ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.
advertisement
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) является важнейшей сельскохозяйственной культурой и одним из наиболее значимых объектов исследований в области генетики, цитогенетики, молекулярной генетики и филогенетики растений. Данный вид имеет аллогексаплоидный геном (2n = 6x = 42, ВВAADD), в образовании которого участвовали диплоидные виды T. urartu (AA), Aegilops speltoides (SS) и Ae. tauschii (DD). Копии одного и того же гена в геномах А, В и D называют гомеологичными генами. Выявление гомеологичных генов и исследование, направленное на понимание того, как согласуется работа гомеологичных генов при формировании признаков мягкой пшеницы, каковы структурно-функциональные отличия между гомеологичными копиями, представляет интерес как с эволюционной, так и с генетико-селекционной точки зрения. Система генов, участвующих в формировании признаков окраски, может представлять собой удобную модель для сравнительного изучения гомеологичных генов мягкой пшеницы. Во-первых, признаки окраски являются качественными признаками. Различные аллели в локусах, определяющих окраску, дают легко различимые фенотипы (именно с этим связано широкое использование признаков окраски для таксономического определения и для идентификации сортов пшеницы; Якубцинер и Савицкий, 1947). Во-вторых, путь биосинтеза флавоноидных пигментов, обеспечивающих окраску органов, является универсальным для растений, а генетические основы биосинтеза флавоноидов хорошо изучены у диплоидных злаков (кукуруза и ячмень) (Mol et al., 1988; Jende-Strid, 1993; Сhopra et al., 2008). Таким образом, существует основа для выделения генов биосинтеза флавоноидов пшеницы при использовании подходов сравнительной геномики и сравнительной генетики (Laurie and Devos, 2002). Система генов, участвующих в биосинтезе флавоноидных пигментов у пшеницы, представляет интерес не только как удобная генетическая модель, но и в связи с адаптивным значением некоторых признаков окраски. Например, наличие красной окраски колоса связывают с жизнеспособностью пшеницы в районах с холодным климатом (Darwin, 1883; Синская, 1925; Мартынов и Добротворская, 1997). Красная окраска зерна предупреждает преждевременное прорастание семян (Miyamoto et al., 1961; Freed et al., 1976). Интенсивная антоциановая окраска колеоптиле, стебля и 1 пыльников связана с устойчивостью к твердой и пыльной головне (Богданова с соавт., 2002). Кроме того, антоцианы участвуют в противодействии различным видам абиотического стресса (Chalker-Scott, 1999; Ryan et al., 2002; Gould, 2004). До настоящей работы были выявлены гены, определяющие фенотип по некоторым признакам окраски мягкой пшеницы (McIntosh et al., 2008), о структурной организации и функциональной роли которых ничего не было известно. Также из генома пшеницы были выделены структурные гены, кодирующие некоторые ферменты биосинтеза флавоноидных пигментов (Li et al., 1999; Himi and Noda, 2004; Himi et al., 2006). Однако в целом взаимосвязь между этими двумя группами генов оставалась невыясненной. Неизвестно было, могут ли гены, определяющие фенотип, непосредственно кодировать ферменты биосинтеза флавоноидных пигментов (как это бывает у диплоидных видов; Dooner et al., 1991) или они являются у пшеницы регуляторными по отношению к структурным генам? Кроме того, большинство генов, участвующих в формировании окраски у пшеницы, до сих пор не были картированы, а применение у аллополиплоидной пшеницы стандартных методик, разработанных для картирования структурных генов в диплоидных геномах, было затруднено. Для многих структурных генов биосинтеза флавоноидов пшеницы не были выделены нуклеотидные последовательности гомологичных копий. Также, большинство известных генов, определяющих окраску, были до настоящей работы выявлены только в одном или двух из трех диплоидных геномов, входящих в состав генома аллополиплоидной пшеницы (McIntosh et al., 2008). Связано ли это с редкой встречаемостью генотипов, несущих функциональные аллели в отдельных гомеологичных локусах, или с утратой данных копий ввиду структурных изменений генома после аллополиплоидизации, оставалось неизвестным. Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в установлении геномной локализации и исследовании структурно-функциональных особенностей генов биосинтеза флавоноидных пигментов мягкой пшеницы и ее сородичей. В работе были поставлены следующие задачи: провести генетическое картирование генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски (окраска колеоптиле, пыльников, стебля, листа, колосковых чешуй и перикарпа зерна); 2 изучить распространение данных генов в коллекциях сортов с оценкой динамики частот аллелей у современных сортов по сравнению со стародавними; выяснить функциональную роль генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, в биосинтезе флавоноидных пигментов; выделить последовательности структурных генов, кодирующих отдельные ферменты, участвующие в биосинтезе флавоноидных пигментов, и дать сравнительную характеристику гомеологичных структурных генов мягкой пшеницы и ее сородичей; картировать выделенные структурные гены биосинтеза флавоноидов пшеницы и ржи; охарактеризовать особенности экспрессии гомеологичных генов злаков различного происхождения в геноме аллополиплоидной пшеницы. Научная новизна работы. В настоящей работе получен ряд новых приоритетных результатов. Данная работа является первым комплексным исследованием молекулярно-генетических механизмов формирования признаков окраски у пшеницы с применением методов классической генетики, молекулярной генетики и геномики. Впервые изучена функциональная роль генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, и показано их участие в регуляции транскрипции структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов. Более двадцати генов пшеницы и ее сородичей картированы впервые, а полученные результаты вошли в международный каталог генных символов пшеницы и международный каталог генов и маркеров ржи. Впервые проведено сравнительное картирование генов, участвующих в формировании признаков окраски, локализованных в гомеологичных геномах злаков. Установлено, что и регуляторные, и структурные гены биосинтеза флавоноидных пигментов представлены в геноме пшеницы в виде гомеологичных копий. Показано, что гомеологичные копии структурных локусов характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов. Впервые исследованы взаимоотношения регуляторных и структурных генов, локализованных в разных диплоидных геномах, входящих в состав аллогексаплоидного генома пшеницы. Установлено, что регуляторные гены одинаково активируют гомеологичные копии структурных генов, 3 независимо от того, располагаются регуляторный и структурный ген в одном и том же или разных диплоидных геномах. Впервые на транскрипционном уровне показано, что при биосинтезе флавоноидных пигментов в органах пшеницы гомеологичные копии структурных и регуляторных генов других видов злаков (эгилопсов, ржи и ячменя) могут компенсировать функции недостающих генов пшеницы. Практическая ценность работы. Разработаны специфичные маркеры для структурных генов биосинтеза флавоноидов, которые могут использоваться далее для изучения стресс-индуцируемых изменений в транскриптоме пшеницы. Получен ряд новых геном- и хромосом-специфичных маркеров, которые могут эффективно использоваться для идентификации отдельных геномов и хромосом у межродовых гибридов злаков. Предложен эффективный метод генетического картирования структурных генов в аллополиплоидных геномах растений, у которых применение стандартных методик, разработанных для картирования диплоидных геномов, затруднено ввиду наличия гомеологичных копий генов. Данный метод основан на применении геном-специфичных праймеров, выявляющих межсортовой полиморфизм. Создана база данных по микросателлитным локусам и составлены геномные паспорта для коллекции отечественных яровых сортов мягкой пшеницы, которые могут использоваться в дальнейшем для повышения эффективности регистрации новых сортов, защиты авторских прав и проверки чистоты сортового материала. Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в НГУ (Новосибирск) и Университете М. Лютера (Галле, Германия), а также на школах для молодых ученых (Новосибирск, Звенигород, Гатерслебен). Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Гены, определяющие фенотип пшеницы по признакам окраски, являются регуляторными; разные аллели этих генов предопределяют различия в транскрипционной активности структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов. 2. Регуляторные и структурные гены биосинтеза флавоноидных пигментов представлены в геноме пшеницы в виде гомеологичных копий. 4 3. Гомеологичные копии структурных генов характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов. 4. При биосинтезе флавоноидных пигментов в органах пшеницы гомеологичные копии структурных и регуляторных генов других видов злаков (эгилопсов, ржи и ячменя) могут компенсировать функции недостающих генов пшеницы. Апробация работы. Результаты исследования были представлены более чем на 30 различных российских и международных конференциях, в том числе, на 12-й, 13-й и 14-й международных конференциях Европейского сообщества по анеуплоидам пшеницы (EWAC) (2002, Норвич; 2005, Прага; 2007, Стамбул), 6-й и 8-й Гатерслебенской международной научной конференции (2002 и 2005, Гатерслебен), 11-м международном симпозиуме по молекулярным маркерам (2003, Гатерслебен), 2-й всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы генетики» (2003, Москва), 3-м и 5-м съездах ВОГиС (2004 и 2009, Москва), 7-м съезде Общества растениеводства (GPZ; 2004, Галле; приглашенный доклад), 2-м рабочем совещании консорциума по тандемным повторам «Биоинформатика, Геномика и Функциональность микросателлитов и VNTR» (2006, Будапешт), 1-х и 2-х чтениях памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (2007 и 2009, Москва, Дубна), международной конференции «Молекулярное картирование и селекция растений с помощью маркеров» (2008, Вена), 20-м Генетическом конгрессе (2008, Берлин), 11-м международном симпозиуме по генетике пшеницы (2008, Брисбен), научной конференции «Эколого-генетические проблемы селекции растений» (2008, Краснодар), международной конференции «Хромосома 2009» (2009, Новосибирск), 8-й международной конференции по пшенице (2010, Санкт-Петербург), международной конференции «Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), 7-й международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома» (2010, Новосибирск), 3-й международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции», посвященной Н.В. Тимофееву-Ресовскому (2010, Алушта). Публикации. По результатам исследования опубликовано 27 статей в ведущих 5 отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 2 главы в зарубежных научных монографиях и 20 статей в сборниках научных трудов. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 325 страницах печатного текста, включая 43 таблицы и 80 рисунков. Список цитированной литературы содержит 561 работу. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Определение хромосомной локализации генов, ДНК-маркеров и физическое картирование осуществляли с помощью нуллитетрасомных, дителосомных и делеционных линий сорта Chinese Spring (CS) мягкой пшеницы (Sears, 1944, 1946; Driscoll and Sears, 1971). Для генетического картирования и теста на аллелизм использовали популяции (табл. 1). Для изучения распространения аллелей, контролирующих окраску различных органов у пшеницы, и микросателлитных аллелей использовали коллекции сортов мягкой пшеницы: по 36 образцов из Албании (1941 и 1994 гг.), Индии (1937 и 1976 гг.) и Непала (1937 и 1971 гг.) и 54 яровых отечественных сорта (1926-2001 гг.) (Khlestkina et al., 2004), поддерживаемые в Генбанке IPK (Гатерслебен), ИЦиГ СО РАН (Новосибирск) и ВИР им. Вавилова (Санкт-Петербург). Анализ транскрипции структурных генов биосинтеза флавоноидов проводился при использовании различных генетических моделей, описанных в таблице 2. Фенотипическая оценка признаков окраски (рис. 1) в популяциях 1-3, 5, 7, 10-13 проводилась автором диссертации лично, в популяциях 4, 8-9 и российской коллекции пшеницы - совместно с к.б.н. Пшеничниковой Т.А. (ИЦиГ СО РАН). Данные по окраске колоса популяции 6 и образцов пшеницы из Албании, Индии и Непала предоставил Dr. Börner A. (IPK, Гатерслебен). Соответствие наблюдаемого в популяциях расщепления по маркерам и признакам теоретически ожидаемому определяли с помощью критерия χ2 (Гершензон, 1979). ДНК растений выделяли согласно методике Plaschke et al. (1995). Выделение и очистку РНК растений проводили при использовании наборов реагентов «Plant Rneasy Kit», «RNase-free DNase set» и «RNeasy MinElute Cleanup Kit» (Qiagen). кДНК синтезировали из 1 мг суммарной РНК с помощью обратной транскрипции, используя олигонуклеотидную затравку (dT)15 и набор 6 реагентов «Omniscript Reverse Transcription kit» (Qiagen). Таблица 1. Популяции, используемые для картирования и тестов на аллелизм, обозначения генов, изученных с их помощью в настоящей работе. № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Родительские линии популяции Популяция (численность) T. aestivum Жница / T. aestivum TRI 542 F2 (48), Khlestkina et al., 2006 T. aestivum i:S29BgHg / T. aestivum TRI 546 F2 (97), Khlestkina et al., 2006 T. aestivum Federation / T. aestivum TRI 546 F2 (105), Khlestkina et al., 2006 T. aestivum Голубка / F2 (74), Khlestkina et al., 2006 T. aestivum Новосибирская 67 T. aestivum Голубка / T. aestivum L301 F2 (44), Khlestkina et al., 2006 T. durum х Ae. tauschii W7984 / RIL* (111), van Deynze et al., T. aestivum Opata 85 1995 T. durum х Ae. tauschii SN-N / F2 (146), Khlestkina et al., T. aestivum Ульяновка 2009 T. aestivum Жница / T. aestivum i:S29BgHg F2 (154), Khlestkina et al., 2009 T. aestivum Голубка / T. durum х Ae. tauschii F2 (93), Khlestkina et al., 2009 W7984 T. aestivum СS(Hope 7B) / F2 (134), Khlestkina et al., T. aestivum TRI 2732 2002 T. aestivum TRI 19286 / T. aestivum CS F2 (108) T. durum TRI 15744 / T. durum TRI 2719 F2 (108), Khlestkina et al., 2010 T. aestivum Саратовская 29 / DH** (108), Khlestkina et al., T. aestivum С29(YP 4D*7A) 2010 T.timopheevii k-38555 / T. militinae F2 (70), Salina et al., 2006 T. aestivum Саратовская 29 / T.spelta F2 (42), Khlestkina et al., 2011 T. aestivum СS(Hope 7A) / T. aestivum TRI F2 (74), Khlestkina et al., 2002 15010 T. aestivum Мироновская 808 / T. aestivum F2 (71), Börner et al., 1997 Ai-bian T. aestivum Скала / F2 (93), Leonova et al., 2002 T. aestivum Саратовская 29-T. timopheevii 842 S. cereale Вятка / S. cereale Monstrous F2 (72), Malyshev et al., 2003 S. cereale Р105 / S. cereale Р87 F2 (72), Malyshev et al., 2003 S. cereale Вятка / S. cereale Steel F2 (72), Malyshev et al., 2003 S. cereale Steel / S. cereale Monstrous F2 (72), Malyshev et al., 2003 Гены Rg-A1b Rg-A1c Rg-B1b Rg-D1c, Rc-D1, Pc-D1, Pan-D1, Plb-D1 Rg-D1c Rg-D1b Rg-A1c, Rg-D1b Rg-A1b, Rg-A1c Rg-D1b, Rg-D1c Rc-B1, Pc-B1, Pls-B1, Plb-B1 Pc-D1, Pls-D1, Plb-D1 Pg, Pp1, Pp3, Rc-B1, Pc-B1, Pls-B1, Plb-B1 Rc-A1, Pc-A1, Pls-A1, Plb-A1 F3h-A1 F3h-B1 F3h-B2 F3h-D1 F3h-G1 19 F3h-R1, Ans 20 3Rt 21 -*** 22 -*** * DH – double haploid, ** RIL – recombinant inbred lines, *** популяции использовались для построения микросателлитных карт и сравнительного картирования. ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, используя «Touchdown» протокол (Somers et al., 2003). Количественная ОТ-ПЦР проводилась в трех повторностях на кДНК при использовании набора реагентов «QuantiTect SYBR Green Kit» (Qiagen) и системы «Applied Biosystems 7000 (или 7900) HT» согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР в реальном времени осуществлялся с помощью программы SDS 1.3. (или 2.2.) при использовании порогового метода сравнения графиков накопления ДНК (Ct) и с определением эффективности ПЦР по 7 последовательным разбавлениям образца. Для стандартизации количества кДНК матрицы осуществлялась количественная ОТ-ПЦР с праймерами к референсным генам Ubc и Gapdh пшеницы. Оценка достоверности различий, выявляемых при анализе транскрипции гомеологичных копий генов, осуществлялась с помощью tкритерия Стьюдента (Васильева, 2000). Таблица 2. Генетические модели, используемые для анализа транскрипции генов, участвующих в формировании окраски Ген Растительный материал F3h-1 и Chi Chi, F3h-1, Ans и 3Rt F3h-1 F3h-1 F3h-1, Сhi-B1 F3h-A1, -B1, -D1 F3h-A1, -B1, -D1, -B2 и Сhi-B1 F3h-A1, -B1, -D1, -B2 и Сhi-B1 F3h-A1, -B1, -D1, -B2 F3h-A1, -B1, -R1 F3h-1 F3h-1 Myc-A1 почти изогенная линия мягкой пшеницы i:S29BgHg (Arbuzova et al., 1998), интрогрессивная (почти изогенная) линия CS-Ae.tauschii 1D-4 (Pestsova et al., 2006) пшенично-ржаные дополненные линии CS/Imperial (Driscoll and Sears, 1971) рекомбинантные линии мягкой пшеницы Саратовская 29/Саратовская 29(Yanetzkis Probat 4D*7A) (Khlestkina et al., 2010) рекомбинантные линии мягкой пшеницы CS(Hope 7B)/TRI 2732 (Khlestkina et al., 2002) интрогрессивные линии CS-Ae.tauschii 7D (Pestsova et al., 2006) сорт мягкой пшеницы Саратовская 29 линия мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы CS(Hope 7А) (Kuspira and Unrau, 1958) линия мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы CS(Hope 7B) (Kuspira and Unrau, 1958) сорт мягкой пшеницы Мироновская 808 линия L2R(2D)с замещением хромосомы 2D сорта мягкой пшеницы Саратовская 29 на хромосому 2R сорта ржи Онохойская (Силкова с соавт., 2006) пшенично-эгилопсные дополненные линии CS/Ae.speltoides 7S, CS/Ae.longissima 7S, CS/Ae.searsii 7S (Friebe et al., 1993, 1995, 2000) линия с замещением хромосомы 7D сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28 на хромосому 7Нm ячменя H. marinum (Трубачеева с соавт., 2008) почти изогенная линия мягкой пшеницы i:S29Pp1Pp2 (Arbuzova et al., 1998) Ткань (гены, определяющие фенотип) колосковые чешуи (Rg-A1c, -Rg-D1b) колеоптиле (Rc-R1b) колеоптиле (Rc-A1b) колеоптиле (Rc-B1b) колеоптиле (Rc-D1b) колеоптиле (Rc-A1, Rc-D1) колеоптиле (Rc-A1b) колеоптиле (Rc-B1b) колеоптиле (Rc-D1b) колеоптиле (Rc-1b) колеоптиле (Rc-S1b) колеоптиле (Rc-H1b) перикарп зерна (Pp3) Электрофоретический анализ геномной ДНК, плазмидной ДНК и ПЦРпродуктов проводили согласно Maniatis et al. (1982). ПЦР-фрагменты выделяли из 1% агарозного геля с помощью набора реагентов «MinElute gel extraction kit» и клонировали при использовании «PCR Cloning plus Kit» (Qiagen). ДНК плазмид выделяли методом щелочного лизиса (Maniatis et al., 1982). Клонированные фрагменты ДНК анализировали с помощью набора для секвенирования «ABI PRISM 8 Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit» (Perkin Elmer) при содействии ЦКП СО РАН «Межинститутский центр секвенирования». Кластерный анализ выполнялся с помощью программы MEGA 3.1. (Kumar et al., 2004) при использовании алгоритма UPGMA. Для разработки праймеров к генам биосинтеза флавоноидов пшеницы и ржи и для кластерного анализа использовались последовательности одноименных генов других видов растений, а также EST пшеницы и ржи, выявленные в банках данных нуклеотидных последовательностей NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/) и GRAINGENE (http://wheat.pw.usda.gov/) с помощью алгоритмов UniGene (Pontius et al., 2003) и BLAST (Altchul et al., 1990). Множественное выравнивание последовательностей проводилось с помощью программы MULTALIN (Corpet, 1988), а конструирование праймеров - с помощью компьютерной программы OLIGO (Rychlik and Rhoads, 1989). Для молекулярного картирования, а также для анализа коллекций пшеницы использовались микросателлитные маркеры GWM (Röder et al., 1998; Ganal and Röder, 2007), GDM (Pestsova et al., 2000), BARC (Song et al., 2002), WMC (Somers et al., 2004) и TAGLGAP (MW1B002; Devos et al., 1995). Микросателлитный анализ проводился согласно протоколу, описанному Röder et al. (1998). Построение молекулярно-генетических карт проводилось с помощью компьютерной программы MAPMAKER 2.0 (Lander et al., 1987). ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Картирование признаков окраски. Основой для проведения исследований, направленных на понимание механизмов формирования признаков окраски у пшеницы, является генетическое картирование генов, определяющих фенотип по данным признакам. В настоящей работе с помощью микросателлитных маркеров осуществлено генетическое картирование более 20 генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски (Khlestkina et al., 2002, 2006, 2008, 2009, 2010). В результате гены, определяющие черную (Bg), красную (Rg1, Rg2, Rg3) и серодымчатую окраску колосковых чешуй, были картированы в гомеологичных позициях в дистальных районах хромосом 1АS, 1BS и 1DS мягкой пшеницы (рис. 2). Результаты сравнительного картирования и теста на аллелизм указывают на то, что Rg3 и Bg – разные аллели одного и того же локуса. Согласно правилам обозначения генов пшеницы данный локус получил наименование Rg-A1 с обозначением аллелей 9 Rg-A1a (аллель, определяющий отсутствие окраски), Rg-A1b (Rg3) и Rg-A1c (Bg). Также согласно результатам картирования и теста на аллелизм ген Rg2 и ген, определяющий серо-дымчатую окраску колоса, картированные в хромосоме 1D, являются аллельными и были обозначены Rg-D1b и Rg-D1c, соответственно. Гомеологичный ген в хромосоме 1В (Rg1) был обозначен Rg-B1 (рис. 2) (Khlestkina et al., 2006, 2009). Гены, определяющие окраску колосковых чешуй, гомеологичные генам Rg мягкой пшеницы, изученным в настоящей работе (рис. 2), выявлены только у пшениц (van Deynze et al., 1995; Korzun et al., 1999; Salina et al., 2006; Khlestkina et al., 2006, 2009) и эгилопсов (Arzani et al., 2004; Khlestkina et al., 2006, 2009). Гены, контролирующие похожий признак у других видов злаков, например, гены B/Blp и Re2/Pre2 ячменя и ген Р кукурузы локализованы не в гомеологичной позиции (Ahn et al., 1993; Lundqvist et al., 1996; Davis et al., 1999). Впервые изучен характер наследования признака антоциановой (пурпурной) окраски колосковых чешуй. Фенотипический анализ F2 популяции тетраплоидной пшеницы T. durum (популяция 12; табл. 1) показал, что данный признак контролируется одним доминантным геном (расщепление в популяции соответствовало 3:1, 2 = 0.05, Р > 0.80), обозначенным Pg. Проведенное микросателлитное картирование позволило выявить локализацию данного гена в хромосоме 2А между микросателлитными маркерами Xgwm0817 и Xgwm0328 в тесном сцеплении с геном Рр3 (рис. 3а). Ген Рр3 является одним из двух комплементарных доминантных генов, определяющих антоциановую окраску перикарпа зерна. Расщепление по данному признаку в популяции 12 соответствовало 9:7 (2 = 0.01, Р > 0.90). Комплементарный ген Рр1 был картирован в хромосоме 7В (Khlestkina et al., 2010). На основе схожей функции и хромосомной локализации предполагаемыми ортологами генов Pp3 и Pg могут являться Myc-подобные гены-регуляторы биосинтеза антоцианов риса (Pb/Ra) и кукурузы (Lc/R). Используя известные последовательности кДНК генов Pb/Ra, (U39860, Hu et al., 1996; Wang and Shu 2007) и Lc/R (M26227, Ludwig et al., 1989) мы провели поиск гомологичных последовательностей в базе данных пшеницы. В результате была выявлена гомологичная последовательность в ВАС-клоне 404H6 хромосомы 2А диплоидной 10 пшеницы T. urartu. При использовании праймеров к частичной кодирующей последовательности выявленного гена T. urartu, были выделены 2 нуклеотидные последовательности из геномов А и В тетраплоидной пшеницы T. durum. Рис. 1. Признаки окраски пшеницы, изученные в настоящей работе. 