МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КАБИНЕТ ПО СРЕДНЕМУ И ВЫСШЕМУ МЕДИЦИНСКОМУ ОБРАЗОВАНИЮ ВТОРОЙ ТАШКЕНТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРОЦЕССОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ (Методическое пособие) Ташкент 2005 Кафедра биоорганической и биологической химии Второго Ташкентского Государственного медицинского института Составители: Иноятова Ф.Х., профессор кафедры биоорганической и биологической химии, д.б.н. Эргашов А.Т., ассистент кафедры биоорганической и биологической химии. Орипов О.А., ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики ТашИУВ, к.м.н. Рецензенты: Собирова Р.А., заведующий кафедры биоорганической и биологической химии, фармакологии Второго ТашГосМИ, д.м.н., профессор Арипов А.Н., заведующий кафедры клинической лабораторной диагностики Института Усовершенствования врачей, д.м.н., профессор Методическое пособие к лабораторным занятиям по биологической химии. Предназначено для резидентов и студентов медицинских институтов. В ней даны теоретические основы процессов биотрансформации, рецепторы, взаимодействие, цитохром Р450-зависимая монооксигеназная система, процессы конъюгации, их медицинское значение, а также контрольные вопросы и упражнения по заданной теме. 2 Почему необходима биотрансформация ксенобиотиков Чужеродные соединения, не используемые в качестве пластического материала или в качестве источника энергии, называются ксенобиотиками. Они поступают через дыхательные пути, кожу, желудочно-кишечный тракт и в печени подвергаются обезвреживанию. Образующиеся в процессе метаболизма некоторые метаболиты являются токсичными. Однако организм располагает эффективным механизмом инактивации и выведения чужеродных веществ путем биохимической трансформации. Механизм превращения чужеродных веществ в сущности аналогичен ферментативной модификации обычных эндогенных субстратов, таких как желчные пигменты и стероиды. Биотрансформация происходит главным образом в печени. Почечная экскреция играет кардинальную роль в прекращении биологического действия очень незначительного числа ксенобиотиков, преимущественно представленных малыми молекулами или поляризованных благодаря функциональным группам, полностью ионизированным при физиологических значениях рН. Большинство ксенобиотиков лишены этих физико-химических свойств. Альтернативный процесс, который может привести к прекращению или изменению биологической активности, метаболизм ксенобиотиков. Как правило, липофильные ксенобиотики превращаются в более полярные и, следовательно, более легко экскретируемые вещества. Роль, которую метаболизация играет в инактивации жирорастворимых веществ, весьма важна. Метаболические продукты часто менее фармакодинамически активны, чем их вещества-прародители, и даже могут быть неактивны. Однако некоторые метаболиты имеют повышенную активность или токсические свойства, в том числе мутагенные, тератогенные, канцерогенные. Заслуживает внимания то обстоятельство, что в синтезе таких эндогенных субстратов как стероидные гормоны, холестерин и желчные кислоты, участвуют многие ферменты, связанные с метаболизмом ксенобиотиков. То же относится к образованию и экскреции эндогенных метаболитов, в частности билирубина – конечного метаболита гема. Роль биотрансформации в инактивации ксенобиотиков Большинство метаболических превращений происходит на участке между всасыванием ксенобиотиков в системный кровоток и его почечной элиминацией. Незначительная трансформация происходит в просвете или в стенке кишечника. В целом все эти реакции могут быть отнесены к одной из двух категорий реакций, обозначаемых как фаза I и фаза II (рис.1). I фаза (модификация). Реакции I фазы осуществляются путем введения в неполярную молекулу функциональных групп или модификации уже 3 имеющихся функциональных групп (-ОН, -NH2, -SH). Как правило, это влечет за собой увеличение полярности молекулы и уменьшение биологической активности или токсичности. Однако в ряде случаев чужеродные вещества (некоторые лекарственные вещества и канцерогены) приобретают биологическую активность именно в результате подобного рода модификации. 4 Рис. 1 Этапы биотрансформации ксенобиотиков. К наиболее важным реакциям типа I относятся следующие: 5 Гидролитическое расщепление (гидролиз) эфиров и пептидов. В качестве примера на схеме приводится гидролиз болеутоляющего средства, ацитилсалициловой кислоты (рис.2). Рис.2. Гидролитическое расщепление ацетилсалициловой кислоты. Реакции окисления: гидроксилирование, введение эпоксидной группы, оброзование сульфоксидов , дезалкилирование, дезаминироание. Реакции восстановления: восстановление карбонильной группы, азо- или нитросоединений, дегалогенирование. Реакции метилирования: в качестве примера можно привести инактивацию катехоламина норадреналина (рис.3). Рис.3. Метилирование норадреналина. Реакции десульфирование. 