На правах рукописи Перепечаева Мария Леонидовна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
advertisement
На правах рукописи Перепечаева Мария Леонидовна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОВ Р450 ПОДСЕМЕЙСТВА 1А В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ХОЛОДА 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Гришанова А.Ю. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук кандидат биологических наук Душкин М.И. Макарова С.И. Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) Защита состоится "___" _______ 2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383)333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научноисследовательского института биохимии СО РАМН Автореферат разослан "___" ____________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 2 Русских Г.С. Актуальность проблемы Воздействие умеренного холода на организм в целом – на уровне поведенческих, метаболических, физиологических реакций достаточно хорошо изучено и описано во множестве работ. Однако только в последние несколько лет процессы, происходящие при воздействии холода, стали активно изучаться на молекулярном уровне. Было выявлено, что воздействие умеренного холода (снижение температуры тела на несколько градусов) на клетки млекопитающих вызывает комплексный ответ, включающий, помимо активации компенсаторных механизмов, таких, как убиквитин-протеосомный путь и синтез белков холодового шока, замедление многих процессов: происходит ингибирование транскрипции большинства генов и трансляции большинства белков, процессинга и деградации РНК, ферментативных реакций (Sonna L.A. et al., 2002; Al-Fageeh M.B., Smales C.M., 2006). В этой связи представляется интересным выявленный в опытах на крысах факт, что на фоне воздействия умеренного холода происходит, напротив, увеличение активности ферментов метаболизма ксенобиотиков, и, в частности, цитохрома P450 1A1 (CYP1A1) (Громова О.А. и др., 2002). Механизм этого явления остается неизвестным. Других сведений о влиянии умеренного холода на индукцию CYP1A у теплокровных животных в литературе нет. Известны только немногочисленные работы по изучению индукции CYP1A при совместном воздействии холода и сильных индукторов CYP1A на рыбах (Kloepper-Sams P.J., Stegeman J.J., 1992; Sleiderink H.M., Boon J.P., 1996). Подсемейство цитохромов CYP1A состоит из двух членов: CYP1A1 и CYP1A2. CYP1A1 конститутивно экспрессируется на очень низком уровне, CYP1A2 - на достаточно высоком, но оба фермента индуцируются при воздействии таких соединений, как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и ариламины, которые являются “классическими” индукторами CYP1A. В последние десятилетия накоплено множество сведений о том, что индукторами CYP1A могут быть не только ксенобиотики типа ПАУ, но и вещества с совершенно иными физико-химическими свойствами, в том числе, эндогенного происхождения (Denison M.S., Nagy S.R., 2003). Физические воздействия тоже способны активировать ферменты метаболизма ксенобиотиков: была показана индукция CYP1A при таких воздействиях, как гидродинамический удар, ультрафиолет, ультразвук, гипероксия (Marin E. et al., 1988; Okamoto T. et al., 1993; Гришанова А.Ю., Зуева Т.В., 2000; Gonzalez M.C. et al., 2001; Monk S.A. et al., 2001; Feng Q. et al., 2002). В ответ на воздействие физических факторов в организме происходит запуск различных биохимических реакций биологически активными веществами, полученными из окружающей среды или освобожденными из физиологических «депо». В случае индукции цитохромов Р450 при 3 действии физических факторов логично предполагать наличие эндогенных медиаторов, опосредующих запуск экспрессии соответствующих генов. Если активация CYP1A2 может осуществляться как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне, то для СYP1A1 на данный момент доказан единственный путь активации: путь сигнальной трансдукции, зависимый от арилгидрокарбонового рецептора (AhR). AhR представляет собой лиганд-активируемый транскрипционный фактор. В неактивном состоянии AhR находится в цитоплазме в комплексе с двумя молекулами Hsp90, кошаперонами и тирозинкиназой c-Src. После связывания с лигандом происходит диссоциация комплекса, перенос AhR в ядро и димеризация с белком Arnt (Ah receptor nuclear translocator, ядерный переносчик арилгидрокарбонового рецептора). Затем гетеродимер AhR/Arnt взаимодействует с элементами, чувствительными к ксенобиотикам (XRE) энхансера гена CYP1A1/2, что приводит к инициации транскрипции CYP1A1/2. Hsp90 поддерживает AhR в конформации, облегчающей взаимодействие с лигандом, но препятствующей связыванию с ДНК. Hsp90 относится к белкам теплового шока и выполняет функцию шаперона. Известно, что Hsp90 растений могут активироваться и при воздействии холода (Krishna P. et al., 1995), но данных о влиянии холода на Hsp90 животных в литературе нет. AhR и Arnt являются фосфопротеинами, поэтому процессы фосфорилирования и дефосфорилирования играют важную роль в Ahрецепторном пути. Известно, что для димеризации Arnt c AhR необходимо фосфорилирование Arnt, а для связывания комплекса AhR/Arnt с ДНК - фосфорилирование AhR и осуществляется оно по тирозиновому остатку (Ma Q., 2001). Ряд литературных источников свидетельствует о том, что ингибиторы тирозиновых киназ (ТК) семейства Src снижают экспрессию CYР1A, при этом аналогичные данные о действии на CYР1A неспецифических ингибиторов ТК противоречивы. Имеющиеся в литературе сведения о влиянии на экспрессию CYР1A ингибиторов ТК получены при работе с клеточными культурами и не могут быть экстраполированы на животных. Литературные данные свидетельствуют также о том, что киназы осуществляют посттрансляционную модификацию некоторых форм цитохромов P450, например, CYP2B1/2 (Oesch-Bartlomowicz B., Oesch F., 2005), однако данных о роли ТК в фосфорилировании CYP1A в литературе нет. Известно, что интенсификация метаболизма в условиях холода приводит к возрастанию уровня окислительных процессов в клетке (Куликов В.Ю. и др., 1998; Шустанова Т.А., и др., 2001; Бородин Е.А. 4 и.