100x

УДК 547.914:612.354:577.12:615.244–085
СОСТОЯНИЕ НАДФН-ЗАВИСИМОЙ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ ГИДРОКСИЛИРУЮЩЕЙ
ФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ КРЫС, ОТРАВЛЕННЫХ ЛЕТУЧИМИ КОМПОНЕНТАМИ
ЭПОКСИДНЫХ СМОЛ ПОСЛЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
И.Ю. Высоцкий, доц.
Сумский государственный университет
ВВЕДЕНИЕ
Без изучения сведений о судьбе вводимых в организм извне химических соединений невозможны
высокоэффективное лечение и профилактика патологии химической этиологии, в том числе и интоксикаций
летучими компонентами эпоксидных смол (ЭС).
В предыдущей работе нами было изучено влияние фармакотерапевтических средств на активность
эпоксидгидролазы (ЭГ), глутатион-S-трансферазы (Г-S-Т), γ-глутаминтрансферазы (γ-ГТ), принимающих
участие в метаболизме эпоксидных соединений как в физиологических условиях, так и в условиях острой
интоксикации летучими компонентами ЭС [4]. Реакции, обеспечиваемые этими ферментами, составляют
вторую фазу биотрансформации липидорастворимых ксенобиотиков, имеющих в своей структуре или
получивших нуклеофильные группы при действии микросомальных монооксигеназ в первой фазе [7].
Значительная часть реакций второй фазы, в том числе гидролиз эпоксидов и их конъюгация с глутатионом,
осуществляются ЭГ и Г-S-Т наряду с цитозолем в микросомальной системе печени [7, 31, 32, 34]. Имеются
веские доказательства, что в этой же системе микросомальных оксигеназ, которая предотвращает
накопление липофильных ксенобиотиков и отравление ими организма, образуются эпоксиды [15]. Особую
опасность при этом представляет образование эпоксидов при метаболизме хлорированных углеводородов,
ареноксидов, фосгена [18], а также поступление их в организм из вне в виде эпихлоргидрина (ЭХГ) или
летучих компонентов ЭС. При этом происходят изменения активности ферментов не только второй, но, повидимому, и первой фазы биотрансформации, т.е. микросомальных оксигеназ. Одни ксенобиотики
увеличивают активность микросомальных ферментов, другие, наоборот, тормозят их действие [25].
Повышение активности этой ферментной системы приводит к ускорению обезвреживания токсического
агента, в случае же «летального синтеза» происходит нарушение функции микросомальных монооксигеназ
[1, 17]. Введение животным ЭХГ в зависимости от дозы и кратности воздействия ведет либо к повышению
уровня цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени [7], либо к его резкому снижению [17]. Эти
реакции являются одними из наиболее чувствительных показателей ответа организма на действие
ксенобиотиков [1, 17].
В экспериментальных исследованиях показано, что предварительная обработка животных индукторами
микросомальной системы фенобарбиталом либо бензоналом уменьшала выживаемость белых крыс при
острой интоксикации ЭХГ, а использование ингибиторов цитохрома Р-450 и микросомального окисления
левамизола, хлорида кобальта увеличивало величину этого показателя и сроки гибели животных [2]. При
анализе литературы мы не обнаружили работ, посвященных изучению состояния монооксигеназной
системы эндоплазматического ретикулума гепатоцитов при острой интоксикации летучими компонентами
ЭС, тем более разработки средств фармакологического воздействия на ее активность при данной патологии.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Целью
настоящего
исследования
явилась
оценка
НАДФ-зависимой
монооксигеназной
гидроксилирующей ферментной системы печени у белых крыс на уровне целостного организма в условиях
острого отравления летучими компонентами диановой ЭС ЭД-20 и на фоне лечебно-профилактического
воздействия лекарственных средств, а также индукторов цитозольной и микросомальной эпоксидгидролазы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Вистар. Острое токсическое поражение печени
вызывали путем однократного 4-часового ингаляционного динамического воздействия летучими
компонентами ЭС ЭД-20 в концентрации, составляющей 1/3 LC50 (120-140 мг/м3) по ЭХГ. Ингаляционная
затравка осуществлялась в установке, смонтированной по методу А.П. Яворовского [20] в нашей
модификации [3].