11 12 окраску колоса (Khlestkina et al., 2006, 2009). «Xgwm…», «Xgdm…» и «Xbarc…» - микросателлитные локусы. Популяции, используемые для картирования, описаны в табл. 1. Гомеологичные локусы соединены пунктирными линиями. Рис. 2. Полученные генетические карты хромосом первой гомеологической группы пшеницы, содержащие гены, определяющие Далее с помощью праймеров, специфичных к каждой из двух выделенных последовательностей, соответствующие гены, обозначенные Myc-A1 и Myc-B1, были локализованы в хромосоме 2А (в проксимальном районе 2AL) и 2В (в делеционном районе 2BL-5). Myc-A1 ко-локализовался с генами, определяющими антоциановую окраску перикарпа зерна (Pp3) и колоса (Pg) (рис. 3а). Впервые изучен характер наследования признаков антоциановой окраски листовых пластинок и листовых влагалищ. Фенотипический анализ популяций 4, 10, 11, 12 и 13 показал, что каждый из двух данных признаков наследуется моногенно с доминированием использовании окрашенных популяции 10 форм. Микросателлитное позволило локализовать картирование гены, при определяющие антоциановую окраску листовых пластинок (Plb-В1), листовых влагалищ (Pls-В1), колеоптиле (Rc-В1) и стебля (Рс-В1), в коротком плече хромосомы 7В между маркерами Xgwm0255 и Xgwm0573 (рис. 3б). У твердой пшеницы (популяция 12) вместе с кластером генов Pls-В1, Plb-B1, Pc-B1 и Rc-B1 ко-локализовался один из двух комплементарных доминантных генов, определяющих антоциановую окраску перикарпа зерна, Рр1 (Khlestkina et al., 2010). Аналогичным образом с помощью остальных популяций были картированы гены Pls-А1, Plb-А1, Pc-А1, и Rc-А1, образующие кластер в коротком плече хромосомы 7А, и гены Pls-D1, Plb-D1, Pc-D1, Pan-D1 и Rc-D1, образующие кластер в коротком плече хромосомы 7D (Khlestkina et al., 2008, 2009, 2010). В некоторых популяциях между данными признаками окраски наблюдалась рекомбинация. Ген, определяющий окраску пыльников, картирован в нашей работе только в хромосоме 7D, однако известен его гомеолог, Pan-A1, в хромосоме 7А твердой пшеницы (Blanco et al., 1998). В целом кластеры генов, определяющих антоциановую окраску колеоптиле, стебля, пыльников, листовых пластинок и листовых влагалищ располагаются в хромосомах 7А, 7В и 7D в гомеологичных позициях относительно друг друга (Khlestkina et al., 2008, 2009, 2010). Данные гены ко-локализуются с гомологами Mybподобных регуляторных факторов биосинтеза антоцианов кукурузы С1/Pl, выявленными ранее у пшеницы с помощью блот-гибридизации (Li et al., 1999). Гены Pc, Pan, Plb, Pls, Rc и Pp1 могли произойти в результате дупликации гена-гомолога С1/Pl, расположенного в коротком плече хромосомы 7 диплоидного предка группы видов Triticum-Aegilops, вследствие неравного кроссинговера и последующей 13 тканевой специализации образовавшихся копий. Рис. 3. Полученные генетические карты хромосомы 2А и 7В пшеницы, содержащие гены, определяющие антоциановую окраску различных органов (Khlestkina et al., 2002, 2008, 2009, 2010). Cоответствие генных символов и признаков представлено на рис. 1. «Xgwm…» - микросателлитные локусы. Популяции, используемые для картирования, описаны в табл. 1. Для проведения сравнительного картирования и установления принадлежности генов к одной гомеологической группе важным является наличие картированных микросателлитных маркеров. До настоящей работы были разработаны маркеры и составлены микросателлитные карты для мягкой пшеницы (Röder et al., 1998; Stephenson et al., 1998; Song et al., 2005; Ganal and Röder, 2007) и ее сородичей (Korzun et al., 1999; Pestsova et al., 2000; Salina et al., 2006; Singh et al., 2007; Dobrovolskaya et al., 2007), а также для ячменя (Liu et al., 1996; Ramsay et al., 2000; Li et al., 2003). Для генома ржи микросателлитной карты создано не было. В данной работе при 14 использовании популяций 19-22 (табл. 1) была составлена геномная карта ржи, содержащая 99 микросателлитных локусов Xgwm (картированных на основе микросателлитных маркеров пшеницы) и Xrems (разработанных на основе микросателлитных последовательностей в EST ржи) (Khlestkina et al., 2004). При использовании полученных микросателлитных карт было проведено сравнительное картирование локализации генов Rc пшеницы и ржи, которое указывает на локализацию гена Rc ржи между микросателлитными маркерами Xgwm0130 и Xgwm0676 в проксимальном районе длинного плеча хромосомы 4R. Данный район, как известно (Devos et al., 1993), соответствует проксимальному району короткого плеча хромосом 7 гомеологической группы пшеницы, где находятся гены Rc пшеницы. Согласно правилам обозначения гомеологичных генов ген Rc ржи получил обозначение Rc-R1 (Khlestkina et al., 2009). Распространение генов, определяющих окраску органов пшеницы. Результаты фенотипирования используемых в работе коллекций пшеницы из России, Албании, Индии и Непала указывают на то, что доля красноколосых сортов в них составляет 45, 42, 33 и 31%, соответственно. При сравнении стародавних и современных сортов выявлено, что в российской коллекции доля красноколосых форм со временем снизилась (с 71 до 15%), а в остальных коллекциях возросла. Также выявлены изменения в частотах аллелей микросателлитных локусов. Так, лишь от 2/3 (Албания, Непал) до 3/4 (Россия, Индия) аллелей стародавних сортов сохранились у современных сортов, тогда как остальная часть аллелей утеряна или замещена новыми аллелями, а среди аллелей общих для стародавних и современных сортов выявлено изменение частот встречаемости в среднем на 15% (Khlestkina et al., 2003, 2004, 2006). В результате проведенного анализа создана база данных по микросателлитным локусам и составлены геномные паспорта для коллекции отечественных яровых сортов мягкой пшеницы, а для аллелей Rg-A1b и Rg-B1b, определяющих красную окраску колоса, выявлены диагностические микросателлитные маркеры Xgwm0136 и Xtaglgap (Khlestkina et al., 2004, 2006, 2009). В изучаемой коллекции отечественных сортов также проводилась оценка антоциановой окраски различных органов. Выявлена корреляция между окраской колеоптиле (Rc), стебля (Pc), листовых пластинок (Plb) и листовых влагалищ (Pls; табл. 3), которая может объясняться близким расположением генов Rc, Pc, Pan и Plb в 15 хромосомах 7 гомеологической группы (рис. 3б). Признак окраски ушек, контролируемый хромосомами 1D, 4B, 6B, с остальными признаками антоциановой окраски не коррелировал (табл. 3). Таблица 3. Значения коэффициентов корреляции r (Пирсона) между признаками окраски различных органов у отечественных яровых сортов мягкой пшеницы. Rc Pc Plb Pc 0.786*** Plb 0.429* 0.224 * Pan 0.388 0.185 0.440** Ra 0.149 0.007 0.199 *, **, *** наблюдается корреляция при p < 0.05, 0.02 и 0.01, соответственно. Pan 0.036 Клонирование и картирование структурных генов биосинтеза флавоноидов. Для большинства генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, нуклеотидные последовательности еще не выделены. Поэтому их функциональная роль в биосинтезе флавоноидных пигментов исследовалась посредством сравнительного изучения влияния доминантных и рецессивных аллелей в данных локусах на транскрипционную активность структурных генов биосинтеза флавоноидов. Однако изучение транскрипции структурных генов потребовало предварительного выделения их нуклеотидных последовательностей. Из геномов пшениц, эгилопсов и ржи на основе ПЦР было выделено и отсеквенировано 16 нуклеотидных последовательностей структурных генов биосинтеза флавоноидов, кодирующих ферменты халконфлаванонизомеразу (Chi), флаванон-3-гидроксилазу (F3h), антоцианидинсинтазу (Ans) и антоцианидин-3-гликозидрамнозилтрансферазу (3Rt) (табл. 4). Выравнивание последовательностей разных копий одного и того же гена позволило выявить специфичные для копий нуклеотидные замены. Благодаря выявленным различиям были разработаны праймеры для амплификации индивидуальных копий структурных генов биосинтеза флавоноидов. Использование данных праймеров для анализа нуллитетрасомных, дителосомных, делеционных и дополненных линий позволило осуществить физическое картирование выделенных генов (данные по локализации суммированы в табл. 4). Установлено, что копии одного и того же гена присутствуют в гомеологичных хромосомах в количестве одна копия на хромосому. Исключение составили две копии гена F3h (F3h3 и F3h4), обе локализованные в хромосоме 2В (Khlestkina et al., 2008). 16 Таблица 4. Длина, хромосомная локализация и каталожный номер последовательностей генов, клонированных в настоящей работе (Khlestkina et al., 2008, 2009). Ген Вид Длина отсеквенированного участка (п.