др., 1992; Sahin E., Gümüşlü S., 2007). Это может приводить к накоплению в клетке поврежденных белков и к активации протеосомной системы, осуществляющей их деградацию. Протеосомная система также опосредует процесс деградации и негативной регуляции AhR. Известно, что под действием “классических” индукторов CYP1A in vitro наблюдается усиление деградации AhR протеосомами, что обеспечивает отрицательную обратную связь, приводящую к уменьшению периода полужизни AhR и, следовательно, к ослаблению гиперэкспрессии CYP1A (Ma Q., Baldwin K.T., 2000; Santiago-Josefat B.E. et al., 2001). Данных о том, происходит ли аналогичный процесс in vivo, в литературе нет. Цель и задачи исследования Цель данной работы состояла в исследовании механизма, лежащего в основе увеличения активностей цитохромов Р450 подсемейства 1А в печени крыс при воздействии на организм умеренного холода. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить относительное содержание мРНК и количество белка CYP1A в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4°С. 2. Исследовать относительное содержание мРНК, функциональную активность и количество белка AhR в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4°С. 3. Исследовать относительное содержание мРНК Arnt, AhRR и Hsp90 в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4°С. 4. Исследование возможности участия эндогенных соединений в качестве посредников в процессе индукции CYP1A в печени крыс при разной длительности пребывания животных при 4°С. 5. Исследовать возможную роль протеосом и тирозиновых протеинкиназ (используя в качестве инструмента исследования ингибиторы тирозиновых киназ) в активации CYP1A под действием холода. Научная новизна Впервые установлены механизмы индукции CYP1A под действием холода: индуцирующее влияние холода на CYP1A1 реализуется на транскрипционном уровне через AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции, а CYP1A2 - на посттранскрипционном уровне. Впервые выявлено, что при холодовом воздействии происходит снижение экспрессии таких компонентов AhR-сигнального пути, как Arnt и Hsp90. Показано, что эндогенным посредником в процессе регуляции экспрессии CYP1A1 под действием холода может быть токоферол. Показано, что при этом происходит повышение относительного содержания мРНК токоферол-переносящего белка (α-ТПБ), осуществляющего 5 перераспределение токоферола в организме. Впервые показано разнонаправленное изменение активностей протеосом в печени крыс под действием холода: повышение химотрипсиновой и пептидилглутаминпептидгидролазной протеосомных активностей и уменьшение трипсиновой протеосомной активности. Впервые показана взаимосвязь ТК семейства Src с уменьшением активности CYР1A1 в печени крыс, подвергнутых воздействию холода, на посттранскрипционном уровне. ТК (но не семейства Src) связаны с увеличением активности CYР1A2 в печени крыс при воздействии на крыс умеренного холода (4°С) на посттранскрипционном уровне. Научно-практическая значимость По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярного механизма индукции CYP1A в печени крыс под действием холода. Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов активации экспрессии генов CYP1A. Основные положения, выносимые на защиту 1. Воздействие на крыс умеренного холода приводит к увеличению в печени крыс активности CYP1A1 в результате активации транскрипции гена CYP1A1 с вовлечением Ah-рецептор зависимого пути сигнальной трансдукции, а также к увеличению активности CYP1A2, регулируемой на посттранскрипционном уровне. 2. -Токоферол может участвовать в индукции CYP1A1 в печени крыс под действием холода в качестве одного из эндогенных посредников. 3. При воздействии на крыс умеренного холода происходит повышение химотрипсиновой и пептидилглутаминпептидгидролазной протеосомных активностей, и понижение трипсиновой протеосомной активности. 4. К факторам, негативно регулирующим активность CYP1A1 в печени крыс на фоне воздействия холодом, можно отнести ТК. ТК семейства Src уменьшают активность CYР1A1 в печени крыс, подвергнутых воздействию холода, на посттранскрипционном уровне. ТК (но не семейства Src) участвуют в увеличении активности CYР1A2 в печени крыс при воздействии на крыс умеренного холода на посттранскрипционном уровне. Лимитирующими индукцию CYР1A холодом факторами являются Arnt и Hsp90. Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 8-ая Международная Пущинская школаконференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2004; IX Дальневосточная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2005; XIII 2 6 международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов - 2006”, Москва, 2006; девятая Всероссийская медикобиологическая конференция молодых исследователей “Человек и его здоровье”, Санкт-Петербург, 2006; VI Всероссийская конференция молодых ученых “Проблемы фундаментальной и прикладной медицины” в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине, Новосибирск, 2006; международная научная конференция “свободные радикалы, антиоксиданты и старение”, Астрахань, 2006. Публикации По теме диссертации опубликованы 3 статьи и 6 тезисов в сборниках конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 17 таблиц. Список литературы включает 298 источников, в том числе 275 иностранных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на самцах крыс Вистар массой 150-250 грамм (лаборатория разведения животных Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск). Животные содержались в одиночных клетках и получали стандартную лабораторную диету и воду ad libitum. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в “Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей” (Страсбург, 1985). Забой крыс осуществлялся декапитацией, проводился под эфирным наркозом. Для исследования холодового воздействия экспериментальные крысы содержались в одиночных клетках при +4ºС в течение 1, 5 и 10 суток, контрольная группа содержалась в аналогичных клетках при комнатной температуре. Ежедневно проводилось измерение ректальной температуры и массы тела животных. Для исследования воздействия ингибиторов ТК на фоне воздействия холодом все крысы содержались при температуре +4ºС в течение 5 суток. Экспериментальные крысы получали в течение 5 суток генистеин (5 мг/кг веса тела), гербимицин А (33 мкг/кг веса тела) или гелдамицин (50 мкг/кг веса тела) в растворе ДМСО внутрибрюшинно. Контрольная группа получала только раствор ДМСО внутрибрюшинно. Для исследования воздействия ингибиторов ТК на фоне введения