С целью изучения влияния изучаемых препаратов на монооксигеназную систему гепатоцитов омепразол
вводили животным внутрибрюшинно 1 раз в день по 50 мг/кг массы на протяжении 7 дней, а клофибрат внутрижелудочно 1 раз в день по 200 мг/кг массы в течение 2 дней. Интоксикацию летучими компонентами
ЭС ЭД-20 вызывали через 24 часа после последнего введения омепразола и клофибрата.
Части животных вводили также кверцетин внутрижелудочно в дозе 350 мг/кг (ЕД 50), флавинат внутримышечно 4 мг/кг (ЕД50), липин - внутрибрюшинно 0,8 ммоль/кг (ЕД30), ацетилцистеин внутрибрюшинно 450 мг/кг (ЕД50), никотинамид – внутримышечно 260 мг/кг (ЕД30) по лечебнопрофилактической схеме соответственно за 3; 1; 0,5; 0,5 и 5 часов до начала затравки и через 5 минут после
ее окончания. ЕД50 и ЕД30 применяемых лекарственных средств устанавливали в условиях их
профилактического введения по проценту выживаемости животных на модели острой, ингаляционной,
статической 30-минутной затравки белых крыс наиболее токсичным и опасным летучим компонентом ЭС ЭХГ (LC50-LC100) по методике Б.М. Штабского и соавт. [9].
Мочу у животных, помещенных в обменные клетки, собирали в течение 6 (первый срок исследования) и
24 часов (второй срок исследования) через сутки после завершения введения омепразола и клофибрата,
спустя трое суток после интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД-20 на фоне предварительного
лекарственного воздействия этими препаратами либо после последнего введения по лечебнопрофилактической схеме кверцетина, флавината, никотинамида, липина и ацетилцистеина. Длительность
гексеналового сна определяли через 6, 12, 72 и 120 ч от момента последнего введения препаратов или после
изъятия животных из камеры при применении омепразола и клофибрата.
Состояние детоксицирующей системы печени определяли по активности НАДФН-зависимой
монооксигеназной гидроксилирующей системы на уровне целостного организма. Для этого изучали
интенсивность деметилирования амидопирина, о котором судили по выведению основных его метаболитов
4-аминоантипирина (4-ААП) и N-ацетил-4-аминоантипирина (N-ац-4-ААП) с мочой после нагрузки этим
ненаркотическим аналгетиком [11]. Метод основан на образовании основным метаболитом амидопирина 4аминоантипирином с фенолом соединения типа индофенола, дающего в щелочной среде в присутствии
феррицианида калия красную окраску. Результаты выражали в процентах от введенного количества
амидопирина. Такой методический подход позволяет судить об интенсивности течения метаболических
реакций как первой, так и второй фаз биотрансформации ксенобиотика. Продолжительность гексеналового
сна (в минутах) определяли по методике [16].
Полученные в эксперименте результаты обрабатывали статистически общеизвестным методом с
помощью критерия t Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что в условиях острого ингаляционного динамического воздействия летучими
компонентами ЭС ЭД-20 резко угнетаются реакции первой фазы биотрансформации амидопирина, о чем
свидетельствует значительное снижение уровня экскреции продукта N-деметилирования амидопирина – 4АПП через 6 ч на 67%, а через 24 ч - на 64%. Аналогичная картина наблюдается и в случае определения
продукта второй фазы биотрансформации аналгетика – N-ац-4-АПП под воздействием летучих компонентов
изучаемой смолы. Экскреция данного метаболита с мочой крыс при отравлении ЭС ЭД-20 угнетается на
75% и 54% соответственно через 6 ч и 24 ч по сравнению с интактной серией (табл.1).
