Роль эндотелиального гликокаликса в рецепции стимулов
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Московский физико-технический институт (Государственный университет) Кафедра физики живых систем ФБМФ Российский кардиологический научно – производственный комплекс ВАЛИЕВ Ирек Альбертович «Роль эндотелиального гликокаликса в рецепции стимулов сердечно – сосудистой системы» квалификационная работа бакалавра Руководитель: д. б.н., проф. Мелькумянц А.М. Зав. кафедрой: д. м.н., проф. Хубутия М.Ш. Москва 2014 год Оглавление Введите название главы (уровень 1) ....................................................................................... 1 Введите название главы (уровень 2) ........................................................................................ 2 Введите название главы (уровень 3) .................................................................................... 3 Введите название главы (уровень 1) ....................................................................................... 4 Введите название главы (уровень 2) ........................................................................................ 5 Введите название главы (уровень 3) .................................................................................... 6 2 1.Список сокращений ЭГ - Эндотелиальный Гликокаликс АПФ – Ангиотензин Превращающий Фермент EDRF – Endothelium Derived Relaxing Factor NO – оксид азота АХ – ацетилхолин НА – норадреналин PBS – фосфатный буфер 2.Введение С начала 80-х годов прошлого века произошла смена представлений о физиологической роли эндотелия в регуляции кровообращения. Раньше полагали, что эндотелий – это монослой молекул, выстилающий просвет сосудов и выполняющий две функции: барьерную и антитромбогенную. Однако, в 1980 Фурчготт и Завадски показали (1) , что эндотелий играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса, выделяя в ответ на действие различных стимулов расслабляющее гладкие мышцы вещество, которое было ими названо "endothelium-derived relaxing factor" (EDRF). Впоследствии было показано, что этот производимый эндотелием вазодилататор представляет собой оксид азота (NO). роли эндотелия. (2,3) Эти работы дали начало интенсивному исследованию регуляторной Сейчас общепризнано, что эндотелий играет важнейшую роль в регуляции тонуса сосудов, и как следствие, их гидравлического сопротивления. Среди эндотелий-зависимых регуляций сопротивления сосудов важнейшее значение имеет способность эндотелия выделять EDRF в ответ на увеличение скорости кровотока. Вплоть до начала нового столетия полагали, что клетки эндотелия выделяют EDRF в ответ на действующее на них со стороны текущей крови напряжение сдвига, которое воспринимается эндотелиоцитами в виде сдвиговых деформаций их кортикального слоя. Однако, недавние исследования показали, что напряжение сдвига воспринимается, по-видимому, не самим кортикальным слоем эндотелиоцитов, а покрывающим мембрану эндотелия слоем мукополисахаридов, образующих эндотелиальный гликокаликс. Эта гипотеза возникла после того, как было показано, что при замене крови солевым плазмозамещающим раствором, не содержащим белка, дилататорная реакция исчезает 3 после 30 мин перфузии . Поскольку перфузия безбелковым раствором приводит к (4) повреждению гликокаликса, эти данные позволили сформулировать положение о том, что датчиком напряжения сдвига может служить слой макромолекул на люминальной поверхности эндотелиальных клеток - гликокаликс. 4 3.Обзор литературы 3.1.Эндотелий и его функции в организации кровотока Эндотелий — однослойный пласт плоских клеток мезенхимного происхождения, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов, сердечных полостей. По современным представлениям, эндотелий — не просто барьер или фильтр. Эндотелий — активный эндокринный орган, самый большой в теле, диффузно рассеянный по всем тканям. Эндотелий синтезирует субстанции, важные для контроля свертывания крови, регуляции тонуса и артериального давления, фильтрационной функции почек, сократительной активности сердца, метаболического обеспечения мозга. Контролирует диффузию воды, ионов, продуктов метаболизма. Реагирует на механическое воздействие текущей жидкости, кровяное давление и ответное напряжение, создаваемое мышечным слоем сосуда. Чувствителен к химическим и анатомическим повреждениям, которые могут приводить к повышенной