биотехнологии в эндокринологииx
advertisement
Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКОСТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра патофизиологии лечебного факультета Филатов О.Ю., Малышев И.Ю. КЛЕТОЧНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В ЭНДОКРИНОЛОГИИ Учебное пособие для студентов лечебного факультета и слушателей факультета последипломного образования Москва 2010 1 СОДЕРЖАНИЕ стр. АННОТАЦИЯ 3 Часть 1. Биотехнология получения гормонов 5 Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК 5 Глава 2. Рекомбинантный фоллитропин 31 Глава 3. Рекомбинантный гормон роста 37 Часть 2 Биотехнология использования клеток в терапии 39 Глава 1. Диабет и клеточная трансплантация 39 Глава 2. Диабет и стволовые клетки 47 Глава 3. Трансфекция (перенос) гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной 56 их трансплантацией Часть 3. Перспективы биотехнологии. Топологическая концепция создания биоискусственных органов на примере щитовидной железы 59 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 65 РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ 66 КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ 75 2 Аннотация: Учебное пособие посвящено использованию современных методов клеточных биотехнологий в эндокринологии, и предназначено для методического обеспечения инновационно-образовательной деятельности медицинского ВУЗа. Учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных сотрудников медицинских ВУЗов. В представлен вклад биотехнологии в развитие эндокринологии и, прежде всего, создание генно-инженерных лекарственных препаратов: гормонов (инсулин, гормон роста), рекомбинантных гонадотропинов. К последним можно отнести рекомбинантный фоллитропин, применяющийся для гиперстимуляции яичниов при лечении бесплодия, и другие гормоны половой сферы. Современные достижения генной инженерии позволили создать ряд аналогов инсулина, обладающих заданными свойствами абсорбции из подкожного депо, что облегчило контроль уровня инсулина в крови. В пособии описаны и перспективные направления биотехнологии в области эндокринологии, например, замещение инсулин-продуцирующих клеток при сахарном диабете типа 1 за счет стволовых клеток. Источником таких клеток, способных дифференцироваться в инсулинпродуцирующие, может служить как эмбриональная ткань, так и ткани и органы взрослого организма (в особенности поджелудочная железа и жировая ткань). Вопросы дифференцировки стволовых клеток, развития инсулин-продуцирующих клеток из стволовых, выбора наиболее оптимального источника стволовых клеток для тканевой инженерии подробно освещены в пособии. Другим подходом, разрабатываемым в настоящее время является микроинкапсуляция пересаженных от донора островков Лангерганса с целью избегания иммунного отторжения. В пособии также рассматрены подходы к созданию биоинженерного аналога щитовидной железы ex situ с акцентом на топологический подход. область факультет применения и ФПДО; (факультет, курсы учебный «Патофизиология» курс): и Лечебный «Клеточные биотехнологии в современной медицине» характер издания (учебник, учебное пособие и др.): рукопись 3 учебного пособия формируемые Теоретические и компетенции практические (знания, основы умения использования биотехнологий в эндокринологии объем (печатных листов или др.): 80 стр. формата А4. 4 и навыки): клеточных Часть 1. Биотехнология получения гормонов. Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК. Если мы спросим, каков наиболее перспективный источник инсулина, спасающего жизни больных диабетом на протяжении последних десятилетий, то ответ будет очевиден – это рекомбинантный, или биосинтетический инсулин, т.е. инсулин, полученный из клеток бактерий или дрожжей путем применения технологии рекомбинантной ДНК. До разработки этой технологии использовался инсулин, получаемый из поджелудочной железы животных – свиней и коров, однако структура его несколько отличалась от структуры человеческого инсулина, что служило причиной осложнений со стороны иммунной системы, не желающей принять чужеродный белок. Впрочем, практически одновременно с разработкой технологии биосинтетического инсулина, появилась технология получения т.н. полусинтетического инсулина, полностью аналогичного человеческому, путем определенных модификаций инсулина свиней. Этот метод основан на использовании свиного инсулина с ферментно-химической заменой аланина в 30 позиции Вцепи на треонин. Основным недостатком данного метода является зависимость от получения необходимого количества инсулина от свиней, что в будущем при возрастающих потребностях в инсулине грозит серьезными сырьевыми трудностями. 5 Таким образом, технология рекомбинантной ДНК на сегодняшней день является ведущей технологией по получению инсулина: она позволяет синтезировать сколь угодно большие объемы белка и открывает широкие возможности по созданию аналогов инсулина с заданными свойствами. Первый коммерческий выпуск человеческого инсулина с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в 1980 г. стал результатом совместной деятельности клиники «Город Надежды» (Дуарте, Калифорния), университета Калифорнии (Сан-Франциско), корпорации Genetesch и Eli Lilly. Синтезировались гены А- и В-цепей инсулина, после чего вводились в ген -галактозидазы и экспрессировались в Echerichia coli. При получении продукта А- и Вцепи инсулина отделяли от бактериальных белков с помощью цианобромида. Из А- и В-цепей после очистки в дальнейшем синтезировался человеческий инсулин. В 1986 году тактика производства рекомбинантного инсулина несколько изменилась: инсулин стали получать путем процесса ферментивного преобразования биосинтетического человеческого проинсулина. Ген, кодирующий человеческий проинсулин внедряется в специальные непатогенные штаммы К12 кишечной палочки, которые затем выращивают в процессе ферментации для получения человеческого инсулина. Этап ферментации останавливают путем 6 термической стерилизации, чтобы устранить любую возможность контаминации бактериальными организмами. Таким образом, при биосинтетическом производстве инсулина геном инсулина человека встраивают в геном микроорганизмов – бактерий или дрожжей, которые начинают синтезировать предшественники инсулина, из которых потом ферментативным способом получают инсулин. Современные технологии двух крупнейших производителей человеческого инсулина - Eli Lilly и Novo Nordisk - отличаются по патентно-правовым причинам. Eli Lilly – первый производитель человеческого инсулина, использовавший генно-инженерную технологию, работает на геноме человека, с помощью которого кишечные палочки синтезируют проинсулин, превращающийся в инсулин после ферментативного отщепления С-пептида. Novo Nordisk применяет синтетически полученную ДНК для «мини-проинсулина» (проинсулина, в котором С-пептид короче, чем в проинсулине человека), которая затем вводится в геном клетки пекарских дрожжей. В дальнейшем из мини-проинсулина ферментативным способом выделяют инсулин. Структура полностью биосинтетического аналогична таковой человеческого «натуральной» инсулина молекулы, что позволяет снизить количество осложнений, связанных с образованием антител. Основной сложностью, 7 возникающей при синтезе рекомбинантного инсулина, является загрязнение продукта собственными белками бактерий, а также наличие иных примесей (например, примеси проинсулина). Эта проблема была полностью решена введением сложного процесса очистки получаемого белка путем многоступенчатой хроматографии, в биосинтетическом гельфильтрационной результате инсулине которых примеси не и ионообменной в современном определяются даже высокочувствительными методами. Синтез инсулина бактериальными клетками. Итак, в чем суть технологии биосинтеза инсулина [1] при использовании бактериальных клеток? «Фабрикой» по производству инсулина является всем известная кишечная палочка, обитатель пищеварительного тракта человека. Бактерия E.coli является, пожалуй, наиболее изученной бактериальной клеткой, а также клеткой-мишенью наиболее изученных бактериофагов. Сама по себе кишечная палочка не способна поглощать экзогенную ДНК, поэтому необходимо создать условия для проникновения чужеродной ДНК внутрь клетки, а также ее последующей репликации. Клетка E.coli окружена муреиновым мешком, прилегающим к внешней мембране: путем обработки клеток лизоцимом получают сферопласты. Для этого сначала применяют комплексообразователь этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), связывающую двухвалентные катионы, 8 которые стабилизируют липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий. После этого лизоцим уже может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его, что значительно повышает проницаемость бактериальной клетки и позволяет ввести в нее векторную ДНК. Однако прежде чем вводить необходимый ген в клетку, его необходимо получить и ввести в состав вектора. Для этого существуют различные подходы: например, выделение искомого гена из нативной молекулы ДНК или синтез копии гена по матрице выделенной мРНК, однако, поскольку нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей проинсулин, а также А- и В-цепи инсулина известна, наиболее удобным является метод химического синтеза ДНК. Для синтеза А-цепи инсулина необходимо 63 нуклеотида и 90 нуклеотидов для В-цепи, плюс кодон на конце каждой цепи, сигнализирующий об окончании синтеза белка (стоп-кодон). Кроме того, к началу каждого фрагмента ДНК, кодирующего А- или В-цепь, добавляют анти-кодон, кодирующий метионин, чтобы в последующем можно было отделить молекулу инсулина от фрагмента бактериального белка. Далее синтезированные гены А- и В-цепей инсулина (либо ген проинсулина) вставляют в ген бактериального фермента - -галактозидазы (lacZ), и затем всю эту конструкцию помещают в векторную плазмиду [1]. Что представляет собой вектор? Это носитель, задачей которого является доставить нужную ДНК в клетку-носитель и обеспечить ее экспрессию. 9 Часто в качестве вектора используют плазмиды – кольцевидные самореплицирующиеся нехромосомные формы организации ДНК, присутствующая в большинстве бактерий (см. рис.1). Помимо гена, кодирующего нужный белок (например, ту или иную цепь инсулина, либо проинсулин), вектор должен нести в своем составе регуляторные элементы, необходимые для экспрессии данного гена (в нашем случае транскрипцию гена инсулина будет обеспечивать промотор гена галактозидазы, упомянутой позволяющий отличить выше), а также трансформированные маркерный ген, клетки от нетрансформированных (часто это ген устойчивости к какому-либо антибиотику, например, ампициллину). 10 Рис.1. Электронная фотография бактериальной плазмиды. Каким образом можно вставить нужный ген в плазмиду? В этом помогают специальные ферменты, «разрезающие» молекулу ДНК в участках, соответствующих определенным последовательностям нуклеотидов длиной 4-8 нуклеотидных пар (это т.