н.) Хромосомная локализация Каталожный номер в Генбанке Chi-B1 (Chi2) Chi-D1 (Chi1) Chi-R1 (Chi) F3h-A1 (F3h1)* F3h-B1 (F3h3) F3h-D1 (F3h2)* F3h-B2 (F3h4) F3h-R1 (F3h) F3h-A1 (F3h1) F3h-G1 (F3h2) F3h F3h F3h Ans 3Rt 3Rt T. aestivum T. aestivum S. cereale T. aestivum T. aestivum T. aestivum T. aestivum S. cereale T. timopheevii T. timopheevii T. urartu Ae. speltoides Ae. tauschii S. cereale T. aestivum S. cereale 325 318 218 1852 1626 1374 562 823 542 539 542 542 1326 542 844 848 5B 5D 5R 2A 2B 2D 2B 2R 2A 2G 2A 2S 2D 6R 5D 5R FJ668381 FJ668382 FJ216423 EF463100 EU402957 DQ233636 EU402958 EU815625 EU402959 EU402960 EU402961 EU402963 DQ233637 EU815626 EU815627 EU815628 * полные нуклеотидные последовательности генов; остальные – частичные Для того чтобы установить, какие из выделенных копий гена F3h являются гомеологичными по отношению друг к другу, проводилось их генетическое картирование. Ввиду аллополиплоидной природы генома мягкой пшеницы и низкого уровня межсортового полиморфизма нуклеотидных последовательностей генов пшеницы, генетическое картирование структурных генов у данного вида представляет сложную задачу и требует трудоемких подходов для ее решения (Li et al., 1999; Boisson et al., 2005, Ravel et al., 2006). В настоящей работе был впервые предложен и использован эффективный подход для генетического картирования структурных генов пшеницы, основанный на ПЦР-скрининге родительских линий картирующих популяций с помощью праймеров, специфичных для индивидуальных копий. Как выяснилось, однонуклеотидные локусы, полиморфные между копиями, могут содержать полиморфизмы и между сортами. Таким образом, примененный подход позволял выявлять межсортовые различия с помощью ПЦР, а отобранные полиморфные популяции использовались для генотипирования и последующего генетического картирования индивидуальных копий структурных генов (рис. 4). 17 Рис. 4. Генетические карты хромосом второй гомеологической группы пшеницы и хромосомы 2R ржи. «Xgwm…» микросателлитные локусы, «F3h…» - копии гена F3h, картированные в настоящей работе. Популяции, используемые для картирования, описаны в табл. 1. Гомеологичные локусы соединены пунктирными линиями. В результате было установлено, что копии F3h1, -2 и -3 мягкой пшеницы находятся в гомеологичных локусах, тогда как F3h4 является паралогичным локусом. Согласно правилам обозначения генов пшеницы соответствующие гены были обозначены F3h-A1, -D1, -B1 и -B2 (табл. 4). Гены F3h T. timopheevii и S. cereale были 18 картированы в позициях, гомеологичных по отношению к генам F3h-1 (рис. 4) (Khlestkina et al., 2008, 2009, 2011). На рис. 5 отражено сходство нуклеотидных последовательностей гена F3h в разных геномах и у разных видов растений. Видно, что ген F3h-В2 расположен отдельно от кластера генов F3h-1 не только пшениц и эгилопсов, но ржи и ячменя (Khlestkina et al., 2008). Также было показано, что накопление несинонимичных нуклеотидных замен в данной копии происходит быстрее по сравнению с копиями F3h-1. Анализ транскрипции различных копий гена F3h в колеоптиле показал, что паралогичная копия F3h-В2 отличается от гомеологичных копий F3h-1 и по транскрипционной активности (Khlestkina et al., 2008). Рис. 5. Дендрограмма, отражающая сходство нуклеотидных последовательностей гена F3h разных видов растений. Подчеркнуты номера последовательностей, клонированных в настоящей работе. Для видов, имеющих более одной копии F3h, справа от видового названия указано название копии (Khlestkina et al., 2008). 19 Проведено сравнение между нуклеотидными последовательностями генов Chi, F3h, Ans и 3Rt пшеницы и ржи. Установлено, что отношение частот встречаемости несинонимичных и синонимичных замен (Ka/Ks) увеличивается в ряду генов Chi, F3h, Ans и 3Rt (рис. 6). Такой порядок соответствует занимаемыми позициями ферментов CHI, F3H, ANS и 3RT в пути биосинтеза флавоноидов. Для гена, занимающего самую раннюю позицию в пути биосинтеза (из этих четырех генов) Chi, - наблюдается наименьшая частота встречаемости несинонимичных замен и самый низкий коэффициент Ka/Ks. Для гена, занимающего самую позднюю позицию в пути биосинтеза - 3Rt, - наблюдается наибольшая частота встречаемости несинонимичных замен и самое высокое соотношение (Ka/Ks) (рис. 6). Частота встречаемости несинонимичных замен (Ka) в последовательности гена Chi почти в 9 раз ниже таковой для гена 3Rt. Рис. 6. Соотношение частот встречаемости несинонимичных (Ka) и синонимичных (Ks) нуклеотидных замен, выявленное при сравнении нуклеотидных последовательностей структурных генов биосинтеза флавоноидов пшеницы и ржи. Полученные результаты могут иметь следующее объяснение. Ферменты, участвующие на начальных этапах биосинтеза, задействованы в биосинтезе большего числа классов флавоноидных соединений. Поэтому те мутации в кодирующих их генах, которые приводят к снижению каталитической активности ферментов, уменьшают эффективность биосинтеза большего числа классов флавоноидных соединений. Такое плейотропное воздействие и увеличивает степень давления отбора, снижая вероятность закрепления мутации в генах, участвующих в более ранних этапах биосинтеза. Функциональная роль генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски. Как было показано выше, ген Myc-A1, кодирующий Myc-подобный фактор активации транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов, ко-локализуется в хромосоме 2А с генами, определяющими антоциановую окраску перикарпа зерна 20 (Pp3) и колоса (Pg) (рис. 3а). Мы изучили транскрипцию гена Myc-A1 в неокрашенном перикарпе сорта Саратовская 29 и в окрашенном антоцианами перикарпе почти изогенной линии i:S29Рр1Рр2, несущей доминантные аллели в локусах Рр1 и Рр3 на генетическом фоне сорта Саратовская 29. Выявлена активация транскрипции Myc-A1 в перикарпе линии i:S29Рр1Рр2 по сравнению с сортом Саратовская 29 (рис. 7а). Рис. 7. ОТ-ПЦР-фрагменты, полученные (а) с праймерами к гену Мyc-A1 при использовании РНК, выделенной из перикарпа зерна почти изогенных линий Саратовская 29 и i:S29Рр1Рр2, (б) с праймерами к генам Chi и F3h при использовании РНК, выделенной из колосковых чешуй почти изогенных линий Саратовская 29 / i:S29BgHg и Chinese Spring / CS-Ae. tauschii 1D-4. Ubc и Gapdh- референсные гены. 21 Таким образом, показано, что ген Myc-A1 не только ко-локализуется в хромосоме 2А с геном Pp3, транскрипционную определяющим активность в окраску перикарпа, но и окрашенном перикарпе по сравнению 22 проявляет с неокрашенным. В сочетании с известными данными об ортологичной локализации Рис. 8. Уровень транскрипции генов F3h-A1, F3h-B1, F3h-B2 и F3h-D1 в колеоптиле линий CS(Hope 7А), CS(Hope 7B) и сортов CS, Мироновская 808 пшеницы со 2-го по 6-й день после прорастания, определенный с помощью количественной ОТ-ПЦР с праймерами к указанным выше генам. Результаты оценки достоверности различий приведены в табл. 6 и 7). Myc-подобных генов, регулирующих биосинтез антоцианов в перикарпе зерна риса и кукурузы (Hu et al., 1996; Wang and Shu, 2007; Ludwig et al., 1989), гомологичных MycA1, полученные результаты указывают на то, что Myc-A1 является гéном функциональным кандидатом для гена Рр3 пшеницы. В отличие от гена Рр3 для остальных генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, изучаемых в настоящей работе, нуклеотидные последовательности генов-кандидатов еще не выделены. Поэтому их функциональная роль в биосинтезе флавоноидных пигментов исследовалась посредством сравнительного изучения влияния доминантных и рецессивных аллелей в данных локусах (а именно, в локусах Rg и Rc) на транскрипционную активность структурных генов биосинтеза флавоноидов (рис. 7б, 8). Сравнительный анализ транскрипции генов Chi и F3h в колосковых чешуях двух пар почти изогенных линий (Саратовская 29 / i:S29BgHg и Chinese Spring / CS-Ae. tauschii 1D-4), отличающихся наличием рецессивных/доминантных аллелей в локусах Rg-A1 и Rg-D1, соответственно, показал активацию транскрипции Chi в окрашенных чешуях по сравнению с неокрашенными. F3h был неактивен во всех образцах (рис. 7б). Фермент CHI участвует в биосинтезе нескольких классов флавоноидных пигментов, из которых только для биосинтеза 3-дезоксиантоцианидинов и флобафенов (окрашенные производные флаван-4-олов) не требуется участие флаванон-3-гидроксилазы (табл. 5). Таким образом, результаты анализа изогенных линий (рис. 7б) указывают на участие генов Rg в активации транскрипции генов биосинтеза флавоноидных пигментов флобафенов и/или 3-дезоксиантоцианидинов в колосковых чешуях. Таблица 5. Халконфлавононизомераза и флаванон-3-гидроксилаза флавоноидных пигментов (по Winkel-Shirley 2001, 2002 ). в биосинтезе Флавоноидные пигменты (основные классы) фермент Антоцианидины Халконы и и ауроны антоцианы Флавонолы и гликозиды флавонолов Флобафены и проанто3-дезоксицианидины антоцианидины халконфлаванонизомераза + - + + + флаванон-3гидроксилаза + - + - + «+» данный фермент требуется для биосинтеза данного класса соединений, «-» не требуется. 