агрегации и адгезии циркулирующих клеток, развитию тромбоза, оседанию липидных конгломератов. Тонус сосудов и, следовательно, их диаметр и гидравлическое сопротивление в большей мере определяется состоянием и функцией эндотелия. Многие виды сосудистых патологий вызваны дисфункцией именно эндотелия, а точнее, его вазомоторных функций. Для нас интересна регуляция эндотелием гидравлического сопротивления сосудов соответственно скорости кровотока в них. В конце 1970 – х годов Смешко, Хаютин и их коллеги показали, что магистральные артерии собак расширяются при увеличении в них кровотока и суживаются при его уменьшении(5). Вскоре после этого было показано, что имеет место непрерывное приспособление диаметра, а значит, и гидравлического сопротивления артерий к скорости кровотока (6,7,8), которое осуществляется только в сосудах с интактным эндотелием(9,10,11,12) и определяется способностью эндотелия расслаблять гладкие мышцы в ответ на увеличение механической силы – напряжения сдвига, действующей на них со стороны текущей крови(13,14,15). В итоге, с помощью данной мехагенной регуляции, во-первых, диаметр сосуда изменяется соответственно скорости кровотока в них, что способствует снабжению органов кровью; во-вторых, ослабляются констрикторные реакции, что препятствует спазму сосудов, в-третьих, обеспечивается острая стадия расширения коллатеральных сосудов при окклюзии магистральных артерий. 5 3.2.Сила, действующая на стенку сосудов Как было сказано выше, для артериальных сосудов характерно непрерывное изменение их гидравлического сопротивления в зависимости от скорости кровотока в просвете. Согласно закону Пуазейля гидравлическое сопротивление сосуда: где 𝜂 – вязкость крови, l - длина сосуда, r – его внутренний диаметр. Но какую величину должна воспринимать стенка сосудов, чтобы подстраивать свой диаметр в соответствии со скоростью кровотока? Анализируя различные физиологические данные, Родбард предположил, что клетки эндотелиоцитов, непосредственно контактирующие с кровью, измеряют силу вязкого трения – напряжение сдвига: где Q – объемный расход. Эта гипотеза была подтверждена в опытах, проводимых в нашей лаборатории, а также других исследователей. Например, было показано(14,15), что диаметр сосудов млекопитающих изменяется не только при изменении кровотока, но и при изменении вязкости раствора, перфузирующего артерию. Согласно формуле (2), изменение вязкости прямо пропорционально изменению силы напряжения сдвига 𝜏, т.е. стенка сосудов действительно измеряет скорость кровотока по величине напряжения сдвига. Более того, было показано, что при уменьшении деформируемости коркового (расположенного непосредственно под клеточной мембраной) слоя эндотелиоцитов, артерия утрачивает способность изменять свой диаметр при изменении скорости кровотока или вязкости перфузата. Однако, дилататорные реакции под действием фармакологических агентов, таких как АХ, опосредуемых эндотелием, остаются неизменными(16,17,18,19). Эти данные однозначно доказали гипотезу Родбарда. 3.3.Датчик напряжения сдвига 6 Таким образом, выстраивалась вполне логичная картина, показывающая, каков механизм восприятия изменений скорости кровотока. На клетки эндотелиоцитов со стороны вязкой крови действует сила вязкого трения, регистрируемая стенками как напряжение сдвига (2). Мембрана и корковый слой эндотелиоцитов, деформируясь под действием напряжения сдвига, стимулируют синтез в клетках эндотелия NO, который расслабляет гладкие мышцы сосудов и приводит к дилататорной реакции артерий (рис. 1). рис. 1. Схематическое представление механизма, обеспечивающего регуляцию сопротивления сосудов при изменениях скорости кровотока, без учета роли гликокаликса (39) Однако вскоре появились экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что данная схема может быть неполной. Дело в том, что при перфузии артерий не кровью, а плазмозамещающими растворами дилататорная реакция артерии исчезла(4,7). В этих опытах в качестве перфузата использовали раствор Кребса – Хенселейта, в который добавляли 6-10% декстрана с молекулярной массой 40-60 кДа для того, чтобы вязкость данного раствора была такой же, как и у крови. Оказалось, что после 30 мин перфузии магистральных артерий кошек вазомоторная функция сосуда полностью утрачивается. При этом, реакция сосудов на фармакологические агенты (АХ, НА), действующие непосредственно на