н. сайты рестрикции). Ферменты эти были открыты в 1968 году и названы рестриктазами. В 11 природе рестриктазы являются элементом бактериальной защиты от фагов: в каждом сайте рестрикции собственной ДНК бактерии остатки аденина и цитозина подвергаются метилированию, что препятствует работе рестриктазы, в то время как, если в клетку попадает чужеродная ДНК (например, бактериофага), рестриктаза режет ее на кусочки. В генной инженерии рестриктазы используются в качестве «молекулярных ножниц», разрезающих плазмиду (в том месте, куда необходимо вставить ген), а также для выделения нужного гена из более протяженного участка ДНК. После разрезания рестриктазой на концах получившихся фрагментов ДНК образуются т.н. «липкие» концы, которые при смешивании плазмид и генов формируют временные связи, а затем ген окончательно «пришивается» к плазмиде ферментом ДНК-лигазой (см. рис.2). 12 Рис.2. Пример «работы» рестриктазы. В данном случае сайтом рестрикции является последовательность aaactc и tttgag. Итак, все необходимые гены находятся в составе плазмиды и плазмида введена в бактерию. Что происходит дальше? Необходимо произвести селекцию, т.е. отобрать те бактерии, в которых находится и 13 экспрессируется ген инсулина. Для этого бактерии выращивают последовательно в двух средах: одна из них содержит ампициллин, другая – вещество, реагирующее с продуктом гена lacZ. При выращивании в ампициллин-содержащей среде, бактерии, не получившие векторные плазмиды вместе с геном устойчивости к ампициллину гибнут, те же кишечные палочки, которые захватили плазмиды, остаются в живых и размножаются. Помимо этого, необходимо выделить те бактерии, внутри которых находятся именно рекомбинантные плазмиды (ведь плазмида при инкубации с геном может и не включить его в свой состав). Мы должны вспомнить, что ген инсулина вставляли внутрь гена lacZ, кодирующего фермент галактозидазу. Бактерии с интактным lacZ геном окрашиваются в специальной среде в синий цвет. Очевидно, что в бактериях, несущих рекомбинантные плазмиды, -галактозидаза не экспрессируется, и такие бактерии в синий цвет окрашиваться не будут. В дальнейшем, когда не окрашенные и выжившие в ампициллиновой среде бактерии размножаются, нам остается только удостовериться в том, что они экспрессируют ген проинсулина (или одной из его цепей). Для этого существует ряд способов. Во-первых, можно определить содержание продукта в бактериальной среде. Во-вторых, можно провести кДНКгибридизацию: синтезировать фрагмент ДНК, комплементарный гену проинсулина (или его участку), присоединив к нему радиоактивный 14 или флуоресцентный зонд. В дальнейшем бактериальную ДНК денатурируют и инкубируют с содержащим зонд фрагментом. Если искомый ген есть в геноме бактерии, он связывается с зондом и «выдает» себя по свечению или радиоактивному излучению. Таким образом, получают кишечные палочки, содержащие ген, кодирующий одну из цепей инсулина, либо проинсулин. Бактерии размножаются, ген реплицируется и экспрессируется. (рис.3). Рис.3. Получение бактерий, содержащих ген, кодирующий цепь инсулина Синтезируемый такими бактериями белок представляет собой фрагмент -галактозидазы, соединенный с А- или В-цепью инсулина (или с проинсулином). Цепочки инсулина отщепляют от - галактозидазы и очищают. Затем их смешивают и путем реакции 15 образования дисульфидных связей получают биосинтетический инсулин (Humulin). В случае же получения проинсулина добавляется еще этап ферментативного отщепления С-пептида. Получение инсулина из клеток дрожжей. Лидерные последовательности. Альтернативой инсулину, получаемому из бактерий, является рекомбинантый инсулин, получаемый из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Эти прокариотические организмы способны синтезировать не отдельные цепи, а цельную молекулу инсулина (или его предшественника), что минимизирует необходимость в сложных и дорогостоящих процедурах очистки продукта. S. сerevisiae обладают сложной многокомпонентной секреторной системой, позволяющей осуществлять посттрансляционные модификации гетерологичных белков, в т.ч. N- и О-гликозилирование, а также формирование дисульфидных связей. Эти модификации аналогичны таковым, происходящим в клетках млекопитающих, что позволяет синтезировать с помощью дрожжей биологически активные белки млекопитающих, в т.ч. инсулин. Вспомним, как происходит биосинтез инсулина в клетках островков Лангерганса. Сначала синтезируется препроинсулин, имеющий структуру препептид-В-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, где А и В – 16 это А- и В-цепи проинсулина соответственно, а С – это С-пептид. Препептид отщепляется эндоплазматический проинсулин при ретикулум достигает транспортировке (ЭПР). аппарата К молекулы тому Гольджи, времени, уже в как успевают сформироваться дисульфидные связи, придающие ему определенную структуру в пространстве. Затем проинсулин расщепляется в двух точках, так что отщепляется С-пептид и образуется инсулин. В клетках дрожжей подобная система осуществляет посттрансляционные модификации -фактора. Что такое - -фактор? Это собственный белок дрожжей, принимающий самое непосредственное участие в их половом размножении. Дело в том, что существенным элементом жизненного цикла этих эукариотических организмов является стадия коньюгации. На этой стадии гаплоидные клетки (т.е. клетки несущие по одной копии каждой хромосомы) сливаются, образуя диплоидную клетку. Для того чтобы прошел процесс коньюгации (коньюгация может происходить между клетками разных половых типов; принадлежность к половому типу определяется геном MAT, имеющем два аллельных состояния a и ) необходимо чтобы сливающиеся клетки были остановлены в точке G1-S перехода. Остановка достигается с помощью вышеупомянутого -фактора, выделяемого в среду клетками 17 полового типа . -фактор рецептируется клетками типа а, которые в ответ останавливаются в точке G1-S перехода. Так вот, возвратимся к биосинтезу -фактора в клетках дрожжей: первоначально синтезируется его предшественник препептид-Lys-Arg-(Glu-Ala)2-F-Lys-Arg-(Glu-Ala)3-F-(Lys-ArgGlu-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-F)2. процессингу, в ходе расщепление в точках которого Далее происходит последовательностей он подвергается трипсиноподобное Lys-Arg, а потом дипептидиламинотрансферраза вырезает последовательности Glu-Ala и Asp-Ala [Thim L et al. 1986]. Особенностью биосинтеза инсулина в клетках дрожжей является необходимость добавления к гену, кодирующему инсулин, лидерной последовательности, благодаря которой и становится возможным осуществление посттрансляционных модификаций «объединенного» белка. С этой целью наиболее часто используется препролидерная последовательность вышеупомянутого -фактора (см. рис. 4). 18 Рис.4. Структура «объединенного» белка, состоящего из препептида, пропептида, сайта распознавания Kex2, пептидного спейсера и предшественника инсулина. Звездочками отмечены точки N-гликозилирования. Присоединенная к гену гетерологичного белка препролидерная последовательность -фактора опосредует в дальнейшем транслокацию предшественника инсулина в ЭПР, а оттуда – в аппарат Гольджи. При этом в ЭПР происходит отщепление сигнальной пептидазой пре-региона лидерной последовательности, а в аппарате Гольджи эндопротеаза Kex2 отщепляет ее про-регион. Kex2 «работает» на определенном участке, состоящем из двух аминокислот – Lys-Arg. Далее, уже перед самой секрецией, дипептидиламинотрансфераза, кодируемая геном STE13, отщепляет от белка оставшийся пептидный спейсер, после чего гетерологичный белок (в нашем случае – предшественник инсулина) высвобождается пространство (см. рис. 5) [Ostergaard S et al.2000]. 19 в межклеточное Рис.5. Секреция гетерологичного белка (инсулина) клетками дрожжей, в ходе которой происходит отщепление препептида сигнальной пептидазой, пропептида – Kex2-эндопротеазой и пептидного спейсера – дипептидиламинотрансферразой (Ste13). Первоначально применялась полная препролидерная последовательность -фактора со спейсером, имеющим структуру GluAla-Glu-Ala. Однако такой спейсер плохо удалялся дипептидиламинопептидазой, в результате чего получаемый продукт содержал большую долю примеси Glu-Ala-Glu-Ala-предшественника инсулина. В одном из исследований оказалось, что, если направленным мутагенезом удалить спейсер 20 из структуры лидерной последовательности, вышеупомянутой проблемы можно избежать. Некоторые исследователи, напротив, полагали, что присутствие спейсера необходимо, так как способствует более эффективному процессингу Kex2. Недостаточная «работа» этого фермента приводит к гипергликозилированию белка, что значительно снижает выход инсулина. В конце концов, были созданы спейсеры, более протяженные по длине, эффективно удаляемые трипсином и лизин-специфичной протеазой I, и это позволило в два раза повысить выход предшественника инсулина. Другой подход к повышению эффективности синтеза инсулина в клетках дрожжей последовательностей. – Такие создание «лидеры» синтетических могут лидерных увеличить выход предшественника инсулина с «правильной» трехмерной структурой, так, что он превысит выход, наблюдаемый при использовании препролидера -фактора. Этот эффект коррелирует с увеличением времени нахождения белка в эндоплазматическом ретикулуме, что, видимо, способствует формированию правильной пространственной конформации инсулина (т.е. белок получает дополнительное время на то, чтобы успеть нужным образом «свернуться»). Кроме того, выход продукта повышает исключение сайтов N-гликозилирования из синтетических лидерных последовательностей (чего не наблюдается в случае использования -факторного препролидера). Также можно 21 синтезировать лидерные последовательности, лишенные сайта распознавания Kex2 – в этом случае дрожжи будут секретировать предшественник инсулина, соединенный с пролидерной последовательностью, отщепление которой осуществляется in vitro. Преимущество этого подхода состоит в пролидер может увеличить том, что синтетический стабильность и растворимость «объединенного» белка, создав наиболее благоприятные условия для его последующей очистки и «созревания». Аналоги инсулина Аналогами инсулина модификации структуры называют молекулы белки, полученные путем нормального человеческого инсулина. Такой, модифицированный путем генной инженерии, инсулин обладает несколько иными – более предпочтительными в клинической практике - биологическими и фармакодинамическими свойствами. Первый аналог - инсулин лизпро - был введен во врачебную практику в 1996 году. Через 4 года эндокринологи смогли взять на вооружение два других рекомбинантных аналога - инсулин гларгин и инсулин аспарт. Прежде всего, зададим вопрос: для чего понадобились рекомбинантные аналоги инсулина? Вспомним, что у здорового человека после приема пищи концентрация инсулина в крови быстро повышается, достигая максимума через 30-45 мин и возвращаясь к 22 базальному уровню через 2-3 часа. Фармакокинетические характеристики препаратов человеческого инсулина таковы, что практически невозможно достигнуть устойчивой нормогликемии. При подкожной инъекции короткодействующий препарат человеческого инсулина «правильной» структуры слишком медленно начинает действовать и действие его длится дольше по сравнению с тем, как это происходит у здорового человека (так происходит из-за того, что молекулы инсулина начинают формировать димеры и гексамеры, что мешает им быстро абсорбироваться из места инъекции). В результате этого может наблюдаться ранняя постпрандиальная гипергликемия и повышается риск гипогликемии перед следующим приемом пищи. В случае же использования препаратов человеческого инсулина средней продолжительности или длительного действия, как правило, не удается достичь идеально стабильного базального уровня инсулина в крови. При их применении достигается нежелательный пик концентрации через 3-4 часа после инъекции, а, кроме того, биодоступность таких препаратов значительно варьирует у разных людей и даже у одного и того же человека. Таким образом, возникла необходимость в создании аналогов инсулина с измененными свойствами: с более быстрым началом и меньшей продолжительностью действия для препаратов короткого действия и более плоской кривой «время-эффект» и менее «изменчивой» биодоступностью для препаратов продленного действия. 