23 Сравнительный анализ транскрипции F3h в неокрашенном колеоптиле сорта пшеницы Chinese Spring (CS) и окрашенном колеоптиле замещенных линий CS(Hope 7А) и CS(Hope 7В) показал, что гомеологичные гены F3h-1 активны только в окрашенном колеоптиле (рис. 8). Дальнейший анализ рекомбинантных и интрогрессивных линий мягкой пшеницы (табл. 2) показал, что активация транскрипции F3h-1 связана с присутствием доминантного аллеля в каком-либо из трех гомеологичных локусов Rc-1 (Khlestkina et al., 2008, 2009). Сравнительное картирование генов, участвующих в формировании окраски (около 30 локусов, изученных в настоящей работе, и около 30 локусов, картированных ранее; Li et al., 1999; Himi and Noda, 2004; McIntosh et al., 2008), не выявило ни одного случая ко-локализации генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, и структурных генов биосинтеза флавоноидов. Исследование функциональной взаимосвязи между этими двумя группами генов показало, что гены, определяющие фенотип пшеницы по признакам окраски, участвуют в активации транскрипции структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов (Khlestkina et al., 2008, 2009, 2010; Khlestkina, 2011). Особенности экспрессии гомеологичных генов злаков различного происхождения в геноме аллополиплоидной пшеницы. Количественный анализ уровня транскрипции гомеологичных генов F3h-A1, -B1 и -D1 у образцов пшеницы CS(Hope 7А), CS(Hope 7B) и Мироновская 808, окраска колеоптиле которых контролируется разными гомеологичными генами Rc, показал, что в результате присутствия доминантного аллеля в любом из трех гомеологичных регуляторных локусов Rc происходит коактивация экспрессии гомеологичных копий F3h в колеоптиле (рис. 8). При этом уровни транскрипции F3h-A1, -B1 и -D1 сходны в одном и том же генотипе (табл. 6). В то же время генотипы отличаются между собой по уровню транскрипции F3h, что может быть обусловлено различной активностью транскрипционных факторов, кодируемых разными генами Rc (табл. 7). Таблица 6. Оценка достоверности различий между уровнями транскрипции разных копий гена F3h в колеоптиле линий CS(Hope 7A), CS(Hope 7В) и сорта Мироновская 808 c помощью критерия Стьюдента, t (p = 0.05 для всех приведенных величин). CS(Hope 7A) CS(Hope 7B) Мироновская 808 F3h-A1 vs F3h-B1 0.28 0.04 1.38 F3h-A1 vs F3h-D1 0.40 0.48 0.26 24 F3h-D1 vs F3h-B1 0.40 1.90 0.52 Таблица 7. Оценка достоверности различий между уровнями транскрипции F3h в колеоптиле разных генотипов пшеницы с помощью критерия Стьюдента, t. CS(Hope 7A) vs CS(Hope 7B) 6.17 0.999 t P> CS(Hope 7A) vs Мироновская 808 4.29 0.999 CS(Hope 7B) vs Мироновская 808 2.76 0.95 Сравнение генотипов, несущих доминантные аллели Rc-A1 (СS(Hope 7A) и Саратовская 29; Khlestkina et al., 2010), показало, что в локусе Rc-A1 имеет место множественный аллелизм. В целом независимый анализ четырех различных генотипов мягкой пшеницы (СS(Hope 7A), СS(Hope 7В), Мироновская 808 и Саратовская 29) показал, что регуляторные гены Rc одинаково активируют гомеологичные копии структурных генов F3h, независимо от того, располагаются регуляторный и структурный локус в одном и том же или разных диплоидных геномах (Khlestkina et al., 2008, 2010). Более того, можно полагать, что гомеологичные копии F3h-A1, -B1 и -D1 имеют сходство не только по транскрипционной активности (табл. 6), но и по функциональной активности кодируемых ферментов, так как сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей данных генов показал их высокий уровень гомологии и консервативность мотивов, участвующих в стабилизации пространственной структуры, внутриклеточной локализации фермента, белок-белковых взаимодействиях и формировании активных центров (данные не приведены; функционально значимые мотивы идентифицировались согласно Britch et al., 1993). В пшенично-ржаной линии с замещением хромосомы 2D на 2R (линия L2R(2D); табл. 2) вместо гена F3h-D1 пшеницы присутствует ген F3h-R1 ржи, а окраску колеоптиле контролирует ген Rc пшеницы. Было показано, что в колеоптиле данной линии транскрипция гена F3h-R1 активируется наряду с транскрипцией генов F3h-A1 и F3h-B1 (Khlestkina et al., 2009). Таким образом, ген F3h-R1 ржи способен функционально компенсировать отсутствие одного из трех гомеологов пшеницы, F3hD1, в пшенично-ржаной замещенной линии 2R(2D). На основании анализа транскрипции гомеологичных копий F3h пшеницы в дополненных пшенично-эгилопсных, пшенично-ржаной и замещенной пшеничноячменной линиях (табл. 2) было установлено, что регуляторные гены Rc эгилопсов, ржи и ячменя способны активировать структурные гены F3h пшеницы. Таким образом, доминантные аллели генов Rc эгилопсов, ржи и ячменя способны 25 компенсировать отсутствие доминантных аллелей Rc в замещенных и дополненных линиях, созданных на основе сортов с неокрашенным колеоптиле. Данный эффект наблюдался как на фенотипическом уровне (Friebe et al., 1993, 1995, 2000; Khlestkina et al., 2009), так и на функциональном уровне (рис. 9). При этом действие чужеродного гена на генетическом фоне пшеницы проявляется тем слабее, чем более далек филогенетически донор данного гена по отношению к пшенице (рис. 9; Khlestkina, 2010). Рис. 9. Уровень транскрипции гена F3h-1 пшеницы под действием регуляторных генов Rc эгилопсов, ржи и ячменя. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Большой размер и сложная организация генома мягкой пшеницы затрудняют как полногеномное секвенирование, так и выделение нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих признаки пшеницы. Однако для выделения генов пшеницы можно использовать методы сравнительной геномики и сравнительной генетики, опираясь на известные данные о геномной локализации и структурно- функциональной организации генов диплоидных видов растений. Такой подход, примененный в настоящей работе, позволил отнести гены, определяющие антоциановую окраску колоса (Pg) и перикарпа зерна (Pp3), к семейству генов, кодирующих Myc-подобные факторы регуляции транскрипции генов биосинтеза антоцианов, и идентифицировать нуклеотидную последовательность гена - функционального кандидата (Myc-A1) для гена Рр3. Аналогичным образом гены, 26 определяющие антоциановую окраску стебля (Pc), пыльников (Pan), листа (Plb и Pls), колеоптиле (Rc) и перикарпа зерна (Pp1) пшеницы, можно отнести к семейству Mybподобных регуляторных генов биосинтеза антоцианов (гомологов С1/Pl кукурузы). Также выявлено, что гены Rg, определяющие окраску колоса, участвуют в активации транскрипции генов биосинтеза флавоноидных пигментов. Таким образом, у мягкой пшеницы фенотип по признакам окраски определяют именно регуляторные гены. В этом заключается отличие от диплоидных видов растений, у которых к изменению фенотипа по данным признакам могут приводить мутации не только в регуляторных, но и структурных генах биосинтеза флавоноидных пигментов. По-видимому, у аллополиплоидных форм пшеницы при возникновении функциональной мутации в одной из копий структурного гена биосинтеза флавоноидов окрашенный фенотип сохраняется, благодаря компенсирующей роли гомеологичных копий мутантного гена. Генетическое картирование признаков окраски указывает на то, что гены, контролирующие красную, черную и серо-дымчатую окраску колоса, антоциановую окраску колеоптиле, стебля, листовых