечается при белковом голодании, а также когда в организм не поступают отдельные
необходимые для синтеза белков аминокислоты [Duggleby S.L., Waterlow J.C., 2005].
Минимальные затраты белка в условиях белкового голодания наблюдаются при питании
углеводами; при этом выделение азота может быть в 3—3,5 раза меньше, чем при полном
голодании [Ten Have G.A., Engelen M.P., Luiking Y.C., Deutz N.E., 2007]. Белки при
значительном поступлении с пищей не депонируются, часть их расходуется на пластические
цели, но большая часть - на энергетические [Phillips S.M., 2013]. Переваривание поступивших с
пищей белков начинается в ротовой полости с помощью слюны, в которой содержится ряд
протеолитических ферментов, расщепляющих белки - гидролаз, оксиредуктаз, трансфераз,
протеиназ, пептидаз, кислой и щелочной фосфатазы [Kennedy S. et al., 1998]. При
переваривании белка в желудке стимулируется выделение гистаминов [Chu S., Schubert M.L.,
2013] и гастрина [Kovac S., Anderson G.J., Baldwin G.S., 2011], вызывающих секрецию соляной
кислоты и профермента пепсиногена, являющегося неактивной формой пепсина [Luo H.N., Kim
H.S., Agarwal M., Teraoka I., 2013]. Пепсин в первую очередь гидролизует пептидные связи в
белках,
образованные
ароматическими
аминокислотами,
и
несколько
медленнее
-
дикарбоновыми. В двенадцатиперстной кишке, низкое значение рH вызывает выделение
секретина, стимулирующего выделение из поджелудочной железы в тонкий кишечник
панкреатического сока, нейтрализующего соляную кислоту [Ng S.S., Yung W.H., Chow B.K.,
2002]. Поступление пептидов в тонкий кишечник вызывает секрецию холецистокинина,
который также стимулирует выделение панкреатических ферментов [Little T.J., Horowitz M.,
Feinle-Bisset C., 2005]. Это - проферменты ряда протеаз: трипсиногена, химотрипсиногена,
проэластаз, прокарбоксипептидазы А и В. В кишечнике они превращаются в активные
ферменты: трипсин [Sah R.P., Dawra R.K., Saluja A.K., 2013], химотрипсин [Szabó A., Sahin-Tóth
M., 2012], эластазу и карбоксипептидазы А и В [Andersson B., Pendse M.L., Andersson R., 2010].
В результате последовательного действия всех пищеварительных протеаз большинство
пищевых белков расщепляется до свободных аминокислот, и они подвергаются быстрому
21
всасыванию в кишечнике через клетки полярного эпителия щеточной каемки. Максимальная
концентрация аминокислот в крови достигается через 30-50 минут после приема белковой
пищи. Всасывание L-аминокислот – это активный процесс, требующий затрат энергии [Громова
Л.В., Груздков А.А. 1993]. Перенос аминокислот через эпителий щеточной каемки
осуществляется с различной скоростью целым рядом переносчиков, многие из которых
действуют при участии Na+-зависимых механизмов [García-Giménez E., Alcaraz A., Aguilella
V.M. et al., 2012]. Одна из специфических транспортных систем для некоторых нейтральных
аминокислот функционирует в кишечнике, почках, и, возможно, в мозге, это система - γ
глутамильного цикла [Campesi I. et al., 2013].
1.2.2. Распад белков в организме
В основе существования организма как сложной системы лежит непрерывный обмен со
средой пластическими и энергетическими ресурсами, а также - информацией. Отражением
первых двух видов обмена на уровне биохимии служит взаимосвязь двух динамических
процессов: катаболизма и анаболизма веществ. В организме постоянно происходит распад и
синтез белковых молекул – расщепление белков до аминокислот (катаболизм) и построение
новых белковых молекул (анаболизм). На аминокислоты в сутки распадается около 400 грамм
белков, примерно такое же количество синтезируется. Катаболизм большинства аминокислот
начинается с отщепления L-аминогруппы в результате двух типов реакций: трансаминирования
и дезаминирования [Felux A.K. et al., 2013]. Путем трансаминирования - реакции переноса Lаминогруппы с аминокислоты на L-кетокислоту - образуется новая кетокислота и новая
аминокислота [Zhou Y. et al., 2010]. В клетках человека выявлено более 10 аминотрансфераз,
локализующихся как в цитоплазме, так и в митохондриях, которые отличаются по субстратной
специфичности [Han Q. et al., 2009]. В трансаминирование вступают почти все аминокислоты,
за исключением лизина, треонина и пролина, эти реакции обратимы и играют большую роль в
обмене аминокислот [Crugeiras J., Rios A., Riveiros E., Richard J.P., 2011]. Трасаминирование
является и первой стадией дезаминирования большинства аминокислот, т.е. служит начальным
этапом их катаболизма. В результате реакции дезаминирования выделяется L –кетокислота и
молекула аммиака [Cortellino S. et al., 2011], часть которого образуется в результате
бактериального разложения пищевых белков [Kim E., Coelho D., Blachier F., 2013].
Наиболее активными продуцентами аммиака в кровь являются органы с высоким обменом
аминокислот и биогенных аминов - нервная ткань, печень, кишечник, мышцы [Holecek M. et al.,
2011]. Основной реакцией связывания аммиака, протекающей во всех тканях организма,
является синтез глутамина под действием глутаминсинтетазы, локализованной в митохондриях
[Hu W.W. et al., 2012]. Глутамин - основной донор азота в организме, он используется для
22
синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и других соединений; его тканями поставщиками являются мышцы, мозг и печень. С током крови глутамин транспортируется в
кишечник и почки. В кишечнике происходит гидролиз глутамата, затем трансаминирование с
пируватом.
L-аминогруппа
глутаминовой
кислоты
переносится
в
составе
аланина,
поступающего из кишечника в кровь воротной вены и поглощается печенью [van de Poll M.C. et
al., 2007]. Около 5% аммиака удаляется в составе фекалий, небольшая часть через воротную
вену попадает в печень, остальные 90% выводятся почками, в которых также происходит
гидролиз глутамина, который является одним из механизмов регуляции кислотно-щелочного
равновесия организме и сохранения важнейших катионов для поддержания осмотического
давления [Dass P.D., Martin D., 1990]. Глутаминаза почек значительно индуцируется при
ацидозе [Weiner I.D., Verlander J.W., 2011]. В почках образуется и ими выводится около 0,5
грамм солей аммония в сутки. Из мышц и кишечника избыток аммиака выводится в виде
аланина в печень, где подвергается непрямому дезаминированию, аммиак при этом
обезвреживается, а пируват включается в глюконеогенез [Moriwaki H. et al., 2004]. Таким
образом, в печени аккумулируется большое количество аммиака [Holecek M., Kovarik M., 2013],
что поддерживает низкое содержание его в крови [Barsotti R.J., 2001]. В орнитиновом цикле
[Tamai M. et al., 2013] в печени синтезируется мочевина, которая является основным конечным
продуктом азотистого обмена. Экскреция мочевины в норме составляет 25 г/сутки, увеличение
скорости
синтеза
происходит
при
длительной
физической
работе,
голодании
или
патологических состояниях.
1.2.3. Выведение продуктов белкового обмена
Аминокислоты,
поступающие
в
ток
крови
в
результате
гидролиза
белков
в
пищеварительном тракте, а также аминокислоты, образованные в процессе расщепления
клеточных белков, образуют так называемый аминокислотный пул, который может
использоваться всеми клеточными структурами для белкового синтеза [Veronesi M. et al., 2013].
Наибольшее количество свободных аминокислот поступает из мышц, мозга и кишечника,
причем до 50% - это аланин и глутамин [Stobart J.L., Anderson C.M., 2013]. Почки - основной
источник серина и частично аланина, которые попадают в нее из плазмы печенью [Longenecker
K.L. et al., 2006]. В головном мозге окисляется большое количество аминокислот с
разветвленной боковой цепью [Butt S.A. et al., 2012]. В постабсорбтивном периоде (перед
следующим приемом пищи) основными источниками свободных аминокислот служат мышцы.
Из них в кровоток поступают в основном аланин и глутамин. Аланин поглощается печенью
[Jorgensen J.T. et al., 2012], глутамин - кишечником и почками. В кишечнике азот глутамина
переносится в аланин или серин и в их составе транспортируется в печень, где активируется
23
процесс глюконеогенеза [Larsen M., Kristensen N.B., 2013]. Аминокислоты с разветвленной
боковой цепью (валин, лейцин, изолейцин) освобождающиеся из мышц, направляются в мозг,
являясь источником энергии. Катаболизм всех аминокислот сводится к образованию шести
веществ, вступающих в общий путь катаболизма: пируват, ацетил-КоА, L-кетоглутарат,
сукцинил-КоА, фумарат, оксалоацетат.
В живой природе, в организме человека в частности, не существует изолированного
обмена белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в
целостный
процесс
метаболизма,
подчиняющийся
определенным
закономерностям,
взаимозависимости и взаимообусловленности, допускающий также взаимопревращения между
отдельными классами органических веществ. Подобные взаимопревращения диктуются
физиологическими потребностями организма, а также целесообразностью замены одних
классов органических веществ другими. Так, гликогенные аминокислоты используются в
процессе глюконеогенеза [Pasiakos S.M. et al., 2011], а кетогенные - в синтезе кетоновых тел
[Deng-Bryant
Y.,
Prins
M.L.,
Hovda
D.A.,
Harris
N.G.,
2011],
часть
аминокислот
(гликокетогенных) используется в обоих классах превращений. В организме человека возможен
синтез восьми заменимых аминокислот: Ала, Асп, Асн, Сер, Гли, Глу, Глн, Про; углеводный
скелет данных аминокислот образуется из глюкозы, а универсальным донором L-аминогруппы
служит глутамат. Серин и глицин необходимы не только для синтеза белков и глюкозы (при ее
недостатке в клетках), но и нуклеотидов, коферментов, сложных липидов, креатинина и других
соединений. Метионин и цистеин, содержащие серу, используются в синтезе белков, участвуют
в инициации процесса трансляции, фолдинге, в образовании мембран клеток и липопротеинов,
в составе которых осуществляется транспорт липидов, а также в синтезе таурина. Тирозин
используется не только в синтезе белков, но выступает предшественником таких гормональноактивных соединений как катехоламины, тироксин, меланины. Большую роль в организме
человека играют непептидные азотосодержащие соединения - производные аминокислот:
гормоны надпочечников, щитовидной железы, а также медиаторы ЦНС, медиатор воспаления
(гистамин) и другие [Северин Е.С., 2013].
1.2.4. Синтез белка де ново и переаминирование
«Центральной
догмой
биологии»
называют
поток
информации
от
дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) через рибонуклеиновую кислоту (РНК) на белок,
который характерен для всех живых организмов, за исключением некоторых вирусов [Crick F.,
1970]. Результаты работ по исследованию генетического кода являются одним из самых
значительных достижений XX века в понимании процессов жизни [Novozhilov A.S., Koonin
E.V., 2009]. Биосинтез белков, называемый трансляцией, включает в себя преобразование
24
информации, заложенной в полинуклеотидной последовательности мРНК в аминокислотную
последовательность белка согласно генетическому коду [Ingolia N.T. et al., 2012]. Каждая
молекула
ДНК
представляет
собой
две
правозакрученные,
антипараллельные
полинуклеотидные цепи, упакованные в хромосому, расположены в ядре, в диплоидных
клетках человека их сорок шесть – т.е. 23 пары [Maffeo C., Luan B., Aksimentiev A., 2012]. У
эукариот с ДНК связаны гистоновые и негистоновые белки. В ядре существует 5 видов
гистонов, общая масса которых примерно равна содержанию ДНК [Bartke T. et al., 2010]. К
негистоновым белкам относят семейство сайт-специфических белков типа «цинковые пальцы»,
годимеры, негистоновые белки с высокой электрофоретической подвижностью, ферменты
репликации, транскрипции и репарации [Petruk S. et al., 2013]. Генетическая информация,
считывающаяся с ДНК, «переносится» на молекулу РНК (long RNA), которая строится как одна
полинуклеотидная цепь, отдельные участки которой образуют спирализованные петли«шпильки» за счет водородных связей [Seetin M.G., Mathews D.H., 2012]. В цитоплазме клеток
присутствуют несколько типов РНК - транспортные, матричные, рибосомальные и маленькие
молекулы РНК (small RNA) отличающиеся по массе, структуре, конформации, функции [Okada
H., Hayashizaki Y., 2013]. Первичные транскрипты мРНК подвергаются ряду ковалентных
модификаций, которые необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.
Модификация РНК (сплайсинг) происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже «зрелая» мРНК
[Meyer K.D. et al., 2012]. Варианты сплайсинга могут приводить к образованию различных
изоформ одного и того же белка. Кодирование структуры белков осуществляется, по
современным представлениям, в линейной последовательности нуклеотидов мРНК, однако в
ходе трансляции не наблюдается соответствия между числом мономеров в матрице мРНК и
синтезируемом белке; отсутствует также и структурное сходство между мономерами РНК и
белка. Причины несоответствия транскриптома и протеома клетки обсуждаются сообществом
биологов постгеномного периода с неослабевающим интересом. Кроме самоочевидной
причины - различного времени полужизни тРНК и белка, синтезируемого с данной молекулы
РНК, приводятся последние данные, указывающие на участии, длинных РНК в регуляции
активности транскрипции [Takayama K.,et al., 2013]. Таким образом, не все длинные РНК
непосредственно участвуют в последующих этапах, ведущих к синтезу белка. Код позволяет
шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью соответствия им
определенной последовательности нуклеотидов в ДНК. Генетический код представляет собой
не случайный конгломерат соответствий между кодонами мРНК и аминокислотами белков, а
высокоорганизованную систему, проявляющую общие свойства и закономерности [Ратнер В.А.,
2000]. Для него характерны триплетность, специфичность, вырожденность (включение в белок
одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов), линейность записи
25
информации, универсальность (кроме митохондриальной мРНК, содержащей 4 триплета),
колинеарность (аминокислотная последовательность белка колинеарна последовательности
экзонов в гене или зрелой мРНК после посттранскрипционного удаления интронов) [Amikura
K., Sakai Y., Asami S., Kiga D., 2014]. Таким образом, основными компонентами
белоксинтезирующей системы являются: аминокислоты в достаточном количестве, мРНК
(содержат информацию о структуре синтезируемого белка и используются в качестве матрицы),
тРНК (обеспечивают включение аминокислот в белок), рибосомы, на которых идет сборка
аминокислот
в
белки,
белковые
факторы,
а
также
аденозинтрифосфат
(АТФ)
и
гуанозинтрифосфат (ГТФ) как источники энергии. Каждая эукариотическая мРНК кодирует
строение только одной полипептидной цепи, т.е. она моноцистронна. Рибосома способна
катализировать образование около 100 пептидных связей в минуту [Beznosková P. et al. 2013].
Полипептидные цепи могут подвергаться структурным модификациям, посттрансляционным
изменениям, затем происходит фолдинг полипептидных цепей и формирование уникальной
третичной или четвертичной структуры белков [Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К.К.,
2005; Shen X., Chen S., Li G., 2013].
Способность регулировать синтез белков необходима для успешного выживания любого
организма. В зависимости от возраста и фазы развития, типа ткани или условий окружающей
среды изменяется количество и набор (спектр) синтезируемых белков. Эта регуляция
осуществляется на уровне различных внутриклеточных процессов: репликации, транскрипции,
посттранскрипционных воздействий на мРНК, а также при трансляции и через воздействие на
уже синтезированные белки (посттрансляционно) [Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов
А.П., 2010]. Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно [Jacob
F., Monod J., 1961], которая сводится к «выключению» или «включению» генов как
функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности
передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию для синтеза
специфических белков. Доказанная в опытах на бактериях, эта теория получила широкое
признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка более сложен
[Rajewsky N., 2011]. У эукариот дополнительно существует стратегия наработки мРНК не по
потребности данного момента, а заранее, впрок. Такие метаболически стабильные мРНК
хранятся в неактивной форме и не участвуют в трансляции. Когда определенный белок
становится необходим - мРНК активируется, когда необходимость в продукте трансляции
исчезает – мРНК может быть инактивирована [Стручкова И.В., Брилкина А.А., Веселов А.П.,
2010]. У эукариот только небольшое число генов (обычно менее 1%) доступно для
транскрипции. Стойкая репрессия генов гетерохроматина обеспечивается пространственной
укладкой ДНК [Xu X., Guardiani C., Yan C., Ivanov I., 2013]; метилированием дезоксицитидина
26
ДНК-метилазами [Mengxi D. et al., 2013], что препятствует активной транскрипции;
связыванием с гистонами и образованием нуклеосом, что также снижает транскрипционную
активность ДНК. В целом в геноме человека содержится не более 1,5% белок-кодирующих
нуклеодидных последовательностей [Lander E.S. et al., 2001].
1.3.
Процессы, которые участвуют в создании белковой композиции крови.
1.3.1. Секреция белков в кровь после их синтеза в тканях
По своему происхождению белки плазмы крови разделяют на: белки, секретируемые
тканями и функционирующие в плазме с молекулярным весом (МВ) >45 kDa; антитела, как
уникальный класс функционирующих в плазме белков (более 10 млн. разновидностей);
дистанционные рецепторные лиганды (классические пептиды и гормоны), имеющие различный
МВ и появляющиеся в различные периоды времени для реализации своих функций; локальные
рецепторные лиганды (цитокины и другие медиаторы клеточного ответа); временно
присутствующие в плазме негормональные белки, «адресованные» определенным структурам
(например, лизосомальные белки); белки-продукты повреждения тканей, появляющиеся
вследствие гибели или повреждения клеток (например, сердечные тропонины, миоглобин,
креатин-киназы); аберрантные белки, высвобождающиеся из опухолевых тканей; инородные
белки бактерий или паразитов.
В печени, как наиболее важном органе в белковом обмене, образуется 15-50 г белка в
сутки и происходят следующие процессы: дезаминирование аминокислот (дезаминирование
осуществляется и в других тканях организма, особенно в почках, но по значимости эти
процессы несопоставимы с дезаминированием аминокислот в печени); образование мочевины и
извлечение аммиака из жидких сред организма; взаимное превращение различных аминокислот
и синтез из аминокислот других соединений; образование белков плазмы крови [Kmieć Z.,
2001]. В плазму крови из печени секретируются фибриноген и альбумины крови, большая часть
α- и β-глобулинов и липопротеиды [Nakano M., Kubota M., Owada S., Nagai R., 2013]. В кровь из
ретикулоэндотелиальной системы костного мозга и лимфатических узлов секретируются βглобулины и γ-глобулины [Laudisi F. et al., 2013], пептидные гормоны в основном секретируют
клетки эндокринных желез [Arakelyan K.P. et al., 2007], однако эритропоэтин - клетки почки
[Wang P. et al., 2013]. В плазме крови, при суммарной концентрации белка 60-80 г/л,
содержится 7% общего количества белков организма [Северин Е.С., 2013], примерно 90%
составляют альбумины, иммуноглобулины, липопротеины, фибриноген, трансферрин. По
молекулярному весу белки плазмы крови различаются в широких пределах – их МВ колеблется
от 44 000 до 1 300 000.
27
Белки плазмы крови выполняют множество функций: поддерживают коллоидноосмотическое (онкотическое) давление и, тем самым, постоянный объем крови [Craft E.M.,
Powell L.L., 2012]; ряд белков, в том числе фибриноген, являются основными компонентами
системы гемостаза [Anderson E.L. et al., 2013]; определяют вязкость крови и играют важную
роль в поддержании гемодинамики в сердечно-сосудистой системе [Kwaan H.C., 2010]. Белки
также принимают участие в поддержании постоянства рН крови, так как составляют одну из ее
важнейших буферных систем [Leclercq L., Modena E., Vert M., 2013]. Они выполняют
транспортную функцию [Sitar M.E., Aydin S., Cakatay U., 2013]; участвуют в процессах
иммунитета [Hyvärinen S. et al., 2014]. С белками плазмы связано 40–50% кальция,
значительная часть железа, магния, меди и других элементов; кроме того, протеины являются
резервом аминокислот.
Белковая
композиция
крови
динамически
подвижна,
отражая
изменения
в
функционировании систем и органов организма, что используется в клинической диагностике и
терапевтическом мониторинге заболеваний [Anderson N.L., Anderson N.G., 2002]. Ни один из
компонентов белковой композиции крови не является гомеостатической константой, уровень
ни одного из белков крови (исключая гормоны пептидной природы) не подвержен жесткому
контролю и регуляции, за исключением уровня альбумина, который наряду с другими
небелковыми компонентами, является составляющей строгой гомеостатической константы –
осмоляльности крови. Белки плазмы крови, печени и мышц могут служить в качестве
«резервных», хотя эти резервы по своему существу отличаются от резервов углеводов
(отложение гликогена в печени и мышцах) и липидов (отложение триацилглицеролов в
жировых депо). Существование в организме механизма срочной мобилизации белковых
ресурсов в экстремальных условиях (голодание, тяжелая интоксикация, потеря крови и другие),
несомненно, и оно имеет важное физиологическое значение. Помимо «основных» белков, в
крови содержится большинство белков человеческого организма - тканевые белки попадают в
кровь в результате секреции, «подтекания» или разрушения клеток.
1.3.2. Апоптоз, другие виды разрушения клеток
Во всех многоклеточных организмах поддерживается баланс между пролиферацией и
гибелью клеток. Существуют две формы клеточной гибели — некроз и апоптоз. И если некроз
является пассивным процессом массированного разрушения клеток в ответ на повреждающее
действие какого-либо агента, то апоптоз - это активный, физиологический процесс, строго
контролируемый организмом, являющийся обязательным компонентом жизнедеятельности
многоклеточных организмов [Прохоренков В.И., Рукша Т.Г., Петрова Л.Л., Салмина А.Б.,
2005]. Апоптоз может регулироваться как внешними факторами, так и автономными
28
механизмами. Формирование механизма апоптотической гибели клеток является одним из
самых ранних и фундаментальных достижений эволюции, результатом которой стало
возможным появление всё более сложных многоклеточных организмов. Апоптоз, как
генетически запрограммированное самоубийство клетки, играет ключевую роль в ряде
процессов развития организма, его нормальной жизнедеятельности и регенерации тканей,
поскольку позволяет организму использовать высвобождающиеся ресурсы в виде сложно
организованных молекул и их комплексов. Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерны
такие морфологические изменения, как: конденсация хроматина, фрагментация и разрушение
ядра;
сжатие
цитоскелета;
набухание
клеточной
мембраны.
В
дальнейшем
клетки
фрагментируются, образуются «апоптозные тела». При этом возрастает внутриклеточная
концентрация Са2+; активируются протеазы-каспазы; ДНК режется на фрагменты; клеточная
поверхность меняется - теряется сиаловая кислота, связанная с гликопротеинами и
гликолипидами, что вызывает быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседними
клетками [Северин Е.С., 2013]. Все цитозольные белки гибнущей клетки попадают во
внеклеточную жидкость, пополняя собой, в том числе, и плазменный пул белков. Поэтому в
протеоме
крови
обнаруживаются
белки
«внутреннего
хозяйства»
клеток,
имеющие
внутриклеточную функцию в качестве своего главного назначения.
1.3.3. Реабсорбция белков почками
Протеомика на основе масс-спектрометрии покончила с представлениями о том, что моча
- безбелковая жидкость. Белки попадают в первичную мочу из крови. Считают, что протеомы
мочи и крови на 70% состоят из одних и тех же протеинов [Nagaraj N., Mann M., 2011], но
кроме белков крови в моче выявляются белки почечного происхождения.
На начальном этапе мочеобразования, низкомолекулярные компоненты плазмы крови,
такие как электролиты, продукты обмена (креатинин), β2-микроглобулин, α1-микроглобулин и
ретинол-связывающий белок (RBP) – фильтруются в клубочках нефрона [Vinge L. et al., 2010].
Фильтрация происходит через гломерулярный барьер, где из жидкой части крови образуется до
180 литров первичной мочи [Adachi J. et al., 2006; Eaton D.C., 2012]. Первичная моча, из-за
селективности мембраны, содержит белки с низким молекулярным весом (<60 кДа), такие, как
транспортные белки - витамин Д-связывающий белок, RBP. Белки группы альбумина частично
фильтруются: коэффициент фильтрации альбумина составляет
0,00062, концентрация
альбумина в ультрафильтрате колеблется от 1 до 50 мкг/мл [Amsellem S. et al., 2010]. Однако
прохождение гломерулярного фильтра альбумином, имеющего при физиологических значениях
рН отрицательный заряд и радиус молекулы 3,6 нм, затруднено главным образом из-за
отрицательного заряда молекулы, а не из-за её размера. В норме, альбумин составляет около
29
25% от всех белков, экскретируемых почками. Это соотношение может меняться, в частности, в
случае протеинурии. После прохождения через фильтр, такие высоко представленные белки
сыворотки (находящиеся в сыворотке и плазме крови в высокой концентрации), как легкая цепь
иммуноглобулина, трансферрин, витамин Д-связывающий белок, миоглобин и до 94%
профильтровавшегося альбумина реабсорбируются, главным образом, в проксимальных
почечных канальцах [Vinge L. et al., 2010]. В проксимальных сегментах нефрона происходит
реабсорбция около 66% от всего объема гломерулярного фильтрата. Механизм реабсорбции в
нефроне позволяет предотвратить потери белков орагнизмом. Существует теснейшая
структурно-функциональная связь между реабсорбцией натрия, воды, хлоридов, фосфатов,
бикарбоната и изменениях в различных звеньях процесса реабсорбции белка [Poupin N. et al.,
2012]. За реабсорбцию белков из первичной мочи в проксимальных канальцах нефрона (ПК)
ответственен рецептор-опосредованный эндоцитоз. Скорость эндоцитоза увеличивается
пропорционально концентрации белка в клубочковом фильтрате до тех пор, пока не
достигается максимальная скорость образования эндоцитозных пузырьков. Далее, в процессе
реабсрбции образовавшиеся эндоцитозные вакуоли движутся в сторону базальной части клетки
и сливаются с лизосомами. В эндолизосомальных пузырьках осуществляется протеолиз белков
[Doherty G.J., Mc Mahon H.T., 2009]. При этом в кровь возвращается практически вся глюкоза,
аминокислоты, витамины, значительное количество ионов [Haraldsson B., 2010]. Иной механизм
обеспечивает реабсорбцию небольших линейных пептидов (таких, как ангиотензин II,
брадикинин).
Эти
пептиды
гидролизуются
ферментами
щёточной
каёмки
эпителия
проксимального канальца, после чего аминокислоты транспортируются в клетку [Carone F.A.,
Peterson
D.R.,
1980].
У
практически
здорового
человека,
в
обычных
условиях
жизнедеятельности, содержание белка в суточной моче не превышает 150 мг (что составляет
уровень физиологической протеинурии). Экскреция белка в концентрации более 150 мг/день
считается в клинике протеинурией и является показателем нарушением работы гломерулярного
фильтра или процессов реабсорбции [Наточин Ю.В., 1993; Adachi J. et al., 2006].
1.3.4. Исследование белковой композиции биологических жидкостей человека
до развития протеомики на основе масспектрометрии
Функциональное состояние гломерулярного барьера, канальцевого аппарата, особенности
гемодинамики, концентрация и качественный состав белков плазмы, а также активность
системы регуляции их транспорта в ПК определяют концентрацию белка в моче, его
качественные характеристики. Нормальная концентрация белка в моче составляет до 150 мг/л,
что примерно в 1000 раз меньше, чем в плазме [Наточин Ю.В., 1993]. Это свидетельствует о
высокой эффективности гломерулярного фильтра, препятствующего потере белка из русла
30
крови [Шейман Д.А., 2007]. Общий анализ белка в моче является одним из наиболее массовых
клинико-диагностических исследований [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005]. Отмечают, что
поскольку в моче присутствуют множество соединений, способных вмешиваться в ход
химических реакций метода определения, а содержание белка в моче здорового человека
достаточно низкое, сопоставимое с чувствительностью методов исследования, значения уровня
белка в моче широко варьируют [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Анализ мочи остается одной из
тех лабораторных процедур, которые сложнее всего поддаются стандартизации, в виду
возможных нарушений протоколов сбора, обработки и хранения образцов мочи [Козлов А.В.,
Ларичева Е.С., 2012]. Все методы определения белка в моче можно разделить на качественные,
полуколичественные, количественные. Как показывают многочисленные исследования, ни один
из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет
получать надежные и воспроизводимые результаты. О содержании белка в моче судят по
интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с
мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. В последнее время
приобрели популярность методы сухой химии, благодаря своей простоте, скорости выполнения
анализа. Тем не менее, одним из недостатков этих методов, приводящих к искажению
диагностической
информации,
является
большая
чувствительность
индикатора
бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. Определение белка с
помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней
протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не
обладают способностью детектировать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л).
Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче
глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса. Ложноположительные результаты
могут быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Для количественного определения
белка в моче в клинических лабораториях используют в основном два типа методов:
турбидиметрические и колориметрические. Турбидиметрические методы основаны на
преципитации белка различными химическими агентами: сульфосалициловой кислотой,
трихлоруксусной кислотой, бензетоний хлоридом [Ким Ю.В., Шибанов А.Н., 2005].
Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации [Dilena B.A., Penberthy L.A.,
Fraser C.G., 1983], что приводит к получению ложных результатов, однако, в настоящее время
эти методы широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности
реактивов [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2007]. К группе колориметрических методов
определения белка относятся методы Лоури, биуретовый и методы, основанные на связывании
белка с органическими красителями. Метод Лоури обладает высокой чувствительностью: ~10
мг/л и широкой линейной областью измерения – до 1 г/л. Однако результаты анализа
31
значительно зависят от аминокислотного состава белка – интенсивность окрашивания
различных белков может различаться в 300 и более раз [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005].
Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны
оказывать влияние на результаты исследования, полученные данным методом. Биуретовый
метод практически не зависит от аминокислотного состава белков, это реакция на пептидные
связи белка: для протекания реакции достаточно наличие двух пептидных связей в молекуле
исследуемого вещества, т. е. в реакцию могут вступать низкомолекулярные белки и пептиды,
начиная с трипептидов. Этот метод высокоспецифичен, поскольку в реакции не участвуют
присутствующие в пробе соединения небелковой природы [Пупкова В.И., Прасолова Л.М.,
2005; Marshall T., Williams K.M., 2000]. Область линейной зависимости оптической плотности
от содержания белка примерно в 10 раз шире, чем у метода Лоури, однако чувствительность –
примерно в 10 раз ниже, что непригодно для определения минимальных количеств белка в моче
здорового человека. В связи с этим, она чаще всего используется для количественного
определения белка после его осаждения [Ларичева Е.С. с соавт. 2009]. Методы, основанные на
связывании белка с органическими красителями, привлекают к себе внимание благодаря
простоте, быстроте исполнения и высокой чувствительности [Dilena B.A., Penberthy L.A., Fraser
C.G., 1983; Ramakers J.M., 1984]. Однако они также имеют некоторые недостатки, одним из
которых является различие в способности белков связывать те или иные красители [Пупкова
В.И., Прасолова Л.М., 2005], другим - нарушение линейной зависимости между концентрацией
некоторых белков и оптической плотностью комплекса белок-краситель [Шишкин С.С., 1982;
Загребельный С.H., Пупкова В.И., 1983]. Наиболее широко используемыми красителями в
лабораторной практике определения белка являются кумасси бриллиантовый голубой,
бромфеноловый синий и пирогаллоловый красный. Так, краситель кумасси бриллиантовый
синий способен связываться с положительно заряженными аминогруппами аминокислот,
входящими в состав белковой молекулы, с образованием комплекса с максимумом поглощения
при 595 нм. При этом комплекс белок-краситель обладает интенсивным поглощением, что
обеспечивает высокую чувствительность методу и требует для исследования небольшого
объема образца [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Ramakers J.M., 1984]. Различные белки обладают
неодинаковой способностью связывать данный краситель, так, если поглощение комплекса
кумасси бриллиантовый синий - альбумин принять за 100%, то для гемоглобина и
трансферрина оно оказывается таким же, однако оптическая плотность комплекса с
глобулинами, а также свободными κ- и λ-цепями иммуноглобулинов составляет всего лишь
около 60% [Ramakers J.M., 1984]. Частично эти недостатки устраняются с помощью некоторых
модификаций метода [Marshall T., Williams K.M., 2000]. Краситель бромфеноловый синий
связывается преимущественно с альбумином, а не глобулинами и другими белками, поэтому
32
определение белка в моче, содержащей сложную смесь белков, данным методом не
обеспечивает необходимую точность анализа [Пупкова В.И., Прасолова Л.М., 2005; Ларичева с
соавт., 2009]. Fujita с соавт., в 1983 году предложили использовать для определения белка в
моче органический краситель – пирогаллоловый красный [Fujita Y., Mori I., Kitano S., 1983].
Широкое применение в лабораторной практике данный метод получил после его модификации
Watanabe с соавт. [Watanabe N. et al., 1986]. Методика основана на связывании белка с
красителем в кислой среде (рН ~2,5); на результаты определения не влияет присутствие в моче
многих соединений, в том числе, лекарственных препаратов и их метаболитов, солей,
оснований, кислот. Предложенная модификация позволила расширить линейную область
измерения до 2 г/л, при этом надежность и воспроизводимость модифицированного метода
соответствуют клиническим требованиям. «Тест на открытие» в этом методе при определении
альбумина дает показатели 97–102%, глобулина – 69–72%; чувствительность метода составляет
30–40 мг/л. Вещества, присутствующие в моче, дают суммарную ошибку определения менее
2%. Данный метод является лучшим среди других колориметрических методов, он прост и
удобен для ручного исполнения в клинических лабораториях и адаптации на автоматических
анализаторах [Ларичева Е.С. с соавт., 2009; Marshall T., Williams K.M., 2004]. Результаты
количественного определения содержания белка во фракционной моче зависят от ее объема и
степени разведения, могут не совпадать с таковыми при исследовании суточной мочи.
Полагают, что нормализация результата определения уровня белка на показатель осмолярности
мочи (отношение белок/осмолярность), либо пересчет на содержание креатинина (отношение
белок/креатинин), позволяет приблизить результаты определения белка в случайной пробе
мочи к результатам определения белка в суточном диурезе [Пупкова В.И., Прасолова Л.М.,
2005].
Следует отметить, что все вышеперечисленные стандартные лабораторные методы
используются для определения суммарного уровня белка в моче, без возможности исследовать
белковую композицию образца. Долгое время единственным методом анализа сложных
белковых смесей, таких как плазма крови, оставался электрофорез. Использование
высокоразрешающего метода двумерного электрофореза (2-DE) позволило впервые составить
карту белков плазмы крови [Anderson L., Anderson N.G., 1977], на которой детектировали
примерно 300 пятен, из которых исследователи смогли идентифицировать 40 белков. Более
полная протеомная карта плазмы крови была получена в 1991 году, на которой было выделено
727 пятен, 376 из которых были идентифицированы как 49 различных белков [Anderson N.L.,
Anderson N.G., 1991]. Хотя метод 2-DE является одним из самых известных и
распространенных методов анализа биологических жидкостей и имеет ряд преимуществ перед
другими технологическими платформами, опубликовано не так много работ по его применению
33
в исследовательских целях, такие как поиск биомаркеров заболеваний в плазме (сыворотке)
крови [Трифонова О.П., 2011]. По мнению Воронцова с соавт., наиболее точным и
чувствительным методом, позволяющим обнаружить скрытые изменения функции различных
участков нефрона, является метод уропротеинограммы [Воронцов А.Л., Нестеровская А.Ю.,
Потапова Л.А., 2005]. Основанный на электрофоретическом определении спектра нативных
белков
мочи,
он
дает
возможность
выявить
характер и
выраженность
изменений
функционального состояния нефрона, позволяет отследить динамику процесса, выявить
причины микропротенурий, зафиксировать преморбидные состояния и скрытую патологию
почек на стадиях, не манифестируемых при стандартном клиническом обследовании [Воронцов
А.Л., Нестеровская А.Ю., Потапова Л.А., 2005].
1.4. Начало эры протеомики (изобретение МАЛДИ). Методы и возможности
(чувствительность, производительность) протеомики на основе масспектрометрии
Огромный скачок в темпе развития исследований белков произошел после открытия
возможности использования масс-спектрометрии для идентификации белковых молекул. В
конце 80-х были разработаны методы ионизации белков без разрушения их первичной
структуры - лазерная десорбция и ионизация при содействии матрицы (MALDI) (Танака, Карас,
Бахман, Бар и Хилленкамп) и электроспрей (ESI) (Фенн) [Karas M., Bachmann D., Bahr D.,
Hillenkamp F., 1987]. За эти, так называемые «мягкие» методы ионизации [Tanaka K. et al., 1988;
Costello C.E., 1997], Джон Фенн и Коиши Танака в 2002 году были удостоены Нобелевской
премии по химии. В ESI растворы белков и пептидов распыляются электрическим полем в виде
заряженных капель в капилляр, соединенный через вакуумный и ионный интерфейсы с массдетектором. В MALDI ионизация осуществляется лазерным излучением, которое поглощается
специально подбираемой матрицей, содержащей молекулы анализируемых соединений, и
происходит в вакууме [Николаев Е.Н., 2007; Domon B., Aebersold R., 2006; Palmblad M., Tiss A.,
Cramer R., 2009]. Чем меньше по массе и чем сильнее заряжен белок, тем быстрее он достигает
противоположно заряженного электрода. По времени движения иона до электрода определяют
соотношение массы и заряда фрагмента (m/z). При облучении лазером образуются
преимущественно однозарядные ионы, для них m/z примерно совпадает с массой [Говорун
В.М., Арчаков А.И., 2002]. В то же время каждому из перечисленных методов ионизации
присущи свои достоинства и свои недостатки: для электроспрейного источника ионизации
характерно образование многозарядных ионов, т. е. ионов, образованных за счет присоединения
более одного катиона, что делает совокупность сигналов масс-спектра более сложной для
интерпретации; в масс-спектрах MALDI нижний диапазон масс «заселен» сигналами,
связанными с наличием матрицы, на фоне которых информативные сигналы пептидов могут
34
быть потеряны [Николаев Е.Н., 2007]. Масс-спектрометрические методы позволяют достаточно
быстро анализировать значительное число образцов, они требуют сравнительно небольшого
объема биоматериала, обладают высокой чувствительностью и хорошим разрешением [Говорун
В.М., Иванов В.Т., 2011].
Протеом представляет собой набор белков, присутствующих в клетке, ткани или
жидкости тела конкретного организма в данный момент времени, в данной среде, в данном
физиологическом или патологическом состоянии [Romero R. et al., 2006]. Термин «протеом»
предложил в 1994 году австралийский генетик Марк Уилкинс [Wilkins M., 2009], в научной
среде термин появился в 1995 году [Wasinger V.C. et al., 1995] и с тех пор является
общепринятым. Особенностью биологических образцов, таких как жидкости тела человека, с
точки зрения состава их белков, является сложность (многокомпонентность) и высокое
концентрационное различие входящих в их состав протеинов. Это накладывает повышенные
требования к стандартизации протоколов, предварительной подготовки образцов, в которую
входят многостадийная очистка и фракционирование смеси белков с помощью одно - и
двумерного гель-электрофореза и/или жидкостной хроматографии [Николаев Е.Н., 2007].
Логическим шагом в развитии аналитических методов анализа сложных смесей белков и
пептидов явилась комбинация масс-спектрометров с различными методами разделения смесей
и разработка хромато-масс-спектрометрических комплексов (ЖХ-МС, LC-MS) [Aebersold R.,
Mann M., 2003]. Появление тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) дало возможность
проводить идентификацию белков [Paulo J.A. et al., 2012; Banach T. et al., 2013], устанавливать
первичную аминокислотную последовательность, выявлять посттрансляционные модификации
[Kang C., Yi G.S., 2011], и, наконец, осуществлять сравнительный количественный анализ
белков в биологических образцах. В масс-спектрометрическом анализе белков различают два
подхода: "top-down" и "bottom-up". При "top-down" происходит получение информации о
целых, неповрежденных белковых молекулах, при "bottom-up" – восстановление информации о
белках, при анализе отдельных пептидов этих белков. Причины редкого использования "topdown" связаны с недостаточной селективностью подхода, низкой производительностью, а также
с тем, что для каждой массы белка может подойти несколько вариантов белков-кандидатов
[Han X., Aslanian A., Yates J.R., 3rd 2008]. В методологии "bottom-up" сложную по составу
анализируемую смесь подвергают ферментативному гидролизу (естественными протеазами,
чаще всего - трипсином) для получения смеси пептидов [Link A.J. et al., 1999]. Фермент
расщепляет белки по связи Lys – X и Arg – X (где X — любая аминокислота, отличная от Pro и
Hyp). В результате трипсинолиза получается набор пептидов (триптических пептидов). Данный
метод был одновременно предложен пятью группами, независимо друг от друга: Генцелем и
коллегами, группой Джеймса (ETH, Zurich), лабораторией Роепсторфа (EMBL, Heidelberg),
35
Папином и коллегами (ICRF, London), лабораторией Иейтса (University of Washington)
[Николаев Е.Н., 2007]. Выделяют два направления в приеме "bottom-up": “sort-then-break” и
break-then-sort".
разделение
“Sort-then-break”
белков,
предполагает
предшествующих
предварительное
триптическому
фракционирование
расщеплению,
затем
и
масс-
спектрометрический анализ полученной смеси. При "break-then-sort"смесь белков расщепляют
без предварительного фракционирования с последующим проведением хромато-массспектрометрического анализа [Han X., Aslanian A., Yates J.R., 3rd 2008].
1.5.
Организация HUPO и современное состояние по выявлению
белков крови и мочи человека
В 2001 году была создана международная научная организация «Протеом человека»
(HUPO, Human Proteome Organization), в качестве задач которой были декларированы:
инвентаризация всех белков организма человека, построение молекулярных белковых атласов
клеток, органов и тканей, выяснение закономерностей регуляции функционирования белков
при посттрансляционных модификациях, выявление схем белок-белковых взаимодействий и
новых маркеров патологических процессов [Hanash S., 2004]. Крупномасштабное изучение
протеома плазмы крови выделено в отдельный проект HUPO Plasma Proteome Project (HPPP)
[Omenn G.S. et al., 2005]. В рамках данного проекта был проведен анализ возможностей и
ограничений
существующих
протеомных
методов
с
целью
отработки
стандартных
воспроизводимых протоколов для получения, хранения и предварительной подготовки
образцов плазмы крови, разделения белков и их последующей идентификации. Результаты
проекта
размещены
в
базе
данных
PRIDE
(Proteomics
IDEntifications)
(http://www.ebi.ac.uk/pride), а также в базе данных Европейского института биоинформатики,
который является одним из самых известных хранилищ данных протеомики на основе массспектрометрии. На сентябрь 2012 года, в данной базе содержалось 25853 основанных на MSдетектировании экспериментов протеомики, около 11,1 млн. выявленных белков, 61900000
пептидов и 324 млн. спектров для 89 видов животных, в том числе, и человека [Vizcaíno J.A. et
al., 2013]. На сентябрь 2013 года, как сообщает Abersold, в библиотеке SWATH-MS
содержалось около 10 000 белков и 85 000 пептидов человека, 5 600 белков клеточных линий
[Liu Y. et al., 2013]. Bairoch представил данные о состоянии базы данных neXtProt, содержащей
15 646 белков организма человека, из которых 78% от общего числа, были подтверждены на
белковом уровне [Gaudet P. et al., 2013]. В настоящее время инвентаризация белков крови
человека не завершена.
Однако наиболее впечатляющих успехов в плане практического использования ее
достижений протеомика достигла именно в области исследования протеома мочи [He J.C.,
36
Chuang P.Y., Ma'ayan A., Iyengar R., 2012]. Проект HKUPP (http://eurokup.org) был инициирован
в 2005 году в рамках HUPO для содействия исследованиям протеомики в области нефрологии,
понимания функции и заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития теоретических
протеомных исследованиях в этой области [Vlahou A., Charonis A., Benigni A., 2008]. Для
достижения соответствующих задач было создано несколько под-проектов, наиболее
актуальным из которых является проект «Создание стандартных протоколов и руководящих
принципов для анализа протеома мочи». Это под-проект был всесторонне обсужден в ходе
первого HKUPP симпозиума (во время ежегодного международного конгресса 6-го HUPO октябрь 2007, Сеул, Корея) и второго семинара (во время 40-й Американского общества
нефрологии почечной недели – в ноябре 2007 года в Сан-Франциско, США) [Yamamoto T. et al.,
2008; Rodríguez-Suárez E., Whetton A.D., 2013].
1.6.
Моча
как
Ценность мочи как биоматериала для клинических
и физиологических исследований
биологический
объект
обладает
большим
диагностическим
и
исследовательским потенциалом. Считается, что протеомом мочи содержит подробную
информацию
об
изменениях
в
физиологическом
состоянии
человека
[Mischak
H.,
Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2013]. Моча может быть
получена с использованием неинвазивных процедур и без участия специально обученного
персонала, а также без ограничений в кратности сбора и объема, что исключительно ценно для
неинвазивного мониторинга. Это делает мочу потенциально полезной для быстрого и
надежного применения в клинических условиях [Mischak H., Delles C., Klein J., Schanstra J.P.,
2010; Rodríguez-Suárez E., Siwy J., Zürbig P., Mischak H., 2014]. Моча содержит белки и
пептиды с низкой молекулярной массой, которые могут быть проанализированы с отказом от
чрезмерно-сложных манипуляций, когда каждая дополнительная процедура в пробоподготовке
приводит к генерации артефактов [Lee B. et al., 2011]. Небольшое количество содержащихся в
ней протеаз обеспечивает белковую стабильность мочи [Kentsis A., 2011]. Протеом мочи не
изменяется существенно, если образцы хранятся в течение нескольких лет при -20°С
[Theodorescu D. et al., 2006], или при трехдневном хранении в 4°С, а также в течение 6 час при
комнатной температуре или после повторных циклов замораживания-оттаивания [Schaub S. et
al., 2004; Theodorescu D. et al., 2006; Mischak H., Vlahou A., Ioannidis J.P., 2013]. В моче в
относительно низкой концентрации, в отличие от плазмы крови, присутствуют мажорные
белки (альбумин и глобулины), а динамический диапазон концентраций на 3 порядка меньше,
чем в плазме [Adachi J. et al., 2006]. Состав мочи не является постоянной величиной,
концентрация белка в моче может варьировать от миллиграммов до граммов на литр в
37
зависимости от времени сбора, диеты, физических упражнений, или стадии заболевания.
Диапазон концентраций белков в моче у здоровых людей – 0 - 0,8 г / л [McDonough A.A.,
2010]. Концентрация белка в моче у пациентов с хроническими заболеваниями почек может
превышать 100 г/л [Наточин Ю.В., 1993; Rodríguez-Suárez E., Siwy J., Zürbig P., Mischak H.,
2014]. Конечная моча образуется в результате трёх процессов: фильтрации жидкой части
плазмы (с образованием первичной мочи), реабсорбции электролитов, осмотически свободной
воды и некоторых метаболитов и секреции в нее электролитов и отдельных метаболитов
[Вандер А., 2000; Decramer S. et al., 2008]. Важнейшим компонентом фильтрационного барьера
почки является гломерулярный барьер [Jarad G., Miner J.H., 2009], имеющий трехслойную
структуру и состоящий из таких компонентов как эндотелиальных клеток капилляров,
базальной мембраны и эпителия висцерального листка капсулы, или подоцитов [Miner J. H.,
2011]. За сутки клубочки нефронов фильтруют более 1800 литров крови, в них образуется до
180 литров первичной мочи [Adachi J. et al., 2006; Eaton D.C., 2012]. В проксимальных
канальцах более двух третей фильтрата реабсорбируется [Jia L. et al., 2009; McDonough A.A.,
2010], в кровь возвращается практически вся глюкоза, аминокислоты, витамины, значительное
количество ионов [Haraldsson B., 2010]. Высоко представленные белки плазмы также
реабсорбируются в проксимальных почечных канальцах [Vinge L. et al., 2010]. В дистальных
отделах нефрона обратному всасыванию подвергаются преимущественно электролиты и вода.
Этот процесс контролируется антидиуретическим гормоном (АДГ). Следовательно, в
зависимости от актуальных потребностей организма в осмотически свободной воде, в
дистальных отделах нефрона моча может разбавляться или концентрироваться, что будет
влиять на уровни экскретируемых с нею белков.
1.7. Анализ мочи протеомными методами.
Исследование протеома мочи дает возможность более глубокого понимания нормальной
физиологии, а также патофизиологии заболеваний. Информация, полученная в этих
исследованиях, может быть использована для диагностики различных заболеваний [Marimuthu
A. et al., 2011]. Протеомика мочи стала одной из наиболее активно развивающихся дисциплин в
области биомедицинских исследований [Thongboonkerd V., 2011; Albalat A., Mischak H., Mullen
W., 2011]. Начиная с 2001 года, исследователи пытаются определить протеомный состава мочи.
Так, Spahr с соавт. [Spahr C.S. et al., 2001] провели исследование протеома мочи, используя LCMS/MS. Bergquis с соавт. [Bergquist J, Sciubisz A, Kaczor A, Silberring J., 2002]
идентифицировали белки в четырех жидкостях организма человека: плазме, цереброспинальной
жидкости, слюне и моче, проведя гидролиз белковой смеси собранных образцов с помощью
трипсина и диализа перед последующей масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса
38
с преобразованием Фурье. В полученных масс-спектрах мочи было обнаружено 1183 пика,
которые составили 654 изотопных кластера. В ряде работ по изучению протеома мочи
использовался двумерный 2-DE и одномерный (1-DЕ) электрофорез, а также жидкостная
хроматография (LC). Первая протеомная карта мочи, основанная на анализе образцов мочи
здоровых добровольцев, состояла из 67 белков и их изоформ [Thongboonkerd V., McLeish K.R.,
Arthur J.M., Klein J.B., 2002]. Объединенные образцы мочи 20 здоровых добровольцев,
используя технологии 2-DE-МS), позволили Oh J. с соавт. [Oh J. et al., 2004], идентифицировать
113
белков.
Усилия
по
совершенствованию
методов
пробоподготовки,
повышению
воспроизводимости, усовершенствованию приборной базы, развитию нового программного
обеспечения, позволили определять сотни и тысячи белковых соединений данного образца
[Aebersold R., Mann M., 2003; Nagaraj N., Mann M., 2011]. Используя MALDI-MS и жидкостную
хроматографию с ионизацией электроспреем (LC + ESI-MS/MS), Pieper с соавт. определили в
моче 150 уникальных белков [Pieper R. et al., 2004]. На основе 1D-LC + ESI-MS/MS и LC/LCMS/MS, дополнив ее предварительной аффинной очисткой проб мочи с помощью конковалина
А, Wang с соавт. идентифицировали 225 уникальных белков [Wang L. et al., 2006], а Sun с соавт.
- 226 белков [Sun W. et al., 2005]. Castagna с соавт. [Castagna A. et al., 2005], используя для
концентрирования
белков
микрочастицы,
покрытые
специфическими
лигандами,
идентифицировали 383 уникальных пептида с помощью LC- LTQ-FT (MS/MS). В лаборатории
M. Манна (Мюнхен, Германия) при использовании метода ионно-циклотронного резонанса c
преобразованием Фурье (FT-ICR), дополненного линейной ионной орбитальной ловушкой
(LTQ-Orbitrap),
что
позволило
осуществлять
тандемную
масс-спектрометрию,
было
идентифицировано более 1543 белков в пуловых образцах мочи. Точность измерений достигала
1 ppm (одной миллионной части), измерения сочетались с выполнением многомерной
жидкостной хроматографии (LC/LC + FT-ICR (MS3)) и гель электрофореза (2-DE + MS/MS/MS
(MS3)) [AdachiJ. et al., 2006], что позволило значительно повысить достоверность
идентификации белка, даже по единственному пептиду [Zerefos P.G., Aivaliotis M., Baumann M.,
Vlahou A., 2012]. Как сообщили Marimuthu с соавт., им удалось методом 1DLC/MS/MS
идентифицировать 1823 белка в протеоме мочи здоровых лиц, при этом информация о 671
белке ранее не сообщалось. По мнению авторов работы, полученный список белков может
служить базой для будущих исследований, направленных на выявление мочевых биомаркеров
различных заболеваний [Marimuthu A. et al., 2011]. Kentsis и соавт. выявили 2362 белка в
регулярно собираемых индивидуальных образцах мочи, используя протеомный подход SDSPAGE–LC–MS/MS (фракционирование мочи с помощью ультрацентрифугирования, гельэлектрофореза, ионно-обменной хроматографии с обращенной фазой), сведя потери материала
к минимуму, и используя масс-спектрометр LTQ-Orbitrap и LC-MS/MS [Kentsis A. et al., 2010].
39
Наконец, в 2012 году группа М.Манна (Германия) объявила о выявлении 5823 различных
белков в образцах мочи человека, из которых только около ¼ определялись более чем в одной
публикации с использованием той же техники (LTQ-Orbitrap) [Nagaraj N. et al., 2012].
Большое количество информации может предоставить исследование пептидома мочи.
Coon с соавт. опубликовали первый каталог пептидома человека, который включает 5010
пептидов, охарактеризованных с помощью капиллярного электрофореза в сочетании с массспектрометрией (CE-MS). Из общего числа 443 могут быть идентифицированы по их
аминокислотной последовательности [Coon J.J. et al., 2008]. Возможности MS/MS позволяют
секвенировать природные пептиды массой до 10 кДа [Chalmers M.J. et al., 2005]. В работе Siwy
с соавторами [Siwy J. et al., 2011] описано более 13000 пептидов, более 900 из них секвенировано. К настоящему времени база данных по пептидам содержит записи более чем
20000 образцов [Stalmach A., Albalat A., Mullen W., Mischak H., 2013] и более 1500 сиквенсов.
Основная цель “Human urinary peptidome database” заключается в том, чтобы служить в
качестве универсальной платформы для выявления и валидации биомаркеров множества
заболеваний и патофизиологических изменений [Rodríguez-Suárez E., Siwy J., Zürbig P., Mischak
H., 2014]. Природные пептиды в моче являются результатом протеолитической активности,
изменения в содержании которых, возможно, связаны со многими заболеваниями, в том числе
воспалительными, фиброзными и неврологическими расстройствами [Klein J., Papadopoulos T.,
Mischak H., Mullen W., 2014]. Выделение и анализ протеома экзосом мочи привело к
идентификации более 1000 белков [Gonzales P.A., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008]. Экзосомы
содержат мембранные белки практически всех типов клеток мочеполовой системы, а также
заключают в себе ряд цитозольных белков [Zhou H. et al., 2006]. Как известно, основным
источником экзосом являются мультивезикулярные тела, которые локализуются в клетках
почечного эпителия, подоцитах, клетках почечных канальцев и попадают в мочу в результате
слияния мембраны мультивезикулярных тел с апикальной мембраной эпителиальной клетки
[Gonzales P., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008]. В норме экзосомы содержат примерно 3% от
общего количества белка мочи, они могут нести белковые маркеры почечной дисфункцией и
структурного повреждения [Gonzales P., Pisitkun T., Knepper M.A., 2008].
1.8. Изучение протеома мочи, его применением в клинике
В последние годы протеомика и ее раздел - клиническая протеомика - вовлечены в работу
по открытию биомаркеров различных заболеваний. Поскольку пока фундаментальных данных
подобного рода недостаточно, то трудно определить, являются ли потенциальные биомаркеры
специфическими для определенных заболеваний или просто выявляются из-за динамических
изменений в протеоме мочи. В 2005 Nedelkov предложил ввести понятие «Популяционная
40
протеомика» в качестве направления в исследовании протеома, включая меж - и
внутрипопуляционные исследования в различных странах, а так же растущую потребность в
анализе динамики протеома у отдельных здоровых лиц, как и необходимость оценки внутри - и
межиндивидуальных различий [Nedelkov D., 2005]. Базы данных протеома мочи здоровых
добровольцев могут играть важную роль на этапе обнаружения биомаркеров различных
заболеваний, могут использоваться в качестве контрольной группы при исследованиях [Liu X.
et al., 2012]. Методом 2D – PAGE Thongboonkerd с соавт. изучали внутри - и
межиндивидуальную изменчивость в 38 образцах мочи. Была отмечена значительная степень
межиндивидуальной вариабельности, в большей степени - для альбумина и трансферрина. Было
отмечено также, что в мужской моче было большее количество общего белка, но меньшее
число белковых пятен, по сравнению, с мочой женщин. По мнению данных авторов, на протеом
мочи могут
влиять многие факторы: характер питания, прием лекарств, характер
жизнедеятельности, уровень физической активности, стресс, фазы менструального цикла у
женщин и другие физиологические изменения, а так же факторы окружающей среды, к
примеру, температура и влажность [Thongboonkerd V., Chutipongtanate S., Kanlaya R., 2006].
Khan с соавт. проанализировали образцы мочи мужчин, собранных за день (утром, днем и
вечером) в течение 6-недельного периода (на первой, второй, третьей и шестой неделе) 2-DЕ
гель-электрофореза. Было идентифицировано 339 белка, при этом, отмечалась значительная
большая разница в протеоме образцов, собранных в разные дни исследования, по сравнению с
мочой, собранной в течение одного дня [Khan A., Packer N.H., 2006].
Одним из важных вопросов в методологии протеомики мочи является вопрос о том, какую
фракцию мочи брать для исследования. Несколько групп ученых пытались решить этот вопрос.
Так, по мнению Russo с коллегами, первая фракция утренней мочи может иметь потенциальный
недостаток в виде бактериального загрязнения из-за длительного времени пребывания в
мочевом пузыре [Russo L.M., Bakris G.L., Comper W.D., 2002]. По мнению Thongboonkerd с
соавт., первая утренняя фракция имеет наибольшее количество общего белка, но дает
наименьшее количество белковых пятен для визуализации [Thongboonkerd V., Chutipongtanate
S., Kanlaya R., 2006]. С другой стороны, Zhou с соавт. показали, что разница в результатах
между первой и второй утренней фракцией мочи, при исследовании экзосом, была
минимальной, что свидетельствовало о минимальном уровне деградации экзосом в
мочевыводящих путях/мочевом пузыре. По мнению этих авторов, этому способствуют
ингибиторы протеаз, поэтому они рекомендовали условия длительного хранения при -80°С, со
встряхиванием после оттаивания [Zhou H. et al., 2006]. EuroKUP и HKUPP рекомендуют
предпочтительно использовать для протеомного анализа мочи среднюю порцию второй
утренней фракции или любой утренней фракции, являющейся наименее вариабельной по
41
белковому составу и вследствие этого наиболее пригодной для протеомных исследований, при
этом моча должна собираться в стерильную пластиковую ёмкость [Fiedler G.M. et al., 2007;
Zürbig P. et al., 2011]. Этот протокол позволяет стандартизировать преаналитические условия и
получить высокую воспроизводимость результатов [Zürbig P. et al., 2011]. Учитывая
индивидуальную и групповую вариабельность, а также гендерные различия мочевого протеома,
Marimuthu с соавт. предложили использовать репрезентативную группу, состоящую из 10
мужчин и 10 женщин в качестве контроля для качественного анализа протеома мочи
[Marimuthu A. et al., 2011]. В работе Sun с соавт. образцы мочи были собраны у шести человек:
трех мужчин и трех женщин (средний возраст от 27 до 30 лет), не имеющих острых или
хронических заболеваний, не принимающих лекарства. Для оценки суточной вариабельности,
пробы мочи последовательно собрались пять раз в течение дня следующим образом: 1 утренняя
проба (6 человек), 2 утренняя проба (6 человек), проба до водной нагрузки (6 человек), через 30
минут после водной нагрузки 1 литром воды (6 человек) и 24 часовая фракция (6 человек).
Образцы первой фракции были собраны на 0 и 7 день эксперимента. Методом 1-D LC/MS было
идентифицировано 97, 86, 112, 99, и 92 белков в объединенных пробах, соответственно.
Общими, обнаруженными во всех фракциях, были 42 белка, что соответствовало в среднем
88,7% от каждого образца. Шесть пар первых утренних проб мочи (пул образцов мужчин и
женщин) собранных в 0 и 7 было также проанализировано; в них удалось идентифицировать, в
общей сложности, 99/97, 118/97, 97/98, 158/184, 111/94 и 174/207 белков соответственно.
Общими при этом оказались 68,98% белков, которые появились в обоих парных образцах и
89,15% во всех шести парах образцов. Эти результаты свидетельствуют о том, что при
исследовании между днями, число общих белков было стабильным. Для определения
межиндивидуальных различий, авторы сравнивали все пары мужских и женских образцов
среди шести пар образцов. Сравнительный анализ проб мужчин и женщин показал 58,84%,
общей области, что было ниже, чем между днями (внутри-индивидуальная вариабельность).
Межиндивидуальных различий в протеоме мочи было больше, чем внутрииндивидуальных, что
согласуется с опубликованными ранее результатами исследований [Khan A., Packer N.H., 2006].
Во всех 12 образцах, в общей сложности 26 белков оказались общими. При сравнении 6 пар
мужских и 6 пар женских образцов мочи идентифицировалось 228 и 314 белков соответственно,
пересечение составило 62%, 168 белков были общими, дифференциальный анализ определил 11
гендерно-специфических белков. Результат сравнения объединенных ииндивидуальных
образцов показал, что пул образцов несколько уменьшает численность некоторых белков по
сравнению с анализом индивидуального образца. Авторы сделали вывод о том, что существует
постоянно присутствующий, стабильный уровень белков в моче на различных временных
точках и у разных людей, любые значительные количественные и качественные изменения этих
42
стабильных белков означают, что такие белки могут служить в качестве потенциальных
биомаркеров. Так, среди 42 общих белков найденных в 5 объединенных образцах мочи, 12, по
подтвержденным данным, связаны с 25 известными заболеваниями. Объединение образцов
может устранить меж-индивидуальные различия, увеличивая количество общих белков и
уменьшая число отдельных специфических [Sun W. et al., 2009]. В работе Nagaraj и Mann
изучалась вторая фракция мочи семи человек в течение трех дней. Добровольцами были пять
мужчин и две женщины разных национальностей, здоровые, в возрасте от 25 до 35 лет.
Авторами был проведен троекратный анализ каждого из 21образцов мочи, что составило в
общей сложности 63 LC-MS/MS экспериментов. Всего было идентифицировано 808 белков, в
среднем
по
6
пептидам
внутриндивидуальная
каждый,
техническая
- 45% и межиндивидуальная
вариабельность
была
ниже
8%,
- 47%. Выделено 20 наиболее
представленных белков «основного» протеома мочи. Почти все они являлись гликопротеинами
[Nagaraj N., Mann M., 2011]. В работе Marimuthu с коллегами, методом 1DLC/MS/MS, в моче
здоровых лиц было идентифицировано 1823 белка с менее, чем 1% ложно-положительных
результатов, при этом, об идентификации 671 белка ранее не сообщалось [Marimuthu A. et al.,
2011]. База данных по белкам мочи здорового человека неуклонно пополняется. В настоящее
время считается, что в моче содержатся свыше 3500 [Court M. et al., 2011] и даже – свыше 5 800
белков и их фрагментов, которые могут быть идентифицированы [Nagaraj N. et al., 2012].
Создание баз данных по протеому мочи различных клинических групп находится в
фокусе внимания многих научных коллективов во всем мире [He J.C., Chuang P.Y., Ma'ayan A.,
Iyengar R., 2012]. Состав мочи хорошо коррелирует с этиопатогенезом большого числа
заболеваний, являясь полезным диагностическим источником клинической протеомики
[Mischak H. et al., 2009]. Образно выражаясь, моча является "золотым рудником " для поиска
биомаркеров [Zoidakis J. et al., 2012]. Благодаря разным путям проникновения белка в конечную
мочу, существует возможность обнаружения белковых маркеров в моче, характерных как для
заболеваний почек и мочевыделительной системы, так и для болезней системного характера.
Существует несколько источников белка в моче и поэтому белки мочи условно
подразделяют на три типа:
- преренальные белки – они поступают в мочу в ходе процесса ультрафильтрации из
плазмы крови, составляя 30% от всех белков мочи [Hiemstra T.F. et al., 2011];
- почечные или ренальные белки – попадают в мочу по ходу её прохождения по
нефрону и собирательным трубкам;
- постренальные – они поступают в мочу из эпителия стенок почечных лоханок,
мочеточников и мочевого пузыря, составляя 70% от всех белков мочи [Hiemstra T.F. et al.,
2011].
43
Поскольку часть протеомов крови и мочи является общей [Marimuthu A. et al., 2011],
концентрация белка в моче и белковый состав мочи непосредственно отражают не только
изменения функций почек и мочеполовой системы, но и практически всех других органов и
систем организма [Mischak H. et al., 2009]. Тем не менее, несмотря на технический прогресс в
методах хромато-масс-спектрометрии, вклад протеомики в клиническую практику по-прежнему
скромный [Albalat A., Mischak H., Mulle W., 2011].
Протеомные исследования биомаркеров условно состоят из 4-х основных этапов:
1) подготовки проб (например, экстракция белка);
2) полуколичественного анализа;
3) анализа данных;
4) валидации находок.
Проверка специфичности и «чувствительности» выявления биомаркеров является одним
из шагов необходимых для успешной реализации в клинической практике [Ling X.B. et al.,
2010]. Как правило, для этого используетсяиммуноферментный анализ (ELISA), или вестернблот [Rodríguez-Suárez E., Siwy J., Zürbig P., Mischak H., 2013].
Масс-спектрометрия является центральным аналитическим методом для исследования
протеома мочи [Domon B., Aebersold R., 2006]. В связи со сложностью состава мочи,
фракционирование часто используется до MS-анализа. Общие подходы, используемые в
протеомике, на этапе разделения сложных белковых смесей включают: двумерный
электрофорез, жидкостную хроматографию и капиллярный электрофорез - в сочетании с
масспектрометрией [Rodriguez-Suarez E., Whetton A.D., 2013]. Первые исследования с
использованием 2-DE для определения состава белка в нормальной моче были выполнены в
1979 году [Anderson N.G., Anderson N.L., Tollaksen S.L., 1979]. Использование 2-DE
сократилось в настоящее время в связи с низкой пропускной способностью, широким
динамическим диапазоном сложных образцов, с присутствием гидрофобных белков [Alban A. et
al., 2003]. Последнее поколение масс-спектрометров, соединенных с высокоэффективными LC
системами, принесло лучшее разрешение, чувствительность и воспроизводимость при более
коротких сроках исследования. Тем не менее, для оценки молекулярных масс любого белка, 2DE еще используется. Для изучения протеома мочи методом прямого профилирования в
последние годы используется MALDI-MS [Fiedler G.M. et al., 2007; Molin L. et al., 2012].
Метод Label-free (безметковый метод количественного анализа) c LC–MS может быть
использован в поиске биомаркеров, однако, это дорогостоящая техника и требует высокого
уровня подготовленности исследователей для получения воспроизводимых и надежных
результатов [Rodríguez-Suárez E., Whetton A.D., 2013]. В настоящее время CE–МS
(капиллярный электрофорез в сочетании с масс-спектрометрией) успешно применяется для
44
идентификации пептидных биомаркеров в биологических жидкостях [Albalat A., Mischak H.,
Mullen W., 2011]. Недавно опубликованные исследования сравнения CE-MS и методов LC-MS
подчеркнули значимое различие между двумя системами; CE-МS охватывает более широкий
спектр пептидов и белков, показывает лучшую воспроизводимость [Mischak H., Vlahou A.,
Ioannidis J.P., 2013]. Огромное количество (свыше 20 000) списков белков, характерных для
отдельных заболеваний, содержится в открытых интернет-ресурсах [Coon B.G. et al., 2009].
Одной из сфер применения протеомных исследований мочи в клинике является диабет.
Диабет является хроническим метаболическим заболеванием, которое может привести к
развитию сердечно-сосудистых и почечных осложнений. Диабетическая нефропатия является
прогрессивным хронические заболевания почек, наблюдается у 40 % больных сахарным
диабетом. Раннее обнаружение диабетической нефропатии имеет большое значение, поскольку
помогает предотвратить или отсрочить необходимость почечной заместительной терапии
(трансплантации и гемодиализа), способствует улучшению обслуживания пациентов и снижает
общие затраты на лечение [Matsushita K. et al., 2010]. В настоящее время исследование
микроальбуминурии используется для ранней диагностики диабетической нефропатии. Тем не
менее, микроальбуминурия также наблюдается у практически здоровых людей, и, кроме того, у
1/3 пациентов, страдающих диабетом, развиваются хронические почечные заболевания и в
отсутствие альбуминурии [Thongboonkerd V., 2011]. Протеомные подходы обнаружения
биомаркеров диабетической нефропатии нашли широкие отзывы в последнее время. Так,
Rossing с соавт. описал панель из 65 биомаркеров диабетической нефропатией, кроме того, эта
панель позволяет определить пациентов, которые имели некоторые признаки диабетической
нефропатии в течение 3 лет. Данное исследование показывает, что анализ протеома мочи может
способствовать раннему выявлению диабетической нефропатии и дает прогностически-ценную
информацию [Rossing K. et al., 2008]. Alkhalaf c соавт. проверили специфичность этих 65
биомаркеров в «слепом» исследовании с участием когорты пациентов трех различных
европейских центров [Alkhalaf A. et al., 2010]. Результаты данного исследования позволили
установить, что фрагменты коллагена в моче могут быть биомаркерами для диабета,
вызванного поражением почек, а так же выявляться раньше, чем используемый в настоящее
время в качестве биомаркера альбумин. Good с соавт. подтвердили, что коллагеновые
фрагменты в моче являются устойчивым признаком диабетической нефропатии [Good D.M. et
al., 2010]. При исследовании больных сахарным диабетом (п=35), до наступления
макроальбуминурии, Zürbig с соавт. обнаружили коллагеновые фрагменты в протеоме мочи. По
мнению авторов, это позволяет неинвазивно оценить риск диабетической нефропатии на ранней
стадии заболевания [Zürbig P. et al., 2012], что подтверждается ранее полученными данными
[Kitsiou P.V. et al., 2003].
45
IgA-нефропатия является широко распространённым в мире заболеванием, постановка
диагноза которого связана, как правило, с болезненной и рискованной процедурой почечной
биопсии. Считается, что для оптимизации диагностики, до этой процедуры желательно
использовать неинвазивные биомаркеры. Julian с соавт. были собраны пробы мочи 207
здоровых добровольцев и 45 больных IgA нефропатией и 357 пациентов с другими видами
заболеваний почек. Статистический анализ протеома мочи позволил выявить 25 биомаркеров,
специфичных для IgA [Julian B.A. et al., 2007]. Rocchetti с соавт., с помощью 2-D электрофореза
c HPLC-ESI-MS/MS в моче определили, что очень низкие уровни экскреции кининогена в моче
действительно способны прогнозировать отсутствие клинического ответа на ангиотензинпревращающий фермент у больных IgA-нефропатией после 6-месячного наблюдения по
сравнению с 20 здоровыми пациентами [Rocchetti M.T. et al., 2008].
Системные
васкулиты
(болезнь
Кавасаки)
–
это
группа
заболеваний,
которая
характеризуется воспалением стенок кровеносных сосудов. Используя протеомные методы
анализа биологических жидкостей (крови и мочи) у 236 больных Kentsis с соавт. предложили
филамин С и меприн А в качестве маркеров данного заболевания [Kentsis A. et al., 2013].
Применение капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией, позволило
Haubitz с соавт. в образцах мочи пациентов с васкулитом, по сравнению со здоровыми
волонтерами, определить 113 потенциальных биомаркеров, 58 из которых были детально
исследованы. В течение 6 месяцев 10 пациентов с активной формой заболевания лечили
иммуносупрессивной терапией, что привело к улучшению функции почек и изменению
протеомной композиции 47 белков. Эти результаты, по мнению авторов, позволяют быстро
идентифицировать пациентов с системными васкулитами, с указанием почечных рецидивов, а
также мониторировать ход текущего заболевания [Haubitz M. et al., 2009].
Мочекаменной болезнью страдают около 10% населения, риск рецидива в течение 10-лет
составляет 74% [Stamatelou K.K. et al., 2003]. Эпидемиологические исследования показали связь
данного заболевания с диетой, потреблением жидкости и ожирением [Asplin J.R., 2009],
которые влияют как на функцию почек, так и на мочевыводящие пути. По мнению Wright с
соавт., церулоплазмин является хорошим маркером мочекаменной болезни, что было
подтверждено контрольными результатами ELISA [Wright C.A. et al., 2011].
Одним из основных направлений исследований по выявлению мочевых биомаркеров,
являются оценки осложнений, связанные с отторжением трансплантата почек. Методы
протеомики позволяют выявить маркеры повреждения [Calabuig A.S., Guirado L., Ramos D.,
2012]. Schaub с соавт. выявили фрагменты β -2 -микроглобулина, коррелирующие с острым
почечным отторжением трансплантата [Schaub S. et al., 2004]. Используя методы протеомики,
LC-MS/MS и ELISA в моче 92 здоровых добровольцев, а также пациентов с почечным
46
отторжением и стабильных пациентов, Sigdel с соавт. выявили в моче в общей сложности 1446
белков. Авторы определили изменения в ряде белков, связанных с отторжением, к ним
относятся антигены гистосовместимости, каскады комплемента и внеклеточные матричные
белки [Sigdel T.K. et al., 2010].
При обструкции лоханочно-мочеточникового сегмента, часто обнаруживаемого у
новорожденных детей, использование неинвазивных диагностических и / или прогностических
процедур является весьма желательным [Thornhill B.A. et al., 2005]. Drube с соавт. у 19 детей
меньше 1 года, капиллярным электрофорезом с использованием масс-спектрометрией,
предсказал обструкцию с чувствительностью 83%, специфичность составила 92%. У более
взрослых пациентов чувствительность снизилась до 20% и специфичность до 66% [Caubet C. et
al., 2010]. Bandin с коллегами исследовали протеом мочи 42 пациентов с лоханочно-мочеточной
обструкцией через 5 лет после операции, другую группу составили пациенты без операции,
которых также обследовали через 5 лет и третью группу, составила контрольная группа.
Группа, подвергавшаяся хирургическому воздействию, оказалась наиболее близкой к
контрольной, чем пациенты без операции. Авторы работы рекомендовали долгосрочные
исследования протеома мочи пациентов с лоханочно-мочеточниковой обструкцией, особенно
тех, кто не подвергался оперативному вмешательству [Bandin F. et al., 2012].
Рак мочевого пузыря является одним из наиболее распространенных карцином
мочевыводящих
путей
и,
по
оценкам,
четвертым
по
распространенности
среди
злокачественных опухолей у мужчин и восьмым среди наиболее распространенных
заболеваний у женщин в США [Chavan S. et al., 2008]. Основным результатом исследования,
проведенного Zoidakis с соавт., при сравнеии пулов образцов с инвазивным и неинвазивным
раком мочевого пузыря, методом афинной хроматографии с 1D-SDS-PAGE и тандемной MS,
является обнаружение профилина 1, как потенциального биомаркера рака мочевого пузыря
[Zoidakis J. et al., 2012]. В работе Chenс коллегами, используя капиллярный электрофорез с
масс-спектрометрией, определена панель из 33 белков, специфических для уротелиальной
карциномы. С помощью технологии iTRAQ, подтвержденным Вестерн-блотом, Chen с
коллегами определили, что уровни аполипопротеина A-I (APOA1), аполипопротеина А-II,
предшественника гепарина кофактора 2 и пероксиредоксина - 2 были значительно выше в
образцах больных раком мочевого пузыря, по сравнению с контрольными образцами [Chen Y.T.
et al., 2010]. Orenes-Piñero c соавт. сообщили об определении белка1-альфа в качестве
потенциального мочевого биомаркера рака мочевого пузыря методом 2D-DIGE с массспектрометрией [Orenes-Piñero E. et al., 2007]. Используя 2D-гель электрофорез с массспектрометрией, Gc-глобулин был определен в качестве потенциального мочевого биомаркера
для раннего выявления и мониторинга течения рака мочевого пузыря [Li F. et al., 2012]. В
47
исследовании, с участием IMAC фракционирования мочи, Zoidakis с соавт., определили
профилин-1 в качестве биомаркера для рака мочевого пузыря, что было подтверждено
результатами иммуногистохимии [Zoidakis J. et al., 2012]. В настоящее время существует
европейский исследовательский проект BCMolMed, в котором уделяется особое место
применению
возможностей
современных
методов
протеомики
и
биоинформатики
к
клиническим исследованиям. В частности, исследования проводятся с целью идентификации
биомаркеров и молекулярных детерминант рецидива рака мочевого пузыря [Vlahou A., 2011;
Ok B.G., Ji Y.S., Ko Y.H., Song P.H., 2014].
Рак предстательной железы занимает третье место среди онкологических заболеваний у
мужчин. Greene с соавт. пришли к выводу, что "средний" больной - это мужчина в возрасте 65
лет, с избыточным весом, с образованием на уровне колледжа, и, при этом, имеет от 1 до 2
сопутствующих заболевания [Greene K.L. et al., 2005]. Идентификация чувствительных и
специфичных биомаркеров рака предстательной железы – предмет интенсивных исследований
в течение последних 15 лет. Пилотное исследование Theodorescu с коллегами, выполненное в
2005 году, с использованием капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией,
позволило описать одиночные и панель полипептидов, специфичных для рака простаты в
образцах мочи человека [Theodorescu D. et al., 2005]. В 2008 году эта же группа авторов
сообщила об идентификации панели 12 новых биомаркеров рака предстательной железы,
используя CE сочетании MS [Theodorescu D. et al., 2008]. Использование протеомных методов
исследования мочи, перед выполнением диагностической биопсии для обнаружения рака
предстательной железы, по мнению Schiffer с соавт., позволит сократить количество
необходимых биопсий приблизительно 50%, а стоимость медицинского обслуживания на 20%
[Schiffer E. et al., 2012]. Если этот подход будет реализован в системе общественного
здравоохранения, снижение финансового бремени и числа инвазивных вмешательств будет
существенным, а определение протеомных биомаркеров может войти в клиническую практику
[Rodríguez-Suárez E. et al., 2013; Dijkstra S., Mulders P.F., Schalken J.A., 2014].
Ишемическая болезнь сердца является одной из ведущих причин смертности во всем
мире. К классическим факторам риска сердечнососудистых заболеваний относят: высокое
кровяное давление, диабет и курение, однако, многие люди с ишемической болезнью сердца
имеют только один, или не одного из классических факторов риска [Gerszten R.E., Wang T.J.,
2008]. По мнению Herder и Rodríguez-Suárez с соавт. интегрированные подходы, сочетающие
биомаркеры от геномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики, а также серийные
измерения
биомаркеров,
могут
показать
потенциальную
клиническую
полезность
прогнозирования риска кардиометаболических заболеваний [Herder C., Karakas M., Koenig W.,
2011; Rodríguez-Suárez E. et al., 2013]. Хотя выявлены некоторые диагностические биомаркеры
48
инфаркта миокарда, такие как тропонин итропонин Т, а для сердечной недостаточности мозговой натрийуретического пептид [Gerszten R.E., Wang T.J., 2008], выявление биомаркеров
для ранней диагностики и прогноза будет представлять собой существенный шаг вперед.
Аналогично диабетической нефропатии, фрагменты коллагена были определены, методами
капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией (CE-MS), в качестве
биомаркеров для диагностики ишемической болезни сердца [von Zur Muhlen C. et al., 2009]. В
работе Delles с соавт. изучался протеом мочи 623 лиц, 448 из которых страдала с ишемической
болезнью сердца, а 138 были здоровы. В результате исследования была создана панель
специфических для данного заболевания полипептидов, которая включала в себя: фрагменты
альфа-1- антитрипсина, коллагены типов 1 и 3 типов, гранин, мембранно-связанный рецептор
компонента 1 прогестерона. Авторы отметили изменения протеомного профиля после лечения
ирбесартаном, который используется для лечения гипертензии, в сторону здоровой
композиции. В выводах данной работы отмечено, что протеомные методы способны
идентифицировать белки мочи больных с ишемической болезнью сердца с высокой степенью
достоверности, а также могут быть полезны для мониторинга терапии [Delles C. et al., 2010].
Известно, что в развитых странах около 2% взрослого населения страдают от сердечной
недостаточности, а среди лиц старше 65 лет до 6-10% [Dickstein K. et al., 2008], раннее начало
которой обнаруживается не сразу. Для выявления потенциальных мочевых биомаркеров
диастолической дисфункции левого желудочка, Kuznetsova с соавторами применили метод
капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией при сравнении протеомной
композиции мочи 19 пациентов и 19 здоровых людей. Значительные отличия отмечались по 85
пептидам, 32 из них были подтверждены полимеразной цепной реакцией. Связанными с
дисфункцией левого желудочка оказались несколько фрагментов коллагена 1 и 5, фрагмент
коллагена 3 [Kuznetsova T., Mischak H., Mullen W., Staessen J.A., 2012]. Эти результаты
согласуются с данными, полученными в моделях старения сердца на животных, в которых было
отмечено снижение протеолитической активности и деградации коллагена I [Annoni G. et al.,
1998].
Инсульт является четвертой по значимости причиной смертности и одной из ведущих – по
инвалидности [Minino A.M., Murphy S.L., Xu J., Kochanek K.D. 2011]. Данное заболевание
поражает как молодого, так и пожилого человека, поэтому своевременная диагностика данного
заболевания важна. В работе Dawson исследовали протеом мочи 69 пациентов с инсультом и 33
здоровых добровольцев. Использовали капиллярный электрофорез, соединенный с время пролетной масс-спектрометрией. Кандидаты в биомаркеры были секвенированы методом
жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрией. Авторы определили ряд
пептидов, играющих роль в патофизиологии острого ишемического инсульта. К ним относятся:
49
интер-альфа ингибитор тяжелой цепи H4 [Dawson J. et al., 2012], что было показано также
другими группами при исследовании крови [Rodríguez-Suárez E., Siwy J., Zürbig P., Mischak H.,
2013].
Диагностика аппендицита остается серьезной проблемой, и усовершенствование методов
отличия аппендицита от других расстройств, имитирующих это состояние, крайне необходимы.
В работе Kentsis с соавт. было выявлено 57 кандидатов-маркеров в образцах мочи, собранных у
67 больных, средний возраст которых составил 11 лет. Как показали авторы, диагностическую
эффективность имели калгранилин А, орозомукоид и богатый лейцином альфа-2-гликопротеин
(LRG), повышенные уровни которого коррелируют с гистологическими исследованиями
[Kentsis A. et al., 2010]. Разработанная Kentsis с соавт. панель биомаркеров, а не один
биомаркер, для определения аппендицита, методом SRM, превосходит ELISA в диагностике
заболевания [Rodríguez-Suárez E., Whetton A.D., 2013].
1.9. Феноменология изменений в организме человека при действии реальных и
моделируемых на Земле факторов космического полета
1.9.1. Длительные космические полеты
Установлено, что условия космического полета (КП) приводят к изменениям состояния
многих физиологических систем организма человека [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин
Ю.В., 1980; Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998; Оганов В.С., 2003; Convertino
V.A., 2002]. Несмотря на имеющиеся технические возможности исследования дальнего
космоса, влияние микрогравитации на организм человека остается серьезным барьером участия
человека в сверхдлительных космических полетах [Symons T.B., Sheffield-Moore M., Chinkes
D.L., 2009; Di Giulio C., 2013]. Невесомость вынуждает организм искать новый адекватный
уровень функционирования основных жизненно важных систем. Особенно велика роль
механизмов регуляции физиологических функций, которые осуществляют поиск этого нового
уровня и настройку на него систем организма [Баевский Р.М. с соавт., 2013].
Известно, что к специфическим изменениям, регистрируемым после длительных КП
относятся:
детренированность
сердечно-сосудистой
системы,
вестибуло-вегетативная
дисфункция, деминерализация костной ткани, перестройка систем транспорта воды и ионов в
почке, атрофия мышц, утомление и другие [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980;
Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998; Оганов В.С., 2003; Корнилова Л.Н. с соавт.,
2006; Kozlovskaya I.B. et al., 1988]. В результате устанавливаются адекватные взаимоотношения
организма и окружающей среды, определяемые некоторыми специалистами как результат
«неупотребления», «разгрузки», детренированности [Ильин Е.А., Капланский А.С., 1998;
Nicogossian A.E., 1994].
50
Основное звено в механизме влияния невесомости состоит в устранении веса тела и, как
следствие, гравитационно-обусловленных деформаций структур тела человека, в первую
очередь, ведущих гравиорецепторов [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1990].
Успех адаптации организма к условиям невесомости в значительной мере обусловлен
адекватностью реакции сердечно-сосудистой системы и ее регуляторных механизмов.
Конечным результатом деятельности данной системы является достижение заданного уровня
функционирования целостного организма, поскольку система кровообращения обеспечивает
организм энергией и метаболическими ресурсами (транспорт кислорода и питательных
веществ). Перераспределение жидких сред в верхнюю часть тела, ведущее к увеличению
объема крови в легочном сосудистом русле и в сосудах головного мозга, уже на начальном
этапе КП запускает реорганизацию деятельности сердца и вызывает изменения в гемодинамике.
Для сохранения гомеостаза в условиях длительного космического полета регуляторные
механизмы данной системы постоянно «ищут» оптимальное соотношение между работой
сердечного насоса и сосудистым тонусом [Баевский Р.М. и др., 2000; Агаджанян Н.А., Баевский
Р.М., Берсенева А.П., 2006]. Показано, что изменения объема наполнения левого желудочка
сердца и резистентности почечной артерии в длительных космических полетах отражают
степень гиповолемии с коэффициентом корреляции r = 0,95. Результаты тестов с воздействием
отрицательного давления на нижнюю половину тела (ОДНТ), проведенные у 15 космонавтов в
различные периоды длительных полетов, в большинстве случаев коррелировали с динамикой
гидратационного статуса с r = 0,9-1, что обосновывает вывод о главенстве изменений состояния
жидкостных сред организма в развитии ортостатических нарушений [Фомина Г.А., Котовская
А.Р., 2008]. Выявлено, что во время длительных космических полетов изменяется ударный
объем сердца, снижается частота сердечных сокращений (ЧСС) [Hughson R.L., 2009],
перестраивается фазовая структура сердечного цикла (укорочение изометрического сокращения
и расслабления, уменьшение периода изгнания и фазы быстрого наполнения левого желудочка)
[Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1997]. Перераспределение жидких сред организма, как вдоль оси
тела, так и между отдельными водными пространствами организма, которое развивается
вследствие устранения гидростатической составляющей давления крови, является одной из
основных причин изменений в интегративных функциях организма, таких как физическая
работоспособность, ортостатическая и вестибуло-вегетативная устойчивость [Газенко О.Г.,
Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1986; Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Носков
В.Б., 2001; 2013]. На экскреторную функцию почек и почечную гемодинамику невесомость
воздействует в сложной, двухфазной динамике. Во время начальной фазы космического полёта
(1-2 дня) различные нейрональные и гуморальные механизмы могут становиться главными в
смягчении эффектов повышенного центрального объёма крови, что проявляется в виде
51
увеличения скорости клубочковой фильтрации. Во второй, адаптивной фазе почечная
гемодинамика достигает нового устойчивого уровня равновесия [Григорьев А.И., Ларина И.М.,
Носков В.Б., 2006; Носков В.Б., 2013; Leach Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin Yu.V., 1998;
Norsk P., еt al., 2000; Drummer C., еt al., 2000].
Известно, что во время длительного космического полета происходит снижение
сократительных
свойств
(перестраиваются)
мышц,
механизмы
выносливости,
работоспособности,
метаболорефлекторной
регуляции.
изменяются
Уменьшение
функциональных возможностей мышечной системы в условиях невесомости до сих пор
является
одной
из
основных
медицинских
проблем,
препятствующих
длительному
космическому полету [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Огнева И. В., и
др., 2011; Kozlovskaya I.B. et al., 1988; McDonald K.S., Fitts R.H., 1995; Kachaeva E.V., Shenkman
B.S., 2012]. Моделируемая и реальная гравитационная разгрузка у человека и у лабораторных
животных вызывает мышечную атрофию (за счет активации систем протеолиза цитоскелетных
белков (десмина, титина), особенно медленных мышц-разгибателей (например, m.soleus)
[Григорьев А.И., Шенкман Б.С., 2008; Fitts R.H., Riley D.R., Widrick J.J., 2001; Tesch P.A., von
Walden F., Gustafsson T. et al., 2008].
Нарушение минерального обмена костной ткани является одной из важнейших проблем, с
которой сталкивается человек в условиях длительного космического полета [Григорьев А.И.,
Воложин А.И., Ступаков Г.П., 1994; Оганов B.C., 2003; Оганов В.С. с соавт., 2011]. Процесс
адаптации костной ткани к условиям микрогравитации выражается в замедлении ее
ремоделирования [Vico L., Lafage-Proust M.H., Alexandre C., 1998; David V. et al., 2006],
сопровождается изменением кинетики кальция [Grigoriev A.I., Larina I.M., Morukov B.V., 1999;
Heer M. et al., 1999; Smith S. et al., 2005] и отклонением уровня биохимических маркеров
метаболизма [Morukov B.V., Nichiporuk I.A., Tret'iakov V.S., Larina I.M., 2005].
Космический полет предъявляет к организму человека требования высокой устойчивости
к стрессорным воздействиям [Григорьев А.И., Баевский Р.М., 2007]. Процессы перекисного
окисления липидов имеют универсальный характер, являются показателями стабильности
гомеостаза [Михайлов И.Б., 2006], их активность в клетке контролируется благодаря
многоуровневой антиоксидантной системе защиты [Барабой В.А., 2006]. Повышение
продукции уровня активных форм кислорода (АФК) вызывает не только повреждение
мембранных структур клеток, а также является стимулом для индукции защитных систем
организма [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007; Kietzmann T., Fandrey J., Acker H., 2000].
АФК играют важную роль на начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая
является многокомпонентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила
название редокс-сигнализации по начальному звену, чувствительному к изменению активности
52
свободнорадикального окисления [Скулачев В.П., 2001; Semenza G.L., 1999; Chandel N.S.,
Vander Heiden M.G. et al., 2000]. Одним из важных следствий инициации редокс-сигнализации и
АФК-опосредованной передачи сигнала, является активация ядерных факторов транскрипции,
которые вызывают активацию транскрипции генов, кодирующих компоненты различных
защитных систем - антиоксидантную систему клеток, простагландины, а также систему белков
срочного ответа, которые могут синтезироваться при гипоксии и реоксигенации, гипероксии,
действии окислителей [Peng J., Jones G.L., Watson K., 2000]. Показано, что 28-суточное
антиортостатическое вывешивание вызывает в тканях головного мозга крыс повышение уровня
маркеров окислительного стресса [Chen H.L. et al., 2009]. В печени крыс 72-часовая
гипокинезия снижает синтез ферментов антиоксидантной защиты, при этом одновременно
повышается чувствительность мембранных структур к воздействию активных форм кислорода;
в сердце происходит частичная компенсация повышенного уровня активных форм кислорода за
счет активации защитных систем [Сазонтова Т.Г., Анчишкина Н.А., Архипенко Ю.В., 2007]. У
мышей, доставленных на Землю после 13-дневной миссии Шаттла (STS-118) было отмечено
увеличение активности экспрессии генов, ответственных за подавление активных форм
кислорода [Baqai F.P. et al., 2009]. После длительных полетов у космонавтов обнаруживаются
признаки
ингибирования
процесса
перекисного
окисления
липидов:
так,
снижается
концентрация диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, а также достоверно растет
уровень липидного антиоксиданта - токоферола. Также на первые сутки после КП наблюдается
тенденция к повышению концентрации конечного продукта липопероксидации - шиффовых
оснований и снижение общей антиоксидантной активности, впрочем, нивелирующиеся
достаточно быстро [Маркин А.А., Журавлева О.А., 2001; Моруков Б.В. с соавт., 2011; Stein T.P.,
2002]. Показано, что 14 суточный космический полет не оказывает значимого влияния на
механизмы свободно-радикального окисления липидов и
функционирование системы
антиоксидантной защиты [Zhuravleva O.A., 2011].
Длительное пребывание человека в полете на околоземной орбите сопровождается
изменением целого ряда показателей, характеризующих различные стороны обмена веществ. В
космическом полете интенсивность энергетического обмена снижается, о чем свидетельствует
уменьшение активности малатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы в крови [Попова И.А.,
Ветрова Е.Г., Рустамьян Л.А., 1991]. В этих условиях отмечалось увеличение концентрации
глюкозы, холестерина, триглицеридов, мочевины, мочевой кислоты, лактата в крови и
повышение активностей лактатдегидрогеназы и амилазы. Подобные сдвиги биохимического
состава крови подтверждают активацию катаболических процессов в мышечной ткани
[Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Григорьев А.И., Шенкман Б.С., 2008] и
свидетельствуют о развитии в условиях микрогравитации функциональных изменений в
53
деятельности ряда органов и систем организма. После длительных полетов наблюдается
увеличение прокоагулянтного и снижение фибринолитического потенциала [Кузичкин Д.С.,
2010], достоверное укорочение активированного парциального тромбопластинового времени на
24,9%, что может быть обусловлено активацией калликреин-кининовой и симпато-адреналовой
систем на заключительных этапах полета [Лич К., 1997]. Известно, что калликреин [Баркаган
З.С., Момот А.П., 2008] и адреналин [Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2002] являются
активаторами XII фактора, инициирующего свертывание по внутреннему пути. Независимо от
продолжительности полета концентрация фибриногена значительно увеличивалась, отмечалось
снижение антитромбина 3 (ATIII), наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации
плазминогена [Kuzichkin D.S., MarkinA.A., Morukov B.V., 2010].