23 Аналоги инсулина короткого действия. Итак, путем внесения небольших изменений в аминокислотную последовательность молекулы инсулина (см. рис.6) удалось добиться снижения «стремления» молекул агрегировать и образовывать димеры и гексамеры, за счет чего повысилась скорость их абсорбции, что означает более быстрый эффект и меньшую продолжительность действия. Рис.6. Структура человеческого инсулина Инсулин Asp (B10). Это один из первых аналогов инсулина, предложенный к клиническому применению. В его молекуле аминокислота гистидин в 10 позиции В-цепи заменена на аспарагин, а отличительной особенностью является быстрая абсорбция (в 2 раза 24 быстрее обычного инсулина). В ходе исследований этого аналога выяснилось, что замена единственной аминокислоты привела к изменению трехмерной структуры белка, что отразилось на его взаимодействии со своим рецептором, а именно: повысилась афинность к рецептору инсулина и ИФР-1 и снизилась скорость диссоциации. Таким образом, метаболический инсулина Asp превышал таковой обычного инсулина. И все бы хорошо, если бы не повышенная митогенная активность этого аналога, выявленная на некоторых клеточных линиях, а когда оказалось, что инсулин Asp повышает частоту аденокарциномы у животных, его дальнейшие испытания и вовсе прекратили. Инсулин лизпро (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN). Участок В26-30 молекулы инсулина не играет роли в связывании с рецептором, однако важен для образования инсулиновых димеров. Это значит, что любые изменения в этом участке не повлияют на связывание с рецептором, но могут снизить тенценцию молекул гормона к димеризации, что повысит скорость абсорбции. Инсулин лизпро оказался первым генноинженерным аналогом инсулина, введенным в клиническую практику. Он был получен путем реверсии пролина в 28 позиции и лизина в 29 позиции В-цепи, что заметно снизило способность молекул к ассоциации друг с другом, не повлияв на аффинность к рецептору инсулина. И хотя, аффинность к 25 рецепотору повышению ИФР-1 несколько митогенной повысилась, активности это аналога по не привело к сравнению с нормальным инсулином. Было также показано, что иммуногенность инсулина лизпро не отличается от обычного инсулина. Более того, некоторые пациенты с резистентностью к нормальному человеческому инсулину вследствие формирования антител могли, тем не менее, успешно применять инсулин лизпро. Инсулин аспарт [NovoLog (Novo Nordisk, Princeton, NJ)]. Другим примером изменения аминокислотной последовательности инсулиновой молекулы с целью создания короткодействующего аналога инсулина является инсулин аспарт (Asp B28), в котором замена пролина в 28 позиции В-цепи на аспарагиновую кислоту привела к снижению способности молекул к димеризации. Этот аналог инсулина был одобрен к клиническому применению в июне 2000 года в США. Кинетика взаимодействия инсулина аспарт с рецепторами к инсулину и ИФР-1 полностью аналогична таковой нормального инсулина, однако его аффинность к рецептору ИФР-1 несколько снижена. Инсулин аспарт абсорбируется в два раза быстрее обычного инсулина и достигает в два раза большей максимальная концентрации в крови, в то время как продолжительность его действия меньше. Таким образом, даже при введении этого аналога непосредственно до еды, постпрандиальный уровень глюкозы будет меньше, чем при введении 26 обычного инсулина за 30 мин до еды. Кроме того, снижается риск поздней постпрандиальной гипогликемии. Аналоги инсулина длительного действия. В настоящее время интенсивно изучается проблема преобразований молекулярной структуры инсулина с тем, чтобы замедлить и стабилизировать кинетику абсорбции с целью создания препаратов длительного действия. Один из способов пролонгировать действие инсулина – поднять его изоэлектрическую точку с рН 5,4 до нейтральных значений, путем разработки аналогов с большим числом положительно заряженных аминокислот в молекуле. Тогда молекулы становятся менее растворимыми в нейтральной среде, и подкожная инъекция такого аналога приведет к кристаллизации молекул в месте инъекции, что замедлит их абсорбцию в системный кровоток. NovoSol Basal (Novo Nordisk). NovoSol Basal (B27Arg, A21Gly, B30Thr-NH2) - первый аналог инсулина длительного действия, созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Оказалось, что его период полувыведения превышает таковой инсулина Ультратард НМ (Novo Nordisk) – одного из наиболее длительно действующих препаратов, однако из-за низкой биодоступности для достижения адекватного контроля уровня глюкозы в крови требовались в два раза большие дозировки этого аналога. Кроме того, несмотря на 27 небольшой уровень интраиндивидуальной вариабельности его эффекта, уровень интериндивидуальной вариабельности (т.е. вариабельности между различными индивиуумами) оставался высоким. Вследствие этих причин, дальнейшие испытания NovoSol Basal были прекращены. Инсулин гларгин [HOE 901, LANTUS (Aventis Pharmaceuticals, Parsippany, NJ)]. Этот биосинтетический аналог инсулина длительного действия был введен в клиническую практику в апреле 2000 года в США и в июне того же года в Европе. Инсулин гларгин был получен путем элонгации С-конца В-цепи молекулы инсулина посредством добавления двух остатков аргинина, а также замены аспарагина в 21 позиции А-цепи на глицин (A21Gly, B31Arg, B32Arg). Эти модификации привели к сдвигу изоэлектрической точки с рН5,4 к рН6,7, что сделало это аналог менее растворимым при физиологических значениях рН. Кроме того, замена аспарагина на глицин увеличила его биодоступность, благодаря чему, в отличие от NovoSol Basal, инсулин гларгин был одобрен для клинического применения. После инъекции эффект инсулина гларгин длится в течение 24 часов без выраженного пика концентрации в крови, и действует он «мягче» и с меньшей вариабельностью, чем НПХинсулины (НПХ это аббревиатура названия белкового пролонгатора "Нейтральный Протамин Хагедорна"). Другое преимущество этого 28 аналога в том, что если для НПХ-инсулинов эффект зависит от места введения, для инсулина гларгин такой зависимости выявлено не было. Ацилированные инсулины. Другой способ пролонгировать эффект инсулина – «заставить» его связываться с белками плазмы. Как известно, некоторые гормоны обладают способностью связываться с белками-переносчиками в плазме, что продлевает их период полувыведения. Достигнуть этого можно путем соединения молекулы инсулина с неэстерифицированной жирной кислотой (т.е. ацилированием), которая, в свою очередь, может связываться с альбумином. Поскольку альбумин всегда присутствует в подкожной тканевой жидкости, связывание инсулина с этим белком значительно замедлит скорость его абсорбции и пролонгирует действие. Ацилирование молекулы инсулина обычно производят по остатку лизина в 29 позиции В-цепи. Такой аналог – инсулин детемир (Levemir), в частности, был разработан фирмой Novo Nordisk. Инсулин детемир (LysB29-tetadecanoyl, des(B30)-insulin) был одобрен к применению в Европе с июля 2004 года, а в США в 2006 году. Время абсорбции этого аналога из места введения превышает таковое у НПХинсулинов, а интеридивидуальная вариабельность эффектов ниже. Также по сравнению с НПХ-инсулинами нет выраженного пика концентрации в крови, характерно более медленное начало действия. Инсулин детемир имеет меньшую 29 аффинность связывания с рецептором инсулина (и проявляет меньший эффект по сравнению с обычным инсулином при введении в эквимолярной дозе), но диссоциирует дольше. Было показано также, что связывание этого аналога инсулина с альбумином происходит независимо от связывания с альбумином других лекарственных препаратов, что значительно снижает вероятность лекарственных взаимодействий. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ • Синтез инсулина бактериальными клетками • Получение инсулина из клеток дрожжей. • Модификация нормального человеческого инсулина Синтез инсулина бактериальными клетками • Получение гормона • Помещение гена гормона в вектор • Введение вектора в бактерию • Селекция бактерий, содержащих рекомбинантные гены Синтез инсулина клетками дрожжей S. сerevisiae • Добавление лидерной последовательности к гену инсулина • Отщепление пре-региона в ЭПР дрожжей • Отщепление про-региона в аппарате Гольджи дрожжей • Отщепление спейсера • Секреция рекомбинантного гормона дрожжами Модификация человеческого инсулина Аналоги инсулина Аналоги инсулина короткого действия • Инсулин лизпро • Инсулин аспарт Аналоги инсулина длинного действия • Инсулин гларгин • Инсулин детемир 30 Глава 2. Рекомбинантный фоллитропин В наше дни терапия гонадотропинами воспринимается как нечто само собой разумеющееся при рутинном лечении бесплодия, однако получению безопасных и эффективных препаратов для клинического применения предшествовала длительная и непростая история научных исследований и открытий. История эта началась с попыток экстракции и очистки препаратов гормона от животных, человеческих трупов, затем из человеческой мочи, и закончилась разработкой метода получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с помощью технологии рекомбинантной ДНК, аналогичной таковой, описанной выше для инсулина. Аминокислотные последовательности фолликулостимулирующего гормона были - и -субъединиц описаны впервые исследователями Rathnam и Saxena в 1975 году, а ген, кодирующий молекулу ФСГ был клонирован Howles в 1996 году. Путем определенных манипуляций ген ФСГ «вставляли» в геном клеткипродуцента, используя для этого плазмидный вектор. Таким образом, в начале удалось «заставить» мышиные фибробласты секретировать ФСГ. Однако задача получения рекомбинантного ФСГ в промышленных масштабах казалась совсем не простой. Дело в том, что первые технологии получения различных биологических молекул (например, инсулина) разрабатывались на бактериальных клетках. 