Таблица 1– Влияние исследуемых лекарственных средств на динамику экскреции метаболитов амидопирина
- 4-ААП и N-ац-4-ААП с мочой крыс (в % от введенного количества амидопирина) через трое суток после
острого ингаляционного динамического воздействия летучими компонентами ЭС ЭД-20 (Mm, n=8-10)
Группа
животных
1
Интактные
Контроль
Р1
ЭС ЭД-20 +
+ кверцетин
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ флавинат
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ липин
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ацетилцистеин
Р1
Р2
4-ААП
6
2
1,3390,100
0,4360,048
<0,001
N-ац-4-ААП
Сроки исследования,ч
24
6
24
3
4
5
1,8370,086
12,6990,797 14,4660,568
0,6590,118
3,1620,372
6,7180,312
<0,001
<0,001
<0,001
0,8900,130
<0,02
<0,02
1,2770,139
<0,01
<0,01
7,3540,730
<0,001
<0,002
11,1300,849
<0,01
<0,01
0,9730,130
>0,05
<0,02
1,5890,165
>0,1
<0,002
5,6500,679
<0,001
<0,02
9,2470,667
<0,001
<0,02
1,1970,268
>0,5
<0,05
1,3480,260
>0,1
>0,05
5,3470,563
<0,001
<0,02
9,3930,697
<0,001
<0,02
0,8400,069
<0,002
<0,001
1,2020,072
<0,001
<0,01
10,9341,062
>0,1
<0,001
13,2191,032
>0,25
<0,001
ЭС ЭД-20 +
+ никотинамид
Р1
Р2
0,6710,062
<0,001
<0,02
0,8330,069
<0,001
>0,1
4,4370,698
<0,001
>0,1
7,7270,785
<0,001
>0,25
2
1,7820,09
<0,01
0,6320,068
<0,001
3
2,3620,109
<0,01
0,9520,083
<0,001
4
14,9671,370
>0,1
5,3500,348
<0,001
5
17,5401,209
<0,05
8,2290,488
<0,001
1,1020,116
>0,1
<0,001
1,4120,086
<0,01
<0,001
6,8440,759
<0,001
<0,01
8,8130,707
<0,001
<0,05
0,5080,046
<0,001
>0,25
0,5830,049
<0,001
>0,5
3,8420,303
<0,001
>0,1
6,0180,341
<0,001
>0,1
Продолжение таблицы 1
1
Клофибрат
Р1
Омепразол
Р1
ЭС ЭД-20 +
+ клофибрат
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+омепразол
Р1
Р2
Примечание. Здесь и в таблице 2:
Р1 - дано по сравнению с интактными животными;
Р2 - дано по сравнению с контролем
Следовательно, острая динамическая интоксикация летучими компонентами ЭС ЭД-20 реализуется их
способностью ингибировать ферментную монооксигеназную систему как в первой фазе биотрансформации
– этапе N–деметилирования тест–препарата амидопирина, так и во второй фазе – при его конъюгации с
уксусной кислотой и образовании ацетильного конъюгата.
С целью подтверждения ингибирования монооксигеназной гидроксилирующей системы печени
летучими компонентами ЭС ЭД–20 нами в отдельной серии опытов изучено их влияние на
продолжительность гексеналового сна животных, результаты которых представлены в табл. 2. Показано, что
продолжительность гексеналового сна у интактных животных колеблется в интервале 23,621,83 –
28,571,54 минуты. В изучаемых условиях эксперимента уже в первые 6 и 12 часов от момента извлечения
животных из камеры происходило достоверное увеличение длительности гексеналового сна на 27–30%. В
дальнейшем (72 ч) отмечается пик увеличения продолжительности гексеналового сна (в 3,9 раза) в
сравнении с интактными животными, что в полной мере коррелирует с данными по определению уровня
метаболитов амидопирина и свидетельствует о максимальном угнетении НАДФН-зависимой
монооксигеназной системы печени и, возможно, цитохрома Р-450 [17]. Через 120 часов отмечается
некоторое восстановление детоксицирующей функции печени, что находит свое подтверждение в снижении
продолжительности гексеналового сна в 1,2 раза по сравнению с таковой, регистрируемой на 72-часовой
отметке, однако при этом продолжая оставаться в 2,8 раза выше, чем в группе интактных животных.