6 Эти метаболиты часто неактивны, хотя в некоторых случаях активность не исчезает, а только изменяется. Если метаболиты фазы I достаточно полярны, они могут легко экскретироваться. Однако многие из них не элиминируются и подвергаются последующей трансформации, в ходе которой соединяются с эндогенными глюкуроновой, серной, уксусной кислотами или аминокислотами, формируя высокополярный конъюгат. Подобная конъюгация является отличительным признаком фазы II метаболизма. Огромное количество ксенобиотиков подвергаются последовательно реакциям I и II фаз биорансформации, хотя в некоторых случаях исходное вещество обладает функциональной группой, которая может прямо вступать в конъюгацию. Например, известно, что гидразидный радикал изониазида образует N-ацетилконъюгат в реакции фазы II. Этот конъюгат является далее субстратом для реакции по типу фазы I, а именно, гидролиза до изоникотиновой кислоты. Таким образом, реакции фазы II могут предшествовать реакциям фазы I. Где происходит биотрансформация ксенобиотиков? Хотя многие ткани способны метаболизировать ксенобиотики, главным органом метаболизма лекарств является печень. К другим тканям, отличающимся существенной активностью, относятся желудочно-кишечный тракт, легкие, кожа и почки. После попадания в организм ксенобиотики всасываются в тонком кишечнике неразрушенными и транспортируются через портальную систему в печень, где они подвергаются активному метаболизму. Этот процесс получил название эффект первого прохождения. Некоторые соединения, принимаемые перорально (например, клоназепам, хлорпромазин), более интенсивно метаболизируются в кишечнике, чем в печени. Следовательно, кишечный метаболизм может вносить свой вклад в общий эффект первого прохождения. Этот эффект может столь заметно ограничивать биодоступность соединений. Хотя биотрансформация ксенобиотиков in vivo может осуществляться путем спонтанных некатализируемых химических реакций, громадное большинство соединений катализируются с помощью специфических клеточных ферментов. На субклеточном уровне эти ферменты могут располагаться в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, цитозоле, лизосомах или даже в ядре или плазматической мембране. Микросомальная система оксидаз со смешанной функцией Многие ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, располагаются на липофильных мембранах эндоплазматического ретикулума печени и других тканей. Когда эти пластинчатые мембраны изолируют путем гомогенизации и фракционирования клетки, они преобразуются в везикулы, называемые микросомами. Микросомы сохраняют большинство морфологических и функциональных характеристик инактивных мембран, включая свойство шероховатости или гладкости поверхности, соответственно у шероховатого (рибосомального) и гладкого (нерибосомального) эндоплазматического ретикулума. В то время как шероховатые микросомы в основном связаны с синтезом, гладкие относительно богаты ферментами, ответственными за 7 окислительный метаболизм лекарств. В частности, они содержат важный класс ферментов, известный как оксидазы со смешанной функцией (ОСФ), или монооксигеназы (рис.4). Активность этих ферментов требует присутствия как восстанавливающего агента (НАДФ·Н), так и молекулярного кислорода. При типичной реакции расходуется (восстанавливается) одна молекула кислорода на молекулу субстрата, и один кислородный атом появляется в продукте реакции, а другой – в форме воды. Рис.4. Цикл цитохрома Р-450 в окислении лекарств (R-H – исходное вещество, R-OH – окисленный метаболит, е- - электрон). В этом окислительно–восстановительном процессе ключевую роль играют два микросомальных фермента. Первый из них флавопротеин НАДФ·Нцитохром Р-450-редуктаза. Один моль этого фермента содержит по одному молю флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поскольку цитохром С может служить акцептором электрона, фермент часто обозначают как НАДФ-цитохром С-редуктазу. Второй микросомальный 8 фермент – гемопротеин, называемый цитохромом Р-450, выполняет роль конечной оксидазы. В действительности микросомальная мембрана содержит множество форм этого гемопротеина, и эта множественность возрастает при повторном введении экзогенных химических веществ. Название цитохром Р450 связано с особыми свойствами этого гемопротеина. В восстановленной форме он связывает моноксид углерода с образованием комплекса с максимальным поглощением света цитохрома Р-450 по сравнению с редуктазой печени делает процесс восстановления гема цитохрома Р-450 лимитирующей стадией в процессе окисления ксенобиотиков в печени. Окисленный (Fe3+) цитохром Р-450 соединяется субстратом с образованием бинарного комплекса (этап ←). НАДФ·Н является донором электрона для флавопротеинредуктазы, которая, в свою очередь, восстанавливает окисленный комплекс цитохром Р-450-лекарство (этап ↑). Второй электрон переходит от НАДФ·Н через ту же флавопротеинредуктазу, которая восстанавливает молекулярный кислород и формирует комплекс «активированный кислород»-цитохром Р-450-субстрат (этап →). Этот комплекс переносит «активированный» кислород на субстрат с образованием окисленного продукта (этап ↓). Данный процесс протекает следующим образом: (рис.4): 1. Цитохром Р-450 (Fe2+) соединяясь с субстратом (S) образует ферментсубстратный комплекс. 