31 Однако человеческие гонадотропины, и ФСГ в их числе, имеют очень сложную структуру и требуют определенных посттрансляционных модификаций, приводящих к правильной конформации белковой молекулы и ее гликозилированию – все это делает использование прокариот для синтеза таких молекул крайне затруднительным. Например, от того в каких точках молекулы произойдет гликозилирование зависит очень многое – ее третичная структура, время деградации, распознавание такой молекулы рецепторами клетокмишеней и т. д. Рекомбинантные гликолизилированные пептиды успешно синтезировались некоторыми клеточными линиями млекопитающих, поэтому в научном мире начали активно изучаться культуральные системы клеток млекопитающих, способные синтезировать функциональные молекулы белков. Гены, кодирующие - и -цепи молекулы ФСГ вводили в структуру векторных плазмид (содержащих также промотор, необходимый для запуска транскрипции гена), переносимых в клетку-реципиента. В качестве клеток- продуцентов были выбраны клетки CHO (яичников китайского хомячка, Chinese hamster ovary), поскольку их легко трансфицировать инородной ДНК, эти клетки способны синтезировать гликозилированные белки и легко размножаются в культуре. Первый в мире рекомбинантный человеческий ФСГ (фоллитропин-) был создан лабораторией Serono в 1988 году, а с 1995 32 года начал продаваться в европейских странах под названием GonalF®. Чуть позже, фоллитропина- в 1996 лаборатории году, был лицензирован препарат Organon, получивший название Puregon®. В производстве Gonal-F для создания ФСГ-продуцирующей клеточной линии применялись два вектора, содержащие гены различных субъединиц гормона. Лаборатория Organon использовала только один вектор, который содержал кодирующие последовательности для обеих субъединиц молекулы. Для того, чтобы обеспечить эффективную биопродукцию гормона, отбирались стабильные клеточные линии, экспрессирующие димер ФСГ в достаточно больших количествах. Получаемый рекомбинантный ФСГ был значительно более гомогенным, чем наиболее хорошо очищенный препарат ФСГ гипофиза, что является несомненным преимуществом для клинического применения. Были также созданы клеточные линии, продуцирующие ЛГ и ХГЧ. Препараты этих рекомбинантных гормонов отличаются высокой степенью чистоты и биоактивности (ФСГ>10000, ЛГ 9000 и ХГЧ 20000 МЕ/мг белка соответственно). На иллюстрации представлены основные этапы процесс производства рекомбинантного ФСГ. Аликвоту выбранного клона CHO-клеток выращивают в колбе, называемой «Тflask», потом переносят в роллерные колбы и содержат там в течение 36 дней. ФСГ-продуцирующие клетки помещаются в микроячейки 33 биореактора, перфузируемые раствором, содержащим ростовые факторы, в течение периода времени до 3-х месяцев. Супернатант собирают, содержат при температуре 4ºС до момента очистки и затем выделяют из него рекомбинантный белок. Процесс очистки несколько отличается у различных производителей фоллитропина. Так, при производстве гидрофобную Pugeron применяют хроматографию, ионобменую хроматографию, а эксклюзионную также хроматографию. Производители Gonal-F, кром вышеупомянутых методов очистки, используют еще иммуноаффинный тест, основанный на взаимодействии с моноклональными антителами. Рис.7. Производство фоллитропина в биореакторе 34 Достижения биотехнологии позволяют постоянно расширять круг создаваемых рекомбинантных гонадотропинов, применяемых для лечения бесплодия. Создаются аналоги ФСГ с более длительным периодом полужизни и большей продолжительностью действия. Такие препараты позволили бы избежать ежедневных инъекций фоллитропина для стимуляции овуляции. Известно, что в отличие от ФСГ, другой гонадотропин человека - ХГЧ имеет относительно большой период полужизни, отчасти благодаря наличию четырех олигосахаридных цепочек, присоединенных к остаткам серина путем 35 О-гликозилирования гидрофильный и создающий С-концевой большой «хвост» по молекулы. размерам Технологии направленного мутагенеза и переноса генов позволили присоединить последовательность, кодирующую карбоксиконцевой участок -цепи ХГЧ (КТП – карбокситерминальный пептид), к 3-концу последовательности, кодирующей ФСГ. Синтезированный по этой конструкции белок сохраняет биологическую активность ФСГ, однако дольше «живет» в плазме крови. В 2001 году были опубликованы результаты мультицентрового клинического испытания КТП-ФСГ (время полуэлиминации этого аналога действительно оказалось в 2-3 раза большим, никаких серьезных побочных эффектов зарегистрировано не было), а в 2003 году родился первый ребенок, зачатый благодаря стимуляции яичников этим ФСГ-агонистом. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Синтез рекомбинантного фоллитропина • Помещение генов ФСГ в вектор • Введение вектора в клетки CHO (яичников китайского хомячка, Chinese hamster ovary) • Выращивание клона клеток СНО, содержащих гены ФСГ • Секреция рекомбинантного гормона клетками СНО 36 Глава 3. Рекомбинантный гормон роста Рекомбинантный гормон роста, так же как и инсулин, синтезируется бактериями – непатогенными штаммами кишечной палочки. До разработки и внедрения технологии рекомбинантной ДНК гормон роста получали из гипофизарных желез, взятых от трупов. В 1979 году исследователи Genentech впервые синтезировали человеческий гормон роста, поместив ДНК, кодирующую гормон роста, в векторную плазмиду, которую затем вводили в бактериальную клетку. Принципы технологии получения рекомбинантного гормона роста, в целом, схожи с таковыми для инсулина, однако имеют свои особенности. Ген, кодирующий гормон, был получен путем обратной транскрипции матричной РНК, взятой из гипофиза, так что получался комплементарный ей фрагмент ДНК. С помощью применения рестриктазы HaeIII (от Haemophilus aegyptius - бактерии, являющейся источником данного фермента), распознающей последовательность GG▼CC, полученная ДНК разрезалась в 3-некодирующей области и по 23 кодону, так что получался фрагмент из 551 пар оснований, кодирующий последовательность 24-191 а/к гормона роста. Далее химическим путем синтезировали «адапторный» фрагмент ДНК, кодирующий последовательность первых 23 а/к гормона и содержащий, кроме того, кодон начала транскрипции – ATG. Оба 37 фрагмента объединяли с образованием гибридного «синтетическинатурального» гена гормона роста. Синтезировать такой ген полностью оказалось бы слишком трудной задачей из-за его большой длины (чем короче фрагмент ДНК, тем легче получить его синтетическим путем). В то же время, если бы в плазмиду вставляли непосредственно тот ген, который получали путем обратной транскрипции мРНК, то бактериальная клетка подвергала бы трансляции и тот участок гена, который у человека не транслируется, синтезируя «пре-гормон», содержащий лишние 26 а/к. Этот ненужный «хвост» пришлось бы специально удалять, что создало бы определенные сложности. Таковы причины, по которым решено было конструировать именно гибридный ген. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Синтез гормона роста • Ген, кодирующий СТГ, получают обратной транскрипциейматричной РНК, взятой из гипофиза • С помощью рестриктазы HaeIII получают фрагмент, кодирующий последовательность 24-191 а/к гормона роста • Синтезируют фрагмент ДНК, кодирующий первые 23 а/к гормона и и содержащий кодон ATG • Объединение обоих фрагментов в гибридный «синтетически-натуральный» ген СТГ • Введение гена СТГ в плазмиду • Перенос гена вектором в непатогенные штаммы кишечной палочки и синтез ими гормона 38 Часть 2 Биотехнология использования клеток в терапии. Глава 1. Диабет и клеточная трансплантация. Трансплантация поджелудочной железы. Хирургическая трансплантация цельной васкуляризованной поджелудочной железы (ПЖ) или даже ее половины во многих случаях может иметь отличный долгосрочный результат – излечение диабета. Особенно трансплантация ПЖ показана в случаях, когда больной диабетом страдает от хронической почечной недостаточности (как осложнение диабета) и нуждается еще и в пересадке почки – тогда почку и поджелудочную железу можно взять от одного донора. В этом случае пожизненная иммуносупрессия, применяемая с тем, чтобы не допустить отторжения трансплантата, уже не столь дорогая цена за лечение диабета, т.к. она все равно бы потребовалась при трансплантации почки. Главным недостатком данного способа лечения диабета является его малая доступность для больных диабетом, поскольку количество донорских ПЖ значительно ниже количества больных, требующих пересадки. Кроме того, пересадка ПЖ – это сложная хирургическая операция, требующая общего наркоза и чреватая осложнениями, связанными с высвобождением панкреатических ферментов. Трансплантация клеток островков Лангерганса. 39 Идея трансплантации островков Лангерганса (ОЛ) не нова и выглядит заманчивой,. Изолированные от донора ОЛ легче сохранить до момента трансплантации поскольку каждый отдельный островок достаточно мал, чтобы выжить продолжительное время в подходящей среде, получая кислород путем обычной диффузии. Трансплантация ОЛ не требует общего наркоза и потому легче переносится больными. Однако в связи с определенными сложностями эта методика остается преимущественно экспериментальной, хотя и неоднократно применялась на людях. Первая проблема, которая встает перед учеными и врачами на этом пути – выделение ОЛ из ткани донорской ПЖ, а сделать это совсем не просто. Для того, чтобы получить ОЛ, необходимо предварительно разрушить структуру ПЖ энзиматическим и механическим способом. Часть ОЛ разрушается во время этой процедуры, другие губит ишемия или действие коллагеназ. Если можно позволить себе такое сравнение, то изоляция ОЛ похожа на выкапывание картошки острой лопатой глубокой ночью. Этот процесс длителен и требует большого профессионализма. Получение 3-400000 ОЛ из ПЖ, взятой от трупа (что составляет примерно треть от их общего количества в ПЖ), требует напряженной 5-часовой работы 5 человек. Вместе с тем, для того, чтобы освободить больного диабетом от постоянных инъекций инсулина требуется пересадка в два раза большего числа ОЛ [2]. Как выглядит процесс изоляции ОЛ (по 40 Эдмонтскому протоколу) в деталях? Как правило, ОЛ берутся из ПЖ доноров с констатированной смертью мозга, в более редких случаях – с остановкой сердца. В сосудистое русло изолированной ПЖ вводят холодный раствор University of Wisconsin и транспортируют в лабораторию, где в главный проток ПЖ вводят фермент либеразу (относится к группе коллагеназ). Время транспортировки обычно составляет 2-3ч. Измельченную ферментативным и механическим способами ПЖ помещают в центрифугу, отделяя, таким образом, ОЛ от остальных фрагментов ткани ПЖ (см. рис. 8). Рис.8. Основные этапы получения ОЛ: 1) выбор донора и изоляция ЩЖ, 2) хранение и транспортировка ЩЖ в двухслойной среде, 3) обработка ЩЖ коллагеназой и ее разрушение в камере Рикорди, 4) изоляция и очистка ОЛ из ткани ПЖ 41 Полученные ОЛ вводят в воротную вену реципиента через канюлю. ОЛ образуют микроэмболы в синусоидах печени, а через некоторое время в них прорастают капилляры и устанавливается нормальное кровоснабжение. На этом этапе также возможны осложнения, поскольку ОЛ попавшие в кровяное русло могут активировать комплемент, вызвать локальную агрегацию тромбоцитов, в результате чего может образоваться тромб, угрожающий ишемией паренхиме печени. Пациенты с трансплантированными ОЛ, как и в случае другой аллогенной трансплантации, должны получать иммуносупрессорную