Таким образом, изучение продолжительности гексеналового сна животных еще раз подтверждает тот
факт, что острая динамическая интоксикация летучими компонентами ЭС ЭД-20 в значительной мере
снижает активность детоксицирующих систем печени.
Анализируя результаты исследования содержания метаболита амидопирина – 4-ААП в моче, видно, что
применение кверцетина достоверно усиливает экскрецию с мочой данного продукта превращения
амидопирина по сравнению с группой контрольных крыс как через 6, так и через 24 часа после посадки
животных в обменные клетки на 104 и 94% соответственно. В этих же условиях эксперимента действие
препарата приводило и к усилению реакций II фазы биотрансформации – ацетилирования, то есть
присоединения к молекуле 4-ААП ацетата при участии ацетил–КоА. Уровень N-ац-4-ААП возрастал под
влиянием биофлавоноида в первый срок исследования на 133%, а во второй срок – на 66%. Однако,
несмотря на столь высокую эффективность кверцетина при интоксикации ЭС, изучаемые показатели
состояния монооксигеназной системы все же остаются на 23-42% достоверно ниже таковых,
регистрируемых у интактных животных (табл. 1).
Действие флавината, примененного по лечебно-профилактической схеме, сопровождалось заметно более
выраженным влиянием на реакции N-деметилирования, чем ацетилирования. Так, если через 6 и 24 часа
экскреция 4-ААП с мочой возрастала соответственно в 2,2 и 2,4 раза по сравнению с контролем и была
статистически не достоверной по отношению к интактным животным, то выведение N-ац-4-ААП
увеличивалось только в 1,8 и 1,4 раза (табл. 1). Возможно это связано с участием флавината в виде ФАД и
ФМН в составе НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы. Известно, что НАДФН-цитохром Р-450-редуктаза
служит переносчиком электронов с восстановленного НАДФ на цитохром Р-450 и таким образом участвует
в первом этапе метаболизма жирорастворимых ксенобиотиков – микросомальном гидроксилировании [7].
Что касается липина, то этот препарат в условиях острой интоксикации летучими компонентами ЭС,
судя по динамике и выраженности воздействия на НАДФН-зависимую монооксигеназную
гидроксилирующую ферментную систему печени, был сравним с флавинатом и также увеличивал в
большей степени реакции первой фазы биотрансформации до уровня, регистрируемого у интактных
животных (р1>0,1-0,5) (табл. 1).
Столь выраженный эффект липина свидетельствует о важной роли фосфатидилхолиновых липосом в
функционировании микросомальных монооксигеназ. По-видимому, липин способен стабилизировать
фосфолипидный слой микросом. Последний обеспечивает поддержание каталитической активности
монооксигеназной системы и участвует в прикреплении ее компонентов к мембранам гладкой
эндоплазматической сети [13]. Фосфолипиды также влияют на конформационные изменения молекулы
цитохрома Р-450 и ее стабилизацию [14].
Следует отметить, что по степени влияния на динамику экскреции метаболита амидопирина 4-ААП у
отравленных животных флавинат и липин превосходили кверцетин. Кверцетин, в свою очередь, проявлял
гораздо большую активность при биологическом ацетилировании 4-ААП как чужеродного амина до N-ац-4ААП.