2. Находящееся в составе цитохрома Р-450 Fe2+, восстанавливается. Данная реакция протекает при участии НАДФН-редуктазы, обеспечивающей присоединение к фермент-субстратному комплексу кислорода. 3. Один атом кислорода внедряется в молекулу окисляемого вещества, а другой участвует в образование воды, жедезо в составе цитохрома Р-450 вновь переходит в трехвалентное. 4. Повышается гидрофильность окисляемого вещества, что приводит к облегчению метаболических реакций. Освободившийся цитохром Р-450 взаимодействует с другим субстратом. Основными поставщиками НАДФН2 для реакций микросомального окисления являются: 1) изоцитратдегидрогеназа; 2) глюкоза-6фосфатдегидрогеназа; 3) 6-фосфатглюконатдегидрогеназа. В процессе цитохром Р45—зависимых реакций образуются токсичные метаболиты, такие как Н2О2, ОН, О2-, СО и др. Они обезвреживаются при участии входящих в состав биомембран витаминов-антиоксидантов, обладающих антиоксидантными свойствами микроэлементов (Zn, Cu, Ni, Se и др.), фосфолипидов. Каталитическая активность цитохрома Р-450 регулируется 3 путями: 1. В результате внутримелекулярных изменений цитохрома Р-450 изменяется сродство и специфичность к субстрату. 2. В результате межмолекулярных взаимодействий меняется активность цитохром Р-450-редуктазы. 3. Путем индукции или ингибиции синтеза цитохрома Р-450. Третий путь регуляции широко применяется в медицине. В частности, лечебные 9 препараты фенобарбитал, зиксорин, бензонал, рифампицин, кордиамин являются индукторами цитохрома Р-450. Выраженные окисляющие свойства активированного кислорода позволяют окислить большое количество субстрата. Субстратная специфичность этого комплекса очень низка. Единственным общим свойством разнообразных по структуре лекарств и химических соединений, субстратов этой системы, является высокая растворимость в жирах. Индукция ферментов Интересным свойством некоторых структурно различающихся субстратов является их способность при повторном введении «индуцировать» цитохром Р450 путем увеличения скорости его синтеза и/или снижения скорости разрушения. Индукция ведет к ускорению метаболизма и, как правило, к снижению фармакологической активности индуктора и совместно с ним вводимых препаратов. Однако в том случае, если лекарство превращается в реактивные метаболиты, такая индукция может усилить опосредованную метаболитами тканевую токсичность. Различные субстраты способны индуцировать изоформы цитохрома Р-450 с различной мол. м., различной субстратной специфичностью, различными иммунохимическими и спектральными характеристиками. Двумя наиболее исследованными формами являются: 1) цитохром Р-450 2В1 (бывший Р-450b), который индуцируется при введении фенобарбитала, и 2) цитохром Р-450 1А1 (цитохром Р1-450, или Р-448), индуцируемый полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), прототипом которых является 3метилхолантрен. Кроме того, глюкокортикоиды, макролидные антибиотики, антиконвульсанты и некоторые стероиды способны индуцировать специфические формы, обозначаемые как цитохромы Р-450 3А. Изониазид или хроническое потребление этанола индуцируют другую форму – цитохром Р450 2Е1, которая окисляет этанол и активирует канцерогенные нитрозамины. Клофибрат, понижающий концентрацию липопротеинов очень низкой плотности, индуцирует еще один изофермент – цитохром Р-450 4А, который ответственен за ω-гидроксилирование некоторых жирных кислот, лейкотриенов и простагландинов. Индуцировать цитохром Р-450 могут также поллютанты окружающей среди. Например, воздействие бензпирена и других полициклических ароматических углеводородов, присутствующих в табачном дыме, жареном на углях мясе и других органических продуктах пиролиза, индуцирует цитохром Р450 1А1 и изменяет скорость метаболизма лекарств как у экспериментальных животных, так и у человека. Другие химические вещества из окружающей среды, способные индуцировать специфические цитохромы Р-450, включают полихлорированные бифенилы, которые широко используют в промышленности как изоляционные материалы и пластификаторы, а также 2,3,7,8-тетрахлордибензо-р-диоксин (диоксин, ТХДД) – следовой побочный продукт при химическом синтезе дефолианта 2,4,5,-Т. Повышенный синтез Р-450 требует усиления процессов транскрипции и трансляции. Выявлен цитоплазматический рецептор для полициклических 10 ароматических углеводородов (например, бензпирена, диоксина), показана транслокация индуктор-рецепторного комплекса в ядро с последующей активацией