бенз(α)пирена (БП) все крысы получали разведенный в масле БП в дозе 5 7 мг/кг в течение первых 4 суток. Экспериментальные крысы получали в течение 5 суток генистеин (5 мг/кг веса тела), гербимицин А (33 мкг/кг веса тела) или гелдамицин (50 мкг/кг веса тела) в растворе ДМСО внутрибрюшинно. Контрольная группа получала раствор ДМСО и масло внутрибрюшинно. Цитозольную фракцию и микросомы печени выделяли при температуре +4C методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в микросомах и цитозоле определяли по методу Лоури c соавторами (Lowry O.U. et al., 1951), общее содержание цитохромов P450 измеряли, как описано Омура и Сато (Omura T., Sato R., 1964). Скорости О-деалкилирования высокоспецифичных субстратов для СYP1A1 и CYP1A2 - 7-этокси- (ЭРОД), и 7-метокси- (МРОД) резоруфинов, соответственно, определяли в микросомах печени флюориметрическим методом по скорости образования резоруфина (Burke M.D. et al, 1985). Активность НАДФН-цитохром P450 редуктазы в микросомах печени определяли по скорости восстановления цитохрома c (Phillips A.H., Langdon R.G., 1962). Активность глутатион-S-трансферазы в цитозоле определяли по скорости образования 2,4динитрофенилглутатиона, используя в качестве акцептора глутатиона 1хлор-2,4-динитробензол, а в качестве стандарта S-2,4динитрофенилглутатитон (Habig W.H. et al, 1974). Для детекции белков CYP1A (в микросомах печени) и AhR (в цитозоле печени) белки разделяли электрофорезом по Laemmli (Laemmli U.K, 1970), переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим способом в дискретной буферной системе на приборе Fastblot “Biometra” (Германия). Мембрану инкубировали с антителами мыши против CYP1A1 и CYP1A2 крысы (Grishanova A.Y., Lyakhovich V.V., 1992) для детекции CYP1A, а для детекции AhR - с антителами козы против AhR крысы (Santa Cruz) и против β-актина крысы (Santa Cruz). Для визуализации иммунореактивных белков использовали набор реактивов ЕxtrAvidin alkaline phosphatase staining kit (Sigma). На каждую дорожку геля наносили одинаковое суммарное количество белка. Суммарную РНК клеток печени выделяли фенольным методом (Chattopadhyay N. et al, 1993) или с помощью набора для выделения РНК фирмы Вектор-Бест. Относительное содержание мРНК CYP1A1, CYP1A2, AhR, Arnt, AhRR, Hsp90, α-TTP определяли методом полуколичественной ОТ-ПЦР. Для синтеза кДНК in vitro брали по 400 нг РНК на пробу. Амплификацию проводили с парами праймеров, специфичными к нуклеотидным последовальностям CYP1A1, CYP1A2, AhR, Arnt, AhRR, Hsp90, α-TTP и генов “домашнего хозяйства”: -актина, GAPDH и rpl29, которые выступали в качестве внутреннего стандарта. ПЦР оптимизировали по числу циклов, концентрации Mg2+, количеству 8 праймеров. Каждую пробу амплифицировали дважды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 6% акриламидном или в 2% агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы “DNA Analyzer” (Москва) и денситометрировали с помощью программы ”Total Lab”. Уровень мРНК оценивали путем отношения оптической плотности продукта ОТ-ПЦР, полученного с использованием специфических праймеров к нуклеотидной последовательности гена, к оптической плотности продукта, полученного с использованием специфических праймеров к генам “домашнего хозяйства”. Экстракт ядер получали по методу Gorski (Gorski K. et al, 1986) в модификации Меркуловой (Меркулова Т.И. и др., 1998). Для получения двуцепочечного зонда 26-нуклеотидные последовательности XRE3 (Denison M.S., Deal R.M., 1990) метили [γ-P32] в реакции кинирования (Маниатис Т. и др, 1984) и гибридизовали. ДНК/белковые комплексы анализировали методом задержки в 6% полиакриламидном геле (Denison M.S., Deal R.M., 1990). Определение малонового диальдегида (МДА) проводили как описано Андреевой (Андреева Л. И., 1988); содержание токоферолов в микросомах печени определяли флюориметрическим методом (Hansen L.G., Warwick W.J., 1970); активности протеосом определяли флюориметрическим методом (Selman C., Grune T., 2002); количество карбонильных групп было определено спектрофотометрическим методом в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Reznick A.Z., Packer L., 1994); содержание общего и конъюгированного билирубина в сыворотке крови крыс определяли набором фирмы Вектор-Бест; содержание кортикостерона в сыворотке крови крыс - радиоиммунным анализом. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica, версия 6.0. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стъюдента и подтверждали U-тестом МанаУитни. Результаты представлены в виде M ± SD или SE, где М – среднее, SD – среднее квадратичное отклонение, SE – стандартная ошибка. Число животных в группе 3-21. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика метаболических процессов у крыс при длительном воздействии умеренно низкой температуры (модель Харта) У крыс были определены некоторые параметры физиологических и обменных процессов, которые, как было показано ранее, меняются при длительном воздействии умеренно низкой температуры (Hart J.S, 1956; Hart J.S, 1963). Такими показателями, в частности, являются изменение массы тела и снижение способности организма поддерживать температуру ядра тела. 9 6 Рисунок 1. Динамика изменения среднесуточной прибавки массы тела контрольных и подвергавшихся воздействию холодом крыс. Приведены средние значения ± SE. * – p < 0,005 – контроль – холод Среднесуточная прибавка массы тела крыс, г. 4 2 0 -2 * 0 суток 5 суток 10 суток Результаты измерения массы контрольных и экспериментальных крыс представлены на рисунке 1. Среднесуточная прибавка массы тела крыс снижалась к 5 суткам пребывания на холоде и восстанавливалась до контрольного уровня к 10 суткам. Такие изменения прибавки массы тела крыс, подвергаемых воздействию холода, согласуются с данными литературы (Hart J.S, 1956; Hart J.S, 1963). Результаты измерения температуры ядра тела контрольных и экспериментальных крыс представлены на рисунке 2. Наблюдалось достоверное снижение температуры ядра тела крыс на 1,1°С к 10 суткам холодового воздействия, что согласуется с данными литературы (Hart J.S, 1956; Hart J.S, 1963). Температура ядра тела крыс, °С 39 38 37 36 35 34 Рисунок 2. Динамика изменения температуры ядра тела крыс, подвергавшихся воздействию холодом. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,005 * контроль 5 суток 10 суток Известно, что интенсификация метаболизма в условиях холода приводит к возрастанию уровня окислительных процессов в клетке. Было исследовано содержание карбонильных групп, которое является показателем интенсивности процессов свободнорадикального окисления белков, и содержание малонового диальдегида, являющееся показателем интенсивности процессов перекисного окисления липидов. Данные об этих показателях, представленные на рисунке 3, показывают, что содержание карбонильных групп через 10 суток воздействия холодом достоверно возрастало в 2,4 раза по сравнению с контролем. Статистически достоверных различий в содержании МДА в микросомах печени крыс не выявлено, хотя наблюдалась тенденция к увеличению МДА на 1 сутки воздействия холодом и снижению ниже контрольного уровня к 10 суткам. Полученные результаты о содержании карбонильных групп соответствуют данным Selman c соавторами (Selman C. et al., 2002), 10 которые выявили нарастание содержания окисленных белков в печени мышей-полевок во время их пребывания на холоде в течение времени от 10 часов до 4,5 суток при температуре от 4º до 10ºС. Увеличение уровня карбонильных групп у мышей-полевок через 4,5 суток сопоставимо с тем, которое мы наблюдаем у крыс на 5 сутки воздействия холодом – около 40%. су то к 10 ко нт р 10 су то к ол ь к су то ок су т 5 ол ь 0 5 2 ко нт р МДА, нмоль/мг белка 120 80 40 0 су тк и Карбонильные группы, нмоль/мг белка * 1 4 Рисунок 3. Содержание карбонильных групп белков в цитозоле печени крыс и содержание МДА в микросомах печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05. Данные о содержании МДА соответствуют полученным ранее в модели Харта данным, свидетельствующим о том, что содержание МДА в микросомах печени крыс не возрастает (Колосова Н.Г и др., 1981). Было определено общее содержание токоферолов в микросомах печени крыс, подвергнутых действию холода. Данные, приведенные в на рисунке 4, показывают, что уровень токоферолов на 1 сутки воздействия холодом не изменялся, но возрастал на 5 и 10 сутки пребывания животных на холоде, причем повышение уровня токоферола происходило несмотря на то, что дополнительно токоферол, кроме содержащегося в их обычном рационе, крысы не получали. Это свидетельствует о мобилизации эндогенных запасов токоферола и/или усиленного его усвоения из пищи под действием холода. Токоферол, мкг/мг белка 0,2 * 0,1 Рисунок 4. Количество токоферола в микросомах печени крыс, подвергнутых воздействию холода. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05. * 0 контроль 5 суток 10 суток Известно, что в перераспределении токоферола между тканями принимают участие глюкокортикоиды (Feingold I.B., 1999). Мы определили содержание кортикостерона в плазме крови крыс, пребывающих на холоде. Результаты измерений, представленные на 11 рисунке 5, показывают, что в сравнении с контрольной группой уровень кортикостерона достоверно увеличивался в 2,1 раза на 5 сутки и в 3 раза на 10 сутки воздействия холода. Наблюдаемое увеличение уровня кортикостерона в плазме крови крыс под действием холода согласуется с данными литературы (Hart J.S, 1963; Dronjak S. et al., 2004). Кортикостерон, мкг/мл ** 0,4 Рисунок 5. Содержание кортикостерона в сыворотке контрольных и экспериментальных крыс. Приведены средние значения ± SD. * p – < 0,05; ** – p < 0,005 * 0,2 ок су т 10 су то к 5 су тк и 1 ко нт ро ль 0 Таким образом, показатели исследованных параметров физиологических и обменных процессов свидетельствуют, что условия содержания экспериментальных животных соответствуют условиям классической модели адаптации организма к длительному воздействию умеренно низкой температуры. Характеристика микросомальной монооксигеназной системы (ММС) печени крыс при холодовом воздействии Для характеристики ММС печени контрольных и подвергаемых воздействию холода крыс было исследовано общее количество цитохромов P450, специфические активности CYP1A1 и CYP1A2, активности НАДФН-цитохром P450 редуктазы и глутатион-Sтрансферазы. Результаты представлены на рисунке 6. Общее содержание цитохромов Р450 при воздействии холодом не изменялось. Активность НАДФН-цитохром P450 редуктазы повышалась по сравнению с контрольным уровнем при действии холода в течение 5 суток в 1,8 раза. Достоверных различий между значениями активности фермента у контрольных животных и крыс, подвергаемых действию холода в течение 1 и 10 суток, выявлено не было. Активность глутатионS-трансферазы снижалась в 1,8 раза при воздействии холодом в течение 1 суток по сравнению с контрольным уровнем; между значениями активности фермента в контрольной и подвергаемых действию холода в течение 1 и 10 суток группах животных достоверных различий выявлено не было. Активности CYP1A1 и CYP1A2 снижались на 1 сутки воздействия холодом в 2,2 и 1,7 раза соответственно. Так как целью нашего исследования было изучение процессов, активирующих, а не ингибирующих индукцию CYP1A, то в дальнейшем процессы, происходящие в организме на 1 сутки воздействия холодом, не исследовались. 12 При действии холода в течение 5 и 10 суток активности CYP1A повышались: активность CYP1A1 – в 2,2 и 2,8 раза при 5- и 10-суточном воздействии холодом соответственно, а активность CYP1A2 – в 2,9 и 3,2 раза при 5- и 10-суточном воздействии холодом соответственно. 1 Общее содержание цитохромов P450, нмоль/мг белка 0,5 0 Контроль 1 су тки 80 60 5 су ток 10 су ток Актив ность НАДФН-цитохром Р450 реду ктазы, нмоль/мин на мг * белка 600 400 40 ** 200 20 0 0 Контроль 600 Актив ность глу татион-S-трансферазы, нмоль/мин на мг белка 1 су тки 5 су ток Контроль 10 су ток Актив ность цитохрома P-450 1A1, пмоль/мин на мг белка 450 **** 5 су ток 10 су ток Актив ность цитохрома P-450 1A2, пмоль/мин на мг белка *** **** *** 400 1 су тки 300 200 150 ** *** 0 0 Контроль 1 су тки 5 су ток 10 су ток Контроль 1 су тки 5 су ток 10 су ток Рисунок 6. Характеристика системы биотрансформации ксенобиотиков печени контрольных и подвергавшихся действию холода крыс. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05, ** – p < 0,005, *** – p < 0,001. **** – p < 0,0001. Для активности ЭРОД и МРОД n=21,9,21,14; для содержания цитохромов n=19,9,13,13; для активности НАДФН-цитохром P450 редуктазы, глутатион-Sтрансферазы n=9,9,7,6 для контрольной группы, групп, подвергавшихся воздействию холодом в течение 1,5,10 суток соответственно. Исследование уровней мРНК CYP1A1 и CYP1A2 и апоферментов CYP1A1 и CYP1A2 в печени крыс при холодовом воздействии Для того чтобы определить механизм повышения активностей CYP1A1 и CYP1A2, наблюдаемых на 5 и 10 сутки воздействия холодом, мы исследовали на этих сроках относительное содержание мРНК СYP1A и уровень апоферментов соответствующих генов в печени крыс. 13 Уровень мРНК CYP1A был рассчитан как отношение оптической плотности продукта ОТ-ПЦР, полученного с использованием специфических праймеров к последовательностям генов CYP1A к оптической плотности продукта, полученного с использованием специфического праймера к последовательности -актина. Полученные данные представлены на рисунке 7. Действие холода сопровождалось увеличением относительного содержания мРНК CYP1A1 в печени крыс, подвергавшихся воздействию холодом в течение 5 и 10 суток, в 37 и в 26 раз соответственно, по сравнению с контрольной группой. Относительное содержание мРНК CYP1A2 достоверно снижалось по сравнению с содержанием в контрольной группе на 5 сутки воздействия холодом в 1,4 раза и к 10 суткам воздействия холодом – в 1,5 раза. Таким образом, действие холода на организм вызывает в печени крыс накопление мРНК, кодирующей CYP1A1 и снижение уровня мРНК, кодирующей CYP1A2. Белок CYP1A1 и CYP1A2 детектировали методом иммуноблот анализа в микросомах печени крыс с использованием моноклональных антител против CYP1A1/1A2 (клон 14H5, Grishanova A.Y., Lyakhovich V.V., 1992). В качестве положительного контроля использовали микросомы печени крыс, индуцированных 3-метилхолантреном. Полученные данные представлены на рисунке 8. 3 мРНК CYP1A1/ мРНК b-актина мРНК CYP1A2/ мРНК b-актина ** 2,5 2 1,5 1 0,5 0 2 ** 1 0 Контроль 5 суток Контроль 10 суток * ** 5 суток 10 суток Рисунок 7. Относительное содержание мРНК генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени крыс, подвергавшихся воздействию холода. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,005, ** – p < 0,001. Для полуколичественного анализа апоферментов электрофоретическому разделению подвергали по 100 мкг микросомного белка из печени контрольных и подвергавшихся холодовому воздействию крыс. CYP1A1 обнаруживался в микросомах печени крыс, подвергавшихся действию холода в течение 5 и 10 суток, и содержание его увеличивалось во времени. В контрольной группе и в группе животных, находившихся под действием холода в течение 1 суток, апофермент CYP1A1 обнаружен не был. CYP1A2 был зарегистрирован в микросомах печени крыс как контрольной, так и экспериментальных 14 групп, причем длительность воздействия холодом влияет интенсивность полосы, соответствующей CYP1A2, увеличивая ее. 1 2 3 4 5 на CYP1A1 CYP1A2 К ___________Холод______________ 1 сутки 5 суток МХ 10 суток Рисунок 8. Иммуноблот микросомных белков печени крыс с использованием моноклональных антител против CYP1A1/1A2 (клон 14Н5, Grishanova A.Y., Lyakhovich V.V., 1992). Дорожки: 1 – микросомы печени контрольных животных; 2–4 – микросомы печени крыс после холодового воздействия; 5 – микросомы печени крыс, индуцированных 3–метилхолантреном. На дорожки 1–4 было нанесено по 100 мкг микросомного белка, на дорожку 5 – 30 мкг микросомного белка. Таким образом, действие на организм холода приводит к появлению апофермента СYP1A1 и к увеличению содержания апофермента СYP1A2 в печени крыс. В настоящее время единственным доказанным механизмом индукции CYP1A1 является AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции (Ma Q., 2001). Индукция CYP1A2 по данным ряда исследователей возможна как с участием AhR, так и может быть опосредована другими факторами (Adams N.H., 1993; Quattrochi L.C. et al., 1994; Ryu D.Y. et al., 1997). Полученные нами данные об изменении относительного содержания мРНК СYP1A1 и CYP1A2 и апоферментов, кодируемых соответствующими генами, позволяют заключить, что индукция СYP1A1 в печени крыс под действием холода происходит в результате транскрипционной активации гена, а индукция СYP1A2 опосредуется посттранскрипционными механизмами. Исследование активности протеосом при действии холода Активация транскрипции гена CYP1A1 происходит с участием лиганд-активируемого транскрипционного фактора – AhR. Ускорение или замедление деградации белка AhR может быть одним из факторов, обеспечивающих регуляцию экспрессии CYP1A1. Показано, что на индукцию CYP1A1 “классическими” лигандами AhR влияют протеосомы (Ma Q., Baldwin K.T 2000). Для выяснения возможного участия протеосом в регуляции экспрессии CYP1A1 в печени крыс под действием холода были исследованы активности 20S протеосом (пептидилглутаминпептидгидролазная, трипсиновая и химотрипсиновая) в цитозоле печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. 15 Из результатов, представленных на рисунке 9, видно, что протеосомные активности по-разному изменяются на фоне воздействия холодом. Так, пептидилглутамин-пептидгидролазная активность достоверно возрастала в 2 раза, а трипсиновая активность достоверно снижалась на 10-е сутки воздействия холодом по сравнению с контрольной группой. Химотрипсиновая активность увеличивалась в 3,4 раза как на 5-е, так и на 10-е сутки воздействия холодом. пептидилглутаминовая протеосомная активность трипсиновая протеосомная активность ** 8 4 су то к 10 ут ок су то к 10 су то к ль 0 5 10 5 активность 0 тр о су то к тр о Ко н су то к активность ль 0 * 20 Ко н * 20 ** 12 5с 40 ль 40 16 нт ро 60 ко 60 химотрипсиновая протеосомная активность Рисунок 9. Протеосомные активности в цитозоле крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,01; ** – p < 0,0005. Таким образом, при воздействии холодом на крыс две протеосомные активности в печени увеличивались и одна – снижалась. Такие данные о разнонаправленном изменении активности 20S протеосом не дают возможности однозначно говорить о влиянии протеосом на уровень белка AhR в печени крыс при их длительном пребывании на холоде. Исследование влияния холода на экспрессию основных компонентов AhR-сигнального пути Для более полного понимания молекулярных механизмов индукции CYP1A1 в печени крыс под действием холода было исследовано влияние длительного пребывания крыс на холоде на экспрессию основных компонентов AhR-сигнального пути трансдукции: Hsp90, Arnt, репрессора AhR (AhRR) и на экспрессию AhR. Данные, представленные на рисунке 10(А), показывают, что под действием холода относительное содержание мРНК Нsp90 уменьшалось на 5 и 10 сутки воздействия холодом в 1,7 и 1,8 раза соответственно. Данные об относительном содержании мРНК AhR на разных сроках воздействия холодом, представленные на рисунке 10(Б), показывают, что относительное содержание мРНК АhR в печени крыс под действием холода не изменяется. 