терапию. Каковы результаты трансплантации ОЛ при диабете? При проведении процедуры по Эдмонтонскому протоколу около 80% реципиентов не зависят от экзогенного инсулина в течение года и около 70 % - в течение 2 лет. К сожалению, часть пересаженных ОЛ со временем перестает «работать»: через 5 лет после пересадки введения инсулина не требуют только 50 % больных [3]. Возможно, этот процесс связан с истощением функции -клеток или реакцией иммунной системы на трансплантат. Очевидно, что первая проблема, которая встает перед учеными и медиками при аллогенных трансплантациях – это решение вопроса, как можно избежать иммунного отторжения трансплантата. Теоретически существует два способа преодоления этой проблемы: 1) оказание подавляющего влияния на иммунную 42 систему реципиента (иммуносупрессанты, главным образом, и применяются на практике), 2) модификация клеток трансплантата с тем, чтобы снизить их иммуногенность. Второй подход, в свою очередь, включает в себя два подраздела: 1) изоляцию трансплантируемых клеток от иммунной системы путем окружения их полупроницаемой мембраной или оболочкой, 2) генетическая инженерия клеток, позволяющая снизить их иммуногенность. В качестве примера последнего подхода, можно привести исследование, в котором ОЛ от мышей, нокаутных по 2микроглобулину (это означает, что на клетках отсутствовали антигены МНС I класса), после аллогенной трансплантации практически не распознавались иммунной системой реципиента и не разрушались натуральными киллерами. Активно изучалась стратегия введения и экспрессии гена аденовирусного белка gp19К в клетках ОЛ. Этот белок задерживает молекулы МНС I класса в эндоплазматическом ретикулуме клетки, не давая им экспрессироваться на наружной мембране. Однако позже выяснилось, что gp19К с разной аффинностью взаимодействует с различными аллелями MHC (а гены МНС, как известно, очень полимрфны), и потому, не всегда оказывает свое «защитное» действие. Еще одна концепция состоит в предотвращении цитокин-индуцированного апоптоза -клеток – например, путем введения в клетки вектора с геном антиапоптотического белка bcl-2 43 (идея небезопасная, поскольку клетки, не умеющие убивать себя, могут дать начало злокачественной опухоли). Иммунной реакции на трансплантат можно избежать (или, по крайней мере, значительно ослабить ее), если поместить ОЛ в специальные капсулы. В последние годы активно изучается возможность эффективность пересадки ОЛ, помещенных в Са2+связанные альгинатные микрокапсулы. Напомним, что альгинат, состоящий из солей альгиновой кислоты, получают из бурых водорослей. Альгиновая кислота представляет собой полимерную цепь, состоящую из двух мономеров — остатков полиуроновых кислот (Dманнуроновой и L-гиалуроновой) в разных пропорциях, варьирующихся в зависимости от конкретного вида водорослей. В отличие солей альгиновых кислот с моновалентными металлами (натрий Na+), соли альгиновых кислот с бивалентными металлами (кальций Са2+) плохо растворимы в воде из-за перекрестных связей, возникающих между полимерными молекулами альгиновых кислот. Таким образом, при добавлении растворимых солей кальция или бария к соли альгиновой кислоты с моновалентным металлом происходит реакция альгиновой кислоты с освободившимися ионами двухвалентного металла. В результате, отдельные цепочки альгиновых кислот перекрестно связываются ионами кальция, что приводит к формированию эластичного геля и полимеризации массы, так 44 образуется капсула. Альгинатная капсула имеет поры, пропускающие питательные вещества к инкапсулированным ОЛ, но слишком маленькие для того, чтобы пропустить иммунные клетки, что и позволяет значительно ослабить иммунную реакцию. В качестве материала для микрокапсул долгое время использовался Са2+связанный альгинат-полилизин-альгинатный полимер (следуя протоколу Lim и Sun, разработавших этот метод в 1980 году). Однако результаты, полученные некоторыми исследователями, применявшими такие микрокапсулы, не слишком впечатляют. Оказалось, что время выживания ОЛ слишком мало, сами капсулы недостаточно стабильны, а полиаминокислота, содержащаяся в их составе, цитотоксична. Микрокапсулы на основе Ba2+-связанного альгината лишены этих недостатков и активно исследуются. Schneider и соавт., впервые успешно пересадившие человеческие микроинкапсулированные ОЛ, применяли микрокапсулы на основе высоко очищенного альгината ультравысокой вязкости, связанного ионами Ba2+. При в альгинатную массу белка (альбумина) микрокапсулы демонстрировали особенно высокую стабильность. Так, по данным этих иследователей, инкапсуляция ОЛ от крыс и людей в такие микрокапсулы защищала ОЛ от иммунного отторжения при пересадке их иммунокомпетентным мышам-«диабетикам» [4]. Если неинкапсулированные ОЛ теряли свою функцию уже через 4-8 дней после трансплантации (т.е. у мышей 45 начиналась гипергликемия), то инкапсулированные – через 7 месяцев и более без применения иммуносупрессии. Подход к микроинкапсуляции ОЛ активно изучается и разрабатывается, но еще ни разу не применялся у людей. В случае введения такого метода (в его наиболее совершенном виде) в клиническую практику можно надеяться на повышение эффективности трансплантации аллогенных ОЛ, а также на появление возможности трансплантации ксеногенных ОЛ. Как бы то ни было, в настоящее время трансплантация ОЛ применяется весьма ограниченно в связи с такими недостатками, как трудность получения донорской ПЖ, сложность РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ изоляции ОЛ, высокая стоимость процедуры, необходимость иммуносупрессивной терапии, посему ученые активно Биотехнология трансплантации островковых клеток • Выделение ОЛ из ткани донорской ПЖ ищут новые пути решения проблемы диабета. • Разрушение ткани ПЖ энзиматически (либераза) и механически с последующим центрифугированием • Основные этапы получения ОЛ: 1) выбор донора и изоляция ПЖ, 2) хранение и транспортировка ПЖ в двухслойной среде, 3) обработка ПЖ коллагеназой и ее разрушение в камере Рикорди, 4) изоляция и очистка ОЛ из ткани ПЖ Введение ОЛ в воротную вену • • ОЛ образуют микроэмболы в синусоидах печени Приживление ОЛ в ткани печени • В печени в ОЛ прорастают капилляры и устанавливается нормальное кровоснабжение Приживление островковых клеток • Решение проблемы иммунного отторжения трансплантата ОЛ • Снижение иммуногенности трансплантата • Изоляция трансплантируемых клеток мембраной (альгинатные микрокапсулы) • Генетическая инженерия клеток трансплантата (введение gp19К или bcl-2) • Подавление иммунного ответа • иммуносупрессоры46 Глава 2. Диабет и стволовые клетки. Эмбриональные стволовые клетки Источником эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) служит внутренняя клеточная масса эмбрионов в стадии пре-имплантации. Эти клетки обладают двумя основными свойствами: способостью к неограниченной пролиферации и плюрипотентным потенциалом развития (т.е. эти клетки могут дифференцироваться и дать начало любой ткани организма). Наличие этих особенностей делает ЭСК привлекательным материалом для клеточной инженерии. Каковы принципы работы с ЭСК? Для того, чтобы клеточная терапия была успешной, необходимо получить «чистую» популяцию клеток определенного типа. Несмотря на прогресс науки и биотехнологии, эта задача остается сложной для биологов и в наши дни. Наиболее часто используемый метод дифференцирования ЭСК – инициация дифференцировки через формирование т.н. «эмбриоидного тела». ЭСК помещают в условия для культивирования, в которых они не могут адгезировать к поверхности (сосуд сделан из специального «скользкого» пластика, с которым клетки не взаимодействуют), добавляя в культуральную среду необходимые факторы роста и дифференцировки – ЭСК при этом начинают формировать агрегаты, называемые эмбриоидными телами, поскольку весь этот процесс отчасти напоминает образование раннего эмбриона in vivo. Однако 47 дифференцирующиеся клетки становятся гетерогенными, поскольку, в зависимости от их нахождения внутри эмбриоидного тела, они попадают в различные условия и получают различные паракринные/аутокринные сигналы. Поэтому из эмбриоидного тела необходимо выделить определенный тип клеток, способных дифференцироваться потом в инсулин-продуцирующие. Была описана серия экспериментов, в которых удалось «заставить» мышиные ЭСК дифференцироваться в инсулин-секретирующие структуры, напоминающие ОЛ (см. рис.9). Исследователи взяли ЭСК из внутренней клеточной массы бластулы и культивировали их так, что сформировались эмбриоидные тела (обозначены голубым цветом на рис.). Затем из этих эмбриоидных тел была выделена популяция клеток, экспрессирующая маркер нестин (на рис. обозначены сиреневым). Затем, используя сложную пяти-стадийную технику культивирования, ученые индуцировали клетки к формированию ОЛподобных структур, секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы (правда, в меньших количествах, чем настоящие ОЛ). При инъекции мышам с диабетом, эти клетки оставались жизнеспособными и продолжали секретировать инсулин, хотя и не влияли значительно на симптомы болезни. 48 Рис. 9. Развитие инсулин-продуцирующих ОЛ-подобных структур из мышиных ЭСК. В 2003 году ученые из Эдинбургского университета разработали новую – адгезивную – культуральную систему, в которой удалось дифференцировать мышиные ЭСК в предшественники нейронов. После этого в нескольких лабораториях было показано, что культивирование 49 ЭСК в адгезивной среде может позволить в некоторых случаях получить более гомогенную клеточную линию, чем если идти путем формирования эмбриоидных тел (в частности, обнадеживающие результаты были получены в экспериментах с дифференцировкой кардиомиоцитов, гепатоцитов и эндокринных клеток ПЖ) [5]. Калифорнийские биологи D'Amour и соавт. разработали все детали процесса дифференцировки из человеческих ЭСК в адгезивной среде эндокринных панкреатических клеток, способных продуцировать инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид. В процессе дифференцировки ЭСК проходили все те этапы, которые проходят стволовые клетки при органогенезе in vivo: стадию дефинитивного энтодермального листка, стадию энтодермы кишечной трубки, панкреатической энтодермы и эндокриныых клеток- предшественников, окончательно дифференцирующихся в гормонпродуцирующие клетки [6]. Несмотря на то, что эмбриональные стволовые клетки способны дифференцироваться в любой тип клеток, в т.