Известно, что на первые сутки после полета, как правило, наблюдалась умеренная
гипокалиемия и повышенная активность ионизированного кальция, при этом выраженность
этих сдвигов не зависела от продолжительности космического полета [Носков В.Б., 2001; 2013].
В этот период нередко отмечалась гипернатриемия, повышение концентрации общего белка в
крови и высокий гематокрит, что на фоне увеличенного водопотребления и сниженной
экскреции осмотически активных веществ свидетельствовало о сохраняющемся дефиците
объема циркулирующей плазмы и гипогидратации организма [Газенко О.Г., Григорьев А.И.,
Наточин Ю. В., 1986; Носков В.Б. 2001, 2013; Vorobiev D. et al., 1995; Grigoriev A.I., Noskov
V.B., Larina I.M., 2009]. Адаптивные реакции были направлены на восполнение потерь
внеклеточной жидкости и минеральных веществ, которые необходимы для формирования
земного типа водно-солевого гомеостаза [Моруков Б.В., Носков В.Б., Ларина И.М., Наточин
Ю.В.,
2003].
Исследования
регуляторных
реакций
показали,
что
после
окончания
продолжительных космических полетов выявляются: активация ренин-альдостероновой
системы,
снижение
эффективности
действия
антидиуретического
гормона,
дисбаланс
простагландинов прессорного/депрессорного класса [Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков
В.Б., 2006]. Содержание волюморегулирующих гормонов в плазме крови в этот период
увеличивается, что вызывает снижение почечной экскреции осмотически активных веществ и
положительный водный баланс, способствующий увеличению объема плазмы и ликвидации
дефицита массы тела. Известно, что у космонавтов после длительных КП экскреция с мочой и
уровень в плазме кортизола резко увеличивается [Ларина И.М., 2001; Stowe R.P., Sams C.F.,
Pierson D.L., 2011].
Известно, что системы иммунитета, гемостаза обмена липидов тесно связаны друг с
другом [Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К., Алборов Р.Г., 2003; Кузник Б.И., 2010].
Стресс, который испытывают космонавты во время приземления (т.е. острая фаза
реадаптации к условиям земной гравитации), может вносить существенный вклад в ослабление
54
функции иммунокомпетентных клеток. По всей видимости, эти изменения являются
результатом действия совокупности многих факторов, включая нейропептидные гормоны,
катехоламины (в особенности глюкокортикоиды) и другие [Stowe R.P., Sams C.F., Pierson D.L.,
2003]. Существенным изменениям в условиях космического полета подвергается клеточный
иммунитет человека, ответственность за который несут Т-лимфоциты. Исследования,
проведенные после длительных космических полетов, позволили выявить ряд закономерностей
в изменениях Т-системы иммунитета [Константинова И.В., 1988; Konstantinova I.V. et al., 1991].
Так, функциональная активность Т-лимфоцитов снижалась. У части космонавтов отмечали
также снижение количества этих клеток в периферической крови [Рыкова М.П., Антропова
E.H., Мешков Д.О., 2001]. Эксперименты in vitro подтвердили, что микрогравитация может
сама по себе изменять функциональный статус Т-клеток, нарушая проведение сигнала и
ремоделируя цитоскелет [Lewis M.L. et al., 1998].
Адаптация системы иммунитета человека к условиям космического полета достигается
ценой значительного повышения напряженности ее функционирования на уровне системных
взаимоотношений иммунокомпетентных клеток. По мнению Рыковой, кратковременное
воздействие факторов космического полета ведет к интенсификации работы иммунной системы,
проявляющейся в повышении связанности ее компонентов. Длительное воздействие этих
факторов приводит к перенапряжению, а в дальнейшем и к истощению функциональных
резервов иммунной системы, проявляющемся в ослаблении связанности ее компонентов
[Рыкова М.П., 2013]. Под действием факторов гравитационной разгрузки происходят изменения
регуляции функций тромбоцитов [Li S. et al., 2010; Gawaz M., Vogel S., 2013]. Показано, что на
борту станции «МИР», в течение 15-месячной экспедиции, наблюдались изменения в системе
красной крови: снижение концентрации и изменение формы эритроцитов; снижение
гемоглобина и гематокрита; отклонения в метаболизме эритроцитов [Poliakov V.V. et al., 1998].
Завершающий этап полета является серьезным испытанием для человека после
предшествующего пребывания его в микрогравитации [Котовская А.Р., 2008]. Хорошо
известны механизмы неблагоприятных эффектов перегрузок, особенно при направлении +G z,
на организм космонавтов, в первую очередь на сердечно-сосудистую систему [Васильев П.В.,
Котовская А.Р., 1975]. Существует несколько основных аспектов влияния длительной
перегрузки на сердечно-сосудистую систему: местные сосудистые реакции на увеличение или
снижение гидростатического давления; рефлекторные реакции системы быстрой адаптации,
реализующие через синокаротидную и аортальную барорецептивные зоны; изменения
гемодинамики и биоэлектрической активности сердца; отставленные реакции гуморальных и
биохимических систем, связанные с вторичной дегидратацией и микроциркуляторными
расстройствами [Котовская А.Р., Вартбаронов Р.А., 1997]. При воздействии перегрузок
55
наблюдаются тахикардия, изменения центральной гемодинамики, регионального кровотока во
всех частях и органах (снижение ударного объёма крови, увеличение минутного кровотока,
увеличение общего и удельного периферического сопротивления сосудов, нарушения
сердечного ритма и др.). Переход от невесомости к нормальной силы тяжести на Земле
приводит к снижению сердечного выброса и сосудосуживающего резерва, что сказывается на
ортостатической устойчивости после КП [Fu Q., Witkowski S., Levine B.D., 2004]. Отмечено, что
сердечная мышечная масса уменьшается после полета, сократительная функция сердца может
быть так же изменена [Hughson R.L., 2009]. Восстановление ортостатической устойчивости
после длительных КП происходит медленнее, чем после кратковременных, что свидетельствует
о более глубоких изменениях в системе сосудистой регуляции [Фомина Г.А., Котовская А.Р.,
Почуев В.И., Жернавков А.Ф., 2008]. Результаты Vandeput показывают, что, несмотря на
довольно быстрое исчезновение симптомов ортостатической неустойчивости, сердечнососудистая система восстанавливается гораздо медленнее. Через 5 дней после возвращения из
коротких и длительных КП нервные механизмы регуляции сердечного ритма остаются
нарушенными. Частота сердечных сокращений восстанавливается практически полностью
после месяца автономного контроля [Vandeput S., Widjaja D., Aubert A.E., Van Huffel S., 2013].
После длительных КП нарушается динамическая цереброваскулярная ауторегуляция и
снижается цереброваскулярная реактивность [Zuj K.A. et al., 2012].
Нарушение минерального обмена костной ткани является одной из важнейших проблем, с
которой сталкивается человек в условиях длительного космического полета [Григорьев А.И.,
Воложин А.И., Ступаков Г.П., 1994; Оганов В.С., 2003]. Теоретически ожидаемые потери
костной массы в трабекулярных структурах костей нижней половины тела космонавтов в
процессе КП (длительностью 5-7 мес.) в отдельных случаях квалифицируются как обратимая
остеопения, и рассматриваются как проявление функциональной адаптации костной ткани. При
этом
показаны
высокая
индивидуальная
вариабельность
изменений
и
стабильность
индивидуального характера соотношения изменений костной массы в разных сегментах скелета
независимо от типа космических станций [Новиков В.Е., с соавт., 2010]. После длительных
космических полетов происходит снижение объемной минеральной плотности губчатого и
компактного вещества большеберцовой кости. В лучевой кости отмечается увеличение средней
объемной минеральной плотности и объемной минеральной плотности компактного вещества.
У большинства обследованных космонавтов в лучевой и большеберцовой кости снижается
число трабекул, увеличивается их толщина и степень неоднородности трабекулярной сети
[Простяков И.В., 2010]. Известно, что соотношение гормонов, регулирующих обмен кальция в
организме, изменялось после космических полетов. Так, на 1-ые сутки после длительного
пребывания в условиях микрогравитации в крови достоверно повышалось содержание
56
паратиреоидного гормона, и снижался уровень кальцитонина по сравнению с предполетными
данными. В ранний послеполетный период увеличивалась концентрация в крови остеокальцина
– пептида, являющегося маркером образования кости. Его содержание возрастало до 180% от
предполетного уровня на 14-ые сутки периода реадаптации, что, очевидно, связано с
активацией [Ларина И.М., 2001]. Динамика содержания биохимических маркеров метаболизма
костной ткани в сыворотке крови показывает, что уровень резорбции значительно повышается
как после коротких, так и после длительных КП и 90 суток восстановительного периода
сохраняется на повышенном уровне; увеличение уровня маркеров остеогенеза отмечается после
длительных КП и сохраняется и через 90 суток после приземления [Простяков И.В., 2010]
В послеполетный период наблюдалось изменение белкового, липидного, углеводного
обмена [Григорьев А.И. с соавт., 1986; Маркин А.А., Журавлева О.А., 2001]. Отмечалось
значительное увеличение активности креатинфосфокиназы за счет мышечного изофермента, что
связано, вероятно, с возобновлением гравитационных нагрузок. Тенденция к увеличению
активности
ключевых
ферментов
энергетического
метаболизма
(лактатдегидрогеназы,
малатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы) в течение 1-й недели периода восстановления
происходит вследствие повышения энерготрат организма в процессе реадаптации к земным
условиям [Журавлева О.А. с соавт., 2011]. Увеличение активности общей лактатдегидрогеназы по сравнению
с фоновыми значениями, возможно, связано с активностью ее сердечного изофермента,
активацией энергетического метаболизма в ответ на действие посадочных перегрузок и
возобновление гравитационных нагрузок на организм. Тенденция к гипергликемии, повышение
лактата и пирувата на первые сутки периода восстановления, отражает, вероятное включение
путей анаэробной утилизации глюкозы. Концентрация триглицеридов колебалась на уровне
дополетных значений. Отмечалась тенденция к увеличению активности трансаминаз, динамика
общего и прямого билирубина заметно понижалась по отношению к фоновым значениям,
повышалась костная щелочная фосфотаза, что возможно связано с активацией остеобластов при
возобновлении гравитационной нагрузки на костную ткань. Концентрация сывороточного
железа была понижена, что отражает, по мнению Ивановой последствия развития в ходе полета
эритроцитопенического синдрома [Иванова С.М., 2002], концентрация холестерина и его
фракций имела незначительную тенденцию к росту. После длительных экспедиций наблюдали
повышение содержания пепсина в крови и моче, что связано с развитием гиперсекреторного
состояния желудка, сопряженного с повышением в крови уровня гастрина [Афонин Б.В., 2001].
Также было показано увеличение в крови и моче концентрации амилазы и липазы, что
объясняется феноменом их «уклонения в кровь» из клеток поджелудочной железы [Смирнов
К.В., 1990]. Как уже было описано выше, на 1-ые сутки после завершения длительных
57
космических полетов возрастала концентрация инсулина в крови, что сопровождалось
одновременным повышением содержания С-пептида [Афонин Б.В., 2001].
Таким образом, хотя существует обширная литература, отражающая послеполетные
изменения в организме человека в острый период реадаптации, в том числе, и по составу
основных мажорных белков, биологически активных веществ белкового характера, ферментов,
однако про белки, которые формируют измененный протеом мочи, известно мало. В работе
Пахаруковой, при изучении протеомного профиля сыворотки крови, после длительных
космических полетов, обнаружены изменения, проявляющиеся в уменьшении пиков
аполипопротеина СI и β2-микроглобулина. Были выявлены сдвиги в содержании фрагментов
высокомолекулярного кининогена, С3 комплемента, интер-α-трипсинового ингибитора и
фибриногена, обусловленных интенсификацией ограниченного протеолиза в крови в период
реадаптации [Пахарукова Н.А., 2010]. Исследование протеомного профиля мочи космонавтов,
после продолжительных космических полетов на Международной Космической Станции
(МКС) позволило Образцовой определить группу из 15 белков мочи, которые в основном
выявлялись после полета, а также стабильную часть субпротеома, представленную 21 белками с
различной субклеточной локализацией и тканевой специфичностью [Образцова О.А., 2013].
Использование
протеомных
технологий
получения
данных
и
современных
биоинформационных подходов их анализа выявило в моче космонавтов и их дублёров 18
белков, происходящих из тканей почек и мочевыводящих путей [Киреев К.С., 2013]. При
сравнении с контрольной группой выявлено 3 белка (афамин, аминопептидаза А и аквапорин2), присутственность которых в моче, наиболее вероятно, связана с воздействием факторов КП
[Киреев К.С., 2013; Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013].
1.9.2. Адаптивные механизмы в условиях «cухой» иммерсии
«Сухая» иммерсия» (СИ) как экспериментальное воздействие на организм человека,
моделирующее некоторые эффекты невесомости, активно применяется в области космической
физиологии и медицины и является наиболее адекватной моделью определенных эффектов
невесомости. Время развития, степень и глубина структурных и функциональных изменений,
вызванных иммерсией в основных физиологических системах организма человека - наиболее
близки к таковым, происходящим в условиях реальной невесомости [Григорьев А.И., 1978;
Козловская И.Б., 2008; Томиловская Е.С., 2011]. При данной модели микрогравитации, тело
испытуемого погружено в воду в горизонтальном положении до уровня подмышечных впадин
при термонейтральной температуре. Специальная водоотталкивающая тканевая пленка
полностью изолирует тело от воды, окружает и закрывает его [Шульженко И.Б., Виль-Вильямс
И.Ф., 1976]. Согласно данным многочисленных исследований показано, что в «сухой»
58
иммерсии происходит уменьшение общей воды тела. Обжатие мышц нижних конечностей
иммерсионной средой, с уменьшением емкостных сосудов, обеспечивает повышенный
венозный возврат крови к сердцу, запускающий рефлекс Генри - Гауэра, что, в свою очередь
вызывает угнетение секреции антидиуретического гормона и альдостерона. Это приводит к
уменьшению реабсорбции воды и электролитов (Na+) в почке. Развивается диурез по типу
салуреза, на фоне ускоренного тока жидкости по канальцам нефрона [Григорьев А.И., 1978;
Hughson R.L. et al., 1994]. В экспериментах с «костюмной» и «сухой» иммерсией через
несколько часов после начала эксперимента обнаруживается снижение активности ренина
плазмы, концентрации альдостерона, антидиуретического гормона и ангиотензина II [Ларина
И.М., Суханов Ю.В., Лакота Н.Г., 1999]. Было выявлено, что в СИ наблюдается увеличение
скорости экскреции осмотически активных веществ (ОАВ), которое обеспечивается в большей
мере приростом скорости выведения жидкости, при снижении концентрации ОАВ в моче. В
эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией диурез превышал фоновую величину на 88%, в
7 суточной - на 70% [Носков В.Б., c соавт., 2011], что можно объяснить включением
волюморегулирующих рефлексов. Воздействие «сухой» иммерсии вызывает быструю потерю
жидкости и натрия, что увеличивает соотношение Na+/K+ в моче [Григорьев А.И., 1978; Ларина
И.М., Лакота Н.Г., 2002; Ларина И.М. с соавт., 2008]. Наблюдаемая при этом потеря веса тела
обусловлена снижением
уровня гидратированности
организма, наиболее
выраженные
изменения наблюдаются в первые сутки воздействия. Натрийуретические пептиды принимают
непосредственное участие в регуляции водно-электролитного баланса: так, предсердный (ANP)
и мозговой (BNP) натрийуретические пептиды представляют особый интерес в длительных
иммерсионных исследованиях, поскольку они высвобождаются из кардиомиоцитов в ответ на
растяжение и центральную гиперволемию [Yamamoto K., Burnett J.C.Jr., Redfield M.M., 1997]. В
сравнении с BNP, исследование NT-proBNP является более предпочтительным из-за его
большего времени полужизни в крови (90 минут), стабильности и высокой воспроизводимости
результатов анализа [Wu A.H. et al. 2003]. Увеличение уровня NT-proBNP во время периода
восстановления может отражать степень детренированности сердца после иммерсионного
воздействия [Ешманова А.К., 2009; Ларина И.М. с соавт., 2011].
Регуляторные и метаболические изменения, происходящие в «сухой» иммерсии,
отражаются на белковом составе жидкостей тела. Так, экскреция белка в 5 -суточной «сухой»
иммерсии не превышала пределы физиологической нормы [Воронцов А.Л. с соавт., 2011]. В
динамике эксперимента содержание белков, выявляемое электрофоретическим разделением,
относящихся к тубулярной фракции (с молекулярной массой менее 65 кДа) имело тенденцию к
снижению на 40%, при этом уровень экскреции альбумина повышался на 35 - 40%. По мнению
Воронцова с соавт., отмечалась ремодуляция тубулярной реабсорбции низкомолекулярных
59
белков и альбумина. Авторы заключают, что увеличение экскреции альбумина происходит
вследствие снижения реабсорбции в канальцах, а не за счет увеличения гломерулярной
проницаемости, поскольку изменений белков с молекулярной массой более 69 кДа, которые
представляют гломерулярную фракцию протеинов мочи, не наблюдалось. В крови уровень
иммуноглобулинов либо не изменялся, либо имел тенденцию к повышению, в моче уменьшался в ходе эксперимента, что, возможно, связано со снижением проницаемости
гломерулярного фильтра для высокомолекулярных белков [Воронцов А.Л. с соавт., 2011]. Так
же отмечалось стабильное повышение уровня белка Тамма-Хорсваля на 25% в ходе
эксперимента. В условиях 7-cуточной СИ регистрировалось развитие реакции «острой фазы»:
увеличивалось содержания интер-α-трипсинового ингибитора, α1-кислого гликопротеина,
церулоплазмина, гаптоглобина, α2-макроглобулина и уменьшение уровня аполипопротеина А
регистрируемое двумерным электрофорезом [Ларина О.Н., Беккер А.М., 2006]. Изучение
параметров гемостаза в условиях 7-суточной «сухой» иммерсии показало достоверное
увеличение активности антиплазмина на 3-ий день эксперимента. В 1-ый день периода
восстановления отмечено уменьшение антикоагулянтого звена гемостаза – снижение
активностей антитромбина III, плазминогена и протеина С [Kuzichkin D.S. et al., 2013].
Концентрации общего белка и альбумина в 7-суточной «сухой» иммерсии не изменялись
[Маркин А.А. с соавт., 2008], а активность креатинфосфокиназы, изоцитратдегидрогеназы,
лактатдегидрогеназы достоверно снижалась [Буравкова Л.Б., Ларина И.М., Попова И.А., 2003].
Отмечалась тенденция к повышению активности глутаматдегидрогеназы и щелочной
фосфатазы, сдвиги липидного обмена, в частности, увеличение уровня холестерина и его
атерогенной фракции [Маркин А.А. с соавт., 2008], наблюдаемые и в космических полетах
[Маркин А.А. с соавт., 2005]. В ходе 7-суточной СИ выявлена тенденция к снижению уровня
тиреотропного гормона и обнаружено достоверное снижение трииодтиронина на 3-и сутки
эксперимента и увеличение тироксина на 7-ые [Ларина И.М. с соавт., 2008].
Определена вариабельность показателей экскреции жидкости, электролитов и параметров
гормональной регуляции, отмечаемая в СИ, частично связана с различными условиями
испытаний
(температура
водной
среды,
потребление
жидкости,
соли).
Об
этом
свидетельствовали также и результаты, полученные ранее в экспериментах, в которых
предпринимались попытки стандартизировать температурные условия и позу обследуемого, а
также уровень потребления добровольцами натрия, жидкости и белка [Ларина И.М., 2000;
Ларина И.М., Лакота Н.Г., 2002].
Известно, что адаптация организма к условиям невесомости или моделируемому на Земле
характерному перераспределению жидкостных сред организма, в значительной степени связана
с реакциями сердечно-сосудистой системы, ее регуляторных механизмов [Григорьев А.И.,
60
Баевский Р.М., 2007; Mailet A. et al., 2000]. В иммерсии сжатие поверхностных тканей и сосудов
уменьшает
периферическую
сосудистую
емкость
и
вызывает
продолжительную
транскапиллярную реабсорбцию, приводящую к быстрому перераспределению циркулирующей
крови между регионами тела с относительной центральной гиперволемией. У добровольцев,
участвующих в испытаниях с "сухой" иммерсией, наблюдается существенное ограничение
двигательной активности и снижение тонуса скелетной мускулатуры [Григорьев А.И.,
Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004]. Эти изменения физиологических систем вызывают
сердечно-сосудистую дисфункцию [Iwase S., Sugiyama Y. et al., 2000]. Главные признаки этого
синдрома - тахикардия, снижение физической работоспособности и развитие ортостатической
неустойчивости. Как показали Bart с соавт., исследовавшие состояние сердечно-сосудистой
системы, барорефлекторной регуляции сердечного ритма у здоровых молодых людей в
условиях воздействия 1-часовой водной иммерсии, уже в первые минуты после начала
иммерсионного воздействия снижается частота пульса и растет ударный объем. Авторы
отметили, что в течение первых 20 минут условия иммерсии приводят к прогрессивному
снижению среднего систолического артериального давления (АД) и общего сосудистого
сопротивления [Bart V. et al., 2007].
При изменении положения тела с горизонтального в вертикальное (при ортопробе)
происходит перераспределение гидростатического давления в регионах тела; в верхней
половине тела оно снижается, а в нижней - повышается. При этом активно развивается процесс
компенсации
возмущения,
отражающий
функциональную
способность
системы
кровообращения. Он проявляется в увеличении ЧСС, повышении тонуса сосудистой стенки,
перераспределении объема циркулирующей крови. Эти реакции - снижение ударного (в
среднем на 20-40%) и минутного (в среднем на 8-22%) объемов сердца, увеличение ЧСС (в
среднем на 10-30 уд./мин.), среднего систолического АД (на 12 мм рт. ст.) и увеличение
диастолического АД (в среднем на 3-18 мм рт. ст.) - направлены на поддержание адекватного
уровня системного давления крови в изменившихся условиях [Аронов Д.М., Лупанов В.П.,
2009].
При моделировании эффектов микрогравитации на Земле снижение ортостатической
устойчивости развивается очень рано. Butler с соавт. регистрировали это снижение уже после 4х часов пребывания добровольцев в АНОГ [Butler G.C., Xing H.C., Hughson R.L., 1990].
Механизмы снижения ортостатической устойчивости в условиях микрогравитации и иммерсии
в настоящее время рассматриваются как многофакторный процесс. Обобщение результатов
многочисленных исследований выявило круг основных факторов, обусловливающих развитие
ортостатической неустойчивости: уменьшение объема внеклеточной жидкости и объема
циркулирующей
крови;
перераспределение
сосудистого
тонуса;
снижение
роли
61
периферического мышечного сердца по передвижению крови из артерий через капилляры в
вены;
снижение
эффективности
мышечной
помпы
в
гемоциркуляции;
повышение
растяжимости вен голени и уменьшение градиента давления в венозной системе большого
круга кровообращения;образование зоны свободной растяжимости вен (трансмуральное
давление снижается настолько, что вены вместо округлой приобретают эллипсоидную или
уплощенную форму); ослабление рефлекторных антигравитационных механизмов сердечнососудистой системы (ССС); изменение нейро-эндокринной регуляции циркуляторного
гомеостаза [Баевский Р.М., 2003; 2006; Морева Т.И., 2008; Фомина Г.А., Котовская А. Р., 2008;
Иванов Г.Г. с соавт., 2011; Nicogossian A.E. et al., 1994].
1.9.3. Антиортостатическая гипокинезия (АНОГ)
Гипокинезия является не только одной из моделей невесомости, ее можно считать
неизбежным спутником научно-технического прогресса, который сопровождается как
значительным снижением доли физического труда, так и характерным стилем жизни. Для
определенных категорий людей гиподинамия является профессиональной, а в некоторых
случаях - вынужденной (постельный режим) [Коваленко Е. А., Гуровский Н. Н., 1980; Оганов
В.С., 1998]. Антиортостатическая гипокинезия – это строгий постельный режим, при котором
положение наклона головы находится под различными углами ниже горизонтального
положения [Григорьев А.И., Ларина И.М., 2001; Михайлов В.М. 2001; Lathers C.M., Charles J.B.,
1994].
C увеличением продолжительности пилотируемых космических полетов, длительность
экспериментов по антиортостатическому воздействию на организм человека увеличивалась с
одного часа и более [Быстров В.В. с соавт. 1986; Butler G.C., Xing H.C., Hughson R.L., 1990],
далее – до суток [Frey M.A. et al. 1993], затем – до 5-7 суток [Шульженко Е.Б. с соавт., 1984].
Затем продолжительность антиортостатического воздействия возрастала до 30 суток [Федоров
Б.М., Стрельцова Е.Н., Себекина Т.В., 1985; Стажадзе Л.Л. с сотр., 1988], 120 суток [Лобачик
В.И. с сотр., 1989], и, наконец, до 370 суток [Григорьев А.И., Моруков Б.В., 1989]. Угол
наклона головного конца кровати обычно не превышал 10°-15°, чтобы избежать неприятных
ощущений, вызванных выраженным перераспределением крови и неудобством сохранения
этого положения на протяжении длительного периода времени [Шульженко Е.Б. с соавт., 1984].
Сопоставление результатов исследований в наземных модельных экспериментах
(гипокинезия, антиортостатическая гипокинезия или иммерсия) и исследований, выполненных
в реальных полетах, показали, что можно пользоваться наземной имитацией действия
отдельных факторов космического полета для изучения основных закономерностей и
характерных сдвигов водного и минерального метаболизма. Основными воздействующими
62
факторами при модельных экспериментах являются гиподинамия и перераспределение жидких
сред организма вдоль оси тела [Ларина И.М., Попова И.А, Михайлов В.М., Буравкова Л.Б.,
1999; Ларина И.М., 2000; Носков В.Б., 2013], важными следствиями чего являются
взаимообусловленные реакции со стороны различных систем организма. Было показано, что 8часовая АНОГ вызывает увеличение кровенаполнения головы и груди на 6-9% (P<0,05), по
сравнению с исходным горизонтальным положением. Дальнейшее пребывание в условиях
АНОГ сопровождается развитием компенсаторно-адаптивных реакций, характеризующихся,
главным образом, уменьшением общего объема циркулирующей плазмы на 317 мл (P<0,05) на
2-е сутки АНОГ и перемещением объемов крови из брюшной полости и нижних конечностей,
которое к 7 суткам АНОГ составило -11% и -23% (P<0,05) соответственно [Lobachik V.I.,
Abrosimov S.V., Zhidkov V.V., Endeka D.K., 1991]. Через неделю воздействие АНОГ приводит к
отрицательному балансу жидкости и электролитов, снижению концентраций общего белка и
альбумина [Ларина И.М., Суханов Ю.В, Лакота Н.Г., 1999; Ларина И.М., 2003]. В эксперименте
с 20-суточной АНОГ отмечалось снижение концентрации С-реактивного белка, причем в
группе с использованием профилактических мероприятий (физических упражнений) его
концентрация была ниже, чем в контрольной группе. Снижение уровня α-2-глобулинов
наблюдалось во время 370-суточной АНОГ, эта тенденция сохранялась и в период
восстановления. Вероятно, эти изменения связаны с нарушением синтеза плазматических
белков в печени [Ларина О.Н., 1992]. В ходе экспериментов с длительной гипокинезией (120суточная АНОГ с участием 25 мужчин, 370-суточная АНОГ с участием 9 мужчин) наблюдалось
повышение базальных уровней адренокортикотропного гормона, антидиуретического гормона,
активности ренина плазмы и активация синтеза кортикостероидов, более выраженная для
минералокортикоидов. Было показано снижение чувствительности почек к антидиуретическому
гормону в начале 3-го месяца АНОГ с последующим ее восстановлением к 300-м суткам
гипокинезии. Таким образом, в условиях длительной гипокинезии изменения показателей
гормонального статуса добровольцев характеризовались повышением активности гипоталамогипофизарно-надпочечниковой и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы с фазными
изменениями чувствительности органов-мишеней к циркулирующим гормонам [Воробьев Д.В.,
Ларина И.М., Гончарова А.Г., 1998]. В ходе 120-суточной АНОГ в сыворотке крови
увеличивалась концентрация предсердного натрийуретического пептида, который подавляет
активность различных звеньев ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Maillet A. et al.,
2000], однако была понижена в более кратковременных экспериментах – 28 [Maillet A. et al.,
1996] и 60 - суточной АНОГ [Custaud M.A. et al., 2005]. Изменение параметров циркадианных
ритмов соматотропина было отмечено в ходе 370-суточного эксперимента и снижение его
среднесуточной концентрации [Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999]. Изменялось содержание
63
гормонов, регулирующих обмен кальция как в ходе 120-суточной, так и 370-суточной АНОГ.
На 75-ые сутки экспериментов уровень паратиреоидного гормона был ниже фонового, а
концентрация кальцитонина повышалась [Ларина И.М., Моруков Б.В., Григорьев А.И., 1999;
Ларина И.М., 2003]. В тоже время, во время 24-часовой АНОГ содержание данных гормонов не
изменялось [Uchakin P.N. et al., 1998]. Уровни лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрасферазы,
аланинаминотрасферазы достоверно не отличались от фоновых значений в 7-суточном и 120суточном экспериментах у мужчин [Ветрова Е.Г., Дроздова Т.Е., Попова И.А., 1988; Попова
И.А. с соавт., 1988], но были повышены в ходе 370-суточной АНОГ [Попова И.А. с соавт.,
1989]. В течение периода восстановления все отклонившиеся параметры возвращались к
фоновым значениям. Показатели липидного обмена также изменялись в ходе АНОГ (120
суток): было показано увеличение содержания холестерина и снижение уровня αлипопротеинов [Смирнов К.В. с соавт., 1986]. Кроме того, было отмечено увеличение инсулина
в крови после АНОГ различной продолжительности, что возможно связано с перестройкой
инсулярного
аппарата
или
изменением
углеводного
обмена
при
моделировании
микрогравитации [Афонин Б.В., 1989].
1.9.4. Длительная изоляция в гермообъеме
Целью модельных исследований в замкнутых гермообъектах являлось развитие и
отработка систем и биомедицинских средств, направленных на сохранение здоровья, высокого
уровня физической и психической работоспособности, стабильного психофизиологического
состояния, эффективной реабилитации с сохранением оптимальных параметров соматического
и психического здоровья [Моруков Б.В., Белаковский М.С., Демин Е.П., Суворов А.В., 2012].
Известно, что изоляция экипажа в гермообъекте ограниченного объема не воспроизводит такие
факторы орбитального полета, как невесомость и повышенный уровень радиации, но
формирующиеся при этом искусственная атмосфера и микроклимат, а также возможные
сложности психологического взаимодействия между членами экипажа в процессе совместной
деятельности позволяют изучить многие трудности реальной космической экспедиции.
В исследованиях с длительной изоляцией в гермообъектах было показано снижение
основного обмена веществ на четверть его величины. При этом наблюдались сдвиги
холестеринового обмена: так, наряду с признаками гиперхолестеринемии, отмечалось
изменение фракций холестерина в сторону преобладания его атерогенных форм. Отмечались
признаки усиления катаболических реакций [Каландаров С.К., Коршунова В.А., Проскурова
Г.И., 1986]. Тем не менее, клинически-значимых сдвигов белкового, энергетического,
углеводного метаболизма обнаружено не было, что могло свидетельствовать, о компенсации
организмом воздействия всего комплекса воздействующих факторов [Маркин А.А., Строгонова
64
Л.Б., Вострикова Л.В., 1997]. Так, исследование электрофоретических фракций белков плазмы
крови после 135- суточной изоляции показало значительное уменьшение содержания интер-αтрипсинового ингибитора, α-2-микроглобулина, гаптоглобина и α-2-глобулиновой фракции, что
может быть следствием подавления синтеза белков в печени. После окончания эксперимента,
на 2-ой и 7-ой дни, наблюдалось проявление слабой острофазной реакции [Ларина О.Н., 1997].
Так же, в динамике 240-суточной изоляции, наблюдалось понижение содержания общего белка
в крови, кроме того, отмечалась тенденция к снижению уровня альбумина [Маркин А.А. с
соавт., 2001].
В ходе 240 - суточной изоляции были выявлены периодические колебания уровней
иммуноглобулинов G, M, и А в крови [Поликарпов Н.А. с соавт., 2001; Рыкова М.П. с соавт.,
2004]. После окончания эксперимента было также отмечено снижение содержания в крови
данных классов иммуноглобулинов [Константинова И.В. с соавт., 1997]. В динамике
длительной изоляции показало изменение толерантности к глюкозе, что сопровождалось
активацией секреции С-пептида, инсулина и гастрина [Афонин Б.В. с соавт., 2001].
В
полуторагодовой
изоляции
(Марс-500)
повышалась
активность
трансаминаз,
наблюдалась тенденция к снижению уровня мочевой кислоты, железа, и креатинина. По
биохимическим данным не отмечалось признаков ослабления метаболизма скелетных мышц,
миокарда, поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта [Моруков Б.В. с соавт., 2012].
В
ходе
эксперимента,
при
исследовании
белкового
спектра
мочи,
методом
электрофоретического разделения, было выявлено увеличение доли гломерулярного (> 69 кДа)
и тубулярного (< 65 кДа) компонентов белка мочи на начальных этапах эксперимента с
последующей тенденцией к снижению содержания этих белков. На 244–272 сутки, во время
имитации выхода на поверхность Марса, доля тубулярного компонента снижалась, а
гломерулярного,
включая
высокомолекулярные
фракции
медленных
глобулинов
и
иммуноглобулинов G, росла, с тенденцией к росту содержания альбумина. По мнению авторов,
эти изменения отразили физиологическую реакцию почек на физические нагрузки,
сопровождавшие подготовку к имитации выхода и психологический стресс. Относительное
содержание трансферрина с 168-х суток изоляции находилось на уровне близком к фоновому.
Содержание гликопротеина почечных канальцев (белка Тамма-Хорсваля) не повышалось
[Моруков Б.В. с соавт., 2012].
В данном исследовании был проведен анализ протеомной композиции мочи, который
позволил выявить сети взаимодействий, состоящие более, чем из 200 белков различного
происхождения, динамика изменений которых оказалась тесно связанной с уровнем
потребления соли [Ларина И.М. с соавт. 2012; Пастушкова Л.Х. с соавт., 2012].
65
1.10. Характеристика возрастных изменений физиологических систем организма
Старение является сложным биологическим процессом, обусловленным множеством
факторов, каждый из которых вносит свой вклад в изменения большинства клеток и органов
[Oeseburg H., de Boer R.A., van Gilst W.H., vander Harst P., 2010]. Если исходить из
представлений системной биологии, то ухудшение работы «системы», которое происходит с
возрастом, скорее всего, включает нарушение нескольких механизмов. Так, по мнению Soltow с
соавт., со старением сопряжено четыре основных процесса:
1) снижение потребления и эффективности использования энергии;
2) снижение структурной и/или метаболической организации;
3) снижение барьерных функций;
4) повышение вероятности нарушений в процессе репликации ДНК в процессе деления
клеток).
Очевидно, методы протеомики могут быть использованы для исследования первых трех
процессов [Soltow Q.A., Jones D. P., Promislow D. E. L., 2010].
В течение последнего столетия продолжительность жизни человека в промышленно
развитых странах увеличилась почти в два раза за счет улучшения неонатальной помощи,
профилактики и лечения инфекций, заболеваний сердечно-сосудистой системы, эндокринных и
других болезней. Однако старение населения и связанные с ним заболевания приносят
обществу значительные социальные и экономические потери [Sahin E., Depinho R.A., 2010],
поэтому рождаются такие объединения, как исследовательский консорциум «Когорты для
изучения болезней сердца и старения в геномной эпидемиологии» (Cohorts for Heart and Aging
Research in Genomic Epidemiology, CHARGE) [Psaty B.M, Sitlani C., 2013]. Возникла
необходимость понимания молекулярных путей и биологических процессов, лежащих в основе
старения. Полагают, что возможности биомедицинских технологий уже сейчас могут либо
увеличить возраст начала развития тяжелых возрастных заболеваний и замедлить их
прогрессию, либо дадут возможность замедлить процесс старения как таковой [Olshansky
S.Jay., Perls T., 2008]. В настоящее время предложено несколько теорий старения. Отдельные из
них, отчасти, противоречат друг другу, отчасти – дополняют. Эволюционная теория
«запрограммированного старения», сформулированная немецким биологом XIX века Августом
Вейсманом [Weismann А., 1889], постулирует, что побочный продукт реализации генетической
программы онтогенеза, биологическим механизмом которой является ограничение числа
делений соматических клеток. Гипотеза об изменении с возрастом генетического аппарата
клетки, является одной из признанных в современной геронтологии. Одни ученые
рассматривают возрастные изменения генома как наследственно запрограммированные, другие
66
считают, что старение – результат накопления случайных мутаций. Как известно, теломеры это концевые участки хромосом, которые не содержат кодирующих участков, но защищают
таковые от повреждений, могущих произойти при делении клетки. Теломеры содержат
уплотнённую ДНК и стабилизируют хромосомы. При каждом цикле деления клетки
происходит укорачивание теломер, что приводит к «репликативному старению» клетки.
Теломеры
постулируются
в
качестве
универсальных
биологических
часов,
которые
сокращаются вместе со старением клеток. Укорочение теломер связано не только со старением,
но и с возрастными сопутствующими заболеваниями, в том числе, с опухолями, ишемической
болезнью сердца, и сердечной недостаточностью [Москалев А.А., 2008; Oeseburg H. et al.,
2010]. Открытие, удостоенное Нобелевской премии по медицине и физиологии 2009 года,
объяснило, как именно теломеры защищают хромосомы. В 1985 году Блэкберн впервые
экспериментально
идентифицировала
теломеразу
-
фермент,
добавляющий
особые
повторяющиеся последовательности ДНК к 3'-концу цепи ДНК на участках теломер, которые
располагаются на концах хромосом в эукариотических клетках. Теломераза перестает работать
в дифференцированных соматических клетках взрослого человека, сохраняя свою активность в
половых и стволовых клетках, а также в клетках большинства опухолей. Было установлено, что
при более низких концентрациях теломеразы и меньшей длине теломер, в лимфоцитах крови
человека в несколько раз увеличивается риск сердечно-сосудистых заболеваний, которые, как
известно, составляют главную причину старческой смертности [Farzaneh-Far R. et al., 2010].
Под руководством профессора Рудольфа были идентифицированы 4 белка (LL-37/CRAMP,
STMN-1, EF-1б, Chi3L3), экспрессия которых повышалась при повреждениях теломер [BegusNahrmann Y. et al., 2009]. Ученые установили, что длина теломер связана с физической
активностью
после
поправок
на
возраст,
пол,
вес,
наличие
вредных
привычек,
социоэкономический статус [Cherkas L.F. et al., 2008]. В то же время, в ходе исследований в
лаборатории Зглиницки было показано, что одним из ключевых факторов укорочения
теломерных участков является окислительный стресс, который сильнее воздействует на
укорочение теломер, чем репликативное старение [Ahmed S. et al., 2008]. Выдвинутая
Харманом (1956) и Эмануэлем (1958), свободнорадикальная теория объясняет не только
механизм старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов (сердечнососудистых заболеваний, ослабления иммунитета, нарушений функции мозга, развитие
катаракты, рака и некоторых других). Согласно этой теории, причиной нарушения
функционирования клеток является избыточное образование свободных радикалов – активных
форм кислорода, образующихся главным образом в митохондриях [Remmen H.V., Jones D.P.,
2009]. Возможно, окислительный стресс при старении может быть результатом дисбаланса
прооксидантов и антиоксидантов [Jones D.P., 2006]. В процессе старения митохондрии
67
подвергаются самоликвидации, названной Скулачевым митоптозом. Когда количество
погибших митохондрий возрастает, продукты их распада инициируют апоптоз. Один из
предложенных митохондриальных антиоксидантов (SkQ1), у мышей и крыс замедляет развитие
таких признаков старения, как инволюция тимуса и фолликулярных клеток селезенки,
уменьшение соотношения лимфоцитов и нейтрофилов в крови, развитие остеопороза,
катаракты, ретинопатии, глаукомы, гипотермии, исчезновение эстральных циклов у самок и
полового влечения у самцов [Skulachev V.P., 2009]. Обнаружено, что на молекулярном уровне
важную роль в процессе старения играет нарушение координации между ядерным и
митохондриальным геномами. Раскоординация начинается с падения уровня никотинамидаденин-динуклеотида (NAD), который кодируется геном SIRT1; в этих условиях он не может
контролировать активность одного из транскрипционных факторов - HIF. Уровень HIF
повышается, что нарушает нормальную коммуникацию генов ядра и митохондрий [Hubbard
B.P., Sinclair D.A., 2014]. На системном уровне физиологическое старение проявляется
нарушением способности адаптироваться к физиологическим стрессам [Lipsitz L.A., Goldberger
A.L., 1992]. Существует связь между неконтролируемой провоспалительной активностью и
связанными со старением заболеваниями. Снижение ядерного рецептора активаторов
пролиферации пероксисом (PPARs) тесно связано с повышением уровня воспалительных
медиаторов в процессе старения [Chung J.H. et al., 2008]. По мнению Hjelmborg с соавт.,
генетическое влияние на продолжительность жизни не линейно – оно минимально до 60 лет, но
увеличивается в дальнейшем, что говорит о необходимости поиска генов, влияющих на
продолжительность жизни у людей старших возрастных категорий [Hjelmborg J. et al., 2006].
В начале 50-х годов Дильман выдвинул и обосновал идею о существовании единого
регуляторного механизма, определяющего закономерности возникновения и развития в
организме различных гомеостатических систем в процессе его онтогенеза. Согласно его
гипотезе, главная причина старения – это возрастное снижение чувствительности гипоталамуса
к регуляторным сигналам, поступающим от нервной системы и желез внутренней секреции
[Дильман В.М., 1987]. По мнению Panowski и Dillin, эндокринная сигнализация играет
ключевую роль в большинстве процессов, которые изменяются при старении многоклеточных
организмов [Panowski S.H., Dillin A., 2009]. Возрастзависимые изменения в сигнальных
каскадах различных гормонов, начиная от концентрации гормона в крови и заканчивая
функциональным состоянием клеток и тканей, формируют фенотипические признаки старения.
Одним из возможных маркеров старения является гормон роста, поскольку хорошо известно,
что уровень этого гормона с возрастом снижается. Секреция гормона роста снижается
примерно на 14% за 10 лет, начиная с 20-25 лет, а его рецепторы при старении подвергаются
десенситизации. Полагают, что подобное снижение уровня гормона роста ответственно и за
68
возрастзависимое накопление жировой ткани, и за снижение мышечной массы, а также за
уменьшение содержания минералов в костях. Однако механизм снижения уровня гормона роста
при старении может быть опосредован некими пока не идентифицированными процессами.
Бартке с соавт. показали, что мыши с нарушенной функцией гипофиза живут дольше
контрольных животных, а «сверхпродукция» гормона роста приводит к сокращению
продолжительности жизни [Brown-Borg H.M., Rakoczy S.G., Sharma S., Bartke A., 2009]. С
возрастом отмечаются определенные нейроэндокринные нарушения, например, изменяется
уровень лютеинизирующего гормона (ЛГ), нарушаются связи, такие как АКТГ-кортизол, ЛГтестостерон [Veldhuis J.D., 1997]. По мнению Fanelli с соавт., происходят важные изменения в
эксперссии пероксисом (органелла эукариотической клетки, содержащая большое количество
ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции), что коррелирует с
развитием глиоза, происходящим в гиппокампе в процессе старения [Fanelli F. et al., 2013].
Исследования
долгожителей
показали,
что
в
их
субпопуляции
отмечается
низкая
заболеваемость раком, болезнями сердца, а также более высокая чувствительность к инсулину,
что связано с гомозиготностью по гену FOXO3A GG. В молодости, как правило, долгожители
испытывали нехватку калорий и в течение всей жизни имели низкий индекс массы тела
[Willcox B.J. et al., 2008]. В эксперименте, проведенном на 70-летних добровольцах,
использовали панель из 10 маркеров: индекс талия-бедро, систолическое и диастолическое
кровяное давление, содержание в моче кортизола, норадреналина и адреналина, содержание в
сыворотке крови дегидроэпиандростерона, гликозилированного гемоглобина, липопротеинов
высокой плотности и общего холестерина. Разрегулированная постоянная выработка гормоновмедиаторов стресса (адреналин, норадреналин, дофамин), так называемая аллостатическая
нагрузка, исследовалась у добровольцев дважды с интервалом в 2,5 года. Выявлено, что
постоянная выработка этих гормонов может происходить в течение долгого времени и
причинять большой вред организму. По данным исследования, увеличение каждого из этих 10
биомаркеров повышает риск смертности в ближайшие 4,5 года на 3,3% [Wolkowitz O.M., Burke
H., Epel E.S., Reus V.I., 2009].
Понимание этиологии процесса старения затруднено и такими факторами, как различное
время начала старения тканей. Органы стареют с разной скоростью, этот процесс зависит от
многих факторов, включая генетическое влияние на продолжительность жизни человека, образ
жизни, факторы окружающей среды, а также общее снижение функциональных резервов
[Hjelmborg V.B. et al., 2006]. Концепция тканевой (органной) «мозаичности» предполагает
различную «уязвимость» клеточных систем, определяющих устойчивость организма к
предъявляемым требованиям. Основой такой мозаичности служат причины генного порядка,
которые влияют, в конечном счете, на функциональный дисбаланс, инверсии клеточных циклов
69
или трансформацию прогениторных (стволовых) клеток и т.п. [Гомазков О.А., 2011].
Отсутствуют адекватные биомаркеры, способные дать представление о количественной мере
старения на молекулярном и клеточном уровнях, а также влияние на продолжительность жизни
условий жизнедеятельности, такие как, к примеру, калорийность пищи [Kenyon C., 2005].
Считают, что ограничение калорийности рациона связано с увеличением митохондриальной
активности, что может принести пользу в замедлении старения и сопутствующих заболеваний
[Guarente L., 2008]. Риск смерти от сердечно-сосудистых заболеваний и/или рака неуклонно
снижается у людей после 60 лет, а старше 80 – преобладают другие причины смерти [de los
Campos G., Klimentidis Y.C., Vazquez A.I., Allison D.B., 2012]. С возрастом происходит общее
снижение физиологических резервов, необходимых для того, чтобы справиться с вызовами
гомеостаза [Paletta F.X., Cowdry E.V., 1942]. У лиц пожилого возраста эти прогрессивные
изменения приводят к повышенной восприимчивости к многочисленным заболеваниям [Martin
J.E., Sheaff M.T., 2007]. В Соединенных Штатах почти у 50% людей старше 65 лет развиваются
сердечно-сосудистые заболевания, у 35% - артропатии, у 15% - диабет 2 типа, у 10% заболевания легких [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. Физиологические параметры у человека при
старении снижаются на 80% к 80 годам от своего функционального максимума. В работе Bulpitt
с соавт., отдельные показатели, связанные со старением, были определены в группах 397
мужчин и 130 женщин в возрасте от 37 до 58 лет. Седые волосы, неупругость кожи
положительно связаны с хронологическим возрастом, отрицательная связь обнаружена между
уровнем сывороточного альбумина, концентрацией креатинина в сыворотке, систолическим
давлением, уровнем кальция крови [Bulpitt C.J. et al., 1994].
1.10.1. Морфо-функциональные признаки старения почечной ткани
C возрастом фильтрационная способность почек снижается на 20-25% на протяжении
периода с 40 до 80 лет [Zürbig P., Schiffer E., Mischak H., 2009]. Анатомо-функциональное
старение в почках отражается на составе белков, выводимых с мочой [Esposito C., Dal Canton
A., 2010; Glassock R.J., Rule A.D., 2012]. Отмечают, что возрастное снижение веса почек
начинается с 40-50 лет, к 70-80 годам достигает 10-30% [Rao U.V., Wagner H.N.Jr., 1972].
Морфологически стареющая почка характеризуется развитием гиалиноза, уменьшением числа
нефронов и интерстициальным фиброзом [Pannarale G. et al., 2010]. Многочисленные
исследования подтвердили увеличение склеротических клубочков с возрастом [Vazquez Martul
E., Veiga B.A., 2003; Rule A.D. et al., 2010]. Исследование прижизненных биоптатов донорских
почек показало образование гломерулосклероза на протяжении всей жизни: 19% , 38% , 47%,
65% , 76% и 82%, соответственно у ворастных групп от 18 - до 29 лет; от 30 - до 39 лет; 40-49
лет; 50-59 лет; 60-69 и 70-77 лет [Rule A.D. et al., 2010]. В процессе старения организма
70
клубочки приобретают ишемический внешний вид, происходит утолщение базальной
мембраны, интракапсулярный фиброз, что свидетельствует о сосудистом происхождении
поражения. Со временем происходит отложение коллагена в боуменовой капсуле, медиальная
гипертрофия и гиалиноз артериол [Mancilla E. et al., 2008; Rule A.D. et al., 2010]. У 1957
потенциальных доноров почек, которым была сделана компьютерная томография, ангиография
и урограмма, были выявлены признаки, развитие которых положительно коррелировало с
возрастом:
распространенность
почечной
дисплазии
фиброзно-мышечной
артерии,
атеросклеротическое сужение сосуда, фокусное кортикальное истончение паренхимы,
кальцификация [Lorenz E.C. et al., 2011]. Из 447 возраст-зависимых генов - 49 кодируют
белковые компоненты внеклеточного матрикса [Rodwell G.E. et al., 2004]. Гломерулосклероз,
атеросклероз, трубчатая атрофия и интерстициальный фиброз - составляют нефросклероз,
оценка выраженности которого может быть выполнена по числу различных гистологических
аномалий [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007; Glassock R.J., Rule A.D., 2012]. Частота развития
нефросклероза, определенного по двум или более из этих аномалий, возрастает с возрастом
постепенно: 2,7% для 18–29 летних; 16% для 30–39 летних; 28% для 40–49 летних; 44% для 5059 летних; 58% для 60-69 летних; и 73% для 70-77 летних [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007;
Glassock R.J., Rule A.D., 2012], что подтверждают гистологические исследования [Rodwell G.E.
et al., 2004]. Существуют противоречивые данные об изменениях размера клубочков с
возрастом. Некоторые авторы сообщают о снижении клубочковой поверхности или объема
гломерул с возрастом [Nyengaard J.R., Bendtsen T.F., 1992], другие авторы не находят
возрастной зависимости [Hoy W.E. et al., 2003] или отмечают увеличение объема клубочков с
возрастом [Fulladosa X. et al., 2003]. Так, в процессе старения, с 40 лет, отмечается нарастание
размеров площадей почечных телец и сосудистых клубочков, с последующим снижением этих
показателей с 56-60 - летнего возраста. После 60 лет отмечается тенденция снижения размеров
почечных телец и сосудистых клубочков всех генераций нефронов, которое сменяется
относительным подъемом этих величин после 70 лет, что связано со значительным снижением
числа почечных телец в корковом и мозговом веществе почек [Тризно М.Н., Асфандияров Ф.Р.,
Кафаров Э.С., 2009]. Склероз почечных канальцев приводит к нарушению реабсорбции воды и
натрия - важных участников регуляции уровня артериального давления в организме. В
результате, по мере прогрессирующей утраты канальцами способности удерживать натрий,
может развиться артериальная гипотония. В работе Hoy с соавт. было подсчитано число
клубочков при морфологическом исследовании 78 почек, в возрастном диапазоне от
новорожденных до пожилых лиц (вплоть до 84 лет). Число клубочков в органе колебалось
почти в девять раз (с 210 332 до 1825380), снижаясь на протяжении всей взрослой жизни (г=
-0,32 , p=0,009). Средний объем почечного тельца изменялся в 5,6 раза у взрослых и обратно
71
коррелировал с числом клубочков (г = - 0,38, p=0,001) [Hoy W.E. et al., 2003]. Однако слабость
коэффициентов корреляции указывала, что кроме собственно возраста, существуют и другие
факторы (фактор), влияющие на данные морфологические показатели. Дегенеративные
изменения в клубочках ведут к атрофии приводящих и отводящих артериол. По мере снижения
числа функционирующих почечных клубочков, оставшиеся подвергаются нагрузке в виде
гиперфильтрации и гиперперфузии, что приводит к повреждению структуры и нарушению
функций гломерул. Скорость клубочковой фильтрации с возрастом постепенно падает, с 2025% от 40 до 80 лет [Zürbig P. et al., 2009]. Способность почек концентрировать мочу так же
постепенно снижается с возрастом на 22% у возрастных групп старше 55 лет по сравнению с 40
- летними [Hoang К. et al., 2003]. Происходят так же и сопутствующие изменения в паренхиме,
связанные со старением [Martin J.E., Sheaff M.T., 2007; Zürbig P. et al., 2009]. По данным
гистологических исследований, снижение скорости клубочковой фильтрации в стареющем
организме сопровождается ростом объема интерстициальной ткани [Hoang K. et al., 2003], то
есть расширением внеклеточного матрикса, поддерживающего равновесие синтеза и
деградации [Liu Y., 2006]. Учет снижения функции почек с возрастом имеет важные следствия
не только для поддержания гомеостаза организма, но и в клинических аспектах, таких как
использование лекарственной терапии, трансплантации почки.
Очевидно, важно понимать, какие молекулярные механизмы и клеточные изменения,
лежат в основе процессов, связанных со старением, т. к. понимание этих процессов помогает
предотвратить опасные для жизни заболевания почек [Esposito C., Dal Canton A., 2010].
Использование протеомных методов для изучения маркеров старения в моче человека начато не
так давно. Исследование низкомолекулярного протеома мочи 324 здоровых людей, в широком
возрастном диапазоне, от 2 до 73 лет позволило выявить высокое сходство списка маркеров
старения с маркерами хронической почечной недостаточности. Из 209 пептидов, уровень
которых изменялся с возрастом, только одиннадцать были связаны с полом, тринадцать связаны
с полом и возрастом. Из работы следует, что 73% «возраст-зависимых» пептидов были также
маркерами хронической почечной недостаточности. Это еще раз подтверждает гипотезу, что
возрастные изменения могут иметь патогенез, имеющий общие звенья с таковым при
хронических заболеваниях [Zürbig P. et al., 2009]. Выявленное Zürbig с соавт., снижение
фрагментов
коллагена-α1
с
возрастом
отражает
угнетение
активности
почечных
протеолитических ферментов, что сопровождается повышением объема внеклеточного
матрикса у пожилых людей [Zürbig P. et al., 2009]. В моделях старения у животных,
модификация экспрессии и активности матричных металлопротеиназ, сопровождались
увеличением осаждения компонентов внеклеточного матрикса в паренхиме почке [Gagliano N.
et al., 2000].
72
1.10.2. Характеристика процессов старения отдельных тканей
Организм человека обладает замечательной способностью обновления тканей на
протяжении всей жизни. Этот непрерывный потенциал самообновления поддерживается
стволовыми клетками [Чернилевский В.Е., 2008; Sharpless N.E., De Pinho R.A., 2007; Rossi D.J.,
Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Тимус млекопитающих отвечает за пролиферацию,
созревание и селекцию наивных Т-лимфоцитов. При старении отмечается деградация тимуса и
снижение его функциональной активности – инволюция, происходящая, в основном, за счет
угнетения дифференцировки Т-клеток в тимусе на различных стадиях. У стареющих мышей
увеличивается число DN1 (дважды негативные тимоциты) клеток. Переход от стадии DN1 к
стадии DN2 обуславливает цитокин IL-7, уровень которого уменьшается в процессе старения
тимуса. Для дифференцировки DN1 клеток в DN2 клетки IL-7 увеличивает экспрессию антиапоптозного белка bcl-2. Из-за активации bcl-2, при сверхэкспрессии IL-7, возможны
гиперпролиферация лимфоидных клеток и развитие лимфом. Чтобы обойти эти проблемы и
увеличить тимопоэз при старении, группа под руководством доктора Томана предложила
вводить в тимус стареющих мышей клетки стромы, секретирующие IL-7 [Virts E.L., Phillips
J.A., Thoman M.L., 2006].
Стволовые клетки стареют в результате таких событий, как повреждение ДНК,
укорочение теломер, деятельности транскрипционного фактора, регулирующего клеточный
цикл (p53), гена p16, в результате чего происходит снижение репликативной функции
отдельных видов стволовых клеток с возрастом, с чем, по мнению Sharpless и De Pinho, связаны
некоторые возрастные заболевания человека - атеросклероз и сахарный диабет 2 типа [Sharpless
N.E., De Pinho R.A., 2007]. Старение тканеспецифичных стволовых клеток и клеток
предшественников, как полагают Rossi с соавт., приводит к старению тканей и функций у
пожилых людей [Rossi D.J., Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Накапливаются доказательства
того, что параллельно с возраст-ассоциированным физиологическим спадом, особенно в
пролиферативно-активных органах и тканях, снижаются пролиферативные реакции и
направление дифференциации стволовых клеток [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. В то же время,
эти долгоживущие возобновляемые резервуары могут также негативно повлиять на здоровье
пожилых лиц, обеспечивая предпочтительный рост злокачественных клеток [Rossi D.J.,
Jamieson C.H., Weissman I.L., 2008]. Группой Патэля показано, что пересадка стволовых клеток
значительно улучшает функцию сердца у пациентов, перенесших шунтирование [Bruckner B.A.
et al., 2009]. В работе Валюшкиной и Буравковой было показало наличие изменений в
популяции мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников костного мозга крыс,
связанных с возрастом животных. Были выявлены изменения пролиферативного потенциала,
73
доли клеток, содержащих бета-галактозидазу (выполняющих ферментативную функцию в
организме), способности к остеогенной и адипогенной дифференцировке, а также снижение
способности к участию в процессах репарации с увеличением возраста донора клеток. При этом
полученные популяции клеток не имели различий в иммуннофенотипе. Кроме этого, удалось
показать, что культивирование клеток старых животных при пониженном содержании
кислорода приводит к эффектам, противоположным таковым при старении: увеличении
пролиферативной
активности
и
остеогенеза,
снижении
доли
стареющих
клеток
и
индуцированного адипогенного потенциала [Валюшкина М.П., Буравкова Л.Б., 2012]. У
новорожденных красный костный мозг в основном эритробластический, т.е. в нем преобладают
эритробласты. К периоду полового созревания морфология и функция красного костного мозга
соответствуют нормативам взрослого человека. В старческом возрасте красный костный мозг
ослизняется. С возрастом печень и почки проявляют пониженную способность к метаболизму,
уменьшается сердечно-сосудистой резерв, связанный со снижением максимальных частота
сердечных сокращений, сократительной способности сердечной мышцы и емкости легких [Vijg
J., Dolle M.E., 2007].
Анатомические и физиологические изменения, связанные с возрастом, проявляются с
разной скоростью в различных органах и тканях. Отличительными чертами старения являются
потеря мышечной массы, снижение двигательной активности, снижение костной массы
(остеопороз), а также истончение слизистых и снижение эластичности кожи. С возрастом в
кроветворной
системе
проявляется
нормоцитарная
анемия,
происходит
накопление
миелоидных клеток в костном мозге. Другие ткани, такие, как мозг, печень и почки,
испытывают более низкую степень клеточной потери относительно общего снижения массы.
Эти возрастные клеточно-структурные изменения тканей тесно связаны с функциональным
(физиологическим) ослаблением реактивности в ответ на стресс различной природы и
повышенным риском развития заболеваний. При использовании трансгенных мышей (несущих
ген LacZ) удалось изучить связанный со старением спектр мутаций в различных органах. С
возрастом в печени частота мутаций возрастает, в мозге увеличение числа мутаций
наблюдалось в возрасте 4-6 месяцев, а затем прекращалось. Полагают, что при старении
накапливается и является тканеспецифичным большое число повреждений ДНК [Gravina S.,
Vijg J., 2010]. С возрастом снижаются функции различных органов, реакции на
физиологические потребности организма [Sahin E., Depinho R.A., 2010]. Функциональный спад
наиболее заметен с возрастом в костно-мышечной системе, где происходит снижение уровня
активности, силы и диапазона движения и развития артропатии. В костях с 30-летнего возраста
начинают преобладать признаки остеорезорбции - увеличивается диаметр гаверсовых каналов,
уменьшается толщина трабекул большеберцовой кости, кортикального слоя ребер. Признаки,
74
определяющие степень выраженности остеопороза, являются основными при определении
биологического возраста у лиц старше 30 лет [Федулова М.В., 2004]. Заболевания костной
ткани, в том числе остеопороз, достаточно широко распространены в настоящее время. Одной
из главных причин развития остеопороза считают нарушение нормального протекания цепи
реакций, блокирующих запуск белком NFkB естественных внутриклеточных защитных
механизмов и ведущих к гибели клетки при апоптозе [Pederson L. et al., 2008].
Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), препятствуя преждевременной гибели клетки
и вырождению костной ткани, запускает каскад реакций с вовлечением целого ряда ферментов,
что приводит, в конечном итоге, к активации NFkB-сигнального пути и способствует
выживанию
остеокласта.
Полагают,
что
утрата
наиболее
часто
встречающихся
межмолекулярных связей в коллагеновых волокнах - дивалентных сшивок - это одна из причин
развития хрупкости костей у лиц пожилого возраста [Brüel A., Ortoft G., Oxlund H., 1998].
Скелетные мышцы испытывают снижение регенеративного потенциала с возрастом, что
проявляется снижением числа миогенных волокон и их замены фиброзной тканью [Cerletti M. et
al., 2008]. При этом происходит ослабление регенерации после травм, и, как правило, неполное
восстановление [Di Iorio A. et al., 2006]. Возрастные изменения приводят к потере мышечной
массы – саркопении, при этом скорость метаболизма в ткани замедляется. Для объяснения
причин саркопении был предложен ряд теорий. Одна из них связывает саркопению с
увеличением количества свободных радикалов, окислительным стрессом и возрастзависимой
аккумуляцией митохондриальных аномалий: то есть с накоплением мутаций в мДНК,
приводящих к дефектам белков электрон-транспортной цепи. Исследователи под руководством
Айкена предположили, что мышцы, которые наиболее ослабляются в результате саркопении,
будут нести больше дефектов электрон-транспортной цепи, чем мышцы, меньше старадющие
от саркопении. Оказалось, что миоциты, в которых отсутствует цитохромоксидаза и
наблюдается повышенная активность сукцинат-дегидрогеназы, несут мутации мтДНК.
Накопление делеций мДНК приводит к потере активности цитохромоксидазой и вызывает
повышенную активность сукцинат-дегидрогеназы [McKiernan et al., 2009].
Нейрогенезу человека продолжается в течение всей взрослой жизни, при этом новые
нейроны
происходят
от
нервных
стволовых
клеток
(НСК),
локализующихся
в
субвентрикулярной зоне и в субгранулярной зоне гиппокампа зубчатой извилины [Gage F.H.,
2000]. Однако при старении организма активность нейрогенеза снижается, что может
способствовать нейродегенеративным заболеваниям. При сравнении популяций НСК в
субвентрикулярной зонах молодых (2-4 месячных) и старых (24-26 месячных) мышей
отмечается примерно двукратное сокращение нервных стволовых клеток старых мышей
[Molofsky A.V. et al., 2006]. В дополнении к этому, общее снижение числа вновь
75
сформированных нейронов имеет и функциональные последствия, так, в стареющем мозге
мыши, снижение нейрогенеза связано с нарушениями обоняния [Enwere E. et al., 2004].
Известно,
что
селезенка
человека
выполняет
иммунную,
фильтрационную
и
депонирующую функции, участвует в процессах гемолиза, синтеза белков и в кроветворении
[Кузнецова Е.П., Линькова Н.С, Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013]. С возрастом
наблюдается снижение функциональной активности этого органа, увеличивается число
стареющих эритроцитов в кровеносном русле, что является одной из причин неэффективности
газообменных процессов в тканях при старении. Возрастные изменения в селезенке
характеризуются как морфологической, так и функциональной картиной инволюции.
Количество лимфатических узелков и размеры их центров с возрастом уменьшается.
Ретикулярные волокна белой и красной пульпы грубеют и становятся более извилистыми,
формируются узловатые утолщения волокон. При возрастной атрофии селезенки количество
макрофагов и лимфоцитов в пульпе уменьшается, тогда как число зернистых лейкоцитов и
тучных клеток возрастает. Как в старческом, так и в детском возрасте в селезенке
обнаруживаются гигантские многоядерные клетки - мегакариоциты. Важную роль в процессах
старения селезенки играют кейлоны – высокомолекулярные белки, угнетающие пролиферацию
иммунных клеток селезенки. Из кейлонов были выделены низкомолекулярные пептиды –
супрессоры активности иммунных клеток – тафцин и спленин. Предшественник тафцина
синтезируется в лимфоцитах селезенки в виде лейконина, который путем ограниченного
протеолиза преобразуется в активную форму. Спленин по функциям и структуре напоминает
гормон тимуса тимопоэтин, что свидетельствует о сходстве иммунологических процессов, а
возможно, и механизмов старения указанных органов. Так, активные центры спленина и
тимопоэтина различаются лишь одним аминокислым остатком [Кузнецова Е.П., Линькова Н.С,
Дудков А.В., Войцеховская М.А., 2013].
Печень человека претерпевает ряд структурных изменений, часть которых носит
компенсаторно-приспособительный
характер
и
обеспечивает
удовлетворительное
функционирование органа в процессе старения. После 50 лет отмечено уменьшение массы
печени (до 600 г), что коррелирует с изменением относительной доли массы органа к массе
тела. В связи с развитием возрастных изменений после 70 лет орган уменьшается на 150—200
грамм [Лазебник Л. Б., Ильченко Л. Ю., 2007]. Выраженная атрофия печени отмечается лишь к
8-му десятилетию; данный показатель значительно варьирует, но не достигает резкой степени
выраженности даже у долгожителей. Начиная с 45 - летнего возраста происходит уменьшение
общего числа гепатоцитов [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007]. В старческом возрасте
выявлено увеличение количества и размера лизосом, а также колебания активности лизосомных
ферментов [Sersté T., Bourgeois N., 2006], обнаружено повышенное включение липофусцина в
76
гепатоцитах центральных долек с тенденцией к атрофии этих клеток. Изменяются размеры
митохондрий, растет число вторичных лизосом [Лазебник Л.Б., Ильченко Л.Ю., 2007].
Поджелудочная железа является органом пищеварительной и эндокринной системы, ее
роль в жизнедеятельности организма трудно переоценить [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006].
Главная составляющая эндокринной функции поджелудочной железы - синтез в островках
Лангерганса инсулина и глюкагона, которые служат ключевыми гормональными факторами,
регулирующими энергетический метаболизм [Дедов И.И., Петеркова В.А., 2006; Волков В.П.,
2014]. С возрастом значительно сокращается популяция эндокриноцитов островкового аппарата
поджелудочной железы за счёт β-клеточного компонента [Снигур Г. Л., Смирнов А. В., 2010;
Волков В.П. 2014], что приводит к уменьшению толерантности к глюкозе и зачастую к
развитию диабета [Meier J.J., Ueberberg S., Korbas S., Schneider S., 2011]. Анализ возрастных
изменений цитометрических параметров β-клеток показал, что размер последних плавно
уменьшается и после 40 лет статистически достоверно отличается от данного показателя у
молодых [Волков В.П., 2014]. С возрастом происходит уменьшение размеров железы и ее
частичная атрофия [Sato T. et al., 2012]. Группа японских ученых под руководством Tohno
изучила содержание основных химических элементов в протоке поджелудочной железы и в
общем желчном протоке у людей различного возраста при помощи плазменно-атомной
эмиссионной спектрометрии. Отмечено, что с возрастом в протоке поджелудочной железы
наблюдается значительное увеличение содержания магния. Кроме того, при оценке
соотношений между элементами удалось установить прямую корреляцию с возрастом
соотношения сера/магний, а также фосфор / натрий [Tohno Y. et al., 2004].
В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению протеома
мочи применительно к клиническим и/или геронтологическим задачам. В них отмечается
необходимость исследования "нормального старения", выявления физиологических процессов,
которые наиболее выражено страдают от старости [Bakun M. et al., 2014].
Таким образом, изучение протеома мочи здорового человека в нормальных условиях
жизнедеятельности, и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета
имеет большую теоретическую и практическую значимость, так как может позволить на
молекулярном уровне выявить возрастные изменения, а так же механизмы приспособления
человека к новым условиям существования, определить адаптивные возможности организма, не
связанные с развитием заболевания. Результаты исследования помогут лучше понять
направленность и диапазон происходящих в условиях космического полета физиологических
изменений в организме и разработать эффективные меры профилактики и коррекции
неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.
77
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. Материалы исследования
Приборы:
- Робот для префракционирования образцов биоматериала ClinProt
(«BrukerDaltonicsGmbH», Германия);
- Времяпролетный масс-спектрометр с ионизацией MALDI Autoflex III TOF/TOF
(«BrukerDaltonicsGmbH», Германия);
- хроматограф Agilent 1100;
- Гибридный масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса с преобразованием
Фурье LTQFTMS («Thermo»);
- вакуумный концентратор;
- прибор для измерения мультичастотного импедансана Hydra ECF/ICF 4200
(XitronTechnologies, SanDiego, USA);
- AUTION Max (АХ-4280).
Химические реактивы:
- Деионизованная вода (для ВЭЖХ), Merck, Германия;
- Трифторуксусная кислота (для ВЭЖХ), Merck, Германия;
- Ацетон (для ВЭЖХ), Химмед, Россия;
- Этанол (для ВЭЖХ), Merck, Германия;
- -циано-4-гидроксикоричная кислота (HCCA) (матрица для MALDI-TOF-массспектрометрии), Bruker Daltonics GmbH, Германия;
- 2,5-дигидроксибензойная кислота (матрица для MALDI-TOF-масс-спектрометрии),
Bruker Daltonics GmbH, Германия;
- Tris основной;
- EDTA;
- Guanidine-HCL;
- DTT;
- Йодацетамид;
- Соляная кислота;
- Бикарбонат аммония;
- Модифицированный трипсин;
- Муравьиная кислота.
78
2.2. Объекты исследования
В качестве объекта исследований были использованы пробы мочи 52 здоровых
добровольцев в привычных условиях жизнедеятельности, испытателей, участвовавших в
наземных модельных экспериментах – 105 - и 520 - суточных изоляциях в гермообъеме, 5суточной «сухой» иммерсии, 21-суточной антиортостатической гипокинезией с углом наклона
продольной оси тела относительно горизонта -6°, космонавтов, совершивших длительные
орбитальные полеты на МКС.
Все добровольцы были допущены врачебно-экспертной комиссией к проведению
испытаний.
Процедуры
и
методики
исследований
были
одобрены
Комиссией
по
биомедицинской этике Института медико-биологических проблем РАН, а от испытателей,
принимавших участие в исследовании, получено письменное Информированное согласие (табл.
1).
Таблица 1. Общий объём проведённых исследований.
Эксперимент
Количество
участников
Средний возраст
Число
образцов
Здоровые
добровольцы
52 добровольца
36,5 года
(19-54)
52
520 - суточная
изоляция в
гермообъекте
6 добровольцев
31 год
(25-37)
84
21 - суточная АНОГ(8 добровольцев
6°)
32 года
(20-44)
56
5 - суточная
СИ
14 добровольцев
25 лет
(21-29)
182
Длительные
космические полеты
(169-199 суток)
15 космонавтов
43 года
(35-51)
45
Члены дублирующих
12 космонавтов
экипажей
105 - суточная
изоляция в
гермообъекте
6 добровольцев
43 года
(36-50)
33 года
(25-41)
Общее количество образцов:
24
144
587
79
2.3. Модельные эксперименты
2.3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев
Для исследования протеома мочи использовали образцы мочи 52 здоровых добровольцев
в возрасте 19-54 лет, не подвергавшихся никаким воздействиям и находившихся в привычных
условиях жизнедеятельности.
2.3.2. 520-суточная изоляция в гермообъеме
Эксперимент
с
участием
здоровых
добровольцев
был
проведен
в
Наземном
Экспериментальном Комплексе (НЭК) ГНЦ РФ - ИМБП РАН, состоящем из 3 соединенных
друг с другом модулей, с использованием автономных систем жизнеобеспечения, в котором
были созданы условия полного контроля жизненного ритма, физической нагрузки и диеты
[Моруков Б.В., Белаковский М.С., Дёмин Е.П., Суворов А.В., 2012].
Обследуемые добровольно находились 520 суток в НЭКе, получали стандартный рацион
питания, с контролируемым содержанием всех нутриентов (использовали CARRAR System),
водопотребление
учитывалось.
Одной
из
особенностей
их
рациона
питания
был
контролируемый, но периодически изменяющийся режим потребления соли (табл. 2) на
протяжении от первых до двести пятьдесят первых суток.
Таблица 2. Предписанный добровольцам режим потребления соли (г/сутки).
Период эксперимента,
сутки
1-61
62-121
122-169
170-205
206-251
Уровень потребления
соли, г/сутки
12
9
6
12
9
Примечание: в РФ норма потребления соли для человека находится в пределах 4 – 12 г/сутки.
Проведение балансовых исследований на протяжении первой половины эксперимента
требовало от испытателей полного потребления всех продуктов рациона питания, а также учета
потребления жидкости. После 251 суток и до конца восстановительного периода режим
солепотребления был обычным, его уровень не учитывали. Разработанные для использования в
данном эксперименте рационы по содержанию необходимых организму человека пищевых
веществ соответствовали принятым физиологическим нормам для контингентов, чья
профессиональная деятельность по энерготратам относится к категории средней тяжести.
Пищевой состав рационов отвечал рекомендациям Всемирной организации здравоохранения
(ВОЗ), а также был согласован с российско-американскими нормами по пищевому составу
рационов питания для экипажей МКС [Агуреев А.Н., Сидоренко Л.А., 2012]. Рацион питания
80
добровольцев в среднем содержал: белков -101,7 г. (14,7%), жиров – 83,2 г. (27,5%), углеводов –
376,8 г. (55,1%) при калорийности 2750 ккал/сутки.
2.3.3. 105-суточная изоляция в гермообъеме
Обследуемые добровольно находились 105 суток в НЭКе, получали стандартный рацион
питания, с контролируемым содержанием всех нутриентов (использовали CARRAR System),
водопотребление учитывалось [Моруков Б.В., Демин Е.П., Васильева Г.Ю., 2010].
В ходе эксперимента, согласно Программе, директивно изменялось количество
потребления соли (NaCl) обследуемыми: с 1 по 35 сутки изоляции каждый из них потреблял в
среднем 11,55 г поваренной соли в день, с 36 по 70 сутки – 8,73 г, с 71 по 75 сутки – 11,85 г, 75
по 104 сутки - 7,38 г. Эти уровни среднего потребления несколько отличались от
предписанного (табл. 3).
Таблица 3. Предписанный добровольцам режим потребления соли (г/сутки).
Период
эксперимента
сутки
неделя
Уровень потребления соли,
г/сутки
1 – 35
36 – 70
71 – 75
76 – 98
1-5
6-9
10
11-14
12
9
12
6
Примечание: в РФ норма потребления соли для человека находится в пределах 4 – 12 г/сутки.
Также в ходе изоляции менялся характер используемых профилактических физических
тренировок. Так, в течение эксперимента все испытатели тренировались по полчаса в день на
велоэргометре. Кроме того, проводились дополнительные тренировки с использованием
низкочастотной
электромиостимуляции
(3
часа
в
день),
высокочастотной
электромиостимуляции (40 минут в день) и силового тренажера «MDS» (40 минут в день). Вид
дополнительных тренировок у обследуемых изменялся каждые 30 суток эксперимента.
2.3.4. 21-суточная антиортостатическая гипокинезия
Обследуемые добровольно находились 21 суток в антиортостатическом положении, с
углом наклона продольной оси тела относительно горизонтального положения - 6°, в
контролируемых условиях на базе исследовательского центра MEDES во Франции, в Тулузе.
Исследование проводилось в рамках совместной российско-французской лаборатории.
Участники
эксперимента
не
подвергались
никаким
дополнительным
воздействиям,
направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в физиологических
системах, получали стандартный рацион питания, с контролируемым содержанием основных
81
нутриентов, учитывали водопотребление. Пищевой состав рационов отвечал рекомендациям
ВОЗ.
2.3.5. 5-суточная «сухая» иммерсия
Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в
воду в положении лежа до уровня верхней трети плеча (t воды = 33-34°C), но не соприкасались
с ней, будучи отделенными, от воды водонепроницаемой свободно закрепленной к бортам
тканью. Определенные процедуры (гигиенического характера, а также измерение массы тела) и
эксперименты научной программы требовали изъятия испытуемого из ванны; в этом случае
испытуемый оставался лежать на спине, на мобильной платформе. Общее время, проведенное
вне ванны при 120 часовой иммерсии, составляло 4.11±0.15 часа (M±m). Ежедневное
потребление калорий составило ~2880±60 ккал/сутки. Потребление натрия нормировалось на
массу тела на уровне 2.8 ммоль/кг/день, кальция ~1100 мг/день, белков – 1.15 г/кг/день.
Обследованные
участники
эксперимента
не
подвергались
никаким
дополнительным
воздействиям, направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в
физиологических системах [Козловская И.Б., 2008; Томиловская Е.С. 2011; Coupé M. et al.,
2013].
2.3.6. Длительные космические полеты
Образцы мочи космонавтов и дублеров собирали в рамках программы «Исследование
протеома крови и мочи у основных и дублирующих членов экипажей до и после космических
полётов на МКС («Протеом»)», программа исследования которого была одобрена комиссией по
биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН.
Объектом исследования служили образцы мочи, полученные от пятнадцати российских
космонавтов мужчин в возрасте от 35 до 51 года, совершивших космические полеты
длительностью от 169 до 199 суток на борту Российского сегмента МКС. В качестве
контрольной группы использовались образцы мочи дублеров космонавтов. Эти лица проходили
аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания и водопотребления находились перед
полетом в тех же условиях, что и члены основного экипажа.
2.4.
Циклограмма сбора проб мочи
Сбор биологических образцов мочи здоровых добровольцев осуществлялся однократно.
В эксперименте с 520-суточной изоляцией сбор образцов биологического материала
осуществлялся в фоновом периоде за 7 дней до начала эксперимента на 50-е, 93-е, 124-е, 153-е,
82
180-е, 251-е, 274-е, 303-е, 330-е, 371-е, 400-е, 427-е сутки изоляции, а также на 7-е сутки по
окончании эксперимента.
Сбор биологических образцов в эксперименте с 105-суточной изоляцией осуществлялся
ежедневно в фоновом периоде за 6 дней до начала эксперимента, еженедельно в изоляции, а
также на 1-е, 6-е, 8-е сутки по окончании эксперимента.
В эксперименте с 21-суточной антиортостатической гипокинезией (-6°) сбор образцов
биологического материала осуществлялся в фоновом периоде за 7 дней до начала
эксперимента, на 5-е, 16-е, 21-е сутки изоляции, а также на 1-е, 3-е и 6-е сутки по окончании
эксперимента.
В эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией сбор образцов биологического
материала выполнялся в фоновом периоде за 8 и 3 дня до начала эксперимента, на 2-е, 3-е, 4-е,
5-е сутки иммерсии, а также на 1-е, 3-е и 5-е сутки по окончании эксперимента.
Сбор
образцов
мочи
космонавтов
экспедиций
на
Российском
сегменте
МКС
осуществлялся за 30-45 дней до старта, а так же на 1-е и 7-е сутки после приземления.
Образцы биологического материала дублёров были получены дважды в интервалы
времени, соответствующие пред - и первому послеполетному сбору биоматериала у основных
членов экипажей (табл. 4).
Таблица 4. Циклограмма сбора мочи.
Эксперимент
Здоровые добровольцы
Сроки сбора мочи
однократно, утром
в фоновом периоде;
50, 93, 124, 153, 180, 251, 274, 303, 330, 371,
520-суточная изоляция в гермообъекте
400, 427 сутки эксперимента;
7 сутки по окончании эксперимента
в фоновом периоде;
105-суточная изоляция в гермообъекте еженедельно в течение 105 суток
1, 7 сутки по окончании эксперимента
в фоновом периоде;
21-суточная антиортостатическая
5, 16, 21 сутки эксперимента;
гипокинезия (-6°)
1, 3, 6 сутки по окончании эксперимента
в фоновом периоде;
5 – суточная «сухая» иммерсия
2, 3, 4, 5 сутки эксперимента;
1, 3, 5 сутки по окончании эксперимента
Длительные космические полеты
Члены дублирующих экипажей
30-45 дней до старта;
1 и 7 сутки после приземления
соответствует пред- и послеполётному сбору
проб у основного экипажа
83
2. 5. Методы исследования
Поскольку на протеомный состав мочи человека влияет множество факторов (диета,
которой придерживается обследуемый, уровень двигательной активности, состояние водного и
электролитного обмена организма и другие), то в соответствии с требованиями EuroKUP и
HKUPP использовался стандартизированный протокол сбора мочи для анализа протеома. В
соответствии с этим протоколом для протеомного анализа мочи использовалась средняя порция
второй утренней фракции (предпочтительно) или любая утренняя фракция, которая является
наименее вариабельной по белковой композиции вследствие этого – наиболее пригодной для
исследований [Валеева О.А. с соавт., 2011; Fiedler G.M. et al., 2007]. Сбор осуществлялся в
стерильную пластиковую ёмкость для сбора мочи [Zürbig P. et al., 2011].
Кроме протеомных методов исследования, в эксперименте с иммерсией, применялись
общепринятые методики изучения биохимического состава крови и мочи при исследовании
образцов. Анализ проводили на автоматическом анализаторе мочи AUTION Max (АХ-4280). На
приборе Hydra ECF/ICF 4200 (Xitron Technologies, San Diego, USA) получали параметры
распределения жидкости по компартментам.
2. 5. 1. Подготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу
Несмотря на малое содержание протеаз в моче, способных изменить белковую
композицию образцов при их хранении, для изучения белкового состава требуется начать
предварительную пробоподготовку не позднее, чем через 20 минут после отделения фракции
мочи. Каждый образец мочи центрифугировали 10 минут при 4°С, 2000 g для удаления
загрязнений в виде крупных мертвых клеток, их фрагментов, отбирали надосадочную фракцию,
которую замораживали при температуре -80°С для длительного хранения. В дальнейшем
замороженные образцы размораживали при комнатной температуре и центрифугировали
повторно 10 минут при 4°С, 2000 g.
Основные этапы подготовки образцов для протеомного анализа состояли из следующих
этапов [Fliser D., Wittke S., Mischak H., 2005; Mischak H. et al., 2007; Валеева О.А. с соавт.,
2011]:
1) концентрирование образцов (надосадочную жидкость) центрифугированием с
использованием пробирок с фильтрами AmiconUltra Ultracel-15 3k при 2000 g, 50 минут, +4°C,
до 20-ти кратного уменьшения объёма;
2) высушивание образцов в вакуумном концентраторе при +30°C;
3) восстановление (перерастворение осадка в буфере для восстановления – 0,2 М Tris
основной (рН 8,5), 2,5 мМ EDTA, 6М Guanidine-HCL, добавление ДТТ – 15 минут при 70°C) и
84
алкилирование (добавление йодацетата натрия – 30 минут при комнатной температуре в
темноте) выделенной белковой фракции для денатурации белков, разрыва S-S мостиков и
предотвращения обратного образования дисульфидных связей;
4) осаждение белков ацетоном с 0,1% ТФУ при -20оС 8-19 часов и получение сухого
белкового осадка (при последовательной промывке три раза этанолом с перерастворением
осадка, полученного центрифугированием при 2000 g, 10 минут, +4°C);
5) трипсинолиз – протеолиз с помощью трипсина, для чего образец растворяли в ABB
((NH4)2HCO3) буфере (pH 8,0) до конечной концентрации 1 мг/мл белка, определенной методом
по Бредфорду (Bio-Rad) и добавляли трипсин 1:60 по массовым частям к белку и инкубировали
при 37°C 8-12 часов.
2. 5. 2. Прямое профилирование образцов
Для получения показателей вариабельности масс-спектров образцов мочи выполняли
прямое профилирование образцов после их концентрирования до 20-ти кратного уменьшения
объема. Очистка и концентрация белков из проб мочи осуществлялась с помощью набора
магнитных частиц MB-HIC («Bruker Daltonics»), разработанного для специфического захвата
протеинов и пептидов в биологических образцах. Метод основан на гидрофобном
взаимодействии перед проведением MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа [Fiedler
G.M. et al., 2007]. Все шаги пипетирования растворов, отделения магнитных частиц и нанесения
на MALDI-мишень выполнялись роботом ClinProtrobot («Bruker Daltonics») с помощью
программы ClinProtrobot 1.3. Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с
каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Использовали растворители
высокой степени очистки (HPLC-grade), фирмы «Merck», Германия. Масс-спектры были
получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics»),
работающем в положительном линейном режиме в диапазоне масс от 1000 до 17000 Да.
Ионизация достигалась облучением твердотельным лазером. Калибровка масс-спектрометра
осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein
Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»). Сухой стандарт растворяли в 125 мкл 1% ТФУ.
Далее стандарт смешивали с матрицей в соотношении 1:10 и наносили на мишень. Спектры
получали в автоматическом режиме с помощью редактора «Auto Xecute». Далее по каждому
спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его
площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные
экспортировали в таблицы MS Excel и значения площадей в повторных измерениях усредняли.
Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ
FlexAnalysis 3.0 и Statistica 6.0. Статистический анализ проводили с использованием
85
непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows) [Пахарукова
Н.А. с соавт., 2009; Tiss A. et al., 2007].
2. 5. 3. Хромато-масс-спектрометрический анализ
Анализ образцов проводили на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent
Technologies Inc., Санта-Клара, США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo,
Бремен, Германия) – масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса, совмещенный с
линейной квадрупольной ионной ловушкой, использующейся для накопления ионов и
измерения спектров столкновительно индуцированной фрагментации (МС/МС) ионов. Для
хроматографии использовали колонку с обращенной фазой ReproSil-Pur C18 (диаметр частиц 3
мкм, диаметр пор 100 А, Dr. Maisch GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленную с
использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, New Objective Inc., США) способом, описанным
Ишихама [Ishihama Y. et al., 2002].
Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся при помощи
программы Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в 2-х стадийном режиме
автоматического измерения спектров. В качестве подвижной фазы использовались растворитель А: H2O–HCOOH (1000:1, по объему), растворитель В: CH3CN–HCOOH (1000:1,
по объему). Выполнялась градиентная хроматография с линейным увеличением относительного
содержания растворителя B в потоке от 5% до 50% за 90 минут, после каждого эксперимента
система промывалась 95% ацетонитрилом в течение 15 минут, а затем 100% растворителем А
еще 5 минут.
Измерение масс-спектров
продуктов
хроматографического разделения
производилось в диапазоне от 300 до 1600 m/z.
2. 5. 4. Биоинформационные методы
Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовали для поиска и
идентификации белков по базе данных IPI-human (международные индексы белков, International
protein indices) (version 3.65; 86379 sequences; 34740770 residues) при помощи программы Mascot
(Matrix Science, Лондон, Великобритания; version 2.0.04) [Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M.,
Cottrell J.S.,1999]. Идентификация в поисковой машине Mascot основана на алгоритме MOWSE.
Первым этапом поиска является сравнение измеренных масс продуктов МС-МС пептидов для
всех записей последовательностей в базе данных с теоретическими масс-спектрами
фрагментации. В итоге по степени совпадения определяется MascotScore, являющийся
индексом достоверности того, что детектируемым пептидам соответствует определенный белок
из конкретной базы данных. Score всех обнаруженных пептидов (конкретного белка)
86
суммируется, откуда вычисляется суммарный Score для белка. Основные параметры для Mascot
поиска были следующие:
1) enzyme – trypsin;
2) peptidtolerance ±5 ppm;
3) MS/MS (fragments) toltrance ±0,5 Дa.
В списке белков, полученном в результате Mascot-поиска, достоверными считались
только те белки, для которых были идентифицированы 2 и более триптических пептида с
рейтингом (Score) более 24. Для автоматического отбора и сравнительного анализа белков,
результаты Mascot-поиска обрабатывали с помощью специальной программы, разработанной в
лаборатории профессора Е.Н. Николаева [Агрон И.А. с соавт., 2010].
Для определения места образования, функции выявленных белков, а также для анализа
биологических процессов, в которых в организме участвуют обнаруженные в моче белки,
использовались биоинформационные ресурсы. Соответствие идентификаторов IPI и Swiss Prot
определялось по базе данных UniProtKB [Magrane M., Consortium U., 2011]. Для анализа
тканеспецифичности
экспрессии
и
преимущественной
тканевой
локализации
белков,
выявленных в моче, использовались базы данных TiGER [Liu X. et al., 2008], The Human Protein
Atlas [Uhlen M. et al., 2010], PaxDB [Wang M. et al., 2012], UniProtKB [Magrane M., Consortium
U., 2011], DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009]. Для определения
молекулярных функций (MF) и биологических процессов (BP) Gene Ontology использовалась
база данных UniProt-GOA (file: gene_association.goa_human, Submission Date: 5/13/2013)
[Dimmer E.C. et al., 2012]. Оценка представленности тканей проводилась с помощью программы
DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009], в которой использовались метод
EASEscore с поправкой Benjamini на множественное сравнение и база UPtissue. Для оценки
сверхпредставленности MF и BP, связанных с выявленными белками, использовался
Hypergeometrictest (Fisher’sexacttest) с поправкой на множественное сравнение Benjamini–
Hochberg. Расчеты проводились с помощью программы BiNGO [Maere S., Heymans K., Kuiper
M., 2005]. Построение ассоциативных генных сетей между белками осуществлялось с помощью
ANDSystem [Demenkov P.S., Ivanisenko T.V., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., 2011].
87
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Возрастные изменения
Объектом исследования послужили образцы мочи, полученные от пятидесяти двух
здоровых мужчин в возрасте от 19 до 54 лет. Во время обследования рацион питания и
водопотребления не контролировались, как и физические нагрузки, которые оставались на
привычном уровне. В результате хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов
мочи было идентифицировано 259 различных белков (по номенклатуре UniProtKB). Так как
белки экспрессируются в различных тканях, из которых они попадают в кровь, и затем – в
мочу, необходимо было определить тканевую принадлежность этого набора белков. Из базы
данных TiGER были извлечены данные о соответствии между регистрируемыми белками и
тканями, на основании содержащейся в данной базе информации о тканеспецифической
экспрессии генов для различных тканей человека. Анализ данных показал, что из общего числа
идентифицированных белков в настоящее время тканевая принадлежность известна для 141
(табл. 5).
Таблица 5.Тканевая представленность белков по базе данных TiGER.
Ткань
мочевой пузырь
кровь
кости
костный мозг
толстая кишка
глаза
сердце
почки
гортань
печень
легкие
мышцы
поджелудочная железа
периферическая нервная система
простата
кожа
тонкая кишка
мягкие ткани
селезенка
желудок
гонады
тимус
язык
Число
белков
3
13
9
8
4
4
8
17
11
32
1
7
9
1
13
10
1
10
8
6
8
1
7
88
Оказалось, что белки, присутствующие в моче, представляют почти все ткани.
Наибольшая их часть экспрессируется в печени (32), почках (17), клетками крови (13), простате
(13), наименьшее - по 1 белку - в легких, периферической нервной системе, тонкой кишке и
тимусе.
Известно, что белки участвуют в биологических процессах, для идентифицированных в
данной работе белков, с помощью базы Gene Ontology, были определены 715 процессов,
которые были сгруппированы в 15 групп (табл. 6).
Таблица 6.
Группы биологических процессов, выявленные с помощью
программы Gene Ontology.
Группы процессов
Регуляция на организменном уровне
Развитие и рост организма
Развитие и рост органов и тканей
Иммунная система
Внутриклеточные процессы
Рост и развитие клеток
Регуляция внеклеточного матрикса
Клеточная подвижность
Клеточная адгезия, взаимодействия
Регуляция ферментативной активности
Метаболизм и каскады, сигнальные пути молекул
Ответ на стимул
Передача и регуляция сигнала
Гемостаз
Участие в воспаление
Число
белков
68
10
51
96
139
18
6
28
43
29
117
56
26
19
9
715
Наибольшее число процессов было отнесено к внутриклеточным (139), затем – к
метаболизму и каскадам сигнальных путей (117). На третьем месте оказались процессы,
связанные с функциями иммунной системы (96); наименьшее число процессов - 6 – относилось
к регуляции внеклеточного матрикса. Таким образом, выявленные белки оказались
участниками множества процессов происходящих в различных клетках и тканях организма.
В связи с тем, что группу здоровых лиц составили добровольцы разного возраста, была
предпринята попытка выявления возраст-зависимых изменений состава белков в моче.