эндотелий, сохраняются. С другой стороны, при добавлении в тот же самый раствор Кребса – Хенселейта 1-2% процентов бычьего сывороточного альбумина, 7 дилататорная реакция сосуда на повышение скорости кровотока сохранялась на протяжении длительного промежутка времени(7). Возник вопрос, почему для сохранения длительной дилататорной реакции сосудов в раствор перфузата необходимо добавление альбумина? Можно было предположить, что альбумин создает коллоидно – осмотическое давление, которое препятствует отёку клеток стенок. Но при этом декстран был использован в концентрации, необходимой для создания коллоидно – осмотического давления, примерно равного онкотическому давлению плазмы крови. Также неясно было, почему при отсутствии отклика сосуда на изменение кровотока реакция артерии на АХ остается неизменной. Напрашивалось предположение о том, что альбумин препятствует деградации какой – то механоцептивной структуры, за которую, возможно, ошибочно принимался за корковый слой эндотелиоцитов. Здесь полезно вспомнить о работе, сделанной Hamelin & Schneeberger, в которой было показано, что при замене крови фторуглеродной эмульсией, не содержащей белка, у крыс наблюдается нарушение проницаемости легочных сосудов(20). Известно, что нарушение проницаемости сосудов связано в первую очередь с повреждением гликокаликса(21). Эти данные, а также мысль о том, что ЭГ является структурой, непосредственно контактирующей с кровью, наводили на мысль о возможном участии ЭГ в рецепции механогенных стимулов. 3.4. Эндотелиальный гликокаликс: структура, толщина Как было сказано выше, ЭГ – это слой макромолекул, обращенных в просвет сосуда. Этот слой состоит из множества связанных с мембраной молекул, таких как гликопротеины и протеогликаны, являющихся основой для взаимодействия между плазмой и эндотелиоцитами. О структуре ЭГ, довольно хорошо описанного in vitro, очень мало информации in vivo. Причиной для этого может служить моментальная самосборка и – разборка ЭГ при внешних воздействиях, а также ферментативная деградация и сброс его элементов под действием напряжения сдвига . Основную часть элементов ЭГ составляют мукополисахариды (глюкозаминогликаны), которые ковалентно соединены с каркасными белками эндотелиальной мембраны, образуя протеогликаны (синдеканы и глипиканы). Глюкозаминогликаны также присоединяются к другим белковым структурам ЭГ, гликопротеинам. Протеогликаны, представляющие собой длинноцепочечные белковые молекулы, длина которых более 1 мкм, являются основой ЭГ. Стержнем протеогликанов 8 служит обычно длинный филамент гиалуронана (гиалуроновой кислоты), к которому с помощью контактных белков крепятся внутренние (ядерные) белки. Присоединенные к ним гликозаминогликаны представляют собой, как правило, цепочки гепарансульфата или (значительно реже) хондроитинсульфата. Терминальными молекулами гликозаминогликанов являются сиаловые кислоты, создающие отрицательный поверхностный заряд ЭГ. Протеогликаны, наряду с некоторыми гликопротеинами, формируют пространственную структуру гликокаликса и обеспечивают его связь с внутриклеточными структурами эндотелиоцитов. Не вдаваясь в дальнейшие подробности, заметим, что протеогликаны и гликопротеины образуют квазипериодическую трехмерную сеть, волокнами которой являются длинные (длиной около нескольких мкм) коровые белки протеогликанов, имеющие диаметр порядка 10-12 нм и удаленные друг от друга примерно на 20 нм(22). Эти коровые белки соединяются с волокнами актина, расположенными непосредственно в корковом слое эндотелиоцитов. Используя данные о структуре ЭГ, Вейнбаум и его коллеги построили математическую модель, показывающую как ЭГ взаимодействует с внутриклеточным актиновым цитоскелетом, вызывая деформацию актиновых волокон(23). Здесь важно, что, согласно оценкам авторов(24), изгибной жесткости коровых белков достаточно для передачи возникших в них деформаций под действием напряжения сдвига на актиновые волокна эндотелиоцитов. Было упомянуто, что ЭГ является структурой, которая может легко собираться и разбираться под действием внешних факторов. Например, показано(25,26), что коровые белки легко разрушаются под действием гиалуронидазы и гепариназы, которые срезают с протеогликанов гиалуронан и гепарансульфат соответственно. Ганс Винк и его коллеги, установили, что введение в кровь окисленных липопротеидов низкой плотности приводит к 60-ти процентному