Токсическое действие ЭС связывают, как правило, с их окисляющей способностью, легкостью
отщепления ими свободных радикалов, а также с окислением ряда ферментов, содержащих тиоловую
группу, в том числе цитохрома Р-450 [5]. Для реактивации сульфгидрильных групп цитохрома Р-450 и
других ферментов при отравлении летучими компонентами ЭС ЭД-20 мы применили широко известный
антидот тиоловых ядов – ацетилцистеин. Как видно из табл. 1, под влиянием этого препарата содержание 4ААП в моче возрастало через 6 часов на 93%, а через 24 часа - на 82%, что было ниже, чем при
использовании по лечебно-профилактической схеме кверцетина, флавината и липина. В то же время
концентрация N-ац-4-ААП в моче в результате действия ацетилцистеина была наиболее высокой. По
сравнению с контролем она возрастала в первый срок исследования на 246%, а во второй – на 97% и
практически не отличалась от таковой у интактных крыс (р 1>0,1-0,25). Этот факт свидетельствует о том, что
под влиянием ацетилцистеина в условиях острого ингаляционного воздействия на организм летучих
компонентов ЭС в большей степени тормозится нарушение реакций II фазы биотрансформации.
Наиболее слабый эффект в условиях изучаемой патологии наблюдался при использовании в качестве
антидотно-лечебного средства никотинамида. Применение никотинамида за 5 часов до начала интоксикации
и через 5 минут после ее окончания сдерживало уменьшение экскреции 4-ААП на 54 и 26%, а N-ац-4-ААП –
на 40 и 15% соответственно через 6 и 24 часа после посадки животных в обменные
клетки (табл. 1).
Таким образом, в опытах на целостном организме установлено, что кверцетин, флавинат, липин,
ацетилцистеин и никотинамид обладают способностью в разной степени усиливать и ускорять процессы
обезвреживания ксенобиотиков за счет реакций I и II фаз биотрансформации, что реализуется активацией
экскреции с мочой метаболитов амидопирина в условиях острой динамической интоксикации летучими
компонентами ЭС. Флавинат и липин при отравлении ЭС усиливают в большей мере реакции I фазы
метаболизма ксенобиотиков, а ацетилцистеин – II фазы. По степени влияния исследуемых лекарственных
препаратов на экскрецию с мочой 4-ААП их можно расположить в порядке уменьшения активности в
следующем порядке: липин = флавинат > кверцетин > ацетилцистеин > никотинамид, а на экскрецию N-ац4-ААП – ацетилцистеин > кверцетин > флавинат > липин > никотинамид.
Для более корректного и полного представления о функционировании монооксигеназной системы
организма животных в условиях острого отравления летучими компонентами ЭС и лечебнопрофилактического применения изучаемых лекарственных средств представлялось целесообразным
исследовать влияние препаратов на продолжительность гексеналового сна.
Из таблицы 2 следует, что применение кверцетина за 3 часа до помещения животных в камеру и спустя 5
минут после их извлечения уменьшает продолжительность гексеналового сна через 6, 12, 72 и 120 часов от
момента последнего введения препарата на 12, 14, 35 и 20% соответственно. Однако если в первых два
срока эксперимента имеющиеся отличия в величинах изучаемого показателя в сравнении с группой
интактных крыс не носят достоверного характера, то в последующие сроки (72 и 120 ч) сохраняется
достаточно высокий уровень достоверности (р1<0,001). Продолжительность гексеналового сна, несмотря на
лечение, еще остается выше, чем у интактных животных, на 156% (72 ч) и 123% (120 ч).
Применение в этих условиях флавината сопровождалось похожей с кверцетином динамикой изменений,
но характеризовалось более выраженным и достоверным во все сроки исследования действием (р 2<0,020,001). Под воздействием флавината длительность гексеналового сна у отравленных животных на 6 часовой
отметке была почти на 29% меньше, чем в контроле, и на 10%, – чем у интактных животных, а на 12 часовой
отметке – на 21% ниже, чем в контрольной группе животных. В дальнейшем, по истечении 72 и 120 часов с
момента окончания затравки уменьшение изучаемого показателя составило 46 и 32%, но было выше, чем у
интактных животных, на 113 и 89%, что тем не менее значительно меньше, чем в аналогичные сроки у
кверцетина (табл. 2).