регуляторных участков генов. Для других классов веществиндукторов (например, фенобарбитал) аналогичный рецептор еще не найден. Ингибирование ферментов Некоторые лекарственные субстраты могут ингибировать активность цитохром Р-450-содержащих ферментов. Хорошо известным ингибитором является прадифен (SKF 525-A). Это соединение активно связывается с молекулой цитохрома и тем самым конкурентно ингибирует метаболизм потенциальных субстратов. Препараты, содержащие имидазол, такие как циметидин и кетоконазол, связываются с железом гема цитохрома Р-450, инактивируя его, и тем самым эффективно снижают метаболизм как эндогенных субстратов (тестостерона), так и других совместно вводимых лекарств. Макролидные антибиотики, такие как олеандомицин, эритромицин и другие дериваты эритромицина, метаболизируются цитохромом Р-450 3А1 до продуктов, которые диссоциируют с железом гема цитохрома и делают его каталитически неактивным. Некоторые субстраты необратимо ингибируют цитохром Р-450 за счет химической модификации апопротемна или гема цитохрома промежуточными продуктами своего метаболизма. Антибиотик хлорамфеникол метаболизируется цитохромом Р-450 до веществ, которые алкилируют его апоцитохром и таким образом инактивирует фермент. Растущий список ингибиторов, которые «атакуют» гем, включает стероиды этинилэстрадиол, норэтиндрон и спиронолактин, общеанестезирующий агент флюроксен, барбитураты секобарбитал и аллобарбитал, аналгезирующие седативные вещества аллилизопропилацетилмочевину, диэтилпентенамид и этхлорвинол, растворитель карбондисульфид и пропилтиоурацил. Реакции фазы II Реакции II фазы заключаются в связывании субстрата (билирубина, стероидного гармона, модифицированниго ксенобиотика или лекарственного вещества) с высокополярным соединением, несущим отрицательный заряд .Образование конъюгатов связано с промежуточными высокоэнергетическими продуктами и специфическими ферментами. Такие ферменты (трансферазы) могут локализоваться в микросомах или в цитозоле, а продукты реакции носят названия коньюгатов (табл.1). Чаще всего в качесве полярного соединения выступает глюкуроновая кислота (GlcUA), а продуктами реакции (коньюгатами) являются O- и N- глюкурониды (рис.5). Коферментом в этих реакциях является уридиндифосфатглюкуроновая кислота (UDPGlcUA),активная форма глюкуроновой кислоты. Связывание с полярной молекулой глюкуроновой кислоты придаёт неполярным (гидрофобным) соединениям высокую растворимость, что облегчает их выведения из организма . Образование коньюгатов может осуществляется путём биосинтеза сернокислых эфиров с участим фосфааденозинфосфосульфата(3’-фосфо-5’адинилсульфата),поставляющего «активный сульфат», или путём образавания 11 амидов с глицином и глутамином. По сравнению с исходными соединениями коньюгаты гораздо лучше растворимы в воде и легко эксретируется. Из печени коньюгаты выводятся рецепторзависимой экскрецией в желчные капилляры или попадают в кровь, откуда выводится почками за счет фильтрации. Рис.5. Глюкуроновая конъюгация тетрагидрокортизола. 12 Конъюгация лекарств, как считают, является конечным событием инактивации и рассматривается как реакция «истинной детоксикации». Однако эта концепция не абсолютна, так как известно, что некоторые реакции конъюгации (ацилглкуронизация нестероидных противовоспалительных веществ, О-сульфатирование N-гидроксиацетиламинофлуорена и Nацетилирование изониазида) могут привести к образованию активных продуктов, обладающих гепатотоксичностью. В качестве примера рассмотрим следующие процессы. Образующиеся в результате гниения аминокислот фенол, крезол, скатол и др. соединения обезвреживаются путем конъюгации. При этом образуются дополнительные гидрофильные группировки, повышающие растворимость данных соединений, что облегчает выведение их из организма. Скатол и индол образуют калиевые соли индоксила и индоксил сульфатов. Большинство лекарств также метаболизируются в печени. Например: фенобарбитал путем окисления и конъюгации выводится в виде оксифенобарбиталглюкуронидов, ацетилсалициловая кислота (аспирин) деациллируясь превращается в салицилат, затем конъюгируется с УДФГ образуюя салицилатглюкуронид. Дальнейшие его превращения приводят к образованию салицилпировиноградной кислоты и выведение из организма. Некотрые соединения, например желчные кислоты, бензойная кислота, обезвреживаются образованием парных соединений с гликоколом и образуют гиппуровую кислоту, что позволяет использовать данный метод для оценки обезвреживающей функции печени. Одним из путей обезвреживания яаляется метилирование, например, никотинамид превращаясь в метилникотинамид, экскретируется. Нарушение обезвреживания нитрозаминов может привести к развитию неопластических процессов в различных органах и тканях. Соединения, способствующие злокачественному перерождению нормальных клеток, называются нитрозаминами. Бензантрацен и