уменьшению толщины гликокаликса микрососудов кремастерной мышцы хомяков, что сопровождается повышенной адгезией тромбоцитов на эндотелии(27). Причем это изменение толщины было изменчиво: оно достигает максимума спустя 25 мин после инъекции липопротеидов низкой плотности и исчезает после 25 мин перфузии. Интересны также данные о толщине слоя ЭГ. Согласно последним исследованиям(28), толщина данного слоя составляет несколько мкм. Причем толщина данного слоя зависит от величины напряжения сдвига. Наиболее наглядно это было продемонстрировано в работах Вульфа(29) и Ванга(30) , показавших, что чем выше величина напряжения сдвига, действующая на стенку сосуда, тем толще гликокаликс. Именно c истонченной структурой гликокаликса связывают многие патофизиологические процессы в организме, например такие, как отек легких(21) и развитие атеросклероза(31-33). 9 Таким образом, ЭГ – это обильная, легко повреждаемая трехмерная структура, толщина которой зависит от состава жидкости (крови), с которой ЭГ непосредственно взаимодействует. При этом все повреждения ЭГ, как правило, обратимы. Ведь гликокаликс – это внеклеточный матрикс, постоянно синтезируемый клетками эндотелиоцитов(31), и его состояние определяется балансом сил, приводящих к деградации или синтезу его структуры. 3.5. Эндотелиальный гликокаликс - датчик напряжения сдвига Все вышеперечисленные экспериментальные факты наводят на мысль об участии ЭГ в механорецепции, т.е. именно он обеспечивает восприятие механического стимула, действующего на стенку со стороны текущей крови, что приводит, в конечном счете, к расслаблению гладких мышц сосудов. В связи с этим, схема, приведенная в рис.1, нуждается в изменениях. Скорость течения воспринимается не непосредственно корковым слоем эндотелиоцитов, а гликокаликсом (рис.2), деформация которого передается на актиновые волокна коркового слоя, деформируя эти структуры клетки. Эта деформация приводит к синтезу эндотелиоцитами оксида азота, расслабляющего гладкие мышцы, что обеспечивает дилататорную реакцию сосудов. 10 Рис.2. Схематическое представление механизма, обеспечивающего регуляцию сопротивления сосудов при изменения скорости кровотока, с учетом возможной роли гликокаликса(39) Данное предположение было сделано на основе математической модели взаимодействия ЭГ и коркового слоя эндотелиоцитов(34,35,23,24). Естественно, эта гипотеза нуждалась в проверке. На данный момент накоплено достаточно много экспериментальных данных, указывающих на то, что ЭГ может быть датчиком напряжения сдвига. Во – первых, в работе Флориана и его коллег(36) ферментативно удаляли с протеогликанов гепарансульфат и следили за продукцией NO в двух случаях – в статичных условиях и подвергая клетки значительному (20 дин/см2) напряжению сдвига. В результате было получено, что в клетки, подвергающиеся действию гепариназы, полностью утрачивают способность производить EDRF в ответ на механостимулы. При этом клетки эндотелия могли производить NO в ответ на добавление в перфузат брадикинина. Во – вторых, более полно данный вопрос был изучен в работе Пахакиса и его коллег(37). В эксперименте с поверхностного слоя культуры эндотелиальных клеток ферментативно удаляли все основные структуры ЭГ – гепарансульфат, гиалуронан, хондроитинсульфат и сиаловую кислоту. Далее, путем сравнения с нативными эндотелиальными клетками, их подвергали их различным напряжениям сдвига и смотрели как меняется синтез NO и простациклина, который также является дилататорным фактором(38). Выяснилось, что 11 инкубация в течение 2 часов клеток эндотелия бычьей грудной аорты в растворах, содержащих 15 мЕд/мл гепариназы или нейроминидазы, вызывающая разрушение примерно 40% гепарансульфата или сиаловой кислоты, соответственно, приводит примерно к двукратному уменьшению продукции этими клетками NO в ответ на действие на них напряжения сдвига, среднее значение которого составляло 14 дин/см2. Гиалуронидаза, использовавшаяся в концентрации 1,5 Ед/мл вызывала удаление из ЭГ примерно 60% гиалуронана, что сопровождалось уменьшением продукции NO примерно в 2,5 раза. В то же время разрушение порядка 44% хондроитинсульфата хондроитиназой не сопровождалось значимым уменьшением продукции оксида азота в ответ на повышение напряжения сдвига. Ни один из этих ферментов не влиял на продукцию оксида азота, вызываемую гистамином или брадикинином, и не влиял на степень увеличения производства клетками простациклина, концентрация которого значительно повышалась при увеличении действующего на эндотелиоциты напряжения сдвига как до, так и после разрушения структур ЭГ. Основываясь на этих экспериментальных данных, можно сделать вывод о том, что в настоящий момент есть достаточно оснований утверждать, что ЭГ участвует в эндотелий зависимых реакций артерий, происходящих при изменениях кровотока. 