Известно, что анатомо-функциональное старение в самих почках отражается на составе белков,
выводимых с мочой [Glassock R.J., Rule A.D., 2012], возрастное снижение веса почек
начинается с 40-50 лет [Rao U.V., Wagner H.N.Jr., 1972].
89
Анализ наших данных свидетельствует о том, что с возрастом число различных белков в
моче здорового человека слабо, но достоверно увеличивается (R = 0.566, p-value=1.24E-05)
(график 1).
График 1. Зависимость количества белков от возраста испытуемых.
Очевидно, чтобы понять как масса выводимых белков должна меняться в процессе
старения почки, была исследована зависимость между этими показателями. Как оказалось, с
возрастом достоверно увеличивается средняя молекулярная масса белков (R=0.428558, pvalue=0.00079) (график 2).
График 2. Зависимость средней молекулярной массы белков от возраста добровольцев.
По нашим данным, отмечается достоверная корреляция средней массы экскретируемых
белков от возраста, т.е. не только число различных выводимых почкой белков зависит от
возраста, но и их средняя масса. Чем старше человек (в отсутствии заболеваний почек), тем
90
больше разнообразных белков выводятся почками и тем они в среднем тяжелее. Известно, что
стареющая почка характеризуется развитием гиалиноза, уменьшением числа нефронов и
интерстициальным фиброзом [Pannarale G. et al., 2010], с возрастом происходит увеличение
числа склеротических клубочков. Исследование прижизненных биоптатов донорских почек
подтвердило формирование гломерулосклероза на протяжении всей жизни [Rule A.D. et al.,
2010]. При старении органа клубочки приобретают ишемический внешний вид, происходит
утолщение базальной мембраны, интракапсулярный
фиброз, отложение коллагена в
боуменовой капсуле [Mancilla E. et al., 2008]. Отмечается тенденция снижения размеров
почечных телец и сосудистых клубочков всех генераций нефронов после 60 лет, что связано со
значительным снижением числа почечных телец в корковом и мозговом веществе почек
[Тризно М.Н., Асфандияров Ф.Р., Кафаров Э.С., 2009]. По мере снижения числа
функционирующих
почечных
клубочков
оставшиеся
подвергаются
нагрузке
в
виде
гиперфильтрации и гиперперфузии, что приводит к повреждению структуры и нарушению
функций гломерул. Это отражается на скорости клубочковой фильтрации, которая с возрастом
постепенно падает, с 20-25% от 40 до 80 лет [Zürbig P. et al., 2009]. Увеличение с возрастом, как
количества белков, так и их средней молекулярной массы свидетельствует о том, что
описанные выше возрастные изменения в почках приводят к нарушению проницаемости
гломерулярного фильтра, которые сопровождаются повышением его проницаемости для белков
с большей молекулярной массой.
Мы полагали, что в числе выводимых белков возрастная зависимость не распределена
равномерно, т.е. возможно, существует подгруппа белков, чье выведение преимущественно
зависит от возраста обследуемых. Действительно, среди анализируемых белков были выделены
23 белка, которые достоверно чаще встречаются в моче с увеличением возраста обследуемых
(p<0.05). Оказалось, только один белок - регулятор передачи сигналов через рецепторы,
сопряженные с G-белком
(RGSL1) достоверно исчезает с возрастом. Достоверность связи
встречаемости белков и возраста испытуемых оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента
для коэффициента корреляции Пирсона (R package, функция cor.test) с поправкой БенджаминиХокберга на множественное сравнение (R package, функция p.adjust). Коэффициент корреляции
рассчитывался по динамики появления/исчезновения белков (табл. 7).
Таблица 7.
Белки, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением
возраста добровольцев (p<0.05).
Название белка
Название
гена
1
2
Галектин-3-связывающий белок
LGALS3BP
Молекулярная
масса, kDa
3
65,33
R
p-value
4
5
0,66
3,28E-05
91
Продолжение Таблицы 7.
1
2
Ингибитор плазменной
протеазы серинового типа
Фибронектин
Маннан-связывающая лектин
сериновая протеаза 2
Дезоксирибонуклеаза-1
АминопептидазаN
Кубилин
Коллаген альфа-1(VI) цепь
Рецептор тирозин - киназного
белка UFO
Рецептор липопротеина 2
низкой плотности
Полимерный рецептор
иммуноглобулина
Эндосалин
ICOS лиганд
Гелсолин
Глюстерин
Лизосомные альфа-глюкозидазы
Молекулы клеточной адгезии 4
Рецептор G-белка семейства C
Гомолог белка Roundabout 4
CMRF35-подобная молекуле 9
Не - рецепторный белок
тирозин- фосфатазы
Поджелудочная альфа-амилаза
Инсулиноподобный фактор
роста-связывающий белок 7
Примечание:
3
4
5
SERPINA5
45,67
0,62
0,01
FN1
262,62
0,61
0,01
MASP2
75,7
0,55
0,01
DNASE1
ANPEP
CUBN
COL6A1
31,43
109,54
398,74
108,53
0,54
0,54
0,53
0,50
0,01
0,01
0,01
0,01
AXL
98,34
0,50
0,01
LRP2
521,96
0,50
0,01
PIGR
83,28
0,50
0,01
CD248
ICOSLG
GSN
CLU
GAA
CADM4
GPRC5C
ROBO4
CD300LG
80,86
33,35
85,70
52,50
105,32
42,79
48,19
107,46
36,06
0,49
0,49
0,47
0,46
0,45
0,45
0,44
0,43
0,42
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
0,02
SIRPA
54,97
0,42
0,02
AMY2A
57,71
0,40
0,03
IGFBP7
29,13
0,39
0,05
R - коэффициент корреляции Пирсона; corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини
Хокберга (Benjamini Hochberg) на множественность сравнения.
Молекулярная масса этих белков от 29,1 (у инсулиноподобного фактора роста связывающего белка) до 521,958 (у рецептора липопротеина 2 низкой плотности). Т.е., с
возрастом в мочу попадают не только легкие, но и тяжелые белки, что подтверждает наши
предыдущие заключения.
Старение характеризуется общим снижением физиологических функций организма
[Dinenno F.A., Kirby B.S., 2012; Zhou L.Y. et al., 2012]. Процесс старения органов различен,
зависит от многих факторов, включая генетические, образ жизни, влияние окружающей среды,
общих функциональных резервов организма [Пахарукова Н.А с соавт., 2009; Sahin E., DePinho
R., 2010].
Среди идентифицированных белков, частота появления которых в моче увеличивается с
возрастом (23), для 21 тканевая принадлежность известна согласно базе TIGER(табл. 8).
92
Таблица 8. Тканевая принадлежность значимо коррелирующих с возрастом белков мочи.
Ткани
Число белков
костный мозг
2
печень
2
поджелудочная железа
2
гонады
3
кость
3
мягкие ткани
2
толстая кишка
1
тонкая кишка
1
почки
2
селезенка
2
гортань
1
Целью анализа данных на последующем этапе служила необходимость выяснения того, в
каких процессах участвуют достоверно чаще встречающиеся в моче белки с возрастом. Для
этого для 23 белков, (Таблица 7), с помощью программы BiNGO было выявлено 30
сверхпредставленных процесса, которые были объединены в 9 групп (табл. 9).
Таблица 9.
Значимо коррелирующие с возрастом сверхпредставленные процессы,
полученные с помощью программы BINGO.
Группы процессов
Клеточная адгезия и взаимодействия
Метаболизм и каскады, сигнальные пути
молекул
Регуляция на организменном уровне
Гемостаз
Внутриклеточные процессы
Развитие и рост органов и тканей
Иммунная система
Развитие и рост организма
Ответ на стимул
Количество
процессов
4
4
7
5
5
1
2
1
1
30
Среди значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов, полученных
с помощью программы BiNGO можно отметить процессы, связанные с адгезией, с работой
93
иммунной системы, метаболизмом углеводов, обменом витамина D, регуляцией апоптоза
дендритных клеток, гемостазом и другие.
Таким образом, с помощью высокотехнологичных протеомных методов, на основе
хромато-масс-спектрометрии, в образцах мочи, полученных от пятидесяти двух здоровых
мужчин, в возрасте от 19 до 54 лет, было выявлено 259 различных белков. Для 141 из них
определена тканевая принадлежность и выявлены 715 процессов, в которых они участвуют.
Отмечена достоверная положительная корреляция средней степени выраженности числа (R =
0.566, p-value=1.24E-05) и массы белков (R=0.428558, p-value=0.00079) с возрастом.
Определены 23 белка, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением возраста
обследуемых (p<0.05) и только один белок - RGSL1- регулятор передачи сигналов через
рецепторы, сопряженные с G-белком (МВ 125,69) - реже. Продуцентами значимо связанных с
возрастом обследуемых белков мочи, по базе TiGER, оказались 11 тканей организма. Среди
значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов можно отметить
процессы, связанные с адгезией, с функциями иммунной системы, метаболизмом углеводов,
обменом витамина D, регуляцией апоптоза дендритных клеток, гемостазом и другие.
3.2. Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей.
Достоверные источники для оценки вариабельности содержания тех или иных белков в
моче у здоровых лиц малочисленны [Sun W. et al., 2009; Liu X. et al., 2012]. Используя
преимущество контролируемых условий комплексного эксперимента с длительной изоляцией
(520 суток), было проведено исследование протеомного состава мочи 6 здоровых добровольцев.
Одним
из
условий
их
жизнедеятельности
был
контролируемый,
но
периодически
изменяющийся режим потребления соли (табл. 2). Проведение балансовых исследований на
протяжении первой половины эксперимента требовало от испытателей полного потребления
всех продуктов рациона питания, а также учета потребления жидкости. С 252 суток и до конца
восстановительного периода режим солепотребления был произвольным. Pационы по
содержанию необходимых организму человека пищевых веществ соответствовали принятым
физиологическим нормам для контингентов, чья профессиональная деятельность по
энерготратам относится к категории средней тяжести. Пищевой состав рационов отвечал
рекомендациям ВОЗ, а также был согласован с российско-американскими нормами по
пищевому составу рационов питания для экипажей Международной Космической Станции
[Агуреев А.Н., Сидоренко Л.А., 2012].
Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов, полученных в ходе
520 суточной изоляции, были представлены отчётами по идентификации IPI индексов белков в
базе данных Mascot [Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S., 1999]. В образцах мочи
94
6 испытателей было достоверно обнаружено 256 различных белков. Белковый состав мочи на
протяжении времени наблюдения сильно варьировал. Постоянными белками, в течение 520
суток оставались семь белков: эпидермальный фактор роста, полимерный рецептор
иммуноглобулина, ингибитор сериновых протеаз плазмы, белок AMBP, кератин, тип II
цитоскелета 1, коллаген альфа-1 (VI) цепи, сывороточный альбумин [Пастушкова Л.Х. с соавт.
2014].
Согласно базам данных TiGER [Liu X. et al., 2008], The Human Protein Atlas [Uhlen M. et al.,
2010], PaxDB [Wang M. et al., 2012], Uniprot KB [Magrane M., Consortium U., 2011] постоянные
белки распределены по более, чем 20 тканям. Наибольшим количеством белков оказались
представлены печень, плазма и моча (все 7 белков). Следующими тканями по представленности
являются кожа и тромбоциты (6 белков). Статистический анализ сверхпредставленности тканей
с использованием программы DAVID [Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009] показал,
что печень является наиболее статистически значимо представленным органом. Согласно этой
программе, 5 из 7 постоянных белков могут экспрессироваться в печени, и попадать в мочу из
крови (табл. 10).
Таблица 10. Сверхпредставленные ткани базы данных UP tissue (DAVID)
в списке постоянных белков.
Ткань
Печень
Плазма
Корреляция
p-value
(Benjamini)
AMBP белок, ингибитор сериновых протеаз
0,023
плазмы, альбумин, коллаген альфа-1 (VI) цепи,
полимерный рецептор иммуноглобулина
AMBP белок, ингибитор сериновых протеаз
0,028
плазмы, полимерный рецептор иммуноглобулина
Число постоянных белков в ткани
Вторым статистически значимо представленным источником постоянных белков
оказалась плазма крови. Плазма была представлена 3-мя белками, которые также распределены
и в печени (табл. 10).
Одним из белков, значимо представленных как в печени, так и плазме является AMBP.
Это белок-предшественник α1-микроглобулина (А1М) и бикунина, двух гликопротеинов
плазмы [Tyagi S., Salier J-P., Lal S.K., 2002]. А1М – это гликопротеин, имеющий массу 26 кДа,
белок, обнаруживаемый у млекопитающих, птиц, рыб и амфибий, широко распространен в
различных физиологических жидкостях, включая плазму, мочу и спинномозговую жидкость
[Zhang J-Y., Chen Z-W., Yao H., 2012]. Часть белков А1М плазмы существует в свободной
форме, часть - образует комплексы с иммуноглобулином А, у человека - с протромбином и
альбумином [Berggård T. et al., 1997]. Белок участвует в регуляции роста клетки, метаболизме и
95
иммунном ответе, в связывании и катаболизме гема [Allhorn M. et al., 2002]. Полагают, что А1М
защищает ткани от разрушительного действия гема при внутрисосудистом гемолизе [Allhorn M.
et al., 2002]. Показано, A1M имеет иммуносупрессивные свойства, является ингибитором
миоксалата кальция [Igci M. et al., 2010].
Постоянным белком мочи, который связан со сверхпредставленностью печени и плазмы
крови согласно DAVID, является и ингибитор сериновой протеазы плазмы (PCI), или ингибитор
С-белка. Это гликопротеин массой 57 кДа, состоящий из 387 аминокислотных остатков [Suzuki
K. et al., 1987], принадлежит суперсемейству серпинов (ингибиторов сериновой протеазы).
Наиболее богатым источником белковых ингибиторов сериновых протеаз является плазма
крови. мРНК этого белка встречается во многих тканях и клетках: в печени, сперматозоидах, в
мужских и женских репродуктивных органах, клетках почечных канальцев, кератиноцитах
эпидермиса, тромбоцитах, тучных клетках, макрофагах и мегакариоцитах [Hayashi T., Su T-P.,
2004; Prohaska T.A., Wahlmüller F.C., Furtmüller M., Geiger M., 2012]. PCI обладает
кровоостанавливающим эффектом, действует как прокоагулянт и провоспалительный фактор,
ингибируя активированный С-белок и комплекс тромбин-тромбомодулин. В то же время может
действовать как антикоагулянт, инактивируя такие факторы свертывания, как тромбин, фактор
Xa, фактор XI, калликрены плазмы и фибринолитические ферменты [Rezaie A.R., Cooper S.T.,
Church F.C., Esmon C.T., 1995]. Данный белок в моче способствует угнетению активатора
плазминогена u-PA и калликренов, обладает антимикробными эффектами [Malmström E. et al.,
2009]. PCI участвует в оплодотворении, модулируя активность акрозина, (сериновой протеазы
сперматозоида) защищая окружающие ткани от разрушительного действия акрозина [España F.
et al., 2007].
Cывороточный
альбумин,
связанный
с
перепредставленностью
печени
по
тканеспецифичной экспрессии постоянных белков мочи, является основным транспортным
белком плазмы крови, который выполняет транспортные функции для воды, ионов кальция,
натрия, калия, жирных кислот, гормонов, билирубина и участвует в поддержании
осмоляльности плазмы крови, является основным депо цинка (связывает до 85% всего
количества цинка в плазме) [Lu J. et al., 2008]. Почки человека фильтруют около 3,3 грамм
альбумина ежедневно [Tojo A., Kinugasa S., 2012]. Эффективный радиус альбумина около 36 Å,
что позволяет ему достаточно свободно проходить через гломерулярную мембрану [Maack T. et
al., 1979]. В норме в моче обнаруживается лишь незначительное количество белка (альбумина
<5 мг/л). Известно, что альбумин реабсорбируется в проксимальных канальцах путём рецепторопосредованного эндоцитоза, осуществляется с помощью мегалина, дисфункция которого
отражается на реабсорбции альбумина [Tojo A., Kinugasa S., 2012]. Альбумин человека является
многофункциональным белком, обладающим защитными свойствами, защищает клетки от
96
апоптоза при хронической лимфоцитарной лейкемии [Chuang Y.C. et al., 1992]. Оказывает
защитные
эффекты
благодаря
антиоксидантным
и
антиапоптотическим
механизмам,
противодействуя эндогенным и экзогенным источникам окислительного стресса [Erridge C. et
al., 2004]. Введение средних и высоких доз альбумина человеку внутривенно ослабляет
повреждение тканей головного мозга при ишемическом инсульте, при черепно-мозговой травме
[Chatzidaki-Livanis M. et al., 2006]. Отмечена положительная корреляция между синтезом
альбумина и объемом плазмы крови и концентрацией фибриногена [Rubenstein D.A., Yin W.,
2009]. Альбуминурия является важным маркером риска сердечно-сосудистых и почечных
заболеваний [Kuritzky L., Toto R., Van Buren P., 2011], оказывает влияние на тромбоциты и
субэндотелиальные ткани, участвует в процессе гемостаза [Rubenstein D.A., Yin W., 2009].
Последним среди идентифицированных в эксперименте постоянных белков мочи,
связанных одновременно со сверхпредставленностью печени и плазмы, является полимерный
рецептор иммуноглобулина (PIGR). Это один из наиболее известных белков, циркулирующих в
крови, который связывает иммуноглобулины классов А и М на базолатеральной поверхности
эпителиальных клеток [Ohlmeier S. et al., 2012]. Белок участвует в структурно-функциональном
синергизме между В-клеточной системой иммунитета и секреторным эпителием, обеспечивая
антиген-независимый транспорт иммуноглобулинов из кровотока [Emmerson C.D. et al., 2011].
мРНК полимерного рецептора иммуноглобулина обнаружена в печени, кишечнике, желудке,
легких, а также в клетках эпителия дистальных канальцев почек [Grönwall C. et al., 2012],
является постоянным компонентом протеома мочи здорового человека [Tan Y., Zhang J-J., Liu
G. et al., 2009].
Среди белков, обеспечивающих, согласно DAVID, перепредставленность печени также
является коллаген альфа-1 (VI). Этот белок является альфа-цепью коллагена VI, внеклеточного
компонента, присутствует в соединительной ткани и хряще, где образует множество
структурно-уникальных микрофибрилл вблизи базальной мембраны, взаимодействует с рядом
молекул внеклеточного матрикса [Ishikawa H. et al., 2002]. Известно, что коллаген синтезируют
и секретируют во внеклеточное пространство многие клетки, но в количественном отношении
главными продуцентами коллагена являются фибробласты. Исследования показали, что
коллаген VI соединяет базальную мембрану с перицеллюлярным матриксом в мышце [Ishikawa
H. et al., 2004]. Другие данные говорят о роли коллагена VI в клеточной сигнализации и
миграции клеток [Jimenez-Mallebrera C., Brown S.C., Sewry C.A., Muntoni F., 2005]. Три цепи
коллагена VI: α1(VI), α2(VI) и 3(VI) образуют тройную цепь длиной 100 нм с глобулярными
доменами на N- и С-конце, мутации в любой из них ведут к миопатии Бэтлема или более
тяжелой врожденной мышечной дистрофии Ульриха [Lampe A.K., Bushby K.M.D., 2005].
97
Среди постоянных белков мочи кератин и эпидермальный фактор роста оказались не
связанными со сверхпредставленными тканями, выявленными программой DAVID. Кератин,
тип II цитоскелета 1 или цитокератин 1 принадлежит к семейству кератинов и является
компонентом центрального протеома [Burkard T.R. et al., 2011]. Это основные структурные
белки эпидермиса позвоночных, вместе с актиновыми филаментами и микротрубочками они
образуют цитоскелет эпителиальных клеток позвоночных [Schweizer J. et al., 2006]. В
настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов - CK1-CK20. Спектр цитокератинов в
эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки, положения клетки в эпителиальном
пласте, в клетках однослойного эпителия экспрессируется CK8 и CK18. Присутствие
цитокератинов в клетке является признаком, который может быть использован для
идентификации эпителия: каждому виду эпителиальных клеток с определенной функцией и
локализацией соответствует характерный набор цитокератиновых полипептидов [Бабиченко
И.И., Ковязин В.А., 2008]. Окислительный стресс увеличивает экспрессию кератина 1
эндотелия и активирует лектиновый путь активации компемента (LCP) посредством
присоединения маннозо-связывающего лектина (МBL) к цитокератину 1 [Lei T., Zhao X., Jin S.
et al., 2013]. Lei с соавт., в протеоме мочи здоровых лиц с помощью 2-DE гель-электрофореза, в
сочетании с время-пролетной масс-спектрометрией, обнаружили 14 белков, в том числе ALB,
белок AMBP, кератин типа II цитоскелета 1 [Lei T. et al., 2013].
Одним из самых часто встречаемых белков в протеоме мочи является эпидермальный
фактор роста (EGF)
[Nagaraj N., Mann M., 2011], играет важнейшую роль в регуляции
жизнедеятельности клетки, регуляции транспорта ионов, восстановительных, обменных
процессов в тканях организма [Glogowska A. et al., 2012]. Дистальные канальцы почки,
синтезируют препро-EGF, EGF-продуцирующие клетки локализованы в толстой части
восходящего колена и дистальных извитых канальцев почки мышей и крыс, и, вероятно, у
человека [Nouwen E.J. et al., 1994]. Была предложена экскреция с мочой эпидермального
фактора роста и белка Тамма-Хорсфалла в качестве потенциального маркера функции
дистального канальца нефрона [Thulesen J. et al., 1997]. Рецепторы этого белка поддерживают
баланс между активностью клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза, участвуют
в регуляции клеточного роста и миграции клеток [Al Moustafa A-E., Achkhar A., Yasmeen A.,
2012], играют важную роль в регуляции почечной гемодинамики и транспорта ионов [Pyl’nik
T.O. et al., 2012]. EGF стимулирует реабсорбцию Mg2+ в дистальных извитых канальцах
нефрона, посредством EGF-рецептора и активации канала TRPM6 переходного рецепторного
потенциал-зависимого канала, подсемейства B, расположенного в дистальных канальцах
нефрона, который является основным местом активного трансцеллюлярного транспорта Са2+и
Mg2 [Dimke H., Hoenderop J.G.J., Bindels R.J.M., 2011].
98
Наибольшей
статистической
значимостью,
согласно
программе
Bingo,
среди
сверхпредставленных клеточных компонент GO оказались альфа гранулы тромбоцитов и
внеклеточный регион и внеклеточное пространство (табл. 11). С процессом - альфа гранулы
тромбоцитов оказались связанными три белка (ALB, SERPINA5, EGF). Внеклеточное регион
был представлен шестью из семи постоянных белков за исключением KRT1. Четыре белка
(AMBP, ALB, SERPINA5, EGF) были связаны с внеклеточным пространством. Из таблицы
видно, что одной из характеристик постоянных белков может быть их внеклеточная
локализация.
Таблица 11. Сверхпредставленные клеточные компоненты GO (Bingo)
для постоянных белков.
Название генов
GO
альфа гранулы
тромбоцитов
ALB, SERPINA5, EGF
внеклеточный регион
часть внеклеточного
региона
внеклеточное
пространство
AMBP, ALB, SERPINA5, OL6A1,
PIGR, EGF
AMBP, ALB, SERPINA5, OL6A1,
EGF
AMBP, ALB, SERPINA5, EGF
p-value
сorrected
p-value
1,83E-07
1,66E-05
3,26E-06
1,05E-04
3,48E-06
1,05E-04
2,65E-05
6,02E-04
Анализ сверхпредставленности биологических процессов и молекулярных функций GO
позволил выявить 48 молекулярных функций (табл. 12).
Таблица 12. Сверхпредставленные молекулярных функций, по GO,
для постоянных белков (BiNGO, GOA).
GO
Название генов
p-valu
corrected
p-value
1
2
3
4
связывание монокарбоновой
кислоты
связывание оксалата кальция
связывание IgA
активность ингибитора
эндопептидазы серинового типа
связывание белка
связывание акрозина
активность активатора рецептора
трансмембранного белка
тирозинкиназы
связывание карбоновой кислоты
ALB, SERPINA5
3,85E-05
3,12E-03
AMBP
AMBP
1,62E-04
3,24E-04
6,55E-03
7,49E-03
AMBP, SERPINA5
4,63E-04
7,49E-03
AMBP, ALB, SERPINA5,
5,02E-04
KRT1, COL6A1, EGF
SERPINA5
6,47E-04
7,49E-03
7,49E-03
EGF
6,47E-04
7,49E-03
ALB, SERPINA5
8,18E-04
7,64E-03
99
Продолжение Таблицы 12.
1
активность эндопептидазного
ингибитора
регулятор активности
эндопептидазы
активности ингибитора пептидазы
активность ингибитора
кальциевого канала
связывание токсичного вещества
активность регулятора пептидазы
связывание фосфатидил холина
активность активатора белка
тирозинкиназы
связывание тромбоцитарного
фактора роста
активность регулятора
ферментативной деятельности
связывание ретиноевой кислоты
связывание иммуноглобулина
активность ингибитора фермента
активность ингибитора ионного
канала
активность ингибитора канала
связывание четвертичной группы
аммония
связывание рецептора
эпидермального фактора роста
активность активатора рецептора
связывание жирных кислот
связывание ретиноида
активность регулятора
кальциевого канала
связывание изопреноида
активность регулятора рецептора
активность активатора
протеинкиназы
связывание клеточной
поверхности
связывание шаперона
активность активатора киназы
связывание протеазы
связывание алкоголя
связывание лекарства
связывание ионов меди
активность регулятора канала
связывание липидов
связывание рецептора фактора
роста
антиоксидантная активность
связывание фактора роста
2
3
4
AMBP, SERPINA5
9,77E-04
7,64E-03
AMBP, SERPINA5
1,01E-03
7,64E-03
AMBP, SERPINA5
1,06E-03
7,64E-03
AMBP
1,13E-03
7,64E-03
ALB
AMBP, SERPINA5
SERPINA5
1,29E-03
1,35E-03
1,46E-03
7,82E-03
7,82E-03
7,86E-03
EGF
2,10E-03
1,06E-02
COL6A1
2,26E-03
1,08E-02
AMBP, SERPINA5, EGF
2,68E-03
1,17E-02
SERPINA5
AMBP
AMBP, SERPINA5
2,75E-03
3,07E-03
3,09E-03
1,17E-02
1,19E-02
1,19E-02
AMBP
4,20E-03
1,47E-02
AMBP
4,20E-03
1,47E-02
SERPINA5
4,36E-03
1,47E-02
EGF
4,52E-03
1,47E-02
EGF
ALB
SERPINA5
5,17E-03
5,49E-03
5,97E-03
1,61E-02
1,61E-02
1,61E-02
AMBP
5,97E-03
1,61E-02
SERPINA5
EGF
5,97E-03
7,10E-03
1,61E-02
1,86E-02
EGF
9,51E-03
2,34E-02
ALB
9,67E-03
2,34E-02
ALB
EGF
SERPINA5
SERPINA5
ALB
ALB
AMBP
ALB, SERPINA5
9,83E-03
1,13E-02
1,35E-02
1,51E-02
1,61E-02
1,85E-02
1,89E-02
2,14E-02
2,34E-02
2,61E-02
3,04E-02
3,31E-02
3,43E-02
3,84E-02
3,84E-02
4,23E-02
EGF
2,23E-02
4,30E-02
ALB
COL6A1
2,31E-02
2,48E-02
4,35E-02
4,53E-02
100
Продолжение Таблицы 12.
1
2
связывание фермента
структурная составляющая
цитоскелета
связывание пиридоксальфосфата
связывания гепарина
3
4
ALB, SERPINA5
2,52E-02
4,53E-02
KRT1
2,64E-02
4,61E-02
ALB
SERPINA5
2,67E-02
2,74E-02
4,61E-02
4,62E-02
и 151 биологический процесс (табл. 13), ассоциированных с постоянными белками.
Таблица 13. Сверхпредставленныебиологические процессы GO для постоянных белков
(BiNGO, GOA).
GO
Название генов
1
дегрануляция тромбоцитов
многоклеточные организменные
процессы
ответ на ион платины
отрицательное регулирование
биологического процесса
обеспечение локализации
митохондрии в клетке
положительная регуляция циркадного
сна / цикла бодрствование,
медленного сна
разрушение симбионтом клеткихозяина
гемолиз симбионтом эритроцитов
клетки-хозяина
гемолиз другого организма,
участвующего в симбиотическом
взаимодействии
положительная регуляция процесса
биосинтеза гиалуронана
гемолиз другого организма
лизис симбионтом клеток-хозяев
цитолиз симбионтом клеток-хозяев
цитолиз другого организма
цитолиз другого организма,
участвующего в симбиотическом
взаимодействии
активации тромбоцитов
регулирование протеолиза
регулирование процесса биосинтеза
гиалуронана
2
p-value
3
corrected
p-value
4
ALB, EGF
AMBP, ALB,
SERPINA5, KRT1
COL6A1, EGF
ALB
AMBP, ALB
SERPINA5, KRT1,
EGF
7,46E-05
1,80E-02
1,51E-04
1,80E-02
1,59E-04
1,80E-02
2,17E-04
1,80E-02
ALB
3,18E-04
1,80E-02
ALB
3,18E-04
1,80E-02
ALB
4,76E-04
1,80E-02
ALB
4,76E-04
1,80E-02
ALB
4,76E-04
1,80E-02
EGF
4,76E-04
1,80E-02
ALB
ALB
ALB
ALB
4,76E-04
4,76E-04
4,76E-04
4,76E-04
1,80E-02
1,80E-02
1,80E-02
1,80E-02
ALB
4,76E-04
1,80E-02
ALB, EGF
SERPINA5, EGF
5,36E-04
5,45E-04
1,82E-02
1,82E-02
EGF
6,35E-04
1,90E-02
101
Продолжение Таблицы 13.
1
отрицательное регулирование
холестерина
положительная регуляция циркадного
сна / бодрствование цикла, сна
импорт белка STAT в ядро
катаболический процесс пигмента
активация комплемента, лектиновый
путь
катаболический процесс гема
регулирование циркадного сна /
цикла бодрствование, медленного сна
разрушение клеток другого
организма, участвующего в
симбиотическом взаимодействии
лизис клеток другого организма,
участвующего в симбиотическом
взаимодействии
экзоцитоз
положительная регуляция циркадного
ритма
отрицательное регулирование
эндопептидазной активности
отрицательное регулирование
пептидазной активности
обеспечение локализации органеллы
в клетке
положительное регулирование
импорта катенина в ядро
регулирование локализации белка на
поверхности клетки
положительная регуляция
рецепторной активности,
активированной эпидермальным
фактором роста
гетеротримеризация белка
отрицательное регулирование
стеринового транспорта
отрицательная регуляция транспорта
холестерина
активация трансмембранного
рецептора белка тирозинкиназы
регулирование ответа на стимул
натрий-независимый органический
транспорт аниона
положительная регуляция
пролиферации предшественника
гранулярной клетки мозжечка
ответ на ион ртути
2
3
4
EGF
6,35E-04
1,90E-02
ALB
7,94E-04
2,26E-02
EGF
AMBP
9,53E-04
1,11E-03
2,52E-02
2,52E-02
KRT1
1,11E-03
2,52E-02
AMBP
1,11E-03
2,52E-02
ALB
1,27E-03
2,52E-02
ALB
1,27E-03
2,52E-02
ALB
1,27E-03
2,52E-02
ALB, EGF
1,30E-03
2,52E-02
ALB
1,43E-03
2,52E-02
AMBP, SERPINA5
1,45E-03
2,52E-02
AMBP, SERPINA5
1,57E-03
2,52E-02
ALB
1,59E-03
2,52E-02
EGF
1,59E-03
2,52E-02
EGF
1,75E-03
2,52E-02
EGF
1,75E-03
2,52E-02
COL6A1
1,75E-03
2,52E-02
EGF
1,75E-03
2,52E-02
EGF
1,75E-03
2,52E-02
EGF
1,75E-03
2,52E-02
AMBP, ALB, KRT1,
EGF
1,77E-03
2,52E-02
ALB
1,90E-03
2,61E-02
EGF
2,06E-03
2,61E-02
ALB
2,06E-03
2,61E-02
102
Продолжение Таблицы 13.
1
положительная регуляция
фосфориляции пептидил - треонина
положительная регуляция ответа на
стимул
катаболический процесс
тетрапиррола
катаболический процесс
порфирин- содержащее соединение
регулирование пролиферации
предшественника гранулярной клетки
мозжечка
взаимодействие с хозяином
регулирование циркадного сна /
цикла бодрствования
связь белок-хромофор
негативная регуляция клеточных
процессов
межвидовое взаимодействие между
организмами
симбиоз, охватывающий мутуализм
через паразитизм
положительная регуляция
сигнального пути рецептора
эпидермального фактора роста
регулирование эндопептидазной
активности
негативная регуляция гидролазной
активности
регулирование импорта ионов
кальция
положительная регуляция ERBB
сигнального пути
свертывание крови
коагуляция
гемостаз
слияние сперматозоида с
плазматической мембраной
яйцеклетки
циркадный сон/ цикл бодрствования
регуляция пептидазной активности
лизис клеток другого организма
установление полярности
эпителиальной клетки
разрушение клеток другого организма
секреция клетки
слияние плазменной мембраны
регулирование фосфорилирования
пептидил - треонина
циркадный сон
2
3
4
EGF
2,06E-03
2,61E-02
ALB, KRT1, EGF
2,08E-03
2,61E-02
AMBP
2,22E-03
2,61E-02
AMBP
2,22E-03
2,61E-02
EGF
2,38E-03
2,61E-02
AMBP, ALB
2,41E-03
2,61E-02
ALB
2,54E-03
2,61E-02
AMBP
AMBP, ALB,
SERPINA5, EGF
2,54E-03
2,61E-02
2,61E-03
2,61E-02
AMBP, ALB
2,65E-03
2,61E-02
AMBP, ALB
2,65E-03
2,61E-02
EGF
2,70E-03
2,61E-02
AMBP, SERPINA5
2,75E-03
2,61E-02
AMBP, SERPINA5
2,85E-03
2,61E-02
EGF
2,86E-03
2,61E-02
EGF
2,86E-03
2,61E-02
ALB, EGF
ALB, EGF
ALB, EGF
2,91E-03
2,91E-03
2,98E-03
2,61E-02
2,61E-02
2,61E-02
SERPINA5
3,01E-03
2,61E-02
ALB
AMBP, SERPINA5
ALB
3,01E-03
3,06E-03
3,17E-03
2,61E-02
2,61E-02
2,61E-02
ALB
3,17E-03
2,61E-02
ALB
ALB, EGF
SERPINA5
3,17E-03
3,32E-03
3,49E-03
2,61E-02
2,68E-02
2,68E-02
EGF
3,49E-03
2,68E-02
ALB
3,49E-03
2,68E-02
103
Продолжение Таблицы 13.
1
катаболический процесс кофактора
сборка клеточного компонента
негативная регуляция липидного
транспорта
регулирование потока холестерина
ERK1 и ERK2 каскад
отрицательное регулирование JNK
каскада
циркадное поведение
регулирование катенина в ядро
транспорт желчных кислот и желчных
солей
ритмическое поведение
биогенез клеточного компонента
модификация симбионтом
морфологии или физиологии хозяина
положительная регуляция белкового
убиквитинирования, участвующего в
убиквитин-зависимом
катаболическом процессе белка
локализация митохондрий
негативная регуляция стресс активируемого МАРК каскада
отрицательное регулирование стрессактивируемого сигнального каскада
протеинкиназы
регулирование уровня биологических
жидкостей
положительная регуляция
тирозинкиназной активности
секреция
регулирование МАРК каскада
тримеризация белка
фибринолиз
регулирование рецепторной
активности, активируемой
эпидермальным фактором роста
положительная регуляция связывания
ДНК
заживление ран
регуляция убиквитинирования белка,
участвующего в убиквитинзависимом катаболическом процессе
белка
регуляция циркадного ритма
регуляция транспорта холестерина
регуляция транспорта стерола
активация клеток
2
3
4
AMBP
ALB, COL6A1, EGF
3,49E-03
3,54E-03
2,68E-02
2,68E-02
EGF
3,65E-03
2,73E-02
EGF
EGF
3,96E-03
3,96E-03
2,89E-02
2,89E-02
AMBP
4,12E-03
2,89E-02
ALB
EGF
4,12E-03
4,12E-03
2,89E-02
2,89E-02
ALB
4,28E-03
2,97E-02
ALB
ALB, COL6A1, EGF
4,44E-03
4,53E-03
3,04E-02
3,06E-02
ALB
4,76E-03
3,12E-02
EGF
4,76E-03
3,12E-02
ALB
4,91E-03
3,12E-02
AMBP
4,91E-03
3,12E-02
AMBP
4,91E-03
3,12E-02
ALB, EGF
4,94E-03
3,12E-02
EGF
5,07E-03
3,16E-02
ALB, EGF
AMBP, EGF
COL6A1
KRT1
5,17E-03
5,34E-03
5,39E-03
5,39E-03
3,16E-02
3,16E-02
3,16E-02
3,16E-02
EGF
5,39E-03
3,16E-02
EGF
5,39E-03
3,16E-02
ALB, EGF
5,47E-03
3,17E-02
EGF
5,86E-03
3,36E-02
ALB
EGF
EGF
ALB, EGF
6,34E-03
6,34E-03
6,34E-03
6,46E-03
3,53E-02
3,53E-02
3,53E-02
3,56E-02
104
Продолжение Таблицы 13.
1
регуляция процесса биосинтеза
полисахаридов
метаболизм жёлчной кислоты
положительная регуляция митоза
регуляция метаболизма полисахарида
положительная регуляция деления
ядра
транспорт органического вещества
положительная регуляция активности
рецепторов
отрицательная регуляция ERBB
сигнального пути
отрицательная регуляция сигнального
пути рецептора эпидермального
фактора роста
развитие дольки молочной железы
развитие альвеолы молочной железы
лизис клетки
метаболизм гема
ответ врожденного иммунитета
организация клеточного компонента
регуляция многоклеточного
организменного процесса
положительная регуляция
метаболизма углеводов
модификация морфологии или
физиологии другого организма,
которые участвуют в симбиотических
взаимодействия
регуляции иммунного ответа
отрицательная регуляция протеолиза
JAK-STAT каскад
негативная регуляция гемостаза
негативная регуляция свертывания
крови
биогенез или организация клеточного
компонента
ответ на органическое вещество
положительная регуляция
пролиферации клетки
предшественника нейрона
отрицательная регуляция передачи
сигнала
регулирование активности белка
тирозинкиназы
клеточный ответ на стимул
аминокислотой
2
3
4
EGF
6,65E-03
3,63E-02
ALB
EGF
EGF
7,13E-03
7,29E-03
7,29E-03
3,83E-02
3,83E-02
3,83E-02
EGF
7,29E-03
3,83E-02
ALB, SERPINA5,
EGF
7,48E-03
3,85E-02
EGF
7,60E-03
3,85E-02
EGF
7,60E-03
3,85E-02
EGF
7,60E-03
3,85E-02
EGF
EGF
ALB
AMBP
KRT1, EGF
ALB, SERPINA5,
COL6A1, EGF
7,76E-03
7,76E-03
7,92E-03
8,07E-03
8,22E-03
3,87E-02
3,87E-02
3,91E-02
3,95E-02
3,99E-02
8,31E-03
4,00E-02
ALB, KRT1, EGF
8,41E-03
4,02E-02
EGF
8,86E-03
4,07E-02
ALB
8,86E-03
4,07E-02
AMBP, KRT1
SERPINA5
EGF
KRT1
8,92E-03
9,02E-03
9,02E-03
9,02E-03
4,07E-02
4,07E-02
4,07E-02
4,07E-02
KRT1
9,02E-03
4,07E-02
9,23E-03
4,10E-02
9,23E-03
4,10E-02
EGF
9,49E-03
4,18E-02
AMBP, EGF
9,78E-03
4,28E-02
EGF
9,97E-03
4,32E-02
COL6A1
1,01E-02
4,33E-02
ALB, SERPINA5,
COL6A1, EGF
ALB, COL6A1, EGF
105
Продолжение Таблицы 13.
1
регуляция каскада внутриклеточной
протеинкиназы
негативная регуляция коагуляции
негативная регуляция каталитической
активности
отрицательная регуляция сигнального
пути
отрицательная регуляция клеточной
коммуникации
модификация морфологии или
физиологии другого организма
метаболизм порфирин-содержащего
соединения
регуляция ответа на стресс
2
3
4
AMBP, EGF
1,01E-02
4,33E-02
KRT1
1,03E-02
4,36E-02
AMBP, SERPINA5
1,05E-02
4,42E-02
AMBP, EGF
1,06E-02
4,43E-02
AMBP, EGF
1,07E-02
4,43E-02
ALB
1,08E-02
4,43E-02
AMBP
1,09E-02
4,43E-02
1,09E-02
4,43E-02
1,14E-02
4,59E-02
1,17E-02
1,21E-02
1,22E-02
1,22E-02
4,68E-02
4,76E-02
4,76E-02
4,76E-02
1,23E-02
4,76E-02
1,23E-02
4,76E-02
1,25E-02
4,79E-02
1,26E-02
4,82E-02
1,30E-02
4,91E-02
1,33E-02
4,99E-02
AMBP, KRT1
AMBP, SERPINA5,
регуляция каталитической активности
EGF
катаболический процесс коллагена
COL6A1
сборка белкового комплекса
COL6A1, EGF
биогенез белкового комплекса
COL6A1, EGF
сборка апикального соединения
ALB
клеточный ответ на эндогенный
COL6A1, EGF
стимул
регулирование сигнального пути
рецептора эпидермального фактора
EGF
роста
регулирование ERBB сигнального
EGF
пути
разборка внеклеточного матрикса
COL6A1
многоклеточный организменный
COL6A1
катаболический процесс
положительная регуляция импорта
EGF
белка в ядро
Как видно из таблиц, число белков, ассоциированных с каждым из этих биологических
процессов или молекулярных функций, варьирует в пределах 1-3. Исключение составили
процессы организменные многоклеточные процессы (“multicellular organismal process”,
ассоциировано 6), негативное регулирование биологического процесса (“negative regulation of
biological process”, ассоциировано 5), регулирование ответа на стимул (“regulation of response to
stimulus”, ассоциированно 4), негативная регуляция клеточных процессов (“negative regulation
of cellular process”, ассоциированно 4), организация клеточного компонента (“cellular component
organization”, ассоциированно 4) и биогенез или организация клеточного компонента (“cellular
component organization or biogenesis”, ассоциированно 4). Эти биологические процессы можно
отнести к фундаментальным процессам, в которые вовлечены тысячи белков человека. Среди
106
молекулярных функций исключением является связывание с белками («protein binding»), с
которой ассоциировано 6 белков.
Согласно проведенному анализу биологических процессов постоянные белки оказались не
сильно связаны друг с другом общими процессами. Белок-белковые взаимодействия также
широко распространены и являются основой функционирования белков в многоклеточном
организме. Необходимо было выяснить, насколько постоянные белки являются связанными в
молекулярно-генетических сетях. Для этого мы реконструировали ассоциативную генную сеть
с помощью программы ANDSystem [Demenkov P.S., Ivanisenko T.V., Kolchanov N.A., Ivanisenko
V.A., 2011], в которой постоянные белки были стартовыми вершинами (или хабами) (рис. 1).
Рисунок 1.
Ассоциативная сеть взаимодействия постоянных белков протеома мочи.
Крупными красными шариками выделены постоянные белки. Мелкие
красные шарики - добавленные при реконструкции новые белки,
показывают отдельные взаимодействия между парой белков.
Сравнение ассоциативной генной сети со случайными сетями показал их незначимое
отличие по рассматриваемым характеристикам, что также подтверждает функциональную
независимость друг от друга постоянных белков. В связи с этим, можно предположить, что
идентифицированный набор белков может представлять собой независимые маркеры
различных процессов в организме здорового человека.
Таким образом, с использованием масс-спектрометрического протеомного анализа была
охарактеризована постоянная составляющая протеома мочи здорового человека в эксперименте
107
с 520-суточной изоляцией здоровых добровольцев в наземном комплексе с автономной
системой поддержания жизнедеятельности. Было выявлено 7 белков, преимущественно
синтезирующихся в печени и плазме крови и осуществляющих свою функцию во внеклеточном
пространстве. Анализ сверхпредставленности молекулярных функций и биологических
процессов GeneOntology показал низкую функциональную связанность этих белков между
собой. Полученные данные позволяют заключить, что идентифицированные белки могут
представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме
здорового человека, а также использоваться как стандарты при определении концентрации
других белков в моче.
3.3. Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковый состав мочи
Объектом исследования служили образцы мочи шести добровольцев в возрасте от 26 до
41 года, которые жили в условиях изоляции в гермообъекте в течение 105 суток, находясь в
одинаковых контролируемых условиях [Моруков Б.В., Демин Е.П., Васильева Г.Ю., 2010].
Моча для протеомных исследований собиралась ежедневно в течение семи дней перед началом
эксперимента, еженедельно в течение 105-сутояной изоляции, а также в первый и седьмой день
периода реадаптации.
При прямом профилировании образцов мочи после обработки магнитными частицами
MB-HIC в масс-спектрах было получено, в среднем, по 117 пиков на образец в диапазоне масс
от
944
Да
до
10763
Да.
Технический
коэффициент
вариации
МС-метода
после
предварительного фракционирования образцов магнитными частицами MB-HIC был равен 0,25.
В результате исследования было показано, что в течение всего эксперимента 36 пиков (или
30,7% из выявляемого числа пиков) характеризовались большим коэффициентом вариации,
превышающим технический коэффициент более, чем в два раза. Эти пики, составляющие
наиболее пластичную часть субпротеома, обладают значительной межиндивидуальной
вариабельностью. Средний коэффициент вариации, вычисленный по всем пикам для каждого
участника эксперимента, колебался в пределах 0,31-0,39, что превышает техническую
погрешность метода и выявляет диапазон индивидуальной вариабельности [Валеева О.А. с
соавт., 2011].
Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов были представлены
в виде комплекта из ста двадцати одного (121) файла в формате html, являющихся отчётами по
идентификации IPI индексов белков в базе данных Mascot. Файлы содержали список из 2 037
различных IPI индексов белков со значением Score от 20 до 1700. Всего, среди более, чем 20
тысяч выявленных пептидов, было обнаружено 690 протеотипических, то есть, содержащих
уникальные последовательности аминокислот, присущих только одному белку человека. По
108
ним было идентифицировано около 600 белков, пополнивших базу данных белков мочи
здорового человека.
Как известно, влияние режима потребления соли на состояние органов - мишеней, таких
как сердце, головной мозг, почки начало изучаться давно. Уровень исследований во многом
был обусловлен целями, а также методическими возможностями, имеющимися для изучения
конкретных органов и систем [Потешкина Н.Г., 2012].
Известно, что на характер протеома мочи воздействует целый комплекс факторов. Один
из основных из них – это питание, в том числе, поступление в организм основных нутриентов,
включая соль (NaCl). Задача данного исследования заключалась в том, что бы изучить
протеомную
композицию
мочи
здорового
человека
в
контролируемых
условиях
жизнедеятельности при различном солепотреблении с помощью современных методов
протеомики
на
основе
масс-спектрометрии,
используя
различные
возможности
биоинформатики. Кроме того, предпринималась попытка связать наблюдаемые изменения в
различных процессах и физиологических системах с контролируемым приемом соли.
Для решения этих задач использовалось несколько подходов. Первый - определение
списка
белков,
непосредственно
связанных
с
различным
солепотреблением
внутри
эксперимента, затем - тканей, в которых данные белки преимущественно эксперссируются, а
также анализ сверхпредставленных процессов, в которых данные белки участвуют.
Второй подход включал в себя сравнение всей протеомной композиции мочи в фоновом
периоде (не на контролируемом приеме соли), в процессе эксперимента (с приемом различного
количества соли в различные периоды эксперимента), а также при выходе из изоляции (не на
контролируемом солепотреблении).
Исторически, с развитием сельского хозяйства и животноводства, и реализацией
потребности иметь существенный резерв пищи, 6000-8000 лет назад в эволюцию человека
пришло регулярное добавление соли в пищу. Этому новому риску человечество подверглось
слишком поздно для генетической адаптации путем естественного отбора, вследствие чего его
патофизиологические последствия почти всегда берут свою «дань» в виде сердечно-сосудистых
и других заболеваний, нетрудоспособности и повышения смертности [Драгунов Д.О., 2014;
Stamler J., 1997]. Эксперты, собравшиеся на проводимой ежегодно Всемирной Ассамблее по
Питанию, (Рио-де-Жанейро, 2012) заявили: «Если мы хотим спасти несколько миллионов
людей от ранней, так называемой преждевременной смерти, то нам необходимо отрегулировать
количество употребляемой соли». По мнению Г. Макгрегора (Graham Mac Gregor), сотрудника
Лондонского университета Королевы Мэри, именно соль, которую добавляют в еду, является
главной причиной развития артериальной гипертонии. На период 2010–2020 гг. в США
разрабатывается и вводится новая концепция идеального кардиоваскулярного здоровья (ideal
109
cardiovascular health), и регулирование потребления соли включено во все критически важные
компоненты этой программы [Потешкина Н.Г., 2012; Appel L.J. et al., 2011].
Известно, что почки фильтруют весь объем циркулирующей плазмы каждые 30 минут и
реабсорбируют из этой «первичной мочи» две трети фильтрата в проксимальных канальцах.
Точный
контроль
гомеостаза
солей,
воды
и
артериального
давления
традиционно
приписывается регуляции транспорта в дистальной части канальца нефрона и собирательных
трубочках. Одно из назначений почки млекопитающих – сохранение натрия для поддержания
адекватного объёма крови и внеклеточной жидкости [Наточин Ю.В., 2000]. Транспорт натрия в
проксимальных канальцах быстро и хронически регулируется артериальным давлением,
внеклеточным объемом жидкости, ренин-ангиотензиновой, симпатической нервной, а также
внутрипочечной допаминовой натрийуретической системами. Есть доказательства того, что
регуляция транспорта Na+ в проксимальных канальцах является ключевым звеном в системе
обратной связи, которая соединяет внеклеточный объем жидкости, артериальное давление и
ренин-ангиотензиновую [van Paassen P., de Zeeuw D., Navis G., de Jong P.E., 1996], а так же
симпатическую нервную системы [McDonough A.A., 2010].
У здорового человека экскреция Na+ с мочой прямо пропорциональна количеству Na+ в
организме, в результате чего, содержание Na+ колеблется незначительно, хотя поступление в
организм может колебаться в значительных пределах. Так как Na+ фильтруется в клубочке и
реабсорбируется, но не секретируется, в канальцах, то количество экскретируемого Na+ во
вторичной моче определяется только клубочковой фильтрацией и канальцевой реабсорбцией
[Драгунов Д.О., 2014]. Если увеличить потребление соли, то экскреция натрия прогрессивно
увеличивается и примерно за 3-5 дней достигает постоянного уровня, равному поступлению. В
течение этого периода наблюдается положительный натриевый баланс, сопровождающийся
задержкой воды и соответствующим увеличением массы тела. Затем в ответ на увеличение
объема внеклеточной жидкости возрастает экскреция натрия и восстанавливается натриевый
баланс. Когда потребление соли резко уменьшается, то наблюдается противоположный эффект
[Драгунов Д.О., 2014]. Таким образом, в физиологических условиях в ответ на увеличение
объема внеклеточной жидкости развивается натрийурез, а при его снижении – задержка натрия.
Guyton с соавторами [Guyton A.C. et al., 1972] в своем исследовании показали, что
восстановление
баланса
натрия
после
чрезмерного
употребления
соли
зависит
от
натрийуретического ответа, который стимулирует повышение АД. В основном повышение АД
служит физиологической реакцией, направленной на поддержание баланса натрия и объема
внеклеточной жидкости в нормальных пределах. Ослабление механизмов, ответственных за
соотношение давление-натрийурез, перемещает кривую «вправо», так, чтобы более высокие
цифры АД были необходимы для достижения выделения достаточного количества натрия с
110
мочой, требуемого для поддержания гомеостаза, и таким образом, высокие цифры АД
сохраняются постоянно [Драгунов Д.О., 2014; Rodriguez-Iturbe B., Vaziri N.D., 2007]. Одной из
причин развития этого феномена является изменение функции эпителиальных натриевых
каналов (ENaC), локализованных в дистальных канальцах нефрона. Деятельность ENaC
находится под контролем альдостерона [Oberleithner H., 2012]. Было выявлено, что у сольчувствительных лиц, на фоне их обычной диеты с высоким содержанием соли (в среднем 185
ммоль натрия в день), проксимальная реабсорбция натрия значительно больше, по сравнению с
группой соль-резистентных. При ограничении потребления натрия в среднем до 70 ммоль/сут,
реасорбция натрия в дистальных канальцах статистически значимо не различалась во всех
группах [Strazzullo P., Galletti F., Barba G., 2003]. В исследовании, проведенном Visser и соавт.,
изучалось влияние ангиотензина-II на функцию почек у соль-чувствительных нормотоников.
Исследователи пришли к выводу, что для соль-чувствительных характерна гиперактивация
почечной ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) [Visser F.W. et al., 2008]. У
соль-чувствительных пациентов, на фоне диеты с высоким содержанием соли, реабсорбция
натрия в проксимальных канальцах была повышена по сравнению с группой сольрезистентных. На основании этих данных авторы пришли к выводу, что реабсорбция натрия в
проксимальных канальцах является важным фактором, определяющим изменение соотношения
давление/натрийурез, которое происходит у соль-чувствительных пациентов с артериальной
гипертонией независимо от изменений почечной гемодинамики [Strazzullo P., Galletti F., Barba
G., 2003]. Ангиотензин-II и альдостерон непорседственно регулируют деятельность ENaC через
рецепторы АТII. Однако, эффекты ангиотензина-II и альдостерона имеют разные временные
периоды активации ENaC. Синергизм действия ангиотензина-II и альдостерона может играть
важную физиологическую роль в увеличении ENaC – опосредованной реабсорбции натрия в
дистальном альдостерон-чувствительном отделе нефрона в условиях гиповолемии, чтобы
минимизировать потерю натрия с мочой. С другой стороны, независимое от альдостерона
регулирование ENaC ангиотензинном-II отрицательно действует на баланс натрия при
патологических состояниях, которые вызывают сверхстимуляцию интраренальной РААС,
приводя к повреждению почек [Драгунов Д.О., 2014; Kobori H., Nangaku M., Navar L.G.,
Nishiyama A., 2007].
3.3.1. Определение списка белков, непосредственно связанных с различным
солепотреблением внутри эксперимента
Для определения белков, непосредственно связанных с различным солепотреблением во
время изоляции, был взят список белков 105-суточного эксперимента (без фона и периода
111
реадаптации по его завершению) и определена их связь с приемом соли (независимо от
количества принимаемой соли).
Анализ данных, полученных в 105-суточной изоляции, показал, что частота выявления в
образцах не всех белков, но 21 из них достоверно коррелирует с изменением режима
солепотребления (табл. 14).
Таблица 14. Список белков, частота выявления которых в моче достоверно коррелирует
с солепотреблением.
Название
Название белка
R
p_val
adjust
гена
Кадерин-1
CDH1
0,89
7,00E-06
0,00
Гемопексин
HPX
0,89
7,69E-06
0,00
Антиген CD14 дифференциации
CD14
0,84
8,37E-05
0,04
моноцитов
Соль-активируемая липаза желчи
CEL
0,86
3,37E-05
0,01
Альфа-1 цепь коллагена VI
COL6A1
0,85
7,47E-05
0,01
Цистатин-C
CST3
0,86
7,04E-05
0,01
Цистатин-М
CST6
0,84
9,13E-05
0,01
Гелсолин
GSN
0,83
0,00
0,01
Ингибитор интер-альфа-трипсина
ITIH4
0,84
0,00
0,01
тяжелой цепи Н4
Рецептор гиалуронана 1 эндотелия
LYVE1
0,85
6,00E-05
0,01
лимфатических сосудов
Глутаминил-пептидциклотрансфераза
GPCT
0,83
0,00
0,02
α-N-ацетилглюкозаминидаза
NAGLU
0,82
0,00
0,02
Фибронектин
FN1
0,81
0,00
0,03
Эндосалин
CD248
0,80
0,00
0,03
Молекулы клеточной адгезии4
CADM4
0,80
0,00
0,03
L-лактатдегидрогеназа В цепь
LDHB
0,80
0,00
0,03
Хондроитинсульфатпротеогликан 4
CSPG4
0,79
0,00
0,03
Бета-амилоидбелка A4
APP
0,78
0,00
0,03
Аминопептидаза N
ANPEP
0,78
0,00
0,04
Кишечнаямальтаза-глюкоамилаза
MGAM
0,785
0,00
0,04
Каппа-цепиIgV-IV регион JI
0,77
0,00
0,04
Примечание:
R - коэффициент корреляции Пирсона; corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини
Хокберга (Benjamini Hochberg) на множественность сравнения; adjust- поправка на
множественность сравнения.
С помощью программы ANDvisio была определена ассоциативная сеть взаимодействия
данных белков с NaCl, где крупными красными шарами выделены белки, достоверно
коррелирующие с солепотреблением (рис. 2).
112
Рисунок 2.
Ассоциативная сеть взаимодействия белков с NaCl, выявленных с помощью
программы ANDvisio. Мелкие красные шарики - добавленные при
реконструкции молекулярных цепей «новые» белки (т.е. не выявляемые в
данном исследовании), чёрные линии с зелёными точками показывают
отдельные взаимодействия между парой белков.
Изучение тканевой принадлежности белков, ассоциированных с уровнем потребления
NaCl было выполнено для белков, внесенных в Таблицу 14, однако только для 13 из них была
определена тканевая принадлежность с помощью базы Tiger (табл. 15).
Таблица 15. Список тканей, являющихся преимущественными источниками белков,
связанных с уровнем солепотребления в контролируемых условиях
Ткани
клетки крови
кости
костный мозг
сердце
почки
печень
поджелудочная железа
кожа
мягкие ткани
Число
белков
1
2
1
1
1
2
1
2
2
В некоторых из этих тканей, возможно, происходит не только экспрессия белков,
связанных корреляционными связями с уровнем потребления натрия, но и накопление,
депонирование натрия. Существует гипотеза, что жизнедеятельность здорового человека в
изолированном гермообъеме (со снижением уровня двигательной активности, а также под
влиянием метаболических эффектов эксперимента) сопровождается накоплением натрия в
113
организме в осмотически неактивной форме [Титце Й. с соавт., 2003; Titze J., Machnik А., 2010;
Titze J. 2013; Titze J. et al., 2014]. Активирующиеся в этих условиях процессы депонирования
натрия, по-видимому, локализованы в костной, соединительной ткани или хряще, в которых в
норме содержится 55 до 60% общего натрия в организме [Штеренталь И.Ш., 1993; Тернер А.Я.,
1994]. Основываясь на данных, полученных в исследованиях на крысах, при установлении
локуса депонирования обменноспособного связанного натрия, можно утверждать, что его
преимущественная аккумуляция происходит в костях и коже [Иванова Л.Н., Арчибасова В.К,
Штаренталь И.Ш., 1978; Titze J. et al., 2002]. В условиях острой нагрузки натрием у крыс
накопление происходит в костях [Titze J. et al., 2002], скелетной мускулатуре и печени [Тернер
А.Я.,1994], коже [Иванова Л.Н., Арчибасова В.К, Штаренталь И.Ш., 1978]. У крыс линии
Sprague-Dawley при высоком потреблении соли содержание натрия в коже растет, в то время
как общее содержание натрия в организме, колеблясь в широких пределах от 37,0 до 77,5
ммоль/кг веса тела, зависит от его содержания в пище [Titze J. et al., 2002]. Повышенное
потребление соли (8% NaCl с 1% солевым раствором в качестве питьевой раствора) у крыс
привело к накоплению Na+ в коже, способствуя увеличению интерстициального тонуса наряду
с гиперплазией лимфокапилярной сети [Kanbay M., Chen Y., Solak Y., Sanders P.W., 2011]. В
экспериментах на животных показано, что кожа является не только важным осмотически
неактивным Na+ хранилищем у крыс. Известно, что кожа является самым большим органом с
внеклеточным пространством, насыщена сосудами и состоит, в основном, из компонентов
внеклеточного матрикса и гликозаминогликанов. Осмотически неактивное хранение Na + в коже
сопровождается изменениями в протеогликанах, что выражается их полимеризацией и
сульфатацией [Tyan S.W. et al., 2012]. Эндотелиальный гликокаликс, анионный биополимер,
покрывающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов участвует в механизмах Na
гомеостаза, поскольку он способен временно хранить преимущественно ионы натрия
[Weinbaum S., Tarbell J.M., Damiano E.R., 2007]. Он, видимо, служит в качестве защиты от
быстрого
поглощения
натрия
клетками,
через
эндотелиальные
ENaCs,
замедляя,
в
определенной степени, поток ионов натрия из крови в интерстиций [Oberleithner H., 2012].
Экспериментальные данные указывают, также на то, что Na+ является одним из критических
кофакторов развития гипертрофии миокарда, особенно, при избытке минералокортикоидов,
оказывает влияние, как при наличии, так и в отсутствии повышенного АД [Frohlich E. D., 1999].
При этом, гипертрофия миокарда, вызванная повышенным потреблением соли, может быть
уменьшена большим потреблением солей К+ [Потешкина Н. Г., 2012; Burnier M., Phan O., Wang
Q., 2007]. Гипертрофия левого желудочка, как проявление универсальных механизмов
ремоделирования миокарда, развивается, также вследствие прямой активации солями Na+
114
тканевой РААС и симпатической нервной системы как у соль-чувствительных, так и у сольрезистентных пациентов [Потешкина Н. Г., 2012; Frohlich E. D., 1999; Takeda Y. et al., 2000].
При использовании программы BiNGO, были выявлены 90 процессов, в которых
участвуют связанные с солепотреблением 21 белка. Известно, что сверхпредставленные
процессы - статистически значимо более представленны по сравнению с некоторой
референсной (контрольной) группой. В качестве контроля выбирались все белки человека, для
которых известны биологические процессы. Более значимые процессы представлены (Таблица
16).
Таблица 16. Список наиболее сверхпредставленных биологических процессов белков,
корреляционно связанных с солепотреблением внутри эксперимента.
Процессы
метаболизм и катаболизм гликозаминогликанов
метаболизм и катаболизм аминогликанов
анатомический структурный морфогенез
ответ на аминокислотный стимул
клеточная адгезия
организация внеклеточного матрикса
Приведем краткую характеристику некоторых из них:
Метаболизм (анаболизм и катаболизм) гликозаминогликанов. Гликозаминогликаны
(ГАГ) в составе протеогликанов входят в состав внеклеточного матрикса. Один из
представителей
гликозаминогликанов
-
гепарин,
обладающий
противосвёртывающей
активностью, содержится в межклеточном веществе ткани печени, лёгких, сердца, стенках
артерий. Протеогликаны покрывают поверхность клеток, играют важную роль в ионном
обмене, иммунных реакциях, дифференцировке тканей [Зимницкий А.Н., Башкатов С. А., 2004].
Сульфатированные ГАГ (сГАГ) входят в состав межклеточного вещества вместе с волокнами
коллагена, эластина и гликопротеинами, а также являются структурными компонентами клетки
(секреторных гранул), клеточных мембран и гликокаликса, выполняя различные функции. Так,
они регулируют транспорт воды, солей, аминокислот, липидов, метаболитов в бессосудистых
брадитрофных тканях; а также обеспечивают правильную укладку тропоколлагена в фибриллах
и фибрилл в волокнах коллагена, способствуя специфической структурной организации ткани.
За счет полианионной структуры сГАГ могут менять конформацию различных молекул,
регулируя продукцию и активность цитокинов, так называемых «матрикинов», созревание
лейкоцитов и других клеток воспалительного ряда [Тахчиди Е.Х., Горбунова К.С., 2012].
Высокий отрицательный заряд ГАГ создает во внеклеточном матриксе электрическое поле,
которое регулирует потоки интерстициальной жидкости, активность сигнальных веществ
115
(цитокинов, факторов роста), связывая их во внеклеточном матриксе и определяя их
взаимодействие с клеткой во времени и пространстве [Русова Т. В., Баитов В.С., 2012].
Организация внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс (ВКМ), как составной
элемент стромы, выполняет не только функцию опоры для клеток, но и играет роль в
процессах, влияющих на клеточную пролиферацию, дифференциацию, апоптоз, а также
депонирует
биологические активные факторы роста. Деградация компонентов
ВКМ
осуществляется матриксными металлопротеиназами (ММП), обладающими протеолитической
активностью. ММП секретируются в межклеточное пространство и функционируют в
физиологических условиях. ММП активно участвуют в процессах ремоделирования ВКМ,
разрушая такие его компоненты, как коллаген, эластин, фибронектин, гликозаминогликаны, что
позволило считать эти ферменты эффекторами ремоделирования [Гасанов А.Г., Бершова Т. В.,
2009].
Другие выявленные процессы более подробно освещены в главе 2 части данной главы.
Таким образом, анализ данных, полученных в 105-суточной изоляции, показал, что 21
белок достоверно коррелирует с изменением режима солепотребления внутри эксперимента.
Для этих белков определены сверхпредставленные биологические процессы, которыми
оказались:
метаболизм
(анаболизм
и
катаболизм)
гликозаминогликанов,
организация
внеклеточного матрикса, клеточная адгезия организация внеклеточного матрикса и другие.
3.3.2. Анализ влияния различного уровня солепотребления на белковый состав мочи
в 105-суточной изоляции с помошью программы oposSOM
3.3.2.1. Метод кластеризации - самоорганизующиеся карты
Для
интерпретации
полученных
результатов
применялась
программа
oposSOM,
использующая метод машинного обучения - самоорганизующиеся карты (SOM), ранее
разработанная для кластерного анализа данных экспрессии генов [Wirth H., Loeffler M., von
Bergen M., Binder H., 2011; Wirth H., von Bergen M., Binder H., 2012]. Уровень экспрессии
белков характеризовался числом испытуемых, у которых эти белки были идентифицированы в
заданной временной точке эксперимента. С использованием метода SOM осуществлялось
преобразование измеренных значений частоты встречаемости заданных белков в каждой
временной точке эксперимента в единый ландшафт, представляющий некий «портрет»
соответствующего протеомного фенотипа. Таким образом, ландшафт отображал протеомный
фенотип для каждого из 2000 белков, идентифицированных в образцах мочи, на основе данных
масс-спектрометрии. Дальнейший анализ такого «портрета» позволял проводить оценку
сходства образцов, выбор дифференциальных характеристик, а также сверхпредставленности
различных категорий генов. Основной принцип метода самоорганизующихся карт состоял в
116
том, что белки с похожей временной динамикой частоты их идентификации испытуемых
группировались вместе, в то время как белки с различной динамикой стремились
локализоваться в различных областях карты. Для выделения протеомных фенотипов
использовалось цветовое кодирование двумерной мозаики, отражающее на карте кластеры
белков, обладающих повышенным (красный цвет) или пониженным (синий цвет) уровнем
экспрессии (рис. 3).
Рисунок 3.
Галерея ландшафтов экспрессии белков, построенная с помощью
самоорганизующейся карты, иллюстрирующая уровень их экспрессии в
различных временных точках эксперимента. Цвет характеризует уровень
экспрессии белков, представленных в заданной ячейке карты.
В ходе анализа было применено три различных подхода для выделения групп совместно
экспрессирующихся (коэкспрессирующихся) белков (модулей экспрессии):
(1) вычисление модулей экспрессии путем усреднения значения каждой из ячеек карты по
всем рассматриваемым временным точкам и последующего выбора ячеек с уровнем
экспрессии, представленных в них белков, лежащим в пределах 2% от наибольших и
наименьших значений. Соседние, выбранные по карте ячейки, группировались в модули
экспрессии;
(2) вычисление коррелирующих модулей экспрессии с использованием «зернового
алгоритма», включающего следующие шаги. На первом шаге, производился выбор пары ячеек
на карте («зерна»), имеющих наибольшее значение коэффициента корреляции Пирсона между
временными профилями уровней экспрессии, представленных в них белков. Далее, соседние по
карте ячейки добавлялись к «зерну», если коэффициент корреляции с исходной парой ячеек
превышал определенный порог (использовалось значение, равное 0.5). Расширение модуля
повторялось до тех пор, пока имелась хотя бы одна соседняя ячейка с коэффициентом
корреляции, превышающим заданный порог. Формирование нового модуля стартовало с
выбора пары «зерновых» ячеек, не включенных ни в один из модулей. Сигналом остановки
117
алгоритма являлось отсутствие новых пар «зерновых» ячеек, имеющих корреляцию выше
порога;
(3) использование метода кластеризации k-средних. В качестве меры схожести между
ячейками использовалось эвклидово расстояние между временными профилями экспрессии
белков. Число кластеров задавалось равным числу модулей с белками, обладающих
повышенной экспрессией.
Построенные
таким
образом
модули
экспрессии,
представляли
группы
коэкспрессирующихся белков, и могли определять функциональные модули [Quackenbush J.,
2003]. Для установления биологических функций таких групп белков использовали анализ
перепредставленности биологических процессов Gene Ontology (GO) [Wirth H., von Bergen M.,
Binder H., 2012]. Значимость перепредставленности оценивалась при помощи точного теста
Фишера, а также «z-статистики перепредставленности набора генов» (GSZ), предложенной
[Toronen P., Ojala P., Marttinen P., Holm L., 2009]. GSZ-статистика использовалась для
дополнительной оценки значимости повышения экспрессии белков заданного модуля [Wirth H.,
von Bergen M., Binder H., 2012]. Взаимоотношения между модулями описывалось в терминах
взвешенного топологического перекрытия (wTO) в сети, построенной с использованием парных
корреляций между ячейками [Hopp L., Wirth H., Fasold M., Binder H., 2013].
Галерея ландшафтов экспрессии белков, построенная с помощью самоорганизующейся
карты, иллюстрирующая уровень их экспрессии в различных временных точках эксперимента,
показана на рис. 4. Из рисунка видно, что уровень экспрессии существенно меняется по ходу
эксперимента, что отражает изменения в протеомных фенотипах, вызванные различными
факторами эксперимента, включая динамику NaCl.
Рисунок 4.
Галерея ландшафтов белков, построенная с помощью самоорганизующихся
карт, иллюстрирующая частоту их выявления в различных временных
точках эксперимента.
118
На рис. 4 приведены результаты анализа сходства ландшафтов экспрессии белков,
полученные с помощью метода самоорганизующихся карт второго уровня (2nd level SOM). Из
рисунка видно, что ландшафты последовательно группируются по четырем временным
областям. Первый временной интервал включает ландшафты, построенные с использованием
данных по экспрессии белков до начала изоляции испытуемых. Второй временной интервал
включает в себя временные точки эксперимента приблизительно до конца 6-й недели изоляции,
когда потребление соли было сокращено с 12 г/день до 9 г/день. Третий период заканчивается
после 11 недели, то есть, через две недели после того, как потребление соли было снижено до 6
г/день. Наконец, последний временной интервал включает временные точки эксперимента
последних трех недель изоляции, а также дополнительно еще три временные точки после
изоляции. Стоит отметить, что переход между вторым и третьим временными интервалами
служит своего рода переломным моментом, после которого протеомные ландшафты в фазовом
пространстве карты второго уровня «начинают движение» в сторону начальной точки. В
соответствии с количеством потребляемой соли, образцы, взятые до и после этого момента,
относятся, соответственно, к повышенному и пониженному потреблению соли. Таким образом,
все
экспериментальные
точки
могут
быть
разбиты
на
три
периода:
«ранний»,
«промежуточный» и «поздний».
3.3.2.2. Анализ результатов
В результате этих приемов анализа качественных характеристик белков (частоты
встречаемости в динамике эксперимента), была получена таблица, объединяющая все
результаты данного этапа анализа (табл. 17).
Таблица 17. Суммация эффектов, наблюдаемых при различном уровне солепотребления
Временной
диапазон
1
Начальный
Промежуточный
2
3
Конечный
4
неделя изоляции
до изоляции и
1-6 неделя
эксперимента
7 - 11 неделя эксперимента
12 – 15 неделя
эксперимента и 2
недели после
потребление
NaCl
12 г/день (1-6
неделя)
9 г/день (недели 7-9), 12 г/
день (неделя 10) и 6 г/день
(неделя 11)
6 г/день (недели 12-15)
119
Продолжение Таблицы 17.
1
2
активированные
биологические
процессы¹
активированные
сигнальные пути²
активированные
ткани
общая
экспрессия белка
процент
активации
белков
процент
инвариантных³
белков
Примечание:
3
воспаление,
клеточная
адгезия,
свертывание
крови,
протеолиз,
ангиогенез,
связывание Са 2
+, внеклеточные
процессы
иммунный
ответ, нервная
система,
нуклеотиды,
метаболизм
аминокислот и
липидов
печень,почки,
поджелудочная
железа,
(частично кожа)
увеличенная
и высока
4
метаболический
процесс малых
молекул,
деление клеток, липидный
внутриклеточные
обмен, развитие кожи,
процессы, связывание
ороговение,
Mg 2 +, ответ на цинк,
ремоделированиехроматина,
гибель клеток,
ответ на окислительный
рецептор, связанный с
стресс и гипоксию,
G-белком, регуляция
регуляция апоптоза
артериального
давления (ренин /
ангиотензин)
пищеварительной системы,
метаболизма,
регенеративные процессы
(Wnt-сигнальный путь и
биосинтез N-гликана)
реакция на стресс (р53,
МРМ-сигнальный
путь), метаболизм
энергии (биосинтез
убихинона)
мышцы
яички, желудок,
(частично печени и
почек)
убывающая
низкая
27%
20%
>50%
1) обогащенный анализ; 2) PSF анализ; 3) представляющие собой «шум» и единичные
белки в единичных образцах.
Важно отметить, что уровень от 12 до 6 г/день рассматривается как нормальный диапазон
суточного потребления соли для человека в РФ. Поэтому, наблюдаемые эффекты, связанные со
снижением потребления соли, не связаны с чрезмерным или не физиологическим потреблением
соли, а скорее отражают тонкие ответы на небольшие, но систематические изменения
потребления соли в нормальных физиологических пределах.
3.3.2.2.1. Анализ результатов начального периода исследования
Начальный период исследования включает в себя период до изоляции и первые шесть
недель
(1-6)
эксперимента.
Если
в
начале
эксперимента
солепотребление
было
неконтролируемо, то с первой по шестую неделю оно составляло 12 г/день. С точки зрения
120
ответа организма на высокое солепотребление, этой самый интересный период эксперимента.
Несмотря на то, что весь анализ результатов связан с солепотреблением, нельзя исключить
влияние психо-эмоцианальных нагрузок при «вхождении» в эксперимент, режима тренировок и
т.д. Анализ полученных результатов в начальный период показал высокий уровень экспрессии
белка, процент активации белков составил 27%, т.е. максимальный, за весь период
обследования. По данным обогащенного анализа активируются следующие биологические
процессы: воспаление, клеточная адгезия, свертывание крови, протеолиз, ангиогенез, процессы
Са2+ связывания и внеклеточные процессы. Происходит активация сигнальных путей (PSF
анализ), связанных с иммунным ответом, нервной регуляцией, нуклеиновым обменом,
метаболизмом аминокислот и липидов. Эти процессы преимущественно происходят в печени,
почках, поджелудочной железе (частично - коже).
Далее, были сопоставлены результаты, полученные в ходе анализа протеомных данных
мочи методом, основанным на программе oposSOM, разработанного для анализа данных
экспрессии генов, с результатами, полученными в данном эксперименте и известными
литературными источниками.
Воспаление.
Известно,
что
воспаление
является
универсальной
защитно-приспособительной
компенсаторной реакцией, которая развивается в ответ на повреждение [Серебренникова С.Н.,
Семенов
Н.В.,
Семинский
И.Ж.,
Гузовская
Е.В.,
2012].
Воспаление
относится
к
филогенетически старейшим типам защитных реакций организма, направлено на локализацию,
уничтожение и удаление флогогенного агента, а также на устранение его последствий [Висмонт
Ф.И., 2006]. Запускается цепочка иммунных реакций, в результате которой выбрасываются
провоспалительные цитокины, хемокины и молекулы адгезии, которые обеспечивают быстрое
накопление нейтрофилов в участке повреждения [Рубцов Ю.П. с соавт., 2012; Ioannou A., Dalle
Lucca J., Tsokos G.C., 2011]. Продукция цитокинов и хемокинов нейтрофилами приводит к
миграции макрофагов и выбросу больших количеств провоспалительных цитокинов, таких, как
IFN-γ и TNF-α [Maskrey B.H., Megson I.L., Whitfield P.D., Rossi A.G., 2011]. Дальнейшая
секреция противовоспалительных цитокинов воспаления рекрутирует Т- и В-клетки, ускоряя их
активацию и созревание. Они накапливаются в зоне повреждения, значительно усиливая
воспаление за счет секреции новых доз цитокинов и провоспалительных факторов, что нередко
приводит к нежелательному повреждению и гибели окружающих клеток ткани [Рубцов Ю.П. с
соавт., 2012]. Воспалительный ответ, в свою очередь, запускает молекулярные механизмы,
которые сдерживают активацию и деление клеток иммунной системы. Эти механизмы
включают увеличение чувствительности активированных клеток к апоптозу, повышение уровня
рецепторов к противовоспалительным цитокинам (IL-10 и T GF-β) на поверхности иммунных
121
клеток и продукции этих цитокинов активированными клетками [Konkel J.E, Chen W., 2011].
Все это приводит к завершению острой фазы иммунного ответа, гибели поврежденных и
активированных клеток, фагоцитозу клеточных останков фагоцитами [Рубцов Ю.П. с соавт.,
2012].
Немаловажную роль, при этом, играют как клетки окружающей ткани, которые, находясь
в составе внеклеточного матрикса, поставляют цитокины, а так же и клетки эндотелия сосудов,
которые обеспечивают миграцию нужных клеток в очаг повреждения [Umemoto E. et al., 2011].
Так,
в
работе
Zhou
с
соавт.,
было
продемонстрировано
увеличение
моноцитов
провоспалительной активации в ответ на увеличение уровня соли в пище [Zhou X. et al., 2014].
В исследовании, проведенном на Dahl соль-чувствительных крысах, было показано, что при
высоком уровне потребления соли, активируются такие провоспалительные факторы, как NFkB, TNF-a, что коррелирует с инфильтрацией тибулоинтерстициальной ткани воспалительными
клетками [Gu J.W., 2006]. Избыток потребления соли приводит к увеличению фиброгенного
цитокина TGF-β1 во
внеклеточном матриксе
миокарда, что
обеспечивает
развитие
интерстициального и периваскулярного фиброза. Уменьшение концентрации интер-αтрипсинового ингибитора характерно для начальной стадии воспаления [Шевченко О.П., 1996].
Пониженное содержание всех пиков данного белка было отмечено в течение всего данного
эксперимента, а также в течение первых двух недель периода реадаптации [Пахарукова Н.А.,
2010]. Высокое потребление соли является установленным фактором риска рака желудка. По
мнению Имянитова, предполагается, что соль индуцирует экспрессию генов воспалительного
ответа в слизистой желудка [Имянитов Е.Н., 2009].
Клеточная адгезия.
Высокое потребление соли значительно повышает адгезию циркулирующих клеток,
оказывая прямое влияние на эндотелий [Wild J. et al., 2014]. Натрий уменьшает активность
эндотелия, уменьшая производство оксида азота, стимулируя ингибитор синтазы оксида азота
(NOS) – асимметричный диметиларгинин и активируя оксидазу NADPH, что приводит к
увеличению артериальной жесткости [Zieman S.J., Melenovsky V., Kass D.A., 2005]. При
гистологическом исследовании интимы сосудов с повышенной жесткостью выявляются
поврежденные и беспорядочно лежащие эндотелиальные клетки, повышенное содержание
коллагена, поврежденные молекулы эластина [Жирнова О.А., Берестень Н.Ф., Пестовская О.Р.,
Богданова Е.Я., 2011].
Процессы свертывания крови.
Известно, что система гемостаза условно подразделяется на три системы: свертывания,
противосвертывания и фибринолиза, которые тесно взаимосвязаны. Свертывание крови
обеспечивается взаимодействием белков плазмы и клеток крови с поврежденным эндотелием
122
или субэндотелиальными структурами. При повышенном потреблении соли существенно
изменяется кровообращение [Потешкина Н. Г., 2012].
В данном эксперименте, 16-ые сутки изоляции, в крови отмечалось достоверное
увеличение тромбоцитарного фактора IV (m/z=7765Да) [Пахарукова Н.А., 2010], являющегося
важным компонентом коагуляционного каскада, что свидетельствует об увеличении активности
системы сосудисто-тромобоцитарного (или первичного) гемостаза в крови [Баркаган З.С.,
Момот А.П., 2008]. При этом наблюдается достоверное замедление свертывания крови по
внешнему пути и уменьшение концентрации центрального профермента фибринолитического
звена - плазминогена на 35-е сутки исследования [Моруков Б.В., Маркин А.А., Кузичкин Д.С.,
2011]. Результаты масс-спектрометрической идентификации пятен на электрофоретической
карте, в начале эксперимента, показали увеличение уровня интенсивности белковых пятен,
соответствующих α-цепи фибриногена и плазминогена [Трифонова О.П., 2011]. Известно, что
данные белки выполняют важную роль в системе гемостаза: фибриноген участвует в процессе
свертывания крови, а плазминоген – в процессе фибринолиза, сопровождающего процесс
свертывания. Уровень фибриногена изменяется, в том числе, и при эмоциональном стрессе.
Такими стрессогенными периодами могут быть как начальный этап изоляции, так и конечный
этап изоляции [Трифонова О.П., 2011].
Протеолиз.
Протеолиз
представляет
особую
форму
биологического
контроля,
включает
протеолитические ферменты, их неактивные предшественники, активаторы и ингибиторы.
Протеолиз обеспечивает гомеостаз в норме и при развитии адаптационно-защитных реакций
организма [Яровая Г.А., 2005; Акбашева О.Е., 2011]. Ограниченный протеолиз считают
универсальным механизмом, ответственным за образование, инактивацию и модификацию
гормонов, ферментов, физиологически активных пептидов [Мареев В.Ю., 2000]. Реакции
ограниченного
протеолиза
лежат
в
основе
функционирования
таких
важнейших
физиологических систем, как РААС, калликреин–кининовая (ККС), система иммунитета,
гемостаза, комплемента, апоптоза [Ефременко Ю.Р., Конторщикова К.Н., 2003]. Система
комплемента состоит более, чем из 20 белков, составляющих 10% глобулиновой фракции
сыворотки крови. Продукты активации комплемента индуцируют лизис чужеродных клеток,
хемотаксис фагоцитов, усиливают поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов,
повышают проницаемость сосудов, способствуют освобождению из клеток серотонина и
гистамина [Levi M., Van Der Poll T., 2013].
При изучении протеома сыворотки крови в данном эксперименте было выявлено
достоверное увеличение площади пиков фрагментов комплемента С3 (m/z=1450; 1692; 1779;
1865 Да). Обнаруженные изменения могут указывать на возможную активацию системы
123
комплемента в начальном периоде изоляции [Пахарукова Н.А., 2010]. Обнаружены изменения в
интенсивности белковых пятен, относящихся к факторам С1 и С4 системы комплемента и
иммуноглобулина М, что, по мнению Трифоновой, связано с активацией иммунной системы
организма в период изоляции, так же и адаптацией организма к новым условиям
жизнедеятельности, в том числе, к специфической микробной среде гермообъекта [Трифонова
О.П., 2011]. Известно, что в период острой адаптации (первые 20 дней) у испытателей
происходит нарастание потенциала патогенности аутомикрофлоры [Ильин В.К. с соавт., 2010].
Ангиогенез.
Ангиогенез - сложный физиологический процесс образования новых кровеносных
сосудов. Он происходит посредством активации эндотелиальных клеток, экспрессии в них
протеаз, разрушения внеклеточного матрикса, пролиферации, миграции и образования
эндотелиальными клетками первичных высокопроницаемых сосудистых структур, которые
после стабилизации и «взросления» за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток
трансформируются в трехмерную сосудистую сеть [Гарбузенко Д.В., 2013]. В норме, в
организме процессы ангиогенеза протекают с умеренной интенсивностью, активизируются
только при регенерации повреждённых тканей, канализации тромбов, ликвидации очагов
воспаления, образовании рубца и других процессах восстановления. Физиологический
ангиогенез представляет собой тканевый ответ либо на гормональную стимуляцию (ангиогенез
в репродуктивной системе), либо на изменение окружающей среды [Спринджук М.В., 2010].
Основным индуктором ангиогенеза как в физиологических условиях, так и при различных
патологических состояниях, является гипоксия. Клетки реагируют на недостаток кислорода
несколькими способами, в том числе, накоплением гипоксии-индуцибельных факторов (HIFs),
что стимулирует экспрессию ангиогенных факторов роста. Стимулировать ангиогенез также
способны белки-члены семейства фактора роста фибробластов (FGF). Клеточный ответ на FGFs
происходит через специфическое связывание с рецепторами FGF (FGFR), обладающими
внутренней тирозинкиназной активностью, что является предпосылкой для фосфорилирования
и активации сигнальных молекул при участии гепаринсвязывающих белков [Гарбузенко Д.В.,
2013]. Рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) локализуются преимущественно в
эндотелиальных клетках и участвуют в регуляции ангиогенеза, стабилизации вновь
образованных сосудов, изменении их проницаемости и дилатации сосудов. VEGFR3 является
рецептором, который передает сигналы для стимуляции лимфогенеза. Стимулируя рост
лимфатических сосудов, он увеличивает объем лимфатической системы, которая служит
буфером при повышении количества натрия и воды в организме, препятствуя резкому
повышению АД при гиперсолевой диете [Мангилёва Т.А., 2012]. Рост напряжения сдвига и
активизация РААС при артериальной гипертензии (АГ) тоже ассоциируется с увеличением
124
содержание VEGF за счет механического воздействия на клетки эндотелия сосудов и
взаимодействия ангиотензина II с ангиотензиновыми рецепторами первого типа, что приводит к
росту экспрессии HIF-1α и увеличению синтеза VEGF. Длительное снижение концентрации или
блокада VEGF ведет к ухудшению выживаемости эндотелиальных клеток, разрежению
микрососудов (уменьшение в тканях терминальных артериол и капилляров) и повышению АД
[Herr D. et al., 2008].
Са2+связывание.
Чрезмерное потребление натрия активирует механизмы, способствующие увеличению
концентрации внутриклеточного кальция и уровня катехоламинов плазмы [Rozendorff C., 2010].
Избыточное присутствие ионов Na+ в клеточной жидкости приводит к перегрузке и
недостаточности Na+/K+ обмена, с последующей гипополяризацией клеточной мембраны,
компенсаторному усилению механизма Na+/Сa2+ обмена, что приводит к перегрузке ионами
Са2+ цитоплазмы [Потешкина Н.Г., 2013]. Увеличение содержания Са2+ и Na+ в сосудистой
стенке повышает ее чувствительность к веществам прессорного действия за счет увеличения
чувствительности к ним рецепторов [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009]. Эти данные
согласуются с антигипертензивным эффектом антагонистов кальция. Ряд исследователей
полагает, что солечувствительность ассоциируется с внеклеточным Са2+ солерезистентность - с
концентрацией ренина и внутриклеточным Са2+ [Resnick L.M., 1994]. Добавление 1,5 г
карбоната кальция в диету с нормальным содержанием соли снижало АД у солечувствительных
и повышало его у солерезистентных гипертоников [Потешкина Н.Г., 2013; Weinberger M.H.,
Wagner U.L., Fineberg N.S., 1993].
Внеклеточная жидкость.
Вопрос
о
взаимосвязи
солепотребления
и
гомеостаза
внеклеточной
жидкости
затрагивается при описании взаимоотношений различных физиологических систем и
процессов. Известно, что при увеличении потребления соли, экскреция натрия увеличивается и
примерно за 3-5 дней достигает постоянного уровня, равному поступлению. В течение этого
периода наблюдается положительный натриевый баланс, сопровождающийся задержкой воды и
соответствующим увеличением массы тела. В ответ на увеличение объема внеклеточной
жидкости возрастает экскреция натрия и восстанавливается натриевый баланс. Когда
потребление соли резко уменьшается, то наблюдается противоположный эффект. Таким
образом, в физиологических условиях в ответ на увеличение объема внеклеточной жидкости
развивается натрийурез, а при его снижении – задержка натрия [Драгунов Д.О., 2014].
Повышение содержания Na+ во внеклеточной жидкости, даже при сохранении ее
изоосмолярности, вызывает увеличение жесткости эндотелия [Коноплева Л.Ф., 2011], снижает
продукцию природного вазодилатора – оксида азота [Dickinson K.M, Keogh J.B, Clifton P.M.,
125
2009], в том числе, путем увеличения продукции его эндогенного ингибитора диметил Lаргинина [Потешкина Н.Г., 2012].
Условия данной длительной изоляции не вызывают, по мнению Ничипорука с соавт.,
проводивших исследования биоимпедансометрическими методами, а так же методами
иммуноферментного анализа, изменений состава тела, состояния метаболизма и его
нейрогуморальной регуляции, значимо и специфически отличных от привычной среды
обитания [Ничипорук И.А. с соавт., 2011].
В начальном периоде эксперимента происходит активация сигнальных путей (PSF
анализ), которые связаны с адаптивным иммунным ответом, нервной регуляцией, нуклеиновым
обменом, метаболизмом аминокислот и липидов.
Клетки иммунной системы и солевой баланс.
Исследование, недавно опубликованное в Nature, показало, что соль может стать одним из
главных факторов возникновения таких аутоиммунных заболеваний, как рассеянный склероз,
псориаз, ревматоидный артрит и болезнь Бехтерева (воспалительное заболевание позвоночника
и суставов), сахарный диабет 1 типа [Kleinewietfeld M. et al., 2013]. Авторы показали, что
увеличение потребления соли может индуцировать патогенные клетки Th17. Избыток соли
способен запустить механизм аутоиммунных заболеваний у людей, имеющих генетическую
предрасположенность к ним. Профессор Йельского университета Дэвид Хафлер, считает, что
дело не в "плохих генах" или "плохой окружающей среде", но в плохом взаимодействии "генов
и среды". По его словам, соль является одним из факторов риска наравне с курением или
дефицитом витамина D. Machnik с соавт. показали, что избыток соли оказывает влияние на
реакции врожденного иммунитета [Machnik A. et al., 2009]. Известно, что баланс Na в
организме регулируется не только почками, его концентрация в соединительной ткани кожи
(где он хранится) может быть выше, чем в крови. Макрофаги способны к распознанию
высокого уровня Na+. Было обнаружено, что в коже гипертоников содержится значительное
количество
соли, иммунные клетки
(мононуклеарных
система фагоцитов) способны
регулировать баланс соли и кровяное давление [Machnik A. et al., 2009]. Wiig с соавт.
предположили, что кожа является гипертонической интерстициальной жидкостью [Wiig H. et
al., 2013]. По мнению доктора Titz, в настоящее время имеется достаточное количество
доказательств того, что Na+ депонируется в коже в неионном виде, т.е. без адекватного объема
жидкости. Результаты работ Titze говорят о том, что электролиты в коже нелегко уравновесить
с плазмой, но если это достигается, то это позволяет избежать почечного гомеостатического
контроля [Titze J., Machnik A., 2010; Titze J., 2014]. Эти данные подтверждают идею о том, что
внутрисосудистые и интерстициальные пространства представляют собой два различных
внеклеточных отсека электролитов, которые регулируются независимым образом. В серии
126
экспериментов авторы определили, что состав электролитов кожи регулируется макрофагами в
ее локальной системе интерстициальных лимфатических капилляров [Machnik A. et al., 2009;
Wiig H. et al., 2013]. Макрофаги выступают в качестве датчиков и регуляторов состава
электролитов в интерстиции кожи. Макрофаги обладают хемотаксисом в отношении тканей с
высокой концентрацией соли. В этих условиях в макрофагах активируется NFAT5, который
запускает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов C (VEGFc), в результате чего
реализуется гиперплазия лимфатических капилляров кожи, что приводит впоследствии к
снижению кровяного давления [Титце Й. с соавт., 2003; Titze J., Ritz E., 2009; Heer M. et al.,
2009].
Известно, что центральную роль в реализации феноменов адаптивного иммунного ответа
играют В- и Т-клетки. Результаты исследований количественных характеристик этих клеток в
данном эксперименте показали, что во время пребывания в гермообъекте у обследуемых
наблюдалось увеличение абсолютного содержания В-клеток и Т-клеток, связанное с
повышением уровня в периферической крови лимфоцитов. Оно служило ответом на
антигенную стимуляцию, связанную с изменениями микробного сообщества среды обитания и
микробного пейзажа различных
биотопов человеческого организма, возникающих в
гермообъекте [Моруков Б.В. с соавт., 2010]. У некоторых из обследуемых отмечалось
увеличение (на 15% и более от фонового уровня) относительного содержания CD19+лимфоцитов, что свидетельствует о напряжении В-звена адаптивного иммунитета. Изменение
CD4+-лимфоцитов, по мнению Рыковой, вероятно связано со сдвигом равновесия системы в
сторону интенсификации образования факторов, стимулирующих иммунные реакции [Рыкова
М.П., 2013].