Действие липина через 6 и 12 часов после завершающего введения отравленным животным препарата
практически не отличалось от такового у флавината, но заметно снижалось через 72 и 120 часов. Так, если
под влиянием липина продолжительность гексеналового сна по сравнению с контролем спустя 6 и 12 часов
уменьшалась на 24 и 27% и не отличалась от таковой у интактных крыс (р 1>0,5), то через 72 и 120 часов
регистрируемое уменьшение длительности сна было не больше 15 и 7% соответственно, а отличия с
интактными животными составляли 236 и 161% (табл. 2). Эти результаты могут служить, в определенной
степени, экспериментальным обоснованием более длительного применения липина в условиях острой
интоксикации ЭС.
Таблица 2 – Влияние исследуемых лекарственных средств на длительность гексеналового сна (в
минутах) в белых крыс при острой динамической ингаляционной интоксикации летучими компонентами ЭС
ЭД-20 (М±m, n=8-10)
Группа
животных
Интактные
Контроль
Р1
ЭС ЭД-20 +
+ кверцетин
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ флавинат
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ липин
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ ацетилцистеин
Р1
Р2
Клофибрат
Р1
Омепразол
Р1
ЭС ЭД-20 +
+ клофибрат
Р1
Р2
ЭС ЭД-20 +
+ омепразол
Р1
Р2
Сроки исследования (в часах после
воздействия повреждающих факторов)
6
12
72
120
28,57±1,54
26,14±2,30
23,62±1,83
26,90±2,11
36,19±1,87
34,00±1,89
92,78±6,29
75,25±3,90
<0,01
<0,05
<0,001
<0,001
31,87±1,71
>0,1
>0,1
29,25±2,39
>0,25
>0,1
60,50±1,92
<0,001
<0,001
60,14±3,63
<0,001
<0,001
25,75±1,75
>0,1
<0,02
26,75±1,35
>0,5
<0,01
50,25±2,53
<0,001
<0,001
50,87±2,10
<0,001
<0,001
27,50±1,38
>0,5
<0,01
24,75±2,00
>0,5
<0,01
79,37±5,32
<0,001
>0,1
70,14±6,08
<0,001
>0,25
28,87±2,13
>0,5
<0,05
17,43±1,81
<0,001
41,17±1,75
<0,001
27,37±2,37
>0,5
<0,05
12,37±1,51
<0,001
35,22±1,99
<0,02
51,25±3,28
<0,001
<0,001
14,67±1,22
<0,002
33,00±1,69
<0,01
54,37±2,68
<0,001
<0,001
21,94±2,29
>0,1
30,37±1,71
>0,1
26,00±1,93
>0,25
<0,01
22,57±1,49
>0,1
<0,001
64,62±1,99
<0,001
<0,002
67,00±4,37
<0,001
>0,1
37,50±2,88
<0,02
>0,5
36,14±2,91
<0,05
>0,5
44,14±2,06
<0,001
<0,001
48,43±2,43
<0,001
<0,001
Применение по лечебно-профилактической схеме ацетилцистеина практически полностью сдерживало
возникновение нарушений продолжительности гексеналового сна у отравленных животных в первые 12 ч
после интоксикации (р1>0,5). Характерно, что в отличие от липина действие этого SH-содержащего
препарата было более продолжительным во времени. Длительность гексеналового сна под влиянием
ацетилцистеина уменьшалась по сравнению с контролем через 72 часа на 45%, а через 120 часов – на 28% и
была сопоставимой с аналогичным эффектом в эти же сроки у флавината (табл. 2). Эти факты указывают на
целесообразность комбинированного использования липина с ацетилцистеином либо флавинатом, что
может значительно усилить и продлить их влияние на монооксигеназную систему организма при
отравлении летучими компонентами ЭС.