пластинок, листовых влагалищ и пыльников, присутствуют в полиплоидном геноме пшеницы в виде гомеологичных копий. Однако изучение наследования данных признаков у отдельных сортов свидетельствует о том, что ко-экспрессия гомеологов, контролирующих окраску, наблюдается крайне редко. Более того, и на фенотипическом, и на функциональном уровне выявлено, что доминантные аллели в гомеологичных регуляторных локусах отличаются между собой паттернами экспрессии, а для отдельных локусов характерен множественный аллелизм. В этом регуляторные гены отличаются от структурных генов биосинтеза флавоноидов, для которых характерна ко-экспрессия и схожая функциональная активность гомеологичных копий. Таким образом, наблюдаемое разнообразие форм аллополиплоидной пшеницы по признакам окраски достигается за счет различных комбинаций аллелей в разных гомеологичных регуляторных локусах. В целом стратегия, разработанная в настоящем исследовании для изучения генетических механизмов формирования признаков окраски, учитывающая особенности сложной организации аллополиплоидного генома пшеницы, может быть рекомендована для изучения генетических механизмов формирования различных 27 признаков как у самой пшеницы, так и у других видов растений, имеющих аллополиплоидный геном. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что разные аллели генов, определяющих фенотип пшеницы по признакам окраски, предопределяют различия в транскрипционной активности структурных генов биосинтеза флавоноидных пигментов в соответствующих органах. 2. Показано, что и регуляторные, и структурные гены биосинтеза флавоноидных пигментов представлены в геноме пшеницы в виде гомеологичных копий. При этом гомеологичные копии структурных генов характеризуются более схожими между собой паттернами экспрессии по сравнению с гомеологичными копиями регуляторных генов. 3. Регуляторные гены одинаково активируют гомеологичные копии структурных генов, независимо от того, располагаются регуляторный и структурный локус в одном и том же или разных диплоидных геномах аллополиплоидной пшеницы. 4. Установлено, что красная, черная и серо-дымчатая окраска колоса пшеницы контролируется гомеологичными локусами Rg в первой гомеологической группе хромосом, регулирующими биосинтез флобафенов и 3-дезоксиантоцианидинов. Доказано, что локусам Rg присущ множественный аллелизм, за счет чего достигается разнообразие форм пшеницы по признакам окраски колоса. Выявлено уменьшение частот встречаемости аллелей, контролирующих красную окраску колоса у современных отечественных сортов яровой мягкой пшеницы по сравнению со стародавними сортами. 5. Сравнительное картирование признаков окраски показало, что в отличие от генов Rg, гомеологичный ряд которых выявлен только у пшениц и их сородичей, ряды генов, контролирующих антоциановую окраску различных органов пшеницы, более широко представлены в семействе злаков. При этом установлено, что а) гены, контролирующие антоциановую окраску колеоптиле (Rc-1), стебля (Pc-1), листовых пластинок (Plb-1), листовых влагалищ (Pls-1), пыльников (Pan-1) и перикарпа зерна (Рр1) пшеницы, существуют в виде кластеров, расположенных в гомеологичных районах хромосом седьмой 28 гомеологической группы и предположительно относятся к семейству Myb-подобных генов, кодирующих активаторы транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов; б) в хромосомах второй гомеологической группы пшеницы выявлены гены, кодирующие Myc-подобные активаторы транскрипции генов биосинтеза антоцианов, из которых ген Myc-A1 ко-локализуется в хромосоме 2А с генами, контролирующими антоциановую окраску перикарпа зерна (Рр3) и колоса (Pg), а его функциональная активность в перикарпе напрямую связана с образованием пигмента в данной ткани. 6. Сравнительный анализ структурных генов биосинтеза флавоноидов (Chi, F3h, Ans и 3Rt), выделенных из геномов пшениц и их сородичей, показал, что в генах, кодирующих ферменты, задействованные на более поздних этапах биосинтеза флавоноидов, накопление несинонимичных нуклеотидных замен происходит быстрее, чем в генах, кодирующих ферменты, участвующие в более ранних этапах биосинтеза, а в паралогичных копиях одного и того же гена накопление несинонимичных нуклеотидных замен происходит быстрее, чем в гомеологичных копиях. 7. Впервые на транскрипционном уровне показано, что при биосинтезе флавоноидных пигментов в органах пшеницы гомеологичные копии структурных и регуляторных генов других видов злаков (эгилопсов, ржи и ячменя) могут компенсировать функции недостающих генов пшеницы. При этом действие чужеродного гена на генетическом фоне пшеницы проявляется тем слабее, чем более далек филогенетически донор данного гена по отношению к пшенице. 29 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Khlestkina E.K., Salina E.A. Genome-specific markers of tetraploid wheats and their putative diploid progenitor species // Plant Breed. - 2001. - V. 120. - P. 227-232. Khlestkina E.K., Pestsova E.G., Salina E.A., Röder M.S., Arbuzova V.S., Koval S.F., Börner A. Molecular mapping and tagging of wheat genes using RAPD, STS and SSR markers // Cell. Mol. Biol. Lett. - 2002. - V. 7. P. 795-802. Щербань А.Б., Хлесткина Е.К., Салина Е.А. Анализ ДНК маркера, специфичного для G-генома пшеницы // Генетика. - 2004. - T. 40. C. - 372-379. Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Шумный В.К. Генотипирование отечественных сортов мягкой пшеницы с использованием микросателлитных (SSR) маркеров // С.-х. биол. 2004. № 5. - C. 44-52. Khlestkina E.K., Huang X., Quenun S.Y.B., Chebotar S., Röder M.S., Börner A. Genetic diversity in cultivated plants – loss or stability // Theor. Appl. Genet. - 2004. - V. 108. - P. 1466-1472. Khlestkina E.K., Röder M.S., Efremova T.T., Börner A., Shumny V.K. The genetic diversity of old and modern Siberian varieties of common spring wheat determined by microsatellite markers // Plant Breed. - 2004. - V. 123. - P. 122-127. Khlestkina E.K., Myint Than M.H., Pestsova E.G., Röder M.S., Malyshev S.V., Korzun V., Börner A. Mapping of 99 new microsatellite-derived loci in rye (Secale cereale L.) including 39 expressed sequencing tags // Theor. Appl. Genet. - 2004. - V. 109. - P. 725-732. Khlestkina E.K., Pshenichnikova T.A., Röder M.S., Arbuzova V.S., Salina E.A. Börner A. Comparative mapping of genes for glume colouration and pubescence in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet. - 2006. - V. 113. - P. 801-807. Khlestkina E.K., Röder M.S., Grausgruber H., Börner A. A DNA fingerprinting-based taxonomic allocation of Kamut wheat // Plant Genet. Res. - 2006. - V. 4. - P. 172-180. Хлесткина Е.К., Салина Е.А. SNP-маркеры: методы анализа, способы разработки и сравнительная характеристика на примере мягкой пшеницы // Генетика. - 2006. - T. 42. C. 725-736. Хурматов Х.Х. Сергеев Д.А., Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Насырова Ф.Ю., Алиев К.А. RAPD- и SNP-анализ генома пшеницы и диких сородичей зерновых злаков Таджикистана // Изв. АН Респ. Таджикистан. - 2006. - T. 154. - C. 18-24. Khlestkina E.K., Varshney R.K., Röder M.S., Graner A., Börner A. A comparative assessment of genetic diversity in cultivated barley collected in different decades of the last century in Austria, Albania and India by using genomic and genic simple sequence repeat (SSR) markers // Plant Genet. Res. - 2006. - V. 4. - P. 125-133. Щербань А.Б., Хлесткина Е.К., Сергеева Е.М., Салина Е.