Нервная система.
В научной литературе обсуждается вопрос об основной причине гипертонии, которая
может возникать либо в результате чрезмерной активности симпатической нервной системы,
либо при чрезмерной реабсорбции соли почками [Kapusta D.R., Pascale C.L., Kuwabara J.T.,
Wainford R.D., 2013]. Комбинация нескольких факторов - стресса, повышенного потребления
соли, чрезмерной активности симпатической нервной системы (СНС) приводит к стимуляции
РААС, эфферентной вазодилятации, снижению клубочковой фильтрации и усилению
канальцевой реабсорбции натрия, что способствует ретенции Na+ [Бабкин А.П., Гладких В.В.,
2009]. С другой стороны, по мнению Koolen с соавт., само избыточное потребление с натрия
пищей повышало активность СНС у солечувствительных и солерезистентных гипертоников.
Однако, у последних не происходило значимого повышения АД за счет компенсаторного
повышения чувствительности барорецепторов, выделенных в группы по уровню экскреции
норпенифрина почками [Koolen M.I., Bussemaker-Verduyn den Boer E., van Brummelen P., 1983].
127
Показано, что диета с высоким содержанием соли увеличивает концентрацию натрия в
спинномозговой жидкости, активирует симпатическую нервную систему животных и человека
[Stocker S.D., Monahan K.D., Browning K.N., 2013]. По мнению Kapusta с соавт., патогенез
гипертонической болезни включает в себя интеграцию реакций, как в центральной нервной
системы, так и в почках, и что обе системы непосредственно способствуют развитию
гипертензии. Подавление экспрессии белка Gαi2 в мозге у солерезистентных крыс приводит к
повышенной активности симпатической нервной системы, к задержке почками натрия и
развитию почечной нервно-зависимой сольчувствительной гипертонии [Kapusta D.R., Pascale
C.L., Kuwabara J.T., Wainford R.D., 2013].
В начальном периоде эксперимента происходит активация процессов в следующих
тканях:
печени,
почках,
в
поджелудочной
железе,
(частично
коже),
с
участием
сверхпредставленных белков.
Печень.
У
лиц
с
гиперинсулинемией
и
инсулинорезистентностью
отмечена
высокая
чувствительность АД к поваренной соли, поэтому большинство исследователей считают
гиперинсулинемию, инсулинорезистентность и солечувствительность АД ассоциированными
состояниями [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Giner V., Coca A., de la Sierra A., 2001]. У
солечувствительных пациентов высокосоленая диета индуцирует гиперинсулинемию и
ухудшает чувствительность тканей к инсулину [Fujiwara N. et al., 2000]. Действие
гиперинсулинемии на развитие гипертонии может быть связано с развитием центральной
гиперсимпатикотонии, которая приводит к повышению активности ренина в почках и
активации РААС. Внутрипочечный тканевый ангиотензин-II сокращает как приносящие, так и
отводящие
артериолы,
приводя
к
снижению
почечного
кровотока,
уменьшению
фильтрационной нагрузки по натрию [Fujiwara N. et al., 2000]. Ренин регулирует начальный,
ограничивающий
скорость,
этап
РААС
путём
отщепления
N-концевого
сегмента
ангиотензиногена для формирования биологически инертного декапептидаангиотензина 1 или
Ang-(1-10). Первичный источник ангиотензиногена - печень. Ангиотензин - II усиливает
реабсорбцию натрия за счет одновременного воздействия на ренальные сосуды и почечные
канальцы, снижая медуллярный кровоток, повышает пассивную реабсорбцию натрия в петле
Генли. Ангиотензин-II повышает натрий - водородный обмен в проксимальных канальцах и
активность Na+-K+-АТФ-азы. Конечный итог этих воздействий реализуется в снижении
экскреции натрия с мочой и формировании солезависимой гипертонии [Бабкин А.П., Гладких
В.В., 2009]. Показано, что повышение концентрации глюкозы в крови увеличивает экспрессию
гена ангиотензиногена в почечной ткани и активизирует почечную РААС. Вследствие
инсулинорезистентности тканей и гипергликемии отсутствует или снижено подавление
128
экспрессии гена ангиотензиногена, и продукция ангиотензина - II в почечной ткани усилена.
Ангиотензин - II через воздействие на АТ-1-рецепторы усиливает выделение норадреналина в
синапсах почек и приводит к почечной гиперсимпатикотонии. Стимуляция эфферентных
нервов почек увеличивает канальцевую реабсорбцию натрия, приводя к задержке жидкости и
повышению АД [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009; Botero-Velez M., Curtis J.J., Warnock D.G.,
1994]. Таким образом, гиперинсулинемия и инсулинорезистентность, ассоциируясь с
солечувствительностью АД, усугубляют течение друг друга [Бабкин А.П., Гладких В.В., 2009].
Почки.
Почкам отводится центральная роль в регуляции АД, что обусловлено их участием в Na +
гемостазе, а также в реабсорбции K+ и Clˉ. Сохранение натрия для поддержания адекватного
объёма крови и внеклеточной жидкости является одним из назначений почки млекопитающих
[Наточин Ю.В., 2008]. Еще 40 лет назад было продемонстрировано, что трансплантация почек
от генетически нормотензивных крыс к линии крыс с гипертензией, предотвращала или
контролировала гипертонию [Dahl L.K., Heine M., 1975]. Почка может выступать как органмишень для действия большинства известных факторов, связанных с сердечно-сосудистыми
эффектами,
отвечать
за
формирование
системных
метаболических
и
сосудистых
патологических процессов, являясь активным генератором факторов риска [Смирнов А.В.,
Добронравов В.А., Каюков И.Г., 2010]. При различных механизмах усиления диуреза (водная
нагрузка, осмотический диурез, салурез после инъекции фуросемида или аналогов вазотоцина)
выявлено увеличение выделения белков с мочой. В основе этих типов физиологической
протеинурии, по-видимому, лежит изменение гидродинамики гломерулярного аппарата
[Наточин Ю.В., 2008]. Известно, что высокий уровень поступления хлорида натрия с пищей
ассоциирован с развитием и прогрессированием артериальной гипертензии, которая, в свою
очередь, служит важным детерминантом повреждения почек и сердца. Поражение почек, как
органа мишени, встречается часто при гипертонической болезни сердца и у пациентов с
другими сердечно-сосудистыми заболеваниями, особенно в сочетании с хронической сердечной
недостаточностью [Драгунов Д.О., 2014]. У лиц с избыточной массой тела высокий уровень
поступления натрия с пищей определяет развитие гиперфильтрации в клубочках [Lely A.T. et
al., 2007]. Гомеостатический ответ почек на высокосолевую диету включает регулирование
вдоль всего нефрона; высокое потребление соли уменьшает реабсорбцию Na+ путём
уменьшения количества Na+ транспортёров и связанных с ними регуляторов в активных
доменах плазматической мембраны главным образом путем перераспределения, а не изменения
в размере их общего пула (уменьшается только количество NCC-натрий-хлор транспортеров).
Перераспределение из одного места в другое, а не деградация и синтез, может обеспечить
механизм для быстрой и постоянной адаптации к ситуациям с высоким или низким
129
потреблением натрия без необходимости синтезировать или разрушать сложные белковые
механизмы (транспортёры). Уменьшение количества транспортеров натрия в активных
апикальных доменах будет также, теоретически, компенсировать гломерулотубулярный баланс,
и обеспечивать экскрецию натриевой нагрузки во время диеты с высоким потреблением соли
[McDonough A.A., 2010].
Метаболизмом аминокислот или липидов.
Известно, что толстая кишка наряду с другими органами непрерывно участвует в
обеспечении стабильности физико-химических условий всех жидкостных компартментов
организма, поддерживая гомеостаз. Она является не только одним из органов выделения, но и
возвращает в портальный кровоток ионы, такие как натрий, хлор, а также воду до экскреции с
фекальными массами. Обеспечивает участие колоноцитов толстой кишки в поддержании
постоянства осмоляльности крови и выполнении осморегулирующей функции [Ерофеев Н.П.,
Радченко В.Г., Селиверстов П.В., 2012]. Колоноциты и плотные контакты между ними
управляют интенсивностью абсорбции воды и электролитов, выступают в роли органа
локального и системного водно-солевого гомеостаза. Толстая кишка имеет собственный
локальный механизм транспорта ионов натрия из просвета кишки в интерстициальную
жидкость. Посредством этого механизма колоноциты абсорбируют около 95% натрия,
находящегося в просвете толстой кишки. Короткоцепочечные жирные кислоты, особенно
бутират (масляная кислота), модулируют распознавание и уничтожение собственных
мутантных, в том числе, опухолевых клеток, а также вторгшихся микроорганизмов.
Производителем короткоцепочечных жирных кислот являются симбиотические анаэробные
бактерии толстой кишки [Ерофеев Н.П., Радченко В.Г., Селиверстов П.В., 2012; Böhmig G.A. et
al., 2007].
Таким образом, с помощью биоинформационных подходов, методами современной массспектрометрии удалось наблюдать физиологические эффекты адаптации организма здорового
человека к высокому солепотреблению (12г/день), нашедшие отражение в динамике изменений
протеома мочи. В этот период эксперимента (фон и первые шесть недель эксперимента)
отмечались: повышение активности белкового синтеза, активация адаптивной иммунной
системы, провоспалительных белков. Известно, что макрофаги, помимо защиты организма от
инфекций, принимают участие в регуляции солевого баланса и артериального давления. В
регионах тела с высокой концентрацией соли они вызывают образование новых кровеносных и
лимфатических сосудов, особенно в коже, тем самым, регулируя микроциркуляцию организма.
В поддержку этого механизма мы находим, что такие процессы, как ангиогенез, клеточная
адгезия,
активируются
в
период
высокого
солепотребления
наряду
с
экспрессией
провоспалительных агентов. Увеличение экспрессии белка в начале эксперимента может быть
130
связано с потребностью организма активировать процессы в почках, которые участвуют в
экскреции и регуляции водного баланса в ответ на повышенное солепотребление.
3.3.2.2.2. Анализ результатов промежуточного периода исследования.
Промежуточный
период
исследования,
который
был
определен
с
помощью
биоинформационных методов, включал в себя 7 - 11 неделю эксперимента. Солепотребление в
этот период времени было различным и составляло 9 (7-9 недели), 12 (10 неделя) и 6 г/день (11
неделя), соответственно. Экспрессия белка, по сравнению с начальным периодом исследования,
снижалась, процент активации белков составил 20%. В это период активируются процессы,
связанные с делением клеток, с липидным обменом, ремоделированием хроматина, ответом на
окислительный стресс и гипоксию, с регуляцией апоптоза, и ремоделированием мышц. PSF
анализ выявил активацию белков, связанных с деятельностью пищеварительной системы,
процессов метаболизма, регенеративных процессов (Wnt-сигнальный путь и биосинтез Nгликанов).
Липиды.
Экспериментальные работы показали, что у крыс Dahl, чувствительных к соли, при
содержании на высокосолевой диете, увеличивается кровяное давление, а также уровни
плазменных триглицеридов и общего холестерина в плазме крови, по сравнению с
резистентными к соли животными, содержавшихся на том же рационе. Кроме того, у Dahl крыс
отмечалось повышенное содержание мембранных фосфолипидов, но содержание холестерина в
мембранах существенно не изменялось [Vokurková M. et al., 2005]. В работе Silambarasan и Raja
оценивался антигипертензивный эффект диосмина у самцов крыс Вистар, принимавших 1%
NaCl в питьевой воде в течение шести последовательных недель. При этом отмечалось
значительное увеличение систолического, диастолического артериального давления, натрия и
хлорида в сыворотке и продуктов перекисного окисления липидов в плазме и тканях (печень,
почки, сердце и аорта) и значительное снижение калия в сыворотке крови, а так же общих
нитритов и содержания нитратов в плазме [Silambarasan T., Raja B., 2012].
В эксперименте со 105-суточной изоляцией было выявлено изменение липидных и
фосфолипидных фракций указывающее на увеличение микровязкости клеточных мембран на
70-е, 105-е сутки эксперимента и после его завершения. По-видимому, это может быть связано
с возможной активацией процессов перекисного окисления липидов в плазматической
мембране [Иванова С.М. с соавт., 2010]. В сыворотке крови на 40-60% увеличилась
концентрация триглицеридов в зависимости от срока исследования [Маркин А.А. с соавт.,
2010].
131
Ремоделирование.
Как известно, риск возникновения многих заболеваний не может быть сведен только к
определенным генетическим детерминантам. Воздействие тех или иных средовых факторов
приводит к увеличению темпа мутирования, числу генетических повреждений и, вследствие
этого, к возникновению определенных заболеваний [Gu Y. et al., 2006]. Основными
механизмами эпигенетического контроля считаются метилирование ДНК, ремоделирование
хроматина, регуляция на уровне РНК (в частности, РНК интерференция), прионизация белков и
инактивация X хромосом [Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Мехова Л.В., Войтенко В.П., 2011].
Изучение протеома плюрипотентных клеток, в частности белков, образующих основную
систему поддержания плюрипотентности (OCT4, NANOG, COX2) показало, что белки не
только взаимодействуют между собой,
но и образуют сложную цепь с другими
транскриптационными факторами, а также с белками, участвующими в модификациях и
ремоделировании хроматина [Медведев С.П., Покушалов Е.А., Закиян С.М., 2012]. Имеются
данные о взаимосвязи гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ) и дисфункции эндотелия, чаще
встречающиеся у пациентов с повышенным употреблением поваренной соли. Формирование
ГЛЖ рассматривается как компенсаторный механизм, реализующийся в ремоделировании
миокарда в ответ на перегрузку левого желудочка и направленный на поддержание в этих
условиях достаточной насосной функции сердца [Аксенова Т.А., Горбунов В.В., 2013].
Считают, что изменения структуры хроматина являются регуляторным механизмом,
управляющим транскрипцией генов цитокинов [Нестерова И.В. с соавт., 2010; Zhang X. et al.,
2004].
Хотя большинство обследованных испытателей в 105-суточной изоляции не имели
выраженной гипертрофии левого желудочка, однако у 4 (66,6%) из них отмечались изменения
левого желудочка [Буйлов С.П. с соавт., 2010].
Окислительный стресс.
Окислительный стресс (оксидативный стресс) – это повреждение тканей в результате
избыточного
образования
свободнорадикальных
окислительных
компонентов
и
недостаточности механизмов антиоксидантной защиты. Среди нормальных метаболитов
клетки, обладающих окислительными свойствами, главное место, несомненно, принадлежит
активным формам кислорода (АФК), к которым относятся супероксиданион, перекись
водорода, оксид азота, пероксинитрит, гидроксильный радикал, гипохлорная кислота [Смирнов
А.В., Каюков И.Г., Добронравов В.А., 2008]. В работе Арутюнян с соавт., изучалась динамика
изменения активности ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) в аорте и плазме крови, а
также образования АФК в аорте крыс на фоне двух гиперсолевых диет (0,4% и 1% растворы
NaCl). При гиперсолевых диетах активность АПФ в аорте прогрессивно снижалось до
132
минимума в течение одной недели и оставалось на уровне ниже контрольного в течение месяца.
Обе диеты снижали количество АФК в аорте, этот эффект возрастал с увеличением дозы соли.
Авторы пришли к заключению, что спектр АФК в аорте при гиперсолевых диетах отличается от
контрольного и зависит как дозы соли, так и от длительности воздействия [Арутюнян Т.В. с
соавт., 2013]. Оксидативному стрессу отводится ключевая роль в инициации повреждения
эндотелия, при этом, происходит постепенное истощение и извращение компенсаторной
дилатирующей
способности
эндотелия,
отмечается
специфическая
инактивация
гена
эндотелиальной NO-синтазы, которая сопровождается увеличением среднего АД примерно на
15-20 мм рт.ст. Оксид азота (NO) способен подавлять пролиферативный ответ гладкомышечных
клеток сосудистой стенки и оказывать целый ряд системных эффектов в просвете сосуда –
блокировать агрегацию тромбоцитов, а так же окисление липопротеидов низкой плотности и
экспрессию молекул адгезии. В клинических исследованиях у пациентов с сольчувствительной
АГ выявлено снижение продукции NO [Чернявская Т.К., 2013]. Нарушение продукции NO
происходит уже при
уровне потребления 250 ммоль/сут
Na+. Наследуемый и/или
приобретенный (возраст, воспалительный процесс в стенке артерий) дефект продукции NO
позволяет не препятствовать действию тканевого фактора роста (TGF-β1), при этом, снижается
чувствительность гладкой мускулатуры сосудов к NO [Потешкина Н.Г., 2012; Dickinson K.M.,
Keogh J.B., Clifton P.M., 2009]. Избыток соли, приводя даже к незначительному росту АД и
тканевого кровотока, активирует «стрижущие силы» кровотока вызывая тем самым растяжение
эндотелия, который как биосенсор через сигнальные механизмы увеличивает продукцию TGFβ1 [Потешкина Н.Г., 2012]. В свою очередь TGF-β1 стимулирует гипертрофию гладких мышц
сосудов, увеличивает продукцию первичных коллагеновых волокон и усиливает их
взаимодействие
с
гладкомышечными
клетками,
глюкозамингликанами
и
другими
коллагеновыми волокнами, формируя перекрестные связи, что приводит к росту жесткости
малых артерий [Потешкина Н.Г., 2012]. Натрийуретический пептид и индуцируемый гипоксией
фактор HIF-1α вовлечены в адаптивный механизм ответа на перегрузки натрия для
предотвращения или ослабления вредных эффектов оксидативного стресса и гипоксии и
развитие фиброза в почках [Della Penna S.L. et al., 2014].
Деление клеток.
Поддержание относительного устойчивого внутреннего состояния на уровне клетки
определяет клеточный гомеостаз [Johnson M.D. et al., 2012]. В работе Su с соавт., с помощью
жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии в левом желудочке крыс,
перенесших 5/6 нефрэктомию (модель хронической почечной недостаточности), которых
кормили в течение 2 недель нормальной и высокосолевой диетой, были обнаружены
специфические фосфопротеины, играющие важную роль в процесс ремоделирования сердца.
133
Функциональная аннотация по базам данных позволила установить, что большинство
выявленных фосфопротеинов - важные сигнальные молекулы, такие как протеинкиназы,
рецепторы и фосфатазы, вовлеченные в энергетический метаболизм, в межклеточные
взаимодействия, дифференцировку, гибель клеток и другие биологические процессы. Анализ
функциональных связей взаимодействующих генов показал, что 23 из них связаны с «высоким»
потреблением соли [Su Z. et al., 2014].
Мышцы.
В эксперименте со 105-суточной изоляцией было отмечено увеличение активности КФК
креатинфосфокиназы за счет мышечного изофермента КФК ММ. На 35 сутки эксперимента
активность КФК ММ увеличилась в 3,8 раза, по сравнению, с фоновым уровнем и более, чем в
1,6 раза относительно верхней границы физиологической нормы, что, по мнению авторов
работы, отражает особенности реакций скелетной мускулатуры на проведение физических
тренировок. В дальнейшем этот показатель снижался, однако, по сравнению с фоном КФК ММ
оставалась повышенной на 44-61% [Маркин А.А. с соавт., 2010]. Активность АСТ на 35-сутки
изоляции также увеличилась (фермент представлен в печени, миокарде и скелетных мышцах),
однако, уровень активности высокоспецифичного фермента миокарда ОБДГ (ЛДГ1) не
изменялся относительно фоновых значений на 35-сутки эксперимента.
Пищеварительная система.
Известно, что соль является естественным стимулятором пищеварительных ферментов,
при ее полном исключении из рациона, нарушается работа пищеварительной системы, что
сопровождается потерей чувства вкуса, слабостью, быстрой утомляемостью, отдышкой,
судорогами и перебоями в работе сердца. В то же время, эпидемиологические исследования
показали, что высокое потребление соли само по себе является фактором риска рака желудка
[Имянитов Е.Н., 2009]. Сочетание двух факторов - диеты с высоким содержанием соли и
инфицирование бактерией Helicobacter pylori (хеликобактериоза) вдвое увеличивает риск
развития рака желудка. Пытаясь определить способствующие этому феномену факторы, авторы
исследования, Gaddy соавт., в экспериментах in vitro установили, что высокая концентрация
соли в окружающей бактерию среде заставляет ее усиленно синтезировать онкобелок Cag A, то
есть потенцирует ее канцерогенные свойства и делает ее более вирулентной [Gaddy J.A. et al.,
2013].
Метаболизм.
Изменения метаболизма, обнаруженные у добровольцев в 105-суточной изоляции и
подобных экспериментах («СФИНКС»), частично схожи с результатами, полученными после
космических полетов, а именно, авторами публикаций отмечена тенденция к снижению уровня
энергетического,
белкового
и
нуклеинового
обмена.
Однако,
не
наблюдалось
134
перераспределения жидких сред организма, имеющих место в невесомости, как и эффектов,
сопряженных
с
гемодинамическими
сдвигами:
снижения
активности
ферментов
поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта, печени, в отличие от их повышения
после космического полета [Маркин А.А. с соавт., 2010; Афонин Б.В. с соавт., 2001]. В работе
Graudal с соавт. было показано, что снижение потребления NaCl у добровольцев вызывало
снижение АД на 1%, а также приводило к активности ренина плазмы, альдостерона,
плазменного адреналина, норадреналина и увеличению на 2,5% холестерина и 7%
триглицеридов [Graudal N.A., Hubeck-Graudal T., Jurgens G., 2011].
Регенеративные процессы (Wnt-сигнальный путь и биосинтез N-гликана).
Известно,
что
каждая
клетка
представляет
собой
сложную
функциональную
саморегулирующуюся систему, все компоненты которой взаимосвязаны и взаимозависимы, а
сигнальные системы в норме позволяют удерживать параметры гомеостаза в контролируемых
пределах. При силе воздействия, превышающей пороговые значения, клетка может перейти на
иной
уровень
функционирования.
Запуск
соответствующей
программы
поддержания
гомеостаза на уровне клеточной популяции может вызывать гипертрофию, гиперпролиферацию
или стимулировать апоптоз [Замай Т. Н., 2011]. Переход клеток на новый уровень определяется
потребностями организма и условиями среды, однако стратегию поведения каждая клетка
выбирает в зависимости от наличия в ней энергетических и пластических ресурсов,
специализации, а также исходя из собственного функционального состояния. Так, сигнальный
путь Wnt - один из внутриклеточных сигнальных путей, задействованный в широком спектре
биологических процессов, начиная с эмбрионального развития и заканчивая регенерацией
тканей взрослого организма [Куликова К.В. с соавт., 2012; Yang Y., 2012]. Во внеклеточной
среде белки Wnt образуют комплексы с гликанами внеклеточного матрикса, что может
существенно влиять на мощность и продолжительность их сигнала [Berendsen A.D. et al., 2011].
Передача сигналов Wnt играет важную роль в формировании кроветворной системы, они могут
увеличить регенерационные способности поврежденного костного мозга и улучшить
результаты трансплантации стволовых клеток [Куликова К.В. с соавт., 2012; Lento W. et al.,
2014]. В работе Батюшина с соавт., методом масс-спектрального анализа белков мочи, показана
активация кадгеринового структурного комплекса и Wnt-сигнального пути в нефроцитах у 90
пациентов с хронической сердечной недостаточностью, по сравнению с 30 практически
здоровыми людьми [Батюшин М.М. c соавт., 2009].
Изменение профиля гликозилирования оказывает сильное влияние на иммуногенность и
общую биологическую активность [Li Y. et al., 2011]. Гликаны участвуют в выполнении самых
разных функций, связанных с клеточным распознаванием – в клеточной миграции, росте
аксонов, в формировании и стабилизации синапсов, а также в модулировании синаптической
135
активности [Kleene R., Schachner M., 2004]. Анализ уровня N-гликанов в сыворотке крови
является перспективным методом для идентификации новых биомаркеров почечноклеточного рака [Hatakeyama S. et al., 2014]. Данные многоцетрового исследования Parsons c
коллегами показали, что у пациентов с интерстициальным циститом возникает аномальное
гликозилирование белка Тамм-Хорсфалла, что может играть определенную роль в развитии
этого заболевания [Parsons C.L. еt al., 2011].
Таким образом, в промежуточный период исследования, при солепотреблении 6-9 г/день,
отмечается снижение экспрессии белков, по сравнению с начальным периодом исследования,
на 7%. При этом, в этот период времени (7-11 неделя эксперимента) активируются процессы,
связанные
с
клеточным
окислительный
стресс
метаболизмом,
и
гипоксию,
ремоделированием
регуляцией
хроматина,
апоптоза,
ответом
липидным
на
обменом,
ремоделированием мышц. PSF анализвыявил активацию белков, связанных с работой
пищеварительной системы, регенеративных процессов (путь Wnt-сигнальный путь и биосинтез
N-гликана).
3.3.2.2.3. Анализ результатов заключительного периода исследования
Заключительный период исследования включал в себя 12 – 15 недели эксперимента, при
контролируемом потреблении соли 6 г/день, а также восстановительный период эксперимента –
потребление соли в этот период времени было неконтролируемым. Отмечался низкий уровень
экспрессии
белка,
по
данным
обогащенного
анализа,
активировались
следующие
биологические процессы: метаболизм малых молекул, процессы «домашнего хозяйства»
клеток, связывание Mg2+, ответ на цинк, гибель клеток, процессы, опосредованные
рецепторами, связанными с G-белком, регуляция артериального давления (ренин/ангиотензин).
PSF выявил активацию процессов, связанных с реакцией на стресс (р53-, МРМ-сигнальный
путь), энергетический метаболизм (биосинтез убихинона).
Связывание Mg2+.
Нормальный уровень магния в организме признан основополагающей константой,
контролирующей
здоровье
человека,
установлено
наличие
не
менее
290
генов
в
последовательности генома человека, которые кодируют белковые соединения способные
связывать магний как кофактор множества ферментов. Внутриклеточная биодоступность
магния в организме регулируется рядом генов, контролирующих «сборку» и функционирование
белков на поверхности клеточных мембран, осуществляющих роль рецепторов или ионных
каналов, среди которых описаны TRPM-6 (Transient Receptor Potential Cation Channel) и TRPМ7, как наиболее важные. Изменения функционального состояния TRPM-7 под действием
катехоламинов на фоне эмоционального стресса способствуют развитию внутриклеточного
136
дефицита магния и повышение его уровня в крови [Громова О.А., Гоголева И.В., 2007; Шилов
А.М. с соавт., 2008]. Так, стрессовая ситуация, вызванная интенсивным шумовым
воздействием, приводит к значительному повышению экскреции магния с мочой (p=0,017), при
этом, значимо повышается уровень магния в крови [Громова О.А., Гоголева И.В., 2007].
В последние годы проводятся работы по изучению хронопатологических аспектов
дефицита магния. Показано, что оптимальный уровень магнезиемии является необходимым для
нормального функционирования эпифиза и супрахиазматических ядер, играющих роль
биологических часов [Громова О.А., Гоголева И.В., 2007; Durlach J., Pages N., Bac P., Bara M.,
Guiet-Bara A., 2005].
Избыточное потребление соли способствует активному выведению магния из организма и
ингибирует его вхождение в клетку [Шилов А.М. с соавт., 2009].
Внутриклеточные процессы.
В работе Замай предлагается феноменологическая модель ионной регуляции роста
клеточных популяций. В ней показано, что баланс Na+, К+, Ca2+ и Н+ во вне- и внутриклеточном
пространстве – константа, регуляция которой осуществляется на нескольких иерархических
уровнях. Соотношение катионов во вне- и внутриклеточном пространстве определяет
осмолярность среды и размер клетки. Стресс-факторы вызывают возмущение центральных
механизмов регуляции ионного гомеостаза – симпатическую и гипоталамо-гипофизарную
системы,
стимулирующие
секрецию
кортикостероидов,
кардиотонических
стероидов,
катехоламинов и инсулиноподобного фактора роста, биологическим эффектом которых,
помимо прочих, является увеличение размеров клетки за счет входа в нее катионов натрия и
воды. Усиление метаболической активности при действии стресс-факторов увеличивает
содержание Н+ в клетке, которое впоследствии уменьшается за счет работы Na+/H+ - обмена,
вследствие чего происходит защелачивание внутриклеточного содержимого и закисление
внеклеточного пространства. Повреждение механизмов транспорта ионов и неспособность
клетки поддерживать внутриклеточный ионный гомеостаз приводит к увеличению в клетках
содержания катионов натрия и воды, нарушению баланса кальция и протонов водорода, что в
совокупности нарушает компактизацию хроматина, стимулирует гиперэкспрессию генов,
уровень эпигенетической и геномной нестабильности, и, как следствие, гиперпролиферацию и
мутагенез [Замай Т.Н., 2011].
В работе Потешкиной на примере кардиомиоцитов показано, что при избытке Na+ в
интерстиции активизируется Na+/Н+ мембранный обмен, что уменьшает Na+ трансмембранный
градиент и усиливает Na+/Са2+ обмен с последующей перегрузкой кардиомиоцита ионами Са2+.
Рост внутриклеточной концентрации Na+ приводит к активизации генов, регулирующих
клеточный рост [Потешкина Н.Г., 2012]. Избыточное присутствие ионов Na+ во внеклеточной
137
жидкости приводит к перегрузке и недостаточности Na+/K+- обменников, с последующей
гипополяризацией клеточной мембраны, компенсаторному усилению механизма Na+/Сa2+
обмена, с перегрузкой ионами Сa2+ цитоплазмы гладкомышечных клеток [Потешкина Н.Г.,
2012; Re R. N., 2003].
Ответ на цинк.
Цинк необходим для нормального роста и полового развития, функционирования
иммунологических
реакций,
нормального
течения
процессов
заживления,
репарации,
биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Он требуется для деятельности более, чем 100
ферментов, связанных с обменом углеводов, белков, энергетическим обменом, синтезом
нуклеиновых кислот, биосинтезом гема, транспортом CO2 и др. [Шарафетдинов Х.Х., Сенцова
Т.Б., 2012; Arnold L.E. et al., 2011]. Цинк является мощным антиоксидантом, защищает
клеточные мембраны от активных форм кислорода [Волосовец А.П. с соавт., 2012].
Програмируемая гибель клеток (апоптоз).
Апоптоз важен для уравновешивания процессов пролиферации, дифферентации, а также
элиминации функционально неполноценных иммунокомпетентных клеток [Хаитов Р.М., 2001;
Артюхов В.Г. с соавт., 2014]. Отмечено, что интенсивность апоптоза клеток клубочка
достоверно коррелирует с их общим числом, а также – при мезангиопролиферативном варианте
хронического гломерулонефрита – с интенсивностью протеинурии. Активация апоптоза играет
роль в развитии гломерулосклероза, кортикального некроза, обструктивных нефропатий,
рефлюкс-нефропатии, поликистоза, гидронефроза, интерстициального нефрита, в том числе,
циклоспориновой нефропатии, посттрансплантационной острой почечной недостаточности
[Варга О.Ю., Хейфец Л.М., Волкова Т.О., Кручек М.М., 2006].
Рецепторы, опосредующие сигналинг через G-белки.
В последние годы достигнуты большие успехи в установлении пространственной
структуры сопряженных с G-белками рецепторов (GPCR) [Шпаков А.О, Шпакова Е.А., 2014;
Granier S., Kobilka B., 2012]. Они широко представлены на мембранах большинства клеток в
органах-мишенях [Федорова О.А., 2013], являются сенсорами в большинстве гормональных
сигнальных систем. Связывание GPCR с гормонами приводит к активации гетеротримерных Gбелков и эффекторов, представленных ферментами-генераторами вторичных посредников,
такими как аденилатциклаза, фосфолипаза С и фосфатидилинозитол-3-киназа, ионными
каналами, которые в сотни и тысячи раз усиливают первоначальный сигнал и формируют
адекватный ответ клетки на гормональное воздействие [Шпаков А.О, Шпакова Е.А., 2014].
Регуляция артериального давления (ренин / ангиотензин)э
В физиологических условиях РААС играет ключевую роль в регуляции сосудистого
тонуса и водно-электролитного баланса. Исследованиями последних десятилетий показана роль
138
активности РААС в формировании и прогрессировании АГ, сердечной недостаточности,
хронических заболеваний почек и системного атеросклероза [Визир В.А., Березин А.Е., 2010].
Согласно концепции о двухкомпонентности РААС выделяют центральное звено, включающее
циркулирующие в крови гормоны, и локальное тканевое звено, каждое из которых имеет
различную функциональную значимость. Центральное звено РААС, как система «быстрого
реагирования», обеспечивает относительно кратковременный контроль, включающийся у
больных при декомпенсации их состояния. Тканевые РААС - являются системами длительного
воздействия. Их активность в тканях остается высокой даже в случае нормализации
концентрации ренина и ангиотензина–II в циркуляции. Исследования продемонстрировали
наличие локальных РААС в мозговой ткани, сердце, периферических сосудах, надпочечниках,
почках, печени и жировой ткани [Дедов И.И., Александров А.А., 2005]. Внутрипочечная ренин–
ангиотензиновая система является мощным физиологическим стимулятором почечных
функций, ангиотензин - II сокращает как приносящие, так и отводящие артериолы и
стимулирует констрикцию мезангиальных клеток, приводя к снижению почечного кровотока,
уменьшению скорости гломерулярной фильтрации и фильтрационного заряда натрия [Дедов
И.И., Александров А.А., 2005]. Активизация тканевой почечной РАС играет важную роль в
формировании солезависимой артериальной гипертонии [Navar L.G. et al., 2002]. Натриевая
реабсорбция в почечных канальцах очень чувствительна к внутрипочечному уровню
ангиотензина II. Ангиотензин - II усиливает реабсорбцию натрия за счет одновременного
воздействия на ренальные сосуды и почечные канальцы. Селективная экспрессия почечного
ангиотензиногена,
ведущая
к
формированию
большого
количества
внутрипочечного
ангиотензина II, вызывает подъем системного артериального давления, несмотря на отсутствие
изменений в концентрации ангиотензина II в циркулирующей крови [Дедов И.И., Александров
А.А., 2005].
Реакция на стресс (p53-, mTOR-сигнальные пути).
Биологическая роль р53 заключается в обеспечении стабильности генома и генетической
однородности клеток в целостном организме, в обеспечении соблюдения интересов целостного
организма, в том числе, ценой жертвы отдельной клетки. Активировать р53 могут истощение
запасов нуклеотидов, нарушения цитоскелета (нарушения полимеризации актиновых волокон,
деполимеризация микротрубочек), нарушения биогенеза рибосом, состояние гипоксии и
ишемии, состояние гипероксии, отсутствие или избыток некоторых ростовых факторов или
цитокинов, нарушения клеточной адгезии и фокальных контактов, дефектные интегрины,
нарушение прикрепления клеток к субстрату (что сопровождается р53-зависимой гибелью
неприкрепленных клеток), появление полиплоидных клеток, разрушение хромосомного
веретена, гипер- и гипотермия, действие NO и многие другие события [Чумаков П.М. 2007;
139
Horn H.F., Vousden K.H., 2007; Corona G., Maggi M., 2010]. В работе Чумакова отмечено, что в
пределах физиологически-допустимых отклонений, при умеренных стрессах, физиологических
нагрузках, нарушениях диеты, незначительных воспалительных процессах активность р53, при
его сравнительно низком, базовом, уровне направлена на обеспечение гомеостаза, поддержание
адекватного уровня репарации, мобилизации оптимальных источников энергетических
ресурсов, переключении процессов биосинтеза, обеспечении защиты генома от мутагенных
воздействий со стороны избытка кислородных радикалов. При превышении же физиологически
допустимого уровня повреждений задачей р53 становится избавление от генетически опасных
дефектных клеток, что достигается либо путем активации апоптоза, либо за счет терминального
выхода клеток из процесса деления, что является формой генетической смерти [Чумаков П.М.
2007].
Половые гормоны
Известно, что уровень тестостерона влияет на отложение висцерального жира,
окружность талии и, в связи с этим, - на уровень липидов крови, артериального давления,
развитие инсулинорезистентности [Дедов И.И., Калинченко С.Ю., 2006; Corona G., Maggi M.,
2010]. Выявлена отрицательная корреляция между уровнями тестостерона и систолического АД
у мужчин с нормальными показателями АД (r = -0,35; р < 0,001), с изолированной
систолической гипертензией (r = -0,67; р < 0,001) и АГ (r = -0,19; р < 0,05), тогда как
отрицательная корреляция с показателями диастолического АД отмечена только у мужчин с
нормальными значениями АД (r = - 0,19; р < 0,05) [Князькова И.И., 2012]. В исследовании,
включавшем 1093 мужчин (среднего возраста 52,1±13,0 лет) установлена взаимосвязь между
повышением пульсового давления и содержанием свободного тестостерона в крови. Кроме
того, доказано, что у пациентов с АГ дефицит андрогенов ассоциируется с повышенной
жесткостью артериальной стенки и аорты по сравнению со здоровыми лицами, сопоставимыми
по возрасту [Князькова И.И., 2012].
Определенное негативное влияние условий изоляции на биосинтетические процессы
половых стероидов со сдвигом их активности в сторону ароматизации тестостерона до
эстрогенов отмечены в 105-суточной изоляции [Ларина И.М. с соавт. 2011].
Таким образом, на заключительном периоде исследования, который включал в себя 12–15
недели эксперимента, при контролируемом потреблении соли 6 г/день, а также не на
контролируемом (индивидуально-привычном) в восстановительный период, отмечался самый
низкий уровень экспрессии белка. По данным обогащенного анализа, активировались
следующие биологические процессы: метаболизм малых молекул, внутриклеточные процессы,
связывание Mg,2+ ответ на цинк, гибель клеток, рецептор, связанный с G-белком, регуляция
артериального давления (ренин/ангиотензин). PSF анализ выявил активацию процессов,
140
связанных с реакцией на стресс (р53-, МРМ-сигнальный путь), половых гормонов. Отчасти эти
изменения, возможно, связаны с выходом добровольцев из эксперимента и сопряжены с
психоэмоциональным напряжением. При этом белковая композиция мочи за неделю
восстановительного периода не возвращалась к фоновым значениям, что указывает на
инертность биологических процессов, в которые были вовлечены данные белки-участники.
Таким образом, проведенный биоинформационный анализ позволил выявить широкий
круг физиологических процессов, реагирующих на модуляции солепотребления, и показать их
взаимосвязи и действующие механизмы. Часть из них могла быть прямо связанной с
регуляцией
солевого
гомеостаза
(например,
ремоделирование).
Однако
большинство
биологических процессов не исследовались ранее у здорового человека, в связи с изменениями
состава рациона. Изменения протеома мочи в контролируемых условиях жизнедеятельности,
были связаны не только с режимами солепотребления, динамика изменений карт SOM не
следовала буквально за изменением уровня соли в рационе. Вторым по значимости фактором,
систематически воздействующим на добровольцев в изоляции, являлась гиподинамия.
3.4. Анализ протеома мочи в АНОГ
Гиподинамия является одним из значимых факторов воздействия на организм здорового
человека во время антиортостатической гипокинезии. Изучение воздействия АНОГ на
протеомную композицию мочи организма человека ранее не проводилось. Исследование
прямого профилирования сыворотки крови при обработке проб магнитными частицами MB
WCX в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией вызвал незначительные
изменения в протеомных профилях сыворотки крови. Так, в контрольной серии эксперимента
было обнаружено 8 пиков, достоверно отличающихся от фона. В частности, выявлено
увеличение пика интер-α-трипсинового ингибитора (m/z=2116 Да), что свидетельствует об
активации протеолитических систем сыворотки крови [Пахарукова Н.А. с соавт., 2009].
Вероятно, продолжительность эксперимента была недостаточна для развития ярко выраженных
изменений на уровне синтеза или модификации тех белков, которые охватываются данной
технологической платформой. В то же время, в серии с профилактическим приемом
десмопрессина в данном эксперименте было обнаружено увеличение пиков аполипопротеина
СI и уменьшение пика тромбоцитарного фактора IV. Как в контрольной группе АНОГ, так и в
группе с применением профилактики в виде приема десмопрессина (в виде таблетки, по 0,2 мг
через 17 и 20 часов после начала АНОГ), обнаружены сдвиги активности протеаз,
проявляющиеся в изменении паттерна фрагментов различных высокопредставленных белков
(фибриногена, комплемента С3, интер-α-трипсинового ингибитора и кластерина) [Пахарукова
Н.А. с соавт., 2009].
141
Объектом исследования в данном эксперименте служили образцы мочи восьми
добровольцев в возрасте от 20 до 44 лет. Испытатели находились в условиях АНОГ с углом
наклона тела относительно горизонтального положения -6° в течение 21 суток, находясь в
одинаковых контролируемых условиях. Моча для протеомных исследований собиралась
ежедневно за семь дней до начала эксперимента, на 5-е, 16-е, 21-е сутки АНОГ, также на 1, 3 и
6 день периода реадаптации. Всего в проанализированных образцах было выявлено 221
различных IPI индексов белков со значением Score от 24 до 1700. Идентификация белков,
выполнена по базе данных UniProt КВ, позволила достоверно обнаружить было 169
протеотипических белков в образцах мочи 8 добровольцев.
3.4.1. Постоянно присутствующие белки
В динамике эксперимента на всех временных точках были выявлены 6 постоянных
белков: эпидермальный фактор роста, белок AMBP, остеопонтин, уромодулин, простагландинH2 D-изомераза, сывороточный альбумин. Часть из этих белков выявлялась также и при других
воздействиях: в длительной изоляции, до и после космических полетов, до и после «сухой»
иммерсии [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2014]. Можно говорить о формирующемся списке
постоянно присутствующих белков мочи, выявляемых при различных экстремальных
воздействиях.
Для понимания значимости этих находок была выполнена ручная аннотация этих белков.
Эпидермальный фактор роста, белок AMBP, сывороточный альбумин были аннотированы
ранее, в главе «Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей».
Остеопонтин (MB 35,423 Дa) – это мультифункциональный фосфорилированный
гликопротеин, относящийся к классу матриксных белков, модулирующих минерализацию [Cho
H.J. et al., 2009]. Он является ингибитором образования центров кристаллизации, роста и
агрегации кристаллов оксалата кальция, на основании чего можно предполагать его роль в
предотвращении камнеобразования в почках [Kleinman J.G. et al., 2004]. Модифицированные
варианты белка могут функционировать как регуляторные переключатели активации или
ингибирования минерализации [Penescu M., Purcarea V. L., Sisu I., Sisu E., 2010].
Уромодулин (MB 69,761 Дa), известный также как белок Тамма-Хорсфалла, является
одним из наиболее распространённых белков мочи [Rampoldi L. et al., 2011]. Он
обнаруживается исключительно в клетках толстого восходящего колена петли Генле и эпителия
дистальных канальцев, в апикальных зонах клеток, откуда секретируется в мочу [Renigunta A.
et al., 2011]. Биологические функции уромодулина связывают с водно-электролитным балансом,
отводят роль фактора риска в развитии хронической почечной недостаточности и гипертензии
[Rampoldi L. et al., 2011; El-Achkar T.M., Wu X.R., 2012].
142
Простагландин-H2 D-изомераза (MB 21,029 Дa) является представителем семейства
липокалинов, участвующим в метаболизме арахидоновой кислоты, и играющим ключевую роль
в регуляции сна, болевых ощущений, при подавлении приступов эпилепсии [Kaushik M.K. et al.,
2014]. Считают, что определение этого белка может быть применено в качестве одного из
диагностических
критериев
некоторых
неврологических
расстройств,
дисфункции
сперматогенеза, сердечно-сосудистых и почечных заболеваний [Zhou Y. et al., 2010].
Таким образом, определен перечень постоянных белков, выявленных на всех временных
точках эксперимента. Этот список пересекался с аналогичными перечнями постоянных белков
в других экспериментальных ситуациях, в которых обследовались здоровые люди, таких как
длительная изоляция в гермообъекте, космические полеты, «сухая» иммерсия. Обоснованным
представлялось заключение, что появление в моче этих белков не только характерно для
здоровых мужчин, но они характеризуются постоянным присутствием в моче, при различных
экстремальных воздействиях.
3.4.2. Транзиторно присутствующие белки
Кроме постоянно присутствующих в моче белков, отдельные протеины появлялись в моче
транзиторно в определенный период эксперимента (табл.18).
Таблица 18. Транзиторно появляющиеся белки мочи в эксперименте с АНОГ.
-7
нет
относительные сутки экспериментального периода
5
16
21
+1
богатый цистеином гаммаманносилальфа-1 цепь
секреторный белок глутамил- олигосахарид коллагена
1
гидролаза -1,2-альфаманнозидаза
IA
пептидил-пролилфибулин-5
цис/трансизомераза
урокиназный
IgGFcактиватор
связывающий
плазминогена
белок
гистон
H2B
тип 1-D
+3
C3компонент
комплемен
та
+6
кадгери
н 11
антиген
CD9
Так, в фоновом периоде, на 7-е сутки до начала эксперимента не было выявлено
специфических белков, определяющих специфичность данной, конкретной точки эксперимента.
На 5-е сутки АНОГ специфичными оказались 3 белка: богатый цистеином секреторный
белок 1 (МВ 28,48 Da) играющий роль в мужской фертильности [Koppers A.J., Reddy T.,
O'Bryan M.K., 2011], пептидил-пролил-цис/транс изомераза (МВ 23,743 Da) - белок
143
центрального протеома [Burkard T.R. et al., 2011], участвующий в фолдинге белков [Jansen G. et
al., 2012], регуляции некоторых мембранных рецепторов и каналов, апоптозе, в процессе
коагуляции, и остеогенезе [Barnes A.M. et al., 2010]; а так же урокиназный активатор
плазминогена (МВ 48,50 Da), участвующий в процессе свертывания крови, протеолизе,
фибринолизе, регуляции адгезии, гомеостазе, ангиогенезе [Жалялов А.С., 2012].
На 16 сутки эксперимента специфическим белком оказалась гамма-глутамил-гидролаза
(МВ 35,964 Da) – лизосомальный фермент, вовлеченный в метаболизм фолатов и антифолатов,
принимающий участие в процессах протеолиза [Chave K.J., Auger I.E., Galivan J., Ryan T.J.,
2000].
На 21 сутки эксперимента в качестве специфичного белка для АНОГ выявлена манносилолигосахарид-1,2-альфа-маннозидаза IA (МВ 72,969 Da), входящая в центральный протеом
[Burkard T.R. et al., 2011] и участвующая в обмене олигосахаридов [Wilson I.B., 2012].
В период реабилитации перечень специфических белков был иным. На первые сутки
после эксперимента специфичными оказались 4 белка: альфа-1 цепь коллагена, фибулин-5, IgG
Fc-связывающий белок, гистон H2B тип 1-D.
Альфа-1 цепь коллагена 1 типа (МВ 138,941 Da) – это белок, участвующий в
формировании соединительной ткани. Кость - постоянно обновляющаяся ткань, в которой в
динамическом равновесии протекают процессы, как резорбции, так и костеобразования.
Коллаген 1 типа, альфа-1 цепь которого кодируется геном COLIA1, является наиболее
распространенным структурным белком матрикса соединительной (около 30%) и костной
(около 90%) тканей. Полиморфизм гена COL1A1 ассоциирован с минеральной плотностью
костной ткани и с хрупкостью костей [Зорина О.А., Борискина О.А., Ребриков Д.В., 2013],
”качеством” костной ткани [Stewart T.L. et al., 2006]. Показано, что моделирование эффектов
микрогравитации приводит к ингибированию остеогенной дифференцировки мультипотентных
мезенхимных стромальных клеток (ММСК) и преостеобластов [Huang Y. et al., 2009]. По
мнению некоторых авторов, эти изменения связаны с нарушениями в актиновом цитоскелете
клеток и активностью малых ГТФ-аз семейства Rho [Meyers V.E., Zayzafoon M., Douglas J.T.,
McDonald J.M., 2005]. Гершович исследовал экспрессию ключевых транскрипционных
факторов RUNX2, PPARγ, регулирующих, соответственно, остеогенный и адипогенный
дифференцировочный потенциал ММСК, а также основных маркеров их остеогенной
дифференцировки ALPL, COL1A, BGLAP, OMD. Показано, что после 20 суток экспозиции
ММСК на RPM (Random Positioning Machine) достоверно активировалась экспрессия гена цепи
коллагена 1 типа - COL1A [Гершович П.М., 2010].
Фибулин -5 (МВ 50,180 Da) кальций-связывающий эпидермальный фактор роста (cbEGF)
обогащенный белок внеклеточного матрикса, имеющий значение для формирования
144
эластичных тканей [Jones R.P. et al., 2009]. Фибулины представляют собой семейство
секретируемых гликопротеинов, которые действуют не только как межмолекулярные мосты в
пределах внеклеточного матрикса для формирования надмолекулярных структур, но и в
качестве посредников в клеточных процессах и ремоделирования ткани [de Vega S., Iwamoto T.,
Yamada Y., 2009]. Внеклеточные фибулины -3, -4, -5 и являются компонентами микрофибрилл
и участвуют в формировании и поддержании гомеостаза тканей. В частности, фибулин -5
необходим для образования эластических волокон, облегчает отложения эластина в
микрофибриллярный каркас [Wan W., Gleason R.L. Jr., 2013]. Обнаружено активное кальцийзависимое связывание коротких фибулинов с иммобилизованным гепарином [Djokic J. et al.,
2013].
IgG Fc-связывающий белок (МВ 572,017 Da) антитела класса IgG продуцируются в ответ
на проникновение в организм большинства бактерий и вирусов, они участвуют в формировании
активного иммунитета и иммунологической памяти, активируют систему комплемента по
классическому пути [Слободчикова С.В., 2014]. Введение очищенного препарата кроличьего
или человеческого Fc-фрагмента иммуноглобулина G предотвращало у крыс развитие
экспериментального гломерулонефрита [Тотолян А.А., Бурова Л.А., 2001].
Гистон H2B типа 1-D (МВ 13,936Da) - компонент хроматина. Известно, что основную
массу хроматина составляют белки гистоны, определяющие структуру хроматина и его
функции во время развития, роста, дифференциации и при поддержании гомеостаза клеток
[Beck H.C. et al., 2006]. Гистоны являются компонентом нуклеосом - основной единицы
хроматина [Королев В.Г., 2011]. В основе эпигенетической регуляции генов лежат два
взаимосвязанных процесса: метилирование ДНК и химические модификации гистонов
[Шалгинских Н.А., 2014].
Для 3-их суток периода восстановления после АНОГ специфическим белком, выявленным
в моче, оказался C3-компонент комплемента (МВ 187,148 Da). Комплемент - это каскадная
система протеолитических ферментов, осуществляющая гуморальную защиту организма от
действия чужеродных агентов, является важным компонентом как врождённого, так и
приобретённого иммунитета [Gullstrand B. et al., 2009]. С3 - центральный компонент системы
комплемента, белок острой фазы воспаления. Он участвует как в классическом, так и в
альтернативном пути комплемента. Активация С3 способствует выделению гистамина из
тучных клеток и тромбоцитов, поддерживает фагоцитоз, усиливает проницаемость стенок
сосудов, усиливает сокращение гладкой мускулатуры, хемотаксис лейкоцитов и соединение
антител с антигеном; играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний [Одинцов
Ю.Н., Перельмутер В.М., 2007].
145
На 6-е сутки периода восстановления выявлены были 2 специфичных белка: кадгерин 11 и
антиген CD9.
Кадгерин 11 (МВ 87,965 Da) - является трансмембранным рецептором адгезии, связанным
с цитоплазматической стороны с пучками микрофиламентов [Баринов Э.Ф., Сулаева О.Н.,
2010]. Кадгерины 11 сосредоточены в местах адгезивных межклеточных контактов, их
внутриклеточный домен также взаимодействует с актиновым цитоскелетом посредством
катенинов, способствуя сохранению формы клеток [Kottke M.D., Delva E., Kowalczyk A.P.,
2006]. Известно, что кадгерины представляют собой наиболее разнообразную группу кальцийзависимых гликозилированных протеинов. Они участвуют главным образом в межклеточных
взаимодействиях,
обеспечивающих
адгезию
между
двумя
молекулами,
которые
экспрессированы на поверхности двух клеток одного и того же типа [Махнева Н.В., Белецкая
Л.В., 2012]. Цитоплазматический домен этих молекул играет важную роль в связи с протеинами
цитоскелета [Kottke M.D., Delva E., Kowalczyk A.P., 2006]. Кроме физического контакта,
который кадгерины обеспечивают между двумя клетками, они способствуют передаче ряда
сигналов через структуры цитоскелета, контролируя рост и дифференцировку клеток.
Показано, что ключевыми регуляторами роста и созревания сосудов являются кадгерины
[Парфенова Е.В. с соавт., 2007]. Клетки сердечно-сосудистой системы, включая эндотелий,
перициты и гладкомышечные клетки, содержат VE-кадгерин и N (R)-кадгерин, которые
обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом и поддерживают ее
целостность [George S.J., Beeching C.A., 2006]. В работе Алексеева показано, что при изучении
белков мочи методами протеомики у пациентов с сахарным диабетом был выявлен E-кадгерин,
концентрация которого в моче была повышенной по сравнению с контрольной группой в 1,3,
5,2 и 8,5 раз при, соответственно, нормо-, микро- и макроальбуминурии. Кроме того,
отношение концентрации в моче растворимого sE-кадгерина (фрагмента E-кадгерина с ММ 80
кДа) к креатинину также значительно увеличилась в группах с микро - и макроальбуминурией
по сравнению с нормоальбуминурическими пациентами. Чувствительность и специфичность
определения sE-кадгерина в моче для диагностики диабетической нефропатии составляет,
соответственно, 78,8 и 80% [Алексеев А.В. с соавт., 2014].
Антиген CD9 (МВ 25,416 Da) - это мембранный гликопротеин из надсемейства
тетраспанинов, играет роль в клеточной миграции и адгезии [Алексеенко Л.Л., 2014].
Считается, что CD9 является маркером экзосом [Джагаров Д.Э., 2013].
Таким образом, в начальном периоде эксперимента, при изучении белковой композиции
мочи, мы наблюдали процессы адаптации к факторам антиортостатической гипокинезии,
выражающиеся в активации процессов, играющих роль в мужской фертильности, свертывании
крови, протеолизе, фибринолизе, регуляции адгезии, поддержании гомеостазе. Далее, в
146
процессе эксперимента, преимущественно активировались процессы, связанные с протеолизом,
обменом олигосахаридов. Интересны процессы, связанные с выходом из эксперимента. Так, на
+1 сутки восстановительного периода активизируются процессы, связанные с метаболизмом
коллагена, которые обеспечивают прочность костной ткани, внеклеточного матрикса,
имеющего значение для формирования эластичных тканей, приобретенного иммунитета. Далее,
на 3 сутки восстановительного периода, включается каскадная система комплемента, а на +6
сутки отмечаются процессы, которые обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки
друг с другом для поддержания ее целостности, активируются процессы восстановления в
местах адгезивных межклеточных контактов, сохранения целостности актинового цитоскелета,
а так же регуляции процесса сперматогенеза.
Для выявления и оценки процессов, которые, напротив, угнетаются на протяжении АНОГ
и период восстановления после нее, был определен список исчезающих (специфических)
белков в тех же точках исследования (табл. 19).
Таблица 19. Транзиторно исчезающие белки мочи в эксперименте с АНОГ.
-7
Внеклеточная сульфатаза SULF-2
Ig лямбда-7
цепь C
региона
хондроитин
сульфат
протеоглика
н-4
Нейтрофильный
желатиназоассоциирова
нный
липокалин
относительные сутки экспериментального периода
5
16
21
+1
+3
член 8
цитокерасульфгидрильн
кератин 2 суперсемейства
нет
тин 9
ая оксидаза 1
типа 6 В
иммуноглобулинов
дерматопонт
ин
альфа-1Bгликопротеин
+6
семеногелин 2
антитромбин
III.
мультимерин-1
Оказалось, что на следующий день после прихода добровольцев в стационар, за семь
суток до начала эксперимента, во второй фракции утренней мочи были выявлены исчезающие
белки, т.е. те белки, которые присутствовали в пробах, собранных на всех точках исследования,
кроме данной. К ним относились: внеклеточная сульфатаза SULF-2 (МВ 100,455 Da),
принимающая участие в регуляции деятельности фактора роста фибробластов, в регуляции Wnt
- сигнального пути [Lamanna W.C., Frese M.A., Balleininger M., Dierks T., 2008], в развитии
147
костей и хрящей [Huegel J. et al., 2013]; Ig лямбда-7 цепь C регион (МВ 11,303 Da), входящая в
состав различных иммуноглобулинов, играя положительную роль в противодействии
токсическому эффекту неферментативного гликозилирования [Щеглова Т., Маккер С.П.,
Трамонтано А., 2009]; хондроитин сульфат протеогликан - 4 (МВ 250,537 Da), являющийся
компонентом внеклеточного матрикса, играющий важную роль в ионном обмене, иммунных
реакциях, дифференцировке тканей [Миминошвили О.И. с соавт., 2013]; нейтрофильный
желатиназо-ассоциированный липокалин (МВ 22,588 Da), появляющийся в ответ на различного
рода стрессы, такие как воспаление, ишемия, инфекция, а так же при опухолевом росте
[Ералиев А.Р. с соавт., 2013]. Показана возможность его определения для улучшения
диагностики субклинического поражения почек [Haase-Fielitz A. et al., 2011]. При стрессе
NGAL особенно активно синтезируется иммунными клетками, гепатоцитами, адипоцитами,
клетками предстательной железы, клетками почечных канальцев, а также клетками эпителия
респираторного и пищеварительного трактов. В зависимости от конкретной ситуации, NGAL
может быть донором железа, что при поражении почек оказывает ренально-протективное
действие, а также имеет проапоптозную активность: при повреждении почечных канальцев
происходит повышение уровня NGAL как в сыворотке (в 7–16 раз), так и в моче (в 25–1000
раз!) [Вельков В.В., 2011].
На 5-е сутки эксперимента из протеома мочи исследуемых исчезал белок цитокератин 9
(МВ 62,064 Da), относящийся к центральному протеому [Burkard T.R. et al., 2011]. Этот белок
обнаружен в эпителии кожи, покрывающем ладони и пятки человека, в регионах тела,
испытывающих различную весовую нагрузку. Получены данные, что основой некоторых
наследственных кожных болезней, при которых резко снижается прочность кожного эпителия,
являются мутации генов кератина 9, специфичного для пяток и ладоней, при этом нарушается
прочность кожи именно в этих участках [Васильев Ю.М., 2006; Smith F., 2003]. В описываемый
период обследования исчезает также дерматопонтин (МВ 24,005 Da) - распространенный белок
внеклеточного матрикса, локализующийся главным образом на поверхности коллагеновых
волокон [Okamoto O., Fujiwara S., 2006]. Он способствует формированию фибрилл, возможно,
путем изменения конформации фибронектина и активирует адгезию фибробластов в начальной
стадии заживления ран [Kato A. et al., 2011].
На 16 сутки эксперимента не выявляется сульфгидрильная оксидаза 1(МВ 82,578 Da),
которая катализирует окислительно-восстановительные реакции [Ельников Р.С., Смахин М.Ю.,
Быстрова Н.А., 2011]. Этот фермент регулирует клеточный рост [Chakravarthi S. et al., 2007],
ангиогенез [Hellebrekers D.M. et al., 2007], защищает клетки от окислительного стресса [Morel
C. et al., 2007]. Исчезает альфа-1B-гликопротеин (МВ 54,254 Da) - один из белков острой фазы
148
воспаления, он обладает антигепариновой активностью, а при повышении концентрации происходит ингибирование агрегации тромбоцитов [Bastos-Amador P. et al., 2012]. Выявляется с
повышенной частотой в моче пациентов, со стероидно - устойчивым нефротическим
синдромом [Piyaphanee N. et al., 2011]. Не выявляется на 16 сутки эксперимента мультимерин-1
(МВ 138,110 Da), который принимает участие в тромбоцитарном гемостазе и контроле
артериального давления. Он входит также в состав семейства С1q-подобных белков, участвует
в классическом пути активации комплемента [Colombatti A. et al., 2012].
На +1 сутки после завершения эксперимента не выявляется кератин 2 типа 6 В (МВ 60,067
Da), который принимает участие в формировании цитоскелета, обнаруживается при псориазе,
при активном процессе заживления ран [Smith F.J. et al., 2003]. Показано, что биоптаты
здоровой кожи в органной культуре, обработанной интерлейлином-1, экспрессировали кератин
6 во всех супрабазальных слоях эпидермиса [Белова О.В., Арион В.Я., Сергиенко В.И., 2008;
Аль Касем Амин, 2012].
На
+3
сутки
восстановительного
периода
исчезает
член
8
суперсемейства
иммуноглобулинов (МВ 65,034 Da), принимающий участие в пролиферации клеток, адгезии,
развитии нервной системы, оплодотворении, скелетной мышечной ткани [Ray A., Treloar H.B.,
2012].
На 6 сутки восстановительного периода не выявляются семеногелин 2 и антитромбин III.
Семеногелин - 2 (МВ 65,444 Da) – это основной белковый представитель семенной жидкости
человека, обеспечивающий разрежение спермы (важное условие, обеспечивающее ее
фертильность) [Тюзиков И.А., Калинченко С.Ю., Ворслов Л.О., Греков Е.А., 2013].
Антитромбин III (МВ 52,602 Da) - основной эндогенный антикоагулянт, ингибитор плазменных
факторов свёртывания крови, плазменный кофактор гепарина [Szabo R. et al., 2005]. В работе
Кузичкина показано быстрое уменьшение активности антитромбина III, наступающее уже к 13
часу после начала АНОГ. Относительная средняя разность показателя с фоновыми
значениями при этом составляла 6,4 – 7,7%. В 7 суточной «сухой» иммерсии было показано,
что только к 8 суткам восстановительного периода происходит возвращение данного
показателя к фоновым значениям [Кузичкин Д.С., 2010]. В работе Шахматова и Киселева
показано, что гипокинезия крыс на протяжении 7 суток приводит к существенным изменениям
со стороны коагуляционного гемостаза, при этом, отмечалось снижение уровня фибриногена,
повышение содержания растворимых фибрин - мономерных комплексов. Авторы делают вывод
о том, что снижение антикоагулянтной активности плазмы свидетельствует об активации
процесса внутрисосудистого свертывания крови у экспериментальных животных к данному
сроку иммобилизации [Шахматов И.И., Киселев В.И., 2004]. В работе Альфонсова в 30
суточной АНОГ- 6° отмечалось повышение гипокоагуляционных реакций, что сменяется
149
повышением тромбообразующей функции крови на 7 и 15 день периода реадаптации.
Снижение гемостатической функции крови связано, по мнению авторов, со снижением
активности плазменных факторов свертывания и функции тромбоцитов [Альфонсов В.В.,
Альфонсова Е.В., 2010].
Таким образом, в начальный период эксперимента с антиортостатической гипокинезией
регистрировались изменения белкового состава мочи, которые свидетельствовали о вовлечении
в процесс адаптации различных типов тканей и клеток организма. Так, на 5 сутки эксперимента
снижалась активность процессов, связанных с пролиферативной активностью клеток
соединительной ткани дермы, с формированием фибрилл. Кроме того, менялись определенные
окислительно-восстановительные реакции, ангиогенез, тромбоцитарный гемостаз, артериальное
давление, подавлялся классический путь активации комплемента. После завершения
экспериментального периода не выявлялся белок, принимающий участие в формировании
цитоскелета, причем позднее, вероятно, менялась активность процессов, характерных для
гипокинезии, таких как пролиферация, адгезия клеток. Кроме того, к шестым суткам
восстановительного периода изменялись процессы, связанные с разрежением спермы, а так же с
коагуляционным
гемостазом,
что
аналогично
данным,
полученным
после
коротких
космических полетов [Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б. 2003].
3.4.3.Тканевая представленность белков
Как правило, большинство белков происходят в организме из нескольких тканей, однако,
одни из них являются все-таки преимущественными. На следующем этапе анализа было
выполнено извлечение из базы данных TiGER информации о соответствии между
регистрируемыми IPI и тканями, на основании содержащейся в данной базе информации о
тканеспецифической экспрессии генов для тканей человека. Анализ наших данных показал, что
из числа идентифицированных белков (169) в настоящее время тканевая принадлежность
известна для 131(табл. 20).
Таблица 20. Тканевая представленность белков, выявленных в моче добровольцев
во время 21 суточной АНОГ.
Ткани
Число
экспрессируемых белков
1
2
мочевой пузырь
клетки крови
кости
костный мозг
толстая кишка
5
9
7
7
5
150
Продолжение Таблицы 20.
1
2
Глаза
сердце
почки
гортань
печень
легкие
мыщцы
поджелудочная железа
периферическая нервная
система
простата
кожа
тонкая кишка
мягкие ткани
селезенка
желудок
яички
тимус
язык
3
6
9
9
25
1
1
8
1
8
7
1
5
4
3
2
1
4
Из таблицы видно, что преимущественный синтез белков, выявленных нами в моче во
время АНОГ, и попавших в нее из крови, осуществляется в различных тканях организма. Так,
более всего белков экспрессируется в печени - 25, почках, крови и гортани - по 9, и по 1 в
легких, мышцах, периферической нервной системе и тимусе.
Далее, для каждой временной точки эксперимента были определены сверхпредставленные
ткани (табл. 21).
Таблица 21. Динамика сверхпредставленных тканей.
-7
относительные сутки экспериментального периода
5
16
21
+1
+3
плазма
плазма
плазма
плазма
печень
печень
печень
печень
желчь
желчь
желчь
желчь
моча
моча
моча
моча
слюна
слюна
слюна
слюна
плазма
печень
желчь
моча
слюна
плазма
печень
желчь
моча
слюна
поджелудочная железа
поджелудочная железа
лимфоциты лимфоциты
мочевой
мочевой
пузырь
пузырь
семенные
пузырьки
+6
плазма
печень
желчь
моча
слюна
поджелудочная железа
поджелудочная железа
поджелудочная железа
поджелудочная железа
поджелудочная железа
лимфоциты
мочевой
пузырь
лимфоциты
мочевой
пузырь
почки
лимфоциты
мочевой
пузырь
почки
лимфоциты
мочевой
пузырь
лимфоциты
мочевой
пузырь
почки
151
Среди
9
сверхпредставленных
тканей
(плазма,
печень,
желчь,
моча,
слюна,
поджелудочная железа, лимфоциты, мочевой пузырь) встречающихся в эксперименте,
специфическими на 5 сутки эксперимента являются семенные пузырьки, а на заключительном
этапе эксперимента и в начале восстановительного периода – почки (табл. 22).
Таблица 22. Динамика специфических сверхпредставенных тканей в эксперименте.
-7
-
относительные сутки экспериментального периода
5
16
21
+1
+3
семенной
почки
почки
пузырек
+6
почки
Известно, что основные функции семенных пузырьков состоят в продукции основной
части семенной жидкости (до 75% от объема эякулята), в накоплении компонентов семенной
жидкости до момента семяизвержения и участии в механизме семяизвержения (в момент
семяизвержения
содержимое
семенных
пузырьков
и
семявыносящих
протоков
по
эякуляторным протокам поступает в мочеиспускательный канал, где смешивается с секретом
простаты). Возможно, что специфичная сверхпредставленность белков этой ткани на 5-е сутки
эксперимента связана с активацией богатого цистеином секреторного белка 1, играющего роль
в мужской фертильности [Koppers A.J., Reddy T., O'Bryan M.K., 2011]. В работе Воробьева с
соавт. показано, что при длительной гипокинезии с углом наклона тела относительно горизонта
-6° параметры сперматогенеза, характеризующие фертильность эякулята, снижались через 3
месяца, и одновременно возрастала секреторная активность добавочных половых желез
[Воробьев Д.В., Гончарова А.Г. Ларина И.М., 1998]. В том же эксперименте, Ничипорук с
соавт. отметил снижение, по сравнению с исходными (фоновыми) показателями и нормами
ВОЗ, процента живых, активно подвижных сперматозоидов, а так же увеличение количества
морфологически
измененных
форм
клеток
и
уменьшением
объема
эякулята.
Это
сопровождалось и определенными гормональными сдвигами: падением концентрации
фолликулостимулирующего гормона в крови на 55–60 и 108–110 сутки исследований, но и
практически неизмененной концентрацией лютеинизирующего гормона и тестостерона. В то же
время, отмечалась тенденция к нарастающему снижению концентрации пролактина в крови,
что косвенно отражало состояние дофаминергической системы организма в исследуемый
период. Возможно, по мнению авторов, изменения концентрации пролактина могли влиять на
снижение фертильности, поскольку известно, что у мужчин этот гормон участвует в регуляции
сперматогенеза и биосинтеза половых стероидов [Ничипорук И.А. с соавт., 1999]. Отмечена
связь между фертильностью, импотенцией гипогонадотропной природы и недостаточностью
секреции пролактина [Ничипорук И.А. с соавт., 1999; Руководство ВОЗ, 2001]. В других сериях
152
модельных исследований, в условиях изоляции длительностью 110 и 150 суток, обнаружено
уменьшение объема эякулята, концентрации сперматозоидов и подвижности клеток с
одновременным повышением числа незрелых половых клеток, что, вероятно, указывает на
некоторое усиление деструкции в сперматогенном эпителии. Выявленные отклонения
параметров эякулята от исходного уровня протекали на фоне увеличения объема
предстательной железы и семенных пузырьков [Курило Л.Ф. с соавт., 1995]. Анализ
полученных результатов после 520 суток изоляции показал достоверное изменение только двух
параметров: снижение числа живых сперматозоидов на 15% и уменьшение нормальных форм
сперматозоидов на 26%. Отмечено незначительное увеличение концентрации сперматозоидов и
объёма эякулята, а так же уменьшение подвижности сперматозоидов и содержания
лецитиновых зерен в эякуляте [Евдокимов В.В. с соавт., 2011].
Известно, что на первые сутки после перехода к условиям невесомости или модельных
экспериментов, происходят наиболее интенсивные сдвиги в жидкостных средах организма,
когда вслед за гемодинамическими сдвигами и изменением активности волюморегулирующих
гормонов, развиваются первичные изменения водно-электролитного обмена и функции почек.
Так, в этот период снижается реабсорбция жидкости и электролитов в почечных канальцах,
усиливается клубочковая фильтрация и в несколько раз возрастает диурез и выведение
осмотически активных веществ, при одновременном снижении водопотребления. Cоздаются
условия для развития отрицательного баланса жидкости и основных электролитов [Газенко
О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Носков В.Б., 2013]. Показано, что в условиях 120
суточной АНОГ (- 6°) содержание общей жидкости тела у обследуемых снижалось через 2
месяца на 5,8%, а объем внеклеточной жидкости на 11,7%, и такой дефицит сохранялся до
конца эксперимента [Лобачик В.И., Жидков В.В., Абросимов С.В., 1989]. При полугодовых
полетах на борту международной космической станции все жидкостные сектора организма
уменьшались в среднем на 5,2–10,4% [Носков В.Б. 2013], что вполне сопоставимо с данными,
полученными как в модельных экспериментах, так и в космических полетах. В целом, в
условиях невесомости и при ее моделировании наблюдаются очень сходные изменения
гидратационного статуса человека с одинаковой направленностью и степенью выраженности
[Носков В.Б., 2013].
В начальном периоде действия невесомости или при ее моделировании происходит
снижение секреции АДГ или вазопрессин и гормонов РААС, при одновременном увеличении
содержания в крови натрийуретического пептида и снижении симпатического влияния.
Преимущественная роль в развитии описанных реакций принадлежит волюморегулирующему
рефлексу: при этом не наблюдается существенных изменений концентрации осмотически
активных веществ и ионного состава крови. Вследствие произошедших первоначальных
153
гормональных сдвигов развивается гиповолемия и гипогидратация организма, что служит
стимулом для увеличения продукции осмо - и волюморегулирующих гормонов. После
возвращения человека из космического полета или пребывания в условиях постельного режима
или АНОГ обычным является увеличение активности РААС, а также концентрации АДГ, при
одновременном усилении их почечной экскреции, причем выраженность этой реакции не
зависит прямо от продолжительности пребывания в невесомости или в АНОГ. Такая активация
волюморегулирующих
обусловленной
гормонов
необходимостью
является
проявлением
восстановления
объема
компенсаторной
реакции,
внутрисосудистой
жидкости
[Григорьев А.И., Ларина И.М. 2001; 2009; Григорьев А.И., Ларина И.М. Носков В.Б., 2006;
Носков В.Б., 2013]. Таким образом, активация экспрессии белков тканей почек на 21сутки
АНОГ, и в период острой адаптации является закономерной реакцией вовлекающей основной
эффекторный орган – почку.
Известно, что регуляторные механизмы, направленные на поддержание объема крови,
адекватного потребностям организма при любых изменениях массы тела, действуют наиболее
эффективно. Во время пребывания здоровых добровольцев в условиях АНОГ происходит
закономерное уменьшение объемов общей жидкости тела и внеклеточной жидкости, за счет
усиления почечной экскреции жидкости и электролитов, при этом развивается отрицательный
водный баланс, т.е. возникает состояние умеренной гипогидратации [Газенко О.Г., Григорьев
А.И., Наточин Ю.В. 1980; Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б., 2003]. Так,
показано, что к концу 120 суточного АНОГа (без использования средств профилактики) из всех
показателей удельных объемов жидкостных сред организма наиболее близкими к фоновым
значениям оказались параметры объема циркулирующей плазмы, нормализованные на массу
тела. Очевидно, в силу особой роли крови в обеспечении жизненно важных функций, ее объем
регулируется более жестко, чем объемы других жидкостных компарментов. Если для
начального этапа адаптации к АНОГ было характерно снижение, как массы тела, так и объема
циркулирующей плазмы, то при длительном пребывании в условиях АНОГ связь между этими
показателями нарушалась [Моруков Б.В., Смирнова Т.М., Ларина И.М., 2008]. Общее
содержание воды в организме, в основном, определяется количеством внутрисососудистой,
межклеточной и внутриклеточной жидкости. В этой связи уменьшение массы циркулирующей
крови может быть существенной причиной, способствующей снижению переносимости
ортостатического воздействия, т.к. существует определенная зависимость между количеством
циркулирующей крови, минутным объемом сердца и величиной мозгового кровотока
[Михайлов В.М. 2001].
154
3.4.4. Процессы, связанные с регуляцией жидкостных объемов тела
Для того, что бы понять, как воздействует АНОГ на процессы, происходящие в почках и
как быстро они возвращаются к фоновому уровню функционирования, был взят один из 106
процессов, принимающих участие в деятельности почек, а именно: «регуляция уровня
жидкости тела» (regulation of body fluid level). По GO- «regulation of body fluid level» включает в
себя любой процесс, который регулирует уровни жидкости в организме (схема 1).
Схема 1. Взаимодействие процессов: от «biological procеss» до «regulation of body fluid level»
Всего в процессе «regulation of body fluid level» по GO участвуют 720 белков, в образцах
мочи эксперимента выявлялось – 18 белков, динамика появления или исчезновения которых из
мочи представлена в табл. 23.
Таблица 23. Динамика белков, участвующих в процессе «regulation of body fluid level».
Название белка
1
альфа-1-антитрипсин
кининоген-1
относительные сутки эксперимента
-7
5
16
21 +1
+3
+6
2
3
4
5
6
7
8
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
155
Продолжение Таблицы 23.
1
2
3
4
5
6
7
8
эпидермальный фактор роста
альбумин
ингибитор сериновых протеаз
плазмы C1
лизосом-ассоциированный
мембранный гликопротеин- 2
CD44 антигена
витамин К-зависимым белком Z
кластерин
тромбоцитарный гликопротеин
VI
эндотелиальный рецептор
протеина С
Просапозин
альфа цепь фибриногена
антитромбин 3
мультимерин-1
серотрансферин
фибронектин
протеазный ингибитор 1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
Примечание: «-» - данный белок не выявляется в пробе; «+» - данный белок выявляется в пробе
Как видно из табл. 23, динамика белков в процессе эксперимента различна. Для того, что
бы определить, как быстро возвращается белковая композиция этого процесса к фоновому
уровню, было определено общее число выявленных белков в каждой точке эксперимента и
построен график зависимости числа белков данного процесса от времени (табл. 24).
Таблица 24. Динамика зависимости общего количества белков процесса
«regulation of body fluid level» от времени эксперимента
Относительные сутки
эксперимента
-7
5
16
21
+1
+3
+6
Сутки
Число белков
1
13
24
29
30
33
36
12
11
12
14
15
10
12
156
16
14
12
10
8
6
4
2
0
5
0
10
15
20
25
30
35
40
График 3.
Зависимость числа белков процесса «regulation of body fluid level» от
времени пребывания в эксперименте
Примечание:
Зеленые точки - теоретическое время возвращения к исходному (фоновому) уровню
белковой композиции процесса.
Анализ показал, что динамика представленности 7 белков данного процесса: альфа-1антитрипсина (SERPINA1, MB 46,737Дa), кининогена-1 (KNG1, MB 71,957Дa), эпидермального
фактора роста (EGF, MB 133,994Дa), альбумина (ALB, MB 69,367 Дa), ингибитора сериновых
протеаз плазмы C1 (SERPING1, MB 55,154 Дa), лизосом-ассоциированного мембранного
гликопротеина- 2 (LAMP2, MB 44,961Дa), CD44 антигена (CD 44, MB 81,538 Дa) не изменяется
в течение эксперимента.
В то же время, сравнение 2х точек - за семь дней до эксперимента и шесть дней после
воздействия, показало, что почти вся белковая композиция возвращается к фоновым значениям,
отличаясь 2 белками: витамин К-зависимым белком Z и мультимерином-1. Так, витамин Кзависимым белком Z (PROZ, MB 44,744 Дa) не выявляется на 5 сутки воздействия; в течение
эксперимента наблюдается определенный дрейф его представленности. Однако к шестому дню
последействия он не обнаруживается в моче. Витамин К-зависимый белок функционирует в
артериях и костной ткани, регулируя активность матричного Gla-белка (MGP, Matrix Glaprotein) и остеокальцина (BGP, Bone Gla-protein) посредством трансформации радикалов
глютаминовой
кислоты
в
γ-карбоксиглютаминовую
кислоту
через
процессы
карбоксилирования, что делает биологически активными оба вышеназванных протеина.
Показано, что MGP ингибирует сосудистую кальцификацию, а BGP играет важную роль в
процессах минерализации [Fusaro M. et al., 2011], эти белки играют ключевые роли в процессах
минерализации и в предотвращении эктопической кальцификации [Zak-Gołab A., Okopień B.,
Chudek J., 2011]. Мультимерин-1выявляется только на 1 и 6 сутки восстановительного периода,
аннотирован выше.
157
В начальном периоде эксперимента (на 5 сутки) 2 белка процесса «regulation of body fluid
level» исчезают, а один появляется. К исчезающим белкам относится: витамин К-зависимый
белок Z, функции которого были описаны ранее и кластерин (CLU, МВ 52,495 Da) - димерный
гликопротеин, он подавляет апоптоз и участвует в агрегации клеток [Алексеев А.В. с соавт.,
2014]. Ozer с соавт. обнаружили, что повышенный уровень кластерина в моче сохраняются во
время регенерации почечных структур [Ozer J.S. et al., 2010]. Определение мочевой экскреции
кластерина имеет практическую значимость, как при мониторинге длительного повреждения
почек, так и в периоде восстановления после заболевания. В работе Solichova с соавт. было
установлено, что уровень кластерина в моче слабо коррелирует с величиной протеинурии (r =
0,28, р = 0,018) и соотношением «общий белок/креатинин» (r = 0,26, р = 0,02) [Solichova P. et al.,
2007]. В то же время корреляции между этим показателем и скоростью клубочковой
фильтрации (СКФ), возрастом, содержанием в моче α1-микроглобулина, альбумина, ионов
натрия и калия, соотношения «альбумин/креатинин» выявлено не было. Авторы заключили, что
измерение уровня кластерина в моче не дает никаких преимуществ перед другими маркерами
почечного повреждения [Solichova P. et al., 2007]. К вновь появляющемуся на 5 сутки белку
относится тромбоцитарный гликопротеин VI (GP6, МВ 36,866 Da), являющийся рецептором, с
которым связываются фибриноген и фактор Виллебранда. Этот процесс имеет большое
значение для агрегации тромбоцитов [Pokidysheva E. et al., 2014].
На 16 сутки эксперимента исчезает эндотелиальный рецептор протеина С (PROCR, МВ
26,671 Da) участвующий в свертывании крови [Ireland H.A. et al., 2009] и играющий важную
роль в активации протеина C [Демьяненко А.В., Капустин С.И., Сорока В.В., Чечулов П.В.,
2013]. Известно, что эндотелий выполняет не только барьерную функцию, но и является
крупнейшим паракринным органом, играющим важную роль в поддержании сосудистого
гомеостаза, тонуса и анатомической структуры сосудистой стенки. Наиболее значимыми и
специфичными
кандидатами
в
маркеры
эндотелиальной
дисфункции
называют
десквамированные эндотелиальные клетки, растворимые молекулы адгезии (sICAM-1, sVCAM1), тромбомодулин, эндотелиальный рецептор протеина С и некоторые другие [Полякова А.П.,
Блинов М.Н., Каргин В.Д., Капустин С.И., 2011]. Исчезающий на 16 и 21 сутки эксперимента
просапозин (PSAP, МВ 58,113 Da) является белком, который у человека кодируется геном
PSAP. Данный ген кодирует высококонсервативный гликопротеин, который является
предшественником 4 продуктов расщепления: сапозинов A, B, C и D. Он обладает
нейротрофической активностью и необходим для гидролиза специфическими лизосомальными
гидролазами некоторых сфинголипидов [Meyer R.C., Giddens M.M., Schaefer S.A., Hall R.A.,
2013].
158
Только на 21-е сутки эксперимента выявляется альфа цепь фибриногена (FGA МВ 94,973
Da), которая способствует полимеризации мономеров в фибрин [Митрофанов К.Ю., Желанкин
А.В., Сазонова М.А., 2013] и действует как кофактор в агрегации тромбоцитов. Показано, что
частота выявления белка возрастает после длительных космических полетов [Пастушкова Л.Х.
с соавт., 2013]. На 21 сутки определяется также антитромбин 3, описанный ранее.
Специфическим белком как 1, так и 3 суток периода восстановления является
мультимерин-1, аннотированный выше.
На 3 сутки два белка не выявляются: серотрансферин (TF, МВ 77,064Da) - один из
маркеров обмена железа в организме [Павлов Ч.С., Баев А.А., Лавров А.В., 2005], белок острой
фазы при воспалении [Гордеева О.Б., 2013]; фибронектин (FNI МВ 262,625Da) - один из
ключевых белков межклеточного матрикса [Shi F. et al., 2014]. Известно, что существует
несколько форм фибронектина, которые синтезируются разными клетками - растворимый, или
плазменный фибронектин синтезируется гепатоцитами, нерастворимый, или тканевый
синтезируется
в
основном
фибробластами
или
эндотелиоцитами,
глиоцитами
и
эпителиальными клетками. Обе формы фибронектина вовлекаются в разнообразные процессы:
способствуют адгезии и миграции эпителиальных и мезенхимальных клеток, контролируют
дифференцировку и поддержание цитоскелета клеток, активно участвуют в воспалительных и
репаративных процессах, проявляют протеолитическую активность [Llopis-Hernández V. et al.,
2013].
В начале восстановительного периода возрастает частота выявления протеиназного
ингибитора
1
(TIMP1
МВ
23,171),
который
относится
к
семейству
матриксных
металлопротеиназ (ММРs), играющих важную роль в физиологических и патологических
процессах, включая эмбриогенез, тканевое ремоделирование, заживление ран, воспаление. В
исследовании Athero Gene выявлено, что ММP-9 и TIMP-1 являются независимыми
предикторами сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и гибели пациентов с ишемической
болезнью сердца [Son D.J. et al., 2013]. В нормальной сосудистой стенке можно найти только
ММР-2, TIMP-1 и -2. Это дает основание использовать эти белки в качестве маркеров острой
фазы ССЗ (разрыв бляшки). Основные локусы экспрессии TIMP-1 находятся в яичниках и
костной ткани. TIMPs ингибируют развитие опухоли, метастазирование и ангиогенез
[Каплунова В.Ю., c соавт., 2013; Кожевникова М.В., 2014].
Таким образом, при анализе протеома мочи определены 18 белков, участвующих в
процессе «regulation of body fluid level». Среди них выделены постоянно присутствующие в
течение АНОГ белки: альфа-1-антитрипсин, кининоген-1, эпидермальный фактор роста,
альбумин,
ингибитор
протеаз
плазмы
C1,
лизосом-ассоциированный
мембранный
гликопротеин- 2, CD44 антиген. Динамика другой части белков изменялась в течение
159
эксперимента: витамин К-зависимого белка, мультимерина-1, витамин К-зависимого белка Z,
кластерина, тромбоцитарного гликопротеина VI, эндотелиального рецептора протеина С,
просапозина, альфа цепи фибриногена, антитромбина 3, серотрансферина, фибронектина. К 6
суткам восстановительного периода белковая композиция процесса «regulation of body fluid
level» возвращалась к фоновым значениям. Следовательно, биоинформационный анализ с
использованием ресурсов Uniprot KB (для сопоставления IPI и SwissProt ID) и BiNGO (для
поиска сверхпредставленных процессов), позволил построить гипотезы о связи биологического
процесса
«регуляция
уровня
жидкости
тела»
со
многими
другими
процессами:
ремоделированием, коагуляцией, комплементом, клеточной адгезией и другими.
3.4.5. Белки и процессы, связанные с функциями почек.
Изучение водно-электролитного обмена, функции почек и их гормональной регуляции во
время модельных экспериментов (гипокинезия, иммерсия и др.), а также при космических
полетах и в реадаптационном периоде показало важнейшую роль водно-солевого гомеостаза в
адаптации организма человека и животного к новым условиям жизнедеятельности в
невесомости. Рядом авторов было установлено, что в начальный период действия невесомости
изменение волюморегуляции является следствием перераспределения крови, приводящего к
изменению продукции гормонов, формированию отрицательного водного баланса, а также
перераспределению жидких сред организма между различными водными секторами [Григорьев
А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Hinghofer-Szalkay H.G. et al., 2002]. На более поздних
этапах полета наступает перестройка водно-солевого гомеостаза, уменьшается диурез и
экскреция почками натрия, увеличивается продукция антидиуретического гормона и гормонов
ренин-ангиотеизин-альдостероновой системы. После возвращения к земной гравитации у
большинства космонавтов развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение
потерь внеклеточной жидкости и минеральных веществ для формирования исходного (земного)
типа водно-солевого гомеостаза [Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б., 2003;
Носков В.Б., 2013].
Почки, как эффекторный орган водно-солевого обмена, играют центральную роль в этих
процессах. В данном исследовании было выявлено 9 белков, принимающих участие в функциях
почек. Эти белки присутствовали хотя бы у одного из обследуемых и участвовали в 106
биологических процессах, объединенных в 13 подгрупп, представленных в табл. 25.
160
Таблица 25. Группы почечных процессов.
Группы процессов
Развитие, рост органов и тканей
Сигнальные пути, ответ на стимул
Взаимодействие с микроорганизмами
Клеточная адгезия и межклеточные взаимодействия
Регуляция ферментативной активности
Участие в воспалении
Регуляция на организменном уровне
Метаболизм
Гемостаз
Внутриклеточные процессы
Иммунная система
Число
процессов в группе
30
11
2
1
1
1
23
12
10
14
1
106
Наибольшее количество процессов представлено в подгруппе развитие и рост органов и
тканей - 30, регуляции на организменном уровне - 23, метаболизме и гемостазе, соответственно,
12 и 10.
Была определена динамика 9 почечных белков до, во время и после эксперимента. Все эти
белки, обнаруженные в моче добровольцев-участников АНОГ, встречаются также и в списке 17
почечных белков космонавтов и дублеров (табл. 26) [Пастушкова Л.Х. с соавт. 2013].
Таблица 26. Динамика почечных белков.
Название белка
относительные сутки эксперимента
-7
5
16
21
+1
+3
+6
калликреин 1
+
+
+
+
+
+
+
кининоген-1
+
+
+
+
+
+
+
витамин К-зависимый белок Z
+
+
+
+
+
+
+
остеопонтин
+
+
+
+
+
+
+
мегалин
+
+
+
+
+
+
+
уромодулин
+
+
+
+
+
+
+
кубилин
+
+
+
+
+
+
+
эпидермальный факторроста
+
+
+
+
+
+
+
аминопептидаза А
+
-
-
-
+
+
+
Примечание: «-» - данный белок не выявляется в пробе, «+» - данный белок выявляется в пробе
161
На наш взгляд, было интересно сравнить композицию почечных белков на +1-е сутки
после АНОГа и продолжительного космического полета. Так, сразу после эксперимента с
АНОГ (на всех точках восстановительного периода) присутствует аминопептидаза А, в то же
время, на протяжении эксперимента она не обнаруживается. У космонавтов, совершивших
длительные полеты, пептидаза обнаруживается только на 7-е сутки восстановительного
периода [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013]. Известно, что аминопептидаза А является жизненно
важным ферментом в контроле артериального давления через деградацию ангиотензина-II.
Считают, что она кратковременно появляется в моче как маркер обратимой канальцевой
дисфункции средней выраженности [Motoyoshi Y. et al., 2009]. В физиологических условиях
такие признаки наблюдаются после эпизодов гипоксии почечной ткани [Barratt J., Topham P.,
2007]. В данном эксперименте с АНОГ на первые сутки после воздействия афамин и аквапорин
- 2 не обнаруживаются, а у космонавтов они являются специфическими белками первых
послеполетных суток [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013].
Таким образом, в данном исследовании было выявлено 9 белков, принимающих участие в
реакциях почек на антиортостатическое воздействие. При сравнении белковой композиции
мочи 21 суточной АНОГ с таковой после длительных космических полетов было показано, что,
в моче добровольцев не обнаруживаются аквапорин-2 и афамин, что, возможно связано с более
длительными и значимыми воздействиями на организм космических полетов по сравнению с
АНОГ. Так, от количества аквапорина-2 зависит повторное всасывание воды почками и, как
следствие, количество выделяемой мочи, а так же, вероятно, выделяемого с мочой кальция
[Starklint J. et al., 2006], а афамин играет важную роль в защите от окислительного стресса,
являясь антиоксидантом и антиапоптотическим белком [Heiser M. et al., 2002].
3.4.6. Белки и процессы, связанные с функциями ССС
В данном эксперименте было выявлено 13 белков, осуществляющих свои функции в ССС
и участвующие в 142 процессах, объединенных в 12 групп (Таблица 27). Все эти белки входят в
список из 14 белков, выявленных до и после космического полета [Пастушкова Л.Х. 2013].
Таблица 27. Группы процессов, связанные с функциями сердечно-сосудистой системы.
Группы процессов
Число белков
1
2
Метаболизм и каскады, сигнальные пути молекул
Регуляция на организменном уровне
Клеточная подвижность
Внутриклеточные процессы
Биосинтез
Клеточная адгезия и межклеточные взаимодействия
15
30
6
12
9
3
162
Продолжение Таблицы 27.
1
2
Гемостаз
Ответ на стимул
Развитие и рост органов и тканей
Взаимодействие с микробиотой
Регуляция внеклеточного матрикса
Иммунная система
22
21
8
9
3
4
142
Наибольшее количество процессов было связано с регуляцией (30), гемостазом (22),
ответом на различные стимулы (21).
Далее был проведен анализ и динамика данных белков в процессе эксперимента (табл.
28).
Таблица 28. Динамика белков сердечно-сосудистой системы.
Название белка
альбумин
церулоплазмин
эндотелиальный рецептор протеина С
калликреин-1
кининоген-1
остеопонтин
простагландин-H2 D-изомераза
несекреторная рибонуклеаза
кадерин-2
урокиназный активатор плазминогена
цистатин-C
гамма –глутамилтранспептидаза 1
тиоредоксин
-7
+
+
+
+
+
+
+
+
-
5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
относительные сутки
эксперимента
16 21
+1
+3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Примечание: «-» - данный белок не выявляется в пробе; «+» - данный белок выявляется в пробе
Постоянных белков сердечно-сосудистой системы в АНОГе было обнаружено 9; они так
же входят в список постоянных белков до и после КП [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013].
Цистатин С присутствует у космонавтов как до, так и после КП, а у испытателей в АНОГе, он
выявляется во время эксперимента и на первые сутки периода восстановления. Цистатин С
отмечен в качестве высокочувствительного маркера тяжести сердечно - сосудистых
расстройств, выявляемый независимо от других кардиомаркеров, таких как кардиальные
163
тропонины, натрийуретические пептиды, С - реактивный белок [Виллевальде С.В., Гудгалис
Н.И., Кобалава Ж.Д., 2010; Харченко М.С. с соавт., 2012].
Во время эксперимента с АНОГ отмечался определенный дрейф кадгерина 2; он
выявлялся на 5 сутки эксперимента, затем исчезал на 16, и затем, вновь появлялся в образцах в
конце эксперимента, на 21 сутки и 1 сутки восстановления. На третьи и шестые сутки
восстановительного периода он не обнаруживался в моче. Кадгерины I и II группы,
представляют собой гликопротеиды, участвующие в Са2+ - зависимой межклеточной адгезии.