16 су то к Б 10 5 Ко нт ро ль А су то к 0 су то к 0,4 1,2 0,8 0,4 0 ** 10 * су то к 0,8 мРНК АhR/мРНК GAPDH 5 мРНК Нsp90 /мРНК GAPDH Ко нт ро ль 1,2 Рисунок 10. Относительное содержание мРНК Нsp90 (А) и мРНК AhR (Б) в печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05. ** – p < 0,005. Результаты иммуноблот анализа белка AhR в цитозоле печени крыс, представленные на рисунке 11 (А и Б), показывают, что количество AhR в цитозоле под действием холода не изменяется Рисунок 11. (А) – Иммуноблот цитозольных белков печени крыс с AhR А использованием антител против AhR и β-актина. Дорожки 1 – β-актин цитозоль печени контрольных 6 животных; 2 – экстракт ядер печени 4 крыс после воздействия холодом в течение 5 суток; 3 – экстракт ядер 2 Б печени крыс после воздействия 0 холодом в течение 10 суток. На 1 2 3 дорожки было нанесено по 100-150 мкг цитозольного белка. (Б) – Количество AhR было рассчитано как отношение оптической плотности продукта, полученного с использованием антител против AhR к оптической плотности продукта, полученного с использованием антител против β-актина. 2 3 AhR / β-актин 1 Результаты исследования относительного содержания мРНК Arnt и AhRR представлены на рисунке 12 (А и Б). мРНК AhRR/мРНК βактина 0,3 ** 0,2 0,1 су то к 10 су то к 5 -0,1 Ко нт ро ль су то к Б 10 су то к 0 5 А мРНК Аrnt/мРНК βактина * Ко нт ро ль 2 1,5 1 0,5 0 Рисунок 12. Относительное содержание мРНК Аrnt (А) и мРНК AhRR (Б) в печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05; ** – p < 0,005. 17 Данные, представленные на рисунке 12 (А), показывают, что и на 5 и на 10 сутки воздействия холодом в печени крыс происходит уменьшение относительного содержания мРНК Аrnt в 1,2 и 1,8 раза соответственно. Данные, представленные на рисунке 12(Б), показывают, что под действием холода относительное содержание мРНК AhRR в печени крыс не изменяется. Таким образом, холодовое воздействие на крыс не влияет на экспрессию в их печени ключевого транскрипционного фактора – AhR, регулирующего транскрипцию CYP1A1, а также на экспрессию AhRR. Однако экспрессия в печени двух других компонентов AhR-зависимого сигнального пути – Hsp90 и Arnt, при холодовом воздействии на крыс ингибируется. Исследование влияния ингибиторов тирозинкиназ (ТК) на активность CYP1A на фоне холодового воздействия AhR и Arnt являются фосфопротеинами. Фосфорилирование AhR необходимо для связывания комплекса AhR/Arnt с ДНК, а фосфорилирование Arnt – для димеризации с AhR (Ma Q., 2001). Фосфорилирование AhR осуществляется по тирозиновому остатку при участии ТК, в частности, в процессе индукции CYP1A1 омепразолом (Lemaire G. et al., 2004). Показано, что в функционировании сигнального пути AhR принимает участие ТК c-Src. (Park S., Henry E.C. et al., 2000). cSrc протеинкиназа является интегральным компонентом комплекса AhRhsp90 в цитозоле, и при связывании лиганда с AhR c-Src активируется и освобождается из комплекса (Enan E., Matsumura F., 1996). Для изучения роли ТК в индукции CYP1A под действием холода, исследовали влияние на активность CYP1A и мРНК CYP1A ингибиторов ТК – неспецифического конкурентного ингибитора ТК генистеина и ингибиторов ТК семейства Src гербимицина А и гелданамицина, которые одновременно являются ингибиторами Hsp90. Результаты представлены на рисунке 13. Генистеин не изменял активность CYP1A1, индуцированную холодом, однако вызывал повышение уровня мРНК CYP1A1 в 1,7 раза. Активность CYP1A2 под действием генистеина снижалась в 1,7 раза, а уровень мРНК CYP1A2 не изменялся. Активность CYP1A1 под действием гербимицина А и гелданамицина на фоне воздействия холодом возрастала в 1,6 и 3,1 раза соответственно, в то время как уровень мРНК CYP1A1 при этом не изменялся. На активность CYP1A2 и на уровень мРНК CYP1A2 в печени крыс, находящихся на холоде, ни гербимицин А, ни гелданамицин не влияли. 18 CYP 1A2 т о к Х о л о д 200 5 128 100 123 114 100 иц ин еи иц ин ам ко ге лд ан н 0 рб им еи н рб им иц ге ин лд ан ам иц ин 300 ге ге ко ни ст ль 0 CYP 1A2 ге 100 с у т о к ни ст 117 5 ль 105 100 0 мРНК CYP 1А2/ мРНК бета-aктинa, % 200 93 50 Х о л о д с у т о к * 172 300 100 ге 5 CYP 1A1 нт ро мРНК CYP 1А1/ мРНК бета-aктинa, % Х о л о д 72 * 58 ко нт ро ль ге ни ст еи н ге рб им иц ин ге лд ан ам иц ин 0 100 150 нт ро 124 100 200 ге ни ст еи н ге рб им иц ин ге лд ан ам иц ин * 163 400 200 Aктивность, % * 310 600 ко нт ро ль Aктивность, % CYP 1A1 с у т о к Х о л о д 5 с у т о к т о13. кАктивность и относительное содержание т о к мРНК CYР1A при введении Рисунок генистеина, гербимицина и гелданамицина на фоне 5 суток воздействия холодом. Результаты выражены в процентах по отношению к контрольному уровню. Контрольная группа – крысы, подвергшиеся холодовому воздействию в течение 5 суток и получавшие ДМСО. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05. На фоне введения БП – “классического” индуктора CYР1A, ингибиторы ТК, в отличие от их действия на фоне холода, не влияли ни на активность CYР1A, ни на относительное содержание мРНК CYР1A. Результаты представлены на рис. 14. 