А. Геномные изменения на ранних этапах образования аллополиплоида Aegilops longissima x Triticum urartu // Генетика. - 2007. - T. 43. - C. 963-970. Khlestkina E.K., Röder M.S., Unger O., Meinel A., Börner A. More precise map position and origin of a durable non-specific adult plant disease resistance against stripe rust (Puccinia striiformis) in wheat // Euphytica. - 2007. - V. 153. - P. 1-10. Varshney R.K., Beier U., Khlestkina E.K., Kota R., Korzun V., Graner A., Börner A. Single nucleotide polymorphisms in rye (Secale cereale L.): discovery, frequency, and applications for genome mapping and diversity studies // Theor. Appl. Genet. - 2007. - V. 114. - P. 11051116. Iqbal N., Eticha F., Khlestkina E.K., Weidner A., Röder M.S., Börner A. The use of simple sequence repeat (SSR) markers to identify and map alien segments carrying genes for effective resistance to leaf rust in bread wheat // Plant Genet. Res. - 2007. - V. 5. - P. 100-103. Khlestkina E.K., Röder M.S., Salina E.A. Relationship between homoeologous regulatory 30 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. and structural genes in allopolyploid genome - a case study in bread wheat // BMC Plant Biol. - 2008. - V. 8. - P. 88. Khlestkina E.K., Giura A., Röder M. S., Börner A. A new gene controlling the flowering response to photoperiod in wheat // Euphytica. - 2009. - V. 165. - P. 579-585. Козлова С.А., Хлесткина E.K., Салина E.A. Особенности применения SNP-маркеров, разработанных для аллополиплоидной пшеницы // Генетика. - 2009. - V. 45. - P. 92-96. Khlestkina E.K., Pshenichnikova T.A., Röder M.S., Börner A. Clustering anthocyanin pigmentation genes in wheat group 7 chromosomes // Cereal Res. Commun. - 2009. - V. 37. P. 391-398. Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Anthocyanin biosynthesis genes location and expression in wheat-rye hybrids // Mol Genet. Genom. - 2009. - V. 282. - P. 475-485. Khlestkina E.K., Salina E.A., Pshenichnikova T.A., Röder M.S., Börner A. Glume coloration in wheat: allelism test, consensus mapping and its association with specific microsatellite allele // Cereal Res. Commun. - 2009. - V. 37. - P. 37-43. Simon M.R., Khlestkina E.K., Castillo N.S., Börner A. Mapping quantitative resistance to septoria tritici blotch in spelt wheat // European J. Plant Pathol. - 2010. - V. 128. - P. 317-324. Khlestkina E.K., Röder M.S., Börner A. Mapping genes controlling anthocyanin pigmentation on the glume and pericarp in tetraploid wheat (Triticum durum L.) // Euphytica. - 2010. - V. 171. - P. 65-69. Khlestkina E.K., Röder M.S., Pshenichnikova T.A., Börner A. Functional diversity at Rc (red coleoptile) locus in wheat (Triticum aestivum L.) // Mol. Breed. - 2010. - V. 25. - P. 125-132. Khlestkina E.K., Kumar U., Röder M.S. Ent-kaurenoic acid oxidase genes in wheat // Mol. Breed. - 2010. - V. 25. - P. 251-258. Khlestkina E.K., Salina E.A., Matthies I., Leonova I.N., Börner A., Röder M.S. Comparative molecular marker-based genetic mapping of flavanone 3-hydroxylase genes in wheat, rye and barley // Euphytica. - 2011. - DOI: 10.1007/s10681-010-0337-2 (Online First). Главы в монографиях 28. 29. Khlestkina E.K., Röder M.S., Pshenichnikova T.A., Simonov A.V., Salina E.A., Börner A. Genes for anthocyanin pigmentation in wheat: review and microsatellite-based mapping // Verrity J.F., Abbington L.E. (Eds.). Chromosome mapping research developments. N.-Y.: NOVA Science Publishers, 2008. - P. 155-175. Khlestkina E.K. Regulatory-target gene relationships in allopolyploid and hybrid genomes // Urbano K.V. (Ed.). Advances in Genetics Research. Vol. 3. N.-Y.: NOVA Science Publishers, 2010. - P. 311-328. Статьи в сборниках научных трудов 30. 31. 32. 33. 34. Хлесткина Е.К. Геномная дактилоскопия отечественных сортов мягкой пшеницы с помощью ДНК-маркеров // Материалы III конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А.Лаврентьеву. Новосибирск, 1-3 декабря 2003. - T. 2. - C. 78-82. Khlestkina E.K., Röder M.S., Unger O., Meinel A., Börner A. Fine mapping and origin of a gene for non-specific adult plant disease resistance against stripe rust (Puccinia striiformis) in wheat // EWAC Newsl. -2003. - V. 12. P. 111-113. Börner A., Khlestkina E.K., Huang X., Chebotar S., Röder M.S. (2004) Genetische Diversität in Kulturpflanzen –Verlust oder Stabilität? // Vortr. Pflanzenzücht. - 2004. - V. 63. P. 199 - 204. Khlestkina E.K., Röder M.S., Efremova T.T., Börner A., Shumny V.K. Siberian wheat germplasm - molecular investigation // Vortr. Pflanzenzücht. - 2004. - V. 63. - P. 51-58. Хлесткина Е.К. Изучение внутри- и межвидового полиморфизма злаков на основе 31 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. микросателлитных маркеров // Материалы IV конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А.Лаврентьеву. Новосибирск, 17-19 ноября, 2004. T. 2. - C. 91-95. Khlestkina E.K., Huang X., Varshney R. K., Chebotar S., Röder M.S., Graner A., Börner A. Comparative studies of genetic diversity in wheat and barley germplasm collected at different time periods // EWAC Newsl. - 2006. - V. 13. - P. 94-97. Khlestkina E.K., Röder M.S., Unger O., Meinel A., Börner A. Non specific adult plant disease resistance against stripe rust (Puccinia striiformis) fine mapping and origin of Yrns-B1 // EWAC Newsl. - 2006. - V. 13. - P. 129-133. Pshenichnikova T.A., Börner A., Dobrovol’skaya O. B., Khlestkina E.K., Röder M., Ermakova M.F. (2006) The use of precise genetic stocks for precise gene mapping: results obtained within EWAC // EWAC Newsl. - 2006. - V. 13. - P. 13-17. Börner A., Korzun V., Khlestkina E.K., Dobrovol’skaya O.B., Pshenichnikova T.A., Castro A.M., Röder M.S. (2006) Genetic stocks in the 21st century - waste or important tool? // EWAC Newsl. - 2006. - V. 13. - P. 17-22. Хлесткина Е.К. Клонирование и анализ ряда структурных генов биосинтеза антоцианов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) // Материалы V конференции молодых ученых СО РАН, посвященной М.А.Лаврентьеву. Новосибирск, 20-22 ноября, 2007. - C. 104-107. Zaynali Nezhad K., Lohwasser U., Khlestkina E.K., Röder M.S. Börner A. Assessment of post anthesis drought tolerance in bread wheat (Triticum aestivum L.) // Vortr. Pflanzenzücht. - 2007. - V. 72. - P. 219-222. Börner A., Korzun V., Khlestkina E.K., Dobrovolskaya O.B., Pshenichnikova T.A., Simon M.R., Röder M.S. Genetic stocks in wheat research - Examples of successful co-operation // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 21-26. Weidner A., Schubert V., Eticha F., Iqbal N., Khlestkina E.K., Röder M.S., Börner A. (2008) Expression and chromosomal location of leaf rust resistance from Aegilops markgrafii introgressed into hexaploid wheat background // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 79-82. Khlestkina E.K., Salina E.A., Tereschenko O.Yu., Leonova I.N., Börner A., Röder M.S. Approach to comparative mapping of structural genes in polyploid wheat and rye // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 33-34. Khlestkina E.K., Pshenichnikova T.A., Salina E.A., Röder M.S., Arbuzova V.S., Börner A. Microsatellite mapping of genes for coloration of different wheat plant organs on homoeologous groups 1 and 7 chromosomes // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 85-90. Khlestkina E.K., Röder M.S., Salina E.A. Flavanone 3-hydroxylase genes in Triticum aestivum L. // Proc. 11th Intern. Wheat Genet. Symp. Brisbane, 24-29 August, 2008. - P. 100. Börner A., Neumann K., Lohwasser U., Röder M.S., Khlestkina E.K., Dobrovolskaya O.B., Pshenichnikova T.A., Martinek P., Simon M.R., Kobiljski B. Germplasm collections as an important tool for breeding - examples on wheat // Proc. Int. Conf. Conventional and molecular breeding of field and vegetable crops. Novi Sad, November 24-27, 2008. - P. 77-82. Ermakova M.F., Chistyakova A.K., Shchukina L.V., Morozova E.V., Khlestkina E.K., Pshenichnikova T.A. The diversity of Siberian bread wheat cultivars on grain quality in dependence of breeding period // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 174-176. Khlestkina E.K., Röder M.S., Börner A. Identification of glume coloration genes in synthetic hexaploid and common wheats. Wheat Inf. Serv. (eWIS). - 2009. - V. 108. - P. 1-3. Tereschenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E.I., Arbuzova V.S., Salina E.A. The genetic basis of anthocyanin biosynthesis in wheat, rye and wheat-rye hybrids under normal and stress conditions // Proc. III Intern. Conf. Modern problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution, dedicated to N.W. Timofeeff-Ressovsky. Alushta, October 9-14, 2010. - P.171-174. 32