Они взаимодействуют с актиновым цитоскелетом, а также принимают участие во
внутриклеточной
сигнализации
[Махнева
Н.В.,
Белецкая
Л.В.,
2012].
Гамма-
глютамилтранспептидаза – микросомальный фермент, который встречается во многих
паренхиматозных органах, участвует в обмене аминокислот. Он катализирует перенос гаммаглутамилового остатка с пептида на аминокислоту или другой пептид, или на иную
субстратную молекулу [Северин Е.С., 2013]. Появление его на 3 и 6 сутки после эксперимента,
возможно, связано с изменениями в белковом обмене на уровне организма.
Оказалась интересной динамика тиореодоксина. Этот белок появляется на первые, а также
на 16 и 21 сутки АНОГ, а затем исчезает. Отмечено, что данный белок является специфичным
для 1 суток после полета [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013; 2015]. Возможно, он появляется так
же в полете, однако, мы имели возможность обследовать космонавтов только на первые и
седьмые сутки после воздействия. Тиоредоксины экспрессируются почти во всех тканях
организма, включая кардиомиоциты [Hashemy S.I., 2011], защищают клетки от различных
видов повреждений [World C.J. et al. 2006]. При сердечно-сосудистой патологии уровень белка
в сыворотке крови значительно возрастает [Miyamoto S. et al. 2004].
Таким образом, была определена динамика 13 белков, принимающих участие в работе
сердечно-сосудистой системы. Тиоредоксин, как белок, функционирующий в сердечнососудистой системе, а так же стресс-индуцируемый белок, защищает клетки от различных
видов повреждений; он появляется в моче добровольцев на 16 сутки эксперимента и исчезает к
3 суткам восстановительного периода. В моче космонавтов этот белок появляется только на
первые сутки восстановительного периода [Пастушкова Л.Х., с совт. 2013]. Возможно, он
появляется в моче космонавтов и во время полета, однако, пока нет возможности исследовать
белковую композицию мочи во время космического полета.
3.4.7. Белки и процессы, связанные с функциями костно-мышечной системой
Известно, что до и после изоляции в гермообъеме (Эксперимент "Марс-105") методом
pQCT в лучевой кости у большинства испытателей отмечено ухудшение показателей
микроархитектуры - снижение числа трабекул и увеличение негомогенности трабекулярной
164
сети. В большеберцовой кости отмечено снижение объемной минеральной плотности как
трабекулярной, так и кортикальной кости, а также не вполне ожидаемое улучшение качества
трабекулярной кости в виде роста числа трабекул и снижения негомогенности трабекулярной
сети [Простяков И.В., Новиков В.Е., Моруков Б.В., 2010]. Длительный постельный режим
сопровождается уменьшением костной массы, снижением минеральной плотности костей
нижней половины скелета (поясничные позвонки, проксимальный эпифиз бедренной кости). В
костях верхней половины скелета выявляется тенденция к увеличению содержания минералов
("гиперминерализация") [Оганов В.С.,1998]. Потери костной массы доступны измерению и их
величина
при
гипокинезии
длительностью
до
4
мес.
может
достигать
значений,
квалифицируемых по Т-критерию как остеопения. Увеличение длительности постельного
режима до 6 месяцев и более может сопровождаться в отдельных случаях развитием
остеопороза. Предполагается, что явления остеопении при гипокинезии связаны с общим
снижением скорости процессов ремоделирования и обусловлены дефицитом механической
стимуляции костной ткани в этих условиях [Оганов В.С, 2003]. Известно, что уже на 7-й день
пребывания здорового человека в гипокинезии регистрируется повышение почечной экскреции
калия, а к концу 2-й недели – это приводит к его отрицательному балансу [Fuller J.H., Bernauer
E.M., Adams W.C., 1970]. Исследователи отмечали повышение суточной экскреции калия и в
более поздние периоды гипокинезии [Пак З.П. с соавт., 1973]. Источником потери калия
является мышечная ткань, подвергающаяся гипотрофии. Мышечная гипотрофия ответственна
также за отрицательный баланс азота в гипокинезии, развивающийся как следствие
повышенного выведения фосфатов и азотистых продуктов почками [Федоров И.В., Черный
А.В., Федоров А.И., 1977]. Ограничение двигательной активности ведет к увеличению
выведения кальция с мочой из организма, что повышает риск образования почечных камней и
костных переломов, вызывает снижение функциональной активности С-клеток щитовидной
железы и повышение активности паратиреоцитов. Это приводит к дисбалансу гормонов,
регулирующих обмен кальция, к торможению новообразования костной ткани [Григорьев А.И.,
Ларина И.М., 2001; Долганова Т.И., Лунева С.Н., Колчерина В.В., 2008]. В работе Морукова
показано, что длительная антиортостатическая гипокинезией приводит к прогрессирующим
потерям кальция, которые обусловлены сдвигами метаболизма и процессов остеогенеза в
костной ткани, изменениями содержания в крови кальцийтропных гормонов, транспорта
кальция в почках и его всасывания в желудочно-кишечном тракте [Моруков Б.В., 1999]. Во
время гипокинезии кальций теряется неравномерно из различных костей скелета, отмечалось
большее влияние условий эксперимента на эпифизы и трабекулярные зоны, чем на диафизы и
компактную кость [Дурнова Г.Н, с соавт., 2004]. При этом меры профилактики (прием
бисфосфонатов) не отменяют развитие отрицательного баланса кальция, а лишь несколько
165
уменьшают его темп [Оганов B.C., 1998; Моруков Б.В., 1999; Долганова Т.И., Лунева С.Н.,
Колчерина В.В., 2008]. Скорость, с которой костная ткань восстанавливалась после
гипокинезии, не велика: после 30-36-недельных экспериментов ее плотность вернулась к
исходному уровню не ранее, чем через 6 месяцев [Donaldson C.L. et al., 1970].
В условиях безопорности снижается участие постуральных мышц в локомоторных
движениях при одновременном увеличении доли участия мышц фазных; уменьшается
поперечная жесткость и максимальная произвольная сила; выражено снижается абсолютная
сила одиночных волокон в изометрическом сокращении, вызванном ионами кальция;
уменьшаются поперечные размеры мышечных волокон; выявляются процессы трансформации
миозинового фенотипа в быструю сторону [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С.,
2004; Templeton G.H. et al., 1984]. При исследовании суммарного содержания белков в тканях у
крыс при гипокинезии было обнаружено существенное его уменьшение в мышцах бедра и
голени задних конечностей [Гаевская М.С., След Л.М., Илюшко Н.Д., 1970].
В данном эксперименте было выявлено 22 белка, участвующих в функциях костномышечной системы. Эти белки принимают участие в 452 процессах, которые объединены в 16
групп (табл. 29).
Таблица 29. Группы процессов, связанных с костно-мышечной системой.
Группы процессов
Передача и регуляция сигнала
Регуляция на организменном уровне
Участие в воспалении
Регуляция ферментативной активности
Регуляция внеклеточного матрикса
Развитие и рост органов и тканей
Ответ на стимул
Метаболизм
Клеточная подвижность
Клеточная адгезия и межклеточные
взаимодействия
Иммунная система
Гемостаз
Внутриклеточные процессы
Сигнальные пути
Биосинтез
Число
процессов в группе
10
41
19
16
5
60
42
60
16
30
11
16
94
24
8
452
Наибольшее количество процессов связано с внутриклеточными процессами (94),
метаболизмом (60), развитием и ростом органов и тканей (60).
166
Далее был проведен анализ и динамика данных белков в процессе эксперимента (табл.
30).
Таблица 30. Динамика костно-мышечных белков.
Название белка
простат - специфический антиген
витронектин
кадгерин-1
тетранектин
миелоидный клеточно-cпецифический
богатый лейцином гликопротеин
антиген
остеопонтин
макрофагальный колониестимулирующий
фактор 1
несекреторная рибонуклеаза
муцин-1
проэпидермальный фактор роста
фруктозо-1,6-бисфосфатаза
мультимерин-1
активатор плазминогена урокиназного типа
кадерин-2
индуцируемый пролактином белок
хондроитин-4-сульфат протеогликан
цистатин-C
дипептидаза 1
бета-2 микроглобулин
белок S100-A8 (кальгранулин А)
альфа-1 цепи коллагена
относительные сутки эксперимента
-7
5
16 21 +1 +3 +6
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Примечание: «-» - данный белок не выявляется в пробе; «+» - данный белок выявляется в пробе
Из данной группы костно-мышечных белков, выделены 12 постоянно присутствующих
протяжении всего эксперимента. К ним относятся: 1) простат - специфический антиген помимо ферментативной функции разжижения эякулята [Сивков А.В., Черепанова Е.В.,
Шадеркина В.А., 2013], участвует в регулировании роста костей через NO [Jacox L. et al., 2014];
2) витронектин, который взаимодействует с гликозаминогликанами, коллагеном, отвечает с
фибронектином за адгезию остеобластов и их предшественников [Мастыков А.Н., Дейкало
В.П., Болобошко К.Б., 2012]; 3) кадгерин-1, - регулирует клеточную дифференцировку, является
рецептором в Ca-зависимой межклеточной адгезии, принимает участие в поддержании
нормальной формы клетки, приводя к ремоделированию цитоскелета, увеличению инвазивной
167
способности клеток [Сучков С.В. с соавт., 2013]; 4) тетранектин - протеин межклеточного
матрикса [Жерносеков Д.Д., Юсова Е.И., Гриненко Т.В., 2012], принадлежащий к семейству
лектинов С-типа, вовлеченный в фибринолиз, ремоделирование костной ткани, имеет Са2+
зависимую активность [Мартусевич А.К., Симонова Ж.Г., Камакин Н.Ф., 2011]; 5) миелоидный
клеточно-специфический богатый лейцином гликопротеин - мембранный гликопротеин,
который экспрессируется в моноцитах и макрофагах [Черношей Д.А., Кирильчик Е.Ю.,
Канашкова Т. А., 2010; Kelley S.L., Lukk T., Nair S.K., Tapping R.I., 2013]; 6) CD44 антиген рецептор гиалуроновой кислоты, через связь с которой опосредуются как межклеточные
взаимодействия, так и взаимодействия клеток с межклеточным матриксом [Dougherty G.J.,
Landorp P.M., Cooper D.L., Humphries R.K., 1991], обладает высоким сродством к другим
лигандам, таким как остеопонтин, коллагены различного типа, металлопротеиназы, участвует в
ремоделировании костной ткани [Гершович П.М., 2010; Ларина И.М. с соавт., 2013;
Пастушкова Л.Х. с соавт., 2013]; 7) остеопонтин - синтезируется в костной ткани, связывается с
гидроксиапатитами, формирует интегральную часть минерализованного матрикса [Волков
Н.М., 2011; Konno S. et al., 2011]; 8) макрофагальный колониестимулирующий фактор 1,
принимает участие в созревании, дифференцировке и активности остеокластов [Wei S. et al.,
2010]; 9) несекреторная рибонуклеаза обладает цитотоксическими свойствами, избирательным
хемотаксисом для дендритных клеток [Teufel D.P., Kao R.Y., Acharya K.R., Shapiro R., 2003]; 10)
муцин-1-трансмембранный
белок,
эспрессируется
многими
эпителиальными
клетками
[Кособокова Е.Н., Косоруков В.С., Барышников А.Ю., 2013]; 11) эпидермальный фактор роста
стимулирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток, включая фибробласты и
увеличение высвобождения кальция из костной ткани, способствует резорбции кости [Гапеенко
Е.В., Державец Л.А., 2011]; 12) фруктозо-1,6-бисфосфатаза играет важную роль в
регулировании зондирования глюкозы и инсулина, секреции панкреатических клеток
[Gawarammana I. et al., 2010]. Мультимерин-1 аннотированный выше исчезает только на 16
сутки эксперимента.
На 3 сутки эксперимента вновь появляются 3 белка - активатор плазминогена
урокиназного типа, кадерин-2 и индуцируемый пролактином белок.
Активатор плазминогена урокиназного типа принимает участие в стимулировании,
миграции эндотелиальных, гладкомышечных, эпителиальных клеток и моноцитов, является
ключевым регулятором ремоделирования в стенке сосудов после механического повреждения
[Ткачук В.А., Плеханова О.С., Белоглазова И.Б., Парфенова Е.В., 2013; Франциянц Е.М. с
соавт., 2014]. Кадерин-2 - кадгерины I и II группы, представляют собой гликопротеиды,
участвующие в Са2+ - зависимой межклеточной гомофильной адгезии, взаимодействуют с
актиновым цитоскелетом, а также участвуют во внутриклеточной сигнализации [Foty R.A.,
168
Steinberg M.S., 2004]. Индуцируемый пролактином белок связывается со многими белками,
включая фибриноген, актин, кератин, миозин, тропомиозин, действует как ингибитор апоптоза
Т клеток [Naderi A., Vanneste M., 2014].
Кадгенин-2 и индуцируемый пролактином белок выявляются на 5 сутки эксперимента и
исчезают на 16, вновь эксперссируются на 21 сутки эксперимента. Таким образом, эти белки
выявляются в острый период, при адаптации к АНОГу, и в день окончания воздействия. Еще
три белка выявляются на пятые сутки эксперимента и имеют различную динамикухондроитин-4-сульфат протеогликан, цистатин С и дипептидаза 1. Хондроитин-4-сульфат
протеогликан, появляясь на 5 сутки эксперимента, остается до конца исследования. Данный
белок экспрессируется в хондроцитах, эндотелиальных гладкомышечных клетках [Campoli M.
et al., 2004]. Он стимулирует эндотелиальные клетки к росту сосудов [Chekenya M., Pilkington
G.J.,
2002],
формирует
совместно
с
многочисленными
полисахаридными
цепями
гликозаминогликанов внеклеточный матрикс [Климанцев И.В. с соавт., 2009]. Цистатин С
аннотирован ранее, в данной главе. Он так же вовлечен в деградацию костной ткани [Brand H.S.
et al., 2004]. Данный белок появляется в эксперименте и на первые сутки периода
восстановления.
Дипептидаза 1- мембранный гликопротеин расщепляет дипептиды до аминокислот,
действует на пептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно как свободная
аминная, так и свободная карбоксильная группы. Гидролизует широкий спектр дипептидов,
участвует в системе глутатиона, может играть важную роль в регуляции активности
лейкотриена [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009]. Выявляется во время эксперимента,
на 3 и 6 сутки восстановительного периода.
На
16
сутки
эксперимента
обнаруживается
бета-2
микроглобулин
-
это
низкомолекулярный белок является частью легкой цепи мембраносвязанных HLA-антигенов. В
конечной моче присутствует лишь 0,1% от общей концентрации в организме, экскреция бета-2
микроглобулина с мочой не зависит от диуреза. У здоровых людей экскреция его с мочой
составляет не более 250 мкг/л, определение повышенных количеств будет свидетельствовать о
вовлечении канальцев в патологический процесс [Алексеев А.В. с соавт., 2014; Leney A.C.,
2014]. На 6 сутки периода восстановления в белковой композиции он не обнаруживается.
На первые и шестые сутки после эксперимента в моче обнаруживается белок S100-A8, а
только на первые - коллаген I типа альфа I.
Белок S100-A8 известный также как кальгранулин А, появляется только на первые и
шестые сутки после эксперимента. Является внутриклеточным кальций связывающим белком,
который
продуцируется
нейтрофилами
и
моноцитами
[Знаменская
Л.Ф.,
2011].
Активированные нейтрофилы и моноциты вырабатывают большое количество кальций
169
связывающих белков S100 A8, S100 A9 (или MRP14) и S100 A12, образуют комплекс, который
может служить в качестве эндогенного антагониста TLR и активировать сигнальные пути TLR
[Баранов А.А. с соавт., 2013]. Белки S100 принимают участие в регуляции процессов обмена
Са2+,
фосфорилирования,
дифференцировки
метастазирования
организации
клеток,
[Муравьев
регенерации,
Ю.В.,
цитоскелета,
секреции,
Лебедева
транскрипции
а
В.В.,
также
2012].
На
ДНК,
роста
и
опухолевого
роста
и
клеточных
культурах
эпителиальных тканей продемонстрировано ингибирующее влияние некоторых представителей
белков S100 (S100 A8/A9) на казеинкиназу II, фосфорилирующую многие ключевые клеточные
белки, в том числе и белки-регуляторы клеточного цикла [Полетаев А.Б., 2007].
Коллаген I типа альфа I, входит в состав костей, сухожилий, связок, кожи и других
соединительных тканей [Wenstrup R.J. et al., 2004]. В работе Мякоткина с соавт., выявлены
ассоциации остеопороза взрослых с полиморфизмами генов альфа 1 цепи коллагена 1 типа
(COL1A1), рецепторов кальцитонина (CTR), витамина D (VDR) и эстрогенов (ER),
паратиреоидного гормона (PTH), интерлейкина 6 (IL 6), трансформирующего фактора роста
(TGFB1) [Мякоткин В.А. с соавт., 2008; Крылов М.Ю., Беневоленская Л.И., Мякоткин В.А.
2010]. Поскольку коллаген I типа является основным белком, составляющим костную ткань,
полиморфизм COL1A1 и COL1A2 генов рассматривается одним из определяющих плотность
костной ткани [Stewart T.L. et al., 2006].
Таким образом, в начальном периоде эксперимента, наблюдаются процессы адаптации к
АНОГу, выражающиеся в активации процессов, играющих роль в мужской фертильности,
свертывании крови, протеолизе, фибринолизе, регуляции адгезии, гомеостазе. В процессе
эксперимента, активируются процессы, связанные с протеолизом, обменом олигосахаридов. На
первые сутки восстановительного периода (ВП) активизируются процессы, связанные с
метаболизмом коллагена, обеспечиваюшие прочность костной ткани, внеклеточного матрикса,
имеющий значение для формирования эластичных тканей. На 3 сутки ВП активизируется
система комплемента. На 6 сутки ВП активизируются процессы, которые обеспечивают
взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом для поддержания ее целостности,
происходят процессы восстановления в местах адгезивных межклеточных контактов,
актиновым цитоскелетом, регуляция процесса сперматогенеза.
Среди
9
сверхпредставленных
тканей
(плазма,
печень,
желчь,
моча,
слюна,
поджелудочная железа, лимфоциты, мочевой пузырь) встречающихся в эксперименте,
специфическими являются на 5 сутках эксперимента семенные пузырьки, на 21, +1 и +6 сутках
восстановительного периода - почки.
Определены 18 белков, участвующие в процессе «regulation of body fluid level», выделены
7 постоянных: альфа-1-антитрипсин, кининоген-1, эпидермальный фактор роста, альбумин,
170
ингибитор протеаз плазмы C1, лизосом-ассоциированный мембранный гликопротеин- 2, CD44
антиген не изменяется в течение эксперимента, а так же динамика и функции вариабельных
протеинов: витамин К-зависимый белок, мультимерин-1, витамин К-зависимый белок Z,
кластерин, тромбоцитарный гликопротеин VI, эндотелиальный рецептор протеина С,
просапозин, альфа цепь фибриногена, антитромбин 3, серотрансферин, фибронектин. К 6
суткам восстановительного периода белковая композиция процесса «regulation of body fluid
level» возвращается к фоновым значениям.
Выявлено 9 белков, принимающих участие в работе почек. При сравнении белковой
композиции мочи 21 суточной АНОГ с таковой после длительных космических полетов было
показано, что, в моче добровольцев не обнаруживаются аквапорин-2 и афамин, что, возможно,
связано с более длительными и значимыми воздействиями на организм космических полетов.
От количества аквапорина-2 зависит повторное всасывание воды почками и, как следствие,
количество выделяемой мочи, а так же, вероятно, выделяемого с мочой кальция, а афамин
играет важную роль в защите от окислительного стресса, являясь антиоксидантом и
антиапоптотическим белком.
Была определена динамика 13 белков, принимающих участие в работе сердечнососудистой системы. Тиоредоксин, как белок сердечно-сосудистой системы, так и стрессиндуцируемый белок, защищает клетки от различных видов повреждений, появляется в моче
добровольцев на 16 сутки эксперимента и исчезает к 3 суткам восстановительного периода. В
моче космонавтов этот белок появляется только на +1сутки восстановительного периода.
Возможно, он появляется в моче космонавтов ранее, однако, нет возможности исследовать
белковую композицию мочи во время космического полета.
Была определена динамика 22 белков, принимающих участие в работе костно-мышечной
системы. Постоянными из них являются простат - специфический антиген, витронектин,
кадгерин, тетранектин, миелоидный клеточно-специфический богатый лейцином гликопротеин,
CD44 антиген, остеопонтин, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1, несекреторная
рибонуклеаза, муцин-1, эпидермальный фактор роста, фруктозо-1,6-бисфосфатаза. Белок S100A8 известный также как кальгранулин А, появляется только на первые и шестые сутки после
эксперимента, является специфическим белком первых суток восстановительного периода.
3.5. Изучение взаимосвязи между состоянием сердечно-сосудистой системы,
водно-солевого обмена и протеомом крови и мочи в эксперименте
с 5-суточной «сухой» иммерсией
Более срочная реакция перераспределения жидкостных сред тела человека, чем в АНОГ,
наблюдается в «сухой» иммерсии [Буравкова Л.Б., Ларина И.М., Попова И.А., 2003; Ларина
И.М. с соавт., 2008]. Считают, что иммерсия является моделью, воспроизводящей этот эффект с
171
высокой степенью соответствия данных изменений таковым в космическом полете. Условия
иммерсии индуцируют заметное ухудшение функций сердечно-сосудистой системы, вызывая
тахикардию покоя и уменьшение ударного объема, а также другие изменения [Иванов Г.Г. с
соавт., 2011; Bart V. et al., 2007].
Обследование 14 здоровых добровольцев, принявших участие в эксперименте по
воздействию условий «сухой» иммерсии, выполнялось с целью изучения адаптационных
механизмов сохранения гомеостаза и для оценки функционального состояния сердечнососудистой системы, водно-электролитного обмена при изучении протеомной композиции
крови и мочи. Работы проводились совместно с лабораторией вегетативной регуляции кардиореспираторной системы, возглавляемой профессором Баевским Р.М. и лабораторией
нейрососудистой биологии, Университета города Анже, Франция, под руководством МаркаАнтуана Кусто.
Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в
воду, в положении лежа, до уровня верхней трети плеча (t воды = 33-34°C), но не соприкасались
с ней, будучи отделенными, от воды водонепроницаемой свободно плавающей тканью.
Образцы крови и мочи от участников испытаний были получены согласно протоколам
экспериментов.
Ранее был проведен 7-суточный эксперимент, моделирующий условия безопорности, с
участием 5 здоровых мужчин-добровольцев (в возрасте 22,9±0,5 года, М±m), которые не
подвергались никаким дополнительным воздействиям. Была выявлена быстрая потеря
жидкости и натрия, а также потеря веса тела, которая была обусловлена снижением уровня
гидратированности организма. Наиболее выраженные изменения наблюдались в первый день
воздействия иммерсии,
в последующие
дни
устанавливался
новый
уровень
водно-
электролитного обмена. Уменьшение осмоляльности мочи отражало повышенную экскрецию
воды, но не электролитов [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Некоторое увеличение креатинина в
плазме, скорее всего, было связано с изменениями белкового обмена мышечной ткани при
гиподинамии и снижении мышечного тонуса. Выраженная тахикардия при ортостазе, а также
обнаруженные изменения электрофизиологических характеристик миокарда и гиповолемия во
время СИ, поддержали гипотезу увеличения нагрузки на сердце в период восстановления на
фоне детренированности [Ларина И.М. с соавт., 2011; Navasiolava N.M. et al., 2011]. Методом
двумерного электрофореза обедненной фракции плазмы крови, собранной в этом эксперименте,
с последующей масс-спектрометрией анализа пептидных фрагментов было выявлено
достоверное увеличение уровня аполипопротеинов А-I, A-IV и E в период реадаптации по
сравнению с фоном и 7-м днем пребывания в иммерсии. В то же время, происходило снижение
уровня α-, β-фибриногена, фактора С4В комплемента и сывороточного амилоида Р [Трифонова
172
О.П. с соавт., 2010]. Кроме того, при изучении протеомного профиля сыворотки крови
отмечалось достоверное снижение площади пика ангиотензина II на 7-ые сутки эксперимента
(m/z=1051 Да). Данные изменения указывают на сдвиги в работе ренин-ангиотензинальдостероновой системы, направленные на снижение объема циркулирующей в организме
жидкости [Pakharukova N. et al., 2011; Villanueva J. et al., 2006]. Ранее было установлено, что
«сухая» иммерсия вызывает ускоренное выведение жидкости, электролитов (натрия) и
снижение объема циркулирующей плазмы [Ларина И.М. с соавт., 2008; 2011].
Прямое протеомное профилирование сыворотки крови показало, что на 7-ые сутки
«сухой» иммерсии площади пиков фрагмента высокомолекулярного кининогена (m/z=2133 Да)
и фрагмента комплемента С3 (m/z=1350; 1449 Да) достоверно уменьшились по сравнению с
фоном. Площади пиков аполипопротеина СIII (m/z=9133; 9419 Да) и фрагмента комплемента
C4a (m/z=3206 Да) были повышены на 7-ые сутки иммерсии. К 7-ым суткам периода
реадаптации площади всех изменившихся пиков не возвращались к фоновым значениям, что
свидетельствует о неполном восстановлении белковой композиции крови [Pakharukova N. et al.,
2011]. Глубина всех изменений имела значительные индивидуальные различия. Таким образом,
обнаруженные изменения протеомного профиля сыворотки крови указывают на перестройку
гормональной и иммунной систем, а также метаболизма липидов.
Исследования в 5-суточной СИ преследовали цель подтверждения результатов,
полученных в ходе 7-суточной «сухой» иммерсии, а так же получение дополнительной
информации об адаптационных механизмах сохранения гомеостаза с помощью протеомных
методов, как в крови, так и в моче, на уровне белков, выполняющих функции в ССС, тканей
почек и мочевыводящей системы.
В эксперименте с 5-ти суточной «сухой» иммерсией принимало участие 14 здоровых
некурящих мужчин (возраст 25 ± 1 год, рост 174 ± 1 см, вес 67.9 ± 1.5 кг; M ± m). Испытуемые
проходили пассивный ортостатический тест до СИ и в периоде восстановления после ее
завершения. Все участники были разделены на 2 группы по 7 человек. У первой группы
ортостатический тест был в день подъема из иммерсионной ванны, у второй - на следующий
день. Давление крови и частота сердечных сокращений (ЧСС) (с использованием
сфигмоманометра) определялись ежедневно в 8 утра. Начало и конец иммерсии приходилось10
утра, поэтому утренние измерения в первый день проводились до иммерсии, во время
иммерсии, после окончания воздействия.
3.5.1. Исследования водно-электролитного обмена в 5-суточной СИ
За первые 24 часа иммерсии объем плазмы уменьшился на 17-18% и сохранялся на низком
уровне до конца иммерсии. Расчет объем циркулирующей плазмы (ОЦП) по концентрации
173
общего белка плазмы также обнаружил снижение объема плазмы во время иммерсии, но менее
выраженное, примерно на 7-8%. На второй день восстановления объем плазмы, подсчитанный
тремя методами, не отличался от фоновых значений (рис. 5).
Рисунок 5.
Изменения объема плазмы в процентах от объема плазмы фона,
вычисленные через гемоглобин и гематокрит (Hb и Hct), только через
гематокрит (Hct) и белки плазмы. Ф - фон; ИМ – «сухая иммерсия»;
В - восстановление. Представлены средние значения ± стандартная ошибка;
* p<0.05 по сравнению с фоном.
Потребление воды варьировало в течение эксперимента незначительно. Диурез
увеличился примерно на 90% на 1 день, и оставался на этом уровне в течение иммерсии.
Частичный водный баланс на 1 день становился отрицательным, и оставался таковым в течение
всей иммерсии. На первый день восстановления наблюдалось компенсаторное уменьшение
диуреза
и
увеличение
водного
баланса
(табл.
31).
174
Таблица 31. Потребление воды, диурез, частичный водный баланс и биохимия мочи до, во время и после 5 суточной СИ.
Показатели
Ф-3
Ф-2
Ф-1
ИМ1
ИМ2
ИМ 3
ИМ 4
ИМ 5
В-0
В+1
В+2
Потребление
жидкости,л/сут
1.91±0.17
1.54±0.19
1.50±0.19
1.50±0.12
1.47±0.16
2.0±0.22
1.86±0.2
2.14±0.24
1.95±0.17
1.64±0.19
1.34±0.16
Диурез, л/сут
1.37±0.22
1.13±0.1
1.23±0.15 2.31±0.21* 1.94±0.19* 2.24±0.34* 1.99±0.2* 2.26±0.31* 0.91±0.11*
1.06±0.1
1.23±0.13
Частичный водный баланс
организма, мл/сут
770±210
420±190
320±110
780±170*
520±110*
230±180*
210±150*
590±160
200±85
Экскреция калия,ммоль/сут
35±6
35±5
39±6
40±2
41±4
45±6
47±5
55±6
38±4
42±3
51±4
Экскреция
натрия,ммоль/сут
132±12
120±15
123±21
211±17*
163±17*
131±13
137±15
157±14
46±4*
70±8
113±19
Соотношение Na+/K+ в моче
3.8±0.4
3.8±0.4
3.4±0.6
5.6±0.7*
4.0±0.3
3.2±0.3
3.0±0.2
3.0±0.2
1.5±0.2*
1.8±0.3*
2.1±0.3
132±13
108±13
121±21
181±13*
160±18*
128±12
130±15
147±14
54±4*
61±7*
111±17
9.1±1.2
8.7±1.0
8.9±1.4
9.1±0.6
9.3±1.0
9.5±1.2
8.5±0.8
10.8±1.2
7.4±0.7
7.8±0.6
8.2±0.9
209±25
208±29
203±30
231±20
205±23
231±24
223±18
275±21
171±20
210±13
252±30
496±56
497±42
487±56
360±27
375±22
348±40*
377±40
386±52
534±43
502±59
537±29
Экскреция хлоридов,
ммоль/сут
Экскреция креатинина,
ммоль/сут
Экскреция мочевины,
ммоль/сут
Экскреция осмотически
активных веществ, мОсм/кг
230±160* 1030±180*
Примечание: Ф- фон; ИМ – «сухая иммерсия»; В - период восстановления после СИ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против В-1.
175
Потеря натрия с мочой возросла в начале СИ (с двукратным увеличением на 1
сутки), затем уменьшилась в период восстановления (с 3-кратным уменьшением на
первый день окончания), динамика экскреции хлора мочи была сходной. Экскреция калия
с мочой имела незначительные изменения, соотношение Na+/K+ в моче увеличилось
значительно только на 1 сутки. Окончание иммерсии сопровождалось уменьшением
соотношения Na+/K+. Осмоляльность мочи уменьшилась во время иммерсии со
значительным падением показателя на 3-и сутки, тенденция от p=0.07 до 0.09 на 1, 2 и 4
день, с незначительным различием в сравнении с восстановлением, мочевина и креатинин
мочи изменялись незначительно. Клиренс креатинина во время эксперимента не
изменялся. Клиренс осмотически свободной воды изменялся незначительно в течение
эксперимента, осмотически активных веществ во время иммерсии уменьшился.
Методом
распределения
измерения
жидкости
мультичастотного
по
компартментам.
импедансана
Динамика
получали
объемов
параметры
жидкостных
компартментов тела показана на рис. 6.
Рисунок 6.
Изменения жидких компартментов. Им – «сухая иммерсия»;
В - восстановление. Представлены средние значения ± стандартная
ошибка; * p<0.05 против фона.
Внеклеточная жидкость уменьшилась в начале иммерсии на 5.1 ± 1.3%, с
максимальным падением показателя на 7.8 ± 1.4% к 3-им суткам. В абсолютных
значениях объем внеклеточной жидкости уменьшился на 3 день на 1.4±0.3 л. Общая вода
организма также уменьшилась примерно на 1.6 л на 3-и сутки и оставалась на этом уровне
176
на 5 сутки эксперимента. В период восстановления уже через 7 часов после окончания
СИ, показатели объемов внеклеточной жидкости и общей воды тела не отличались
значительно от уровня фона. Внутриклеточная жидкость показала незначительные
вариации в ходе эксперимента и уменьшилась примерно на 3% на В+1 день. Уровень в
крови Na+, K+, Cl-, Ca2+ белков, мочевины, креатинина и осмоляльность оставались в
пределах нормы. СИ сопровождалась значительным увеличением содержания K+, Ca2+ и
белков крови. Мочевина крови слегка уменьшилась в начале СИ, и немного увеличилась
через 24 часа после её окончания (табл. 32).
Таблица 32. Биохимия крови до, во время и после сухой иммерсии
Na+, ммоль/л
K+, ммоль/л
Cl-, ммоль/л
Ca2+, ммоль/л
Белки, г/л
Мочевина,
ммоль/л
Креатинин,
ммоль/л
Осмолярность,
мосм/кг
Ф-1
136±2
3.6±0.1
103±2
2.14±0.05
65±2
4.5±0.3
ИМ2
ИМ3
ИМ5
138±2
139±3
137±2
4.0±0.1*
4.1±0.1*
4.0±0.1*
104±1
105±2
102±1
2.22±0.04* 2.23±0.05* 2.27±0.05*
70±2*
70±2*
72±2*
3.6±0.2*
4.1±0.2
4.5±0.3
В+1
135±2
3.7±0.1
102±1
2.18±0.04
67±2
5.4±0.3*
В+3
136±2
3.7±0.1
103±2
2.08±0.05
64±2
5.2±0.4
74±2
72±2
75±3
76±2
77±3
72±2
288±7
283±3
283±4
290±4
284±3
284±6
Примечание: Ф - фон; ИМ- «сухая иммерсия»; В - восстановление; представлены средние значения ±
стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.
Таким образом, весь комплекс выполненных исследований позволил достаточно
полно охарактеризовать гидротационный статус организма и водно-электролитный
гомеостаз. Так, импедансометрические исследования показали достоверное снижение
общей жидкости организма на 3-й день пребывания в иммерсионной ванне по сравнению
с фоном (на 3,8±1,0 %, p=0.012), что в абсолютных цифрах составляет около 1,6 л.
Содержание внеклеточной жидкости также снижалось, начиная с первых суток, причем
максимальное снижение (в среднем по группе на 7,8±1,4%) наблюдалось на 3-и сутки
эксперимента. В восстановительном периоде (0-е и 1-е сутки) наблюдалась явная
тенденция к сокращению потерь, как общей жидкости тела, так и внеклеточного её
сектора по сравнению с периодом «сухой» иммерсии. ОЦП, который измерялся по
динамике гемоглобина и гематокрита, достоверно снижался в среднем на 17,8±2,7% через
24 часа после погружения в иммерсионную ванну (p<0,001) и оставался сниженным до
конца пребывания в иммерсии. На 2-е сутки восстановления объем плазмы не отличался
от исходного. Колебания объема внутриклеточной жидкости в период иммерсии и
177
восстановления были в пределах 2-3% и достоверно не отличались от фона, что
свидетельствует о том, что изменения гидратационного статуса во время «сухой»
иммерсии не затрагивают тканевой метаболизм. Следовательно, снижение содержания
общей жидкости организма происходило, главным образом, за счет потери внеклеточной
жидкости. Тощая масса тела за 4 суток иммерсионного воздействия незначительно
уменьшилась у всех испытателей, а количество жира, наоборот, превысило фоновый
уровень. При этом нормированное на массу тела количество общей жидкости организма
снижалось на 4-е сутки эксперимента.
Следовательно,
при
«сухой»
иммерсии
происходило
увеличение
жировой
составляющей массы тела, а поскольку жировая ткань практически не содержит
жидкости, то увеличение жира создавало впечатление большей потери жидкости и тощей
массы тела. Таким образом, можно заключить, что по данным импедансометрии масса
тела испытателей практически не изменялась на 4-е сутки эксперимента на фоне
снижения уровня гидратации организма [Coupé M. et al., 2013].
3.5.2. Исследование сердечно-сосудистой системы в 5-суточной СИ
ЧСС и давление крови в состоянии покоя до СИ оставались в пределах нормы. ЧСС
немного уменьшилось в начале СИ, а систолическое давление крови было несколько ниже
в конце эксперимента (табл. 33).
Таблица 33. Утреннее кровяное давление и ЧСС до, во время и после сухой иммерсии.
SBP,
mmHg
DBP,
mmHg
ЧСС,
bpm
Ф-2
Ф-1
ИМ1 ИМ2 ИМ3 ИМ4
ИМ5
В0
В+1
В+2
124±3 123±3 121±3 116±2 121±2 123±3 113±2* 121±3 123±2 118±2
72±2
69±2
71±2
68±1
73±2
68±2
70±2
71±1
68±2
64±2
64±4
65±4
67±4
57±2* 56±3* 61±3
58±2
57±2
69±3
71±2
Примечание: Ф- фон; ИМ- сухая иммерсия; В- восстановление; SBP- систолическое давление крови; DBPдиастолическое давление крови; ЧСС- частота сердечных сокращений; представлены средние значения ±
стандартная ошибка; * p<0.05 против Ф-1.
Изучение параметров гормональной регуляции показало, что активность ренина
плазмы, через 24 часа после начала СИ уменьшилась вдвое, а концентрация BNP в плазме
- увеличилась в четыре раза, альдостерон плазмы не изменялся. Через 24 часа после
окончания СИ наблюдали двукратное увеличение активности ренина и трехкратное -
178
содержания альдостерона. На четвертый день восстановления активность ренина и
уровень альдостерона не изменялись, а BNP значительно увеличилось (Рисунок 7).
Рисунок 7.
Альдостерон крови, ренин и BNP до, во время и после иммерсии. Ф фон; ИМ – «сухая иммерсия»; В - восстановление. Представлены
средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против фона.
До СИ только 1 испытуемый из 14 не завершил 20-минутный стандартый тест. После
СИ (на R0 день), 4 из 7 испытуемых не смогли его завершить. Однако, испытатели (7
человек), у которых ортопроба была на следующий день (R+1) выполнили тест
полностью. Измерения в день ортопробы после иммерсии по сравнению с фоном до
эксперимента, проводившиеся в положении лежа на спине, показали значительное
увеличение ЧСС и SBP, и тенденцию к увеличению DBP (р=0.058), общее периферическое
сопротивление (TPR) (p=0.06) и сосудистое сопротивление кожи (SVR) (более, чем 2кратное увеличение, р=0.063). Ударный объем (SV) уменьшился, а СО (сердечный
выброс) оставалось неизменным. Измерения, проводившиеся в положении стоя, показали
увеличение ЧСС и DBP и уменьшение SV после иммерсии, в то время как SBP, TPR, SVR
и CО не изменялись. На В+1 день все гемодинамические значения не показали различия
от уровня до иммерсии как в положении лежа на спине, так и в положении стоя. SVR в
положении стоя было значительно выше, чем в положении лежа при всех измерениях,
кроме измерений на R0 день (рис. 8) [Coupé M. et al., 2013].
179
Рисунок 8.
ЧСС, ударный объем и общее периферическое сопротивление в
положении лежа на спине и в конце ортопробы до 5-суточной сухой
иммерсии, сразу после сухой иммерсии (группа R0) и через 24 часа
после окончания сухой иммерсии (группа R+1). * p<0.05 против фона.
В данном эксперименте сотрудниками лаборатории Р.М. Баевского впервые
изучались 24-х часовые изменения дисперсии микроколебаний электрокардиографии
(ЭКГ). Для анализа использовались данные Холтеровского (суточного) мониторирования,
из которых «нарезались» участки записи длительностью в 20-30 минут из каждого часа
суточной записи и анализировались их средние значения при усреднении за каждые 4 часа
мониторинга. Одновременно анализировалась частота ЧСС и амплитуда QRS-комплекса
ЭКГ. При этом рассчитывали индекс метаболической адаптации (индекс ЧСС макс /ИММ
макс).
Изменения ЭКГ сигнала при воздействии 5-суточной иммерсии отчетливо
проявлялись, начиная с 3-х суток эксперимента. Вначале регистрировался достоверный
рост амплитуды основных зубцов ЭКГ, особенно в ночной период (23-06 часов). При этом
в интервале 22-02 часа отмечалось достоверное увеличение индекса «Миокард». В
стандартном исполнении метода дисперсионного картирования анализ микроколебаний
ЭКГ, характеризующих электрофизиологические свойства миокарда, проводится в 30секундных отрезках с определением различных параметров [Иванов Г.Г., Сула А.С.,
2009]. Наибольшие изменения этого индекса отмечались на 5-е сутки эксперимента в
периоды 15-18 часов и с 22 часов до 10 часов утра. На 5-е сутки обращал на себя внимание
180
выраженный рост ЧСС с 22 часов до 02 часов ночи и в утренние часы (07-10 часов).
Однако, важно отметить, что изменения ЧСС в 1-е сутки эксперимента имели
противоположный характер – наблюдалось отчетливое урежение ЧСС. Таким образом,
выявлялась картина последовательного включения в реакцию на иммерсионное
воздействие вначале электрических, а затем энерго-метаболических процессов в
миокарде. Рост частоты пульса указывал на интегральный характер реакции сердечнососудистой системы. После эксперимента наблюдался выраженный рост частоты пульса в
течение суток (до 100-108 уд/мин), который сопровождался достоверным увеличением
амплитуды зубцов ЭКГ. Описанная картина изменений дает основание для обсуждения
гипотезы о преимущественно, энерго-метаболическом генезе наблюдаемых реакций (рис.
9) [Иванов Г.Г. с соавт., 2011].
среднесуточные значения амплитуды QRS- комплекса (ЭКГ)
среднесуточные значения нормализованного индекса «миокард» (м-н)
среднесуточные значения частоты пульса в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией.
Рисунок 9.
Среднесуточные значения амплитуды QRS- комплекса (ЭКГ),
нормализованного индекса «миокард» (м-н) и частоты пульса в
эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией.
Изучение функции автономной нервной системы показало, что экскреция
эпинефрина и норметанефрина с мочой не изменялись значительно в течение
181
эксперимента. Выведение метанефрина с мочой уменьшалось во время восстановления.
Экскреция норэпинефрина мочи обнаруживала тенденцию к увеличению во время первой
половины иммерсии (1 день, р=0.076; 2 день, р=0.072; 3 день, p<0.05). Выведение
дофамин также выявляло тенденцию к увеличению во время первой половины иммерсии
(1 день, р=0.08; 2 день, р=0.09) с тенденцией к уменьшению на R0 день (р=0.07) (Таблица
34).
Таблица 34. Катехоламины мочи до, во время и после сухой иммерсии.
Эпинефри
н,
µg/сут.
Норметан
ефрина,
µg/сут.
Метанефр
ин,
µmol/сут.
Норэпине
фрин,
µmol/сут.
Дофамин,
µg/сут.
Примечание:
Ф-3
Ф-2
Ф-1
ИМ1
ИМ2
ИМ3
ИМ4
ИМ5
В0
В+1
В+2
5.02
±0.75
6.34
±1.04
6.79
±0.95
6.46
±0.91
6.65
±1.09
7.33
±0.83
6.06
±0.65
7.37
±1.01
6.26
±0.93
5.34
±0.62
6.75
±0.9
25
±5
22
±2
24
±3
30
±4
27
±3
32
±3*
28
±4
29
±4
29
±4
28
±3
28
±4
0.44
±0.07
0.51
±0.05
0.53
±0.06
0.6
±0.06
0.59
±0.08
0.62
±0.05
0.5
±0.07
0.59
±0.07
0.41
±0.03*
0.4
±0.02*
0.56
±0.07
0.93
±0.24
0.85
±0.11
0.88
±0.14
1.04
±0.1
0.88
±0.1
0.98
±0.08
0.92
±0.12
0.97
±0.12
0.88
±0.13
0.94
±0.11
1.1
±0.13
250
±39
173
±18
221
±30
311
±32
247
±19
254
±31
236
±32
229
±31
174
±27
180
±30
223
±41
Ф – фон; ИМ- «сухая иммерсия; В- восстановление;
представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против В-1.
Значительных различий в вариабельности спектре симпатического индекса и
чувствительности спонтанного барорефлекса до и после иммерсии (на R0 и R+1 день) не
выявлялось (рис. 10).
Рисунок 10. Симпатический индекс (LF/HF) и чувствительность спонтанного
барорефлекса (SBRs) в положении лежа и в конце 70° ортопробы
до, сразу после (группа R0) и через 24 часа после окончания 5суточной сухой иммерсии (группа R+1).
182
Оценка спонтанного барорефлекса в позиции стоя показала тенденцию к
уменьшению на R0 день, но не на R+1 день.
Вес тела во время СИ уменьшился примерно на 700-800 г. Это уменьшение было
значительным на 2 и 3 день, при этом 4 и 5 день тенденция к уменьшению сохранялась
(р=0.06). Во время восстановления не было каких-либо значительных изменений веса
тела. Все исследуемые значения параметров крови, имеющие отношение к метаболизму,
были в пределах нормы. Уровни инсулина, оценка инсулинрезистентности (HOMA-IR),
содержание лептина и фракции LDL- и HDL-холестерола увеличились во время СИ. На
второй день восстановления эти значения не отличались от фоновых. Уровни глюкозы и
триглицердов натощак изменились незначительно во время СИ (табл. 35).
Таблица 35. Метаболические показатели крови до, во время и после сухой иммерсии.
Ф-1
ИМ 2
ИМ 3
ИМ 5
В+1
В+3
C-реактивный
белок, mg/l
0.35±0.08
0.43±0.12
0.52±0.14
0.4±0.09
0.47±0.09 0.72±0.22
Уровень глюкозы,
mmol/l
4.97±0.11
4.96±0.08
4.99±0.08
4.82±0.08
4.86±0.11 4.66±0.09
Уровень инсулина,
µU/ml
5.73±0.54 7.24±0.49*
7.19±0.44
8.2±0.63*
6.16±0.61 5.31±0.79
Оценка инсулинрезистентности
1.27±0.13 1.59±0.11*
1.59±0.09
1.76±0.15* 1.35±0.16 1.11±0.17
Лептин, ng/ml
2.23±0.31 2.49±0.28* 2.73±0.38* 2.66±0.33 2.05±0.22 2.75±0.55
Общий
холестеринплазмы, 3.71±0.18 4.14±0.18* 4.31±0.23* 4.52±0.31* 3.61±0.2 3.53±0.17
mmol/l
HDL холестерол
высокой
плотности, mmol/l
1.23±0.08 1.32±0.08*
LDL холестерол
низкой плотности,
mmol/l
2.11±0.17 2.41±0.16* 2.59±0.21* 2.76±0.27* 2.04±0.16 2.03±0.14
Триглицериды,
mmol/l
0.81±0.11
Примечание:
0.86±0.12
1.28±0.07
0.96±0.06
1.32±0.1*
0.97±0.07
1.12±0.08 1.15±0.07
0.97±0.09 0.76±0.07
Ф - фон; ИМ – «сухая иммерсия»;
В- восстановление; представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против
фона.
183
Как следует из приведенных данных, свободный кортизол мочи немного
увеличился во время иммерсии (значительно на 2 день и 4 день) и не изменялся в период
восстановления (рис. 11).
Рисунок 11. Свободный кортизол мочи до, во время и после сухой иммерсии.
Представлены средние значения ± стандартная ошибка; * p<0.05 против
В-1.
Таким образом, результаты, полученные в эксперименте, показали, что в течение 5суток СИ общее содержание воды тела уменьшилось (на 3-4%), главным образом за счет
внеклеточного компартмента (уменьшение на 6-8%) и быстро стабилизируется на новом
уровне. Пять дней СИ было достаточно, чтобы метаболизм замедлился, уменьшилась
глюкозотолерантность и выявилась гиперхолестеролемия, без изменений вегетативной
нервной системы. СИ продолжительностью в 5 суток индуцировала заметное ухудшение
сердечно-сосудистой системы, изменяя ортостатическую устойчивость при подъеме из
иммерсионной среды, которая быстро компенсируется (через 24 часа после возвращения к
нормальным условиям). Осмоляльность внеклеточной жидкости остается стабильной в
течение СИ, свидетельствуя о том, что не происходит значительных изменений,
касающихся внутриклеточного объема. Главные изменения, происходящие в ответ на
сухую иммерсию, касаются внеклеточной жидкости, а именно внутрисосудистой и
тканевой жидкости. Фундаментальные работы по изучению регуляции жидкостей
организма во время краткосрочной водной иммерсии представлены в работе Gauer-Henry
и Epstein [Epstein M.J., Blatteis C.M., 1996]. Водно-электролитные изменения при
иммерсии вызваны застоем в центральных сосудах: гидростатическое давление снижает
объем сосудов периферии и сдвигает баланс Старлинга (Starling) в сторону уменьшения
184
абсорбции тканевой жидкости (гемодилюция), что приводит к центральной гиперволемии.
Через 24 часа после начала СИ все еще продолжалось воздействие системных регуляторов
(подтверждено 2-кратным уменьшением активности ренина плазмы и 4-кратным
увеличением BNP), но через 48 часов иммерсии основные процессы перераспределения
заканчиваются и концентрации гормонов возвращаются к доиммерсионному уровню и
остаются таковыми до конца СИ [Coupé M. et al., 2013]. Увеличение содержания BNP на
четвертый день восстановления может быть не связано непосредственно с регуляцией
жидкостных объемов тела и гемодинамикой, а скорее отражает увеличение нагрузки на
сердце после периода снижения физической активности во время СИ. Ранее похожее
увеличение содержания NT-proBNP, которое отражает содержание BNP, наблюдалось на
4 день восстановления после 7-суточной СИ [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Отсутствие
увеличения BNP в первые 24 часа периода восстановления может отражать
необходимость восполнить воду и компенсировать гиповолемию, что приоритетнее, чем
необходимость «разгрузки» нетренированного сердца. Уменьшение объема плазмы,
рассчитанное с помощью концентрации общего белка плазмы, составило как минимум 1/3
от значения, вычисленного на основе показателей Hct или Hb и Hct. Эту разницу можно
объяснить частичным переносом альбумина (который составляет примерно 60% от
общего пула белков) в тканевую жидкость. Во время иммерсии, когда имеет место
давление внешних слоев ткани и постоянная транскапиллярная «аутотрансфузия»
[Krasney J.A., Blatteis C.M.,1996], увеличивается потеря тканевой жидкости. Чтобы
ограничить дегидрацию ткани, альбумин плазмы, по-видимому, должен перейти в
тканевую жидкость и чтобы увеличить ее осмотическое давление. Частичный переход
белков из плазмы в тканевую жидкость предотвращает дальнейшее уменьшение объема
интерстиций, что ограничивает потерю жидкости и обеспечивает ее адекватное
перераспределение между внутри - и внесосудистыми секторами [Gogolev K.I.,
Aleksandrova E.A., Shul’zhenko E.B., 1980]. Белки плазмы могут накапливаться вне
сосудов, и, если необходимо, быстро возвращаться в сосуды, чтобы восстановить потерю
белков плазмы. Это было показано экспериментами с сухой иммерсией и АНОГ, в
которых пул белков плазмы был восполнен в период восстановления со скоростью,
превышающей скорость синтеза de novo [Chaĭka A.M., Balakhovskiĭ I.S., 1982]. Условия
СИ, с одной стороны, возможно, увеличивают симпатическую активность из-за
гиповолемии и стресса, а с другой стороны, уменьшают ее из-за физической
неактивности. Большинство работ по СИ говорит о том, что эти условия увеличивают
симпатическую активацию [Navasiolava N.M. et al., 2011]. Мы, однако, не наблюдали
выраженных изменений активности вегетативной нервной системы. Вариабельность ЧСС
185
оставалась неизменной, хотя чувствительность барорефлекса была несколько ослаблена.
Концентрации катехоламинов мочи и их метаболитов изменялись незначительно.
Пять суток СИ индуцировали заметное ухудшение функций сердечно-сосудистой
системы, вызвав тахикардию и уменьшение ударного объема в положении лежа и стоя.
Наблюдаемая тахикардия и увеличение TPR совместно с сужением сосудов кожи
помогают поддерживать давление крови в условиях уменьшенного объема крови. Более,
чем 2-кратное увеличение SVR в положении лежа без увеличения SVR в положении стоя
сразу после СИ может отражать напряжение систем, поддерживающих кровоток мозга.
Метаболические эффекты СИ главным образом связаны с вынужденной физической
неактивностью. СИ быстро ухудшает метаболизм глюкозы и липидный профиль, вызывая
уменьшение чувствительности к инсулину и дислипидемию. Такие же изменения
наблюдаются в экспериментах с постельным режимом. Важно заметить, что физическая
неактивность даже в течение короткого периода может ухудшить метаболизм
[Bergouignan A. et al., 2010; Blanc S. et al., 2010]. Увеличение свободного кортизола во
время СИ может быть связано как с увеличением диуреза, так и стрессом, вызванным
участием в эксперименте [Fenske M., 2006]. Ряд механизмов может участвовать в
детренированности сердца, при СИ: потеря объема циркулирующей крови [Convertino
V.A., 1996], ухудшение чувствительности барорефлекса [Convertino V.A., 2002],
дисфункция вегетативной нервной системы [Convertino V.A., 2002; Mano T., 2005],
уменьшение сократительной способности стенок сосудов [Convertino V.A., 1995],
вызванное уменьшением мышечного тонуса [Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман
Б.С., 2004], макрососудистая [Zhang L.F., 2001] и микрососудистая [Coupe M. et al., 2009]
дизрегуляция, вызванная физической неактивностью и продолжительным уменьшением
напряжения сдвига (share-stress) [de Groot P.C., Bleeker M.W., Hopman M.T., 2006],
ослабление миокарда, гормональные изменения, вестибулярные изменения или изменения
метаболизма [Ларина И.М., Суханов Ю.В., Лакота Н.Г., 1999; Ларина И.М. с соавт., 2008].
По-видимому, гиповолемия является главной причиной наблюдаемого быстрого
ухудшения функций сердечно - сосудистой системы при СИ. Важность гиповолемии
показана обратным взаимодействием между сокращением объема плазмы, вызванным
микрогравитацией, и ортостатической устойчивостью [Convertino V.A., 1996]. Coyle с
соавт. показали, что уменьшение SV, максимального потребления кислорода, увеличение
ЧСС и общего периферического сопротивления, в положении стоя, после двух недель
малоподвижного образа жизни (без тренировок) у мужчин, которые до этого интенсивно
тренировались в течение нескольких лет, главным образом было следствием падения
объема крови. При увеличении объема крови инфузией раствора декстрана спад работы
186
сердечно-сосудистой системы после нескольких недель без тренировок был минимальным
[Coyle E.F., Hemmert M.K., Coggan A.R.1986]. Интересно сравнить данную работу, в
которой объема плазмы был нормализован спонтанно, с работами, в которых объем
плазмы, был восстановлен по предписанию. Нормализация объема плазмы солью и водой
после 12-суточного АНОГ препятствовала ортостатической гипотензии и изменениям
гемодинамики и эндокринным изменениям в положении лежа, но не была эффективной в
предотвращении тахикардии и гиперчувствительности к эпинефрину в вертикальном
положении
тела
флюдрокортизоном
[Waters
W.W.
(синтетический
et
al.,
2005].
Восстановление
минералокортикоид) после
объема
7-суточной
плазмы
АНОГ
значительно ограничило ортостатическую неустойчивость (только 1 из 7 испытуемых
остался неустойчивым) и предотвратило изменения чувствительности барорефлекса
[Vernikos J., Convertino V.A., 1994]. Использование бедренных манжет в 7-суточном
АНОГ значительно (но не полностью) ограничило уменьшение объема плазмы и
барорефлекторную чувствительность, однако, не смогло предотвратить ортостатическую
неустойчивость [Custaud M.A., 2000].
3.5.3. Прямое профилирование сыворотки крови в 5-суточной СИ
При прямом профилировании образцов сыворотки крови, полученных в ходе
эксперимента, было детектировано 175 пиков в диапазоне масс от 1000 до 17 000 Да после
обработки магнитными частицами MB WCX. При этом были обнаружены достоверные
отличия по 48 пикам (что составило 27,4% от всех пиков протеомного профиля) в массспектрах, по сравнению с фоновым периодом. После идентификации белков была
проведена сравнительная оценка площадей их пиков на масс-спектрах, пропорциональная
содержанию белка в образце. В результате выявлялось достоверное увеличение пиков
фрагментов комплемента С3 (m/z=1779; 1449 Да) на 3-и и 5-е (m/z=1866,0) сутки
эксперимента (рис. 12).
187
Рисунок 12. Фрагмент комплемента С3. Представлены средние значения ±
стандартная ошибка; * p<0.05, на 5 сутки эксперимента.
Белок С3 является главным белком системы комплемента, он играет основную роль
в активации системы комплемента по классическому и альтернативному путям [Sahu A.,
Lambris J.D., 2001]. На 1-е сутки (рис. 13) восстановительного периода достоверно
увеличивались площади пиков белка С4а системы комплемента (m/z=1741,33; 3208,87
Да), что можно отнести к эффектам острофазной реакции.
Рисунок 13. Фрагмент комплемента С4. Представлены средние значения ±
стандартная ошибка; * p<0.05, на 1сутки.
Хорошо известно, что при повышении протеолитической активности плазмы
крови, белки системы комплемента могут подвергаться действию протеаз [Бельтюков
П.П., Галебская Л.В., Симкина Н.Б., 2003]. После завершения длительных космических
полетов были выявлены сдвиги в уровне белка С3 системы комплемента [Пахарукова Н.А.
с соавт., 2010]. У одного из космонавтов обнаружено снижение концентрации С3 и С4
факторов комплемента после 16-ти суточного КП [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю., 1979]. У
двух космонавтов было обнаружено увеличение и С3, и С4 фактора комплемента после
49-суточного полета [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю., 1980]. Отмечено увеличение С3
188
белка системы комплемента в условиях микрогравитации (28 суток) [Goncalves A. et al.,
2006].
На 2-е и 3-и сутки (рис. 14) иммерсии происходило достоверное увеличение пика с
m/z=1065, 96 Да.
Рисунок 14. Фрагмент брадикинина. Представлены средние значения ± стандартная
ошибка; * p<0.05, на 2 и 3сутки эксперимента.
Пик соответствует брадикинину - физиологически активному пептиду, состоящему
из 9 аминокислот, который образуется при действии калликреина на молекулупредшественник
–
кининоген.
Брадикинин
быстро
разрушается
на
неактивные
метаболиты (время полужизни данного пептида invivo составляет всего 17 секунд,
поэтому его концентрация в плазме крови и тканях изменяется в очень больших пределах
[Villanueva J. et al., 2006].
Высокомолекулярный кининоген (фактор XV или фактор Фитцджеральда)
относится к белкам системы гемостаза, участвует в активации фазы плазменного
протеолиза, контролирует адгезию и активность тромбоцитов; подавляет активность
цистеиновых протеиназ, препятствуя их деградирующему действию на плазменные белки
при повреждении различных тканей [Goncalves A. et al., 2006; Villanueva J. et al., 2006].
Модулирует
воспалительные
и
антитромботические
реакции,
создает
важную
регуляторную систему при взаимодействии плазменных белков с клетками крови и
сосудистой стенки, принимает участие в процессе свертывания крови [Яровая Г.А., 2001].
Во всех изученных пробах было обнаружено достоверное увеличение фрагмента
фибриногена (m/z = 2863,54Да) на 3-и и 5-е сутки эксперимента (рис. 15).
189
Рисунок 15. Фрагмент фибриногена. Представлены средние значения ± стандартная
ошибка; * p<0.05, на 5сутки эксперимента.
Полученные результаты могут быть объяснены либо активацией протеолиза, либо
значительным увеличением концентрации фибриногена. Некоторые авторы указывают на
увеличение содержания фибриногена в крови после космических экспедиций [Фомин
А.Н., 1981; Stein T.P., Leskiw M.J., 2000]. При острых воспалительных процессах в
организме, стрессе и изменении уровня физической активности [Козлов А.А. с соавт.,
2006]. Вероятно, что высокая степень эмоционального напряжения добровольцев на
заключительном этапе эксперимента могла также повлиять на содержание фибриногена в
крови [Пастушкова Л.Х. с соавт., 2011]. Кроме того, увеличение содержания данного
белка может быть связано с адаптивным снижением объема циркулирующей крови
[Фомин А.Н., 1981].
Достоверное увеличение на 5-ые сутки иммерсии и 3-и сутки восстановительного
периода тромбоцитарного фактора IV (m/z = 7765 Да) (рис. 16), являющегося важным
компонентом коагуляционного каскада, свидетельствует об увеличении активности
системы сосудисто-тромобоцитарного (или первичного) гемостаза в крови [Баркаган, З.С.,
Момот, А.П., 2008].
Рисунок 16. Фрагмент тромбоцитарного фактора. Представлены средние значения ±
стандартная ошибка; * p<0.05, на 5сутки эксперимента и 3 сутки
восстановительного периода.
190
На 7-е сутки восстановительного периода было отмечено достоверное отличие по
сравнению с фоном площади пика фрагмента высокомолекулярного кининогена
(m/z=2134,8 Да) (рис. 17).
Рисунок 17. Фрагмент кининогена. Представлены средние значения ± стандартная
ошибка; * p<0.05, на 7сутки восстановительного периода.
Таким образом, все вышеупомянутые белки относятся к белкам иммунной
системы, "острой фазы" и системы коагуляции, которые выявляются в сыворотке крови и
других биологических жидкостях и обладают различными физиологическими свойствами.
Общей характеристикой белков данной группы является их выраженная опсонизирующая,
антипротеолитическая и бактериостатическая активность, а также способность к
связыванию свободных радикалов, усилению коагуляции крови и активации системы
комплемента [Пахарукова Н.А., 2010; Пастушкова Л.Х. с соавт., 2011]. Возможно, что эти
белки являются наиболее пластичной частью протеома сыворотки крови, чьи изменения
наступают уже в период срочной адаптации. В работе Тигранян с соавт. показано, что
острый период адаптации после кратковременных полетов связан с активацией
протеолитических систем, главным образом с калликреин–кининовой системой (ККС),
которая играет важную роль в регуляции активности каскадных протеолитических систем
плазмы крови [Тигранян Р.А. с соавт., 1987].
3.5.4. Белки, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе
В результате прямого профилирования мочи в эксперименте было получено 213
пика в диапазоне масс от 1 000 Да до 10 000 Да, при этом 61 пик (или 28% из общего
числа пиков) изменялся, очевидно, представляя наиболее пластичную часть мочевого
протеома. Наибольшее количество изменений отмечено на 5-ые сутки эксперимента и
сразу после окончания воздействия. Следует отметить, что все отмеченные на данных
191
точках пики обладают разнонаправленными изменениями, характеризующимися как
увеличением, так и уменьшением площади пика. На 8-ой день выхода из эксперимента
отмечено наименьшее количество достоверно изменяющихся пиков, что можно связать с
восстановлением и возвращением белковой композиции к фоновым значениям
[Пастушкова Л.Х. с соавт., 2012].
После
хромато-масс-спектрометрического
анализа
всех
образцов
мочи
добровольцев было идентифицировано 256 различных белков (по номенклатуре
UniProtKB). Далее из общего числа выявленных белков с помощью системы ANDSystem
было выявлено 9 белков, участвующих в функциях сердечно-сосудистой системы (табл.
36).
Таблица 36. Белки мочи, выполняющие функции в сердечно-сосудистой системе
во время сухой иммерсии (%).
Наименование белков
Сывороточный альбумин
Фетуин А
Цистатин-С
Е-Кадхерин
Витамин D-связывающий
белок
Перлекан
Калликреин-1
Кининоген-1
Эпидермальный фактор
роста
Примечание:
ММ,
кДа
Ф-8
(n=14)
относительные сутки
иммерсии
В3
(n=14
)
69,36
39,32
15,79
97,45
100%
14,3%
14,3%
37,5%
ИМ 2
(n=8)
100%
0%
0%
25%
ИМ 4
(n=8)
100%
12,5%
12,5%
25%
ИМ 5
(n=6)
100%
16,6%
16,6%
50%
94%
11,7%
11,7%
28,5%
52,96
0%
0%
0%
16,6%
11,7%
468,83
28,89
71,95
62,5%5
42,9%
93%
37,5%
12,5%
100%
50%
50%
75%
28,5%
100%
83%
44,4%
76,5%
94%
133,99
87,5%
87,5%
75%
100%
85,7%
ММ – молекулярная масса; Ф - фон; ИМ – «сухая иммерсия»;
В- восстановление; n–число исследованных образцов.
К ним относились сывороточный альбумин, фетуин А, цистатин-С, Е-кадхерин,
витамин D-связывающий белок, кининоген-1, калликреин-1, перлекан, эпидермальный
фактор роста. В большинстве случаев эти белки экспрессировались в различных тканях:
печени, почках, сердце, поджелудочной железе, селезенке, и попадали в мочу из крови.
Один из них выявлялся в моче постоянно, вне зависимости от фазы эксперимента –
альбумин.
Альбумин был аннотирован ранее в главе «Постоянно присутствующие белки в
моче здоровых людей», цистатин - С - в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ».
192
Фетуин А - кальций-связывающий белок, продуцируемый преимущественно в
печени,
является
циркулирующим
ингибитором
сосудистой
кальцификации.
Циркулирующий в крови фетуин способен депонироваться в гладкомышечных клетках
сосудов, что ингибирует их превращение в остеобластоподобные клетки [Земченков А.Ю.,
Герасимчук Р.П., 2009]. Отмечают, что низкие уровни фетуина в сыворотке крови
являются фактором риска кальцификации артерий у больных с хронической почечной
недостаточностью, также связаны с атеросклеротическими поражениями сердечнососудистой системы [Громова О.А. с соавт., 2011]. Wilund с соавт. предполагают, что
постоянные физические упражнения могут одновременно подавлять кальцификацию
коронарных артерий и повышать минеральную плотности костной ткани. Фетуин А
положительно коррелирует с максимальным потреблением кислорода (р = 0,679, p <.05).
Он тормозит патологические обызвествления в мягких тканях и сосудах, даже в условиях
атеросклероза [Westenfeld R. et al., 2009]. Фетуин А играет важную роль в метаболических
расстройствах, таких как резистентность к инсулину, сахарный диабет, ишемический инсульт
и нейродегенеративные заболевания [Mori K., Emoto M., Inaba M., 2012]. У нокаутных по
гену фетуина-А мышей наблюдается повышенная чувствительность к инсулину, высокий
клиренс глюкозы, низкий уровень жирных кислот и триглицеридов в плазме крови [Ix J.H.
et al., 2012]. В данном эксперименте уровень инсулина, лептина и фракции LDL- и HDLхолестерола увеличивались, а уровни глюкозы и триглицердов натощак изменились
незначительно. На второй день восстановительного периода эти значения не отличались
от фоновых показателей [Coupe M. et al., 2013]. Динамика присутственности в моче
фетуина хорошо согласуется с этими данными.
E-кадхерин - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства кадхеринов,
кальций - зависимый белок клеточной адгезии. Он
участвует в механизмах,
регулирующих межклеточные контакты, подвижность и пролиферацию эпителиальных
клеток [Agiostratidou G. et al., 2006]. Снижение уровня Е-кадхерина в моче отмечено на
фоне нефропатического синдрома [Andersen R.F. et al., 2012]. Экспрессия Е-кадхерина
широко выражена в дистальных канальцах и собирательных трубках нефрона, а благодаря
его роли в межклеточных взаимодействиях. Он может вносить вклад в механизмы
реабсорбции натрия и воды на фоне нефропатии, что объясняет его роль в ответе
организма на перераспределение жидкости на фоне иммерсионного воздействия [Tani T. et
al., 1995].
Выявление витамин-Д-связывающего белка было эпизодическим к концу СИ и
сохранило тенденцию к повышению после иммерсии. Помимо основной функции,
(регуляция костного метаболизма и фосфорно-кальциевого обмена), гормонально-
193
активные метаболиты витамина Д играют важную роль в иммунной, сердечно-сосудистой
системах, в углеводном обмене. Отмечена негативная корреляция между уровнем
витамина Д и уровнем артериального давления, выраженностью атеросклероза
коронарных артерий [Ших Е.В., Милотова Н.М., 2009]. Витамин D и его метаболиты
оказывают протективные эффекты при различных сердечно-сосудистых заболеваниях:
противовоспалительные и антисклеротические [Pilz S. et al., 2010], в предотвращении
гипертрофии кардиомиоцитов [Artaza J.N., Sirad F., Ferrini M.G., Norris K.C., 2010],
уменьшают агрегацию тромбоцитов и тромбообразование [Aihara K. et al., 2004].
Показано, что этот белок, наряду с аполипопротеином Е, альдолазой, может выступать в
качестве биомаркера повреждения сосудов, что подтверждается в исследовании на
лабораторных
животных,
выполненном
методом
двумерного
электрофореза
с
последующем масс-спектрометрическим анализом. Показано, что на 2-ую и 5-ую неделю
после повреждения сосудов, уровень витамин Д-связывающего белка снижался, по
сравнению, с контрольной группой животных [Huang N.F., Lee R.J., Li S., 2010]. Повидимому, эпизодическое появление в моче на поздних сроках СИ и после нее, этого
белка, скорее связано со снижением селективности для него клубочкового фильтра, чем
является отражением динамики в крови. О правомерности такого заключения
свидетельствуют данные авторов, выявлявших отрицательную корреляцию между
уровнем витамина Д и активностью ренина плазмы [Xiang W. et al., 2005].
Перлекан - играет важную роль в формировании внеклеточного субэндотелиального
матрикса и базальной мембраны сосудов, способствуя поддержанию барьерной функции
эндотелия и его целостности за счет связывания с молекулами клеточной адгезии,
подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток и стимулирует пролиферацию
эндотелиальных клеток посредством связывания факторов роста [Aplin J.D., 1997;
Максименко А.В., Турашев А.Д., 2014].
Эпидермальный фактор роста - открытый в 60-х годах ХХ века американскими
учеными, обнаружившими новый белок в коже, эпидермальный фактор роста является
одним из самых распространенных белков протеома мочи [Nagaraj N., Mann M., 2011].
Исследователи EGF получили Нобелевскую премию в области биологии и медицины
[Glogowska A. et al., 2012]. Этот белок был аннотирован ранее, в главе «Постоянно
присутствующие белки в моче здоровых людей».
Кроме вышеперечисленных, среди белков сердечно-сосудистой системы, которые
были выявлены с помощью программы ANDVisio, были обнаружены белки калликреин –
кининовой системы: KNG1 - кининоген-1 и KLK1 – калликреин. Эта система является
ключевой
протеолитической
системой,
включающей
калликреины,
кининогены,
194
рецепторы
кининов,
кининазы,
участвующей
в
регуляции
широкого
спектра
физиологических функций организма. Частота выявления в моче калликреина 1 (KLK1),
снизившись вначале СИ, затем нарастала до 100% и не восстанавливалась до фоновых
значений в течение недели после окончания иммерсии. KLK1синтезируется во многих
органах, включая почки и артерии, где при его участии образуются вазодилататоры
брадикинин и каллидин. В почках калликреины продуцируются в клетках дистальных
канальцев, где и происходит высвобождение кининов [Ponticelli C., Meroni P.L. 2009].
Калликреин-кининовая и ренин-ангиотензиновая системы регулируют тонус сосудов и
обеспечивают оптимальный уровень оксигенации тканей. Связь между этими системами
осуществляется на уровне проренина, который активируется калликреином, а также
ангиотензинпревращающего фермента, участвующего в деградации брадикинина и
образовании ангиотензина II. Последний выполняет функцию вазоконстриктора и
является основным маркером повреждения эндотелия сосудов, а брадикинин расширяет
просвет сосудов [Yao Y. et al. 2012]. В настоящее время описано 4 основных вида
рецепторов ангиотензина II. Наиболее интересными для нас являются рецепторы
ангиотензина 1 типа, расположенные на эндотелии сосудов и опосредующие все основные
сердечно-сосудистые эффекты ангиотензина. Ангиотензин II является одним из самых
мощных вазоконстрикторов, что определяет его роль в патогенезе артериальной
гипертонии [Минушкина Л.О. с соавт., 2000]. В эксперименте 7-суточной «сухой»
иммерсии было показано, методом прямого профилирования, достоверное снижение
ангиотензина II в сыворотке крови [Pakharukova N.A. et al., 2011]. Он оказывает сильное
сосудосуживающее действие, вызывает быстрое повышение АД. Кроме того, он
стимулирует секрецию альдостерона, а в больших концентрациях - увеличивает секрецию
антидиуретического гормона (что способствует повышению реабсорбции натрия и воды,
гиперволемии) и активирует симпатическую нервную систему. Все эти эффекты
способствуют развитию гипертензии. Реакции активной регуляции водно-электролитного
обмена в условиях иммерсии проявляются быстрее, чем в АНОГ. Так, уже через
несколько часов после начала эксперимента обнаруживается снижение активности ренина
плазмы, концентрации альдостерона, антидиуретического гормона и ангиотензина II в
экспериментах с «костюмной» и «сухой» иммерсией [Ларина И.М., Суханов Ю.В., Лакота
Н.Г., 1999]. Исследования методом лазер-допплерфлоуметрии, в сочетании с ионофорезом
вазоактивных субстанций, выполненные в СИ, показали признаки дисфункции эндотелия со
снижением
эндотелий-зависимой
вазодилатации
на
уровне
микрососудов
кожи
[Navasiolava N.M. et al., 2010]. В последние годы показано, что эндотелий сосудов играет
важную роль в регуляции сократимости сосудов посредством системы химических
195
медиаторов. Секретом этого исключительно функционально активного монослоя также
оказывает регулирующее влияние на циркулирующие в крови клеточные элементы
[Zufferey P. et al., 2011], на все типы клеточных компонентов стенок сосудов [Ozkor M.A.,
Quyyumi A.A., 2011]. Эта функциональная активность эндотелия привлекает к нему
пристальное внимание в связи с регуляцией сосудистого тонуса (сосудистого
сопротивления, как компоненты регуляторного механизма кровяного давления) [Liao J.,
Farmer
J.A.,
2010].
Само
существование
эндотелия
предполагает
возможную
многофакторность дисфункций этого функционального клеточного элемента сосудистой
стенки. Ключевым медиатором эндотелиальных клеток является оксид азота, уровень
которого в определенной степени регулируется уровнем брадикинина, образующегося из
кининогена под действием активированного прекалликреина (калликреина). Yu с соавт.,
на основании экспериментальных и клинических исследований показали обратную
корреляцию между содержанием в моче KLK1 и показателями артериального давления.
По их мнению, KLK1 способствует улучшению сердечной, ренальной и неврологической
функций [Yu H. et al., 2002]. Являясь антагонистами, ККС и РААС осуществляют
адаптивную защиту организма. В данном исследовании показано, что через 24 часа после
начала
иммерсионного
воздействие
происходит
подавление
активности
ренин-
ангиотензиновой системы, в частности, вдвое снижается активность ренина плазмы,
повышается диурез и экскреция натрия [Coupe M. et al., 2013]. После выполнения
обследуемыми ортостатической пробы отмечалось увеличение каллекреина 1 во всех
образцах.
Таким образом, под влиянием условий эксперимента с 5-суточной «сухой»
иммерсией с использованием протеомных методов анализа белкового состава мочи и
биоинформационных подходов, было выявлено 9 белков, осуществляющих свои функции
в ССС, к ним относились сывороточный альбумин (ALB), альфа-2-HS-гликопротеин
(АHSG), цистатин-С (CST3), витамин D-связывающий белок (GC), кининоген-1(KNG1),
калликреин-1(KLK1), перликан, фетуин А, Е - кадхерин. Частота выявления в образцах
характеризовалась различной динамикой в ходе эксперимента. У части белков динамика
выявления зависела от модификаций, под действием факторов СИ, функций почек
(селективности гломерулярного барьера, процессов реабсорбции натрия и воды,
регуляции
почечной
гемодинамики).
У
другой
части
свидетельствующем о развитии дисфункции эндотелия сосудов.
–
являлась
признаком,
196
3.5.5. Белки тканей почек и мочевыводящей системы
Следующим
этапом
работы
было
обнаружение
белков
тканей
почек
и
мочевыводящей системы в моче и их связь различными параметрами водно-солевого
обмена, наблюдаемыми в ходе эксперимента. С помощью системы ANDSystem было
выявлено 18 белков, 7 из которых, демонстрируют динамические изменения частоты
своего обнаружения в условиях СИ на 4 сутки, по сравнению с фоновыми значениями
(табл. 37).
Таблица 37. Изменение числа обнаружений белков тканей почек и мочевыводящей
системы в образцах мочи 8 здоровых добровольцев.
Белок
CUBN_HUMAN
KLK1_HUMAN
MGA_HUMAN
LRP2_HUMAN
PROZ_HUMAN
AMPE_HUMAN
EGF_HUMAN
OSTP_HUMAN
DPP4_HUMAN
MUCEN_HUMAN
KNG1_HUMAN
NEP_HUMAN
S12A1_HUMAN
VCAM1_HUMAN
XPP2_HUMAN
UROM_HUMAN
AQP2_HUMAN
S12A3_HUMAN
Ф
СИ 4 Разница
Число обнаружений
4
7
3
4
7
3
0
3
3
5
7
2
5
7
2
0
1
1
7
8
1
7
8
1
0
0
0
0
0
0
7
7
0
1
0
-1
1
0
-1
1
0
-1
1
0
-1
4
3
-1
2
0
-2
2
0
-2
%
37
37
37
25
25
12
12
12
0
0
0
-12
-12
-12
-12
-12
-25
-25
Анализ корреляции динамики частоты встречаемости белков с динамикой
параметров водно-солевого обмена, для пяти точек эксперимента (фон, 2, 4, 5 и 3 сутки
после завершения эксперимента) выявил 6 белков, демонстрирующих корреляцию между
динамикой частоты встречаемости белка в образцах и различными параметрами водносолевого обмена (табл. 38).
197
Таблица 38. Корреляции частоты выявления отдельных белков
с параметрами водно-солевого обмена.
Белки
Корреляция частоты встречаемости белка с
параметром водно-солевого обмена
MGA_HUMAN Водопотребление
KLK1_HUMAN Экскреция жидкости
Экскреция натрия
Частичный водный баланс
PROZ_HUMAN Экскреция жидкости
Экскреция натрия
Частичный водный баланс
CUBN_HUMAN Экскреция натрия
KNG1_HUMAN Водопотребление
OSTP_HUMAN Частичный водный баланс
Экскреция натрия
R
p_val
0,96
-0,87
-0,97
0,96
-0,90
-0,87
0,90
-0,88
-0,87
0,91
-0,94
0,01
0,05
0,01
0,01
0,04
0,06
0,04
0,05
0,06
0,03
0,02
Для понимания выявленной динамики протеомного состава мочи на фоне 5 суточной
иммерсии необходимо рассмотреть функции обнаруженных белков.
Кубулин (МВ 398,736 Дa) и мегалин (МВ 521,958 Дa) – гликопротеиновые
рецепторы,
мембранные
белки,
которые
совместно
осуществляют
рецептор-
опосредованный эндоцитоз белков через апикальную мембрану клеток проксимальных
канальцев почек [Batuman V., еt al., 1998]. Показано, что эти мультилигандные рецепторы
связываются с большим числом лигандов [Verroust P.J., Birn H., Nielsen R. et al., 2002].
Эндоцитоз осуществляется после связи комплекса лиганд-кубулин с мегалином, который
опосредует внутриклеточное перемещение кубулина [Christensen E.I. et al., 2009]. Кубулин
«распознаёт» свои специфические лиганды, но только последующее образование связи с
мегалином обеспечивает интернализацию всего комплекса в цитоплазму [Amsellem S. et
al., 2010]. Кроме эпителия проксимальных канальцев, кубулин в почке экспрессируется
также в подоцитах, которые могут интернализировать белки, профильтровавшиеся из
крови [Prabakaran T. et al., 2012]. Мегалин выражено экспрессируется в почках в клетках
проксимальных канальцев и во всех компонентах эндоцитозного аппарата [Christensen E.I.
et al., 2009]. Комплекс рецептор-мегалин через рецептор-опосредованный эндоцитоз
поступает в эндосомы, которые затем подкисляются для облегчения диссоциации лигандрецепторного комплекса [Gekle M., Mildenberger S., Freudinger R., Silbernagl S., 1995],
затем рецепторы рециркулируют к люминальной мембране. Появление в моче фрагментов
мембранных рецепторов, скорее всего, означает, что они вошли в состав экзосом. Однако,
не смотря на их совместную работу, и увеличение частоты встречаемости белков в
198
образцах на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с фоном, только для кубулина удалось
выявить достоверную корреляцию с уровнем экскреции натрия. Известно, что дефицит
кубулина приводит к потери альбумина и апоА-I с мочой [Aseem O. et al., 2014] и
увеличение экспрессии белка может быть направлено на противодействие потери белка на
фоне увеличение диуреза на первые сутки иммерсионного воздействия.
Витамин К-зависимый белок Z аннотирован в главе «Анализ протеома мочи в
АНОГ». Помимо увеличения частоты встречаемости белка в образцах на 4-е сутки
эксперимента, по сравнению с фоном, наблюдалась достоверная корреляция частоты
встречаемости этого белка с динамикой экскрецией жидкости, экскрецией натрия и
показателями частичного водного баланса.
Остеопонтин (MB 35,423 Дa) – аннотирован ранее, в главе «Анализ протеома мочи в
АНОГ». Хотя, увеличение частоты встречаемости белка в образцах на 4-е сутки
эксперимента, по сравнению с фоном не выявлялось, наблюдалась достоверная
корреляция динамики частоты обнаружения в образцах данного белка с динамикой
частичного водного баланса и экскреции натрия.
Белки калликреин-кининовой системы аннотированы ранее, в главе «Белки тканей
почек и мочевыводящей системы». В ходе СИ было отмечено увеличение частоты
встречаемости в образцах KNG1 и KLK1 на 4-е сутки эксперимента, по сравнению с
фоном. Динамика частоты обнаружения в образцах кининогена коррелировала с
водопотреблением, а калликриина с экскрецией жидкости, экскрецией натрия и
частичным водным балансом. Столь тесная связь с парамерами водно-солевого обмена
может быть обусловлена тем, что калликреин-кининовая система, функционирующая в
почках, существенно отличается от плазменной. Синтезируемый канальциевым эпителием
кортикальных сегментов нефрона калликреин поступает в канальцевую жидкость, а затем
в мочу. В результате взаимодействия калликреина с кининогенами в дистальных
канальцах образуется брадикинин, что приводит к усилению почечного кровотока,
подавлению реабсорбции натрия и воды из организма [Katori M., Majima M., 2014].
Мальтаза-глюкоамилаза,
фермент
апикальной
клеточной
мембраны;
он
определяется в почках, тонком кишечнике, гранулоцитах. Зарегистрировано увеличение
частоты встречаемости в образцах на 4-е сутки, по сравнению с фоном, и достоверная
корреляция с динамикой водопотребления.
Аквапорин-2
аннотирован
в
главе
«Выявление
значимо
представленных
биологических процессов по составу протеома мочи космонавтов на первые сутки после
длительных космических полетов». В ходе СИ выявлено снижение частоты обнаружения
в образцах данного белка к 4-м суткам эксперимента по сравнению с фоновым значением.
199
Тиазид чувствительный Na,Cl контранспортер (NCC) опосредует реабсорбцию
натрия через апикальную мембрану дистальных извитых канальцев нефрона, кодируется
геном SLC12A3 и принадлежит к семейству SLC12 электронейтральных котранспортёров
ионов хлоридов [Gamba G., 2010]. В почках расположен в дистальных извитых канальцах
[Arroyo J.P., 2011], кроме почки экспрессируется в кишечнике и костной ткани [Dvorak
M.M. et al., 2007]. Уровень белка находится под контролем сразу нескольких гормонов, в
том числе альдостерона, ангиотензина II, глюкокортикоидов, эстрогенов, инсулина, и
вазопрессина. То обстоятельство, что NCC регулируют так много различных гормонов
предполагает,
что
реабсорбция
натрия
посредством
NCC
является
важным
гомеостатическим механизмом контроля [Sohara E. et al., 2011; Chávez-Canales M. et al.,
2013]. Альдостерон активирует NCC как при приёме внутрь, так и в ответ на рацион с
низким содержанием натрия [Kim G.H. et al., 1998]. Вызывает некоторое удивление, что и
ангиотензин II также способен активировать NCC, поскольку мишенью для его
воздействия являются, прежде всего, проксимальные канальцы [McDonough A.A., 2010].
Это влияние может быть обусловлено необходимостью активизировать ретенцию натрия
при гиповолемии, так как это состояние характеризуется повышенным уровнем в плазме
как ангиотензина II, так и альдостерона [van der Lubbe N. et al., 2013]. В эксперименте с
СИ выявлено снижение частоты обнаружения в образцах S12A3 к 4-м суткам
эксперимента по сравнению с фоновым значением.
Таким образом, были
идентифицированы белки, которые демонстрируют
ассоциативную связь с функциями выделительной системы, выявляемую в ходе
автоматической экстракции данных из базы данных PubMed при анализе с помощью
системы
ANDCell.
Эти
протеины
также
демонстрируют
чувствительность
к
иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих
белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися
параметрами водно-солевого обмена (на 4-е сутки эксперимента по сравнению с
фоновыми значениями). Изучение физиологических функций выявленных белков может,
с одной стороны, подтвердить уже устоявшиеся представления о физиологическом ответе
на иммерсионное воздействие, а с другой - предоставить новую информацию о ранее
неизвестных механизмах адаптивного процесса.
3.6. Выявление значимо представленных биологических процессов по составу
протеома мочи космонавтов на первые сутки после длительных космических
полетов
Известно, что космический полет воздействует на организм человека комплексом
факторов, среди которых микрогравитация является ведущим и не воспроизводимым (с
200
большой продолжительностью) на Земле. Возможность на молекулярном уровне выявить
механизмы приспособления человека к земной силе тяжести после длительного
пребывания на околоземной орбите дает возможность лучше понять направленность и
диапазон происходящих в условиях космического полета физиологических изменений в
организме человека.
В образцах мочи пятнадцати российских космонавтов было выявлено 294 различных
белков, 211 из них представлено в образцах, собранных в фоновом периоде, 243 - на
первые сутки после КП и 207 – в пробах, собранных у группы космонавтов на седьмые
сутки восстановительного периода. В образцах мочи двенадцати членов дублирующих
(российских) экипажей присутствовало 211 различных белков. Эти лица относились к той
же возрастной группе, проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания
и находились в тех же условиях, что и космонавты. Образцы биологического материала у
космонавтов-дублеров были получены дважды, в интервалы времени, соответствующие
пред-
и
послеполетному
сбору
биоматериала
у
космонавтов,
совпадающие
с
предполетным обследованием и сбором образцов у космонавтов на 1-ые сутки после
полета (т.е. через 180-240 суток после старта космической экспедиции основного
экипажа). В образцах мочи обследованных дублеров было выявлено 181 и 169 белков. Все
добровольно участвовали в эксперименте «Исследование протеома крови и мочи у
основных и дублирующих членов экипажей до и после космических полётов на МКС
(«Протеом»), в рамках которого осуществлялся сбор биологических образцов до и после
полета.
У космонавтов на первые сутки после полета было выделено 34 специфических
белка, которые встречались хотя бы один раз в трех повторах хромато-массспектрометрического определения. Эти белки не обнаруживались ни в пробах мочи
фонового периода, ни в образцах, собранных космонавтами на 7 сутки после КП, ни в моче
членов дублирующих экипажей. Тканевая принадлежность этих белков была определена
по базе данных TiGER (табл. 39) [Liu, et al., 2008].
Таблица 39. Тканевая принадлежность 34 специфичных для КП белков
по базе данных TiGER.
Орган, ткань организма
1
легкие
ЖКТ (гортань, язык, желудок)
костный мозг
почки, мочевой пузырь
Число белков
2
1
6
3
3
201
Продолжение Таблицы 39.
1
Глаза
печень
кожа
сердце
предстательная железа
клетки крови
мышцы
селезенка
2
2
2
1
2
3
3
3
1
Очевидно, что протеом мочи могут составлять не только белки почек и мочеполовой
системы, но и протеины практически всех других систем организма. Из крови в мочу
поступает значительная часть белков, преодолевая гломерулярный фильтр (что возможно
как по размеру молекулы, так и по электростатическому заряду). Происхождение белков
плазмы, идентифицированных по пептидам в моче, различно, это как белки крови,
осуществляющие в ней свою функцию, так и продукты «подтекания» тканей, или
внутриклеточные белки, поступающие в кровь в результате клеточной гибели
(апоптотической или в результате протеолиза) [Anderson N.L., Anderson N.G., 2002; Jia L. et
al., 2009].
Повышение или снижение относительной доли тех или иных белков в моче может
свидетельствовать об активации (включении) или угнетении (выключении) определенных
процессов в организме. Было проведено сравнение биологических процессов, которые, с
одной стороны, сверхпредставлены1 в моче, а с другой стороны, отличаются по числу
наблюдаемых белков между состояниями до и после полёта.
Для выявления процессов, которые реагируют на условия космического полёта,
находили сверхпредставленные процессы для белков, определённых только на первые
сутки после полёта, и сверхпредставленные процессы, для белков присутствующих во всех
группах образцов мочи кроме, первых суток (рис. 18).
Согласно приведенной схеме (рис. 18), с помощью программы BiNGO [Maere S.,
Heymans K., Kuiper M., 2005], для 34 белков, специфичных для проб мочи первых
послеполетных суток обследования, было выявлено 63 сверхпредставленных процесса.
Среди них, согласно базе данных Uniprot-GOA [Dimmer E.C. et al., 2012], наиболее
сверхпредставленным процессом оказался “response to inorganic substance”, который, по
существу, представлял собой реакцию регуляции гомеостаза электролитов и минеральных
веществ (p-value = 2.2*10-6).
1
доля белков данного процесса выше среди белков мочи, чем среди всех белков человека
202
Рисунок 18. Схема поиска биологических процессов «реагирующих» на условия
космического полёта.
Примечание: «Белки» – наборы белков для указанного состояния, «СБП» – найденные
сверхпредставленные биологические процессы Gene Ontology для указанного состояния, «До полёта» космонавты до полёта, «Первые» и «Седьмые сутки» - космонавты на первые и седьмые сутки после полёта,
соответственно, «Дублёры 1» и «2» – два измерения для дублёров, «специфичные +» – характерные только
для первых суток после полёта, «специфичные -» – процессы, найденные для всех групп образцов мочи
кроме, первых суток.
Три белка, включенные в этот процесс (утероглобин, β-субъединица гемоглобина,
глутатион-пероксидаза 3) – также участвуют в системе антиоксидантной защиты
(“response to reactive oxygen species”), активация которой является специфичным для +1
суток сверхпредставленным процессом [Григорьев А.И., Баевский Р.М. 2007; Маркин
А.А., Журавлева О.А., 2001; Selvaraj N., Bobby Z., Sridhar M.G., 2008]. Вторым по
значимости процессом оказалась регуляция водного баланса организма (“regulation of
body fluid levels”), отнесенная к процессам, связанным с функцией почек. Процессы,
имеющие p-value<0.01, были связаны с гемостазом. Всего для +1 суток после КП
выявлялось 10 сверхпердставленных процессов с p-value<0.01. Последним из них по
значимости,
являлся
фундаментальный
процесс
«localization»,
включающий
всевозможные механизмы транспорта и депонирования веществ, вовлекающий тысячи
белков организма.
Также было выявлено 6 сверхпредставленных процессов для двух белков (кератин I
типа цитоскелетный 28 и кератин II типа цитоскелетный 5), присутствовавших во всех
группах образцов мочи, за исключением первых суток. Эти процессы связаны с развитием
кожных покровов и формированием клеточных контактов.
Далее была осуществлена попытка связать основные, из выявленных 63-х
сверхпредставленных процессов, с физиологическими изменениями, происходящими в
различных системах организма в ранний восстановительный период. В них вошли 9
203
процессов, связанных с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена; 3
процесса – с мышечной системой; 3 – с функциями сердечно-сосудистой системы; 9 – с
перекисным окислением липидов и системой антиоксидантной защиты; 11 – с иммунной
системой; 5 – с системой гемостаза; и 2 – с обменом веществ.
На первые сутки после полета, как правило, отмечалась умеренная гипокалиемия и
повышенная активность ионизированного кальция, нередко отмечалась гипернатриемия,
повышение концентрации общего белка в крови и высокий гематокрит, что при
увеличенном водопотреблении и сниженной экскреции осмотически активных веществ,
свидетельствует
о сохраняющемся дефиците объема циркулирующей
плазмы и
гипогидратации организма [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Газенко
О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д. 1990; Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М.,
Носков В.Б., 2003; Носков В.Б., 2013; Grigoriev A.I., Morukov B.V., Vorobiev D.V., 1994].
Развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение потерь внеклеточной
жидкости и минеральных веществ, необходимые для формирования земного типа водносолевого гомеостаза [Моруков Б.В., Наточин Ю.В., Ларина И.М., Носков В.Б., 2003].