дрожжевые афлотоксины, являются канцерогенами и обезвреживаются путем образования эпоксидов. В печени различные биологически активные вещества (адреналин, норадреналин, гистамин, серотонин, тиронин) обезвреживаются путем окисления при участии аминооксидаз; эстрогенные, андрогенные, кортикостероидные гормоны окисляясь в виде кетостероидов экскретируются с мочой. Обезвреживания тяжелых металлов. В связывании и обезвреживании металлов принимает участие белок печени металлотионеин. Этот белок с высоким содержанием остатков цистиена обладает высоким сродством к ионам двухвалентных металлов , таким , как Cd, Cu, Hg и Zn. Ионы таких металлов являются индукторами биосинтеза металлотионина. Метаболизм ксенобиотиков с образованием токсичных продуктов Метаболизм ксенобиотиков не всегда является безобидным биохимическим событием, ведущим к детоксикации и элиминации веществ. Некоторые вещества могут в процессе метаболизма трансформироваться в 13 активные промежуточные продукты, которые токсичны в отношении различных органов. Такие токсические реакции не выражены при незначительном действии исходного вещества, когда механизмы детоксикации не перегружены и количество эндогенных детоксицирующих косубстратов (глутатиона, глюкуроновой кислоты, сульфата) достаточно. Однако когда эти ресурсы истощены, могут преобладать токсические пути, что ведет к явной органотоксичности или канцерогенезу. Число примеров такой токсичности, вызываемой лекарствами, быстро увеличивается. В качестве примера можно привести гепатотоксичность, вызванную ацетаминофеном (парацетамолом, рис.6). Рис. 6. метаболизм ацетаминофена (Ац) с образованием гепатотоксичных метаболитов (Г-SH – глутатион; Г-S – остаток глутатиона; Ац* - реактивный метаболит). Это аналгетическое и жаропонижающее средство вполне безопасно в терапевтических дозах. В норме оно соединяется с глюкуроновой и серной кислотами, что в совокупности составляет 95% экскретируемых метаболитов. На альтернативный путь цитохром Р-450-зависимой конъюгации с глутатионом (Г-SH) приходятся оставшиеся 5%. Когда доза ацетаминофена значительно превышает терапевтическую, пути образования глюкуронида и сульфата насыщаются, и возрастает роль цитохром Р-450-зависимого пути. Гепатотоксичность не выявляется до тех пор, пока количество глутатиона достаточно для конъюгации. Однако постепенно расход глутатиона печени начинает превышать его восстановление и происходит накопление активного и токсичного метаболита. В отсутствие внутриклеточных нуклеофильных веществ типа глутатиона этот активный продукт (как предполагают, Nгидроксилированное производное или N-ацетилбензоиминохинон) реагирует с 14 нуклеофильными группами клеточных макромолекул, например белков, что ведет к гепатотоксическому действию. Понимание химической и токсикологической характеристики электрофильной природы активного метаболита ацетаминофена способствовало созданию эффективного антидота – цистеамина и Nацетилцистеина. Введение более безопасного N-ацетилцистеина в сроки от 8 до 16 часов после перидозировки ацетаминофена предупреждает развитие скоротечной гепатотоксичности и летальный исход. Сходное механистическое объяснение может быть использовано применительно к нефротоксичности фенацетина и гепатотоксичности афлатоксина и бензпирена. Клиническое значение метаболизма лекарств и ксенобиотиков Доза и частота приема, необходимые для достижения эффективной концентрации в крови и тканях, могут варьировать у больных из-за индивидуальных различий в распределении лекарств и скорости метаболизма и элиминации. Эти различия определяются генетическими факторами и такими, не связанными с генетикой переменными, как возраст, пол, размер и функция печени, циркадный ритм, температура тела, факторы окружающей среды и питания, в частности воздействие индукторов или ингибиторов метаболизма лекарств. Рассмотрим наиболее важные факторы, влияющие на метаболизм лекарств, которые имеют клиническое значение. Индивидуальные отличия в скорости метаболизма зависят от природы ксенобиотика. Так, в одной и той же популяции при одинаковом уровне в плазме можно наблюдать 30-кратных разброс в скорости метаболизма одного лекарства и лишь двухкратную вариабельность для другого. Генетические факторы, которые влияют на уровень активности ферментов, могут быть ответственны за отличия метаболизма ксенобиотиков. Например, сукцинилхолин гидролизуется в два раза медленнее у лиц с генетическим дефектом активности псевдохолинэстеразы по сравнению с лицами, имеющими ее нормальный уровень. Аналогичные фармакогенетические влияния выявлены в отношении ацетилирования изониазида и гидроксилирования варфарина. Эффект медленного ацетилирования (изониазида и сходных аминов) вызван скорее синтезом меньшего количества соответствующего фермента, чем его аномальной формой. Врожденный по аутосомному рецессивному типу фенотип медленного