19 ми ци н A ге 124 87 100 50 0 БП + + БП + ге ни ст ге ни ст БП 95 100 БП еи н ге рб им иц БП ин + А ге лд ан ам иц ин 0 150 ге рб им иц БП ин + А ге лд ан ам иц ин 50 200 еи н 100 + БП БП мРНК СYP 1A2 / мРНК бета-актин, % 125 80 БП рб им ни ге БП + БП CYP 1A2 120 100 БП мРНК СYP 1A1 / мРНК бета-актин, % 150 лд ан а ст еи БП ми ци н ге ге + БП 0 + рб им иц ин ст еи ни ге + БП 50 CYP 1A1 200 80 100 лд ан а н A 0 83 иц ин 50 122 100 150 + 100 200 н 123 ге 118 + 150 100 150 CYP 1A2 Активность, % 200 БП Активность, % CYP 1A1 Рисунок 14. Активность и относительное содержание мРНК CYР1A при введении генистеина, гербимицина А и гелданамицина в течение 5 суток на фоне введения БП в дозе 5 мг/кг. Результаты выражены в процентах по отношению к контрольному уровню. Контрольная группа получала ДМСО и масло. Приведены средние значения ± SD. Исследование влияния холода на ДНК-связывающую способность AhR в печени крыс Для доказательства AhR-зависимого механизма индукции CYP1A1 в печени крыс под действием холода была исследована функциональная активность AhR. Появление ДНК-связывающей формы AhR в печени крыс выявляли с помощью метода гель-ретардации. На рисунке 15(A) представлен радиоавтограф электрофоретического распределения в 6 % ПААГ 32Р-меченого XRE3, инкубированного с экстрактами белков ядер клеток печени контрольных и подвергнутых действию холода в течение 5 либо 10 суток крыс. В качестве положительного контроля использовали экстракты ядер клеток печени крыс, получавших классический индуктор CYP1A – БП. Интенсивность засветки полосы, соответствующей ДНКбелковому комплексу, образованному активной формой димера AhR/Arnt 20 и 32Р-меченным XRE3, увеличивалась у крыс, подвергнутых воздействию холода в течение 5 и 10 суток. Для доказательства специфичности комплексов, образованных 32 Р-меченным XRE3 и белками ядерных экстрактов, проводили их истощение немеченными олигонуклеотидами: XRE3. Полученные данные, представленные на рисунке 15 (Б), свидетельствуют о специфичности исследуемых комплексов, так как они ослабляются или исчезают при добавлении XRE3. 32Р-XRE3 32Р-XRE3 К К Холод 5с БП Холод 10с __________ ___________ + БП + XRE3 - + + + + + + + + х20 х50 х75 х100 AhR/Arnt/ 32 Р-XRE3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Б A Рисунок 15. А – Радиоавтограф электрофореграммы, полученный после электрофореза в 6% ПААГ 32Р-меченного XRE3, инкубированного с белками ядер клеток печени крыс контрольных (К), подвергнутых холодовому воздействию и получавших бензо(α)пирен (БП). 32Р-меченный XRE3 присутствует во всех дорожках. Дорожки: 1 – 32Р-меченный XRE3, 2,3 – печень контрольных крыс; 4–6 – печень крыс после воздействия холодом в течение 5 суток, 7 – печень крыс, индуцированных БП, 8–10 – печень крыс после воздействия холодом в течение 10 суток. Б – Радиограф электрофоретического разделения в 6% ПААГ 32 Рмеченного XRE3, инкубированного с белками ядер клеток печени крыс, индуцированных БП. 32Р-меченный XRE3 присутствует во всех дорожках. Числами указан избыток немеченного олигонуклеотида. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что транскрипционная индукция CYP1A1 опосредуется через Ahрецепторный путь сигнальной трансдукции. 21 Исследование содержания токоферола в печени и билирубина в сыворотке крови крыс под действием холода Исследование того, какие эндогенные вещества могут опосредовать процесс индукции СYP1A1, возможно, в качестве лигандов AhR, проводилось на основе ранее полученных данных о том, что токоферол (Сидорова Ю.А., 2005) и билирубин (Гришанова А.Ю., Зуева Т.В., 2000) способны осуществлять транскрипционную активацию CYP1A1. В печени контрольных и экспериментальных животных было измерено содержание билирубина в сыворотке крови, и токоферола в микросомах печени. Результаты представлены на рисунке 16 (А, Б). Токоферол, мкг/мг белка 0,2 * 15 * 10 0,1 А Билирубин, мкмоль/л * 5 0 контроль 5 суток Б 10 суток 0 Контроль 5 суток 10 суток Рисунок 16. Количество токоферола в микросомах печени и билирубина в сыворотке крови крыс, подвергнутых воздействию холода. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,05; ** – p < 0,01 Токоферол, мкг/мг белка Из рисунка 16 видно, что содержание билирубина через 5 суток достоверно не изменялось и увеличивалось только на 10 сутки воздействия холодом в 1,7 раза. Уровень токоферола возрастал на 5 и 10 сутки эксперимента в 6 и 15 раз, соответственно. 0,22 0,14 0,06 -0,02 0 200 400 600 800 Рисунок 17. Корреляция между между содержанием токоферола и активностью CYP1A1 в микросомах печени крыс. Коффициент корреляции для токоферола и ЭРОД составил r = 0,63; p < 0,05. ЭРОД, пкмоль/мин на мг белка На рисунке 17 представлены результаты корреляционного анализа между содержанием токоферола и активностью CYP1A1, который показывает, что между исследуемыми параметрами существует корреляция (r = 0,63; р<0,05). 22 Транспорт α-токоферола происходит с участием недавно обнаруженных токоферол-ассоциированных белков, к которым относится α-ТПБ. Была исследована экспрессия α-TПБ в печени контрольных и экспериментальных крыс. Результаты представлены на рисунке 18. 0,8 мРНК α-TTБ/ мРНК rpl29 * Рисунок 18. Относительное содержание мРНК α-TПБ в печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию. Приведены средние значения ± SD. * – p < 0,00005 0,4 су то к 10 су то к 5 су тк и в 1 ча со 5 Ко нт ро л ь 0 Относительное содержание мРНК α-TПБ в печени крыс, подвергавшихся холодовому воздействию в течение 5 суток, возрастало в 1,4 раза. При других сроках холодового воздействия достоверных различий выявлено не было. Возрастание относительного содержания мРНК α-ТПБ в печени на 5 сутки действия холода может объясняться тем, что в этот период времени происходит интенсивное перераспределение токоферола в организме, для обеспечения которого необходимо повышение количества токоферол-транспортных белков. Снижение экспрессии α-ТПБ к 10 суткам холодового воздействия говорит о том, что произошло достаточное накопление токоферола в клетке, чтобы запустились механизмы обратной связи, уменьшающие экспрессию αТПБ. Не ясно, является ли повышение активности CYP1A “побочным“ явлением при адаптации организма к холоду, или оно выполняет какую-то физиологическую функцию. Миллионы лет назад ксенобиотиков типа ПАУ не существовало, и небольшое увеличение активности цитохромов P450 могло значимо не сказываться на состоянии организма в такой ситуации, когда ему более важно приспособиться к охлаждению. Тогда можно было бы сделать вывод о том, что ответ организма на длительное воздействие умеренного холода не представляет собой набор только адаптивных физиологических и биохимических реакций, целью которых является приспособление к неблагоприятному фактору окружающей среды. Так как все процессы в организме тесно связаны между собой, в том числе на уровне молекулярных механизмов регуляции, неудивительно, что при воздействии холода может происходить и множество процессов, не имеющих прямого отношения к адаптивным реакциям на охлаждение. 