Происходит
действия
активация
ренин-альдостероновой
антидиуретического
гормона,
системы,
снижение
дисбаланс
эффективности
простагландинов
прессорного/депрессорного класса [Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006]. В
этот период увеличивается содержание волюморегулирующих гормонов в плазме крови,
что вызывает снижение почечной экскреции осмотически активных веществ и
положительный водный баланс, который способствует увеличению объема плазмы и
восполнению дефицита массы тела. Таким образом, после космического полета
развиваются адаптивные реакции, направленные на восполнение потерь внеклеточной
жидкости.
Как отмечено нами ранее, белки мочи космонавтов, выявленные в образцах,
собранных в первые сутки после полета, оказались участниками 9 процессов, которые
связаны с функцией почек и состоянием водно-электролитного обмена (табл. 40). Данные
процессы определяют как транспорт воды, так и транспорт ионов.
Практически все белки, указанные в табл. 40 являются новыми участниками хорошо
известных в космической физиологии процессов. Белки, обнаруженные в моче участников
АНОГ, входят также и в список почечных белков космонавтов и дублеров [Пастушкова
Л.Х. с соавт., 2013]. В моче добровольцев не обнаруживается аквапорин-2, это, возможно
связано с более длительным и значимым воздействием на организм космических полетов.
204
Таблица 40. Процессы, связанные с функцией почек
и состоянием водно-электролитного обмена
Биологические процессы
Белки
Транспорт воды и водный обмен
Регуляция реабсорции осмотически
аквапорин-2
свободной воды в нефроне
Клеточный ответ на водные стимулы
аквапорин-2
Регуляция водного гомеостаза
CD 63, протеин C, аквапорин-2, β-субъединица
гемоглобина, |титин, просапозин
Системный почечный процесс
аквапорин-2, β-субъединица гемоглобина
Транспорт ионов
Ионный транспорт
карбоновая ангидраза 1, протеин C, αальбумин, β-субъединица гемоглобина,
кальпротектин, липокалин-1, просапозин, eIF-6,
аквапорин-2, Ig лямбда -7 chain C регион, Ig
kappa chain V-I регион Ni, агрин, титин, CD 63,
Транспорт бикарбонатов
карбоновая ангидраза 1, β-субъединица
гемоглобина
Регуляция транспорта ионов
CD 63
Клеточный ответ на ионы магния
фруктозо-1,6-бисфосфатаза 1
Транспорт кислорода через мембрану
аквапорин-2
эритроцитов
AQP2 (MB 28,837 Да) – белок апикальной мембраны эпителия собирательных трубок
почек, который формирует молекулярный водный канал (пору) для переноса воды через
липидный бислой мембран [Peng J., Jones G.L., Watson K., 2000]. Белки семейства
аквапоринов, встраиваясь в мембрану, избирательно пропускают молекулы воды и
являются совершенно непроницаемыми для заряженных частиц. Почечная экскреция воды
регулируется главным образом через влияние вазопрессина на аквапорин-2 (AQP2),
который экспрессируется в дистальном отделе нефрона [Stein T.P., 2002]. Вазопрессин
регулирует проницаемость для воды эпителия собирательных трубок нефрона путём
воздействия на миграцию аквапорина-2 из внутриклеточных везикул к люминальной
мембране. Это ведёт к реабсорбции осмотически свободной воды и концентрированию
мочи. Показано, что активация регуляции со стороны вазопрессина усиливает экскрецию
аквапорина-2 с мочой, который поступает в мочу в составе экзосом небольшого размера,
образующихся без разрушения эпителиальных клеток [Zhang H., Tao L., Jiao X., 2007].
AQP2 может теряться при нарушении внутриклеточной рециркуляции [Fröhlich M., Deen
P.M., Klipp E.A., 2010], а также в состоянии усиленной почечной реабсорбции воды [Stein
T.P., 2002]. Именно этот процесс является характерным для состояния почки после
приземления космонавтов (рис. 19) [Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю. В., 1980].
205
Рисунок 19. Связь аквапорина с водной депривацией.
Из 63 биологических процессов, белки которых были выявлены на 1 сутки после
полета, 3 были связаны с функциями мышечной системы, такими как сборка саркомеров и
механотрансдукция
роль
в
мышечных
клетках,
развитие
мышечного
волокна,
положительная регуляция синаптического роста в нервно-мышечном соединении.
Функциональные возможности мышечной системы в условиях невесомости до сих пор
являются одной из основных медицинских проблем в длительных космических полетах
[Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004]. Наиболее очевидным следствием
воздействия невесомости является потеря мышечной массы и связанные с ней
функциональные нарушения, такие как снижение сократительных свойств мышц,
выносливости
и
работоспособности
человека,
изменение
(перестройка)
системы
метаборефлекторной регуляции (табл. 41).
Таблица 41. Процессы, связанные с мышечной системой.
Биологические процессы
Белки
Структурно-функциональная организация мышечных клеток
Сборка саркомеров и механосигнальная роль в титин
мышечных клетках
Развитие мышечного волокна
титин, филамин С
Метаборефлекторная регуляция мышц
Положительная регуляция синап-тического
роста в нервно-мышечном соединении
агрин
Гравитационная разгрузка вызывает мышечную атрофию за счет активации систем
протеолиза цитоскелетных белков, таких как десмин, титин [Григорьев А.И., Шенкман
Б.С., 2008; Tesch P.A., von Walden F., Gustafsson T., еt al., 2008]. Титин – гигантский
эластичный
полифункциональный
белок
поперечно-полосатых
и
гладких
мышц
[Григорьев А.И., Шенкман Б.С, 2008; Vikhlyantsev I.M. et al., 2011]. В саркомерах
206
сердечной и скелетных мышц позвоночных он является третьим по представленности
(после актина и миозина) белком. Титин участвует в формировании «правильной»
структуры саркомера: организации тонких и толстых филаментов в саркомеры,
последовательное соединение которых формирует миофибриллу, являющуюся основной
структурно-функциональной
единицей
мышечного
волокна.
Пучки
миофибрилл
формируют сократительный аппарат, обеспечивающий сократительные возможности
мышечной клетки (рис. 20) [Tskhovrebova L., Trinick J., 2010].
Рисунок 20. Связь титина (прямая и через посредников) с миозином.
Титин
принимает
участие
в
запуске
и
регуляции
актин-миозинового
взаимодействия как через связывание с белками тонких нитей, так и посредством
изменения АТФазной активности и Са2+ чувствительности миозина. Играет важную роль в
процессах внутриклеточной сигнализации, участвует в регуляции экспрессии мышечных
генов и белкового обмена в саркомере [Tskhovrebova L., Trinick J., 2002]. Снижение в 2 раза
N2A-изоформы
титина
было
обнаружено
в
m.soleus
крыс
после
14-суточной
моделируемой гравитационной разгрузки, и сопровождалось уменьшением пассивного
напряжения при растяжении мышцы. Более длительное вывешивание (14- и 30-суток)
связано с деструктивными изменениями в титине, вплоть до полного разрушения его NTизоформы [Shumilina Y.V., Vikhlyantsev I.M., Podlubnay Z.A., Kozlovskaya I.B., 2010;
Vikhlyantsev I.M. et al., 2011; Okuneva A.D. et al., 2012].
Среди белков, участников мышечных процессов, выявлен агрин, играющий
центральную роль в формировании и поддержании нервно-мышечных контактов,
участвуя в дифферентации постсинаптических структур.
Агрин экспрессируется
мотонейронами, нервными и шванновскими клетками, участвует в запуске сигнальных
207
каскадов, приводящих к формированию необходимых компонентов постсинаптической
мембраны [Hilgenberg L.G. et al., 2006; Higuchi O., Yamanashi Y. 2011].
Очевидно, активация систем протеолиза цитоскелетных белков, таких как десмин,
титин, лежит в основе мышечной атрофии, которая, в свою очередь, обуславливает
снижение сократительных свойств мышц, выносливости и физической работоспособности
после космического полета [Григорьев А.И., Шенкман Б.С, 2008; Vikhlyantsev I.M. et al.,
2011].
Также, в образцах, собранных на первые сутки после полета были выявлены белки,
участники процессов, обеспечивающих адаптацию сердечно-сосудистой системы к
земной гравитации после завершения КП: транспорт оксида азота, регуляция объемного
кровотока, ответ на тироксиновые стимулы (табл. 42).
Таблица 42. Процессы, связанные с сердечно-сосудистой системой.
Биологические процессы
Белки
Регуляция тонуса сосудов
Транспорт оксида азота
β-субъединица гемоглобина
Регуляция объемного кровотока
карбоновая ангидраза 1, CD 63, α-альбумин,
аквапорин-2, в-субъединица гемоглобина, Ig
лямбда-7 цепь C региона, Ig kappa chain V-I
регион Ni, титин, просапозин
Белок сердца, связанный со стрессом
Ответ на тироксиновые стимулы
тиоредоксин
Известно, что оксид азота выполняет множество функций в организме: является
нейромедиатором, вазодилататором, антиагрегантом, мощным фактором гомеостаза
[Андронов Е.В., Киричук В.Ф., Иванов А.Н., Мамонтова Н.В., 2007]. Эндотелиальные
клетки являются источником оксида азота, он опосредует сосудорасширяющие эффекты
эндотелийзависимых вазодилататоров, тормозит образование фактора эндотелина-1 и
высвобождение норадреналина. Принимает участие в регуляции сосудистого тонуса и
кровотока,
системной
гемодинамики
и
микроциркуляции,
ингибирует
адгезию
форменных элементов крови к эндотелию [Киричук В.Ф. с соавт., 2011]. Белок бетасубъединицы гемоглобина (HBB), (MB~ 16 кДа) участвует не только в транспорте
кислорода из легких в различные ткани, но и в транспорте окиси азота, а также
потенцирует активность брадикинина, что приводит к снижению кровяного давления
[Shumilina Y.V., Vikhlyantsev I.M., Podlubnay Z.A., Kozlovskaya I.B., 2010; Kayashima Y.,
Smithies O., Kakoki M., 2012]. Специфичным для первых суток послеполетного периода
оказался и белок тиоредоксин аннотированный в главе «Анализ протеома мочи в АНОГ».
208
Он выявляется в моче на первые, а также на 16 и 21 сутки АНОГ. Возможно, он
появляется так же и во время полета, однако, у нас имелась возможность обследовать
космонавтов только на первые и седьмые сутки после космического полета.
В ответ на окислительный стресс тиоредоксины обильно экспрессируются в
эндотелии [Landmesser U., Drexler H., 2007]. На первые сутки после посадки после
длительных КП уровень в плазме кортизола резко увеличивается [Ларина И.М. с соавт.,
2002; Symons T.B., Sheffield-Moore M., Chinkes D.L., 2009].
Ранее было показано, что после длительных полетов у космонавтов обнаруживаются
признаки ингибирования процесса перекисного окисления липидов, а также достоверно
растет уровень липидного антиоксиданта – токоферола [Маркин А.А., Журавлева О.А.,
2001; Selvaraj N.,et al. 2008].
Среди специфичных для +1 суток после КП белков нами были обнаружены те,
которые участвуют в 9 процессах, связанных с перекисным окислением липидов, с
регуляцией и метаболизмом активных форм кислорода (Таблица 43).
Таблица 43. Процессы, связанные с перекисным окислением липидов и
антиоксидантной активностью.
Биологические процессы
Белки
Перекисное окисление липидов
Ответ на гидроперекиси
глутатион-пероксидаза
липидов
Метаболизм реактивных форм
β-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза,
кислорода
Регуляция клеточного ответа на окислительный стресс
CD 63, утероглобин, протеин C, аквапорин-2, βсубъединица гемоглобина, Ig лямбда -7 chain C
Ответ на стресс
регион, тиоредоксин, Ig kappa chain V-I регион Ni,
кальпротектин, глутатион-пероксидаза 3, титин
Регуляция и метаболизм АФК
Катаболизм перекиси водорода
β-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3
Клеточный ответ на реактивные
β-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3
формы кислорода
утероглобин,
аквапорин,
2β-субъединица
Ответ на кислород-содержащие
гемоглобина, тиоредоксин, кальпротектин, глутатионсоединения
пероксидаза 3
Ответ на реактивные формы утероглобин, β-субъединица гемоглобина, глутатионкислорода
пероксидаза 3
клеточный ответ на перекись
β-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3
водорода
Метаболизм перекиси водорода
β-субъединица гемоглобина, глутатион-пероксидаза 3
209
Транскрипция гена гем-оксигеназы регулируется уровнем свободнорадикального
окисления [Starklint J. et al., 2006] и индуцируется различными прооксидантными
факторами [Clark J.E., Foresti R., Green C.J., Motterlini R., 2000]. Каталаза и
глутатионпероксидаза (GSH-Px) - ферменты утилизирующие H2O2 [Semenza G.L., 1999].
Супероксид может повышать время жизни H2O2, так как он инактивирует каталазу и
глутатионпероксидазу. Отмечают, что системы иммунитета, гомеостаза и перекисного
окисления липидов тесно связаны друг с другом [Бышевский А.Ш., Умутбаева М.К.,
Алборов Р.Г., 2003]. В данном исследовании на первые сутки после КП было выявлено 11
процессов, связанных с регуляцией функций иммунитета, в которых принимают участие
следующие белки: CD63 антиген, утероглобин, фруктоза-1, 6-дифосфатаза-1, βсубъединица
гемоглобина,
белок
S100-A8,
тиоредоксин,
агрин,
аквапорин-2,
глутатионпероксидаза 3, проактиватор полипептида, К-зависимый белок С, проактиватор
полипептида, титин. С системой гемостаза оказались связаны 5 процессов, с участием
следующих белков: CD63 антиген, титин, витамин К-зависимый белок С, проактиватор
полипептида. Кроме того, на первые сутки после полета 2 процесса были связаны с
обменом веществ, в которых участвовали следующие белки: 6-фосфоглюконолактоназа,
фруктозадифосфатальдолаза B, аквапорин-2. Процессов, связанных с внутриклеточными
процессами, на 1 сутки после полета выявлено 8. К ним относились следующие белки:
фруктоза-1,6-дифосфатаза-1, эукариотический трансляционный фактор инициации 6, βсубъединица гемоглобина, геликаза лимфоид – специфическая, глутатионпероксидаза-3,
титин, карбоангидраза-1, карбоангидраза-1, афамин, аквапорин-2, иммуноглобулин
лямбда, иммуноглобулин каппа-6.
Таким образом, при изучении белкового состава мочи космонавтов после завершения
продолжительных
полетов
удалось
выявить
специфические
белки-
участники
физиологических процессов, характерные для процессов реадаптации к земным условиям
жизнедеятельности. Эти белки преимущественно синтезировались в различных органах и
функциональных системах организма.
Специфичными сверхпредставленными для +1 суток периода восстановления после
полета, как правило, были процессы, происходящие во многих клетках и тканях.
Биоинформационными методами и с помощью ручной аннотации белков и процессов.
использованных
в
данной
работе,
удалось
связать
биологические
факты
и
физиологические особенности состояния космонавтов в первый сутки после завершения
полетов, хорошо известные и документированные ранее, с выявленными в моче белками,
участниками различных биологических процессов.
210
Кроме подтверждения на молекулярном уровне механизмов раннего периода
реадаптации, были также выявлены процессы, не изученные ранее, но происходящие в
организме с участием обнаруженных белков. Построение ассоциативных сетей белокбелковых взаимодействий дало возможность выдвинуть гипотезы о взаимном влиянии и
взаимной вовлеченности процессов, происходящих во внеклеточной жидкости при
адаптации к КП и моделируемым его эффектам. Исследование протеома мочи человека на
первые сутки после окончания КП, в острый период реадаптации организма человека к
земной гравитации, позволило выявить многообразие механизмов приспособления
организма человека к условиям жизнедеятельности на Земле после длительного
пребывания на околоземной орбите.
211
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты
проведенных
исследований
показывают,
что
хромато-мас-
спектрометрический анализ мочи является информативной технологической платформой
для характеристики протеома мочи, который может служить индикатором различных
физиологических состояний организма здорового человека.
Протеомный метод анализа, ввиду его высокой чувствительности, позволил
исследовать белок в каждой пробе мочи и полностью оценить его белковую композицию.
В соответствии с требованиями EuroKUPи HKUPP использовался стандартизированный
протокол сбора мочи для протеомного анализа, в котором использовалась средняя порция
второй утренней фракции, которая является наименее вариабельной по белковому составу
и вследствие этого – наиболее пригодной для протеомных исследований [Fiedler G.M. et
al., 2007]. Сбор мочи осуществлялся в стерильную пластиковую ёмкость [Zürbig P. et al.,
2011], использовалась оптимальная рабочая концентрация белка в пробе в пределах 0,11,0
мг/мл,
что
не
является
нижним
пределом
чувствительности
метода.
Концентрационный диапазон исследуемых белков был 10-7 -12-12 ммоль/л. Пробы мочи
испытуемых были проанализированы протеомными методами индивидуально, трижды и
для последующего анализа были отобраны пептиды, выявленные в двух или трёх
повторах. Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовался для
поиска и идентификации белков по базе данных IPI-human при помощи программы Mascot
(MatrixScience, Лондон, Великобритания; version 2.0.04). С использованием параметров: 1)
enzyme – trypsin; 2) peptidetolerance ±5 ppm; 3) MS/MS (fragments) toltrance ±0,5 Da. Из
списка белков, полученного в результате поиска, отбирались только те, для которых были
идентифицированы 2 и более триптических пептида с рейтингом (score) > 24 [Agron I.A.,
Avtonomov D.M., Kononikhin A.S. et al., 2010]. Указанные выше критерии контроля
качества результатов были более строгими, чем в работах, использующих пул образцов,
что повышало достоверность получаемых результатов и выводы.
Результаты
проведенной
работы
позволили
охарактеризовать
протеомную
композицию мочи здоровых мужчин в возрасте от 19 до 54 лет, выявить при этом сотни
различных белков, принадлежащих большинству тканей организма человека. Была
продемонстрирована достоверная положительная, средней степени выраженности,
корреляция возраста обследуемого и числа (R=0.566; p-value=1.24E-05), а также массы
белков (R=0.429; p-value=0.00079) в образце. При этом, с увеличением возраста
достоверно чаще выявлялись 23 белка, продуцентами, которых были 11 тканей и органов
тела человека.
212
Полученные данные могут быть основой для успешного поиска и валидации
независимых маркеров различных состояний и процессов в организме здорового человека,
а также использоваться как внутренние стандарты при определении концентрации других
белков в моче.
Одним из центральных вопросов в исследовании протеома мочи является
изменчивость, вариабельность состава присутствующих белков. Достоверные источники
для оценки вариабельности содержания тех или иных белков в моче у здоровых лиц в
контролируемых условиях малочисленны. Ранее совместно с Образцовой О.А. были
выявлены показатели индивидуальной и групповой вариабельности белковых пиков с
помощью
метода
прямого
профилирования
образцов
[Образцова
О.А.,
2013].
Исследование протеома мочи здорового человека в течение длительного промежутка
времени (530 суток) позволило показать, что в образцах постоянно выявлялись 7 белков,
имеющих низкую функциональную связанность между собой. На основании этого можно
предположить, что идентифицированный набор белков может представлять собой
независимые маркеры различных процессов в организме здорового человека.
Помимо анализа протеомного профиля мочи здорового человека в привычных
условиях, проводилась оценка изменений белковой композиции в ответ на изменение
условий жизнедеятельности. Экстремальные условия представляют собой один из
немногих способов, позволяющих вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека,
чтобы распознать механизмы поддержания постоянства состава внутренней среды и
сохранения резервов здоровья, т.е. выявить адаптивный потенциал организма. Для
здорового человека список методов (условий), этически дозволенных и доступных для
воздействий, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короток. Для
понимания того, как формируются физиологические реакции на различные воздействия
необходимо перебросить концептуальные и функциональные мостики от генетики к
белкам, от белков к клеткам, далее к органам, и системам в организме. С другой стороны,
очевидно, что белки, изменение уровня которых наблюдается в экстремальных условиях,
не могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры развития заболеваний,
поскольку они участвуют как в естественном молекулярном ответе организма в процессе
адаптации к изменению условий жизнедеятельности.
Поэтому в ходе данной работе был проведен анализ изменений протеома мочи при
воздействии
длительных
космических
полетов
и
модельных
экспериментов,
имитирующих отдельные эффекты микрогравитации (антиортостатическая гипокинезия,
«сухая» иммерсия), а также условия существования в длительной космической
экспедиции (105 - суточной изоляции в гермообъеме).
213
Анализ данных, полученных в 520-суточной изоляции, показал, что состояние
физиологических систем организма здоровых молодых мужчин систематически и
последовательно изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне
нормального суточного потребления соли в РФ (норма 4-12г/сут.). Кроме того, выявлено,
что белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не возвращается к
фоновым значениям, что указывает на инертность биологических процессов, в которые
вовлечены белки, связанные с регуляцией солевого обмена. Таким образом, эти данные
существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния
различного уровня приема соли (6 – 12 г/сутки) на организм здорового человека.
Было показано, что протеом мочи здорового человека во время его пребывания в
течение 21 суток в антиортостатической гипокинезии при 21-суточном АНОГе
характеризуется определенным дрейфом появляющихся и исчезающих из мочи белков.
При этом, определена значимость появления белков, участвующих в деятельности разных
органов и систем организма: почек, сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем.
В эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией, после идентификации белков,
выполненной по базе данных UniProt КВ и системы ANDSystem, было выявлено 9 белков,
осуществляющих свои функции в сердечно-сосудистой системе, к которым относились
сывороточный
альбумин,
альфа-2-HS-гликопротеин,
цистатин-С,
витамин
D-
связывающий белок, кининоген-1, калликреин-1, перликан, фетуин А, Е–кадхерин. Их
частота выявления в образцах характеризовалась различной динамикой в ходе
эксперимента. Так, белки кининоген 1 и калликреин 1 относятся к калликреин –
кининовой системе, которая вместе с ренин-ангиотензиновой системой регулируют тонус
сосудов и обеспечивают оптимальный уровень оксигенации тканей. Связь между этими
системами осуществляется на уровне проренина, который активируется калликреином, а
также ангиотензин-превращающего фермента, участвующего в деградации брадикинина и
образовании ангиотензина II. В данном исследовании было показано, что через 24 часа
после начала иммерсионного воздействия происходит подавление активности ренинангиотензиновой системы, в частности, вдвое снижается активность ренина плазмы,
повышаются диурез и экскреция натрия. Частота выявления в моче калликреина 1,
снизившись в начале СИ, затем нарастала до 100% и не восстанавливалась до фоновых
значений в течение недели после окончания иммерсии, что согласуется с результатами,
полученными так же в крови. Кроме того, идентифицированы белки, которые
демонстрировали ассоциативную связь с функциями выделительной системы и
чувствительностью к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией
214
встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с
изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.
После завершения продолжительных полетов выявлены специфические белки, они
оказались участниками физиологических процессов, характерных для процессов
адаптации организма человека к микрогравитации и/или реадаптации к земным условиям
жизнедеятельности. Биоинформационный анализ позволил связать хорошо известные и
документированные ранее биологические факты и физиологические особенности
состояния космонавтов в первые сутки после завершения полетов с выявленными в моче
белками, участниками различных биологических процессов, и позволяют более полно
представить механизмы адаптации физиологических систем организма человека в острый
период адаптации к земной гравитации.
Таким образом, изучение физиологических функций, присущих выявленным белкам
может, с одной стороны, подтвердить уже устоявшиеся представления о физиологическом
ответе на воздействие, а с другой - предоставить новую информацию о ранее неизвестных
механизмах адаптивного процесса.
215
5. ВЫВОДЫ
1. Использование высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-массспектрометрии позволяет выявить в моче здоровых лиц сотни различных белков,
принадлежащих большинству тканей организма человека. Вариабельность белкового
состава мочи здорового человека зависит от возраста обследуемого, характера
рациона питания, уровня двигательной активности. Выявлено 23 белка, которые чаще
обнаруживаются в моче с увеличением возраста обследуемых (p<0.05). Отмечается
корреляция между возрастом добровольцев и числом белков (R=0.566; p-value=1.24E05), а также их массой (R=0.429; p-value=0.00079).
2. Во время 520-суточного пребывания добровольцев в контролируемых условиях в моче
постоянно выявлялись 7 белков, синтезируемых преимущественно печенью и
клетками крови.
3. Изменения в уровне солепотребления в физиологическом диапазоне значений
позволили
выявить
21
белок,
достоверно
коррелирующий
с
режимом
солепотребления в контролируемых условиях жизнедеятельности на протяжении 105
суток. Биоинформационный анализ протеомных данных методом построения
самоорганизующихся
карт
показал,
что
эффекты,
вызванные
изменением
солепотребления, проявлялись в изменении активности различных биологических
процессов, протекающих с участием выявленных белков. При потреблении соли 12
г/сут отмечена максимальная активностью синтеза белка (27%), а при 6-9 г/сут
отмечалось снижение на 7% синтеза белка.
4. По данным протеомных исследований мочи, ранний период пребывания в условиях
антиортостатической гипокинезии, активируются процессы свертывания крови,
протеолиза, фибринолиза, регуляции клеточной адгезии и подавляется активность
пролиферации клеток соединительной ткани. В процессе 3-х недельного воздействия
активизируются протеолиз, обмен олигосахаридов, но снижается активность
процессов образования АФК, ангиогенеза, тромбоцитарного гомеостаза, регуляции
АД.
5. В условиях АНОГ в моче выявлено 9 белков – «минорных» участников регуляции
водного баланса организма и 22 белка, участвующих в регуляции костно-мышечной
системы. Большинство из них не исследовались ранее применительно к адаптации
организма. Белковая композиция мочи за неделю восстановительного периода не
возвращалась к фоновым значениям, что указывает на инертность биологических
процессов, в которые были вовлечены данные белки.
216
6. Изменения белкового состава мочи здоровых лиц в условиях «сухой» иммерсии
свидетельствуют о модификации функций почек, а также развитии дисфункции
эндотелия сосудов. В этих условиях выявлено 9 белков, осуществляющих свои
функции в ССС системе.
7. В белковом составе мочи космонавтов после завершения продолжительных полетов
выявлены специфические белки, участвующие в процессах реадаптации к земным
условиям. Биоинформационный анализ позволил связать известные физиологические
особенности состояния космонавтов в первые сутки после завершения полетов с
этими белками.
217
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Агаджанян Н.А. Количественная оценка функционального состояния организма.
Проблемы адаптации и учение о здоровье: учеб. пособие / Н.А. Агаджанян, Р.М.
Баевский, А.П. Берсенева // М.: Изд-во РУДН. - 2006. – С. 145 – 146.
2.
Агрон И.А. База данных по точным массово-временным меткам для хроматомасс-спектрометрического анализ протеома мочи / И.А. Агрон, Д.М. Автономов,
А.С. Кононихин и др. // Биохимия. - 2010. - Т.75. - №4. - С. 598 - 605.
3.
Агуреев А.Н. Разработка и апробация системы обеспечения питанием экипажа
проекта «МАРС-500» / А.Н. Агуреев, Л.А. Сидоренко // Международный
симпозиум по результатам экспериментов, моделирующих пилотируемый полет
на Марс. (МАРС-500). Сборник материалов. – 2012. – С. 5 - 6.
4.
Акбашева
О.Е.
Ингибиторы
протеиназ
в
регуляции
плазменного
и
внутриклеточного протеолиза: автореферат дисс. доктора мед. наук / О.Е.
Акбашева.- Томск. 2011. - 42 c.
5.
Аксенова Т.А. Роль дисфункции эндотелия и вкусовой чувствительности к
поваренной соли в развитии гипертрофии левого желудочка у больных
гипертонической болезнью. / Т.А. Аксенова, В.В.
Горбунов // Сибирское
медицинское обозрение. - 2013. - № 2. - С. 27 - 30.
6.
Алексеев А.В. Современные биомаркеры острого повреждения почек / А.В.
Алексеев, А. Гильманов, А.Ж. Ильманов, Р.С. Гатиятуллина и др. // Вестник
Татарстана . – 2014. – Т. 7 (583). С. 22 - 27.
7.
Алексеенко Л.Л. Реакция стволовых клеток человека на тепловой стресс:
автореферат дисс. канд. биол. наук / Л.Л. Алексеенко.- Санкт-Петербург. 2014. 26 c.
8.
Альфонсов В.В. Влияние гиподинамии на свертывание крови, фибринолиз и
сосудисто-тромбоцитарный гемостаз / В.В. Альфонсов, Е.В. Альфонсова //
Ученые
записки
Забайкальского
государственного
университета.
Серия:
Естественные науки. - 2010. - Вып. № 1. – С. 13 - 19
9.
Аль Касем Амин. Динамика уровня лептина, модулятора роста TGF-B1 и
противовоспалительного цитокина IL-1 в системном кровотоке у больных
псориазом с избыточной массой тела под влиянием системной терапии ожирения
/ Аль Касем Амин // Таврический медико-биологический вестник. – 2012. - Т.15.
- № 2. - С. 14 - 18.
218
10.
Андронов Е.В. Роль оксида азота в регуляции микроциркуляторного звена
системы гемостаза / Е.В. Андронов, В.Ф. Киричук, А.Н. Иванов, Н.В. Мамонтова
// Саратовский научно-медицинский журнал. – 2007. - Т. 3 (17). – С. 39 – 44.
11.
Аронов Д.М. Атеросклероз и коронарная болезнь сердца / Д.М. Аронов, В.П.
Лупанов // М. Триада–Х. Изд. 2–е, переработ. -2009. - 248 с.
12.
Артюхов В.Г. Апоптоз и некроз лимфоцитов, индуцированные ультрафиолетовым
облучением в присутствии аутологичной плазмы / В.Г. Артюхов, О.В.
Земченкова, О.В. Башарина и др. // Цитология. – 2014. - № 1. - С. 77 – 83.
13.
Арутюнян
Т.В.
Действие
гиперсолевой
диеты
на
активность
ангиотензинпревращающего фермента и образование активных форм кислорода в
аорте крыс / Т.В. Арутюнян, А.Ф. Корыстова, Л.Н. Кублик и др. // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - № 12. - С. 723 - 728.
14.
Афанасьев М.А. Эффекты реальной и моделируемой микрогравитации на
некоторые структурно- метаболические параметры скелетных мышц / М.А.
Афанасьев, С.Л. Кузнецов // Вестник РАМН. – 2013. - № 1. – С. 47 – 51.
15.
Афонин Б.В. Влияние космических полетов и условий антиортостатической
гипокинезии различной продолжительности на концентрацию инсулина в крови. /
Б. В. Афонин // Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1989. - Т.
23 - № 3. - С. 77 - 79.
16.
Афонин Б.В. Система пищеварения. Послеполетные клинико-физиологические
исследования Орбитальная станция «Мир» / Б.В. Афонин // М.: Аником, - 2001. Т. 1. - С. 620 - 628.
17.
Афонин Б.В. Изменения толерантности к глюкозе и состояния пищеварительной
системы при длительном пребывании в условиях гермообъекта орбитальной
станции. Модельный эксперимент с длительной изоляцией: проблемы и
достижения / Б.В. Афонин., И.А. Ничипорук, А.М. Зякун и др. // М.: Слово. - 2001.
- C. 238 - 251.
18.
Бабиченко
И.И.
Новые
методы
иммуногистохимической
диагностики
опухолевого роста / И.И. Бабиченко, В.А. Ковязин // Учеб. пособие. М. РУДН. 2008. – 109 с.
19.
Бабкин А.П. Роль поваренной соли в развитии артериальной гипертензии / А.П.
Бабкин, В.В. Гладких // Международный медицинский журнал. Клиника.
Диагностика. Лечение. -2009. - № 3. - С. 40 - 45.
20.
Баевский Р.М. Вегетативный баланс и адаптация к условиям длительного
космического полета по данным 24-часового мониторирования сердечного ритма
219
/ Р.М. Баевский, В.В. Богомолов, А.Л. Гольдбергер и др. //Авиакосмическая и
экологическая медицина. – 2000. - №1. - С. 23 - 26.
21.
Баевский Р.М. Концепция физиологической нормы и критерии здоровья / Р.М.
Баевский // Российский физиологический журнал. - 2003. - № 4. - С. 473 – 487.
22.
Баевский Р.М. Проблема оценки и прогнозирования функционального состояния
организма и ее развитие в космической медицине / Р.М. Баевский // Успехи
физиологических наук. - 2006. - № 3. - С. 42 - 57.
23.
Баевский Р.М. Исследования вегетативной регуляции кровообращения в условиях
длительного космического полета / Р.М. Баевский, Е.С. Лучицкая, И.И. Фунтова и
др. // Физиология человека. - 2013. - № 5. - С. 42 - 52.
24.
Барабой В.А. Биоантиоксиданты / В.А. Барабой // Киев. Книга плюс. - 2006. - 462
с.
25.
Баранов А.А. Протокол ведения пациентов с ювенильным артритом / А.А.
Баранов, Е.И. Алексеева, Т.М. Базарова и др. // Вопросы современной педиатрии.
- 2013 – Т. 12 (1). – С. 37 - 56.
26.
Баринов Э.Ф. Гастроинтестинальные миофибробласты – роль в регуляции
физиологической активности и репарации желудочно-кишечного тракта / Э.Ф.
Баринов, О.Н. Сулаева // РЖГГК. - 2010. - Т. 20. - №3. - С. 9 - 18.
27.
Баркаган З.С. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза / З.С
Баркаган, А.П. Момот // Издание 3-е.М.: "Ньюдиамед".- 2008. - 292 с.
28.
Батюшин М.М. Поражение почек при эссенциальной артериальной гипертензии /
М.М. Батюшин, И.М. Кутырина, С.В. Моисеев с соавт. // Глава в книге
«Нефрология. Национальное руководство» под редакцией Н.А. Мухина - М.
ГЭОТАР-Медиа. - 2009.- С. 434 - 446.
29.
Белова О.В. Роль цитокинов в иммунологической функции кожи. / Белова О.В.,
Арион В.Я., В.И. Сергиенко //Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008. - №1. - С. 41-55.
30.
Бельтюков
П.П.
Состояние
системы
комплемента
человека
после
протеолитической обработки in vitro / П.П. Бельтюков, Л.В. Галебская, Н.Б.
Симкина // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. - 2003. - Т. 44. № 1. – С. 24 - 27.
31.
Биохимия. Учеб. для вузов. Под ред. Е.С. Северина. - 5-е изд., испр. и доп. / Е.С.
Северина. - М. ГЭОТАР - Медиа. - 2013. - 768 с.
220
32.
Бышевский А.Ш. Связь гемостаза с перекисным окислением липидов / А.Ш.
Бышевский, М.К. Умутбаева, Р.Г. Алборов / А.Ш. Бышевский.- М. Мед. Книга. 2003. - 96 с.
33.
Буйлов С.П. Изучение влияния 105-суточной изоляции в гермообъеме на
функциональное
состояние
сердечно-сосудистой
системы
испытателей-
добровольцев / С. П. Буйлов, Ю.И. Воронков, М. А. Скедина и др. //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2010. - Т. 44. - № 4. - С. 27 - 30.
34.
Буравкова Л.Б. Особенности метаболизма у человека при выполнении физической
нагрузки после 7-суточной «сухой» иммерсии / Л.Б. Буравкова, И.М. Ларина, И.А.
Попова // Физиология человека. - 2003. – Т. 29. - №5. – С. 82 - 89.
35.
Быстров В.В. Деятельность сердца человека в первые часы и сутки пребывания в
условиях антиортостатической гипокинезии / В.В. Быстров, А. Ф. Жернавков,
А.А. Савилов // Космическая биол. и авиакосм. мед. - 1986. - Т. 20. - №2. - С. 42 46.
36.
Бышевский А.Ш. Щитовидная железа, гемостаз и перекисное окисление липидов /
А. Ш. Бышевский // Забайкальский медицинский вестник. - 2004. С. 24 - 28.
37.
Вайсерман А.М. Радиационный гормезис в экспериментальных исследованиях /
А.М. Вайсерман, Н.М. Кошель, Л.В. Мехова и др. // Медицинская радиология и
радиационная безопасность. – 2011. - Т. 56. - № 4. - С. 5 - 16.
38.
Валеева О.А. Вариабельность протеома мочи здорового человека в эксперименте
со 105-суточной изоляцией в гермообъекте / О. А. Валеева, Л.Х. Пастушкова, Н.А.
Пахарукова и др. // Физиология человека. - 2011. - Т. 3. - №3. - С. 98 – 102.
39.
Валюшкина М.П. Влияние содержания О2 в среде на мультипотентные
мезенхимальные клетки-предшественники костного мозга разновозрастных крыс /
М. П. Валюшкина, Л.Б. Буравкова // Медицинский академический журнал. – 2012.
- Т. 12. - № 3. - С. 57 - 59.
40.
Вандер А. Физиология почки / А. Вандер. 5-е изд., пер. с англ.. «Питер» 2000. –
256 с.
41.
Варга О.Ю.
Активность
апоптоза
лимфоцитов
при
хроническом
гломерулонефрите / О.Ю. Варга, Л.М. Хейфец, Т.О. Волкова, М.М. Кручек //
Нефрология и диализ. -2006. -Т. 8. - №2. - С. 151 - 157.
42.
Васильев П.В. Длительные линейные и радиальные ускорения. Основы
космической биологии и медицины / П.В. Васильев, А. Р. Котовская, О.Г. Газенко
и др. // ред. М. - 1975. - T. 2. Кн.1. - С. 177 - 232.
221
43.
Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо. Ч.1. Живые нити / Ю. М.
Васильев // Соровский общеобразов. журн. 1996. №2, С. 36-43.
44.
Введение в молекулярную диагностику / Под ред. М.С. Пальцева. М.: Медицина. 2010. - 368 с.
45.
Вельков В.В. NGAL-«Ренальный тропонин», ранний маркер острого повреждения
почек: актуальность для нефрологии и кардиохирургии / В. В. Вельков // Научнопрактический журнал «Клинико-лабораторный консилиум». - 2011. - №2. - С. 90 100.
46.
Ветрова Е.Т. Влияние клиностатической и антиортостатической гипокинезии на
активность ферментов сыворотки крови / Е. Т. Ветрова, Т. Е. Дроздова, И. А.
Попова // Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1988. - Т. 22. - №
4. - С. 70 - 73.
47.
Визир
В.А.
Клиническое
значение
терапевтического
синергизма
антигипертензивных лекарственных средств и статинов/ В.А. Визир, А.Е. Березин
/ Конспект кардиолога. Часть 1. Клиника, диагностика, лечение (хроническая
сердечная
недостаточность,
хроническое
легочное
сердце,
артериальная
гипертензия) // Донецк. Издатель Заславский А.Ю. - 2010. - С. 59 – 71.
48.
Висмонт Ф.И. Воспаление (патофизиологические аспекты, учеб. метод. пособие /
Ф. И. Висмонт.- Мн. БГМУ. - 2006. – 48 с.
49.
Волков В.П. К вопросу о силе влияния нейролептиков на функциональную
морфологию эндокринных желез / В.П. Волков // Universum. Медицина и
фармакология.
Электрон.
научн.
журн.
-
2014.
-
№
10
(11).
URL:
http://7universum.com/ru/med/archive/item/1645.
50.
Волков Н.М. Физиология метаболизма костной ткани и механизм развития
метастазов в кости / Н. М. Волков // Практическая онкология. – 2011. - Т. 12. - №3.
- С. 97 - 102.
51.
Виллевальде С.В. Цистатин С как новый маркер нарушения функции почек и
сердечно-сосудистого русла / С.В. Виллевальде, Н.И. Гудгалис, Ж.Д. Кобалава //
Кардиология. - 2010. – Том 50. – N. 6. - С. 78 - 82.
52.
Волосовец А.П. К вопросу о роли цинка в клинической педиатрии. / А.П.
Волосовец, С.П. Кривопустов, Е.Ф. Черний и др. // Журнал «Дитячий лікар» 2012. -№5. - С. 37 - 39.
53.
Воробьев Д.В. Особенности реакций гипофизарно-надпочечниковой системы у
мужчин и женщин в условиях длительной антиортостатической гипокинезии /
Д.В. Воробьев, И.М. Ларина, А.Г. Гончарова // Тезисы докладов XI конференции
222
по космической биологии и авиакосмической медицине. Москва. 22-26 июня 1998
года. - Т.1. - С. 174.
54.
Воронцов А.Л. Белковый состав мочи у человека в условиях 5-суточной иммерсии
/ А.Л. Воронцов, А.Ю. Нестеровская, Б.В. Моруков и др. // Авиакосмическая и
экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - № 6. - С.18 - 21.
55.
Воронцов А.Л. Использование метода электрофореза белков нативной мочи в
дифференциальной
диагностики
нефропатий
/
А.
Л.
Воронцов,
А.Ю.
Нестеровская, Л.А. Потапова // Нефрология и диализ. - 2005. - Т. 7. - № З. - С. 1216.
56.
Гаевская М.С. Влияние гипокинезии на белковый состав скелетных мышц / М. С.
Гаевская, Л. М. След, Н. Д. Илюшко // Косм. биол. и мед. – 1970. - Т. 4. - М. - С.
25 - 29.
57.
Газенко О.Г. Водно-солевой гомеостаз и невесомость / О.Г. Газенко, А.И.
Григорьев, Ю.В. Наточин // Косм. биол. и авиакосм. медицина. - 1980. - Т. 14. №5. - С. 3 - 10.
58.
Газенко
О.Г.
Медицинские
исследования
по
программе
длительных
пилотируемых полетов на орбитальном комплексе "Салют-7" "Союз-Т" / О.Г.
Газенко, А.И. Григорьев, А.Д. Егоров // Космич. биология
и авиакосмич.
медицина. - 1990. - 24. - № 2. - С. 9 - 15.
59.
Гапеенко Е.В. Уровень опухолевых маркеров, факторов роста, регуляторов
неоангиогенеза у больных раком молочной железы / Е.В. Гапеенко, Л.А.
Державец // Здравоохранение. - 2011. - № 4. - С. 31 - 33.
60.
Гарбузенко Д.В. Механизмы адаптации сосудистого русла к гемодинамическим
нарушениям при портальной гипертензии / Д.В. Гарбузенко // Вестник
Российской Академии медицинских наук. – 2013. - № 1. - С. 52 - 57.
61.
Гасанов
А.Г.
Роль
изменений
внеклеточного
матрикса
при
возникновении сердечно-сосудистых заболеваний / А.Г. Гасанов,
Т.В. Бершова // Биомедицинская химия. - 2009. - № 2. - С.155 – 167.
62.
Гершович
П.М.
Влияние
моделирования
эффектов
микрогравитации
на
цитоскелет и экспрессию генов у мезенхнмальных стромальных клетокпредшественников костного мозга человека in vitro. автореферат диссертации на
соискание ученой степени кандидата биологических наук / П.М. Гершович. -2010.
- 25с
223
63.
Говорун В.М. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке.
Обзор / В. М. Говорун, А. И. Арчаков // Биохимия. - 2002. - Т: 67.- № 10. - С. 1341
- 1359.
64.
Говорун В.М. Протеомика и пептидомика в фундаментальных и прикладных
медицинских исследованиях / В.М. Говорун, В.Т. Иванов // Биоорганическая
химия. - 2011. - Т. 37, № 2. - С. 199 - 215.
65.
Григорьев А.И. Осморегулирующая функция почек при иммерсии / А. И.
Григорьев // Физиологический журнал СССР. - 1978. - Т. 4. - № 3. - С. 389 – 397.
66.
Григорьев А.И. Водно-солевой обмен и функция почек. Результаты медицинских
исследований,
выполненных
на
орбитальном
научно-исследовательском
комплексе «Салгот-6 — Союз» / А.И. Григорьев, A.C. Ушаков, И.А. Попова и др.
// Москва. Наука. - 1986. - С. 145 - 162.
67.
Григорьев А.И. 370-суточная
антиортостатическая
гипокинезия
(задачи и
общая структура исследования) / А. И. Григорьев, Б. В.Моруков // Космическая
биол. и авиакосм. мед. - 1989. - Т.23. - №5. – С. 47 - 50.
68.
Григорьев А.И. Минеральный обмен у человека в условиях измененной
гравитации / А. И. Григорьев,
А. И. Воложин, Г.П. Ступаков // Проблемы
космической биологии. - М.: Наука. - 1994. - Т. 74. - 216 с.
69.
Григорьев А. И. Теория и практика медицинского контроля в длительных полетах
/ А. И. Григорьев, А. Д. Егоров // Авиакосмическая и экологическая медицина. –
1997. - № 1. - С.14 - 25.
70.
Григорьев А.И. Содержание соматотропина и других регуляторов мышечного
метаболизма в крови человека при длительных космических полетах и
гипокинезии / А. И. Григорьев, И. М. Ларина // Физиология человека. - 1999. - Т.
25. - №4. - С. 89 - 96.
71.
Григорьев А. И. Водно-солевой обмен и функции почек у человека при
длительной гипокинезии / А. И. Григорьев, И. М. Ларина // Нефрология. - 2001. № 3. - С.7 - 18.
72.
Григорьев А.И. Роль опорной афферентации в организации тонической мышечной
системы / А. И. Григорьев, И. Б. Козловская, Б. С. Шенкман // Российский
физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2004. - Т. 90. - № 5. - С. 507 - 521.
73.
Григорьев А.И. Влияние космических полетов на состояние и регуляцию водно электролитного обмена / А. И. Григорьев, И. М. Ларина, В. Б. Носков // Рос.
физиол. журнал им. И.М. Сеченова. - 2006. - Т. 92. - №1. – С. 5 - 17.
224
74.
Григорьев А.И. Концепция здоровья и космическая медицина / А. И. Григорьев,
Р. М. Баевский // M. Слово. - 2007. – 208 С.
75.
Григорьев А.И. Скелетные мышцы в безопорном пространстве / А. И. Григорьев,
Б. С. Шенкман // Вестник Российской академии наук. - 2008. - Т.78. - № 4. - С. 337
- 345.
76.
Громова Л.В. Относительная роль различных механизмов всасывания глюкозы в
тонкой кишке при физиологических условиях / Л. В. Громова, А. А. Груздков //
Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. – 1993. - Т. 79. - № 6. - С. 65 - 72.
77.
Громова О.А. Применение магния в зеркале доказательной медицины и
фундаментальных исследований в терапии / О. А. Громова, И. В. Гоголева //
Трудный пациент. - 2007. - Т.146 (12). - С. 104 - 110.
78.
Гомазков О.А. Старение мозга и нейротрофическая терапия. Монография / О. А.
Гомазков // М. ИКАР. - 2011. - 92 с.
79.
Гордеева О.Б.
Современные возможности дифференциальной диагностики
анемических синдромов у детей / О. Б. Гордеева // Астраханский медицинский
журнал. Научно-практический медицинский журнал. – 2013. - Т. 8. - № 2. – С. 14 18.
80.
Гусева Е.В.
Влияние 49-суточного космического полета на показатели
иммунологической реактивности и белковый состав крови экипажа «Салют-5» / Е.
В. Гусева, Р. Ю. Ташпулатов // Космическая биология и авиакосмическая
медицина. - 1979. - Т. 13. - №1. - С. 3 - 8.
81.
Гусева Е.В. Влияние полетов различной продолжительности на белковый состав
крови космонавтов / Е. В. Гусева, Р. Ю. Ташпулатов // Космическая биология и
авиакосмическая медицина. - 1980. - Т. 14. - №1. - С. 13 - 17.
82.
Дедов И.И. Сахарный диабет и антагонисты АТ1-рецепторов: в поисках золотого
ключика / И.И. Дедов, А.А. Александров // Рус. Мед. Журн. - 2005. – 11. – С. 1116.
83.
Дедов И.И. Возрастной андрогенный дефицит у мужчин / И.И. Дедов, С. Ю.
Калинченко // М. Практическая медицина. - 2006. - 240 с.
84.
Дедов И.И. Руководство по детской эндокринологии / И.И. Дедов, В.А.
Петеркова // М.: Универсум Паблишинг. - 2006. - 600 с.
85.
Демьяненко А.В. Роль генетического полиморфизма компонентов плазменного
звена гемостаза в патогенезе венозного тромбоэмболизма (обзор литературы) /
А.В. Демьяненко, С.И. Капустин, В.В. Сорока и др. // Гематология. – 2013. - Т.14.
- С. 819 - 844.
225
86.
Джагаров Д.Э. Экзосомы — бутылочная почта организма / Д. Э.
Джагаров // Химия и жизнь. – 2013. - №6. – С. 6 - 9.
87.
Дильман В.М. Четыре модели медицины / В. М. Дильман // Медицина. - 1987. 288 С.
88.
Доброгорская Я.И. Моделирование реакции ацилирования субстрата в активном
центре сериновых
протеаз / Я.И. Доброгорская, А.В. Немухин // Вестник
Московского Университета. Сер.2. Химия. - 2003. - Т. 44, - №2. - С. 103 - 107.
89.
Долганова Т.И. Функциональное состояние и обмен основных электролитов у
человека при гипокинезии (обзор литературы) / Т. И. Долганова, С.Н. Лунева,
В.В. Колчерина // Современные наукоемкие технологии. - 2008. - № 11. С. 6 – 10.
90.
Драгунов Д.О. Натрийурез у больных с гипертонической болезнью I и II стадии,
осложненной хронической сердечной недостаточностью.: автореф. дисс. канд.
мед. наук / Д.О. Драгунов.- Москва. 25 с.
91.
Дурнова Г.Н. Возрастные особенности развития остеопений у крыс при дефиците
опорных нагрузок на задние конечности / Г.Н. Дурнова, В.И. Алексеев, А.С.
Логинов и др. // Авиакосм. и эколог. медицина. - 2001. - Т. 35.- № 1. - С. 24 - 28.
92.
Евдокимов В.В. Особенности сперматогенеза в условиях длительной изоляции /
В.В. Евдокимов, А.В. Сивков, В. И. Ерасова и др. // Экспериментальная и
клиническая урология. – 2010. - №1. С. 56 – 58.
93.
Ельников Р.С. Протективные эффекты метионина и витаминов, участвующих в
обмене сульфгидрильных и метильных групп, при токсическом поражении
печени / Р.С. Ельников, М.Ю. Смахин, Н.А. Быстрова // Курский научнопрактический вестник "Человек и его здоровье". – 2011. - Вып. № 3. - С. 20 - 23.
94.
Ералиев А.Р. Роль нейтрофильного желатиназо-ассоциированного липокалина в
диагностике
заболеваний
почек / А.Р. Ералиев, Д.М. Демеубаева, А.Е.
Наушабаева и др. // Клиническая нефрология. - 2013. - № 4.- С. 57 – 61.
95.
Ерофеев Н.П. Клиническая физиология толстой кишки. Механизмы действия
коротко - цепочечных жирных кислот в норме и при патологии / Н. П. Ерофеев,
В.Г. Радченко, П.В. Селиверстов // Монография. – СПб. Форте Принт. - 2012. - 56
С.
96.
Ефременко Ю.Р. Состояние системы протеолиза в условиях окислительных
воздействий
на
организм
/
Ю.Р.
Ефременко,
К.Н.
Конторщикова
Нижегородский медицинский журнал. – 2003. - № 1. - С. 22 - 26.
//
226
97.
Ешманова А.К. Вариабельность сердечного ритма и состояние миокарда при
воздействии «сухой» иммерсии.: автореферат дисс. канд. медиц. наук / А. К.
Ешманова Москва. - 2009. – 25 с.
98.
Жалялов А.С. Экспериментальное исследование пространственной динамики
фибринолиза in-vitro в присутствии урокиназы и стрептокиназы / А.С. Жалялов //
Ученые записки физического факультета. - 2012.- Т. 2. - С. 122702 - 122705.
99.
Жерносеков Д.Д. Роль плазминоген/плазмина в функционировании клеток крови /
Д.Д. Жерносеков, Е.И. Юсова, Т.В. Гриненко //Укр. біохім. журн. – 2012. - Т. 84. № 4. - С. 5 - 19.
100.
Жирнова О.А. Неинвазивная диагностика нарушения эластических свойств
артериальных сосудов / О.А. Жирнова, Н. Ф. Берестень, О. Р. Пестовская, Е. Я.
Богданова // Электронный журнал ANGIOLOGIA.ru. – 2011. - №1. - С. 18 – 25.
101.
Журавлева О.А. Интенсивность перекисного окисления липидов и состояние
системы антиоксидантной защиты в
реадаптационном
периоде после
длительных полетов на международной космической станции / О.А. Журавлева,
Б.В. Моруков, А.А. Маркин и др. // Физиология человека. - 2011. - Т. 37. - N 3. - С.
92 - 97.
102.
Журавлева О.А. Особенности процессов липопероксидации и реакций системы
антиоксидантной
защиты
у
космонавтов
после
полетов
различной
продолжительности:. автореферат дисс. канд мед. наук. / О.А. Журавлева/ Москва. - 2011. – 25 с.
103.
Загребельный С.Н. Количественные методы определения белка / С. Н.
Загребельный, В.И. Пупкова // Рукопись, депонирована от 1.02.84 N174 МБ-Д84.
Новосибирск. - 1983. - 90 с.
104.
Зайцева Н.С. Влияние гиперосмотического воздействия на внутриклеточную
сигнальную
систему
Nrf2/Keap1/ARE
в
кератиноцитах
человека.
Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов /
Н.С. Зайцева, А.В. Чечушков В.О. Ткачев // Материалы Шестой Всероссийской
научно-практической конференции. Новосибирск. - 2013. - С. 56 - 57.
105.
Замай Т.Н. Ионный механизм регуляции роста популяций нормальных и
опухолевых клеток в организме.: автореф. дисс. доктора биолог. наук / Т.Н.
Замай.- Новосибирск 2011. – 42 c.
106.
Замолодчикова Т.С. Сериновые протеазы в иммунной защите тонкого кишечника
/ Т.С. Замолодчикова // Биохимия. - 2013. -№ 3. - С. 293 - 302.
227
107.
Земченков
А.Ю.
Активаторы
рецепторов
витамина
D
и
сосудистая
кальцификация / А.Ю. Земченков, Р.П. Герасимчук // Нефрология и диализ. 2009. - №4. - С. 276 - 292.
108.
Зилва Дж. Ф. Клиническая химия в диагностике и лечении / Дж. Ф. Зилва, П.Р.
Пэннелл, Т.Т. Березов // М.: Медицина. - 1988. - 528 с.
109.
Зимницкий А.Н. Гликозаминогликаны в биохимических механизмах адаптации
организма к некоторым физиологическим и патологическим состояниям / А.Н.
Зимницкий, С.А. Башкатов // М.: Фармацевтический Бюллетень. - 2004. – 235 с.
110.
Знаменская Л.Ф. Протеомные технологии в изучении патогенеза псориаза / Л.Ф.
Знаменская // Вестник дерматологии и венерологии. 2011. – 3. – С. 27 – 33.
111.
Зорина О.А. Взаимосвязь полиморфизма генов с риском развития агрессивного
пародонтита / О.А. Зорина, О.А. Борискина, Д.В. Ребриков // Стоматология. 2013.- № 4. - С. 28 - 30.
112.
Иванов Г.Г. Показатели дисперсионного картирования ЭКГ при воздействии 5суточной «сухой» иммерсии / Г.Г. Иванов, Р. М. Баевский, Е.Ю. Берсеньев и др //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - №6. - С.44 - 47.
113.
Иванов Г.Г. Дисперсионное ЭКГ-картирование: теоретические основы и
клиническая практика / Г.Г. Иванов, А. С. Сулла // М. Техносфера, - 2009. - 192 с.
114.
Иванова Л.Н. Натрийдепонирующая функция кожи у белых крыс / Л.Н. Иванова,
В.К. Арчибасова, И.Ш. Штаренталь // Физиолог. жур. СССР им. И.М. Сеченова. 1978. - Т. - 64. - №.3. - С. 280 - 295.
115.
Иванова С.М. Система крови в условиях космических полетов и после их
завершения / С.М. Иванова // В кн. Орбитальная станция «МИР». – 2002. - Т. 2. С. 159 - 196.
116.
Иванова С.М. Морфофункциональные свойства клеток красной крови и
интенсивность эритропоэза при 105-суточной изоляции / С.М. Иванова, Б.В.
Моруков, Ю.В. Ярлыкова и др. // Авиакосм, и экол. Мед. - 2010. -Т. 44. -№4. - С.
35 - 39.
117.
Ильин В.К. Изучение характера изменения микрофлоры человека в условиях 520суточной изоляции. Международный симпозиум по результатам экспериментов,
моделирующих пилотируемый полет на Марс (Марс-500) / В.К. Ильин, Л.Н.
Мухамедиева, З.О. Соловьева и др. // Сборник материалов. М. Воронеж: Научная
книга. – 2012. - С. 26.
118.
Ильин Е.А. Сравнительный анализ изменений, развивающихся у крыс в
невесомости и при вывешивании в антиортостатическом положении / Е.А. Ильин,
228
А.С. Капланский // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 1998. - Т. 32. №6. - С. 43 - 50.
119.
Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология рака
желудка / Е.Н. Имянитов //
Практическая онкология. – 2009. - Т. 10. - №1. - С. 1 - 10.
120.
Каландаров С.К. Влияние искусственной среды обитания гермообъектов на
некоторые показатели обмена веществ у человека / С.К. Каландаров, В.А.
Коршунова, Г.И. Проскурова // Космическая биология и авиакосмическая
медицина. - 1986. - Т. 20. - № 10. - С. 343 - 344.
121.
Каплунова В.Ю. Вопросы этиологии, патофизиологии и вариантов течения
гипертрофической кардиомиопатии / В.Ю. Каплунова, Ю.Н. Беленков, Е.В.
Привалова и др. // Сердечная недостаточность. — 2013. — Том 14. — №3. — C.
141 – 148.
122.
Катков В.Е. Влияние кратковременной антиортостатической гипокинезии на
давление в различных отделах сердечно-сосудистой системы здорового человека /
В.Е. Катков, В.В. Честухин, О.Х. Зыбин и др. //Космическая биол. и авиакосм.
мед. - 1979. - Т. 13. - №3. - С. 62 - 67.
123.
Ким Ю.В. Методы определения концентрации белка в моче / Ю.В. Ким, А.Н.
Шибанов // Лабораторная медицина. – 2005. - №7. - С. 59 - 64.
124.
Киричук
В.Ф.
Влияние ингибитора NO-синтазы L-NAME и
облучения
электромагнитными волнами терагерцевого диапазона на частотах молекулярного
спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176 – 150,664 ГГц на
системную
гемодинамику
крыс-самцов,
подвергнутых
острому
иммобилизационному стрессу / В.Ф. Киричук, А.Н. Иванов, Т.С. Великанова и др.
// Биомедицинская радиоэлектроника. -2011. -№1. - С. 19 – 24.
125.
Киреев К.С. Белки почек и мочевыводящей системы в протеоме мочи здорового
человека после длительного космического полёта.: автореф. дисс. канд. мед. наук
/ К.С. Киреев – Москва. 2013. – 26 с.
126.
Климанцев И.В. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани и
плацентарная недостаточность / И.В. Климанцев, М.И. Кесова, О.В. Болотова и
др. // Мать и дитя: Матер. X Юбил. Всеросс. форум. – М. - 2009. – С. 90 - 91.
127.
Климовицкий В.Г. Механизмы влияния мезенхимальных стволовых клеток на
репаративный остеогенез / В.Г. Климовицкий, В.К. Гринь, В.М. Оксимец и др. //
Журнал «Травма». - 2009. – Т. 10, № 2. - С. 123 - 133.
229
128.
Князькова И.И. Контроль артериального давления у больных артериальной
гипертензией с сахарным диабетом / И.И. Князькова // Клінічна фармакологія. 2014. - №2 (178). - С. 62 - 67.
129.
Князькова И.И. Дефицит андрогенов и кардиоваскулярный риск / И.И. Князькова
// «Здоровье Украины», тематический выпуск. – 2012. - №6. - С. 48 – 49.
130.
Коваленко Е.А. Гипокинезия / Е.А. Коваленко, Н.Н. Гуровский // М. Медицина. 1980. – 308 с.
131.
Кобалава Ж.Д. Роль цистатина С в оценке взаимосвязи функционального
состояния почек и воспаления у больных артериальной гипертонией и диабетом 2
типа / Ж. Д. Кобалава, В.В. Толкачева, С.В. Виллевальде и др. // Клиническая
фармакология и терапия. - 2009. - № 1. - С. 21 - 25.
132.
Кожевникова М.В. Влияние регуляторов ренин-ангиотензин-альдостероновой
системы и системы матриксных металлопротеиназ на формирование клинических
вариантов течения гипертрофической кардиомиопатии.: автореф. дисс. канд. мед.
наук / М.В. Кожевникова. Москва - 2014 – 25 с.
133.
Козлов А.А. Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования
плазменного гемостаза / А.А. Козлов, А. Л. Беркович, Н.Д. Качалова и др. //
Российская академия медицинских наук, Москва. - 2006. – 24 с.
134.
Козлов А.В. Концентрация белка в моче: мифы и реальность / А.В. Козлов, Е.С.
Ларичева // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. – 2012. - №3. - С.
28 - 33.
135.
Козловская И.Б. Фундаментальные и прикладные задачи иммерсионных
исследований / И.Б. Козловская //Авиакосмическая и экологическая медицина. 2008. - Т.42. - №5. - С. З - 7.
136.
Коноплева Л.Ф. Эндотелиальная дисфункция в патогенезе сердечно-сосудистых
заболеваний и методы ее коррекции / Л.Ф. Коноплева // Therapia. - 2011. -№ 3
(56). С. 26 - 30.
137.
Константинова И.В. Иммунная резистентность человека в течение длительной
изоляции / И.В. Константинова, Е.Н. Антропова, Д.О. Мешков и др.
//Авиакосмическая и экологическая медицина. - 1997. - Т. 31. - №4. - С. 57 - 60.
138.
Константинова И.В. Космические полеты человека и иммунная система:
Кратковременные полеты. Иммунная система в экстремальных условиях / И.В.
Константинова // Космическая иммунология. М. Наука. - 1988. - С. 104 - 124.
139.
Корнилова Л.Н. Влияние длительного пребывания в условиях микрогравитации на
вестибулярную функцию и следящие движения глаз / Л.Н. Корнилова, М.И.
230
Алехина, В.В. Темникова и др. // Физиология человека. - 2006. - Т. 32. - № 5. - С.
56 - 64.
140.
Королев В.Г. Хроматин и репарация ДНК / В.Г. Королев // Генетика. - 2011. - Т.
47. - № 4. - С. 449 – 459.
141.
Кособокова Е.Н. Слитные белки на основе антител и цитокинов: получение,
функциональность и перспективы применения в онкологии / Е.Н. Кособокова,
В.С. Косоруков, А.Ю. Барышников // СТМ. - 2013 – Т. 5. - №4. - С. 102 - 111.
142.
Котовская А.Р. Длительные линейные ускорения / А. Р. Котовская, Р. А.
Вартбаронов // Космическая биология и медицина. Совместное российскоамериканское издание в пяти томах / О.Г. Газенко, А.И. Григорьев (Россия), А.Е.
Никогосян, С.Р. Молер (США). М. - 1997. - Т.3. Кн. 2. - С. 10 -67.
143.
Котовская А.Р. Проблема искусственной гравитации: состояние и перспективы /
А.Р. Котовская //Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2008. - № 6. – С.
74 - 83.
144.
Кришталик Л.И. Белки как специфическая полярная среда процессов переноса
заряда / Л. И. Кришталик // Успехи физических наук. - 2012. - Т. 182. - № 12. - С.
1275 - 1300.
145.
Крылов М.Ю. Полиморфизм A19G гена лептина и полиморфизмы GLN223ARG и
LYS109ARG гена рецептора лептина при постменопаузальном остеопорозе /
М.Ю. Крылов, Л.И. Беневоленская, В.А. Мякоткин // Научно-практическая
ревматология. - 2010. - № 5. - С. 27 - 31
146.
Кузичкин Д.С. Влияние факторов космического полета и моделирования их
физиологических эффектов на основные звенья системы гемостаза человека:
автореф. дис. канд. биол. наук / Д.С. Кузичкин.- Москва. 2010 – 24 с.
147.
Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы ругуляции системы гемостаза
в норме и патологии: монография / Б.И. Кузник // Чита: Экспресс-издательство. 2010. - 832 с.
148.
Кузнецова Е.П.
Селезенка: онтогенез и старение / Е. П. Кузнецова, Н. С.
Линькова, А. В. Дудков и др. // Геронтология. Научно-практический журнал. –
2013. - Т. 1. - № 2. - С. 135 – 144.
149.
Кузнецова И.М. Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков / И. М.
Кузнецова, В. Форже, К.К.Туроверов // Цитология. – 2005. - Т. 47 (11). – С. 943 952.
150.
Куликова К.В. Значение сигнального пути Wnt для развития меланомы / К.В.
Куликова, А.В. Кибардин, Н.В. Гнучев и др. // СТМ. – 2012. - № 3. - С.107-112.
231
151.
Кулинский В.И. Система глутатиона. II. Другие ферменты. Тиол-дисульфидный
обмен. Воспаление и иммунитет, функции / Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.
// Биомедицинская химия. – 2009. – Т. 55. Вып. 4.- С. 365-379.
152.
Курило Л.Ф. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам эякулята. /
Курило Л.Ф., Дубинская В.П., Остроумова Т.В. и др. // Проблемы репродукции. 1995. - Т. 1. - № 3. - С. 33-36.
153.
Лазебник Л.Б. Возрастные изменения печени (клинические и морфологические
аспекты) / Л. Б. Лазебник, Л. Ю. Ильченко // Клиническая геронтология. - 2007. №2. - С. 3 - 9.
154.
Ларина И.М. Циркадианные ритмы минералотропных гормонов человека во
время продолжительной антиортостатической гипокинезии / И.М. Ларина, Б. В.
Моруков, А. И. Григорьев // Физиология человека. – 1999. – Т. 25. - №6. – С. 89 95.
155.
Ларина И.М. Механизмы ранних реакций водно-электролитного обмена у
человека в различных наземных моделях эффектов микрогравитации / И. М.
Ларина, Ю. В. Суханов, Н. Г. Лакота // Авиакосмическая и экологическая
медицина. - 1999. - Т. 33. - № 4. - С.17 - 23.
156.
Ларина И.М. Гормональные механизмы обеспечения мышечной работы во время
длительной антиортостатической гипокинезии / И. М. Ларина, И. А. Попова, В.
М. Михайлов и др. //Физиология человека. - 1999. - Т. 25. - №3. - С. 117 - 124.
157.
Ларина И.М. Закономерности адаптации гормональных систем организма
человека к условиям микрогравитации: автореф. дис. докт. биол. наук / И.М.
Ларина. – Москва. 2000. - 51 с.
158.
Ларина И.М. Гормональная регуляция. Послеполетные клинико-физиологические
исследования / И. М. Ларина // Орбитальная станция «Мир». М.: Аником. - 2001. Т. 1. - С. 603 - 606.
159.
Ларина И.М. Изучение температурного гомеостаза в реальной и моделируемой
невесомости / И.М. Ларина, Н.Г. Лакота // Физиология человека. - 2002. - № 3. - С.
82 - 92.
160.
Ларина И.М. Орбитальная станция МИР. Обмен белка во время и после
длительного космического полета / И.М. Ларина, Т. Р. Стейн, М. Дж., Лескив и
др. //M. Аником. - 2002. – 2. - С. 114 – 121.
161.
Ларина И.М. Гормональная регуляция обмена веществ организма человека в
условиях микрогравитации и при моделировании ее физиологических эффектов /
232
И.М. Ларина // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2003. - Т. 37. - №2. С. 32 - 41.
162.
Ларина И.М. Состояние водно-электролитного обмена, функции почек и
микроциркуляторного русла кожи обследуемых во время 7-суточной «сухой»
иммерсии. / И.М. Ларина, М-А. Кусто, Л.Х. Пастушкова и др. // Авиакосмическая
и экологическая медицина. - 2008. - Т. 42 (5). - С. 29 – 35.
163.
Ларина И.М. Взаимосвязь между изменениями водно-электролитного баланса и
реакциями сердечно-сосудистой системы в эксперименте с 7-суточной «сухой
иммерсии» / Р.М. Баевский, Л.Х. Пастушкова, Н.М. Новоселова и др. //
Физиология человека. - 2011.- № 5. - С. 100 - 107.
164.
Ларина И.М. Профиль половых стероидов мочи здоровго человека в условиях
жизнедеятельности в гермообъекте / И. М. Ларина, Е.А. Кочнова, Л.Х.
Пастушкова и др. // Физиология человека 2011.- N 4.- С. 79 – 89.
165.
Ларина И.М. Реконструкция ассоциативных белковых сетей, связанных с
процессами регуляции обмена и депонирования натрия в организме здорового
человека, на основе изучения протеома мочи / И.М. Ларина, Н.А. Колчанов, И.В.
Доброхотов и др. // Физиология человека. - 2012. - Т. 38. - № 3. - С. 107 - 115.
166.
Ларина И.М. Протеом здорового человека при деятельности в экстремальных
условиях / И. М. Ларина, В. А. Иванисенко, Е. Н. Николаев, А. И. Григорьев //
Acta Naturae. – 2014. - Т. 6. - № 3 (22). – С. 71 – 81.
167.
Ларина О.Н. Белковый состав плазмы крови человека и животных при
космических полетах и моделировании воздействия невесомости: автореф. дисс.
канд. биол. наук. / О.Н.Ларина. – Москва. 1992 – 154 с.
168.
Ларина О.Н. Влияние длительной изоляции в гермообъекте на состав
электрофоретических фракций и содержание некоторых индивидуальных белков
плазмы. / О. Н. Ларина //Авиакосмическая и экологическая медицина. - 1997. - Т.
31. - №5. - С. 45 - 54.
169.
Ларина О.Н. Исследование индивидуальных особенностей регуляции уровней
белков крови при моделировании воздействия микрогравитации на человека /
О.Н. Ларина, А.М. Беккер // Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2006.
– Т.43. - №1. – С.51 - 56.
170.
Ларичева Е.С. Способен ли метод определения белка в моче пирогаллоловым
красным претендовать на роль основного? / Е. С. Ларичева, Ю.Н. Андреев, Е Н.
Ребякова и др. // Лабораторная диагностика. – 2009. - № 1 (21). - С. 24 - 31.
233
171.
Лич К. Результаты медицинских исследований в космических полетах / К. Лич //
Космическая биология и медицина. - 1997. - Т III. Кн. 2. - С. З54 - 367.
172.
Лобачик В.И. Состояние жидкостных фаз тела в динамике 120-суточной
антиортостатической гипокинезии / В.И. Лобачик, В.В. Жидков, С.В. Абросимов
// Космическая биол. и авиакосм. мед. - 1989. - Т. 23. - №5. - С. 57 - 61.
173.
Максименко А.В. Эндотелиальный гликокаликс системы кровообращения. I.
Обнаружение, компоненты, структурная организация / А. В. Максименко, А. Д.
Турашев // Биоорганическая химия. – 2014. - Том 40. - № 2. - С. 131–141.
174.
Мангилева Т.А. Система сосудистого эндотелиального фактора роста и
артериальная гипертензия / Т.А. Мангилева // Серце і судини. – 2012. - № 4. - С.
107 – 115.
175.
Мареев В.Ю. Четверть века эры ингибиторов АПФ в кардиологии / В.Ю. Мареев
// Рус. Мед. Журнал. - 2000. –№ 8. - С. 15 - 16.
176.
Маркин А.А. Обмен веществ, интенсивность перекисного окисления липидов и
система антиоксидантной защиты у человека в эксперименте с длительной
изоляцией в гермообъеме / А.А. Маркин, Л.Б. Строгонова, Л.В. Вострикова //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 1997. - Т. 31. - №4. - С. 64 - 70.
177.
Маркин А.А. Особенности обмена веществ у испытателей различных групп в
эксперименте с длительной изоляцией SFINCSS-99. Модельный эксперимент с
длительной изоляцией: проблемы и достижения / А.А. Маркин, О.А. Журавлева,
Л.В. Вострикова и др. // М. Слово. - 2001. - С. 422 - 437.
178.
Маркин А.А. Биохимическое исследование крови. Послеполетные клиникофизиологические исследования. Орбитальная станция. «Мир» / А.А. Маркин.,
О.А. Журавлева //M.:Аником. - 2001. - Т.1. - С. 606 - 612.
179.
Маркин A.A. Особенности обмена веществ у космонавтов после длительных
полетов на международной космической станции / A.A. Маркин, O.A. Журавлева,
Б.В. Моруков и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2005. - Т.39. №4. С. 36 - 41.
180.
Маркин А.А. Динамика биохимических показателей крови в эксперименте с 7суточной «сухой» иммерсией / А.А. Маркин, Б.В. Моруков, О.А. Журавлева и др.
// Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2008. - Т. 42. - №5. - С. 56 - 60.
181.
Маркин А.А. Гомеостатические реакции организма человека при воздействии
условий 105-суточной изоляции / А.А. Маркин, О.А. Журавлева, Б.В. Моруков и
др. // Авиакосмическая и экологическая медицина // 2010. - Т. 44. - № 4. - С. 31 34.
234
182.
Мартусевич А.К. Панкреатические лектины: «двуликий янус» поджелудочной
железы / А.К. Мартусевич, Ж.Г. Симонова, Н.Ф. Камакин // Вестник новых
медицинских технологий. - 2011. - Выпуск № 1. – Т. 18. - С. 12 - 16.
183.
Мастыков
А.Н.
Обогащенная
тромбоцитами
плазма
в
лечении
посттравматической хондропатии коленного сустава / А.Н. Мастыков, В.П.
Дейкало, К.Б. Болобошко // Новости хирургии - 2012. – Т. 20. - №5. - С. 77 - 81.
184.
Махнева Н.В. Экспрессия молекул клеточной адгезии кадгеринового комплекса и
их роль в диагностике при аутоиммунных буллезных дерматозах / Н. В. Махнева,
Л. В. Белецкая // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 1. – С. 59 – 63.
185.
Меерсон Ф.З. Активация перекисного окисления липидов при эмоциональноболевом стрессе / Ф.З. Меерсон, В.Е. Каган, Л.Л. Прилипко и др. // Бюлл. экспер.
биол. и мед. – 1979. - № 10. - С. 404 - 406.
186.
Медведев С.П. Эпигенетика плюрипотентных клеток / С.П. Медведев, Е.А.
Покушалов, С. М. Закиян // Acta Naturae. - 2012. – Т .4. - №4. – С. 28 - 47.
187.
Миминошвили
реваскуляризации
О.И.
Прогнозирование
конечности
при
исхода
критической
инфраингвинальной
ишемии
по
данным
транскутанной оксигенометрии / О.И. Миминошвили, В.Н. Пшеничный, Ю.В.
Родин и др. // Новости хирургии. - 2013. - № 5. - С. 45 - 49.
188.
Минушкина Л.О. Активность ренин-альдостероновой системы и особенности
структуры и функции миокарда левого желудочка у больных артериальной
гипертонией / Л. О. Минушкина, А.A Затейщикова, Н.В. Хотченкова и др. //
Кардиология. - 2000. – Т. 40. - №9. - С. 23 - 32.
189.
Митрофанов К.Ю. Ассоциация мутаций ядерного генома с развитием инфаркта
миокарда / К.Ю. Митрофанов, А.В. Желанкин, М.А. Сазонова // Атеросклероз и
дислипидемии. - № 2 (11). – 2013. - С. 56 - 60.
190.
Михайлов В.М. Гипокинезия как фактор риска в экстремальных условиях / В.М.
Михайлов // Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2001. – 35. - № 2. - С.
26 – 31.
191.
Михайлов И.Б. Клиническая фармакология / И.Б. Михайлов // Издательство
ГЭОТАР. - Медиа. Москва. - 2006. – 640 с.
192.
Морева
Т.И.
Исследование
периферической
гемодинамики
методом
ультразвуковой допплерографии в условиях 7-суточной иммерсии / Т.И. Морева //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2008. - № 5. - С. 35 – 41.
235
193.
Моруков Б.В. Изменения обмена кальция и его регуляция у человека во время
длительного космического полета / Б.В. Моруков, И.М. Ларина, А.И. Григорьев //
Физиология человека. - 1998. - Т.24. - № 2. - С. 102 - 107.
194.
Моруков
Б.В.
Регуляция
минерального обмена
в
условиях
длительной
гипокинезии и космического полета: автореф. дисс. докт. мед. наук. / Б.В.
Моруков.- Москва. 1999.- 49 с.
195.
Моруков Б.В. Орбитальная станция МИР. Медико-биологические эксперименты /
Б.В. Моруков, С.М. Смит, И.М. Ларина и др. // M.: Аником. 2. - 2002. – С. 95 –
113.
196.
Моруков Б.В. Водно-солевой обмен и функция почек в космических полетах и
наземных модельных экспериментах / Б. В. Моруков, В.Б. Носков, И.М. Ларина и
др. // Российский физиологический журнал им И.М. Сеченова. – 2003. - Т. 89. №3. - С. 356 - 374.
197.
Моруков Б.В. Водно-солевой обмен и функция почек в космических полетах и наземных
модельных экспериментах / Б. В. Моруков, Ю. В. Наточин, И. М. Ларина, В. Б.
Носков // Российский физиологический журнал. - 2003. - N 3. - С. 356 – 367.
198.
Моруков Б.В. Депонирование осмотически неактивного натрия в
организме человека стимулируется во время продолжительной
антиортостатической гипокинезии / Б.В. Моруков, Т.М. Смирнова, И.М.
Ларина // Физиология человека. – 2008. - № 5. - С. 80 - 88.
199.
Моруков Б.В. Состояние системы иммунитета человека в условиях 105-суточной
изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания / Б.В. Моруков, М.П.
Рыкова, Е.Н. Антропова и др. //Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. - Т. 44. - №4. - С. 39 - 46.
200.
Моруков Б.В. Эксперимент со 105-суточной изоляцией, моделирующий элементы
межпланетной экспедиции к Марсу: задачи, объем и структура исследований /
Б.В. Моруков, Е.П. Демин, Г.Ю. Васильева // Авиакосмическая и экологическая
медицина. - 2010 - №4. - С. 3 - 5 .
201.
Моруков Б.В. Интенсивность перекисного окисления липидов и состояние
системы антиоксидантной защиты в реадаптационном периоде после длительных
полетов на международной космической станции / Б.В. Моруков, А.А. Маркин,
О.А. Журавлева и др. // Физиология человека. - 2011. - № 3. - С.92 – 97.
236
202.
Моруков Б.В. Показатели системы гемостаза в эксперименте с 105-
суточной изоляцией в гермообъеме / Б.В. Моруков, А.А. Маркин, Д.С.
Кузичкин // Физиология человека. - 2011. -№ 3. - С. 129 - 131.
203.
Моруков Б.В.
Эксперимент с 520-суточной изоляцией в гермообъме: задачи,
структура, предварительные итоги. Международный симпозиум по результатам
экспериментов, моделирующих пилотируемый полет на Марс (Марс-500) / Б.В.
Моруков, М.С. Белаковский, Е.П. Дёмин и др. // Сборник материалов. М.
Воронеж: Научная книга. - 2012. - С.44.
204.
Моруков Б.В. Влияние 520-суточной изоляции в гермообъеме на характер нормо43 и микропротеинурии у человека / Б.В. Моруков, А.Л. Воронцов, А.А. Маркин и
др. // Сборник материалов. М. Воронеж: Научная книга. - 2012. - С. 43.
205.
Моруков Б.В. Исследование системы гемостаза в условиях 520-суточной
изоляции в гермообъеме / Б.В. Моруков, Д.С. Кузичкин, А.А. Маркин и др. //
Сборник материалов. М. Воронеж: Научная книга. - 2012. - С. 39 - 40.
206.
Москалев А.А. Старение и гены / А.А. Москалев // СПб.: Наука. - 2008. - 358 с.
207.
Муравьев Ю.В. Кальций-связывающие белки при ревматических заболеваниях /
Ю. В. Муравьев, В.В. Лебедева // Научно-практическая ревматология. - 2012. Т.50. - № 1. - С. 60 - 64.
208.
Мякоткин В.А. Оценка значимости полиморфизмов генов LR P5, BM P4, TGFβ1
при постменопаузальном остеопорозе / В.А. Мякоткин, М.Ю. Крылов, А.Ю.
Казеева и др. // Научно-практическая ревматология. - 2008. - № 3. - С. 8 - 14.
209.
Назаренко Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований /
Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун // М. Медицина. 2-е изд. - 2002.– 540 с.
210.
Наточин Ю.В. Физиология почки / Ю.В. Наточин // В кн.: Физиология водносолевого обмена и почки. – СПб. Наука. - 1993. – С. 202 - 416.
211.
Наточин Ю.В. Механизмы мочеобрзования / Ю.В. Наточин // В кн.: Нефрология.
Руководство для врачей. Под ред. И.Е. Тареевой. М. Медицина. - 2000. - С. 24 - 48.
212.
Наточин Ю.В. Физиология, биомедицина, медицина / Ю.В Наточин // Успехи
физиологических наук. - 2008. – Т. 39. - № 2. - С. 8 – 31.
213.
Нестерова И.В. Спонтанная и индуцированная реструктуризация хроматина ядер
нейтрофильных гранулоцитов при остром деструктивном панкреатите в стадии
гнойных осложнений / И.В. Нестерова, Н.В. Колесникова, А.А. Евглевский и др. //
Цитокины и воспаление. - 2010. - 9. - № 2. - С. 13 - 17.
237
214.
Нефедов В.П. Гомеостаз на разных уровнях организации биосистем / В. П.
Нефедов, А. А. Ясайтис, В. Н. Новосельцев // Новосибирск. - 1991. - 232 с.
215.
Николаев
Е.Н.
спектрометров
Масс-спектрометрия
с
высокой
точностью
в
протеомике.
измерения
масс
Применение
в
масс-
исследованиях
молекулярного полиморфизма протеомов / Е.Н. Николаев // В кн.: Молекулярный
полиморфизм человека. М.: Российский университет дружбы народов. – 2007. С. 1 - 8.
216.
Ничипорук И.А. Состояние репродуктивной системы мужчин в условиях
антиортостатической гипокинезии / И.А. Ничипорук, В.В. Евдокимов, А.Г.
Гончарова и др. // Проблемы репродукции. – 1999. - Т.5. - №5. - С. 35 - 38.
217.
Ничипорук
И.А.
Динамика
состава
тела,
нейрогуморального
и
психофизиологического статуса человека в условиях 105-суточной изоляции в
гермообъекте / И.А. Ничипорук, Г.Ю. Васильева, В.Б. Носков и др. //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - № 2. - С. 39 - 44.
218.
Ничипорук И.А. Анализ взаимосвязей психофизиологического статуса и системы
адаптивного иммунитета человека в условиях 5-суточной иммерсии / И.А.
Ничипорук, Г.Ю. Васильева, М.П. Рыкова и др. //
Авиакосмическая и
экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - № 6. - С. 57 - 63.
219.
Ничипорук И.А. Динамика концентрации нейроспецифических белков в крови и
риск развития нейропатий в условиях 105-суточной изоляции в гермообъекте /
И.А. Ничипорук, Г.Ю. Васильева, М.П. Рыкова и др. // Авиакосмическая и
экологическая медицина. - 2011. - Т. 45. - № 3. - С. 24 - 29.
220.
Новиков В.Е. Сравнительный анализ изменений костной системы космонавтов в
длительных орбитальных полетах и возможности прогноза для межпланетных
миссий / В.Е. Новиков, В.В. Богомолов, Л.М. Мурашко и др. // Физиология
человека. – 2010. - № 3. - С. 39 - 47.
221.
Новоселецкий В. Долгая дорога к структурам. Нобелевская премия по химии
2012 года / В. Новоселецкий // Наука и жизнь. - 2012. - № 12. - С. 38 -41.
222.
Носков В.Б. Состояние водно-солевого обмена. Послеполетные клиникофизиологические исследования. Орбитальная станция «Мир» / В.Б. Носков // М.
Аником. - 2001. - Т. - С. 599 - 603.
223.
Носков В.Б. Исследование состояния жидких сред организма человека в условиях
длительного космического полета / В.Б. Носков, И.А. Ничипорук, Б.В. Моруков и
др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. – 2005.- Т. 39 (1). - С. 27 – 31.
238
224.
Носков В.Б. Функционирование почек и состояние жидкостных сред организма
человека в условиях 5-суточной иммерсии // Носков В.Б., Ларина И.М.,
Пастушкова Л.Х., Доброхотов И.В., Валеева О.А., Купэ М., Кусто М.А.,
Новоселова А.М. / Авиакосмическая и экологическая медицина. 2011. Т. 45. № 6.
С. 22-26.
225.
Носков
В.Б.
Адаптация
водно-электролитного
метаболизма
к
условиям
космического полета и при его имитации / В.Б. Носков // Физиология человека. –
2013. - Т. 39.- №5. - С. 119 - 125.
226.
Образцова О.А. Особенности протеома мочи здорового человека при влиянии
факторов космического полета: автореф. дисс. канд. биолог. наук / О.А.
Образцова– Москва. 2013. – 25 с.
227.
Оганов В.С. Гипокинезия фактор риска остеопороза / В.С. Оганов // Остеопороз и
остеопатии. - 1998. – Т. 1. - С. 13 - 17.
228.
Оганов В.С. Костная система, невесомость и остеопороз / В.С. Оганов // М. Слово.
- 2003. - 260 С.
229.
Оганов В.С. О природе зоноспецифичности реакций скелета человека в условиях
невесомости / В.С. Оганов, И.А. Скрипникова, В.Е. Новиков и др. // Остеопороз и
остеопатии. - 2011. - № 3. - С. 3 - 6.
230.
Огнева И.В. Изменения клеточного дыхания волокон постуральных мышц крысы в
условиях длительной гравитационной разгрузки при добавлении в рацион
сукцината / И.В. Огнева, О.М. Веселова, И.М. Ларина // Биофизика. – 2011. – Т. 55.
- №1. – С. 122 - 128.
231.
Одинцов Ю.Н. Биологические функции комплемента / Ю.Н. Одинцов, В.М.
Перельмутер // Бюллетень Сибирской медицины. - 2007. - Т. 6. - № 2. - С. 72 - 82.
232.
Октябрьский О.Н. Редокс-регуляция клеточных функций. Обзор / О.Н.
Октябрьский, Г.В. Смирнова // Биохимия. - 2007. - Т. 72. - Вып. 2. - С. 158 - 174.
233.
Павлов Ч.С. Значение мутаций гена гемохроматоза в развитии синдрома
перегрузки железом / Ч.С. Павлов, А. А. Баев, А.В. Лавров // Клинические
перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. – 2005. –№ 3. – С. 17 - 23.
239
234.
Пак З.П. Особенности водно-солевого обмена в условиях 120-суточной
гипокинезии / З.П. Пак, Г.И. Козыревская, Ю.С. Колоскова и др. // Космич.
биология и авиакосмич. Медицина. – 1973. – Т. 7. - №4. - С. 56 - 59.
235.
Парфенова Е.В. Роль Т-кадгерина в регуляции роста кровеносных
сосудов / Е.В. Парфенова, В. А. Ткачук, Н. И. Калинина и др. //
Кардиологический вестник. - 2007. - № 2. - С. 15 - 24.
236.
Пастушкова Л.Х. Прямое протеомное профилирование сыворотки крови человека
в эксперименте с 5-суточной иммерсией / Л. Х. Пастушкова, Н. А. Пахарукова, О.
П. Трифонова и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2011. - Т. 45.
- № 6. - С. 13 - 18.
237.
Пастушкова Л.Х. Анализ белковых взаимодействий на основе изучения протеома
мочи человека в эксперименте со 105-суточной изоляцией / Л. Х. Пастушкова, О.
А. Валеева, А. С. Кононихин и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина.
– 2012. - Т. 46. - № 2. - С. 37 – 43.
238.
Пастушкова Л.Х. Изменения белковой композиции мочи человека после
продолжительных орбитальных полетов / Л.Х. Пастушкова, О.А. Валеева, А.С.
Кононихин и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013.Т. 15.- № 8.- С.166 - 170.
239.
Пастушкова Л.Х. Изучение протеома мочи для оценки состояния сердечно сосудистой системы у человека после космического полета / Л.Х. Пастушкова,
А.С. Кононихин, Е.С. Тийс и др. // Российский физиологический журнал. – 2013.№ 8. - С. 945 - 959.
240.
Пастушкова Л.Х. Постоянные белки мочи здорового человека в эксперименте с
520-суточной изоляцией / Л.Х. Пастушкова, К.С. Киреев, А.С. Кононихин и др.
//Авиакосм. и экологич. медицина. – 2014. - Т.48. - № 1.- С. 48 - 54.
241.
Пастушкова Л.Х. Выявление значимо представленных биологических процессов
по составу протеома мочи на первые сутки после длительных космических
полетов / Л.Х. Пастушкова, А.С. Кононихин, Е.С. Тийс и др. // Российский
физиологический журнал. – 2015. - №2. (в печати)
242.
Пахарукова Н.А. Выбор статистического подхода для анализа протеомных
профилей сыворотки крови здорового человека / Н.А. Пахарукова, А.М.
Носовский, Л.Х. Пастушкова и др. // Авиакосм. и экологич. мед. -2009. - №4. С. 60
- 66.
240
243.
Пахарукова Н.А. Оптимизация метода профилирования сыворотки крови
здорового человека / Н.А Пахарукова., Л.Х Пастушкова., О.П Трифонова и др. //
Физиология человека. - 2009. - Т.35. - №.3. - С. 101 – 107.
244.
Пахарукова Н.А. Прямое протеомное профилирование сыворотки крови
космонавтов после длительных космических полетов / Н.А. Пахарукова, Л.Х.
Пастушкова, Г.И. Самарин и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. –
2010. - Т. 44. - №.5. - С. 16 - 20.
245.
Пащенко А.В. Спектральный анализ вариабельности сердечного ритма при 24часовом воздействии антиортостатической гипокинезии / А.В. Пащенко, М.В.
Баранов, А.К. Ешманова и др. // Функциональная диагностика. - 2007. -№1. - С.40.
246.
Полетаев А.Б. Клиническая и лабораторная иммунология. Избранные лекции. /
А.Б. Полетаев // Медицинское информационное агентство. - 2007. - 189 с.
247.
Поликарпов Н.А. Некоторые наблюдения за состоянием иммунитет-микрофлора у
членов экипажей в условиях эксперимента SFINCSS-99 в сопоставлении с
параметрами гелиогеомагнитной активности. Модельный эксперимент с длительной
изоляцией: проблемы и достижения / Н. А. Поликарпов, М. П. Рыкова, Е.Н.
Антропова и др. // М.: Слово, 2001. – С. 480-490.
248.
Полякова А.П. Молекулярные механизмы эндотелиальной дисфункции при
венозном
тромбоэмболизме:
современные
представления
и
перспективы
дальнейшего изучения (Обзор литературы) / А. П. Полякова, М. Н. Блинов, В. Д.
Каргин и др. // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. – 2011. – T. 12. –
С. 1250 - 1268.
249.
Попова И.А. Активность ферментов сыворотки крови после длительных
космических полетов / И.А. Попова, Е.Г. Ветрова, Т.Е. Дроздова // Космическая
биология и авиакосмическая медицина. - 1984. - Т. 18. - №5. - С. 81 - 82.
250.
Попова
И.А.
Особенности
обмена
веществ
при
120-суточной
антиортостатической гипокинезии / И.А. Попова, Б.В. Моруков, Г.С. Арзамасов и
др. // Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1988. - Т.22. - №2. - С.
40 - 45.
251.
Попова
И.А.
Влияние
длительной
антиортостатической
гипокинезии
на
активность ферментов энергетического и пластического обмена в сыворотке
крови / И.А. Попова, Е.Г. Ветрова, Т.Е. Дроздова // Космическая биология и
авиакосмическая медицина. – 1989. - Т.23. - №4. – С. 51-55.
252.
Попова И.А. Оценка энергетического метаболизма космонавтов / И.А. Попова,
Е.Г. Ветрова, Л. А. Рустамьян // Физиология. - 1991. - Т.34 (1 Suppl). - С. 98 - 99.
241
253.
Потешкина Н.Г. Потребление соли. Сердечно-сосудистая система как органмишени. Часть 3. / Н.Г. Потешкина // Российский кардиологический журнал. 2012. - № 6. - С. 84 - 90.
254.
Потешкина
Н.Г. Избыточное потребление соли: распространенность и
последствия
255.
для здоровья человека (обзор литературы) / Н. Г. Потешкина // Вестник РГМУ. –
2013. - № 2. – С. 29 – 33.
256.
Простяков И.В. Исследование изменений минеральной плотности и структурной
организации костной ткани после воздействия факторов космического полета и
при их наземном моделировании: автореф. дис. канд. мед. наук / И.В. Простяков –
М. - 2010. – 24 с.
257.
Простяков
И.В.
Исследование
минеральной
плотности
и
структурной
организации костной ткани у участников 105-суточного эксперимента с
изоляцией в условиях гермообъема (Марс-105) / И. В. Простяков, В. Е. Новиков,
Б.В. Моруков // Физиология человека. - 2010. - Т.36. - №4. - С. 119 - 124.
258.