ацетилирования наблюдается у 50% темнокожих и белых жителей США, относительно часто у европейцев, живущих в северных широтах, и значительно реже у жителей Азии и эскимосов. Подобным же образом генетически детерминированные дефекты окислительного метаболизма были выявлены для дебризохина, фенацетина, гуаноксана, спартеина, фенформина и других веществ. Эти дефекты наследуются по аутосомно-рецессивному типу и могут проявляться в множественности вариантов метаболической трансформации химических веществ in vivo. Две генетических вариации полиморфизма биотрансформации ксенобиотиков были особенно подробно изучены и внесли некоторую ясность в возможные механизмы. Во-первых, это полиморфизм окисления 15 дебризохина/спартеина, который проявляется у 3-10% лиц кавказской расы и наследуется по аутосомному рецессивному типу. У этих лиц нарушается цитохром Р-450-зависимое окисление дебризохина, спартеина, фенформина, декстрометорфана, метопролола, буфуралола и некоторых β-блокаторов и трициклических антидепрессантов. Результаты изучения показывают, что наблюдаемые дефекты окислительного метаболизма лекарств являются врожденными. Точная молекулярная основа дефекта состоит, видимо, в нарушении экспрессии белка цитохрома Р-450, что ведет к нарушению синтеза необходимого изофермента. Вторым хорошо изученным примером генетического лекарственного полиморфизма является стереоселективное ароматическое (4)гидроксилирование антиконвульсанта мефенитоина. Этот полиморфизм, наследуемый также по аутосомному рецессивному типу, наблюдается у 3-5% кавказского населения и 18-23% населения Японии. Он генетически независим от полиморфизма дебризохин/спартеинового типа. У нормальных «активных метаболизаторов» S-мефенитоин сначала гидроксилируется в положении 4 фенильного кольца, затем конъюгируется с глюкуроновой кислотой и быстро экскретируется с мочой, тогда как для R-мефенитоина характерно медленное N-деметилирование до нирванола. «Медленные метаболизаторы», полностью лишены стереоспецифической S-мефинитоин-гидроксилазной активности, уних как S-, так и N-энантиомеры, перед экскрецией N-деметилируются до нирванола. Молекулярная основа этого нарушения, возможно, связана с экспрессией мутантного изофермента Р-450, который напоминает нормальную форму, но имеет достаточную структурную микрогетерогенность для изменения аффинитета к субстрату и стереоселективности, а следовательно, - и функции. Клинически важно учитывать, что безопастность лекарства может быть значительно ниже у лиц, являющихся «медленными метаболизаторами». Например, в случае недостаточного метаболизма мефенитоина наблюдаются признаки глубокой седации и атаксии после доз препарата, которые хорошо переносятся лицами с нормальным метаболизмом. Выявляются и другие виды генетического полиморфизма в превращениях лекарств, которые наследуются независимо от уже рассмотренных. Изучение метаболизма теофиллина у монозиготных и дизиготных близнецов, включающее анализ родословной различных семей, показало, что у этих лекарств может наблюдаться отчетливый полиморфизм, наследуемый по рецессивному типу. Генетический полиморфизм лекарств выявлен для окисления аминопурина, толбутамида и карбоцистеина. Хотя генетический полиморфизм окисления часто связан со специфическими изоэнзимами цитохрома Р-450, подобные вариации могут иметь отношение и к другим участникам метаболизма. Данные последнего времени о полиморфизме окисления триметиламина, который предположительно метаболизируется флавинмонооксигеназой (фермент Циглера), указывают, что генетические варианты цитохром Р-450-независимых окислительных ферментов могут также участвовать в полиморфизме. Факторы среды тоже вносят вклад в индивидуальную вариабельность метаболизма ксенобиотиков. Курильщики метаболизируют некоторые 16 лекарства быстрее, чем некурящие, в связи с индукцией ферментов. Промышленные рабочие, подвергающиеся воздействию пестицидов, метаболизируют некоторые препараты быстрее, чем лица, не контактирующие с этими веществами. Такие различия затрудняют определение эффективных и безопасных доз лекарств с небольшим значением терапевтического индекса. Возраст и пол. Повышенная чувствительность к ксенобиотикам отмечается у очень молодых или пожилых пациентов. Хотя это может отражать особенности всасывания, распределения и элиминации, нельзя исключать и различия в скорости метаболизма. Исследования на других видах млекопитающих показали, что ксенобиотики метаболизируются с пониженной скоростью в препубертатный период и при старении. Замедление метаболизма может быть связано с уменьшением активности ферментов или дефицитом эндогенных кофакторов. Сходные тенденции выявлены у человека, однако достоверные доказательства еще не получены. Вариации метаболизма, зависящие от пола, показаны у крыс. Молодые крысы-самцы метаболизируют ксенобиотики быстрее, чем взрослые самки или самцы