4.Материалы и методы 4.1. Связь напряжения сдвига, АПФ и гликокаликса Для дальнейшего выяснения роли ЭГ в рецепции механических стимулов нужно вспомнить, что такое ренин – ангиотензиновая система. Ренин – это фермент, который вырабатывается в юкстагломерулярных нефронах почек при недостаточности почечного кровотока. Высвобождаясь в кровь, этот фермент превращает ангиотензиноген, хранящийся в печени, в ангиотензин-I. Под действием постоянно образующегося в клетках эндотелия ангиотензин превращающего фермента (АПФ), ангиотензин–I переходит в ангиотензин–II. вазоконстриктор, вызывающий Это вещество развитие представляет сосудистых собой спазмов и сильнейший ускоряющий атеросклеротические изменения в сосудистой системе. Интересно заметить, что активность АПФ наиболее высока в эндотелиоцитах микроциркуляторного русла легких, а например, в микрососудах почек АПФ совершенно не экспрессируется. 12 Рис.3. Схематическое представление ренин – ангиотензиновой системы в организме(41) Достаточно вспомнить, что для сосудов легких характерны относительно большие величины напряжения сдвига при очень невысоких величинах трансмурального давления. Эти условия вполне способны приводить к истончению гликокаликса, что делает понятным предположение о том, что гликокаликс может быть посредником между изменением напряжения сдвига и синтезом АПФ в клетке. Например, было показано (40,42), что увеличение напряжения сдвига, действующего на культивированные клетки эндотелия, способствует понижении. экспрессии в этих клетках АПФ. Однако, есть и другие работы(43,44,45), в которых получены прямо противоположные результаты: артериальные уровни напряжения сдвига ослабляют активность АПФ промотора и уменьшают экспрессию АПФ микроРНК в эндотелиальных клетках. Как величина напряжения сдвига регулирует синтез/активность АПФ? Для проверки участия гликокаликса в данном процессе в нашей лаборатории была сконструирована и собрана так называемая сдвиговая камера, позволяющая подвергать эндотелиальные клетки различным величинам 𝜏. 4.2. Величина напряжения сдвига в сдвиговой камере Получим выражение для силы, действующей со стороны перфузата на эндотелиальные клетки в сдвиговой камере (рис.5). 13 Рассмотрим движение вязкой жидкости в просвете между двумя параллельными пластинами. Введем начало отсчета в точке О. Обозначим длину пластины L, а ее ширину l. Расстояние от начала отсчета до пластин равно (рис.4). Так как в кровь можно Рис.4. К выводу напряжения сдвига для сдвиговой камеры считать Ньютоновской жидкостью, запишем силу напряжения сдвига: Напишем баланс сил, обусловленных вязким трением и разностью далений ΔP: Производя интегрирование последнего выражения, получим профиль скоростей в камере: где h – расстояние между пластинами. Теперь найдем величину потока в просвете между пластинами. Интегрируя выражение: находим Теперь, комбинируя формулы (3) и (4) получим выражение для напряжения сдвига, выраженное через поток Q, коэффициент вязкости 𝜂, ширину стекла l и высоту зазора h: 4.3. Сдвиговая камера 14 В нашей работе мы пытались объяснить увеличение напряжения сдвига и повышенную экспрессию АПФ с помощью изменения структуры ЭГ. Для данных целей были собраны специальные сдвиговые камеры, в которых можно регулировать величину напряжения сдвига, изменяя его от очень низких (менее 1 дин/см2) до аномально высоких (60-80 дин/см2) значений (рис.5). Рис. 5. Сдвиговая камера Предметное стекло с культурой эндотелиальных клеток пупочной вены человека помещается в сдвиговую камеру, позволяющую пропускать над клетками эндотелия перфузат, подаваемый через входную трубку с помощью перистальтического насоса. Как было показано выше, со стороны перфузата на клетки эндотелия действует напряжение сдвига, численно равное: (5), где l – ширина предметного стекла. Высота зазора h регулируется в интервале 100-400 мкм, что соответствует напряжению сдвига на клетках 20-60 дин/см2. Выставляя разные величины h1 и h2 можно подвергать две культуры клеток различным напряжениям сдвига. Таким образом, изменяя высоту зазора, мы перфузировали культуру клеток эндотелия непульсирующим потоком при высоком и низком напряжениях сдвига. 