Прохоренков В.И. Запрограммированная клеточная гибель кератиноцитов и ее
роль в патогенезе некоторых заболеваний кожи / В.И. Прохоренков, Т. Г. Рукша,
Л.Л. Петрова и др. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2005. -№ 4. - С.4 - 7.
259.
Пупкова В.И. Определение белка в моче и спинномозговой жидкости / В.И.
Пупкова, Л. М. Прасолова // Информ. - метод. пособие. – 2005. - 43 с.
260.
Ратнер В.А. Генетический код как система / В.А. Ратнер // Соросовский
образовательный журнал. - 2000. - № 3. - С. 17 - 22.
261.
Рубцов
Ю.П.
Регуляция
иммунитета
мультипотентными
мезенхимными
стромальными клетками / Ю.П. Рубцов, Ю. Г. Суздальцева, К. В. Горюнов и др. //
Acta Naturae. – 2012. - Т.4. - №1. - С. 24 - 33.
262.
Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и
взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью // WHO laboratory manual
for examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction / пер. с англ.
Р.А.Нерсеяна под научн. ред. рус. перевода Л.Ф. Курило. - 4-е издание. - М.: Издво "МедПресс". - 2001. - 144 с.
263.
Русова Т.В. Биохимические изменения протеогликанов суставного хряща при
прогрессирующем остеоартрозе / Т.В. Русова, В. С. Баитов // Бюллетень
Сибирского отделения РАН. – 2008. - № 2. - С. 25 – 29.
242
264.
Рыкова М.П. Иммунологическое обследование / М. П. Рыкова, E.H. Антропова,
Д.О. Мешков // В кн. Орбитальная станция «Мир». Космическая биология и
медицина. - 2001. - Т. 1. - С. 615 - 618.
265.
Рыкова М.П. Влияние длительной изоляции на формирование аллергических
реакций у человека / М. П. Рыкова, Ю. Г. Герцик, Е.Н. Антропова и др.
//Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2004. - Т. 38.- №2. - С. 24 – 28.
266.
Рыкова М.П. Адаптационные процессы в системе иммунитета человека при
воздействии факторов космического полета: автореф. дис. доктора мед. наук. /
Рыкова М. П. - 2013. – 72 с.
267.
Сазонтова Т.Г. Индукция HSP(s) и ферментов антиоксидантной защиты при
активации свободнорадикального окисления на ранних этапах гипокинезии / Т.Г.
Сазонтова, Н.А. Анчишкина, Ю. В. Архипенко // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. - 2007. – Т. 143. - № 4. - С. 378 - 382.
268.
Серебренникова
С.Н.
Интерлейкин-1,
интерлейкин-10
в
регуляции
воспалительного процесса / С.Н. Серебренникова, Н. В. Семенов, И. Ж.
Семинский и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - №8. - С. 10 - 12.
269.
Сивков А.В. Применение фитопрепаратов на основе терпенов при мочеакменной
болезни / А.В. Сивков, Е.В. Черепанова, В.А. Шадеркина // Экспериментальная и
клиническая урология. – 2011. - № 1. - С. 69 – 72.
270.
Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и
органы: роль активных форм кислорода / В. П. Скулачев // Соросовский
образовательный журнал. - 2001. - Т. 7. - № 6. - С. 1 - 10.
271.
Слободчикова С.В. Влияние антител и цитокинов на эффективность фагоцитоза
staphylococcus aureus: автореф. дисс. канд. мед. наук / С. В. Слободчикова – 2014.
- 22 с.
272.
Смирнов А.В. Концепция факторов риска в нефрологии: вопросы профилактики и
лечения хронической болезни почек / А. В. Смирнов, И. Г. Каюков, В. А.
Добронравов // Нефрология. – 2008. –Т. 12. -№ 1. - С. 7 – 13.
273.
Смирнов А.В. Проблема модификации классификации хронической болезни
почек / А. В. Смирнов, В. А. Добронравов, И. Г. Каюков // Нефрология. - 2010. –Т.
15 (2). – С. 7 – 15.
274.
Смирнов К.В. Некоторые показатели липидного обмена у человек. в условиях
антиортостатической гипокинезии и их коррекция / К. В. Смирнов, И. Л. Медкова,
О. В. Жизневская и др. // Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1986. -Т. 20. - №5. - С. 34 - 37.
243
275.
Смирнов К.В. Пищеварение и гипокинезия // М.: Медицина. - 1990. - 224 с.
276.
Снигур Г.Л. К вопросу стандартизации патогистологической диагностики
сахарного диабета / Г. Л. Снигур, А. В. Смирнов // Вестник Волгоградского
государственного медицинского университета. – 2010. - № 3. - С. 112 - 115.
277.
Спринджук М.В. Ангиогенез / М. В. Спринджук // Вестник восстановительной
медицины. – 2010. - № 5. - С. 15 - 20.
278.
Стажадзе Л.Л. Некоторые клинико-физиологические аспекты кислородного
обеспечения тканей организма в условиях антиортостатической гипокинезии /
Л.Л. Стажадзе, В. Е. Воробьев, Л. Г. Рененкова и др. // Космическая биол. и
авиакосм. мед. -1988. - Т.22. - №2. - С.45 - 49.
279.
Степанов В.М. Молекулярная биология. Том 3. Структура и функции белков / В.
М. Степанов // Учебн. для студ. биол. спец. вузов / Под ред. А.С. Спирина. М.
Высш. школа. - 2002. - 336 с.
280.
Стручкова И.В. Регуляция биосинтеза белка: учебно-методическое пособие / И. В.
Стручкова, А.А. Брилкина, А.П. Веселов // Нижний Новгород. Нижегородский
госуниверситет. - 2010. – 100 с.
281.
Сучков С.В. Протеомика как фундаментальный инструмент доклинического
скрининга, верификации анализов и оценки применяемой терапии / С. В. Сучков,
Д. А. Гнатенко, Д. С. Костюшев и др. // ВЕСТНИК РАМН . – 2013. - № 1. - C. 65 - 71.
282.
Тахчиди
Е.Х.
Применение
сульфатированных
гликозаминогликанов
в
офтальмологии. / Е. Х. Тахчиди, К.С. Горбунова // Вестник ОГУ. – 2012. - №12. С. 201 - 204.
283.
Терентьев А.А. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белокбелковые взаимодействия / А. А. Терентьев, Н. Т. Молдогазиева, К. В. Шайтан //
Успехи биологической химии. – 2009. - N. 49. C. 429 - 480.
284.
Тернер А.Я. Гормональные реакции на водно-солевые нагрузки у людей.
Интеграция функциональных систем в онтогенезе / А.Я. Тернер // Изд-во НГГ1И.
Новосибирск. - 1994. - С. 132 - 147.
285.
Тигранян Р.А. Гормональная реакция организма космонавтов после завершения
кратковременных космических полетов / Р. А. Тигранян, Н.Ф. Калита, Т.А.
Киселева и др. // Космическая биология и авиакосмическая медицина. - 1987. – Т.
21. - №3. – С. 32 - 35.
286.
Титце Й. Исследование баланса натрия во время продолжительной изоляции
человека в наземной модели космической станции / Й. Титце, И.М. Ларина, К.
Гариб и др. // Физиология человека. - 2003. – Том 29. - №5. - С. 90 - 101.
244
287.
Ткачук В.А. Роль мультидоменной структуры урокиназы в регуляции роста и
ремоделирования сосудов / В.А. Ткачук, О.С. Плеханова, И.Б. Белоглазова и др. //
Укр. біохім. журн. – 2013. - Т. 85. - № 6. - С .18 - 45.
288.
Томиловская Е.С. Эксперимент с 5-суточной иммерсией: задачи, объем, структура
исследований, особенности методических подходов / Е.С. Томиловская //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2011. - Т.45. - №6. - C. 3 - 7.
289.
Тотолян А.А. Критический анализ предполагаемых механизмов
патогенеза постстрептококкового гломерулонефрита / А.А. Тотолян,
Л.А. Бурова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - № 4. - С. 316 – 323.
290.
Тризно М.Н. Изменение объемов артериальных и венозных сосудов коркового и
мозгового вещества почки в процессе старения / М.Н. Тризно, Ф.Р. Асфандияров,
Э.С. Кафаров // Саратовский медицинский журнал. - 2009. -Т. 5. - № 1. - С. 15 - 16.
291.
Трифонова О.П. Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового
человека в экстремальных условиях жизнедеятельности: автореф. дис. канд. биол.
наук: / О.П. Трифонова.– М., 2011. – 27 с.
292.
Трифонова О.П. Изменение белкового состава плазмы крови в эксперименте с 7суточной "сухой" иммерсией / О.П. Трифонова, Л.Х. Пастушкова, Н.Ф. Саменкова
и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2010. - Т. 44. - № 5. - С. 24 28.
293.
Тюзиков
И.А.
инфекционном
Коррекция
простатите
андрогенного
как
дефицита
патогенетический
при
хроническом
метод
преодоления
неэффективности стандартной антибактериальной терапии на фоне растущей
антибиотикорезистентности / И.А. Тюзиков, С.Ю. Калинченко, Л.О. Ворслов и др.
// Андрология и генитальная хирургия. – 2013. - №1. - С. 55 - 63.
294.
Федоров Б.М. Изменение кровообращения в бассейне сонных артерий при
антиортостазе и антиортостатической гипокинезии / Б.М. Федоров, Е.Н.
Стрельцова, Т.В. Себекина // Физиология человека. -1985. - Т.11. - №5. - С. 755 762.
295.
Федоров И.В. Гиподинамия и гормональная активность / И.В. Федоров // Космич.
биол. и мед. - 1975. - Т. 5. - № 4. - С. 59 - 61.
296.
Федоров И.В. Интенсивность белкового синтеза в тканях и деградации белка во
время гипокинезии и повышенной мышечной активности / И.В. Федоров, А.В.
Черный, А.И. Федоров // Физиол журн СССР. - 1977. - Т 63. - №8. - С. 1128 - 1133.
245
297.
Федорова О.А. Блокада ренин-ангиотензин-альдостероновой системы у пациентов
с высоким кардиоваскулярным риском и коморбидными состояниями / О. А.
Федорова // Ukrainian medical journal. - 2013 - N 3. - С. 87 - 93.
298.
Федулова М.В. Возрастные изменения костной ткани и их судебно-медицинское
значение: дис. .докт. мед. наук / М.В. Федулова M. - 2004. 188 с.
299.
Фомин
А.Н.
Фибриноген
крови
при
7-суточной
водной
иммерсии
и
кратковременном космическом полете. / Фомин А.Н. // Космическая биология и
авиакосмическая медицина. -1981. - Т.15. - №5. - С. 83-85.
300.
Фомина Г.А. Изменения гемодинамики человека в условиях длительной
невесомости и значение гиповолемии / Г.А. Фомина,
А. Р. Котовская //
Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2008. - № 2. - С. 21 – 25.
301.
Фомина Г.А. Механизмы изменений гемодинамики человека в условиях
микрогравитации и прогноз послеполетной ортостатической устойчивости / Г.А.
Фомина, А.Р. Котовская, В.И. Почуев, А.Ф. Жернавков // Физиология человека. 2008. - Т.34. - №3. - С. 92 - 97.
302.
Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. / Хаитов Р.М. //М. ВИНИТИ РАН. –
2001. -224 С.
303.
Харченко М.С. Добавление уровня цистатина С к подсчету баллов по шкале
GRACE повышает точность оценки риска кровотечений у неинвазивно леченных
больных с острым коронарным синдромом. / Эрлих А.Д., Косенков Е.И. Масенко
В.П,. Грацианский Н.А. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2012. 11(6). - C.38-43.
304.
Хышиктуев Б.С. Уровень продуктов липопероксидациии
и
показатели
антиоксидантной защиты в конденсате выдыхаемого воздуха у больных
туберкулезом
органов дыхании. / Хышиктуев Б.С., Байке Е.Е. //Проблемы
туберкулеза и болезней легких. - 2004. - 9. - С.39 – 41.
305.
Чернилевский В.Е. Роль стволовых клеток в самообновлении организмов и
возможности продленияжизни / В. Е. Чернилевский // Доклады МОИП №41.
Секция геронтологии. - М. - 2008. - С. 82–95.
306.
Черношей Д.А. Распознавание в системе врожденного иммунитета. Учебнометодическое пособие. / Черношей Д.А., Кирильчик Е.Ю., Канашкова Т.А. //
Минск. БГМУ. – 2010. – 66 С.
307.
Чернявская
Т.К.
Современные
подходы
к
диагностике
и
коррекции
эндотелиальной дисфункции у пациентов с артериальной гипертонией / Т.К.
Чернявская // Лечебное дело. – 2013. - № 2. - С. 118 - 130.
246
308.
Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном
организме. / Чумаков П.М. //Успехи биологической химии. – 2007. – 47. С. 3-52.
309.
Шалгинских Н.А. Влияние канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков
на эпигенетическую регуляцию транскрипции: дисс. канд. медицинских наук /
Шалгинских Н.А. Москва. - 2014. - 144 с.
310.
Шарафетдинов
Х.Х.
Оценка
иммуномодулирующей
активности
комбинированных препаратов с содержанием цинка и эхинацеи. / Шарафетдинов
Х.Х., Сенцова Т.Б. // Лечащий врач. - 2012. - № 2. -С.104-106.
311.
Шахматов И.И. Нарастание дизадаптивных сдвигов со стороны системы
гемостаза по мере увеличения продолжительности гипокинезии / И.И. Шахматов,
В.И. Киселев // Фундаментальные исследования - 2004. - № 2.- С. 106 – 107.
312.
Шевченко О.П. Белки острой фазы воспаления / О.П. Шевченко // Лаборатория. –
1996. – 1. - С. 3 - 6.
313.
Щеглова
Т.
Ковалентно-связывающиеся
антитела
подавляют
глубокое
гликирование: врожденный компонент системы приобретенного иммунитета. /
Щеглова Т. Маккер С.П. Трамонтано А. // Аcta naturae. – 2009. - № 2. Т. 1. - С.
73-81.
314.
Шейман Д.А. Патофизиология почки / Д.А. Шейман // 3-е изд., пер. с англ. / под
ред. Ю.В. Наточина. – М. БИНОМ. - 2007. - 208 с.
315.
Шилов А.М. Роль дефицита магния в патогенезе метаболического синдрома. /
Шилов А.М., Мельник М.В., Грязнов Д.А., Осия А.О., Свиридова А.Ю. // Русский
медицинский журнал. - 2008. - № 21. - С.1439-1444.
316.
Шилов А.М. Взаимосвязь дефицита магния и метаболического синдрома./ Шилов
А.М., Авшалумов А.Ш., Грязнов Д.А., Марковский В.Б., Синицина Е.Н., Осия
А.О. // Русский медицинский журнал. – 2009. - № 8. - С.576-581.
317.
Шишкин С.С. Использование связывания красителей для количественного
определения содержания белка в растворах (обзор) / С.С. Шишкин // Вопросы
медицинской химии. - 1982. - Т. 28. - № 5. - С. 134 – 141.
318.
Ших Е.В. Роль полиморфизма гена VDR, кодирующего рецептор витамина D, в
патогенезе артериальной гипертонии / Е.В. Ших, Н.М. Милотова // Биомедицина.
-2009. - №1. C. 55 - 67.
319.
Шпаков
А.О.
Применение
пептидной
стратегии
для
создания
новых
лекарственных препаратов. / Шпаков А.О., Шпакова Е.А. // Бюллетень ФЦСКЭ
им. В.А. Алмазова. - 2013 - С.14-22.
247
320.
Штеренталь И.Ш. Особенности гормональной и сосудистой реакции на
кратковременную солевую нагрузку у больных с пограничной артериальной
гипертонией в зависмости от уровня психоэмоционального напряжения / И. Ш.
Штеренталь, А.А. Николаева, К. Ю. Николаев и др. // Кардиология. - 1993. - 33. №10. - С. 35 - 38.
321.
Шульженко И.Б. Возможность осуществления длительной водной иммерсии
методом «сухой» иммерсии / И.Б. Шульженко, И.Ф. Виль-Вильямс // Космическая
биология и авиакосмическая медицина. - 1976. - Т.10. - №2. - С. 32-34.
322.
Шульженко Е.Б. Внутрисердечная гемодинамика и деятельность сердца человека
при моделированной невесомости / Е.Б. Шульженко, Л. И. Какурин, А.А. Савилов
и др. // Вестник АМН СССР. - 1984. - №4.- С. 32 - 38.
323.
Яровая Г.А. Калликреин-кининовая система: новые факты и концепции (обзор) /
Г.А. Яровая // Вопросы биомедицинской химии. - 2001. - Т.47. - №1. - С. 5 - 20.
324.
Яровая Г.А. Биорегулирующие функции и патогенетическая роль протеолиза. V.
Физиологическая роль и биохимические механизмы реакций ограниченного
протеолиза / Г. А. Яровая // Лабораторная медицина. – 2005. - №7. - С. 81 - 89.
325.
Adachi J. The human urinary proteome contains more than 1500 proteins, including a
large proportion of membrane proteins / J. Adachi, C. Kumar, Y. Zhang et al. // Genome
Biol. – 2006. - P.7 (9). - P. 80.
326.
Aebersold R. Mass spectrometry-based proteomics / R. Aebersold, M. Mann // Nature. –
2003. - V. 422 (6928). - P. 198 - 207.
327.
Aihara K. Heparin cofactor II is a novel protective factor against carotid atherosclerosis
in elderly individuals / K. Aihara, H. Azuma, N. Takamori et al. // Circulation. – 2004.
– V. 109 (22). – P. 2761 - 5.
328.
Agiostratidou G. The cytoplasmic sequence of E-cadherin promotes non-amyloidogenic
degradation of A beta precursors / G. Agiostratidou, R.M. Muros, J. Shioi et al. // J
Neurochem. – 2006. - V. 96 (4). – P. 1182 - 8.
329.
Ahmed S. Telomerase does not counteract telomere shortening but protects
mitochondrial function under oxidative stress / S. Ahmed, J.F. Passos, M.J. Birket et al.
// J Cell Sci. – 2008. – V. 121 (Pt 7). – P. 1046 - 53.
330.
Albalat A. Clinical application of urinary proteomics/peptidomics / A. Albalat, H.
Mischak, W. Mullen // Expert Rev Proteomics. – 2011. – V. 8 (5). – P. 615 - 29.
331.
Alban A. A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis:
two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard
248
/ A. Alban, S.O. David, L. Bjorkesten et al. // Proteomics. – 2003. – V. 3(1). – P. 36 44.
332.
Alkhalaf A. Multicentric validation of proteomic biomarkers in urine specific for
diabetic nephropathy / A. Alkhalaf, P. Zürbig, S.J. Bakker et al. // PLoS One. – 2010. –
V. 5(10). – P. 13421.
333.
Allhorn M. Processing of the lipocalin alpha(1)-microglobulin by hemoglobin induces
heme-binding and heme-degradation properties / M. Allhorn, T. Berggård, J. Nordberg
et al. // Blood. - 2002. – V. 99. – P. 1894 – 1901.
334.
Amikura K. Multiple amino acid-excluded genetic codes for protein engineering using
multiple sets of tRNA variants / K. Amikura, Y. Sakai, S. Asami, D. Kiga // Synth Biol.
– 2014. –V. 3 (3). - P. 140 - 4.
335.
Amsellem S. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule /
S. Amsellem, J. Gburek, G. Hamard et al. // J Am Soc Nephrol. – 2010. - V. 21 (11). P. 1859 - 67.
336.
Andersson B. Pancreatic function, quality of life and costs at long-term follow-up after
acute pancreatitis / B. Andersson, M.L. Pendse, R. Andersson // World J Gastroenterol.
– 2010. - V. 16 (39). - P. 4944 - 51.
337.
Anderson E.L. Anti-müllerian hormone is not associated with cardiometabolic risk
factors in adolescent females / E.L. Anderson, A. Fraser, W. McNally et al. // PLoS
One. – 2013. - V. 8 (5). – P. 64510.
338.
Anderson L. High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins
/ L. Anderson, N.G. Anderson // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1977. - V. 74 (12). - P.
5421-5.
339.
Anderson N.G. Proteins of human urine. I. Concentration and analysis by twodimensional electrophoresis / N.G. Anderson, N.L. Anderson, S.L. Tollaksen // Clin
Chem. – 1979. - V. 25 (7). – P. 1199 - 210.
340.
Anderson N.L. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic
prospects / N. L. Anderson, N.G. Anderson // Mol Cell Proteomics. – 2002. – V. 1 (11).
- P. 845-67.
341.
Andersen R.F. Plasma and urine proteomic profiles in childhood idiopathic nephrotic
syndrome / R.F. Andersen, J. Palmfeldt, B. Jespersen et al. // Proteomics Clin Appl. –
2012. – V. 6 (7-8). – P. 382 - 93.
342.
Angel T.E. Mass spectrometry-based proteomics: existing capabilities and future
directions / T.E. Angel, U.K. Aryal, S.M. Hengel et al. // Chem Soc Rev. – 2012. – V.
41 (10) - P. 3912 - 28.
249
343.
Annoni G. Age-dependent expression of fibrosis-related genes and collagen deposition
in the rat myocardium / G. Annoni, G. Luvarà, B. Arosio et al. // Mech Ageing Dev. 1998. – V. 101 (1-2). – P. 57 - 72.
344.
Aplin J.D. Adhesion molecules in implantation / J.D. Aplin // Rev.Reprod. – 1997. – V.
2. - P. 84 - 93.
345.
Appel L.J. The importance of population-wide sodium reduction as a means to prevent
cardiovascular disease and stroke: a call to action from the American Heart Association
/ L.J. Appel, E.D. Frohlich, J.E. Hall et al. // Circulation. – 2011. – V. 123 (10). – P.
1138 - 43.
346.
Arakelyan K.P. Calcium-regulating peptide hormones and blood electrolytic balance in
chronic heart failure / K.P. Arakelyan, Y.A. Sahakyan, L.R. Hayrapetyan et al. // Regul
Pept. – 2007. –V. 142 (3). - P. 95 - 100.
347.
Arnold L.E. Zinc for attention-deficit/hyperactivity disorder: placebo-controlled doubleblind pilot trial alone and combined with amphetamine / L.E. Arnold, R.A. Disilvestro,
D. Bozzolo et al. // J Child Adolesc Psychopharmacol. – 2011. - V. 21 (1). – P. 1- 19.
348.
Arroyo J.P. Aldosterone paradox: differential regulation of ion transport in distal
nephron / J.P. Arroyo, C. Ronzaud, D. Lagnaz et al. // Physiology (Bethesda). – 2011. –
V. 26. – P. 115 – 123.
349.
Artaza J.N. 1,25(OH)2vitamin D3 inhibits cell proliferation by promoting cell cycle
arrest without inducing apoptosis and modifies cell morphology of mesenchymal
multipotent cells / J.N. Artaza, F. Sirad, M.G. Ferrini, K.C. Norris // J Steroid Biochem
Mol Biol. – 2010. – V. 119 (1-2). – P. 73 - 83.
350.
Aseem O. Cubilin maintains blood levels of HDL and albumin / O. Aseem, B.T. Smith,
M.A. Cooley et al. // J Am Soc Nephrol. – 2014. – V. 25 (5). – P. 1028 - 36.
351.
Asplin J.R. Obesity and urolithiasis / J.R. Asplin // Adv Chronic Kidney Dis. - 2009. –
V. 16 (1). – P. 11 - 20.
352.
Babakova L.L. Impact of 3-month simulation of the microgravity effects on the 42.
neuromuscular junction structure in rat’s m. soleus / L.L. Babakova, I.B. Krasnov, O.M.
Pozdniakov // Aviakosm. Ekolog. Med. – 2008. – V. 42 (4). – P. 31 – 35.
353.
Bakun M. Urine proteomes of healthy aging humans reveal extracellular matrix (ECM)
alterations and immune system dysfunction / M. Bakun, G. Senatorski, T. Rubel et al. //
Age (Dordr). – 2014. – V. 36 (1). – P. 299 - 311.
354.
Banach T. Applicability of 2D gel electrophoresis and liquid chromatography in proteomic
analysis of urine using mass spectrometry MALDI-TOF / T. Banach, Ł. Adaszek, D.
Wyłupek // Pol. J Vet Sci. - 2013. - V. 16 (3). - P. 587 - 92.
250
355.
Bandin F. Urinary proteome analysis at 5-year followup of patients with nonoperated
ureteropelvic junction obstruction suggests ongoing kidney remodeling / F. Bandin, J.
Siwy, B. Breuil et al. // J Urol. – 2012. – V. 187 (3). – P. 1006 - 11.
356.
Baqai F.P. Effects of spaceflight on innate immune function and antioxidant gene
expression / F.P. Baqai, D.S. Gridley, J.M. Slater et al. // J Appl Physiol (1985). 2009. V. 106 (6). – P. 1935 - 42.
357.
Barnes A.M. Lack of cyclophilin B in osteogenesis imperfecta with normal collagen
folding / A.M. Barnes, E.M. Carter, W.A. Cabral et al. // N Engl J Med. – 2010. – V. 362
(6). – P. 521 - 8.
358.
Barratt J. Urine proteomics: the present and future of measuring urinary protein
components in disease / J. Barratt, P. Topham // CMAJ. – 2007. – V. 177. – N. 4. – P.
361 - 368.
359.
Bartke T. Kouzarides TNucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone
methylation / T. Bartke, M. Vermeulen, B. Xhemalce et al. // Cell. – 2010. - V. 143 (3).
- P. 470 - 84.
360.
Barrowman J. Human ZMPSTE24 disease mutations: residual proteolytic activity correlates
with disease severity / P. A. Wiley, S.E. Hudon-Miller, C.A. Hrycyna et al. //Hum Mol
Genet. – 2012. - V. 21 (18). - P. 4084 - 93.
361.
Barsotti R.J. Measurement of ammonia in blood / R.J. Barsotti // J Pediatr. – 2001. V.
138(1 Suppl). - P. 11-9.
362.
Bastos-Amador P. Capture of cell-derived microvesicles (exosomes and apoptotic
bodies) by human plasmacytoid dendritic cells / P. Bastos-Amador, B. Pérez-Cabezas,
N. Izquierdo-Useros et al. // J Leukoc Biol. – 2012. – V. 91 (5). - P. 751 - 8.
363.
Batuman V. Myeloma light chains are ligands for cubilin (gp280) / V. Batuman, P.J.
Verroust, G.L. Navar et al. // Am J Physiol. – 1998. – V. 275 (2 Pt 2). – P. 246 - 54.
364.
Beck H.C. Quantitative proteomic analysis of post-translational modifications of human
histones / H.C. Beck, E.C. Nielsen, R. Matthiesen et al. // Mol Cell Proteomics. – 2006.
– V. 5 (7). – P. 1314 - 25.
365.
Begus-Nahrmann Y. p53 deletion impairs clearance of chromosomal-instable stem cells
in aging telomere-dysfunctional mice / Y. Begus-Nahrmann, A. Lechel, A.C. Obenauf
et al. // Nat Genet. – 2009. – V. 41 (10). – P. 1138 - 43.
366.
Bensimon A. Mass spectrometry-based proteomics and network biology / A. Bensimon,
A.J. Heck, R. Aebersold // Annu Rev Biochem. – 2012. – V. 81. – P. 379 - 405.
251
367.
Berendsen A.D. Modulation of canonical Wnt signaling by the extracellular matrix
component biglycan / A.D. Berendsen, L.W. Fisher, T.M. Kilts et al. // Proc Natl Acad
Sci U S A. – 2011. – V. 108 (41). – P. 17022 - 7.
368.
Berggard T. Prothrombin, albumin and immunoglobulin A form covalent complexes
with alpha1-microglobulin in human plasma / T. Berggard, N. Thelin, C. Falkenberg et
al. // Eur J Biochem. - 1997. – V. 245. – P. 676 – 683.
369.
Bergouignan A. Regulation of Energy Balance during Long-Term Phy- sical Inactivity
Induced by Bed Rest with and without Exercise Training / A. Bergouignan, I. Momken,
D. A. Schoeller et al. // Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. – 2010. - V.
95 (3). - P. 1045 - 1053.
370.
Bergquist J. Catecholamines and methods for their identification and quantitation in
biological tissues and fluids / J. Bergquist, A. Sciubisz, A. Kaczor, J. Silberring // J
Neurosci Methods. – 2002. – V. 113 (1). – P. 1 - 13.
371.
Beznosková P. Translation initiation factors eIF3 and HCR1 control translation
termination and stop codon read-through in yeast cells / P. Beznosková, L. Cuchalová,
S. Wagner et al. // PLoS Genet. - 2013. – V. 9 (11). - P. 1003962.
372.
Bhuyan A.K. On the mechanism of SDS-induced protein denaturation / A.K. Bhuyan //
Biopolymers – 2010. - V. 93 (2). – P. 186 - 99.
373.
Bladbjerg E.M. Genetic influence on thrombotic risk markers in the elderly- a Danish
twin study / E.M. Bladbjerg, M.P. de Maat, K. Christensene et al. // J Thromb Haemost.
– 2006. - V. 4 (3). – P. 599 - 607.
374.
Blanc S. Fuel Homeostasis during Physical Inactivity Induced by Bed Rest / S. Blanc, S.
Normand, C. Pachiaudi et al. // Journal of Clinical En- docrinology & Metabolism. –
2000. - V. 85 (6). – P. 2223 - 2233.
375.
Boersma M.D. Evaluation of diverse α/β-backbone patterns for functional α-helix
mimicry: analogues of the Bim BH3 domain / M.D. Boersma, H.S. Haase, K.J.
Peterson-Kaufman et al. // J Am Chem Soc. – 2012. – V. 134 (1). - P. 315 - 23.
376.
Böhmig G.A. n-butyrate downregulates the stimulatory function of peripheral bloodderived antigen-presenting cells: a potential mechanism for modulating T-cell responses
by short-chain fatty acids / G.A. Böhmig, P.M. Krieger, M.D. Säemann et al. //
Immunology. – 1997. – V. 92 (2). – P. 234 – 43.
377.
Bose B. Systems biology: a biologist's viewpoint / B. Bose // Prog Biophys Mol Biol. –
2013. – V. 113 (3). – P. 358 - 68.
252
378.
Botero-Velez M. Brief report: Liddle's syndrome revisited-a disorder of sodium
reabsorption in the distal tubule / M. Botero-Velez, J.J. Curtis, D.G. Warnock // N Engl
J Med. – 1994. - V. 330 (3). – P. 178 - 81.
379.
Bouley R. Calcitonin has a vasopressin-like effect on aquaporin-2 trafficking and
urinary concentration / R. Bouley, H.A. Lu, P. Nunes et al. // J. Am. Soc. Nephrol. –
2011. – V. 22. – N. 1. – P. 59 - 72.
380.
Brand H.S. Family 2 cystatins inhibit osteoclast-mediated bone resorption in calvarial
bone explants / H.S. Brand, U.H. Lerner, A. Grubb et al. // Bone. – 2004. – V. 35 (3). –
P. 689 - 96.
381.
Brown-Borg H.M. Long-living growth hormone receptor knockout mice: potential
mechanisms of altered stress resistance / H.M. Brown-Borg, S.G. Rakoczy, S. Sharma,
A. Bartke // Exp Gerontol. – 2009. – V. 44 (1-2). – P. 10 - 9.
382.
Brown D. Calcitonin has a vasopressin-like effect on aquaporin-2 trafficking and
urinary concentration / D. Brown // J. Am. Soc. Nephrol. – 2011. – V. 22. – N. 1. – P.
59 - 72.
383.
Bruckner B.A. Microporous polysaccharide hemosphere absorbable hemostat use in
cardiothoracic surgical procedures / B.A. Bruckner, L.N. Blau, L. Rodriguez et al. // J
Cardiothorac Surg. – 2014. – V. 9. – P. 134.
384.
Brüel A. Inhibition of cross-links in collagen is associated with reduced stiffness of the
aorta in young rats / A. Brüel, G. Ortoft, H. Oxlund //Atherosclerosis. – 1998. – V. 140
(1). – P. 135 - 45.
385.
Buczek O. Thermodynamics of single peptide bond cleavage in bovine pancreatic
trypsin inhibitor (BPTI) / O. Buczek, D. Krowarsch, J. Otlewski // Protein Sci. - 2002 V. 11 (4). - P. 924 - 32.
386.
Bulpitt C.J. The assessment of biological age: a report from the Department of
Environment Study / C.J. Bulpitt, M.J. Shipley, P.M. Broughton et al. // Aging
(Milano). – 1994. – V. 6 (3). – P. 181 - 91.
387.
Burkard T.R. Initial characterization of the human central proteome / T.R. Burkard, M.
Planyavsky, I. Kaupe et al. // BMC Syst Biol. – 2011. – V. 5 - P. 17.
388.
Burnier M. High salt intake: a cause of blood pressure-independent left ventricular
hypertrophy? / M. Burnier, O. Phan, Q. Wang // Nephrol Dial Transplant. – 2007. – V.
2 (9). – P. 2426 - 9.
389.
Butt S.A. Imaging cerebral 2-ketoisocaproate metabolism with hyperpolarized (13) C
magnetic resonance spectroscopic imaging / S.A. Butt, L.V. Sogaard, P.O. Magnusson
et al. // J Cereb Blood Flow Metab. – 2012. - V. 32 (8). – P. 1508 - 14.
253
390.
Butler G.C. Cardiovascular response to 4 hours of 6 degrees head-down tilt or of 30
degrees head-up tilt bed rest / G. C. Butler, H. C. Xing, R. L. Hughson // Aviat Space
Environ Med. – 1990. - V. 61 (3). – P. 240 - 6.
391.
Butler G.C. Reduced orthostatic tolerance following 4 h head-down tilt / G.C. Butler,
H.C. Xing, D. R. Northey, R.L. Hughson // Eur J Appl Physiol Occup Physiol. – 1991.
–V. 62 (1). – P. 26 – 3.
392.
Calabuig A.S. Prognostic significance and diagnosis of proteinuria in renal
transplantation / A. S. Calabuig, L. Guirado, D. Ramos // Transplant Rev (Orlando). –
2012. – V. 26 (1). – P. 30 - 5.
393.
Calamini B. Protein homeostasis as a therapeutic target for diseases of protein
conformation / B. Calamini, R.I. Morimoto // Curr Top Med Chem. - 2012. –V.12 (22).
- P. 2623 - 40.
394.
Campesi I. Glutamyl cycle in the rat liver appears to be sex-gender specific / I.
Campesi, A. Galistu, C. Carru et al. // Exp Toxicol Pathol. - 2013 – V. 65 (5). – P. 585
- 9.
395.
Campoli M. HLA antigen changes in malignant tumors of mammary epithelial origin:
molecular mechanisms and clinical implications / M. Campoli, C.C. Chang, S.A.
Oldford et al. // Breast Dis. – 2004. – V. 20. – P. 105 - 25.
396.
de los Campos G. Prediction of expected years of life using whole-genome markers / G.
de los Campos, Y.C. Klimentidis, A.I. Vazquez, D.B. Allison // PLoS One. – 2012. – V.
7 (7). - P. 40964.
397.
Carone F.A. Hydrolysis and transport of small peptides by the proximal tubule / F.A.
Carone, D.R. Peterson // Am J Physiol. – 1980. - V. 238 (3). – P. 151 - 8.
398.
Castagna A. Exploring the hidden human urinary proteome via ligand library beads / A.
Castagna, D. Cecconi, L. Sennels et al // J Proteome Res. – 2005. – V. 4 (6). – P. 1917 30.
399.
Caubet C. Advances in urinary proteome analysis and biomarker discovery in pediatric
renal disease / C. Caubet, C. Lacroix, S. Decramer et al. // Pediatr Nephrol. - 2010. – V.
25 (1). – P. 27 - 35.
400.
Cerletti M. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in
dystrophic muscles / M. Cerletti, S. Jurga, C.A. Witczak et al. // Cell. – 2008. – V. 134
(1). – P. 37 - 47.
401.
Chaĭka A.M. Changes in Plasma and Extracellular Fluid Volumes and Plasma Protein
Mass under Conditions of Head-Down Tilt Hypokinesia and Immersion / A.M. Chaĭka,
I.S. Balakhovskiĭ // Kosmicheskaia Biologiia i Aviakos - micheskaia Meditsina. - 1982.
254
- V. 16 (6). – P. 22 - 28.
402.
Chakravarthi S. Intracellular catalysis of disulfide bond formation by the human
sulfhydryl oxidase, QSOX1 / S. Chakravarthi, C.E. Jessop, M. Willer et al. // Biochem
J. – 2007. – V. 404 (3). – P. 403 - 11.
403.
Chalmers M.J. Combined top-down and bottom-up mass spectrometric approach to
characterization of biomarkers for renal disease / M.J. Chalmers, C.L. Mackay, C.L.
Hendrickson et al. // Anal Chem. – 2005. – V. 77 (22). – P. 7163 - 71.
404.
Chan T.M. Subtypes of associated protein-DNA (Transcription Factor-Transcription
Factor Binding Site) patterns / T.M. Chan, K.S. Leung, K.H. Lee et al. // Nucleic Acids
Res. - 2012 – V. 40 (19). – P. 9392 - 403.
405.
Chandel N.S. Redox regulation of p53 during hypoxia / N.S. Chandel, M.G. Vander
Heiden, C.B. Thompson, P.T. Schumacker // Oncogene. – 2000. - V. 19 (34). – P. 3840
- 8.
406.
Chapple S.J. Effects of 4-hydroxynonenal on vascular endothelial and smooth muscle
cell redox signaling and function in health and disease / S.J. Chapple, X. Cheng, G.E.
Mann // Redox Biol. – 2013 – V.1 (1). – P. 319 - 31.
407.
Chatzidaki-Livanis M. Genetic distinctions among clinical and environmental strains of
Vibrio vulnificus / M. Chatzidaki-Livanis, M.A. Hubbard, K. Gordon et al. // Appl
Environ Microbiol. – 2006. – V. 72. - P. 6136 – 6141.
408.
Chavan S. International variations in bladder cancer incidence and mortality / S.
Chavan, F. Bray, J. Lortet-Tieulent et al. // Eur Urol. – 2014. – V. 66 (1). – P. 59 - 73.
409.
Chave K.J. Molecular modeling and site-directed mutagenesis define the catalytic motif in
human gamma -glutamyl hydrolase / K.J. Chave, I.E. Auger, J. Galivan, T.J. Ryan // J Biol
Chem. – 2000. – V. 275 (51). – P. 40365 - 70.
410.
Chávez-Canales M. Insulin increases the functional activity of the renal NaCl
cotransporter / M. Chávez-Canales, J.P. Arroyo, B. Ko et al. // J Hypertens. – 2013. – V.
31 (2). – P. 303 - 11.
411.
Chen H.L. Simulated microgravity-induced oxidative stress in different areas of rat
brain / H.L. Chen, L.N. Qu, Q.D. Li et al. // Sheng Li Xue Bao. – 2009. – V. 61 (2). –
P. 108 - 14.
412.
Chen P. Collagen VI regulates peripheral nerve myelination and function / P. Chen, M.
Cescon, A. Megighian, P. Bonaldo // FASEB J. – 2014. – V. 28 (3). – P. 1145 - 56.
413.
Chen Y.T. Discovery of novel bladder cancer biomarkers by comparative urine
proteomics using iTRAQ technology / Y.T. Chen, C.L. Chen, H.W. Chen et al // J
Proteome Res. – 2010. – V. (11). - P. 5803 - 15.
255
414.
Cherkas L.F. The association between physical activity in leisure time and leukocyte
telomere length / L.F. Cherkas, J.L. Hunkin, B.S. Kato et al. // Arch Intern Med. – 2008.
– V. 168 (2). – P. 154 - 8.
415.
Cho H.J. Osteopontin: a multifunctional protein at the crossroads of inflammation,
atherosclerosis, and vascular calcification / H.J. Cho, H.J. Cho, H.S. Kim // Curr.
Atheroscler. Rep. – 2009. – V.11. – N.3. – P. 206 - 213.
416.
Choukèr A. Effects of confinement (110 and 240 days) on neuroendocrine stress
response and changes of immune cells in men / A. Choukèr, L. Smith, F. Christ et al. //
J. Appl. Physiol. – 2002. – V. 92. –P. 1619 – 1627.
417.
Christensen E.I. Receptor-mediated endocytosis in renal proximal tubule / E.I.
Christensen, P.J. Verroust, R. Nielsen // Pflugers Arch. – 2009. – V. 458 (6). – P. 1039 48.
418.
Chu S. Gastric secretion / S. Chu, M.L. Schubert // Curr Opin Gastroenterol. - 2013 – V.
29 (6). – P. 636 - 41.
419.
Chuang Y.C. Vibrio vulnificus infection in Taiwan: report of 28 cases and review of
clinical manifestations and treatment / Y.C. Chuang, C.Y. Yuan, C.Y. Liu et al. // Clin
Infect Dis. – 1992. – V. 15. – P. 271 – 276.
420.
Chung J.H. Molecular mechanism of PPAR in the regulation of age-related
inflammation / J.H. Chung, A.Y. Seo, S.W. Chung et al. // Ageing Res Rev. – 2008. –
V. 7 (2). – P. 126 - 36.
421.
Churchward-Venne T.A. Nutritional regulation of muscle protein synthesis with
resistance exercise: strategies to enhance anabolism / T.A. Churchward-Venne, N.A.
Burd, S.M. Phillips // Nutr Metab (Lond). - 2012. - V. 9 (1). - P. 40.
422.
Churchward-Venne T.A. Supplementation of a suboptimal protein dose with leucine or
essential amino acids: effects on myofibrillar protein synthesis at rest and following
resistance exercise in men / T.A. Churchward-Venne, N.A. Burd, C.J. Mitchell et al. // J
Physiol. - 2012. - V. 590 (Pt 11) – P. 2751 - 65.
423.
Clark J.E. Dynamics of haem oxygenase-1 expression and bilirubin production in
cellular protection against oxidative stress / J.E. Clark, R. Foresti, C.J. Green, R.
Motterlini // Biochemical Journal. - 2000. – V. 348 (3). - P. 615 - 619.
424.
Colombatti A. The EMILIN/Multimerin family / A. Colombatti, P. Spessotto, R.
Doliana et al. // Front Immunol. – 2012. – V. 2. – P. 93.
425.
Coon B.G. Lowe syndrome patient fibroblasts display Ocrl1-specific cell migration
defects that cannot be rescued by the homologous Inpp5b phosphatase / B.G. Coon, D.
Mukherjee, C.B. Hanna et al. // Hum Mol Genet. – 2009. – V. 18 (23). – P. 4478 - 91.
256
426.
Coon J.J. CE-MS analysis of the human urinary proteome for biomarker discovery and
disease diagnostics / J.J. Coon, P. Zürbig, M. Dakna et al. // Proteomics Clin Appl. –
2008.- V. 2 (7-8). –P. 964.
427.
Convertino V.A. Clinical aspects of the control of plasma volume at microgravity and
during return to one gravity / V.A. Convertino // Medicine & Science in Sports &
Exercise. – 1996. - V. 28 (10). – P. 45 - 52.
428.
Convertino V.A. Mechanisms of microgravity induced orthostatic intolerance:
implications for effective countermeasures / V.A. Convertino // J. Gravit. Physiol. 2002. - V. 9 (2). – P. 1 - 13.
429.
Corona G. The role of testosterone in erectile dysfunction / G. Corona, M. Maggi // Nat
Rev Urol. – 2010. – V. 7 (1). – P. 46 - 56.
430.
Cortellino S. Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by
linked deamination-base excision repair / S. Cortellino, J. Xu, M. Sannai et al. // Cell. 2011. - V. 146 (1). – P. 67 - 79.
431.
Costello C.E. Time, life ... and mass spectrometry. New techniques to address biological
questions / C.E. Costello // Biophys Chem. – 1997 – V. 68 (1-3). – P. 173 - 88.
432.
Coupe M. Cardiovascular deconditioning: from autonomic nervous system to
microvascular dysfunctions / M. Coupe, J.O. Fortrat, I.M. Larina et al. // Respiratory
Physiology & Neurobiology. – 2009. - V. 169 (1). – P. 10 - 12.
433.
Coupé M. Body Fluid Changes, Cardiovascular Deconditioning and Metabolic
Impairment Are Reversed 24 Hours after a 5-Day Dry Immersion / M. Coupé, E.
Tomilovskaya, F. Larcheret al. // Open Journal of Nephrology // 2013. – 3. – P. 13 - 24.
434.
Court M. Toward a standardized urine proteome analysis methodology / M. Court, N.
Selevsek, M. Matondo et al. // Proteomics. – 2011. - V. 11 (6). – P. 1160 - 71.
435.
Coyle E.F. Effects of Detraining on Cardiovascular Responses to Exercise: Role of
Blood Volume / E. F. Coyle, M. K. Hemmert, A. R. Coggan // Journal of Applied
Physiology. – 1986. - V. 60 (1). – P. 95 - 99.
436.
Craft E.M. The use of canine-specific albumin in dogs with septic peritonitis / E. M.
Craft, L.L. Powell //J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). - 2012. –V. 22 (6). – P. 631 9.
437.
Crick F. Central dogma of molecular biology / F. Crick // Nature. - 1970. - V. 227
(5258). – P. 561 - 3.
438.
Crugeiras J. Substituent effects on electrophilic catalysis by the carbonyl group:
anatomy of the rate acceleration for PLP-catalyzed deprotonation of glycine / J.
257
Crugeiras, A. Rios, E. Riveiros, J.P. Richard // J Am Chem Soc. - 2011. – V. 133 (9). –
P. 3173 - 83.
439.
Custaud M.A. No Effect of Venoconstrictive Thigh Cuffs on Orthostatic Hypotension
Induced by Head-Down Bed Rest / M.A. Custaud, C. Millet, J. Frutoso et al. // Acta
Physiologica Scandinavica. – 2000. - V. 170 (2). – P. 77 - 85.
440.
Custaud M.A. Regulation of blood volume during weightlessness simulation of long
duration / M.A. Custaud, E. Belin de Chantemèle, S. Blanc et al. // Can J Physiol
Pharmacol. – 2005. – V. 83 (12). – P. 1147 - 53.
441.
Cutrona M.B. Silencing of mammalian Sar1 isoforms reveals COPII-independent
protein sorting and transport / M.B. Cutrona, G.V. Beznoussenko, A. Fusella et al. //
Traffic. – 2013 – V. 14 (6). – P. 691 - 708.
442.
Dahl L.K. Primary role of renal homografts in setting chronic blood pressure levels in
rats / L.K. Dahl, M. Heine // Circ Res. – 1975. - V. 36 (6). – P. 692 - 6.
443.
Dalton L.E. Phosphoproteins in stress-induced disease / L.E. Dalton, E. Healey, J.
Irving, S.J. Marciniak // Prog Mol Biol Transl Sci. – 2012. – V. 106. – P. 189 - 221.
444.
Damsgaard C. Hemoglobin isoform differentiation and allosteric regulation of oxygen
binding in the turtle, Trachemys scripta / C. Damsgaard, J.F. Storz, F.G. Hoffmann, A.
Fago //Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2013. – V. 305 (8). – P. 961 - 7.
445.
Dass P.D. Adaptive ammoniagenesis in chronic renal failure / P.D. Dass, D. Martin //
Ren Physiol Biochem. – 1990. - V. 13 (5). – P. 259 - 63.
446.
Daubner S.C. Tyrosine hydroxylase and regulation of dopamine synthesis / S.C.
Daubner, T. Le, S. Wang // Arch Biochem Biophys. – 2011. – V. 508 (1). – P. 1 - 12.
447.
David V. Two-week longitudinal survey of bone architecture alteration in the hindlimbunloaded rat model of bone loss: sex differences / V. David, M.H. Lafage-Proust, N.
Laroche et al. // Am J Physiol Endocrinol Metab. – 2006. – V. 290 (3). – P. 440 - 7.
448.
Dawson J. Urinary proteomics to support diagnosis of stroke / J. Dawson, M. Walters,
C. Delles et al. // PLoS One. – 2012. – V. 7 (5). – P. 35879.
449.
Decramer S. Urine in clinical proteomics / S. Decramer, A. Gonzalez de Peredo, B.
Breuil et al. // Mol Cell Proteomics. - 2008. – V. 7 (10). – P. 1850 - 62.
450.
Della Penna S.L. Renal overexpression of atrial natriuretic peptide and hypoxia
inducible factor-1α as adaptive response to a high salt diet / S.L. Della Penna, G. Cao,
A. Carranza et al. // Biomed Res Int. – 2014. – P. 936978.
451.
Delles C. Urinary proteomic diagnosis of coronary artery disease: identification and
clinical validation in 623 individuals / C. Delles, E. Schiffer, C. von Zur Muhlen et al. //
J Hypertens. – 2010. – V. 28 (11). – P. 2316 - 22.
258
452.
Demenkov P.S. ANDVisio: a new tool for graphic visualization and analysis of
literature mined associative gene networks in the ANDSystem / P.S. Demenkov, T.V.
Ivanisenko, N.A. Kolchanov, V.A. Ivanisenko // In Silico Biol (Gedrukt). – 2011. – V.
11. – P. 149 – 161.
453.
Deng-Bryant Y. Ketogenic diet prevents alterations in brain metabolism in young but
not adult rats after traumatic brain injury / Y. Deng-Bryant, M.L. Prins, D.A. Hovda,
N.G. Harris // J Neurotrauma. - 2011. – V. 28 (9). – P. 1813 - 25.
454.
Denis C.V. von Willebrand factor: at the crossroads of bleeding and thrombosis / C.V.
Denis, P.J. Lenting // Int J Hematol. – 2012. – V. 95 (4). – P. 353 - 61.
455.
Diaz J. Progesterone promotes focal adhesion formation and migration in breast cancer
cells through induction of protease-activated receptor-1 / J. Diaz, E. Aranda, S.
Henriquez et al. // J Endocrinol. - 2012. – V. 214 (2). – P. 165 - 75.
456.
Dickinson K.M. Effects of a low-salt diet on flow-mediated dilatation in humans / K.M.
Dickinson, J.B. Keogh, P.M. Clifton // Am J Clin Nutr. – 2009. – V. 89 (2). – P. 485 –
90.
457.
Dickstein K. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart
failure 2008: the Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart
failure 2008 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with
the Heart Failure Association of the ESC (HFA) and endorsed by the European Society
of Intensive Care Medicine (ESICM) / K. Dickstein, A. Cohen-Solal, G. Filippatos et al.
// Eur J Heart Fail. – 2008. – V. 10 (10). – P. 933 - 89.
458.
Dijkstra S. Clinical use of novel urine and blood based prostate cancer biomarkers: a
review / S. Dijkstra, P.F. Mulders, J.A. Schalken // Clin Biochem. – 2014. – V. 47 (1011). – P. 889 - 96.
459.
Dilena B.A. Six methods for determining urinary protein compared / B.A. Dilena, L.A.
Penberthy, C.G. Fraser // Clin Chem. – 1983. – V. 29 (3). – P. 553 - 7.
460.
Dimke H. Molecular basis of epithelial Ca2+ and Mg2+ transport: insights from the
TRP channel family / H. Dimke, J.G.J. Hoenderop, R.J.M. Bindels // J Physiol (Lond).
– 2011. – V. 589. – P. 1535 – 1542.
461.
Dimmer E.C. The UniProt-GO Annotation database in 2011 / E.C. Dimmer, R.P.
Huntley, Y. Alam-Faruque et al. // Nucleic Acids Research: Oxford Journals Life
Sciences. – 2012. – V. 40 (D1). - P. 565 - 570.
462.
Dinenno F.A. The age-old tale of skeletal muscle vasodilation: new ideas regarding
erythrocyte dysfunction and intravascular ATP in human physiology / F.A. Dinenno,
B.S. Kirby // Circ Res. – 2012. – V. 111 (7). – P. 203 - 4.
259
463.
Djokic J. Fibulin-3, -4, and -5 are highly susceptible to proteolysis, interact with cells
and heparin, and form multimers / J. Djokic, C. Fagotto-Kaufmann, R. Bartels et al. // J
Biol Chem. – 2013. – V. 288 (31). – P. 22821 - 35.
464.
Doherty G.J. Mechanisms of endocytosis / G.J. Doherty, H.T. McMahon // Annu Rev
Biochem. - 2009. – V. 78. – P. 857 - 902.
465.
Domon B. Mass spectrometry and protein analysis / B. Domon, R. Aebersold // Science –
2006. - V. 312 (5771). – P. 212 - 7.
466.
Donaldson C.L. Effect of prolonged bed rest on bone mineral / C.L. Donaldson, S.B.
Hulley, J.M. Vogel et al. // Metabolism. – 1970. – V. 19 (12). – P. 1071 - 84.
467.
McDonough A.A. Mechanisms of proximal tubule sodium transport regulation that link
extracellular fluid volume and blood pressure / A.A. McDonough // Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol. – 2010. - V. 298 (4). – P. 851 - 61.
468.
Mc Donald K.S. Effect of hindlimb unloading on rat soleus fiber force, stiffness, and
calcium sensitivity / K.S. Mc Donald, R.H. Fitts // J. Appl Physiol (1985). – 1995. - V.
79 (5). – P. 1796 - 802.
469.
Dougherty G.J. Molecular cloning of CD44R1 and CD44R2, two novel isoforms of the
human CD44 lymphocyte "homing" receptor expressed by hemopoietic cells / G.J.
Dougherty, P.M. Landorp et al. // J Exp Med. – 1991. – V. 174 (1). – P. 1 – 5.
470. Drummer C. Water and sodium balances and their relation to body mass changes in
microgravity / C. Drummer, C. Hesse, F. Baisch et al. // Eur J Clin Invest. –
2000. - V. 30 (12). – P. 1066 - 75.
471.
Duggleby S.L. The end-product method of measuring whole-body protein turnover: a
review of published results and a comparison with those obtained by leucine infusion /
S.L. Duggleby, J.C. Waterlow // Br J Nutr. – 2005. – V. 94 (2). – P. 141 - 53.
472.
Durlach J. Biorhythms and possible central regulation of magnesium status,
phototherapy, darkness therapy and chronopathological forms of magnesium depletion /
J. Durlach, N. Pages, P. Bac et al. // Magnes Res. – 2002. – V. 1-2. – P. 49 - 66.
473.
Durlach J. Magnesium depletion with hypo- or hyper- function of the biological clock
may be involved in chronopathological forms of asthma / J. Durlach, N. Pages, P. Bac
et al. // Magnes Res. – 2005. – V. 1. – P. 19 - 34.
474.
Dvorak M.M. Thiazide diuretics directly induce osteoblast differentiation and
mineralized nodule formation by interacting with a sodium chloride co-transporter in
bone / M. M. Dvorak, C. De Joussineau, D.H. Carter et al. // J Am Soc Nephrol. – 2007.
– V. 18 (9). – P. 2509 - 16.
260
475.
Eaton D.C. Frontiers in renal and epithelial physiology - grand challenges / D. C. Eaton
// Front Physiol. – 2012. - V. 3. - P. 2.
476.
Edwards I.J. A simple method to fluorescently label pericytes in the CNS and skeletal
muscle / I.J. Edwards, M. Singh, S. Morris et al. // Microvasc Res. – 2013. - V. 89. - P.
164 - 8.
477.
Edwards L.M. Metabolomics reveals increased isoleukotoxin diol (12,13-DHOME) in
human plasma after acute Intralipid infusion / L.M. Edwards, N.G. Lawler, S.B. Nikolic
et al.// J Lipid Res. – 2012. – V. 53 (9). – P. 1979 - 86.
478.
Eknoyan G.A clinical view of simple and complex renal cysts / G. Eknoyan // J Am Soc
Nephrol. – 2009. – V. 20 (9). – P. 1874 - 6.
479.
El-Achkar T.M. Uromodulin in kidney injury: an instigator, bystander, or protector? / T.
M. El-Achkar, X.R. Wu // Am. J. Kidney Dis. – 2012. – V. 59 (3). – P. 452 - 461.
480.
Emmerson C.D. Enhancement of polymeric immunoglobulin receptor transcytosis by
biparatopic VHH / C.D. Emmerson, E.J. van der Vlist, M.R. Braam et al. // PLoS One.
– 2011. – V. 6. - P. 26299.
481.
Enwere E. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling,
diminished olfactory neurogenesis, and deficits in fine olfactory discrimination / E.
Enwere, T. Shingo, C. Gregg et al. // J Neurosci. – 2004. – V. 24 (38). – P. 8354 - 65.
482.
Epstein M.J. Renal, Endocrine and Hemodynamic Effects of Water Immersion in
Humans / M. Fregly, C.M. Blatteis // Handbook of Physiology, Environmental
Physiology. Oxford University Press, Oxford. – 1996. - P. 845 - 853.
483.
Ergin V. 4,5-dianilinophtalimide protects neuroendocrine cells against serum
deprivation-induced stress and apoptosis / V. Ergin, M. Erdogan, C. Karasu, A.
Menevse // Neuro Endocrinol Lett. - 2013. – V. 34 (5). – P. 359 - 65.
484.
Ernst A.A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system / A. Ernst, G.
Avvakumov, J. Tong et al. // Science. - 2013. – V. 339 (6119). – P. 590 - 5.
485.
Erridge C. Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia trachomatis and
Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2 / C. Erridge, A. Pridmore, A.
Eley et al. // J Med Microbiol. – 2004. – V. 53. - P. 735 – 740.
486.
España F. The role of protein C inhibitor in human reproduction / F. España, S.
Navarro, P. Medina et al. // Semin Thromb Hemost. – 2007. – V. 33. – P. 41 – 45.
487.
Esposito C. Functional changes in the aging kidney / C. Esposito, A. Dal Canton // J
Nephrol. – 2010. – V. 23 Suppl 15. – P. 41 - 5.
261
488.
Fan J. Structure and conformational change of a replication protein A heterotrimer
bound to ssDNA / J. Fan, N.P. Pavletich // Genes Dev. – 2012. - V. 26 (20). – P. 2337 47.
489.
Fanelli F. Age-dependent roles of peroxisomes in the hippocampus of a transgenic
mouse model of Alzheimer's disease / F. Fanelli, S. Sepe, M. D'Amelio et al. // Mol
Neurodegener. – 2013. – V. 8. – P. 8.
490.
Farzaneh-Far R. Telomere length trajectory and its determinants in persons with
coronary artery disease: longitudinal findings from the heart and soul study / R.
Farzaneh-Far, J. Lin, E. Epel et al. // PLoS One. – 2010. – V. 5 (1). – P. 8612.
491.
Felux A.K. Paracoccus denitrificans PD1222 utilizes hypotaurine via transamination
followed by spontaneous desulfination to yield acetaldehyde and, finally, acetate for
growth / A.K. Felux, K. Denger et al. // J Bacteriol. – 2013. – V. 195 (12). – P. 2921 30.
492.
Fenske M. Urinary free cortisol and cortisone excretion in healthy individuals: influence
of water loading / M. Fenske // Steroids. – 2006. – V. 71 (11-12). – P. 1014 - 1018.
493.
Fiedler G.M. Standardized peptidome profiling of human urine by magnetic bead
separation and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight
mass
spectrometry / G.M. Fiedler, S. Baumann, A. Leichtle et al. // Clin Chem. - 2007. – V.
53 (3). – P. 421 - 8.
494.
Fitts R.H. Effect of spaceflight on the isotonic contractile properties of single skeletal
muscle fibers in the rhesus monkey / R.H. Fitts, J.G. Romatowski, C. Blaser et al. // J
Gravit Physiol. – 2000. – V. 7 (1). - P. 53 - 4.
495.
Fliser D. Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry for clinical diagnostic
purposes / D. Fliser, S. Wittke, H. Mischak // Electrophoresis. – 2005. – V. 26. – V. 14.
– P. 2708 - 2716.
496.
Foty R.A. Cadherin-mediated cell-cell adhesion and tissue segregation in relation to
malignancy / R.A. Foty, M.S. Steinberg // Int J Dev Biol. – 2004. – V. 48 (5-6). – P. 397 409.
497.
Frey M.A. Cerebral blood velocity and other cardiovascular responses to 2 days of
head-down tilt / M.A. Frey, T.H. Mader, J.P. Bagian et al. // J. Appl. Physiol. – 1993. –
V. 74. – P. 319 - 325.
498.
Frohlich E.D. Target organ involvement in hypertension: a realistic promise of
prevention and reversal / E.D. Frohlich // Med Clin North Am. – 2004. – V. 88 (1). - P.
209 - 21.
262
499.
Fröhlich M. A systems biology approach: modelling of aquaporin-2 trafficking / M.
Fröhlich, P.M. Deen, E. Klipp // Genome Inform. – 2010. – V. 24. – N. 1. – P. 42 - 55.
500.
Fu J. Serine O-acetyltransferase is important, but not essential for cysteine-methionine
synthesis in Fusarium graminearum / J. Fu, X. Zhang, X. Chen, Y. Yin et al. // World J
Microbiol Biotechnol. – 2014. – V. 30 (4). – P. 1219 - 28.
501.
Fu Q. Vasoconstrictor reserve and sympathetic neural control of orthostasis / Q. Fu, S.
Witkowski, B.D. Levine // Circulation. – 2004. – V. 110 (18). – P. 2931 – 7.
502.
Fujita Y. Spectrophotometric determination of minocycline using zirconium (IV), ohydroxyhydroquinonephthalein and fluoride ions in the presence of sodium dodecyl
sulfate / Y. Fujita, I. Mori, S. Kitano // Chem Pharm Bull (Tokyo). – 1983. – V. 31 (11).
- P. 4016 - 21.
503.
Fujiwara N. Study on the relationship between plasma nitrite and nitrate level and salt
sensitivity in human hypertension: modulation of nitric oxide synthesis by salt intake /
N. Fujiwara, T. Osanai, T. Kamada et al. // Circulation. – 2000. – V. 101 (8). - P. 856 61.
504.
Fulladosa X. Estimation of total glomerular number in stable renal transplants / X.
Fulladosa, F. Moreso, J.A. Narváez et al. // J Am Soc Nephrol. – 2003. – V. 14 (10). –
P. 2662 - 8.
505.
Fuller J.H. Renal function, water and electrolyte exchange during bed rest with daily
exercise / J.H. Fuller, E.M. Bernauer, W.C. Adams // Aerosp Med. - 1970. – V. 41 (1). –
P. 60 - 72.
506.
Fusaro M. Bleeding, vertebral fractures and vascular calcifications in patients treated
with warfarin: hope for lower risks with alternative therapies / M. Fusaro, G. Crepaldi,
S. Maggi et al. // Curr Vasc Pharmacol. – 2011. – V. 9 (6). – P. 763 - 9.
507.
Fusaro M. Vitamin K, bone fractures, and vascular calcifications in chronic kidney
disease: an important but poorly studied relationship / M. Fusaro, G. Crepaldi, S. Maggi
et al. // J Endocrinal Invest. – 2011. – V. 34 (4). – P. 317 – 23.
508.
Gaddy J.A. High dietary salt intake exacerbates Helicobacter pylori-induced gastric
carcinogenesis / J.A. Gaddy, J.N. Radin, J.T. Loh et al. // Infect Immun. – 2013. – V. 81
(6). – P. 2258 - 67.
509.
Gage F.H. Structural plasticity: cause, result, or correlate of depression / F.H. Gage //
Biol Psychiatry. – 2000. – V. 48 (8). –P. 713 - 4.
510.
Gagliano N. Age-dependent expression of fibrosis-related genes and collagen deposition
in rat kidney cortex / N. Gagliano, B. Arosio, D. Santambrogio et al. // J Gerontol A
Biol Sci Med Sci. – 2000. – V. 55 (8). – P. 365 - 72.
263
511.
Gamba G. Vasopressin regulates the renal Na+-Cl- cotransporter / G. Gamba // Am J
Physiol Renal Physiol. – 2010. – V. 298 (3). – P. 500 - 1.
512.
García-Giménez E. Divalent Metal Ion Transport across Large Biological Ion Channels
and Their Effect on Conductance and Selectivity / E. García-Giménez, A. Alcaraz,
V.M. Aguilella // Biochem Res Int. – 2012. – P. 245786.
513.
Gaudet P. neXtProt: organizing protein knowledge in the context of human proteome
projects / P. Gaudet, G. Argoud-Puy, I. Cusin et al. // J Proteome Res. – 2013. - V. 12
(1). – P. 293 - 8.
514.
Gawarammana I. Fructose-1, 6-diphosphate (FDP) as a novel antidote for yellow
oleander-induced cardiac toxicity: a randomized controlled double blind study / I.
Gawarammana, F. Mohamed, S.J. Bowe et al. // BMC Emerg Med. – 2010. – V. 10. –
P. 15.
515.
Gawaz M. Platelets in tissue repair: control of apoptosis and interactions with
regenerative cells / M. Gawaz, S.Vogel // Blood. – 2013. – V. 122 (15). – P. 2550 - 4.
516.
Gekle M. Endosomal alkalinization reduces Jmax and Km of albumin receptor-mediated
endocytosis in OK cells / M. Gekle, S. Mildenberger, R. Freudinger, S. Silbernagl // Am
J Physiol. – 1995. – V. 268 (5 Pt 2). – P. 899 - 906.
517.
George S.J. Cadherin:catenin complex: a novel regulator of vascular smooth muscle cell
behaviour / S.J. George, C.A. Beeching // Atherosclerosis. – 2006. – V. 188 (1). – P. 1 11.
518.
Gerszten R.E. The search for new cardiovascular biomarkers / R.E. Gerszten, T.J. Wang
// Nature. – 2008. – V. 451 (7181). – P. 949 - 52.
519.
Gharib C. Fluid and electrolyte regulation in space / C. Gharib, R.L. Hughson // Adv
Space Biol Med. – 1992. – V. 2. – P. 113 - 30.
520.
Chekenya M. NG2 precursor cells in neoplasia: functional, histogenesis and therapeutic
implications for malignant brain tumours / M. Chekenya, G.J. Pilkington // J
Neurocytol. – 2002. – V. 31 (6-7). – P. 507 - 21.
521.
Giner V. Increased insulin resistance in salt sensitive essential hypertension / V. Giner,
A. Coca, A. de la Sierra // J Hum Hypertens. – 2001. – V. 15 (7). – P. 481- 5.
522.
Di Giulio C. Do we age faster in absence of gravity? / C. Di Giulio // Front Physiol. –
2013. - V. 4. – P. 134.
523.
Glassock R.J. The implications of anatomical and functional changes of the aging
kidney: with an emphasis on the glomeruli / R.J. Glassock, A.D. Rule // Kidney Int. –
2012. – V. 82 (3). – P. 270 - 7.
264
524.
Glogowska A. Epidermal growth factor cytoplasmic domain affects ErbB protein
degradation by the lysosomal and ubiquitin-proteasome pathway in human cancer cells /
A. Glogowska, J. Stetefeld, E. Weber et al. // Neoplasia. – 2012. – V. 14. - P. 396 – 409.
525.
Gogolev K.I. Comparative Assessment of Changes during Antior - thostatic
Hypokinesia and Immersion in Man / K.I. Gogolev, E.A. Aleksandrova, E.B.
Shul’zhenko // Human Physiology. – 1980. – V. 6 (6). – P. 392 - 396.
526.
Goncalves A. Postoperative serum proteomic profiles may predict metastatic relapse in
high-risk primary breast cancer patients receiving adjuvant chemotherapy / A.
Goncalves, B. Esterni, F. Bertucci et al. // Oncogen. – 2006. – V. 25. – P. 981 – 9.
527.
Good D.M. Naturally occurring human urinary peptides for use in diagnosis of chronic
kidney disease / D.M. Good, P. Zürbig, A. Argilés et al. // Mol Cell Proteomics. – 2010.
– V. 9 (11). –P. 2424 - 37.
528.
Gonzalez E.M. BMP-1/Tolloid-like metalloproteases process endorepellin, the
angiostatic C-terminal fragment of perlecan / E.M. Gonzalez, C.C. Reed, G. Bix et al. //
J Biol Chem. – 2005. – V. 280 (8). – P. 7080 - 7.
529.
Gonzales P. Urinary exosomes: is there a future? / P. Gonzales, T. Pisitkun, M. A.
Knepper // Nephrol Dial Transplant. – 2008. – V. 23 (6). – P. 1799 - 801.
530.
Granier S.A new era of GPCR structural and chemical biology / S. Granier, B. Kobilka
// Nat. Chem. Biol. - 2012. - Vol. 8. - P. 670 - 673.
531.
Graudal N.A. Effects of low sodium diet versus high sodium diet on blood pressure,
renin, aldosterone, catecholamines, cholesterol, and triglyceride / N.A. Graudal, T.
Hubeck-Graudal, G. Jurgens // Cochrane Database Syst Rev. – 2011. - V. (11) – P.
004022.
532.
Gravina S. Epigenetic factors in aging and longevity / S. Gravina, J. Vijg // Pflugers
Arch. – 2010. – V. 459 (2). – P. 247 - 58.
533.
Greene K.L. Cancer of the Prostate Strategic Urologic Research Endeavor (CaPSURE)
Investigators. Who is the average patient presenting with prostate cancer? / K.L.
Greene, J.E. Cowan, M.R. Cooperberg et al. // Urology. – 2005. – V. 66 (5 Suppl). – P.
76 - 82.
534.
Grichko V.P. Substrate profile in rat soleus muscle fibers after hindlimb unloading and
fatigue / V.P. Grichko, A. Heywood-Cooksey, K.R. Kidd, R.H. Fitts // J Appl Physiol
(1985). – 2000. – V. 88 (2). –P. 473 - 8.
535.
Grigoriev A.I. Water and electrolyte studies during long-term missions onboard the
space stations SALYUT and MIR / A.I. Grigoriev, B.V. Morukov, D.V. Vorobiev //
Clin Investig. – 1994. – V. 72 (3). – P. 169 - 89.
265
536.
Grigoriev A.I. Postflight water-salt metabolism in cosmonauts: The long-duration MIR
missions / A.I. Grigoriev, V.B. Noskov, I.M. Larina // Acta Astronautica. - 2009. - V.
65. – P. 820 - 824.
537.
Grönwall C. MAPK phosphatase-1 is required for regulatory natural autoantibodymediated inhibition of TLR responses / C. Grönwall, Y. Chen, J. Vas et al. // Proc Natl
Acad Sci USA. - 2012. - V. 109. - P. 19745 - 19750.
538.
de Groot P.C. Magnitude and time course of arterial vascular adaptations to inactivity in
humans / P.C. de Groot, M.W. Bleeker, M.T. Hopman // Exercise and Sport Sciences
Reviews. – 2006. - V. 34 (2). - P. 65 - 71.
539.
Gu J.W. Renal NF-kappaB activation and TNF-alpha upregulation correlate with saltsensitive hypertension in Dahl salt-sensitive rats / J.W. Gu, N. Tian, M. Shparago et al.
// Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. – 2006. - V. 291 (6). - P. 1817 - 24. Gu Y.
Functional analysis of mutations in the kinase domain of the TGF-beta receptor ALK1
reveals different mechanisms for induction of hereditary hemorrhagic telangiectasia / Y.
Gu, P. Jin, L. Zhang et al. // Blood. – 2006. – V. 107 (5). – P. 1951 - 4.
540.
Guarente L. Mitochondria-a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins? / L.
Guarente // Cell. – 2008. – V. 132 (2). – P. 171 - 6.
541.
Gullstrand B. Complement classical pathway components are all important in clearance
of apoptotic and secondary necrotic cells / B. Gullstrand, U. Martensson, G. Sturfelt et
al. // Clin Exp Immunol. – 2009. – V. 156 (2). – P. 303 - 11.
542.
Guyton A.C. Arterial pressure regulation. Overriding dominance of the kidneys in longterm regulation and in hypertension / A.C. Guyton, T.G. Coleman, A.V. Jr. Cowley et
al. // Am J Med. – 1972. – V. 52 (5). – P. 584 - 94.
543.
Guyton A.C. Blood pressure control - special role of the kidneys and body fluids / A.C.
Guyton // Science. – 1991. – V. 252 (5014). - P. 1813 - 6.
544.
Ha C.E. Novel insights into the pleiotropic effects of human serum albumin in health
and disease / C.E. Ha, N.V. Bhagavan // Biochim Biophys Acta. – 2013. – V. 1830 (12).
– P. 5486 - 93.
545.
Haase-Fielitz A. Urine hepcidin has additive value in ruling out cardiopulmonary
bypass-associated acute kidney injury: an observational cohort study / A. Haase-Fielitz,
P.R. Mertens, M. Plass et al // Crit Care. – 2011. – V. 15 (4). – P. 186.
546.
Han Q. Biochemical and structural properties of mouse kynurenine aminotransferase III
/ Q. Han, H. Robinson, T. Cai et al. // Mol Cell Biol. – 2009. – V. 29 (3). – P. 784 - 93.
547.
Han X. Mass spectrometry for proteomics / X. Han, A. Aslanian, J.R. 3rd Yates // Curr
Opin Chem Biol. – 2008. – V. 12 (5). – P. 483 - 90.
266
548.
Hanash S. Building a foundation for the human proteome: the role of the Human
Proteome Organization / S. Hanash // J Proteome Res. – 2004. – V. 3 (2). – P. 197 - 9.
549.
Haraldsson B. Tubular reabsorption of albumin: it's all about cubilin / B. Haraldsson // J
Am Soc Nephrol. – 2010. – V. 21 (11). – P. 1810 - 2.
550.
Hashemy S.I. The Human Thioredoxin System: Modifications and Clinical
Applications / S.I. Hashemy // Iran J Basic Med Sci. - 2011. – V. 14. – N. 3. – P. 191
- 204.
551.
Hatakeyama S. Serum N-glycan alteration associated with renal cell carcinoma detected
by high throughput glycan analysis / S. Hatakeyama, M. Amano, Y. Tobisawa et al. // J
Urol. – 2014. – V. 191 (3). – P. 805 - 13.
552.
Haubitz M. Identification and validation of urinary biomarkers for differential diagnosis
and evaluation of therapeutic intervention in anti-neutrophil cytoplasmic antibodyassociated vasculitis / M. Haubitz, D.M. Good, A. Woywodt et al. // Mol Cell
Proteomics. – 2009. – V. 8 (10). – P. 2296 - 307.
553.
Hayashi T. Sigma-1 receptors at galactosylceramide-enriched lipid microdomains
regulate oligodendrocyte differentiation / T. Hayashi, T. - P. Su // Proc Natl Acad Sci
USA 101. – 2004. - P. 14949 – 14954.
554.
He J.C. Systems biology of kidney diseases / J.C. He, P.Y. Chuang, A. Ma'ayan, R.
Iyengar // Kidney Int. - 2012. – V. 81 (1). – P. 22 - 39.
555.
Heer M. Calcium metabolism in microgravity / M. Heer, N. Kamps, C. Biener et al. //
Eur J Med Res. – 1999. – V. 4 (9). – P. 357 - 60.
556.
Heer M. Increasing sodium intake from a previous low or high intake affects water,
electrolyte and acid-base balance differently / M. Heer, P. Frings-Meuthen, J. Titze et
al. // Br J Nutr. – 2009. - V. 101 (9). – P. 1286 - 94.
557.
Heiser M. Vitamin E binding protein afamin protects neuronal cells in vitro / M. Heiser,
B. Hutter-Paier, L. Jerkovic et. al. // J Neural Transm Suppl. – 2002. – V. 62. – P. 337 45.
558.
Hellebrekers D.M. Identification of epigenetically silenced genes in tumor endothelial
cells / D.M. Hellebrekers, V. Melotte, E. Viré et al. // Cancer Res. – 2007. – V. 67 (9). P. 4138 - 48.
559.
Herder C. Biomarkers for the prediction of type 2 diabetes and cardiovascular disease /
C. Herder, M. Karakas, W. Koenig // Clin Pharmacol Ther. - 2011. – V. 90 (1). – P. 52 66.
267
560.
Herr D. Regulation of endothelial proliferation by the renin-angiotensin system in
human umbilical vein endothelial cells / D. Herr, M. Rodewald, H.M. Fraser et al.
Reproduction. – 2008. – V. 136 (1). – P. 125 - 30.
561.
Herrera G.M. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa
channels in mouse urinary bladder smooth muscle / G.M. Herrera, B. Etherton, B.
Nausch, M.T. Nelson // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. – 2005. – V. 289 (2).
– P. 402 - 409.
562.
Hester R.L. Systems biology and integrative physiological modelling / R.L. Hester, R.
Iliescu, R. Summers et al. // J Physiol. – 2011. – V. 589 (Pt 5). – P. 1053 - 60.
563.
Hicke L. Regulation of membrane protein transport by ubiquitin and ubiquitin-binding
proteins / L. Hicke, R. Dunn // Annu Rev Cell Dev Biol. – 2003. – V. 19. – P. 141 - 72.
564.
Hiemstra T.F. Uromodulin exclusion list improves urinary exosomal protein
identification / T.F. Hiemstra, P.D. Charles, S.S. Hester et al. // J Biomol Tech. – 2011.
– V. 22 (4). – P. 136 - 45.
565.
Higuchi O. Molecular mechanisms underlying the formation of neuromuscular junction / O.
Higuchi, Y. Yamanashi // Brain Nerve. – 2011. – V. 63 (7). – P. 649 - 55.
566.
Hilgenberg L.G. Alpha3Na+/K+-ATPase is a neuronal receptor for agrin / L.G.
Hilgenberg, H. Su, H. Gu et al. // Cell. – 2006. –V. 125 (2). – P. 359 - 69.
567.
Hinghofer-Szalkay H.G. Bed rest immobilization with various oral sodium supply:
plasma hormones and body fluids / H.G. Hinghofer-Szalkay, Z. László, D. Jezova et al.
// Endocr Regul. – 2002. – V. 36 (4). – P. 151 – 9.
568.
vB Hjelmborg J. Genetic influence on human lifespan and longevity / J.B. Hjelmborg, I.
Iachine, A. Skytthe et al. // Hum Genet. 2006. – V. 119 (3). – P. 312 – 21.
569.
Hoang K. Determinants of glomerular hypofiltration in aging humans / K. Hoang, J.C.
Tan, G. Derby et al. // Kidney Int. – 2003. – V. 64 (4). – P. 1417 - 24.
570.
Holecek M. Alterations in protein metabolism and amino acid concentrations in rats fed
by a high-protein (casein-enriched) diet - effect of starvation / M. Holecek, M. Kovarik
// Food Chem Toxicol. – 2011. – V. 49 (12). – P. 3336 - 42.
571.
Holecek M. Branched-chain amino acids and ammonia metabolism in liver disease:
therapeutic implications / M. Holecek // Nutrition. – 2013. – V. 29 (10). – P. 1186 - 91.
572.
Hopp L. Portraying the expression landscapes of cancer subtypes: A glioblastoma
multiforme and prostate cancer case study / L. Hopp, H. Wirth, M. Fasold, H. Binder //
Biology (Basel). – 2013. – V. 2 (4). – P. 1411 - 37.
573.
Horn H.F. Coping with stress: multiple ways to activate p53 / H.F. Horn, K.H. Vousden
// Oncogene. – 2007. – V. 26 (9). – P. 1306 - 16.
268
574.
Hoy W.E. A stereological study of glomerular number and volume: preliminary findings
in a multiracial study of kidneys at autopsy / W.E. Hoy, R.N. Douglas-Denton, M.D.
Hughson et al. // Kidney Int Suppl. – 2003. – V. (83). – P. 31 - 7.
575.
Hoyer J.R. Effects of microgravity on urinary osteopontin / J.R. Hoyer, R.A. Pietrzyk,
H. Liu, P.A. Whitson // J Am Soc Nephrol. – 1999. – V. 10 Suppl 14. – P. 389 - 93.
576.
Hu W.W. Chronic h1-antihistamine treatment increases seizure susceptibility after
withdrawal by impairing glutamine synthetase / W.W. Hu, Q. Fang, Z. H. Xu et al. //
CNS Neurosci Ther. – 2012. – V. 18 (8) – P. 683 - 90.
577.
Huang D.W. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive
functional analysis of large gene lists / D.W. Huang, B.T. Sherman, R.A. Lempicki //
Nucleic Acids Res. – 2009 – V. 7. - P. 1 – 13.
578.
Huang N.F. Engineering of aligned skeletal muscle by micropatterning / N.F. Huang,
R.J. Lee, S. Li // Am J Transl Res. – 2010. – V. 2 (1). – P. 43 - 55.
579.
Huang Y. Gravity, a regulation factor in the differentiation of rat bone marrow
mesenchymal stem cells / Y. Huang, Z.Q. Dai, S.K. Ling et al. // J Biomed Sci. – 2009.
– V. 16. – P. 87.
580.
Hubbard B.P. Small molecule SIRT1 activators for the treatment of aging and agerelated diseases / B.P. Hubbard, D.A. Sinclair // Trends Pharmacol Sci. – 2014. – V. 35
(3). – P. 146 - 54.
581.
Huegel J. Heparan sulfate in skeletal development, growth, and pathology: the case of
hereditary multiple exostoses / J. Huegel, F. Sgariglia, M. Enomoto-Iwamoto et al. //
Dev Dyn. – 2013. – V. 242 (9). – P. 1021 - 32.
582.
Hughson R.L. Reduced spontaneous baroreflex response slope during lower body
negative pressure after 28 days of head-down bed rest / R.L. Hughson, A. Maillet, C.
Gharib et al. // J Appl Physiol (1985). – 1994. – V. 77 (1). – P. 69 - 77.
583.
Hughson R.L. Recent findings in cardiovascular physiology with space travel / R.L.
Hughson // Respir. Physiol. Neurobiol. – 2009. - V. 1. – P. 38 - 41.
584.
Hyvärinen S. Recognition of malondialdehyde-modified proteins by the C terminus of
complement factor H is mediated via the polyanion binding site and impaired by
mutations found in atypical hemolytic uremic syndrome / S. Hyvärinen, K. Uchida, M.
Varjosalo et al. // J Biol Chem. - 2014. – V. 289 (7). – P. 4295 - 306.
585.
Igci M. Bikunin and α1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) gene mutational
screening in patients with kidney stones: a case-control study / M. Igci, A. Arslan, Y.Z.
Igci et al. // Scand J Urol Nephrol. – 2010. – V. 44. P. 413 – 419.
269
586.
Ingolia N.T. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep
sequencing of ribosome-protected mRNA fragments / N.T. Ingolia, G.A. Brar, S.
Rouskin et al. // Nat Protoc. – 2012. - V. 7 (8). – P. 1534 - 50.
587.
Ioannou A. Immunopathogenesis of ischemia/reperfusion-associated tissue damage / A.
Ioannou, J. Dalle Lucca, G.C. Tsokos // Clin Immunol. – 2011. – V. 141 (1). – P. 3 - 14.
588.
Di Iorio A. Sarcopenia: age-related skeletal muscle changes from determinants to
physical disability / A. Di Iorio, M. Abate, D. Di Renzo et al. // Int J Immunopathol
Pharmacol. – 2006. –V. 19 (4). – P. 703 - 19.
589.
Ireland H.A. FVII, FVIIa, and downstream markers of extrinsic pathway activation
differ by EPCR Ser219Gly variant in healthy men / H.A. Ireland, J.A. Cooper, F.
Drenos et al. // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2009. – V. 29 (11). – P. 1968 - 74.
590.
Ishihama Y. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics / Y.
Ishihama, J. Rappsilber, J.S. Andersen, M. Mann // J. Chromatogr. A. – 2002. – V. 979
(1-2). – P. 233 - 239.
591.
Ishikawa H. Ullrich disease: collagen VI deficiency: EM suggests a new basis for
muscular weakness / H. Ishikawa, K. Sugie, K. Murayama et al. // Neurology. – 2002. –
V. 59. - P. 920 – 923.
592.
Iwase S. Effects of three days of dry immersion on muscle sympathetic nerve activity
and arterial blood pressure in humans / S. Iwase, Y. Sugiyama, C. Miwa et al. // J Auton
Nerv Syst. – 2000. - V. 79 (2-3). – P. 156 - 64.
593.
Ix J.H. Fetuin-A is inversely associated with coronary artery calcification in
community-living persons: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis / J.H. Ix, R. Katz,
I.H. de Boer et al. // Clin Chem. – 2012. – V. 58 (5). – P. 887 - 95.
594.
Jacob F. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins / F. Jacob, J.
Monod // J Mol Biol. – 1961. – V. 3. – P. 318 - 56.
595.
Jacox L.A. Facial transplants in Xenopus laevis embryos / L.A. Jacox, A.J. Dickinson,
H. Sive // J Vis Exp. - 2014. – V. (85).
596.
Jain A.P. Bone morphogenetic proteins: The anomalous molecules / A.P. Jain, S. Pundir,
A. Sharma // J Indian Soc Periodontol. – 2013. – V. 17 (5). – P. 583 - 6.
597.
Jandrot-Perrus M. Cloning, characterization, and functional studies of human and mouse
glycoprotein VI: a platelet-specific collagen receptor from the immunoglobulin
superfamily / M. Jandrot-Perrus, S. Busfield, A.H. Lagrue et al. // Blood. – 2000. – V.
96 (5). – P. 1798 - 807.
270
598.
Jansen G. An interaction map of endoplasmic reticulum chaperones and foldases / G.
Jansen, P. Määttänen, A.Y. Denisov et al. // Mol Cell Proteomics. – 2012. – V. 11 (9). – P.
710 - 23.
599.
Jia L. An attempt to understand kidney's protein handling function by comparing plasma
and urine proteomes / L. Jia, L. Zhang, C. Shao et al. // PLoS One. – 2009. –V. 4 (4). –
P. 5146.
600.
Jimenez-Mallebrera C. Congenital muscular dystrophy: molecular and cellular aspects /
C. Jimenez-Mallebrera, S.C. Brown, C.A. Sewry, F. Muntoni // Cell Mol Life Sci. –
2005. – V. 62. – P. 809 – 823.
601.
Johnson M.D. Cerebrospinal fluid stimulates leptomeningeal and meningioma cell
proliferation and activation of STAT3 / M.D. Johnson, M. O'Connell, M. Facikу et al. //
J Neurooncol. – 2012. - V. 107 (1). – P. 121 - 31.
602.
Jones D.P. Redefining oxidative stress / D.P. Jones // Antioxid Redox Signal. – 2006. –
V. 8 (9-10). - P. 1865 - 79.
603.
Jones R.P. Fibulin 5 forms a compact dimer in physiological solutions / R.P. Jones,
M.C. Wang, T.A. Jowitt et al. // J Biol Chem. – 2009. – V. 284 (38). – P. 25938 - 43.
604.
Jørgensen J.T. A new manganese-based oral contrast agent (CMC-001) for liver MRI:
pharmacological and pharmaceutical aspects / J.T. Jørgensen, M. Rief, T.B. Brismar et
al. / Acta Radiol. – 2012. – V. 53 (7). – P. 707 - 13.
605.
Julian B.A. Urinary biomarkers of IgA nephropathy and other IgA-associated renal
diseases / B.A. Julian, S. Wittke, M. Haubitz et al. // World J Urol. – 2007. – V. 25 (5).
– P. 467 - 76.
606.
Kachaeva E.V. Various jobs of proteolytic enzymes in skeletal muscle during unloading:
facts and speculations / E.V Kachaeva, B.S. Shenkman // J Biomed Biotechnol. – 2012. P. 493618.
607.
Kakizawa S. Nitric Oxide-Induced Calcium Release: Activation of Type 1 Ryanodine
Receptor, a Calcium Release Channel, through Non-Enzymatic Post-Translational
Modification by Nitric Oxide / S. Kakizawa // Front Endocrinol (Lausanne). - 2013. –
V. 4. – P. 142.
608.
Kanbay M. Mechanisms and consequences of salt sensitivity and dietary salt intake / M.
Kanbay, Y. Chen, Y. Solak, P.W. Sanders // Curr Opin Nephrol Hypertens. – 2011. – V.
20 (1). – P. 37 - 43.
609.
Kang C. Identification of ubiquitin/ubiquitin-like protein modification from tandem mass
spectra with various PTMs / C. Kang, G. S. Yi // BMC Bioinformatics. – 2011. – V. 12
Suppl 14. – P. 8.
271
610.
Kapusta D.R. Central nervous system Gαi2-subunit proteins maintain salt resistance via
a renal nerve-dependent sympathoinhibitory pathway / D.R. Kapusta, C.L. Pascale, J.T.
Kuwabara, R.D. Wainford // Hypertension. – 2013. – V. 61 (2). - P. 368 - 75.
611.
Karas M. Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds Int / M.
Karas, D. Bachmann, U. Bahr, F. Hillenkamp // J. Mass Spectrom. Ion Proc. – 1987. –
V. 78. – P. 53 - 68.
612.
Kasper C.E. Expression of titin in skeletal muscle varies with hind-limb unloading /
C.E. Kasper, L. Xun // Biol Res Nurs. – 2000. – V. 2 (2). – P. 107 - 115.
613.
Kato A. Dermatopontin interacts with fibronectin, promotes fibronectin fibril formation,
and enhances cell adhesion / A. Kato, O. Okamoto, K. Ishikawa et al. // J Biol Chem. –
2011. – V. 286 (17). – P. 14861 - 9.
614.
Katori M. Renal (tissue) kallikrein-kinin system in the kidney and novel potential drugs
for salt-sensitive hypertension / M. Katori, M. Majima // Prog Drug Res. – 2014. – V.
69. – P. 59 - 109.
615.
Kaushik M.K. Prostaglandin D(2) is crucial for seizure suppression and postictal sleep /
M.K. Kaushik, K. Aritake, S. Kamauchi et al. // Exp Neurol. – 2014. – V. 253. – P. 82 - 90.
616.
Kayashima Y. The kallikrein-kinin system and oxidative stress / Y. Kayashima, O.
Smithies, M. Kakoki // Current Opinion in Nephrology and Hypertension. - 2012. – V.
21 (1). - P. 92 - 96.
617.
Kelley S.L. The crystal structure of human soluble CD14 reveals a bent solenoid with
a hydrophobic amino-terminal pocket / S.L. Kelley, T. Lukk, S.K. Nair, R.I. Tapping
// J Immunol. - 2013. - V. 190 (3). – P. 1304 – 11.
618.
Kennedy S. Semi-quantitation of urokinase plasminogen activator and its receptor in
breast carcinomas by immunocytochemistry / S. Kennedy, M.J. Duffy, C. Duggan et al.
// Br J Cancer. – 1998. – V. 77 (10). – P. 1638 - 41.
619.
Kentsis A. Discovery and validation of urine markers of acute pediatric appendicitis
using high-accuracy mass spectrometry / A. Kentsis, Y.Y. Lin, K. Kurek et al. // Ann
Emerg Med. – 2010. - V. 55 (1). – P. 62 - 70.
620.
Kentsis A. Challenges and opportunities for discovery of disease biomarkers using urine
proteomics / A. Kentsis // Pediatr Int. – 2011. – V. 53 (1). – P. 1 - 6.
621.
Kentsis A. Urine proteomics for discovery of improved diagnostic markers of Kawasaki
disease / A. Kentsis, A. Shulman, S. Ahmed et al. // EMBO Mol Med.- 2013.- V. 5 (2).
– P. 210 - 20.
622.
Kenyon C. The plasticity of aging: insights from long-lived mutants / C. Kenyon / Cell.
– 2005. – V. 120 (4). – P. 449 - 60.
272
623.
Khan A. Simple urinary sample preparation for proteomic analysis / A. Khan, N. H.
Packer // J Proteome Res. – 2006. – V. 5 (10). – P. 2824 - 38.
624.
McKiernan S.H. Longitudinal analysis of early stage sarcopenia in aging rhesus
monkeys / S.H. McKiernan, R. Colman, M. Lopez et al. // Exp Gerontol. – 2009. – V.
44 (3). – P. 170 - 6.
625.
Kietzmann T. Oxygen Radicals as Messengers in Oxygen-Dependent Gene Expression /
T. Kietzmann, J. Fandrey, H. Acker // News Physiol Sci. – 2000. – V. 15. – P. 202 208.
626.
Kim E. Review of the association between meat consumption and risk of colorectal
cancer / E. Kim, D. Coelho, F. Blachier // Nutr Res. – 2013. – V. 33 (12). – P. 983 - 94.
627.
Kim G.H. The thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter is an aldosterone-induced protein /
G.H. Kim, S. Masilamani, R. Turner et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1998. – V. 95
(24). – P. 14552 - 7.
628.
King J.D. Metalloproteins diversified: the auracyanins are a family of cupredoxins that
stretch the spectral and redox limits of blue copper proteins / J.D. King, C.L. McIntosh,
C.M. Halsey et al. // Biochemistry. – 2013. - V. 52 (46). – P. 8267 - 75.
629.
Kitsiou P.V. Glucose-induced changes in integrins and matrix-related functions in
cultured human glomerular epithelial cells / P.V. Kitsiou, A.K. Tzinia, W.G. StetlerStevenson et al. //Am J Physiol Renal Physiol. – 2003. – V. 284 (4). - P. 671 - 9.
630.
Kleene R. Glycans and neural cell interactions / R. Kleene, M. Schachner // Nat Rev
Neurosci. – 2004. – V. 5 (3). – P. 195 - 208.
631.
Klein J. Comparison of CE-MS/MS and LC-MS/MS sequencing demonstrates
significant complementarity in natural peptide identification in human urine / J. Klein,
T. Papadopoulos, H. Mischak, W. Mullen // Electrophoresis. – 2014. – V. 35 (7). – P.
1060 - 4.