ч. и -клетки, возможность их использования имеет свои ограничения. Не говоря уже об этическом вопросе применения человеческих ЭСК в терапевтических целях, встает проблема огромной пролиферативной способности этих клеток и связанного с этим риска развития тератокарцином в том случае, если среди вводимых больному -клеток 50 попадется хотя бы одна недифференцированная ЭСК. В экспериментах на модели сахарного диабета у мышей удалось получить инсулинпродуцирующие клетки из ЭСК путем введения в них гена человеческого инсулина и успешно лечить такими клетками мышиный диабет. Однако «перенести» эти результаты на человеческий организм оказалось сложнее, поскольку человеческие ЭСК пролиферируют медленнее и менее жизнеспособны в культуре, чем мышиные. Перспективным подходом является перенос ядра соматической клетки пациента в яйцеклетку с тем, чтобы получить стволовые клетки изологичные клеткам пациента. Разработка этой методики находится пока на самом начальном этапе, а сам метод обещает стать весьма дорогостоящим, хотя иммуносупрессорной и может терапии, позволить сопровождающей избежать любую трансплантацию. Взрослые стволовые клетки I. Стволовые клетки из поджелудочной железы В ряде исследований было показано наличие стволовых клеток, способных дифференцироваться в инсулин-продуцирующие, в ткани ПЖ: в ОЛ, в протоках ПЖ, среди популяции ацинарных клеток. При этом, если стволовые клетки, обнаруженные в протоках ПЖ, превращались в инсулин-продуцирующие 51 при применении специфической стимуляции, то в случае ацинарных клеток- предшественников сначала требовалась их дедиференцировка (т.е. возвращение к недифференцированному фенотипу), а уж потом дифференцировка в -клетки. Впрочем, существует точка зрения, также подтвержденная экспериментально, которая утверждает, что источником -клеток в ПЖ взрослого организма являются не стволовые клетки (или клетки-предшественники), а популяция таких же дифференцированных -клеток, сохранивших способность к размножению. Это исследование, однако, не опровергает возможность наличия в тканях ПЖ стволовых клеток, поскольку авторы не ставили свое задачей их целенаправленных поиск. Существует предположение о том, что стволовыми клетками, способными стать источником -клеток, являются нестин- экспрессирующие мезенхимальные клетки в ОЛ (нестин известен как маркер нейрональных стволовых клеток). Стало известно, что в ПЖ взрослых мышей существуют мультипотентные клетки- предшественники, способные дать начало как нейрональным, так и панкреатическим клеточным линиям. Помимо этого, в некоторых экспериментах нестин-позитивные клетки ОЛ взрослых людей, дифференцировались в инсулин-продуцирующие клетки, а нестинэкспрессирующие клетки, взятые 52 из фетальной ПЖ, могли размножаться, дифференцироваться и образовывать инсулин- продуцирующие ОЛ-подобные кластеры, снижающие гипергликемию у диабетических мышей. Что собой представляет этот загадочный маркер - нестин? Считается что при делении стволовых клеток нестин играет роль в неравномерном распределении компонентов цитоплазмы между дочерними клетками, так что одна из них остается стволовой, а вторая дифференцируется. Клетки, несущие на себе нестин, могут дифференцироваться в различые типы клеток, в частности, не только в эндокринные, но и в экзокринные клетки ПЖ, а также гепатоциты. К сожалению, основные достижения, касающиеся потенциального применения нестин-позитивных клеток при сахарном диабете, были продемонстрированы на мышах. При культивировании таких клеток из человеческих ОЛ было показано, что они могут размножаться и образовывать ОЛ-подобные структуры, а также экспессировать гены гормонов ПЖ (инсулин, глюкагона и соматостатина), однако до сих пор не удалось «заставить» эти клетки секретировать инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы. II. Стволовые Стволовые клетки иного происхождения. клетки, способные дифференцироваться в инсулин- продуцирующие, были обнаружены в печени, центральной нервной системе, селезенке, костном мозге и жировой ткани. Костномозговые стволовые клетки мышей и крыс могут превращаться в инсулин53 секретирующие клетки in vitro и даже снижать гипергликемию на модели диабета у животных. Описано также, что человеческие стволовые клетки могут начать экспрессировать инсулин, если «заразить» их аденовирусом, несущим векторы, содержащие гены некоторых транскрипционных факторов. Стало известно, что не только костномозговые стволовые клетки, но и другие клетки гемопоэтического происхождения могут стать источником клеток, вырабатывающих инсулин. Речь идет о моноцитах периферической крови человека. Если создать в культуре клеток определенные условия, то можно «заставить» моноциты дедифференцироваться и приобрести, таким образом, свойства стволовых клеток. Затем, экспериментально подбирая условия культивирования и набор добавляемых в культуру ростовых факторов, можно превратить такие клетки в гепатоцитоподобные клетки, вырабатывающие альбумин, или ОЛподобные клетки, вырабатывающие инсулин и глюкагон, или в адипоциты, или обратно в моноциты. Интересны результаты полученные Ruhnke и соавт. Исследователи изолировали моноциты периферической крови человека и в течение 6 дней культивировали их в среде, содержащей моноцитарный колоиестимулирующий фактор и интерлейкин-3, благодаря чему была достигнута дедифференцировка моноцитов. Затем полученные недифференцированные клетки поместили на 4-8 дней в среду, содержащую эпидермальный ростовой 54 фактор, фактор роста гепатоцитов и никотинамид. Клетки по мере размножения группировали в структуры, напоминающие ОЛ. Эти неоостровки, демонстрирующие экспрессию панкреатических генов, были пересажены мышам со стрептозоци-идуцированным диабетом. После трансплантации концентрация глюкозы в крови у таких мышей возвратилась к норме и держалась на этом уровне около 8 дней, до тех пор, пока не развилась трансплантированных клеток иммуносупрессорной терапии). реакция иммунного (животные Идея этого отторжения не подхода получали кажется привлекательной. Если бы удалось получить достаточное количество инсулин-продуцирующих клеток из моноцитов периферической крови больного диабетом, а потом пересадить эти клетки обратно тому же больному, то удалось бы избежать иммунного отторжения, а, значит, отпала бы необходимость в иммуносупрессии. При этом, пока еще не были проведены аналогичные исследования на людях, остаются вопросы: 1) можно ли получить достаточное число инсулинпродуцирующих клеток от больного диабетом; 2) будут ли неоостровки вести себя так же как обычные ОЛ в течение длительного времени?; 3) безопасны ли для здоровья человека манипуляции и реагенты, используемые при культивировании клеток? На все эти вопросы предстоит получить ответы в будущем. 55 РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Технологии, использующие стволовые клетки: • • Эмбриональные стволовые клетки • формирование «эмбриоидного тела» • культивирование ЭСК в адгезивной среде • создание гибридных стволовых клеток Стволовые клетки из поджелудочной железы • полипотентные стволовые клетки (нестин-экспрессирующие мезенхимальные клетки в ОЛ) • Стволовые клетки иного происхождения • костномозговые стволовые клетки • культуры моноцитов крови Формирование эмбрионального тела: • ЭСК взяли из внутренней клеточной массы бластулы и культивировали их так, что сформировались эмбриоидные тела. Затем из этих эмбриоидных тел была выделена популяция клеток, экспрессирующая маркер нестин. Затем индуцировали клетки к формированию ОЛ-подобных структур, секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы. Глава 3. Трансфекция (перенос) гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной их трансплантацией Идея использоваться собственные клетки больного с введенным в них геном инсулина для трансплантации кажется также весьма привлекательной, ибо позволяет избежать необходимости иммуносупрессии. Для того, чтобы ввести вектор с необходимыми генами в клетку возможно применение двух методов: использовать для этого вирусы или ввести в клетку плазмиду посредством электропоризации. И хотя первый подход более эффективен, второй 56 является более безопасным, поскольку многие вирусы обладают способностью активировать клеточные онкогены. Перенос гена инсулина с помощью электропоризации был успешно применен в эксперименте на клетках печени мышей; трансплантация таких клеток мышам с диабетом восстанавливала эугликемию. Возможности применения для трансфекции клеток вирусов также широко изучается. Для того, чтобы перенести в клетку вектор, вирус должен быть достаточно большим, чтобы вместить в свой геном генно-инженерную конструкцию. Большинство исследований, посвященных этой тематике, было проведено с двумя типами вирусов: аденовирусами и аденоподобными вирусами и модифицированными ВИЧ. Ранние клинические испытания с обоими типами вирусов имели своим результатом умеренное улучшение состояния больных, однако в трех случаях сообщалось о серьезных осложнениях. В одном из случаев развилась аденовирусная инфекция со смертельным исходом, в двух других модифицированыый ВИЧ, по всей видимости, демаскировал ядерные онкогены, что привело к развитию лейкемии. Эти трагические события вызвали острую критику в адрес проводимых исследований, однако необходимо признать, что культуральные технологии еще недостаточно совершенны, чтобы полностью отказаться от применения вирусных векторов. В последние годы исследовательской группой во главе с Calne и соавт. исследуется также возможность использования 57 модифицированного вируса герпеса I типа. Ранее вариант этого вируса применялся для локального лечения глиобластомы и инъецировался прямо в мозг. При последующем 5-летнем наблюдении пациентов никаких проявлений системного заболевания зарегистрировано не было. К теоретическим преимуществам ВПГ I типа относятся: 1) большая способность к аккомодации генно-инженерной конструкции, 2) несмотря на то, что вирус проникает в ядро, он не интегрирует свой геном в ДНК хозяина и, таким образом, не активирует онкогены. Геном вируса функционирует отдельно от собственной ДНК клетки в виде эписомы, 3) большинство пациентов уже имели ранее контакт с ВПГ- инфекцией, 4) иммунная реакция на ВПГ обычно слабо выражена, 5) существуют эффективные препараты для лечения ВПГ- инфекции (в случае ее активации). К сожалению, результаты работы с этим вирусом еще не были представлены в мировой литературе, поэтому нам остается лишь терпеливо ждать. 58 РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ • помещение гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в вектор (плазмиды, вирусы: Герпес I типа, ВИЧ, аденовирусы) • введение вектора в неинсулинпролуцирующие клетки • трансплантация модифицированных вектором клеток, секретирующих инсулин Часть 3. Перспективы биотехнологии. Топологическая концепция создания биоискусственных органов на примере щитовидной железы В 2007 году Toni и соавт. [7] была представлена новая концепция создания биоинженерных эндокринных органов ex situ, сфокусированная на реализации человеческой биоискусственной щитовидной железы. Щитовидная железа была избрана, как наиболее удобный объект среди эндокринных органов для биоинженерного моделирования, а вовсе не с тем, чтобы поскорее обеспечить всех больных биоисскусственными органами, поскольку гормоны щитовидной железы доступны, недороги и эффективно применяются при недостаточности функции этого органа. Если в будущем представленные ими идеи удастся воплотить в жизнь и создать искусственный полноценный орган, то это будет, прежде всего, означать возможность реализации на практике данной концепции и в 59 дальнейшем даст возможность переключиться на более актуальные для биоинженерии объекты, как, например, поджелудочная железа. Концепция Toni и соавт. основана на теоретическом предположении, подтвержденном рядом экспериментальных данных, о том, что топологическая организация тиреоидной ткани, базирующаяся на взаимодействиях между клетками и межклеточным матриксом, остается постоянной вне зависимости от каких-либо физиологических или патофизиологических трансформаций. Авторы утверждают, что эластический стромально-сосудистый каркас (ССК) щитовидной железы формирует ее общую морфологию и функцию, т.