4.4. Проведение эксперимента 15 Клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC – human umbilical vein endothelial cells) культивировали в лаборатории клеточной адгезии РКНПК в среде DMEM (Dulbecco modified Eagle medium), в которую добавляли 10% инактивированной бычьей фетальной сыворотки. Культивировали на предметных стеклах размером 25х14 мм, толщиной 0,8 мм, помещенных в чашку Петри, диаметром 100 мм. Данная культура инкубировалась при температуре 37 оС в течении в атмосфере, содержащей 5% СО2 в течение 7 дней. Для повреждения ЭГ данную культуру дополнительно инкубировали в течение 2 часов в растворе гепариназы III (200 мЕд./мл), нейраминидазы (150 мЕд/мл) или гиалуронидазы (1.5 Ед/мл). Далее, предметное стекло с культурой клеток помещали в сдвиговую камеру, которую соединяли трубками с перистальтическим насосом и устанавливали поток 6-10 мл/мин. При этом манометр, расположенный на входе в сдвиговою камеру, указывал на величину разности давления 6-30 мм рт.ст. В наших опытах клетки подвергались двум различным величинам напряжения сдвига, от низких, практически нулевых значений, до приблизительно 20 дин/см2. Клетки подвергались данным воздействиям в течение 4-6 часов, после чего проводился лизис для промера активности АПФ. Методика лизиса состояла в следующем. Перекладывали предметное стекло с клетками в чашку Петри и наливали туда PBS – физраствор с фосфатным буфером, покачивали чашку и аккуратно сливали жидкость. Затем добавляли 1 мл PBS – физраствора с 1% Tritona X-100 – детергента, чтобы растворить мембраны эндотелиальных клеток. Соскребали клетки с предметного стекла в раствор 1% Tritona X100. После 10 минут инкубации пипетировали суспензию клеток и переносили полученную массу эппендорф и ставили в холодильник на +4 оС. После нескольких дней инкубации в данных пробирках активность АПФ мерили на кафедре химической энзимологии МГУ (О.А.Кост и коллеги). 5.Результаты и обсуждение 5.1.Результаты После измерения активности АПФ в суспензированных эндотелиальных клетках были получены следующие результаты. В клетках, подвергавшихся низким величинам напряжения сдвига с интактным гликокаликсом, или можно считать, находившихся в статических условиях активность АПФ была принята за 100 единиц. При этом в клетках, подвергающихся напряжениям сдвига порядка 20 Дин/см2 активность АПФ была снижена на 24 единицы. 16 Напротив, в клетках с поврежденной структурой ЭГ не наблюдалось никакой зависимости активности АПФ от величин напряжения сдвига, прикладываемых к клеткам. Т.е. в обеих культурах клеток активность АПФ была одинаковой и равнялась 100 единицам, такой же как и для клеток с интактным гликокаликсом в статических условиях. Полученные данные проиллюстрированы в рис. 6: Рис.6. Гистограмма активности АПФ в зависимости от условий проведения эксперимента 5.2.Обсуждение Полученные результаты, вообще говоря, находятся в согласии с экспериментальными данными, полученными в работах И.Флеминг и ее коллег(40). В этой работе также было показано, что повышенное напряжение сдвига ингибирует синтез АПФ. Однако полученные результаты исследователи объясняли активностью АМФ – активируемой протеинкиназы с помощью субстрата p53. В наших же опытах было показано, что данный механизм может быть связан со структурой ЭГ и его способностью выполнять функцию механочувствительного элемента эндотелиальной клетки. Это было показано путем ферментативного разрушения структуры ЭГ. Однако, наши данные свидетельствуют о кратковременных перестройках в 17 клеточных механизмах, так как опыты проводились в течение 4-х часов. Для подтверждения нашей гипотезы об участии ЭГ в рецепции механостимулов необходимо проведение более длительных экспериментов, когда клетки будут под воздействием различных напряжений сдвига в течение суток и более. Также, для более полного рассмотрения данного вопроса необходимо провести опыты, в которых будет измеряться концентрация NO в оттекающем из сдвиговой камеры перфузате при воздействии на клетки увеличенным напряжением сдвига. И, наконец, чтобы показать, что сходные механизмы, наблюдаемые в экспериментах, протекают in vivo необходимо проведение аналогичных опытов на перфузируемом кровеносном сосуде. 