23 Физиологический смысл повышения активности CYP1A при длительном воздействии умеренного холода, возможно, существует, но пока трудно найти объяснение этому явлению. В литературе появляется все больше информации об эндогенных индукторах CYP1A, однако, физиологическая роль такой индукции CYP1A пока не ясна. Можно предположить, что такие соединения важны для адаптации к холоду сердечно-сосудистой системы, так как известно, что CYP1A метаболизируют арахидоновую кислоту до веществ, играющих важную роль в регуляции сердечно-сосудистой системы. В данной работе мы исследовали не следствия увеличения активности цитохромов 1А под действием холода, а его причину и молекулярный механизм. Результаты проведенного нами исследования подтвердили данные о том, что воздействие холодом приводит к активации цитохромов CYP1A, и прояснили механизм их активации. Оказалось, что CYP1A1 под действием холода активируется на транскрипционном уровне с участием AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции, а CYP1A2 – на посттранскрипционном уровне. Подтвердилось предположение о том, что роль эндогенных посредников в процессе индукции CYP1A1 могут играть токоферол и билирубин. Выяснилось, что лимитирующими факторами, обеспечивающими невысокую степень индукции CYP1A1 под действием холода, могут быть тирозиновые киназы и компоненты AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции. Таким образом, представленные результаты важны как для понимания механизмов активации экспрессии генов CYP1A, так и для понимания молекулярных процессов, происходящих в организме при действии умеренного холода. 1. 2. 3. ВЫВОДЫ Воздействие умеренного холода (4°С) приводит к увеличению в печени крыс активности CYP1A1 через 5 и 10 суток в результате активации транскрипции гена CYP1A1 с вовлечением Ah-рецептор зависимого пути сигнальной трансдукции. При воздействии на крыс умеренного холода (4°С) в течение 5 и 10 суток в печени животных относительное содержание мРНК компонентов AhR-сигнального пути, таких как AhR и репрессор AhR (AhRR), не изменяется, а ядерного переносчика AhR (Arnt) и Hsp90 уменьшается. Воздействие на крыс умеренного холода (4°С) в течение 5 и 10 суток приводит к увеличению в печени животных активности CYP1A2, которое регулируется на посттранскрипционном уровне. 24 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. Корреляционный анализ взаимосвязи между содержанием токоферолов и активностью CYP1A1 в совокупности с данными об увеличении экспрессии α-ТПБ позволяет предполагать участие αтокоферола в регуляции активности CYP1A1. При воздействии на крыс умеренного холода (4°С) происходит повышение химотрипсиновой и пептидилглутаминпептидгидролазной протеосомных активностей и уменьшение трипсиновой протеосомной активности. Данные об изменении активности CYР1A и относительного содержания мРНК CYР1A при одновременном действии холода (4°С) и ингибиторов тирозиновых киназ свидетельствуют о том, что тирозиновые протеинкиназы семейства Src участвуют в уменьшении активности CYР1A1 в печени крыс, подвергнутых воздействию холода, на посттранскрипционном уровне. Тирозиновые протеинкиназы (но не семейства Src) участвуют в увеличении активности CYР1A2 в печени крыс при воздействии на крыс умеренного холода (4°С) на посттранскрипционном уровне. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Громова О.А., Гришанова А.Ю., Перепечаева М.Л., Колосова Н.Г., Колпаков А.Р. Влияние длительного холодового воздействия на активность цитохром Р450 содержащих монооксигеназ и глутатион-Sтрансферазы в микросомах печени крыс. // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. – 2004. – Т.137. – N 9. – C. 268-271. Перепечаева М.Л., Сидорова Ю.А., Гришанова А.Ю. Влияние холодового стресса на экспрессию генов AhR-зависимого пути регуляции CYP1 в печени крыс // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2006. – Т. 141. – N 3. – С. 287–291. Перепечаева М.Л., Колосова Н.Г., Гришанова А.Ю. Активности 20S протеосом и уровень окисленных белков в печени крыс при длительном воздействии холода // Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. – 2006. – Т.142. – N 2. – C. 182-185. Перепечаева М.Л., Сидорова Ю.А., Колосова Н.Г., Гришанова А.Ю. Индукция цитохромов P450 1А1 и 1А2 печени крыс при холодовом стрессе. // 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука 21 века”, Пущино. – 2004. – C. 64. Перепечаева М.Л., Сидорова Ю.А., Гришанова А.Ю. Исследование взаимосвязи между активностями 20S протеосомы и индукцией цитохрома Р450 1A1 на фоне воздействия холодом. // IX Дальневосточная школа-конф. по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток. – 2005. – С. 44. 25 6. 7. 8. 9. Перепечаева М.Л. Токоферол как возможный эндогенный посредник в активации цитохрома P450 1А1 под действием холода. // XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов - 2006”, Москва. – 2006. – C. 178. Перепечаева М.Л. Токоферол-транспортный белок как возможный маркер стресса. // Девятая Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей “Человек и его здоровье”, Санкт-Петербург. – 2006. – С.257-258. Перепечаева М.Л. Содержание окисленных белков и активности 20S протеосом в печени крыс при длительном воздействии холода. // VI Всероссийская конференция молодых ученых “Проблемы фундаментальной и прикладной медицины” в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине, Новосибирск. – 2006. – C. 44. Колосова Н.Г., Гришанова А.Ю. Перепечаева М.Л., Колпаков А.Р. αТокоферол в адаптивных реакциях на холод. // Международная научная конференция “Свободные радикалы, антиоксиданты и старение”, Астрахань - 2006. – С.76-77. Список используемых сокращений AhR – арилгидрокарбоновый рецептор AhRR – репрессор арилгидрокарбонового рецептора Arnt – ядерный переносчик арилгидрокарбонового рецептора CYP – цитохром P450 XRE – элемент, чувствительный к ксенобиотикам α-ТПБ - α-токоферол-переносящий белок БП – бенз(α)пирен ДМСО - диметилсульфоксид МДА – малоновый диальдегид ММС – микросомальная монооксигеназная система мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота МРОД – метоксирезоруфин-О-деметилазная активность ОТ–ПЦР – обратно-транскриптазная полимеразно-цепная реакция ПАУ – полициклические ароматические углевовороды ТК тирозиновая киназа ЭРОД – этоксирезоруфин-О-деэтилазная активность Соискатель Перепечаева М.Л. 26