е. геометрия ССК обеспечивает важнейшую эпигенетическую информацию, дающую направление пролиферации и дифференцировке тиреоцитов и клеток сосудов, так, что в итоге формируется зрелая полноценная щитовидная железа, иными словами утверждается, что «форма органа определяет, в конечном итоге, его функцию». Эта гипотеза в общем и в частности подтверждается множеством экспериментов, как на эмбрионах, так и в культуре клеток. К примеру, если поместить тиреоциты в коллагеновый гель, организованный в пространстве определенным образом, то клетки начнут формировать фолликулы – такие же, как и в самой железе; осуществить же такой процесс в монослое клеток невозможно. Если максимально упростить идею исследователей, то нужно создать биоискусственный ССК такой же 60 пространственной геометрии, как и в «натуральной щитовидной железе», заселить его предшественниками тиреоцитов, эндотелиоцитов, фибробластов и др. клетками, а уж последние, руководствуясь направляющими сигналами от ССК (через молекулы адгезии), будут размножаться, дифференцироваться и перемещаться в нужном направлении. Подобный подход уже успешно применялся для создания биоискусственных органов более простой структуры – например, мочевого пузыря. Речь идет о модели субтотальной цистэктомии у собак с последующей пересадкой биоискусственного мочевого пузыря, созданного путем заселения полимерного каркаса определенной формы эпителиальными и мышечными клетками [8]. Но вернемся к щитовидной железе. Как узнать эту самую геометрию ССК? Первоначальную необходимую информацию могут дать сосудистые слепки органа; можно также воспользоваться данными, полученными при цифровой послойной ангиотомографии высокого разрешения. Кроме того, разрабатываются технологии компьютерного (т.е. математического) моделирования геометрии ССК, основанного на предположении, что ветвление сосудов подчиняется фрактальным закономерностям (фрактал, согласно Б. Мандельброту из Научноисследовательского центра Т. Уотсона фирмы IВМ, состоит из геометрических фрагментов различного размера и ориентации, но аналогичных по форме. На каждом уровне масштаба структура 61 фрактала подобна (хотя и не обязательно идентична) структурам, наблюдаемым как в более крупных, так и в более мелких масштабах). Итак, все эти методы, по мнению авторов, могут снабдить нас необходимой информацией о пространственном устройстве ССК щитовидной железы. Вторым этапом создания биоискусственного органа является подбор материала, из которого и будет сконструирован ССК. В качестве биосовместимых материалов для ССК, из которых легко можно создать разветвленную трехмерную структуру заданной геометрии, которые метаболической имели деградации бы и заданную прочность, иммуногенность, скорость предложены к рассмотрению полиэфиры -гидроксикислот (уже применявшиеся в биоинженерии органов мочеполового тракта), эфиры гиалуроновой кислоты и т.д. Необходимо также «встроить» в полученный каркас молекулы коллагена I типа (лучше всего, аутологичного), которые как раз и будут давать сигналы растущим клеткам. Третий шаг – выделить и культивировать жизнеспособные пролиферирующие тиреоциты (а, точнее предшественники тиреоцитов) для последующего их заселения в стромальный каркас. Так же как и упомянутый выше коллаген, было бы идеально, если бы тиреоциты были аутологичными, т.е. взятыми из щитовидной железы будущего реципиента, в этом случае удалось бы избежать реакции иммунной системы на трансплантат. Так, например, хорошим источником тиреоидной 62 ткани могла бы служить контралатеральная доля тиреоэктомии поводу по щитовидной железы монолатерального после тотальной папиллярного рака (разумеется необходимо было бы проводить скрининг первичных культур тиреоцитов, чтобы вовремя выявить контаминацию раковыми клетками). Тиреоциты, как предполагается, целесообразно заселять не в одиночку, а в компании с эндотелиально-сосудистыми клеткамипредшественниками (предварительно культивированными в присутствие определенных ростовых факторов), поскольку в процессе регенерации ткани формирование in стромы (после vivo и подострого сосудов предшествует тиреоидита) формированию фолликулов. Следующим этапом стала бы оценка функциональной активности полученного органа различными методами, в т.ч. по определению тиреоидных гормонов в крови животных-реципентов, а также оценка жизнеспособности и активности тиреоцитов и организации сосудистого русла в железе спустя некоторое время после трансплантации. Эксперименты по созданию и пересадке биоискусственных органов мочеполовой сферы свидетельствуют о том, что плотная ткань объемом более 3 см3 при трансплантации подвергается риску некроза клеток, находящихся в ее сердцевине, таким образом, следует подбирать каркасный биоматериал с очень высокой пористостью. В этом случае ветвящаяся структура ССК представляется идеальной для 63 трансплантации и быстрого формирования анастомозов между сосудами самого органа и капиллярами окружающих тканей реципиента. Эксперименты по моделированию биоискусственной щитовидной железы идут полным ходом, и можно надеяться, что в недалеком будущем мы услышим о первых результатах с перспективой создания по тому же принципу таких органов, как печень, поджелудочная железа и даже мозг. РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ Биотехнология создания искуственной щитовидной железы • компьютерное моделированияе геометрии стромально-сосудистого каркаса щитовидной железы • конструкция стромально=сосудистого каркаса с использованием полиэфиров гидроксикислот, эфиров гиалуроновой кислоты, молекул коллагена I типа • выделение и культивирование жизнеспособных пролиферирующих тиреоцитов • заселение тиреоцитов в стромально-сосудистый каркас в компании с эндотелиальнососудистыми клетками-предшественниками (предварительно культивированными в присутствие определенных ростовых факторов) 64 Список литературы Использованная литература: 1. Recombinant DNA Technology in the Synthesis of Human Insulin. http://www.littletree.com.au/dna.htm 2. Calne R. Cell transplantation for diabetes. Phil Trans R Soc B 2005; 360: 1769–74. 3. Bretzel RG, Jahr H, Eckhard M, Martin I, Winter D, Brendel MD. Islet cell transplantation today. Langenbecks Arch Surg. 2007 May;392(3):239-53. 4. Schneider S, Feilen PJ, Brunnenmeier F, Minnemann T, Zimmermann H, Zimmermann U, Weber MM. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 2005 Mar;54(3):687-93. 5. Guillot PV, Cui W, Fisk NM, Polak DJ. Stem cell differentiation and expansion for clinical applications of tissue engineering. J Cell Mol Med. 2007 Sep-Oct;11(5):935-44. 6. D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG, Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2006 Nov;24(11):1392-401. 7. Toni R., Della Casa C., Spaletta G., Marchetti G., Mazzoni P., Bodria M. et al. The bioartificial thyroid: a biotechnological perspective in endocrine organ engineering for transplantation replacement. ACTA BIOMED 2007; 78; Suppl 1: 129-155 8. Koh CJ, Atala A. Tissue engineering, stem cells, and cloning: opportunities for regenerative medicine. J Am Soc Nephrol. 2004 May;15(5):1113-25. Рекомендуемая литература: 1. Патологическая физиология. Учебник под ред. В.В.Новицкого, Е.Д.Гольдберга, О.И.Уразовой. Москва, «Гэотар-медиа», 2009. 2. Николас А. Бун, Ник Р. Колледж, Брайан Р. Уолкер, Эндокринология. Издательство: Рид Элсивер (совместно с Издательской группой «ГЭОТАР-Медиа»), 2009 65 Рабочая тетрадь и руководство к методическому пособию Цели изучения После изучения данного методического пособия, обучающийся: 1. Получит представление о принципах синтеза инсулина и его рекомбинантных аналогов. См. стр. 5-30 и рис. 1-8 методического пособия. Современная терапия сахарного диабета основана на применении инсулина, полученного из клеток бактерий или дрожжей путем применения технологии рекомбинантной ДНК. Современные технологии подразумевают два подхода к синтезу инсулина – первый использовавший генно-инженерную технологию, работает на геноме человека, с помощью которого кишечные палочки синтезируют проинсулин, превращающийся в инсулин после ферментативного отщепления С-пептида. Второй применяет синтетически полученную ДНК для «мини-проинсулина» (проинсулина, в котором С-пептид короче, чем в проинсулине человека), которая затем вводится в геном клетки пекарских дрожжей. В дальнейшем из мини-проинсулина ферментативным способом выделяют инсулин. Аналогами инсулина называют белки, полученные путем модификации структуры молекулы нормального человеческого инсулина с измененными свойствами: с более быстрым началом и меньшей продолжительностью действия для препаратов короткого действия и более плоской кривой «время-эффект» и менее «изменчивой» биодоступностью для препаратов продленного действия. Контроль полученных знаний 1. Что такое полусинтетический инсулин? 2. Какова суть технологии рекомбинантной ДНК? 66 3. Какие технологии применяют современные производители рекомбинантного инсулина? 4. Какие бактериальные клетки используют для получения рекомбинантного инсулина? 5. Опишите подходы к получению гена инсулина, необходимого для рекомбинантного синтеза гормона. Какой из этих подходов применяется чаще? 6. Какие векторы применяются в процессе получения инсулина и как эти векторы конструируются? 7. Какова функция рестриктаз и ДНК-лигазы? 8. Опишите процесс селекции бактерий, вырабатывающих инсулин. 9. Какими преимуществами обладает технология получения инсулина из клеток дрожжей? 10.Опишите основные этапы биосинтеза инсулина в эукариотических клетках. 11.Какую функцию выполняет -фактор у дрожжей? 12.Что такое лидерная последовательность и какую роль она играет в процессе синтеза инсулина клетками дрожжей? Какие элементы включает в себя лидерная последовательность? Для чего необходим спейсерный участок? 13.Какие модификации применяют для синтетических лидерных последовательностей и с какой целью? 14.Опишите структуру нормального человеческого инсулина. 15.Чем была обусловлена необходимость создания рекомбинантных аналогов инсулина с модифицированной структурой? 16.Назовите и охарактеризуйте аналоги инсулина короткого действия. 17.Назовите и опишите свойства анлогов инсулина длительного действия. 67 18.Какими свойствами обладают ацилированные инсулины? 