632.
Kleinewietfeld M. Sodium chloride drives autoimmune disease by the induction of
pathogenic TH17 cells / M. Kleinewietfeld, A. Manzel, J. Titze et al. //Nature. – 2013. –
V. 496 (7446). - P. 518 - 22.
633.
Kleinman J.G. Osteopontin and calcium stone formation / J.G. Kleinman, J.A. Wesson,
J. Hughes // Nephron. Physiol. – 2004. – V. 98 (2). – P. 43 - 47.
634.
Kmieć Z. Cooperation of liver cells in health and disease / Z. Kmieć // Adv Anat
Embryol Cell Biol. – 2001. – V. III-XIII. – P. 1 - 151.
635.
Kobori H. The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology
of hypertension and kidney disease / H. Kobori, M. Nangaku, L.G. Navar, A.
Nishiyama // Pharmacol Rev. – 2007. – V. 59 (3). – P. 251 - 87.
273
636.
Konkel J.E. Balancing acts: the role of TGF-β in the mucosal immune system / J.E.
Konkel, W. Chen // Trends Mol Med. – 2011. - V. 7 (11). – P. 668 - 76.
637.
Konno S. Role of osteopontin, a multifunctional protein, in allergy and asthma / S.
Konno, M. Kurokawa, T. Uede et al. // Clin Exp Allergy. – 2011. – V. 41 (10). – P.
1360 - 6.
638.
Koolen M.I. Clinical biochemical and haemodynamic correlates of sodium sensitivity in
essential hypertension / M.I. Koolen, E. Bussemaker-Verduyn den Boer, P. van
Brummelen // J Hypertens Suppl. – 1983. – V. 1 (2). - P. 21 - 3.
639.
Koppers A.J. The role of cysteine-rich secretory proteins in male fertility / A.J. Koppers, T.
Reddy, M.K. O'Bryan // Asian J Androl. – 2011. – V. 13 (1). – P. 111 - 7.
640.
Konstantinova I.V. Cellular immunity and lymphokine production during spaceflights /
I.V. Konstantinova, G. Sonnenfeld, A.T. Lesnyak et al. // Physiologist. – 1991. – V. 34
(1 Suppl). – P. 52 - 6.
641.
Kottke M.D. The desmosome: cell science lessons from human diseases / M.D. Kottke,
E. Delva, A.P. Kowalczyk // J Cell Sci. – 2006. – V. 119 (Pt 5). – P. 797 - 806.
642.
Kovac S. Gastrins, iron homeostasis and colorectal cancer / S. Kovac, G.J. Anderson,
G.S. Baldwin // Biochim Biophys Acta. – 2011. - V. 1813 (5). – P. 889 - 95.
643.
Kozlovskaya I.B. Gravitational mechanisms in the motor system. Studies in real and
simulated weightlessness / I. Kozlovskaya, I. Dmitrieva, L. Grigorieva et al. // Stance
and Motion. Facts and Concepts (V.S. Gurfinkel, M. Ye. Ioffe, J. Massion eds). Plenum,
New York. – 1988. - P. 37 - 48.
644.
Krainer F.W. Knockout of an endogenous mannosyltransferase increases the
homogeneity of glycoproteins produced in Pichia pastoris / F.W. Krainer, C. Gmeiner,
L. Neutsch et al. // Sci Rep. – 2013. – V. 3. – P. 3279.
645.
Krasney J.A. “Head-Out Water Immersion: Animal Studies / M.J. Fregly, C.M. Blatteis
// Hand - book of Physiology, Environmental Physiology, Oxford University Press,
Oxford. - 1996. – P. 855 - 887.
646.
Kříž Z. How ionic strength affects the conformational behavior of human and rat beta
amyloids-a computational study / Z. Kříž, J. Klusák, Z. Krištofíková, J. Koča // PLoS
One. – 2013. – V. 8 (5). – P. 62914.
647.
Kuritzky L. Identification and management of albuminuria in the primary care setting /
L. Kuritzky, R. Toto, P. Van Buren // J Clin Hypertens (Greenwich). – 2011. – V. 13. P. 438 – 449.
274
648.
Kuzichkin D.S. Characteristics of the hemostasis system after long-duration space
missions / D.S. Kuzichkin, A.A. Markin, B.V. Morukov // Aviakosm Ekolog Med. –
2010. - V. 44 (2). – P. 68.
649.
Kuzichkin D.S. Effect of physical countermeasures against support load deficiency on
the hemostasis system in an experiment with 7-day immersion / D.S. Kuzichkin, A.A.
Markin, B.V. Morukov et al. // Aviakosm Ekolog Med. – 2013. – V. 47 (3). – P. 30 - 4.
650.
Kuznetsova T. Urinary proteome analysis in hypertensive patients with left ventricular
diastolic dysfunction / T. Kuznetsova, H. Mischak, W. Mullen, J.A. Staessen // Eur
Heart J. – 2012. – V. 33 (18). – P. 2342 - 50.
651.
Kwaan H.C. Role of plasma proteins in whole blood viscosity: a brief clinical review /
H.C. Kwaan // Clin Hemorheol Microcirc. – 2010. – V. 44 (3). – P. 167 - 76.
652.
Lamanna W.C. Sulf loss influences N-, 2-O-, and 6-O-sulfation of multiple heparan
sulfate proteoglycans and modulates fibroblast growth factor signaling / W.C. Lamanna,
M.A. Frese, M. Balleininger, T. Dierks // J Biol Chem. – 2008. – V. 283 (41). – P. 7724
- 35.
653.
Lampe A.K. Collagen VI related muscle disorders / A. K. Lampe, K.M.D. Bushby // J
Med Genet. – 2005. – V. 42. - P. 673 – 685.
654.
Lander E.S. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing
and analysis of the human genome / E.S. Lander, L.M. Linton, B. Birren et al. // Nature.
-2001. – V. 409. - (6822). – P. 860 - 921.
655.
Landmesser U. Endothelial function and hypertension / U. Landmesser, H. Drexler //
Current Opinion in Cardiology. - 2007. – V. 22 (4). - P. 316 - 320.
656.
Larsen M. Precursors for liver gluconeogenesis in periparturient dairy cows / M. Larsen,
N.B. Kristensen // Animal. – 2013. – V. 7 (10). – P. 1640 – 50.
657.
Lathers C.M. Comparison of cardiovascular function during the early hours of bed rest
and space flight / C.M. Lathers, J.B. Charles // J Clin Pharmacol. – 1994. – V. 34 (5). –
P. 489 - 99.
658.
Laudisi F. Cutting edge: the NLRP3 inflammasome links complement-mediated
inflammation and IL-1β release / F. Laudisi, R. Spreafico, M. Evrard et al. // J Immunol.
– 2013. – V. 191 (3). – P. 1006 - 10.
659.
Leach Huntoon C.S. Fluid and electrolytes regulation in space flight / C.S. Leach
Huntoon, A.I. Grigoriev, Yu.V. Natochin // Science and thechnology Series. - 1998. - V.
94. – P. 219.
660.
Leclercq L. Adsorption of proteins at physiological concentrations on pegylated surfaces
and the compatibilizing role of adsorbed albumin with respect to other proteins
275
according to optical waveguide lightmode spectroscopy (OWLS) / L. Leclercq, E.
Modena, M. Vert // J Biomater Sci Polym Ed. – 2013. – V. 24 (13). – P. 1499 - 518.
661.
Lee B. Waldenström's macroglobulinemia and nephrotic syndrome with membranous
nephropathy / B. Lee, R.S. Smith, N. Tanphaichitr et al. // Scand J Urol Nephrol. –
2011. – V. 45 (6). – P. 473 - 7.
662.
Lee C.K. (1)H, (13) C, (15) N backbone and side-chain resonance assignments of rat
angiogenin / C.K. Lee, K.J. Yeo, E. Hwang, H.K. Cheong // Biomol NMR Assign. –
2013. – V. 7 (1). – P. 89 - 92.
663.
Lei T.
Discovery of potential bladder cancer biomarkers by comparative urine
proteomics and analysis / T. Lei, X. Zhao, S. Jin et al // Clin Genitourin Cancer. – 2013.
- V. 11. P. 56 – 62.
664.
Lely A.T. Low dietary sodium and exogenous angiotensin II infusion decrease plasma
adiponectin concentrations in healthy men / A.T. Lely, J.A. Krikken, S.J. Bakker et al. //
J Clin Endocrinol Metab. – 2007. – V. 92 (5). – P. 1821 - 6.
665.
Leney A.C. Insights into the role of the beta-2 microglobulin D-strand in amyloid
propensity revealed by mass spectrometry / A.C. Leney, C.L. Pashley, C.A. Scarff et al.
// Mol Biosyst. – 2014. – V. 10 (3). – P. 412 - 20.
666.
Lento W. Loss of β-catenin triggers oxidative stress and impairs hematopoietic
regeneration / W. Lento, T. Ito, C. Zhao et al. // Genes Dev. – 2014. – V. – 28 (9). – P.
995 - 1004.
667.
Levi M. Thrombomodulin in sepsis / M. Levi, T. Van Der Poll // Minerva Anestesiol. –
2013. - V. 79 (3). – P. 294 - 8.
668.
Lewis M.L. Spaceflight alters microtubules and increases apoptosis in human
lymphocytes (Jurkat) / M.L. Lewis, J.L. Reynolds, L.A. Cubano et al. // FASEB J. –
1998. - V. 12 (11). – P. 1007 - 18.
669.
Li F. Identification of urinary Gc-globulin as a novel biomarker for bladder cancer by
two-dimensional fluorescent differential gel electrophoresis (2D-DIGE) / F. Li, D.N.
Chen, C.W. He et al. // J Proteomics. – 2012. – V. 77. – P. 225 - 36.
670.
Lu J. Albumin as a zinc carrier: properties of its high-affinity zinc-binding site / J. Lu,
A.J. Stewart, P.J. Sadler et al. // Biochem Soc Trans. – 2008. – V. 36. – P. 1317 – 1321.
671.
Li S. Mechanism of platelet functional changes and effects of anti-platelet agents on in
vivo hemostasis under different gravity conditions / S. Li, Q. Shi, G. Liu et al. // J Appl
Physiol (1985). - 2010. - V. 108 (5). – P. 1241 - 9.
276
672.
Li Y. Detection and verification of glycosylation patterns of glycoproteins from clinical
specimens using lectin microarrays and lectin-based immunosorbent assays / Y. Li, S.C.
Tao, G.S. Bova et al. // Anal Chem. – 2011. – V. 83 (22). – P. 8509 - 16.
673.
Li Y. Hepatocyte growth factor is a downstream effector that mediates the antifibrotic
action of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists / Y. Li, X. Wen,
B.C. Spataro et al. // J Am Soc Nephrol. – 2006. – V. 17 (1). – P. 54 - 65.
674.
Liao J. Statins as adjunctive therapy in the management of hypertension / J. Liao, J.A.
Farmer // Curr Atheroscler Rep. – 2010. – V. 12 (5). – P. 349 - 54.
675.
Ling X.B. Integrative urinary peptidomics in renal transplantation identifies biomarkers
for acute rejection / X.B. Ling, T.K. Sigdel, K. Lau et al. // J Am Soc Nephrol. – 2010. –
V. 21 (4). – P. 646 - 53.
676.
Link A.J. Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry / A. J. Link, J.
Eng, D. M. Schieltz et al. // Nat Biotechnol. – 1999. – V. 17 (7). – P. 676 - 82.
677.
Lipsitz L.A. Loss of 'complexity' and aging. Potential applications of fractals and chaos
theory to senescence / L.A. Lipsitz, A.L. Goldberger // JAMA. – 1992. – V. 267 (13). –
P. 1806 - 9.
678.
Little T.J. Role of cholecystokinin in appetite control and body weight regulation / T.J.
Little, M. Horowitz, C. Feinle-Bisset // Obes Rev. – 2005. – V. 6 (4). – P. 297 - 306.
679.
Liu A.P. Membrane-induced bundling of actin filaments / A.P. Liu, D.L. Richmond, L.
Maibaum // Nature Physics. – 2008. – V. 4. – P. 789 - 793.
680.
Liu X. An individual urinary proteome analysis in normal human beings to define the
minimal sample number to represent the normal urinary proteome / X. Liu, C. Shao, L.
Wei et al. // Proteome Sci. – 2012. – V. 10 (1). – P. 70.
681.
Liu X. TiGER: a database for tissue-specific gene expression and regulation / X. Liu, X.
Yu, D.J. Zack, H. Zhu, J. Qian // BMC Bioinformatics. - 2008. - V. 9. - P. 271.
682.
Liu Y. Quantitative measurements of N-linked glycoproteins in human plasma by
SWATH-MS / Y. Liu, R. Hüttenhain, S. Surinova et al. // Proteomics. – 2013. – V. 13
(8). – P. 1247 - 56.
683.
Llopis-Hernández V. Role of material-driven fibronectin fibrillogenesis in protein
remodeling / V. Llopis-Hernández, P. Rico, D. Moratal et al. // Biores Open Access. –
2013. – V. 2 (5). – P. 364 - 73.
684.
Lobachik V.I. Hemodynamic effects of microgravity and their ground-based simulations
/ V.I. Lobachik, S.V. Abrosimov, V.V. Zhidkov, D.K. Endeka // Acta Astronaut. –
1991. – V. 23. – P. 35 - 40.
277
685.
Longenecker K.L. Crystal structures of DPP-IV (CD26) from rat kidney exhibit flexible
accommodation of peptidase-selective inhibitors / K.L. Longenecker, K.D. Stewart, D.J.
Madar et al. // Biochemistry. – 2006. – V. 45 (24). – P. 7474 - 82.
686.
López Farré A. Heart failure, redox alterations, and endothelial dysfunction / A. López
Farré, S. Casado // Hypertension. - 2001. – V. 38 (6). – P. 1400 - 1405.
687.
Lorenz E.C. Clinical characteristics of potential kidney donors with asymptomatic
kidney stones / E.C. Lorenz, J.C. Lieske, T.J. Vrtiska et al. // Nephrol Dial Transplant. –
2011. – V. 26 (8). – P. 2695 - 700.
688.
van der Lubbe N. K+-induced natriuresis is preserved during Na+ depletion and
accompanied by inhibition of the Na+-Cl- cotransporter / N. van der Lubbe, A.D. Moes,
L.L. Rosenbaek et al. // Am J Physiol Renal Physiol. – 2013. – V. 305 (8). – P. 1177 88.
689.
Luo H.N. Light turn-on transient of a whispering gallery mode resonance spectrum in
different gas atmospheres / H.N. Luo, H.S. Kim, M. Agarwal, I. Teraoka // Appl Opt. –
2013. – V. 52 (12). – P. 2834 - 40.
690.
Maack T. Renal filtration, transport, and metabolism of low-molecular-weight proteins:
a review / T. Maack, V. Johnson, S.T. Kau et al. // Kidney Int. – 1979. – V. 16. – P. 251
– 270.
691.
Machnik A. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a
vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism / A. Machnik, W.
Neuhofer, J. Jantsch et al. // Nat Med. – 2009. - V. 15 (5). - P. 545 - 52.
692.
Maere S. BiNGO: a Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology
categories in biological networks / S. Maere, K. Heymans, M. Kuiper // Bioinformatics.
– 2005. – V. 21. – P. 3448 – 3449.
693.
Maffeo C. End-to-end attraction of duplex DNA / C. Maffeo, B. Luan, A. Aksimentiev
// Nucleic Acids Res. - 2012. – V. 40 (9). – P. 3812 - 21.
694.
Magrane M. UniProt Knowledgebase: a hub of integrated protein data / M. Magrane, U.
Consortium // Database (Oxford). – 2011. – P. 1 – 13.
695.
Maillet A. Cardiovascular and hormonal response during a 4-week head-down tilt with
and without exercise and LBNP countermeasures / A. Maillet, S. Fagette, A.M. Allevard
et al. // J Gravit Physiol. – 1996. – V. 3 (1). – P. 37 - 48.
696.
Maillet A. Orthostatic tolerance and hormonal changes in women during 120 days of
head-down bed rest / A. Maillet, M. Zaouali-Ajina, D. Vorobiev et al. //Aviat Space
Environ Med. – 2000. – V. 71 (7). – P. 706 - 14.
278
697.
Malmström E. Protein C inhibitor-a novel antimicrobial agent / E. Malmström, M.
Mörgelin, M. Malmsten et al. // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5. – P. 1000698.
698.
Mancilla E. Time-zero renal biopsy in living kidney transplantation: a valuable
opportunity to correlate predonation clinical data with histological abnormalities / E.
Mancilla, C. Avila-Casado, N. Uribe-Uribe et al. // Transplantation. – 2008. – V. 86
(12). –P. 1684 - 8.
699.
Mann M. Proteomic analysis of post-translational modifications / M. Mann, O.N. Jensen
// Nat Biotechnol. – 2003. – V. 21 (3). – P. 255 - 61.
700.
Mano T. Autonomic neural functions in space / T. Mano // Current Pharmaceutical
Biotechnology. – 2005. - V. 6 (4). - P. 319 - 324.
701.
Manzano-Fernández S. Usefulness of β-trace protein and cystatin C for the prediction of
mortality in non ST segment elevation acute coronary syndromes / S. ManzanoFernández, A. López-Cuenca, J.L. Januzzi et al. // Am J Cardiol. – 2012. – V. 110 (9). –
P. 1240 - 8.
702.
Marimuthu A. A comprehensive map of the human urinary proteome / A. Marimuthu,
R.N. O'Meally, R. Chaerkady et al. // J Proteome Res. – 2011. – V. 10 (6). – P. 2734 43.
703.
Marshall T. Protein determination in cerebrospinal fluid by protein dye-binding assay /
T. Marshall, K.M. Williams // Br J Biomed Sci. – 2000. – V. 57 (4). – P. 281 - 6.
704.
Marshall T. Total protein determination in urine: elimination of a differential response
between the coomassie blue and pyrogallol red protein dye-binding assays / T.
Marshall, K.M. Williams // Clin Chem. – 2000. – V. 46 (3). – P. 392 - 8.
705.
Marshall T. Elimination of the interference from aminoglycoside antibiotics in the
pyrogallol red-molybdate protein dye-binding assay / T. Marshall, K.M. Williams //
Clin Chem. – 2004. – V. 50 (9). – P. 1674 - 5.
706.
Martin J.E. The pathology of ageing: concepts and mechanisms / J.E. Martin, M.T.
Sheaff // J Pathol. – 2007. – V. 211 (2). – P. 111 - 3.
707.
Maskrey B.H. Mechanisms of resolution of inflammation: a focus on cardiovascular
disease / B.H. Maskrey, I.L. Megson, P.D. Whitfield, A.G. Rossi // Arterioscler Thromb
Vasc Biol. – 2011. - V. 31 (5). – P. 1001 - 6.
708.
Matsushita K. Diabetes-induced inhibition of voltage-dependent calcium channels in the
retinal microvasculature: role of spermine / K. Matsushita, M. Fukumoto, T. Kobayashi
et al. // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2010. – V. 51 (11). – P. 5979 - 90.
709.
Meier J.J. Diminished glucagon suppression after β-cell reduction is due to impaired αcell function rather than an expansion of α-cell mass / J.J. Meier, S. Ueberberg, S.
279
Korbas, S. Schneider // Am J Physiol Endocrinol Metab. – 2011. – V. 300 (4). – P. 717 23.
710.
Mengxi D. Effect of DNA methylation inhibitor on RASSF1A genes expression in nonsmall cell lung cancer cell line A549 and A549DDP / D. Mengxi, W. Qian, W. Nan et
al. // Cancer Cell Int. – 2013. – V. 13 (1). – P. 91.
711.
Metzger J. Urine proteomic analysis differentiates cholangiocarcinoma from primary
sclerosing cholangitis and other benign biliary disorders / J. Metzger, A.A. Negm, R.R.
Plentz, et al. // Gut. – 2013. – V. 62 (1). – P. 122 - 30.
712.
Meyer K.D. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3'
UTRs and near stop codons / K. D. Meyer, Y. Saletore, P. Zumbo et al. // Cell. – 2012.
– V. 149 (7). – P. 1635 - 46.
713.
Meyer R.C. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and
glioprotective factors prosaptide and prosaposin / R.C. Meyer, M.M. Giddens, S.A.
Schaefer, R.A. Hall // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2013. – V. -110 (23). – P. 9529 - 34.
714.
Meyers V.E. RhoA and cytoskeletal disruption mediate reduced osteoblastogenesis and
enhanced adipogenesis of human mesenchymal stem cells in modeled microgravity /
V.E. Meyers, M. Zayzafoon, J.T. Douglas, J.M. McDonald // J Bone Miner Res. – 2005.
– V. 20 (10). – P. 1858 - 66.
715.
Millet C. Endocrine responses to 7 days of head-down bed rest and orthostatic tests in
men and women / C. Millet, M.A. Custaud, A. Maillet et al. // Clin Physiol. – 2001. –
V. 21 (2). – P. 172 - 83.
716.
Millward D.J. Identifying recommended dietary allowances for protein and amino acids:
a critique of the 2007 WHO/FAO/UNU report / D.J. Millward // Br J Nutr. – 2012. – V.
108 Suppl 2. – P. 3 - 21.
717.
Miner J.H. Organogenesis of the kidney glomerulus: focus on the glomerular basement
membrane / J.H. Miner // Organogenesis. – 2011. – V. 7 (2). – P. 75 - 82.
718.
Miniño A.M. Deaths: final data for 2008 / A.M. Miniño, S.L. Murphy, J. Xu, K.D.
Kochanek // Natl Vital Stat Rep. – 2011. – V. 59 (10). – P. 1 - 126.
719.
Mischak H. Clinical proteomics: A need to define the field and to begin to set adequate
standards / H. Mischak., R. Apweiler., R. E. Banks et al. // Proteomics Clin. Appl. –
2007. – V. 1 (2). – P. 148 - 156.
720.
Mischak H. Capillary electrophoresis-mass spectrometry as a powerful tool in
biomarker discovery and clinical diagnosis: an update of recent developments / H.
Mischak, J.J. Coon, J. Novak et al. // Mass Spectrom Rev. – 2009. – V. 28 (5). – P. 703
- 24.
280
721.
Mischak H. Urinary proteomics based on capillary electrophoresis-coupled mass
spectrometry in kidney disease: discovery and validation of biomarkers, and clinical
application / H. Mischak, C. Delles, J. Klein, J.P. Schanstra // Adv Chronic Kidney Dis.
– 2010. – V. 17 (6). – P. 493 – 506.
722.
Mischak H. Renal and urinary proteomics / H. Mischak, V. Thongboonkerd, J.P.
Schanstra, A. Vlahou // Proteomics Clin Appl. – 2011. – V. 5 (5-6). – P. 211 - 3.
723.
Mischak H. Technical aspects and inter-laboratory variability in native peptide
profiling: the CE-MS experience / H. Mischak, A. Vlahou, J.P. Ioannidis // Clin
Biochem. – 2013. – V. 46 (6). – P. 432 - 43.
724.
Miuma S. The level of fasting serum insulin, but not adiponectin, is associated with the
prognosis of early stage hepatocellular carcinoma / S. Miuma, T. Ichikawa, N. Taura et
al. // Oncol Rep. – 2009. – V. 22 (6). – P. 1415 - 24.
725.
Miyamoto M. Present status of therapeutic angiogenesis by autologous bone marrow
cell implantation for refractory chronic peripheral arterial disease and ischemic heart
disease / M. Miyamoto, M. Yasutake, H. Takano et al. // Journal of Nippon Medical
School. - 2003. – V. 70 (5). - P. 436 - 441.
726.
Miyamoto S. Increased plasma levels of thioredoxin in patients with coronary spastic
angina / S. Miyamoto, H. Kawano, T. Sakamoto et al. // Antioxid Redox Signal. – 2004.
– V. 6 (1). – P. 75 - 80.
727.
Molin L. A comparison between MALDI-MS and CE-MS data for biomarker
assessment in chronic kidney diseases / L. Molin, R. Seraglia, A. Lapolla et al. // J
Proteomics. – 2012. – V. 75 (18). – P. 5888 - 97.
728.
Molofsky A.V. Increasing p16INK4a expression decreases forebrain progenitors and
neurogenesis during ageing / A.V. Molofsky, S.G. Slutsky, N.M. Joseph et al. // Nature.
– 2006. – V. 443 (7110). – P. 448 - 52.
729.
Morel C. Involvement of sulfhydryl oxidase QSOX1 in the protection of cells against
oxidative stress-induced apoptosis / C. Morel, P. Adami, J.F. Musard et al. // Exp Cell
Res. – 2007. – V. 313 (19). – P. 3971 - 82.
730.
Mori K. Fetuin-A and the cardiovascular system / K. Mori, M. Emoto, M. Inaba // Adv.
Clin. Chem. - 2012. - V. 56. - P. 175 - 95.
731.
Moriwaki H. Branched-chain amino acids as a protein- and energy-source in liver
cirrhosis / H. Moriwaki, Y. Miwa, M. Tajika, M. Kato et al. // Biochem Biophys Res
Commun. – 2004. – V. 313 (2). – P. 405 - 9.
281
732.
Morukov B.V. Biochemical markers of bone tissue metabolism in cosmonauts after a
prolonged spaceflight / B.V. Morukov, I.A. Nichiporuk, V.S. Tret'iakov, I.M. Larina //
Fiziol Cheloveka. – 2005. - V. 31 (6). – P. 73- 7.
733.
Motoyoshi Y. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during
nonselective proteinuria / Y. Motoyoshi, T. Matsusaka, A. Saito et al. // Kidney Int. –
2008. – V. 74. – N. 10. – P. 1262 - 1269.
734.
Al Moustafa A. - E. EGF-receptor signaling and epithelial-mesenchymal transition in
human carcinomas / A.- E. Al Moustafa, A. Achkhar, A.Yasmeen // Front Biosci (Schol
Ed). – 2012. – V. 4. - P. 671 – 684.
735.
von Zur Muhlen C. Evaluation of urine proteome pattern analysis for its potential to
reflect coronary artery atherosclerosis in symptomatic patients / C. von Zur Muhlen, E.
Schiffer, P. Zuerbig et al. // J Proteome Res. – 2009. – V. 8 (1). – P. 335 - 45.
736.
Naderi A. Prolactin-induced protein is required for cell cycle progression in breast
cancer / A. Naderi, M. Vanneste // Neoplasia. – 2014. – V. 16 (4). – P. 329 - 42.
737.
Nagaraj N. Quantitative analysis of the intra- and inter-individual variability of the
normal urinary proteome / N. Nagaraj, M. Mann // J Proteome Res. – 2011. – V. 10. –
P. 637 – 645.
738.
Nagaraj N. System-wide perturbation analysis with nearly complete coverage of the
yeast proteome by single-shot ultra HPLC runs on a bench top Orbitrap / N. Nagaraj,
N.A. Kulak, J. Cox et al. // Mol Cell Proteomics. – 2012. - V. 11 (3). – P. 111.
739.
Nakano M. The pentosidine concentration in human blood specimens is affected by
heating / M. Nakano, M. Kubota, S. Owada, R. Nagai // Amino Acids. – 2013. – V. 44
(6). – P. 1451 - 6.
740.
Navasiolava N.M. Enforced physical inactivity increases endothelial microparticle
levels in healthy volunteers / N.M. Navasiolava, F. Dignat-George, F. Sabatier et al. //
Am. J. Physiol. Heart Circ Physiol. - 2010. – V. 299 (2). - P. 248 – 56.
741.
Navasiolava N.M. NT-ProBNP levels, water and sodium homeostasis in healthy men:
effects of 7 days of dry immersion / N.M. Navasiolava, A. Pajot, Y. Gallois et al. // Eur
J Appl Physiol. – 2011. – V. 111 (9). – P. 2229 - 37.
742.
Naylor S. Unraveling human complexity and disease with systems biology and
personalized medicine / S. Naylor, J.Y. Chen // Per Med. – 2010. – V. 7 (3). – P. 275 289.
743.
Navar L.G. Regulation of intrarenal angiotensin II in hypertension / L.G. Navar, L.M.
Harrison–Bernard, A. Nishiyama, H. Kobori // Hypertension. – 2002. – V. 39. – P. 316
– 322.
282
744.
Nedelkov D. Population proteomics: addressing protein diversity in humans / D.
Nedelkov // Expert Rev Proteomics. – 2005. - V. 2 (3). – P. 315 - 24.
745.
Nicogossian A.E. 29th Annual Harry G. Armstrong Lecture: the human space enterprise
in the 21st century / A.E. Nicogossian // Aviat. Space Environ Med. – 1994. – V. 65
(12). – P. 1149 - 52.
746.
Ng S.S. Secretin as a neuropeptide / S.S. Ng, W.H. Yung, B.K. Chow // Mol Neurobiol.
– 2002. – V. 26 (1). – P. 97 - 107.
747.
Niida H. DNA damage checkpoints in mammals / H. Niida, M. Nakanishi //
Mutagenesis. – 2006. – V. 21 (1). – P. 3 - 9.
748.
Nishihira K. Thioredoxin in coronary culprit lesions: possible relationship to
oxidative stress and intraplaque hemorrhage / K. Nishihira, A. Yamashita, T.
Imamura et al. // Atherosclerosis. – 2008. – V. 201 (2). – P. 360 - 7.
749. Norsk P. Unexpected renal responses in space / P. Norsk, N.J. Christensen, P.
Bie et al. // Lancet. – 2000. - V. 356 (9241). – P. 1577 - 8.
750.
Nouwen E.J. Hyperplasia, hypertrophy, and phenotypic alterations in the distal nephron
after acute proximal tubular injury in the rat / E.J. Nouwen, W.A. Verstrepen, N.
Buyssens et al. // Lab Invest. – 1994. – V. 70. – P. 479 – 493.
751.
Novozhilov A.S. Exceptional error minimization in putative primordial genetic codes /
A.S. Novozhilov, E.V. Koonin // Biol Direct. – 2009. – V. 4. – P. 44.
752.
Nyengaard J.R. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body
surface in normal man / J.R. Nyengaard, T.F. Bendtsen // Anat Rec. – 1992. – V. 232
(2). – P. 194 - 201.
753.
Oberleithner H. A physiological concept unmasking vascular salt sensitivity in man / H.
Oberleithner // Pflugers Arch. – 2012. – V. 464 (3). – P. 287 - 93.
754.
Oeseburg H. Telomere biology in healthy aging and disease / H. Oeseburg, R.A. de
Boer, W.H. van Gilst, P. van der Harst // Pflugers Arch. – 2010. – V. 459 (2). - P. 259 68.
755.
Oh J. Establishment of a near-standard two-dimensional human urine proteomic map/ J.
Oh, J.H. Pyo, E.H. Jo et al. // Proteomics. – 2004. – V. 4 (11). –P. 3485 - 97.
756.
Ohlmeier S. Sputum proteomics identifies elevated PIGR levels in smokers and mild-tomoderate COPD / S. Ohlmeier, W. Mazur, A. Linja-Aho et al. // J Proteome Res. –
2012. – V. 11. – P. 599 – 608.
757.
Oganov V.S. Comparative analysis of cosmonauts skeleton changes after space flights
on orbital station Mir and international space station and possibilities of prognosis for
283
interplanetary missions / V.S. Oganov, V.V. Bogomolov, A.V. Bakulin et al. // Fiziol
Cheloveka. – 2010. – V. 36 (3). –P. 39 – 47.
758.
Ohue M. Highly precise protein-protein interaction prediction based on consensus
between template-based and de novo docking methods / M. Ohue, Y. Matsuzaki, T.
Shimoda et al. // BMC Proc. – 2013. – V. 7 (Suppl 7). - P. 6.
759.
Ok B.G. Usefulness of urine cytology as a routine work-up in the detection of
recurrence in patients with prior non-muscle-invasive bladder cancer: practicality and
cost-effectiveness / B.G. Ok, Y.S. Ji, Y.H. Ko, P.H. Song // Korean J Urol. - 2014. – V.
55 (10). – P. 650 - 5.
760.
Okada H. The world of functional RNA / H. Okada, Y. Hayashizaki // Rinsho
Shinkeigaku. – 2013. –V. 53 (11). – P. 957 - 61.
761.
Okamoto O. Dermatopontin, a novel player in the biology of the extracellular matrix /
O. Okamoto, S. Fujiwara // Connect Tissue Res. – 2006. – V. 47 (4). – P. 177 - 89.
762.
Okuneva A.D. Changes in titin and myosin heavy chain isoform composition in
skeletal muscles of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) after 12-day
spaceflight / A.D. Okuneva, I.M. Vikhliantsev, M.D. Shpagina et al. // Biofizika. 2012. - 57 (5). – P. 756 - 763.
763.
Olshansky S.J. New developments in the illegal provision of growth hormone for "antiaging" and bodybuilding / S.J. Olshansky, T.T. Perls // JAMA. – 2008. – V. 299 (23). –
P. 2792 - 4.
764.
Omenn G.S. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot
phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups, generating a
core dataset of 3020 proteins and a publicly-available database / G.S. Omenn, D.J.
States, M. Adamski et al. // Proteomics. – 2005. - V. 5 (13). – P. 3226 - 45.
765.
Orenes-Piñero E. Searching urinary tumor markers for bladder cancer using a twodimensional differential gel electrophoresis (2D-DIGE) approach / E. Orenes-Piñero, M.
Cortón, P. González-Peramato et al. // J Proteome Res. – 2007. – V. 6 (11). – P. 4440 8.
766.
Ozer J.S. A panel of urinary biomarkers to monitor reversibility of renal injury and a
serum marker with improved potential to assess renal function / J.S. Ozer, F. Dieterle,
S. Troth et al. // Nat Biotechnol. – 2010. – V. 28 (5). – P. 486 - 94.
767.
Ozkor M.A. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and vascular function / M.A.
Ozkor, A.A. Quyyumi // Cardiol Res Pract. – 2011. – P. 156146.
768.
van Paassen P. Does the renin-angiotensin system determine the renal and systemic
hemodynamic response to sodium in patients with essential hypertension? / P. van
284
Paassen, D. de Zeeuw, G. Navis, P.E. de Jong // Hypertension. – 1996. – V. 27 (2). – P.
202 - 8.
769.
Pakharukova N.A. Changes of human serum proteome profile during 7-day ‘‘dry’’
immersion / N.A. Pakharukova, L.Kh. Pastushkova, I.M. Larina, A.I. Grigoriev // Acta
Astronautica. – 2011. – V. 68. – P. 1523 – 1528.
770.
Paletta
F.X.
Influence
of
colchicine
during
methylcholanthrene
epidermal
carcinogenesis in mice / F.X. Paletta, E.V. Cowdry // Am J Pathol. – 1942. – V. 18 (2).
– P. 291 - 311.
771.
Palmblad M. Mass spectrometry in clinical proteomics - from the present to the future /
M. Palmblad, A. Tiss, R. Cramer // Proteomics Clin Appl. – 2009. – V. 3 (1). – P. 6 - 17.
772.
Panowski S.H. Signals of youth: endocrine regulation of aging in Caenorhabditis
elegans / S.H. Panowski, A. Dillin // Trends Endocrinol Metab. – 2009. – V. 20 (6). – P.
259 - 64.
773.
Pannarale G. The aging kidney: structural changes / G. Pannarale, R. Carbone, G. Del
Mastro, et al. // J Nephrol. – 2010. – V. 23 Suppl 15. – P. 37 - 40.
774.
Paris G.A principal component analysis of the dynamics of subdomains and binding
sites in human serum albumin / G. Paris, C. Ramseyer, M. Enescu // Biopolymers. –
2014. – V. 101 (5). – P. 561 - 72.
775.
Parker T.J. A fragment of the LG3 peptide of endorepellin is present in the urine of
physically active mining workers: a potential marker of physical activity / T.J. Parker,
D.L. Sampson, D. Broszczak et al. // PLoS One. – 2012. – V. 7 (3). – P. 33714.
776.
Parsons C.L. A multi-site study confirms abnormal glycosylation in the Tamm-Horsfall
protein of patients with interstitial cystitis / C.L. Parsons, J. Proctor, J.S. Teichman et al.
//J Urol. – 2011. – V. 186 (1). – P. 112 - 6.
777.
Pasiakos S.M. Level of dietary protein intake affects glucose turnover in endurancetrained men / S.M. Pasiakos, W.F. Martin, C.S. Sharma et al. // J Int Soc Sports Nutr. –
2011. – V. 8 (1). – P. 20.
778.
Patel P.C. Association of cystatin C with left ventricular structure and function: the
Dallas Heart Study / P.C. Patel, C.R. Ayers, S.A. Murphy et al. // Circ Heart Fail. –
2009. – V. 2 (2). – P. 98 - 104.
779.
Paulo J.A. Mass spectrometry-based proteomics for translational research: a technical
overview / J.A. Paulo, V. Kadiyala, P.A. Banks et al. // Yale J Biol Med. – 2012. – V. 85
(1). – P. 59 - 73.
285
780.
Pederson L. Regulation of bone formation by osteoclasts involves Wnt / BMP signaling
and the chemokine sphingosine-1-phosphate / L. Pederson, M. Ruan, J.J. Westendorf et
al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2008. – V. 105 (52). – P. 20764 - 9.
781.
Penescu M. Mass spectrometry and renal calculi / M. Penescu, V.L. Purcarea, I. Sisu, E.
Sisu // J. Med. Life. – 2010. – V. 3 (2). – P. 128 - 136.
782.
Peng J. Stress proteins as biomarkers of oxidative stress: effects of antioxidant
supplements / J. Peng, G.L. Jones, K. Watson // Free Radic Biol Med. – 2000.
- V. 28 (11). – P. 1598 - 606.
783.
Perkins D.N. Probability-based protein identification by searching sequence databases
using mass spectrometry data / D.N. Perkins, D.J. Pappin, D.M. Creasy, J.S. Cottrell //
Electrophoresis – 1999. – V. 20. - P. 3551 – 3567.
784.
Perry A.J. A molecular switch governs the interaction between the human complement
protease C1s and its substrate; complement C4 / A.J. Perry, L.C. Wijeyewickrema, P.G.
Wilmann et al. // J Biol Chem. – 2013. – V. 288 (22). – P. 15821 - 9.
785.
Petruk S. Stepwise histone modifications are mediated by multiple enzymes that rapidly
associate with nascent DNA during replication / S. Petruk, K.L. Black, S.K. Kovermann
et al. // Nat Commun. – 2013. – V. 4. – P. 2841.
786.
Phillips S.M. Considerations for protein supplementation in warfighters / S.M. Phillips
// J Nutr. – 2013. – V. 143 (11). – P. 1838 - 1842.
787.
Pieper R. Characterization of the human urinary proteome: a method for high-resolution
display of urinary proteins on two-dimensional electrophoresis gels with a yield of
nearly 1400 distinct protein spots / R. Pieper, C.L. Gatlin, A.M. McGrath et al. //
Proteomics. – 2004. – V. 4 (4). – P. 1159 - 74.
788.
Pilz S. Vitamin D deficiency and myocardial diseases / S. Pilz, A. Tomaschitz, C.
Drechsler et al. // Mol Nutr Food Res. – 2010. – V. 54 (8). – P. 1103 - 13.
789.
Piyaphanee N. Discovery and initial validation of α 1-B glycoprotein fragmentation as a
differential urinary biomarker in pediatric steroid-resistant nephrotic syndrome / N.
Piyaphanee, Q. Ma, O. Kremen et al. // Proteomics Clin Appl. - 2011. – V. 5 (5-6). - P.
334 - 42.
790.
Pokidysheva E. Biological role of prolyl 3-hydroxylation in type IV collagen / E.
Pokidysheva, S. Boudko, J. Vranka et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2014. – V. 111
(1). – P. 161 - 6.
286
791.
Poliakov V.V. Hematological investigations in conditions of long-term space flights /
V.V. Poliakov, S.M. Ivanova, V.B. Noskov et al. // Aviakosm Ekolog Med. – 1998. –
V. 32 (2). – P. 9 - 18.
792.
van de Poll M.C. Liver manipulation causes hepatocyte injury and precedes systemic
inflammation in patients undergoing liver resection / M.C. van de Poll, J.P. Derikx,
W.A. Buurman et al. // World J Surg. – 2007. – V. 31 (10). – P. 2033 - 8.
793.
Ponticelli C. Kallikreins and lupus nephritis / C. Ponticelli, P.L. Meroni // J Clin Invest.
– 2009. - V. 119 (4). – P. 768 - 71.
794.
Poupin N. Impact of the diet on net endogenous acid production and acid-base balance /
N. Poupin, J. Calvez, C. Lassale et al. // Clin Nutr. – 2012. – V. 31 (3). – P. 313 - 21.
795.
Prabakaran T. Cubilin is expressed in rat and human glomerular podocytes / T.
Prabakaran, E.I. Christensen, R. Nielsen, P.J. Verroust // Nephrol Dial Transplant. –
2012. – V. 27 (8). – P. 3156 - 9.
796.
Preiss L. The c-ring stoichiometry of ATP synthase is adapted to cell physiological
requirements of alkaliphilic Bacillus pseudofirmus OF4. / L. Preiss, A.L. Klyszejko,
D.B. Hicks et al. // Proc Natl Acad Sci USA. – 2013. – V. 110 (19). – P. 7874 - 9.
797.
Priyakumar U.D. Role of hydrophobic core on the thermal stability of proteinsmolecular dynamics simulations on a single point mutant of sso7d / U. D. Priyakumar //
J Biomol Struct Dyn. – 2012. – V. 29 (5). P. 1 - 11.
798.
Prohaska T.A. Interaction of protein C inhibitor with the type II transmembrane serine
protease enteropeptidase / T.A. Prohaska, F.C. Wahlmüller, M. Furtmüller, M. Geiger //
PLoS ONE. - 2012. – V. 7. – P. 39262.
799.
Psaty B.M. The Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology
(CHARGE) Consortium as a model of collaborative science / B.M. Psaty, C. Sitlani //
Epidemiology. – 2013. – V. 24 (3). – P. 346 - 8.
800.
Pucci L. Cystatin C and estimates of renal function: searching for a better measure of
kidney function in diabetic patients / L. Pucci, S. Triscornia, D. Lucchesi et al // Clin
Chem. – 2007. – V. 53 (3). – P. 480 - 8.
801.
Purkayastha P. Alpha 1-antitrypsin polymerization: a fluorescence correlation
spectroscopic study / P. Purkayastha, J.W. Klemke, S. Lavender et al. // Biochemistry. –
2005. – V. 44 (7). – P. 2642 - 9.
802.
Pyl’nik T.O. Expression of the genes Egf and Egfr in renal tissue of the hypertensive
rats of the ISIAH strain / T.O. Pyl’nik, O.E. Redina, S.E. Smolehskaia // Ross Fiziol Zh
Im I M Sechenova. – 2012. – V. 98. - P. 373 – 380.
287
803.
Quackenbush J. Microarrays-Guilt by Association / J. Quackenbush // Science. – 2003.
V. 302 (5643). – P. 240 - 241.
804.
Rajewsky N. MicroRNAs and the Operon paper / N. Rajewsky // J Mol Biol. – 2011. –
V. 409 (1). – P. 70 - 5.
805.
Ramakers J.M. Coomassie Blue: an alternative procedure for proteins / J.M. Ramakers
//Clin Chem. – 1984. – V. 30 (8). – P. 1433 - 4.
806.
Rampoldi L. The rediscovery of uromodulin (Tamm-Horsfall protein): from
tubulointerstitial nephropathy to chronic kidney disease / L. Rampoldi, F. Scolari, A.
Amoroso et al. // Kidney Int. – 2011. – V. 80 (4). – P. 338 - 347.
807.
Rao U.V. Normal weights of human organs / U.V. Rao, H.N. Jr. Wagner // Radiology. –
1972. – V. 102 (2). – P. 337 - 9.
808.
Ray A. IgSF8: a developmentally and functionally regulated cell adhesion molecule in
olfactory sensory neuron axons and synapses / A. Ray, H.B. Treloar // Mol Cell
Neurosci. – 2012. – V. 50 (3-4). – P. 238 - 49.
809.
Re R.N. Intracellular Renin and the Nature of Intracrine Enzymes / R.N. Re //
Hypertension. – 2003. – V. 42. – P. 117 – 22.
810.
Remmen H.V. Current thoughts on the role of mitochondria and free radicals in the
biology of aging / H.V. Remmen, D.P. Jones// J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2009. – V. 64 (2). – P. 171 – 4.
811.
Renigunta A. Tamm-Horsfall glycoprotein interacts with renal outer medullary
potassium channel ROMK2 and regulates its function /A. Renigunta, V. Renigunta, T.
Saritas et al. // J. Biol. Chem. – 2011. – V. 286 (3). – P. 2224 – 2235.
812.
Resnick L.M. Cellular calcium and magnesium metabolism in the pathophysiology and
treatment of hypertension and related metabolic disorders / L.M. Resnick // Am J Med.
– 1992. –V. 93 (2A). – P.11-20.
813.
Rezaie A.R. Protein C inhibitor is a potent inhibitor of the thrombin-thrombomodulin
complex / A.R. Rezaie, S.T. Cooper, F.C. Church, C.T. Esmon // J Biol Chem. - 1995. V. 270. - P. 25336 – 25339.
814.
Rocchetti M.T. Urine protein profile of IgA nephropathy patients may predict the
response to ACE-inhibitor therapy / M.T. Rocchetti, M. Centra, M. Papale et al. //
Proteomics. – 2008. – V. 8(1). – P. 206 - 16.
815.
Rodriguez-Iturbe B. Salt-sensitive hypertension-update on novel findings / B.
Rodriguez-Iturbe, N.D. Vaziri // Nephrol Dial Transplant. – 2007. – V. 22 (4). P. 992 5.
288
816.
Rodríguez-Suárez E. The application of quantification techniques in proteomics for
biomedical research / E. Rodríguez-Suárez, A.D. Whetton // Mass Spectrom Rev. –
2013 - V. 32 (1). – P. 1 - 26.
817.
Rodríguez-Suárez E. Urine as a source for clinical proteome analysis: from discovery
to clinical application / E. Rodríguez-Suárez, J. Siwy, P. Zürbig, H. Mischak // Biochim
Biophys Acta. – 2014. – V. 1844 (5). - P. 884 - 98.
818.
Rodwell G.E. A transcriptional profile of aging in the human kidney / G.E. Rodwell, R.
Sonu, J.M. Zahn et al. // PLoS Biol. -2004. – V. 2 (12). – P. 427.
819.
Romero R. The use of high-dimensional biology (genomics, transcriptomics,
proteomics, and metabolomics) to understand the preterm parturition syndrome / R.
Romero, J. Espinoza, F. Gotsch et al. // BJOG. – 2006. – V. 113 Suppl 3. – P. 118 - 35.
820.
Rosenbaum D.M. Structure and function of an irreversible agonist-β(2) adrenoceptor
complex / D.M. Rosenbaum, C. Zhang, J.A. Lyons et al. // Nature. – 2011. – V. 469
(7329). – P. 236 - 40.
821.
Rosendorff C. Spironolactone for all hypertensive patients? / C. Rosendorff // J
Hypertens. – 2010. – V. 28 (1). – P. 13 - 4.
822.
Rossi D.J. Stems cells and the pathways to aging and cancer / D.J. Rossi, C.H.
Jamieson, I.L. Weissman // Cell. – 2008. – V. 132 (4). – P. 681 - 96.
823.
Rossing K. The urinary proteome in diabetes and diabetes-associated complications:
New ways to assess disease progression and evaluate therapy / K. Rossing, H. Mischak,
P. Rossing et al. // Proteomics Clin Appl. – 2008. – V. 2(7-8). – P. 997 - 1007.
824.
Rubenstein D.A. Glycated albumin modulates platelet susceptibility to flow induced
activation and aggregation / D.A. Rubenstein, W. Yin // Platelets. – 2009. – V. 20. – P.
206 – 215.
825.
Rule A.D. The association between age and nephrosclerosis on renal biopsy among
healthy adults / A.D. Rule, H. Amer, L.D. Cornell et al. // Ann Intern Med. – 2010. – V.
152 (9). – P. 561 - 7.
826.
Russo L.M. Renal handling of albumin: a critical review of basic concepts and
perspective / L.M. Russo, G.L. Bakris, W.D. Comper //Am J Kidney Dis. - 2002. – V.
39 (5). – P. 899 - 919.
827.
Van Ryn J. Dabigatran etexilate-a novel, reversible, oral direct thrombin inhibitor:
interpretation of coagulation assays and reversal of anticoagulant activity / J. van Ryn,
J. Stangier, S. Haertter et al. // Thromb Haemost. – 2010. – V. 103 (6). – P. 1116 - 27.
828.
Sah R.P. New insights into the pathogenesis of pancreatitis / R.P. Sah, R.K. Dawra,
A.K. Saluja // Curr Opin Gastroenterol. – 2013. – V. 29 (5). – P. 523 - 30.
289
829.
Sahin E. Linking functional decline of telomeres, mitochondria and stem cells during
ageing / E. Sahin, R.A. Depinho // Nature. – 2010. – V. 464 (7288). – P. 520 - 8.
830.
Sahu A. Structure and biology of complement protein C3, a connecting link between
innate and acquired immunity / A. Sahu, J.D. Lambris // Immun. Rev. – 2001. – V. 180.
– P. 35 – 48.
831.
Sammons J.D. Biochemical analysis of a rhodopsin photoactivatable GFP fusion as a
model of G-protein coupled receptor transport / J.D. Sammons, A.K. Gross // Vision
Res. – 2013. – V. 93. – P. 43 - 8.
832.
Sato T. Age-related changes in normal adult pancreas: MR imaging evaluation / T. Sato,
K. Ito, T. Tamada et al. // Eur J Radiol. – 2012. – V. 81 (9). – P. 2093 - 8.
833.
Schappi J.M. Tubulin, actin and heterotrimeric G proteins: coordination of signaling and
structure / J.M. Schappi, A. Krbanjevic, M.M. Rasenick // Biochim Biophys Acta. –
2014. – V. 1838 (2). - P. 674 - 81.
834.
Schaub S. Proteomic-based detection of urine proteins associated with acute renal
allograft rejection / S. Schaub, D. Rush, J. Wilkins et al. // J Am Soc Nephrol. – 2004. –
V. 15 (1). – P. 219 - 27.
835.
Schiffer E. Urinary proteome analysis for prostate cancer diagnosis: cost-effective
application in routine clinical practice in Germany / E. Schiffer, C. Bick, B. Grizelj et
al. // Int J Urol. – 2012. – V. 19 (2). – P. 118 - 25.
836.
Schroeder H.W. Jr. Structure and function of immunoglobulins / H.W. Jr. Schroeder, L.
Cavacini // J Allergy Clin Immunol. – 2010. – V. 125 (2 Suppl 2). – P. 41 - 52.
837.
Schweizer J. New consensus nomenclature for mammalian keratins / J. Schweizer, P.E.
Bowden, P.A. Coulombe et al. // J Cell Biol. – 2006. – V. 174. – P. 169 – 174.
838.
Seetin M.G. RNA structure prediction: an overview of methods / M.G. Seetin, D.H.
Mathews // Methods Mol Biol. – 2012. –V. 905. – P. 99 - 122.
839.
Seddon A.M. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera / A.M.
Seddon, P. Curnow, P.J. Booth // Biochim Biophys Acta. – 2004. – V. 1666 (1-2). – P.
105 - 17.
840.
Sekhar A. Protein folding rates and thermodynamic stability are key determinants for
interaction with the Hsp70 chaperone system / A. Sekhar, H.N. Lam, S. Cavagnero //
Protein Sci. – 2012. – V. 21 (10). – P. 1489 - 502.
841.
Selvaraj N. Is euthyroid sick syndrome a defensive mechanism against oxidative stress?
/ N. Selvaraj, Z. Bobby, M.G. Sridhar // Medical Hypotheses. – 2008. – V. 70 (2). - P.
65 - 68.
290
842.
Semenza G.L. Perspectives on oxygen sensing / G. L. Semenza // Cell. - 1999. - V. 98
(3). - P. 281 - 284.
843.
Sersté T. Ageing and the liver / T. Sersté, N. Bourgeois // Acta Gastroenterol Belg. –
2006. – V. 69 (3). – P. 296 - 8.
844.
Sharma J.N. The kinin system in hypertensive pathophysiology / J.N. Sharma //
Inflammopharmacology. - 2013. –V. 21 (1). - P. 1 - 9.
845.
Sharpless N.E. How stems cells age and why this makes us grow old / N.E. Sharpless,
R.A. DePinho // Nat Rev Mol Cell Biol. – 2007. – V. 8 (9). – P. 703 - 13.
846.
Shen X. Role for gene sequence, codon bias and mRNA folding energy in modulating
structural symmetry of proteins / X. Shen, S. Chen, G. Li // Conf Proc IEEE Eng Med
Biol Soc. – 2013. – P. 596 - 9.
847.
Shi F. Fibronectin matrix polymerization regulates smooth muscle cell phenotype
through a Rac1 dependent mechanism / F. Shi, X. Long, A. Hendershot et al. // PLoS
One. – 2014. – V. 9 (4). – P. 94988.
848.
Shumilina Y.V. Isoform composition of proteins of myosin filaments in cardiac muscle
of Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) after space flight / Y.V. Shumilina, I.M.
Vikhlyantsev, Z.A. Podlubnay, I.B. Kozlovskaya // Doklady Biochemistry and
Biophysics. - 2010. – V. 430. - P. 14 - 16.
849.
Sigdel T.K. Shotgun proteomics identifies proteins specific for acute renal transplant
rejection / T.K. Sigdel, A. Kaushal, M. Gritsenko et al. // Proteomics Clin Appl. - 2010.
– V. 4 (1). – P. 32 - 47.
850.
Silambarasan T. Diosmin, a bioflavonoid reverses alterations in blood pressure, nitric
oxide, lipid peroxides and antioxidant status in DOCA-salt induced hypertensive rats /
T. Silambarasan, B. Raja // Eur J Pharmacol. – 2012. - V. 679 (1-3). – P. 81 - 9.
851.
Sitar M.E. Human serum albumin and its relation with oxidative stress / M.E. Sitar, S.
Aydin, U. Cakatay // Clin Lab. – 2013. –V. 59 (9-10). – P. 945 - 52.
852.
Siwy J. Human urinary peptide database for multiple disease biomarker discovery / J.
Siwy, W. Mullen, I. Golovko et al. // Proteomics Clin Appl. – 2011. – V. 5 (5-6). – P.
367 - 74.
853.
Skulachev V.P. New data on biochemical mechanism of programmed senescence of
organisms and antioxidant defense of mitochondria / V.P. Skulachev // Biochemistry
(Mosc). – 2009. – V. 74 (12). –P. 1400 - 3.
854.
Slutzki M. Intramolecular clasp of the cellulosomal Ruminococcus flavefaciens ScaA
dockerin module confers structural stability / M. Slutzki, M. K. Jobby, S. Chitayat, et al.
// FEBS Open Bio. – 2013. – V. 3. – P. 398 - 405.
291
855.
Smith F. The molecular genetics of keratin disorders / F. Smith //Am J Clin Dermatol. –
2003. – V. 4 (5). – P. 347 - 64.
856.
Smith S.M. Bone markers, calcium metabolism, and calcium kinetics during extendedduration space flight on the mir space station / S.M. Smith, M.E. Wastney, K.O. O'Brien
et al. // J Bone Miner Res. – 2005. – V. 20 (2). – P. 208 - 18.
857.
Smith S.M. Strategies for the purification of membrane proteins / S.M. Smith //
Methods Mol Biol. – 2011. –V. 681. – P. 485 - 96.
858.
Sohara E. Acute insulin stimulation induces phosphorylation of the Na-Cl cotransporter
in cultured distal mpkDCT cells and mouse kidney / E. Sohara, T. Rai, S.S. Yang et al.
// PLoS One. – 2011. – V. 6 (8). – P. 24277.
859.
Solichova P. Urinary clusterin concentrations-a possible marker of nephropathy? Pilot
study / P. Solichova, M. Karpisek, R. Ochmanova Stejskal et al. // Biomed Pap Med Fac
Univ Palacky Olomouc. - 2007. – V. 151 (2). – P. 233 - 6.
860.
Soltow Q.A. A network perspective on metabolism and aging / Q.A. Soltow, D.P. Jones,
D.E. Promislow // Integr. Comp. Biol. – 2010. – V. – 50. – P. 844 – 854.
861.
Son D.J. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal
RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis / D.J. Son, S. Kumar, W.
Takabe et al. //. Nat Commun. – 2013. – V. 4. – P. 3000.
862.
Spahr C.S Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. I. Profiling an unfractionated tryptic digest / C.S. Spahr, M.T.
Davis, M.D. McGinley et al. // Proteomics. – 2001. – V. 1 (1). –P. 93 - 107.
863.
Stalmach A. Recent advances in capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry
for clinical proteomic applications / A. Stalmach, A. Albalat, W. Mullen, H. Mischak //
Electrophoresis. – 2013. – V. 34 (11). –P. 1452 - 64.
864.
Stamatelou K.K. Time trends in reported prevalence of kidney stones in the United
States: 1976-1994 / K.K. Stamatelou, M.E. Francis, C.A. Jones et al. // Kidney Int. 2003. – V. 63 (5). – P. 1817 - 23.
865.
Stamler J. The INTERSALT Study: background, methods, findings, and implications /
J. Stamler // Am J Clin Nutr. – 1997. – V. 65 (2 Suppl). - P. 626 - 642.
866.
Starklint J. Increased urinary aquaporin-2 excretion in response to furosemide in
patients with chronic heart failure / J. Starklint, J.N. Bech, O. Nyvad et al. // Scand. J.
Clin. Lab. Invest. – 2006. – V. 66. – N. 1. – Р. 55 - 66.
867.
Stastna M. Analysis of protein isoforms: can we do it better? / M. Stastna, J.E. Van Eyk
// Proteomics. – 2012. – V. 12 (19-20). – P. 2937 - 48.
868.
Stein T.P. Oxidant damage during and after spaceflight / T.P. Stein, M.J. Leskiw //Am.
292
J. Physiol. Endocrinol. Metab. - 2000. -V. 278 (3). - P. 75 - 82.
869.
Stein T.P. Space flight and oxidative stress / T.P. Stein // Nutrition. - 2002. – V. 18 (10).
- P. 867 – 871.
870.
Stobart J.L. Multifunctional role of astrocytes as gatekeepers of neuronal energy supply
/ J.L. Stobart, C.M. Anderson // Front Cell Neurosci. – 2013. – V. 7. – P. 38.
871.
Stocker S.D. Neurogenic and sympathoexcitatory actions of NaCl in hypertension / S.D.
Stocker, K.D. Monahan, K.N. Browning // Curr Hypertens Rep. – 2013. - V. 15 (6). - P.
538 - 46.
872.
Stowe R.P. Effects of mission duration on neuroimmune responses in astronauts / R.P.
Stowe, C.F. Sams, D.L. Pierson // Aviat Space Environ Med. – 2003. – V. 74 (12). – P.
1281 - 4.
873.
Stowe R.P. Adrenocortical and immune responses following short- and long-duration
spaceflight / R.P. Stowe, C.F. Sams, D.L. Pierson // Aviat Space Environ Med. – 2011. V. 82 (6). – P. 627 - 34.
874.
Strazzullo P. Altered renal handling of sodium in human hypertension: short review of
the evidence / P. Strazzullo, F. Galletti, G. Barba // Hypertension. – 2003. - V. 41 (5). –
P. 1000 - 5.
875.
Su Z. Salt-induced changes in cardiac phosphoproteome in a rat model of chronic renal
failure / Z. Su, H. Zhu, M. Zhang et al. // PLoS One. – 2014. - V. 9(6). – P. 100331.
876.
Sun W. Human urine proteome analysis by three separation approaches / W. Sun, F. Li,
S. Wu et al. // Proteomics. – 2005. – V. 5 (18). – P. 4994 - 5001.
877.
Sun W. Improving peptide identification using an empirical peptide retention time
database / W. Sun, L. Zhang, R. Yang et al. // Rapid Commun Mass Spectrom. – 2009.
– V. 23 (1). – P. 109 - 18.
878.
Suzuki K. Characterization of a cDNA for human protein C inhibitor. A new member of
the plasma serine protease inhibitor superfamily / K. Suzuki, Y. Deyashiki, J. Nishioka
et al. // J Biol Chem. – 1987. – V. 262. – P. 611 – 616.
879.
Symons T.B. Artificial gravity maintains skeletal muscle protein synthesis during 21
days of simulated microgravity / T.B. Symons, M. Sheffield-Moore, D.L. Chinkes et al.
// J. Appl. Physiol. – 2009. – V. 107 (1). – P. 34 - 8.
880.
Szabó A. Increased activation of hereditary pancreatitis-associated human cationic
trypsinogen mutants in presence of chymotrypsin C / A. Szabó, M. Sahin-Tóth // J Biol
Chem. – 2012. – V. 287 (24). – P. 20701 - 10.
293
881.
Szabo R. Matriptase-3 is a novel phylogenetically preserved membrane-anchored serine
protease with broad serpin reactivity / R. Szabo, S. Netzel-Arnett, J.P. Hobson et al. //
Biochem J. – 2005. – V. 390 (Pt 1). – P. 231 - 42.
882.
Takayama K. Androgen-responsive long noncoding RNA CTBP1-AS promotes prostate
cancer / K. Takayama, K. Horie-Inoue, S. Katayama et al. // EMBO J. – 2013. – V. 32
(12). – P. 1665 - 80.
883.
Takeda Y. Sodium-induced cardiac aldosterone synthesis causes cardiac hypertrophy /
Y. Takeda, T.Yoneda, M. Demura et al. // Endocrinology. – 2000. –V. 141. – P. 1901 –
4.
884.
Tamai M. In vitro recapitulation of the urea cycle using murine embryonic stem cellderived in vitro liver model / M. Tamai, M. Aoki, A. Nishimura et al. // Amino Acids. –
2013. – V. 45 (6). – P. 1343 - 51.
885.
Tan C. Localized frustration and binding-induced conformational change in recognition
of 5S RNA by TFIIIA zinc finger / C. Tan, W. Li, W. Wang // J Phys Chem B. – 2013.
– V. 117 (50). – P. 15917 - 25.
886.
Tan Y. The level of urinary secretory immunoglobulin A (sIgA) of patients with IgA
nephropathy is elevated and associated with pathological phenotypes / Y. Tan, J.-J.
Zhang, G. Liu et al. // Clin Exp Immunol. - 2009. – V. 156. - P. 111 – 116.
887.
Tanaka K. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-offlight mass spectrometry / K. Tanaka, S. Waki, Y. Ido et al. // Rapid Commun. Mass.
Mass Spectrom. - 1988. – V. 2, 8. - P. 151 - 153.
888.
Tang S.C. The kallikrein-kinin system / S.C. Tang., J.C. Leung., K.N. Lai //
Contributions to Nephrology. - 2011. - V. 170. - P. 145 - 55.
889.
Tani T. Expression of E- and N-cadherin in renal cell carcinomas, in renal cell
carcinoma cell lines in vitro and in their xenografts / T. Tani, L. Laitinen, L. Kangas et
al. // Int J Cancer. – 1995. – V. 64 (6). – P. 407 - 14.
890.
Tauchi H. Age changes in the human kidney of the .different races / H. Tauchi, K.
Tsuboi, J. Okutomi //Gerontologia. – 1971. –V. -17(2). – P. 87 - 97.
891.
Tavitova M.G. Content of energy substrates in fibers of postural muscle soleus and
its antagonist in the condition of support deprivation / M.G. Tavitova, N.M. Fokina,
B.S. Shenkman // Aviakosm Ekolog Med. – 2011. – V. 45 (1). – P. 55 - 9.
892.
Ten Have G.A. Absorption kinetics of amino acids, peptides, and intact proteins / G.A.
Ten Have, M.P. Engelen, Y.C. Luiking, N.E. Deutz // Int J Sport Nutr Exerc Metab. –
2007. – V. 17 Suppl. – P. 23 - 36.
294
893.
Templeton G.H. Influence of suspension hypokinesia on rat soleus muscle / G.H.
Templeton, M. Padalino, J. Manton et al. // J Appl Physiol Respir Environ Exerc
Physiol. – 1984. – V. 56 (2). – P. 278 - 86.
894.
Tesch P.A. Skeletal muscle proteolysis in response to short-term unloading in humans /
P.A. Tesch, F. von Walden, T. Gustafsson et al. // Journal of Applied Physiology. 2008. - V. 105 (3). – P. 902 - 906.
895.
Teufel D.P. Mutational analysis of the complex of human RNase inhibitor and human
eosinophil-derived neurotoxin (RNase 2) / D.P. Teufel, R.Y. Kao, K.R. Acharya, R.
Shapiro // Biochemistry. – 2003. – V. 42 (6). – P. 1451 - 9.
896.
Theodorescu D. Pilot study of capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry as
a tool to define potential prostate cancer biomarkers in urine / D. Theodorescu, D.
Fliser, S. Wittke et al. // Electrophoresis. – 2005. – V. 26 (14). – P. 2797 - 808.
897.
Theodorescu D. Discovery and validation of new protein biomarkers for urothelial
cancer: a prospective analysis / D. Theodorescu, S. Wittke, M.M. Ross et al. // Lancet
Oncol. – 2006. – V. 7 (3). – P. 230 - 40.
898.
Theodorescu D. Discovery and validation of urinary biomarkers for prostate cancer / D.
Theodorescu, E. Schiffer, H.W. Bauer et al. // Proteomics Clin Appl. – 2008. – V. 2 (4).
– P. 556 - 570.
899.
Thongboonkerd V. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by
acetone precipitation or ultracentrifugation / V. Thongboonkerd, K.R. McLeish, J.M.
Arthur, J.B. Klein // Kidney Int. – 2002.- V. 62 (4). –P. 1461 - 9.
900.
Thongboonkerd V. Renal and urinary proteomics: current applications and challenges /
V. Thongboonkerd, P. Malasit // Proteomics. – 2005. – V. 5(4). – P. 1033 - 42.
901.
Thongboonkerd V. Systematic evaluation of sample preparation methods for gel-based
human urinary proteomics: quantity, quality, and variability / V. Thongboonkerd, S.
Chutipongtanate, R. Kanlaya // J Proteome Res. – 2006. – V. 5 (1). – P.183 - 91.
902.
Thongboonkerd V. Study of diabetic nephropathy in the proteomic era / V.
Thongboonkerd // Contrib Nephrol. – 2011. –V. 170. – P. 172 - 83.
903.
Thornhill B.A. Variable chronic partial ureteral obstruction in the neonatal rat: a new
model of ureteropelvic junction obstruction / B.A. Thornhill, L.E. Burt, C. Chen et al. //
Kidney Int.- 2005. - V. 67 (1). – P. 42 - 52.
904.
Thulesen J. Urinary excretion of epidermal growth factor and Tamm-Horsfall protein in
three rat models with increased renal excretion of urine / J. Thulesen, P.E. Jorgensen, O.
Torffvit et al. // Regul Pept. – 1997. – V. 72. –P. 179–186.
295
905.
Tiss A. Serum peptide profiling using MALDI mass spectrometry: avoiding the pitfalls
of coated magnetic beads using well-established ZipTip technology / A. Tiss, C. Smith,
S. Camuzeaux et al. // Proteomics. – 2007. – V.7. – P. 77 - 89.
906.
Titze J. Reduced osmotically inactive Na storage capacity and hypertension in the Dahl
model / J. Titze, H. Krause, H. Hecht et al. // Am J Physiol Renal Physiol. – 2002. – V.
283 (1). - P. 134 - 41.
907.
Titze J. Salt and its effect on blood pressure and target organ damage: new pieces in an
old puzzle / J. Titze, E. Ritz // J Nephrol. – 2009. – V. 22(2). – P.177 - 89.
908.
Titze J. Sodium sensing in the interstitium and relationship to hypertension / J. Titze, A.
Machnik // Curr Opin Nephrol Hypertens. – 2010. - V. 19 (4). - P. 385 - 92.
909.
Titze J. Interstitial fluid homeostasis and pressure: news from the black box / J. Titze //
Kidney Int. - 2013. - V. 84 (5). - P. 869 - 71.
910.
Titze J. Spooky sodium balance / J. Titze, A Dahlmann, K. Lerchl et al. // Kidney Int. –
2014. – V. 85 (4). - P. 759 - 67.
911.
Tohno Y. Age-related changes of elements and relationships among elements in the
common bile and pancreatic ducts / Y. Tohno, S. Tohno, M.O. Yamada et al // Biol
Trace Elem Res. - 2004. – V. 101 (1). – P. 47 - 60.
912.
Tojo A. Mechanisms of glomerular albumin filtration and tubular reabsorption / A.
Tojo, S. Kinugasa // Int J Nephrol. - 2012. - P. 481520.
913.
Toronen P. Robust extraction of functional signals from gene set analysis using a
generalized threshold free scoring function / P. Toronen, P. Ojala, P. Marttinen, L.
Holm // BMC Bioinformatics. – 2009. – V. 10 (1). - P. 307.
914.
Tripette J. Red blood cell aggregation, aggregate strength and oxygen transport potential
of blood are abnormal in both homozygous sickle cell anemia and sickle-hemoglobin C
disease / J. Tripette, T. Alexy, M. D. Hardy-Dessources et al. // Haematologica. – 2009.
– V. 94 (8). – P. 1060 - 5.
915.
Tskhovrebova L. Role of titin in vertebrate striated muscle / L. Tskhovrebova, J. Trinick
// Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. - 2002. - V.
357 (1418). - P. 199 - 206.
916.
Tsuboi N. Glomerular density in renal biopsy specimens predicts the long-term
prognosis of IgA nephropathy / N. Tsuboi, T. Kawamura, K. Koike et al. // Clin J Am
Soc Nephrol. – 2010. – V. 5(1). – P. 39-44.
917.
Tu X. Crystal structure of the globular domain of C1QTNF5: Implications for late-onset
retinal macular degeneration / X. Tu, K. Palczewski // J Struct Biol. – 2012. – V. 180
(3). – P. 439 - 46.
296
918.
Tyagi S. The liver-specific human alpha (1)-microglobulin/bikunin precursor (AMBP)
is capable of self-association / S. Tyagi, J.-P. Salier, S.K. Lal // Arch Biochem Biophys.
– 2002. – V. 399 – P. 66 – 72.
919.
Tyan S.W. Breast cancer cells induce stromal fibroblasts to secrete ADAMTS1 for
cancer invasion through an epigenetic change / S.W. Tyan, C.H. Hsu, K.L. Peng et al. //
PLoS One. - 2012. – V. 7 (4). – P. 35128.
920.
Uchakin P.N. Effects of the 120 days of head-down bed rest on cytokine secretion and
its in vitro modulation by glucocorticoids / P.N. Uchakin, M.L. Cubbage, C.F. Sams et
al. // Gravit Physiol. – 1998. – V. 5 (1). – P. 171 - 2.
921.
Uhlen M. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas / M. Uhlen, P. Oksvold, L.
Fagerberg et al. // Nat Biotechnol. – 2010 - V. 28. – P. 1248–1250.
922.
Uitto J. The role of elastin and collagen in cutaneous aging: intrinsic aging versus
photoexposure / J. Uitto // J Drugs Dermatol. – 2008. – V. 7 (2 Suppl). – P. 12 - 6.
923.
Umemoto E. Novel regulators of lymphocyte trafficking across high endothelial venules
/ E. Umemoto, H. Hayasaka, Z. Bai, et al. // Crit Rev Immunol. – 2011 – V. 31 (2). - P.
147 - 69.
924.
Valenti G. Urinary aquaporin 2 and calciuria correlate with the severity of enuresis in
children. / G. Valenti, A. Laera, G. Pace et al. // J Am Soc Nephrol. – 2000. – V. 11
(10). – P. 1873 - 81.
925.
Valenti G. Low-calcium diet in hypercalciuric enuretic children restores AQP2
excretion and improves clinical symptoms / G. Valenti, A. Laera, S. Gouraud et al. //
Am. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2002. – V. 283. – N. 5. – P. 895 - 903.
926. Vandeput S. Adaptation of autonomic heart rate regulation in astronauts after
spaceflight / S. Vandeput, D. Widjaja, A.E. Aubert, S. Van Huffel // Med Sci
Monit. – 2013. – V. 19. – P. 9 - 17.
927.
Vazquez Martul E. Importance of kidney biopsy in graft selection / E. Vazquez Martul,
A. Veiga Barreiro // Transplant Proc. – 2003. – V. 35(5). – P. 1658 - 60.
928.
De Vega S. Fibulins: multiple roles in matrix structures and tissue functions / S. de
Vega, T. Iwamoto, Y. Yamada // Cell Mol Life Sci. – 2009. – V. 66 (11-12). – P. 1890 902.
929.
Veenhoff L. M. Quaternary structure and function of transport proteins / L.M. Veenhoff,
E.H. Heuberger, B. Poolman // Trends Biochem Sci. – 2002. – V. 27 (5). – P. 242 - 9.
297
930.
Veldhuis J.D. Novel modalities for appraising individual and coordinate pulsatile
hormone secretion: the paradigm of luteinizing hormone and testosterone release in the
aging male / J.D.Veldhuis // Mol Psychiatry. – 1997. – V. 2(1). - P. 70 - 80.
931.
Venanzi M. Mimicking hemoproteins: a new synthetic metalloenzyme based on a
Fe(III)-mesoporphyrin functionalized by two helical decapeptides / M. Venanzi, S.
Cianfanelli, A. Palleschi // J Pept Sci. – 2014. – V. 20 (1). – P. 36 - 45.
932.
Vernikos J. Advantages and disadvantages of fludrocortisone or saline load in
preventing post-spaceflight. Orthostatic hypotension / J. Vernikos., V.A. Convertino //
Acta Astronaut. – 1994. - V. 33. – P. 259 - 266.
933.
Veronesi M. The effect of intradialytic parenteral nutrition (IDPN) on the amino acid
pool, a kinetic study / M. Veronesi, E. Mancini, F. Valente et al. // G Ital Nefrol. – 2013.
– V. 30 (2).
934.
Verroust P.J. The tandem endocytic receptors megalin and cubilin are important
proteins in renal pathology / P.J. Verroust, H. Birn, R. Nielsen et al. // Kidney Int. –
2002. – V. 62 (3). – P. 745 - 56.
935.
Vico L. Effects of gravitational changes on the bone system in vitro and in vivo / L.
Vico, M.H. Lafage-Proust, C. Alexandre // Bone. – 1998. - V. 22(5 Suppl). – P. 95 100.
936.
Vijg J. Genome instability: cancer or aging? / J. Vijg, M.E. Dollé // Mech Ageing Dev.
– 2007. – V. 128 (7-8). – P. 466 - 8.
937.
Vikhlyantsev I.M. Changes in isoform composition, structure, and functional properties
of titin from Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) cardiac muscle after space flight
/ I.M. Vikhlyantsev, A.D. Okuneva, M.D. Shpagina et al. // Biochemistry (Mosc). – 2011. –
V. 76 (12). – P. 1312 - 20.
938.
Villanueva J. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome
patterns / J. Villanueva, D.R. Shaffer, J. Philip et al. // J. Clin. Invest. - 2006. – V. 116
(1). - P. 271 - 84.
939.
Vinge L. The effect of progressive glomerular disease on megalin-mediated endocytosis
in the kidney / L. Vinge, G.E. Lees, R. Nielsen et al. // Nephrol Dial Transplant. – 2010.
– V. 25 (8). – P. 2458 - 67.
940.
Virts E.L. A novel approach to thymic rejuvenation in the aged / E.L. Virts, J.A.
Phillips, M.L. Thoman // Rejuvenation Res. – 2006. – V. 9 (1). – P. 134 - 42.
941.
Visser F.W. Renal response to angiotensin II is blunted in sodium-sensitive
normotensive men / F.W. Visser, A.H. Boonstra, A. Titia Lely et al. // Am J Hypertens.
– 2008. - V. 21 (3). P. 323 - 8.
298
942.
Vizcaíno J A. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools:
status in 2013 / J.A. Vizcaíno, R.G. Côté, A. Csordas et al. // Nucleic Acids Res. –
2013. – V. 41(Database issue). – P. 1063 - 9.
943.
Vlahou A. Report on the first combined working group and management committee
meeting of EuroKUP (Urine and Kidney Proteomics cost action) / A. Vlahou, A.
Charonis, A. Benigni // J Proteomics. – 2009. – V. 71 (6). – P. 682 - 4.
944.
Vlahou A. Back to the future in bladder cancer research / A. Vlahou // Expert Rev
Proteomics. – 2011. – V. 8 (3). – P. 295 - 7.
945.
Vokurková M. Relationships between membrane lipids and ion transport in red blood
cells of Dahl rats / M. Vokurková, O. Nováková, Z. Dobesová et al. // Life Sci. – 2005.
- V. 77(13). – P. 1452-64.
946.
Vorobiev D. Blood volume regulating hormones, fluid and electrolyte modifications
during 21 and 198-day space flights (Altair-MIR 1993) / D. Vorobiev, A. Maillet, J.O.
Fortrat et al. // Acta Astronaut. – 1995. - V. 36 (8-12). – P. 733.
947.
Vugmeyster L. Effect of subdomain interactions on methyl group dynamics in the
hydrophobic core of villin headpiece protein / L. Vugmeyster, T. Do, D. Ostrovsky, R.
Fu // Protein Sci. – 2014. – V. 23 (2). – P. 145 - 56.
948.
Wan W. Dysfunction in elastic fiber formation in fibulin-5 null mice abrogates the
evolution in mechanical response of carotid arteries during maturation / W. Wan, R. L.
Jr. Gleason // Am J Physiol Heart Circ Physiol. – 2013. – V. 304 (5). – P. 674 - 86.
949.
Wang L. Concanavalin A-captured glycoproteins in healthy human urine / L. Wang, F.
Li, W. Sun et al. // Mol Cell Proteomics. – 2006. – V. 5 (3). – P. 560 - 2.
950.
Wang M. PaxDb, a database of protein abundance averages across all three domains of
life / M. Wang, M. Weiss, M. Simonovic et al. // Mol Cell Proteomics. – 2012. – V. 11.
– P. 492 – 500.
951.
Wang P. Erythropoietin derived by chemical synthesis / P. Wang, S. Dong, J.H. Shieh,
et al. // Science. – 2013. –V. 342 (6164). – P. 1357 - 60.
952.
Wang W. The carboxyl-terminal amino acids render pro-human LC3B migration similar
to lipidated LC3B in SDS-PAGE / W. Wang, Z. Chen, T.R. Billiar et al. // PLoS One. –
2013. – V. 8 (9). – P. 74222.
953.
Wasinger V.C. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma
genitalium / V.C. Wasinger, S.J. Cordwell, A. Cerpa-Poljak et al. // Electrophoresis. – 1995.
– V. 16 (7). – P. 1090 - 4.
299
954.
Watanabe N. Urinary protein as measured with a pyrogallol red-molybdate complex,
manually and in a Hitachi 726 automated analyzer / N. Watanabe, S. Kamei, A. Ohkubo
et al. // Clin Chem. – 1986. – V. 32 (8). – P. 1551 - 4.
955.
Waters W.W. Plasma volume restoration with salt tablets and water after bed rest
prevents orthostatic hypotension and changes in supine hemodynamic and endocrine
variables. Heart and circulatory physiology / W.W. Waters, S.H. Platts, B.M. Mitchell
et al. // American Journal of Physiology. – 2005. -V. 288 (2). – P. 839 - 847.
956.
Wei S. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1
receptor-mediated regulation of myeloid cells / S. Wei, S. Nandi, V. Chitu et al. // J
Leukoc Biol. – 2010. – V. 88 (3). – P. 495 – 505.
957.
Wei W. Disulfide bonds within the C2 domain of RAGE play key roles in its
dimerization and biogenesis / W. Wei, L. Lampe, S. Park et al. // PLoS One. – 2012. –
V. 7 (12). – P. 50736.
958.
Weinbaum S. The structure and function of the endothelial glycocalyx layer / S.
Weinbaum, J.M. Tarbell, E.R. Damiano // Annu Rev Biomed Eng. – 2007. –V. 9. – P.
121 - 67.
959.
Weinberger M.H. The blood pressure effects of calcium supplementation in humans of
known sodium responsiveness / M.H. Weinberger, U.L. Wagner, N.S. Fineberg // Am J
Hypertens. – 1993. – V.6 (9). – P. 799 - 805.
960.
Weiner I.D. Role of NH3 and NH4+ transporters in renal acid-base transport / I.D.
Weiner, J.W. Verlander // Am J Physiol Renal Physiol. – 2011. – V. 300 (1). – P. 11 23.
961.
Weismann A. The significance of sexual reproduction in the theory of natural selection.
In: Essays upon heredity and kindred biological problems / E.B. Poulton, S. Schцnland.
A.E. Shipley (Eds) // Oxford: Clarendon Press. - 1889. – P. 251 — 332.
962.
Wenstrup R.J. Reduced type I collagen utilization: a pathogenic mechanism in COL5A1
haplo-insufficient Ehlers-Danlos syndrome / R.J. Wenstrup, J.B. Florer, W.G. Cole et
al. // J Cell Biochem. – 2004. – V. 92 (1). – P. 113 - 24.
963.
Westenfeld R. Fetuin-A protects against atherosclerotic calcification in CKD / R.
Westenfeld, C. Schäfer, T. Krüger et al. // J Am Soc Nephrol. – 2009. - V. 20 (6). – P.
1264 - 74.
964.
Weston L.A. Comparison of bottom-up proteomic approaches for LC-MS analysis of
complex proteomes / L.A. Weston, K.M. Bauer, A.B. Hummon // Anal Methods. –
2013. - V. 5. – P. 18.
300
965.
Wiig H. Immune cells control skin lymphatic electrolyte homeostasis and blood
pressure / H. Wiig, A. Schröder, W. Neuhofer et al. / J Clin Invest. – 2013. – V. 123 (7).
– P. 2803 - 15.
966.
Wild J. Rubbing salt into wounded endothelium: sodium potentiates proatherogenic
effects of TNF-α under non-uniform shear stress / J. Wild, O. Soehnlein, B. Dietel et al.
// Thromb Haemost. - 2014. – V. 112 (1). – P. 183 - 95.
967.
Wilkins M. Proteomics data mining / M.Wilkins // Expert Rev Proteomics. – 2009. – V.
6(6). –P. 599-603.
968.
Willcox B.J. FOXO3A genotype is strongly associated with human longevity / B.J.
Willcox, T.A. Donlon, Q. He, et al. // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2008. – V. 105 (37).
- P. 13987 - 92.
969.
Wilson I.B. The class I α1,2-mannosidases of Caenorhabditis elegans / I.B. Wilson //
Glycoconj J. – 2012. – V. 29 (4). – P. 173 - 9.
970.
Wilund K.R. Physical activity, coronary artery calcium, and bone mineral density in
elderly men and women: a preliminary investigation / K.R. Wilund, E.J. Tomayko,
E.M. Evans et al. // Metabolism. – 2008. – V. 57 (4). – P. 584 - 91.
971.
Wirth H. Expression cartography of human tissues using self 27 organizing maps / H.
Wirth, M. Loeffler, M. von Bergen, H. Binder // BMC Bioinformatics. – 2011. – V. 12.
– P. 306.
972.
Wirth H. Mining SOM expression portraits: Feature selection and integrating concepts
of molecular function / H. Wirth, M. von Bergen, H. Binder // BioData Mining. - 2012.
– V. 5. - P. 18.
973.
Wolfe R.R. Optimal protein intake in the elderly / R.R. Wolfe, S.L. Miller, K.B. Miller
// Clin Nutr. – 2008. – V. 27 (5). – P. 675 - 84.
974.
Wolkowitz O.M. Glucocorticoids. Mood, memory, and mechanisms / O.M. Wolkowitz,
H. Burke, E.S. Epel, V.I. Reus //Ann N Y Acad Sci. – 2009. – V. 1179. – P. 19 - 40.
975.
World C.J. Thioredoxin in the cardiovascular system / C.J. World, H. Yamawaki,
B.C. Berk // J Mol Med (Berl). – 2006. – V. 84 (12). – P. 997 - 1003.
976.
Wright C.A. Label-free quantitative proteomics reveals differentially regulated proteins
influencing urolithiasis / C.A. Wright, S. Howles, D.C. Trudgian et al. // Mol Cell
Proteomics. – 2011. – V. 10 (8). – P. 110.
977.
Wu A.H. Biological variation for N-terminal pro- and B-type natriuretic peptides and
implications for therapeutic monitoring of patients with congestive heart failure / A.H.
Wu, A. Smith, S. Wieczorek et al. // Am J Cardiol. – 2003. – V. 92 (5). – P. 628 - 31.
301
978.
Xu X. Opening pathways of the DNA clamps proliferating cell nuclear antigen and
Rad9-Rad1-Hus1 / X. Xu, C. Guardiani, C. Yan, I. Ivanov // Nucleic Acids Res. – 2013.
– V. 41 (22). – P. 10020 – 31.
979.
Xiang W. Cardiac hypertrophy in vitamin D receptor knockout mice: role of the
systemic and cardiac renin-angiotensin systems / W. Xiang, J. Kong, S. Chen et al. //
Am J Physiol Endocrinol Metab. – 2005. – V. 288 (1). – P. 125 - 32.
980.
Yamamoto A. Molecular dynamics simulations of bovine cathepsin B and its complex
with CA074 / A. Yamamoto, K. Tomoo, H. Miyagawa, et al. // Chem Pharm Bull
(Tokyo). – 2000. – V. 48 (4). – P. 480 - 5.
981.
Yamamoto K. Effect of endogenous natriuretic peptide system on ventricular and
coronary function in failing heart / K. Yamamoto, J.C. Jr Burnett, M.M. Redfield // Am
J Physiol. – 1997. – V. 273 (5 Pt 2). – P. 2406 - 14.
982.
Yamamoto T. Towards standard protocols and guidelines for urine proteomics: a report
on the Human Kidney and Urine Proteome Project (HKUPP) symposium and
workshop, 6 October 2007, Seoul, Korea and 1 November 2007, San Francisco, CA,
USA / T. Yamamoto, R.G. Langham, P. Ronco et al. // Proteomics. – 2008. – V. 8 (11).
– P. 2156-9.
983.
Yang Y. Wnt signaling in development and disease / Y. Yang // Cell Biosci. – 2012. –
V. – 2 (1). – P. 14.
984.
Yao Y. Tissue kallikrein promotes cardiac neovascularization by enhancing endothelial
progenitor cell functional capacity / Y. Yao, Z. Sheng, Y. Li et al. // Hum Gene Ther. –
2012. – V. 23 (8). – P. 859 - 70.
985.
Yap E.H. Functional clustering of immunoglobulin superfamily proteins with proteinprotein interaction information calibrated hidden Markov model sequence profiles /
E.H. Yap, T. Rosche, S. Almo, A. Fiser // J Mol Biol. – 2014. – V. 426 (4). – P. 945 61.
986.
Yu H. Association of the tissue kallikrein gene promoter with ESRD and hypertension /
H. Yu, Q. Song, B.I. Freedman et al. // Kidney Int. – 2002. – V. 61 (3). – P. 1030 - 9.
987.
Yu X.M. Chrysin activates Notch1 signaling and suppresses tumor growth of anaplastic
thyroid carcinoma in vitro and in vivo / X.M. Yu, T. Phan, P.N. Patel et al. // Cancer. –
2013. – V. 119 (4). – P. 774 - 81.
988.
Zagouri F. Heat shock protein 90 (hsp90) expression and breast cancer / F. Zagouri, E.
Bournakis, K. Koutsoukos, C.A. Papadimitriou // Pharmaceuticals (Basel).- 2012. – V.
5(9). – P. 1008 - 20.
302
989.
Zak-Gołab A. Diagnostic value of antineutophil cytoplasmic antibodies / A. Zak-Gołab,
A. Hrycek, M. Holecki, J. Chudek // Wiad Lek. – 2011. – V. 64 (1). – P. 37 - 42.
990.
Zak-Gołab A. Vitamin K, bone metabolism and vascular calcification in chronic kidney
disease / A. Zak-Gołab, B. Okopień, J. Chudek // Przegl Lek. – 2011. –V. 68 (9). – P.
629 - 32.
991.
Zerefos P.G. Analysis of the urine proteome via a combination of multi-dimensional
approaches / P.G. Zerefos, M. Aivaliotis, M. Baumann, A. Vlahou // Proteomics. – 2012.
– V. 12 (3). – P. 391 - 400.
992.
Zhang H. Nitrative thioredoxin inactivation as a cause of enhanced myocardial
ischemia/reperfusion injury in the aging heart / H. Zhang, L. Tao, X. Jiao et al. // Free
Radical Biology & Medicine. - 2007. – V. 43 (1). - P. 39 - 47.
993.
Zhang L. Vascular adaptation to microgravity: what have we learned? / L.F. Zhang //
Journal of Applied Physiology. – 2001. - V. 91 (6). – P. 2415 - 2430.
994.
Zhang P. Protein analysis of atrial fibrosis via label-free proteomics in chronic atrial
fibrillation patients with mitral valve disease / P. Zhang, W. Wang, X. Wang et al. //
PLoS One. – 2013. – V. 8 (4). – P. 60210.
995.
Zhang J.-Y. Protective effect of urantide against ischemia-reperfusion injury via protein
kinase C and phosphtidylinositol 3’-kinase - Akt pathway / J.-Y. Zhang, Z.-W. Chen, H.
Yao // Can J Physiol Pharmacol. – 2012. – V. 90. – P. 637 – 645.
996.
Zhou H. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary
exosomes for biomarker discovery / H. Zhou, P.S. Yuen, T. Pisitkun et al. // Kidney Int.
– 2006. - V. 69 (8). – P. 1471 - 6.
997.
Zhou L.Y. A simple and label-free electrochemical biosensor for DNA detection based
on the super-sandwich assay / L.Y. Zhou, X.Y. Zhang, G.L. Wang et al., // Analyst. –
2012. – V. 137 (21). – P. 5071 – 5.
998.
Zhou X. Transfer RNA: a dancer between charging and mis-charging for protein
biosynthesis / X. Zhou, E. Wang // Sci China Life Sci. - 2013. – V. 56 (10). – P. 921 32.
999.
Zhou X. High-salt intake induced visceral adipose tissue hypoxia and its association
with circulating monocyte subsets in humans / X. Zhou, F. Yuan, W.J. Ji et al. //
Obesity (Silver Spring). – 2014. - V. 22 (6). - P. 1470 - 6.
1000.
Zhou Y. Transamination is required for {alpha}-ketoisocaproate but not leucine to
stimulate insulin secretion / Y. Zhou, T.L. Jetton, S. Goshorn et al. // J Biol Chem. 2010. – V. 285 (44). – P. 33718 - 26.
303
1001.
Zhou Y. Structure-function analysis of human l-prostaglandin D synthase bound with
fatty acid molecules / Y. Zhou, N. Shaw, Y. Li et al. //FASEB J. – 2010. – V. 24 (12). – P.
4668 - 77.
1002.
Zhuravleva O.A. Lipid peroxidation and antioxidant protection system in cosmonauts
following short-term missions to the International Space Station / O.A. Zhuravleva
//Aviakosm Ekolog Med. – 2011. – V. 45 (1). – P. 66 - 7.
1003.
Zieman S.J. Mechanisms, pathophysiology, and therapy of arterial stiffness / S.J.
Zieman, V. Melenovsky, D.A. Kass // Arterioscler Thromb Vasc Biol. – 2005. – V. 25
(5). – P. 932 - 43.
1004.
Zoidakis J. Profilin 1 is a potential biomarker for bladder cancer aggressiveness / J.
Zoidakis, M. Makridakis, P.G. Zerefos et al. // Mol Cell Proteomics. – 2012. – V. 11
(4). – P. 111.
1005.
Zufferey P. Systemic effects of epidural methylprednisolone injection on glucose
tolerance in diabetic patients / P. Zufferey, C. Bulliard, G. Gremion et al. // BMC Res
Notes. – 2011. – V. 4. – P. 552.
1006.
Zürbig P. Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry for proteomic
profiling of human urine and biomarker discovery / P. Zürbig, E. Schiffer, H. Mischak //
Methods Mol Biol. – 2009. – V. 564. – P. 105 - 21.
1007.
Zürbig P. The human urinary proteome reveals high similarity between kidney aging
and chronic kidney disease / P. Zürbig, S. Decramer, M. Dakna et al. // Proteomics. –
2009. – V. 9 (8). – P. 2108 - 17.
1008.
Zürbig P. Urine proteomics in kidney and urogenital diseases: Moving towards clinical
applications / P. Zürbig, H. Dihazi, J. Metzger et al. // Proteomics Clin Appl. – 2011. –
V. 5 (5-6). – P. 256 - 68.
1009.
Zürbig P. Urinary proteomics for early diagnosis in diabetic nephropathy / P. Zürbig, G.
Jerums, P. Hovind et al. // Diabetes. – 2012. – V. 61 (12). – P. 3304 - 13.
1010.
Zuj K.A. Impaired cerebrovascular autoregulation and reduced CO₂ reactivity аfter
long duration spaceflight / K.A. Zuj, P. Arbeille, J.K. Shoemaker et al. // Am J. Physiol
Heart Circ Physiol. – 2012. – V. 302 (12). – P. 2592 - 8.