препуберантного возраста. Эти различия отчетливо связаны с уровнем андрогенов. Некоторые клинические наблюдения указывают на то, что сходные зависимые от пола отличия метаболизма лекарств существуют и у человека применительно к этанолу, пропранолу, бензодиазепинам, эстрогенам и салицилатам. Взаимодействия ксенобиотиков в процессе метаболизма Взаимодействие лекарств. Многие субстраты, вследствие относительно высокой липофильности, не только удерживаются около активного центра фермента, но и неспецифически связываются липидными мембранами саркоплазматического ретикулума. В этом состоянии они могут вызывать индукцию микросомальных ферментов, а также в зависимости от остаточного уровня лекарства в активном центре конкурентно тормозить метаболизм одновременно вводимого лекарства. В список ферментиндуцирующих лекарств входят различные седативногипнотические, противосудорожные средства, транквилизаторы и инсектициды. Пациентам, получающим барбитураты, другие седативные и снотворные средства или транквилизаторы, могут потребоваться значительно более высокие дозы антикоагулянтов варфарина или дикумарола, применяемых перорально. С другой стороны, прекращение приема седативных препаратов может привести к замедленному метаболизму антикоагулянтов и, следовательно, кровоточивости. Сходное взаимодействие наблюдается у больных, получающих такие комбинации лекарств как антипсихотические или седативные с контрацептивными, седативные с противосудорожными, алкоголь с гипогликемическими веществами (толбутамид). Следует также отметить, что индуктор может усиливать не только метаболизм другого вещества, но и свой собственный. Так, продолжительный прием некоторых лекарств может привести к фармакокинетической толерантности – прогрессивному снижению эффективности из-за ускорения собственного метаболизма. 17 С другой стороны, одновременное введение двух или более лекарств может привести к нарушению элиминации более медленно метаболизируемого лекарства и удлинению или потенцированию его фармакологического эффекта. Как конкурентное субстратное ингибирование, так и необратимая субстратная инактивация фермента, могут увеличить уровень лекарства в плазме и привести к токсическому действию, особенно для препаратов с небольшим терапевтическим индексом. Так, показано, что эритромицин угнетает метаболизм антигистаминного средства терфенадина и приводит к появлению побочных эффектов в виде сердечных аритмий. Сходным образом аллопуринол удлиняет продолжительность и усиливает химиотерапевтическое действие меркаптопурина путем конкурентного ингибирования ксантиноксидазы. Следовательно, для предупреждения токсического действия на костный мозг у больных, получающих аллопуринол, необходимо снизить дозу меркаптопурина. Циметидин – лекарство, используемое для лечения пептической язвы, потенцирует фармакологическое действие антикоагулянтов и седативных средств. Метаболизм хлордиазепоксида подавляется на 36% после однократного введения циметидина, эффект устраняется в пределах 48 часов после прекращения приема циметидина. Нарушение метаболизма может также происходить, если одновременно вводимое вещество необратимо ингибирует общий метаболизирующий фермент, как это наблюдается в случае передозировки секобарбитала и новонала (диэтилпентенамид). В процессе микросомального окисления этих препаратов инактивируются ферменты, что ведет к нарушению их собственного метаболизма и метаболизма других косубстратов. Взаимодействие между ксенобиотиков с эндогенными соединениями. Для инактивации ряда ксенобиотиков требуется конъюгация с эндогенными субстратами – глутатионом, глюкуроновой кислотой и сульфатом. Соответственно, различные вещества могут конкурировать за один и те же эндогенные субстраты, поэтому быстро реагирующие препараты могут эффективно снижать уровень эндогенного субстрата и нарушать метаболизм медленно реагирующего лекарства. Заболевания, влияющие на метаболизм ксенобиотиков Острые или хронические заболевания, влияющие на структуру или функцию печени, заметно изменяют печеночный метаболизм некоторых ксенобиотиков. К таким заболеваниям относят жировая дистрофия, алкогольный гепатит, активный или неактивный алкогольный цирроз, гемохроматоз, хронический активный гепатит, билиарный цирроз и острый вирусный или лекарственный гепатит. В зависимости от тяжести эти заболевания нарушают функции печеночных ферментов, метаболизирующих лекарства, особенно микросомальных оксидаз, и тем самым значительно влияют на элиминацию ксенобиотиков. Например, период полувыведения хлордиазепоксида и диазепама у больных с циррозом печени или острым вирусным гепатитом значительно возрастает. Эти лекарства даже в обычных дозах могут вызвать кому у больных с заболеваниями печени. 