6.Выводы Таким образом, анализ полученных экспериментальных данных позволяет сформулировать следующие выводы: эндотелиальный гликокаликс может являться датчиком напряжения сдвига, действующего на сосудистую стенку со стороны текущей в сосуде крови. Поскольку долговременное увеличение напряжения сдвига на сосудистой стенке воспринимается клетками эндотелия именно в виде деформаций гликокаликса, а активность АПФ при увеличении напряжения сдвига уменьшается, можно заключить, что эндотелиальный гликокаликс является связующим звеном в цепочке "увеличение кровотока – уменьшение активности АПФ". 7.Благодарности Приношу глубокую благодарность моему руководителю профессору Артуру Марковичу Мелькумянцу за предоставление интересной темы для дипломной работы, проявленный интерес и поддержку. Сергею Александровичу Балашову за помощь в освоении новых методов, поддержку и терпение. Также приношу благодарность всем работникам Лаборатории Экспериментальной Кардиологии Сердца за дружескую помощь и поддержку. 18 8.Список литературы 1. Furchgott R.F., Zawadski J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 373-376, 1980 2. Furchgott R.F., Cherry P.D., Zawadski J.V., Jothianandan D. Endothelial cells as mediators of vasodilation of arteries. J.Cardiovasc. Pharmacol. 6: S336-S343,1984 3. Moncada S., Radomski M.W., Palmer R.M.J. Endothelium-derived relaxing factor. Identification as a nitric oxide and role in the control of vascular tone and platelet function. Biochem. Pharm. 37 (13): 2495-2501, 1988 4. Мелькумянц А.М., Балашов С.А. Механочувствительность артериального эндотелия. М.:Триада, 2005 5. Смиешко В., Хаютин В.М., Герова М. и др. Чувствительность малой артерии мышечного типа к скорости кровотока: реакция самоприспособления просвета артерий. Физиол. журнал СССР. 1979. Т.65. С.291-298 6. Khayutin V.M., Melkumyants A.M., Rogoza A.N. et al. Flow – induced control of arterial lumen. Acta Physiol. Hung. 1986. V. 68. P.241-251 7. Melkumyants A.M., Balashov S.A., Veselova E.S., Khayutin V.M. Continious control of the lumen of feline conduit arteries by flood flow rate. Cardiovasc. Res. 1987. V.21.P.863-870 8. Melkumyants A.M., Balashov S.A., Khayutin V.M. Control of arterial lumen by shear stress on endothelium. News Physiol. Sci. 1995. V.10.P.204-210 9. Holtz J., Busse R., Geisler M. Flow – dependent dilation of canine epicardial coronary arteries in vivo and in vitro: mediated by endothelium. N-S Arch. Pharmacol. 1983. V.322. P.R44 10. Pohl U., Holtz J., Busse R., Bassenge E. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 1986.V.8.P.37-44 11. Smiesko V., Kozik J., Dolezel S. The control of arterial diameter by flood flow velocity is dependent upon intact endothelium. Physiol. Bohemoslov. 1983.V.32.P.558 12. Smiesko V., Kozik J., Dolezel S.Role of endothelium in the control of arterial diameter by blood flow. Blood vessels. 1985. V.22. P.247-251 13. Мелькумянц А.М., Балашов С.А. Вязкость крови – фактор регуляции тонуса артерий. Медицинская биомеханика. Рига, 1986. Т.2. С. 72-77 14. Melkumyants A.M., Balashov S.A. Effect of blood viscosity on arterial flow induced dilator response. Cardiovasc. Res. 1990.V.24.P.165-168 15. Melkumyants A.M., Balashov S.A., Khayutin V.M. Endothelium – dependent control of arterial diameter by flood viscosity. Cardiovasc. Res. 1989. V.23.P.741-747 16. Мелькумянц А.М., Балашов С.А., Смиешко В., Хаютин В.М. Избирательное подавление чувствительности артерий к скорости кровотока глутаровым альдегидом. Бюллю эксперим. биологии и медицины. 1986. Т.102.С.568-570 17. Мелькумянц А.М., Балашов С.А. Роль деформируемости эндотелиальных клеток в реакциях артерий на изменения напряжения сдвига. Рос. физиол. журн. им. Сеченова. 1999. Т.85.С.910-917 19 18. Melkumyants A.M., Balashov S.A. Control of the arterial lumen by shear stress: role of endothelium deformability. Physiol. Bohemoslov. 1987.V.36.P.571 19. Melkumyants A.M., Balashov S.A. Role of endothelial cells deformability in control of arterial diameter by shear stress. J.Vasc.Res.2001.V.38(s.1).P.18 20. Schneeberger E.E., Hamelin M. Interaction of serum proteins with lung endothelial glycocalix: its effect on endothelial permeability. Am. J. Physiol. 1984. V.247.P.H206-H217 21. Collins S.R., Blank R.S., Deatherage L.S. The endothelial glycocalyx: emerging concepts in pulmonary edema and acute lung injury. Anesth. Analg. 