2. Получит представление о принципах синтеза рекомбинантного фоллитропина. См. стр. 31-36 и рис. 9 методического пособия. Для получения гонадотропинов, пригодных к использованию в терапии биотехнология использует метод получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с помощью технологии рекомбинантной ДНК, аналогичной таковой, описанной выше для инсулина. Гены, кодирующие - и -цепи молекулы ФСГ вводили в структуру векторных плазмид (содержащих также промотор, необходимый для запуска транскрипции гена), переносимых в клеткуреципиента. расширять Достижения круг биотехнологии создаваемых позволяют рекомбинантных постоянно гонадотропинов, применяемых для лечения бесплодия. Создаются аналоги ФСГ с более длительным периодом полужизни и большей продолжительностью действия. Такие препараты позволили бы избежать ежедневных инъекций фоллитропина для стимуляции овуляции. Контроль полученных знаний 1. Удобно ли получать рекомбинантный ФСГ, используя в качестве продуцентов бактериальные клетки? Обоснуйте ответ. 2. Какие клетки были выбраны в качестве продуцентов человеческих гонадотропинов и почему? 3. Какие препараты рекомбинантного фоллитропина вы знаете? 4. Назовите основные этапы производства рекомбинантного ФСГ. 68 5. Что представляет собой рекомбинантный аналог фоллитпропина КТП-ФСГ и каковы его свойства? 3. Получит представление рекомбинантного гормона о принципах роста. См. синтеза стр. 37-38 методического пособия. До разработки и внедрения технологии рекомбинантной ДНК гормон роста получали из гипофизарных желез, взятых от трупов. Рекомбинантный гормон роста, так же как и инсулин, синтезируется бактериями – непатогенными штаммами кишечной палочки. Принципы технологии получения рекомбинантного гормона роста, в целом, схожи с таковыми для инсулина, однако имеют свои особенности. Ген, кодирующий гормон, был получен путем обратной транскрипции матричной РНК, взятой из гипофиза, так что получался комплементарный ей фрагмент ДНК. Далее химическим путем синтезируют «адапторный» фрагмент ДНК, кодирующий последовательность первых 23 а/к гормона и содержащий, кроме того, кодон начала транскрипции – ATG. Оба фрагмента объединяют с образованием гибридного «синтетически-натурального» гена гормона роста. Контроль полученных знаний 1. Откуда получали гормон роста до разработки технологии рекомбинантной ДНК? 2. Опишите технологию получения рекомбинантного гормона роста. 4. Познакомится с принципами трансплантации тканей поджелудочной железы для лечения диабета. См. стр. 39-46 и рис. 10 методического пособия. 69 Для трансплантации полученные донорские островки Лангерганса (ОЛ) вводят в воротную вену реципиента через канюлю. ОЛ образуют микроэмболы в синусоидах печени, а через некоторое время в них прорастают капилляры и устанавливается нормальное кровоснабжение. Проблема, которая возникает при аллогенных трансплантациях – это решение вопроса, как можно избежать иммунного отторжения трансплантата. преодоления этой проблемы: 1) Существует два способа иммуносупрессия реципиента (иммунодепрессанты, которые, главным образом, и применяются на практике), 2) модификация клеток трансплантата с тем, чтобы снизить их иммуногенность. Второй подход, в свою очередь, включает в себя два подраздела: 1) изоляцию трансплантируемых клеток от иммунной системы путем окружения их полупроницаемой мембраной или оболочкой, 2) генетическая инженерия клеток, позволяющая снизить их иммуногенность. Контроль полученных знаний 1. Какие факторы не позволяют применять трансплантацию поджелудочной железы как рутинный метод лечения диабета? 2. Какими преимуществами обладает метод трансплантации островков Лангерганса по сравнению с трансплантацией цельной поджелудочной железы? Какие сложности и ограничения имеет эта методика? 3. Что такое Эдмонтонский протокол? Опишите этапы изоляции и трансплантации островков лангерганса в соответствии с данным протоколом. 4. Какую иммуносупрессию применяют после трансплантации ОЛ в соответсвтии с Эдмонтонским протоколом? 70 5. Какова суть разрабатываемых в последние годы стратегий избежания иммунного отторжения трансплантированных островков Лангерганса. 5. Познакомится с принципом терапии сахарного диабета стволовыми клетками. См. стр. 47-56 и рис. 11-14 методического пособия. Источником эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) служит внутренняя клеточная масса эмбрионов в стадии пре-имплантации. Затем их подвергают дифференцировке. Наиболее часто используемый метод дифференцирования ЭСК – инициация дифференцировки через формирование т.н. «эмбриоидного тела». Затем из этих эмбриоидных тел выделяют популяцию клеток, экспрессирующих маркер нестин. Затем, используя сложную пяти-стадийную технику культивирования, индуцируют клетки к формированию ОЛ-подобных структур, секретирующих инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы. Контроль полученных знаний 1. Как можно индуцировать дифференцировку ЭСК в инсулинпродуцирующие клетки? Что такое «эмбриоидные тела»? Существуют ли адгезивные культуральные системы для дифференцировки ЭСК в инсулинпродуцирующие клетки? 2. Какие факторы могут воспрепятствовать потенциальному терапевтическому применению ЭСК при сахарном диабете? 3. В чем заключается суть технологии переноса ядра соматической клетки в яйцеклетку? Какие преимущества дает данная технология? 4. В каких структурах ткани поджелудочной железы имеются клетки (стволовые, либо клетки-предшественники), способные превращаться в инсулин-продуцирующие? 71 5. Каковы свойства нестин-экспрессирующих мезенхимальных клеток островков Лангерганса? Что такое нестин? 6. В каких органах и тканях помимо поджелудочной железы имеются стволовые клетки, способные дифференцироваться в инсулин-продуцирующие? 7. Какие клетки костномозгового происхождения могут стать источником клеток, вырабатывающих инсулин? Каким образом этого можно добиться? 6. Познакомится с методом трансфекции (переноса) гена человеческого промотором инсулина в с глюкозочувствительным неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной их трансплантацией. См. стр. 56-59 методического пособия. Идея использовать для трансплантации собственные клетки больного с введенным в них геном инсулина кажется также весьма привлекательной, ибо позволяет избежать необходимости иммуносупрессии. Для того, чтобы ввести вектор с необходимыми генами в клетку возможно применение двух методов: использовать для этого вирусы или ввести в клетку плазмиду посредством электропоризации. Контроль полученных знаний Вопросы: 1. Какие существуют способы введения гена инсулина в неинсулинпродуцирующие клетки? 2. Какие вирусные векторы применялись для переноса гена инсулина? Какие факторы ограничили их применение? 3. В чем преимущества ВПГ I типа при использовании его в качестве вектора? 72 7. Познакомится с перспективами биотехнологии. Получит представление о топологической концепции создания биоискусственных органов на примере щитовидной железы. См. стр. 59-64 методического пособия. В 2007 году Toni и соавт. была представлена новая концепция создания биоинженерных эндокринных органов ex situ, сфокусированная на реализации человеческой биоискусственной щитовидной теоретическом железы. Концепция предположении, Toni и соавт. основана подтвержденном на рядом экспериментальных данных, о том, что топологическая организация тиреоидной ткани, базирующаяся на взаимодействиях между клетками и межклеточным матриксом, остается постоянной вне зависимости от каких-либо физиологических или патофизиологических трансформаций. Авторы утверждают, что эластический стромальнососудистый каркас (ССК) щитовидной железы формирует ее общую морфологию и функцию, т.е. геометрия ССК обеспечивает важнейшую эпигенетическую информацию, дающую направление пролиферации и дифференцировке тиреоцитов и клеток сосудов, так, что в итоге формируется зрелая полноценная щитовидная железа, иными словами утверждается, что «форма органа определяет, в конечном итоге, его функцию». Первоначальную необходимую информацию могут дать сосудистые слепки органа; можно также воспользоваться данными, полученными при цифровой послойной ангиотомографии высокого разрешения. Кроме того, разрабатываются технологии компьютерного (т.е. математического) моделирования геометрии ССК. Вторым этапом создания биоискусственного органа является подбор материала, из которого и будет сконструирован ССК. Предложены к рассмотрению полиэфиры -гидроксикислот , эфиры гиалуроновой кислоты и т.д. 73 Необходимо также «встроить» в полученный каркас молекулы коллагена I типа. Третий шаг – выделить и культивировать жизнеспособные пролиферирующие предшественники тиреоцитов для последующего их заселения в стромальный каркас. Контроль полученных знаний 1. Какая идея лежит в основе топологической концепции создания биоискусственных органов? 2. Какими способами можно получить информацию о строении стромально-сосудистого каркаса щитовидной железы? 3. Опишите основные этапы создания биоискусственной щитовидной железы в соответствии с вышеуказанной концепцией. 74 КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ Выберите правильный вариант ответа: 1. Какие бактериальные клетки используют для получения рекомбинантного инсулина? 1. Стафилококк золотистый 2. Бифидобактерии 3. Кишечная палочка 4. Нейсерия 5. Стрептококк 2. Какие клетки были выбраны в качестве продуцентов человеческих гонадотропинов ? 1. Гепатоциты 2. Клетки яичников китайского хомячка 3. Эпителиоциты нефрона пекинской утки 4. Фибробласты 5. Эритроциты 3. Откуда получали гормон роста до разработки технологии рекомбинантной ДНК? 1. Из гипофизарных желез, взятых у кролика 2. Из гипофизарных желез, взятых у собаки 3. Из донорской крови 4. Из гипофизарных желез, взятых от трупов 5. Из материала плаценты 4. В какой орган пересаживают аллогенный трансплантант островков Лангерганса ? 75 1. Большой сальник 2. Поджелудочная железа 3. Подкожная клетчатка 4. Селезенка 5. Печень 5. Как называют культуру стволовых клеток получаемую при воздействии факторов роста и отсутствии адгезии? 1. «Эмбриоидным телом» 2. «Эмбриональным телом» 3. «Стволовым телом» 4. «Неадгезивной культурой» 5. «Эмбриоидной кльтурой» 6. С помощью чего осуществляют трансфекцию гена инсулина? 1. Транспортного белка 2. Вектора 3. Переноса донорского ядра в клетку с последующим клонированием 4. Транслокации в хромосоме 5. Амплификации гена 7. Каким образом проинсулин превращается в инсулин? 1. После ферментативного присоединения С-пептида 2. После ферментативного отщепления А-пептида 3. После ферментативного отщепления С-пептида 4. После ферментативного присоединения А-пептида 5. После ферментативного отщепления А и С-пептидов 76 8. С помощью чего вставляют ген в плазмиду? 1. Рестриктаз и полимераз 2. ДНК-лигаз и полимераз 3. Рестриктаз и транскриптаз 4. Рестриктаз и ДНК-лигаз 5. ДНК-лигаз и транскриптаз 9. Как достигается в инсулинах «короткого действия» этот эффект? 1. Повышением димеризации молекулы 2. Изменением конформации активного центра 3. Снижением афинности к рецептору инсулина 4. Повышением гексамеризации молекулы 5. Снижением димеризации молекулы 10. К чему приводит ацилирование молекулы инсулина «длительного действия» ? 1. К понижению растворимости инсулина 2. К кристаллизации молекулы инсулина 3. К утрате способности связывания с альбумином 4. К приобретению способности связываться с альбуминами 5. К повышению растворимости инсулина 77 ОТВЕТЫ: 1–3 2–2 3–4 4–5 5–1 6–2 7–3 8–4 9–5 10 –4 78