18 При раке печени существенно нарушается метаболизм ксенобиотиков у человека. Например, метаболизм аминопирина у больных со злокачественными опухолями печени заметно медленнее, чем у здоровых людей. У этих больных выявляется также значительно уменьшенный клиренс аминопирина. Исследование биоптатов печени пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой указывают на нарушение способности к окислительному метаболизму лекарств in vitro. Это сочетается с соответствующим понижением содержания цитохрома Р-450. Заболевания сердца за счет ограничения печеночного кровотока могут нарушить кинетику лекарств, метаболизм которых лимитируется кровотоком. Эти лекарства столь легко метаболизируются печенью, что печеночный клиренс практически равен кровотоку через печень. Заболевания легких также могут влиять на метаболизм лекарств, о чем свидетельствует нарушение метаболизма прокаинамида и прокаина у больных с хронической дыхательной недостаточностью и увеличение периода полувыведения антипирина у больных раком легких. Нарушение активности фермента или его нарушенный синтез фермента при отравлении тяжелыми металлами или порфирии тоже приводят к угнетению печеночного метаболизма лекарств. Так, при отравлении свинцом у человека увеличивается период полувыведения антипирина. Влияния эндокринных дисфункций на метаболизм ксенобиотиков были детально исследованы на экспериментальных моделях у животных, но соответствующие данные для людей с гормональной патологией немногочисленны. Нарушения функции щитовидной железы сочетаются с изменением метаболизма некоторых ксенобиотиков и многих эндогенных соединений. Гипотиреоидизм увеличивает период полувыведения антипирина, дигоксина, метимазола и практотола, тогда как гипертиреодизм оказывает противоположное влияние. Немногочисленные наблюдения у больных сахарным диабетом не указывают на очевидные нарушения метаболизма лекарств, судя по периодам полувыведения антипирина, толбутамида и фенилбутазона. В эксперименте у крыс-самцов (аллоксановый или стрептозоциновый диабет) выявляются нарушения превращений некоторых препаратов. Эти изменения устраняются при введении инсулина, который не влияет прямо на печеночные ферменты, метаболизирующие лекарства. Нарушение функции гипофиза, коры надпочечников и половых желез значительно изменяет метаболизм лекарств в печени крыс. На основании этих наблюдений можно предполагать, что такие нарушения могут значительно влиять на биотрансформацию препаратов у человека. Пока необходимые доказательства не будут получены в клинических наблюдениях, подобные экстраполяции могут рассматриваться как предположительные. 19 Использованная литература 1. Бертрам Кацунг. Базисная и клиническая фармакология.- Москва, Бином, 1998.- Т.1.- С.74-86. 2. Кольман Я., Рём К.Г. Наглядная биохимия.- Москва, Мир, 2000.- 308-311. 3. Gilmore D. A. et al. Age and gender influence the stereoselective pharmacokinetics of propranolol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1192; 261: 1181. 4. Gonzalez F. J. et. Al. Characterization of the common genetic defect in humans deficient in debrisoquin metabolism. Nature, 1988; 331: 442. 5. Gonzalez F. J. Human cytochromes P450: problems and prospects. Trends Pharmacol. Sci. 1992; 13: 346. 6. Gonzalez F. The molecular biology of cytochrome P450s. Pharmacol. Rev. 1989; 40: 243. 7. Guengerich F. P. (ed.) Mammalian cytochromes P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry. Plenum Press, 1986. 8. Minchin R. F., Boyd M. R. Localization of metabolic activation and deactivation systems in the lung: significance to the pulmonary toxicity of xenobiotics. Annu. Rey. Pharmacol. Toxicol. 1983; 23: 217. 9. Ortiz de Montellano P. R., Correia M. A. Suicidal destruction of cytochrome P-450 during oxidative drug metabolism. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1983; 23: 481. 10.Zhou H-H et al. Racial differences in drug response: Altered sensitivity to and clearance of propranolol in men of Chinese descent as compared with Amirican males. N. Engl. J. Med. 1989; 320: 565. Контрольные вопросы 1. Что такое ксенобиотики? 2. Из каких фаз состоят процессы биотрансформации ксенобиотиков? 3. Где протекают реакции первой фазы биотрансформации? 4. Из каких компонентов состоит монооксигеназная система? 5. Перечислите последовательность цикла цитохрома Р450 в окислении субстратов? 6. Как регулируется активность цитохром Р450 монооксигеназной системы? 7. Какие соединения участвуют во второй фазе биотрансформации? 8. Приведите примеры биотрансформации эндогенных соединений? 9. Расскажите об индукции и ингибиции ферментов биотрансформации? 10.Клиническое значение метаболизма лекарств? 11.Расскажите о влиянии различных факторов на процессы обезвреживания ксенобиотиков? 12.Как изменяется активность ферментов биотрансформации при различных патологических состояниях? 20 Подписано в печать 10.08.2005г. Форма 60х84 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 95/15.08. Тип.оперативной полиграфии 21 22