2013.V.117.P.664-674 22. Weinbaum S., Tarbell J.M., Damiano E.R. The structure and function of the endothelial glycocalyx layer. Annu. Rev. Biomed. Eng.2007. V.9.P.121-167 23. Thi M.M., Tarbell J.M., Weinbaum S., Spray D.C. The role of the glycocalyx in reorganization of the actin cytoskeleton under fluid shear stress: a “bumper - car” model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101. P.16483-16488 24. Weinbaum S., Zhang X., Han Y. et al. Mechanotransduction and flow across the endothelial glycocalyx layer. Proc. NAtl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. P.7988-7995 25. Henry C.B., Duling B.R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan. Am. j. Physiol. 1999. V.277.P.H508-H514 26. Vogel J., Sperandio M., Pries A.R. et al. Influence of the endothelial glycocalyx on cerebral blood flow in mice. J.Cerebral blood flow & metabolism. 2000. V.20.P.1571-1578 27. Vink H,, Constantinescu A.A., Spaan J.A.E. Oxidized lipoproteins degrade the endothelial surface layer. Implications for platelet-endothelial cell adhesion, Circulat. 2000.V.101.P.1500-1502 28. Eno E. Ebong, Frank P. Macaluso, David C. Spray and John M. Tarbell. Imaging the Endotelial Glycocalyx In Vitro by Rapid Freezing/Freeze Substitution Transmission Electron Microscopy. Arteriosc, Thrombosis and Vasc. Biol. 2011. P.1908-1915 29. Woolf N. The arterial endothelium. Pathology of atherosclerosis.1982.P.25-42 30. Wang S., Okano M., Yoshida Y. Ultrastructure of endothelial cells and lipid deposition on the flow dividers of brachiocephalic and left subclavian arterial bifurcations of the rabbit aorta.J.Japan.Atheroscler.Soc.1991.V.19.P.1089-1100 31. Andrew Koo, C. Forbes Dewey et al. Hemodynamic shear stress characteristic of atherosclerosis – resistant regions promotes glycocalyx formation in cultured endothelial cells. Am. J. Physiol. 2012. C.137-146 32. van den Berg B.M., Spaan J.A., Rolf T.M., Vink H. Atherogenetic region and diet diminish glycocalyx dimension and increase intima-to-media rations at murine carotid artery bifurcation. Am. J. Physiol.2006.P.H915-H920 33. Nieuwdorp M., Meuwese M.C., Vink H., Hoekstra J.B., Kastelein L.L., Stoes E.S. The endothelial glycocalyx: a potential barrier between health and vascular disease. Curr. Opin. Lipidol. 2005. V.16 P. 507511 34. Barakat A.I. A model for shear stress – induced deformation of a flow sensor on the surface of vascular endothelial cells. J. Ther. Biol. 2001. V.210. P.221-236 35. Damiano E.R., Stace T.M. A mechano-electrochemical model of radial deformation of the capillary glycocalyx. Biophys. J. 2002. V.82. P.1153-1157 36. Florian J.A., Kosky J.A., Ainslie K. et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circulat. Res. 2003. V. 93. P. 136-142 20 37. Pahakis M.Y., Kosky J.R., Tarbell J.M. The role of endothelial glycocalyx components in mechanotransduction of fluid shear stress. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V.355(1). P. 37-44 38. Koller A., Kaley G. Prostaglandins mediate arteriolar dilation to increased blood flow velocity in skeletal muscle microcirculation. Circulat. Res. 1990. V. 67. P.529-534 39. Мелькумянц А.М. О роли эндотелиального гликокаликса в мехагенной регуляции сопротивления артериальных сосудов. Успехи физиол. наук. 2012. Т.43. С.45-48 40. Kohlstedt K., Fleming I., Caroline Trouvain et al. AMP – Activated Kinase regulates endothelial cell ACE expression via p53 and the post – transcriptional regulation of microRNA-143/145. Circ. Res.2013.P. 11501158 41. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека. М:Мир.Т.1.2005 42. Gosgnach W. Challah M, Coulet F, Michel JB, Battle T. Shear stress induces angiotensin converting enzyme expression in cultured smooth muscle cells. Cardiovasc Res.2000.V.45.P.486-492 43. Reider M.J., Carmona R., Kreiger J.E et al. Supression of ACE expression and activity by shear stress. Circ. Res.1997.V.45.P.312-319 44. Miyakawa A.A., de Lourdes Junquiera M., Kreiger J.E. Identification of two novel shear stress responsive elements in rat ACE I promoter. Physiol Genomics.2004. V.17.P.107-113 45. Dekker R.J., van Thienen J.V., Rohlena J. et al.Endothelial KLF2 links local arterial shear stress level to the expression of vascular tone – regulating genes. Am. J. Pathol. 2005. V.167. P.609-618 21