Следовательно, анализируя результаты влияния применяемых лекарственных средств на состояние
монооксигеназной системы печени в условиях острого отравления ЭС с помощью гексеналовой пробы,
можно заключить, что флавинат, липин, ацетилцистеин, в несколько меньшей степени кверцетин в первые
12 часов после отравления сдерживают развитие нарушений в НАДФН-зависимой гидроксилазной системе
печени. Через 72 и 120 часов после интоксикации эффективность фармакотерапии в условиях заметного
увеличения продолжительности гексеналового сна была недостаточной, особенно при использовании в
качестве антидотно-лечебного средства липина.
Ранее нами доказана высокая эффективность при остром смертельном отравлении ЭХГ индукторов
микросомальной и цитозольной ЭГ клофибрата и омепразола [2, 4]. Учитывая это, представляло интерес
изучить влияние указанных препаратов на активность НАДФН-зависимой монооксигеназной
гидроксилирующей ферментной системы печени у здоровых крыс и при остром воздействии на организм
животных летучих компонентов ЭС.
Как показывают результаты, представленные в таблице 1, введение интактным животным клофибрата и
омепразола в дозах, вызывающих индукцию ЭГ, оказывало противоположное влияние на степень экскреции
метаболитов амидопирина с мочой. Так, если под влиянием клофибрата через 6 и 24 часа после посадки
животных в обменные клетки экскреция 4-ААП увеличивалась на 33 и 27%, N-ац-4-ААП – на 18 и 21%, то
под влиянием омепразола эти показатели напротив уменьшались соответственно на 53%, 48% и 59%, 43%.
Аналогичная картина наблюдалась при исследовании влияния изучаемых препаратов на продолжительность
гексеналового сна у интактных крыс (табл. 2). Применение клофибрата достоверно снижало время
гексеналового сна у здоровых животных через 6 часов после последнего введения препаратов на 39%, 12
часов – на 53%, 72 часа – на 38%. Изменение этого показателя на 18% (р1>0,1) через 120 часов следует
расценивать как тенденцию к уменьшению. Действие омепразола характеризовалось увеличением
продолжительности сна на 44% (р1<0,001), 35% (р1<0,02), 40% (р1<0,01) и 13% (р1>0,1) соответственно через
6, 12, 72 и 120 часов.
Фармакотерапевтическая активность клофибрата при острой интоксикации летучими компонентами ЭС
характеризовалась достоверным увеличением экскреции 4-ААП с мочой в 2,1-2,5 раза, а N-ац-4-ААП – в
1,3-2,2 раза. Тем не менее несмотря на столь выраженное действие, параметры изучаемых показателей I и II
фаз биотрансформации, за исключением 4-ААП на 6 часовой отметке, оставались достоверно ниже таковых,
регистрируемых у интактных животных. Омепразол, примененный в дозах, вызывающих индукцию ЭГ,
практически не оказывал влияния на экскрецию с мочой метаболитов амидопирина при остром отравлении
ЭС (p2>0,1-0,5) (табл. 1).
Изучение гексеналового сна в условиях изучаемой патологии под влиянием клофибрата
характеризовалось уменьшением его продолжительности в среднем на 11-34%. Использование же
омепразола не влияло на длительность гексеналового сна через 6 и 24 часа от момента завершения
ингаляционной затравки животных, но уменьшало величину этого показателя через 72 и 120 часов на 52 и
36% соответственно, что значительно больше, чем при действии клофибрата (табл. 2).
Таким образом, судя по уровню экскреции с мочой метаболитов амидопирина и продолжительности
гексеналового сна, можно сделать заключение, что клофибрат обладает способностью индуцировать, а
омепразол – угнетать активность микросомальных оксигеназ со смешанными функциями в печени
животных. Индуцирующее действие клофибрата при токсическом поражении печени летучими
компонентами ЭС ЭД-20 проявляется усилением реакций I и II фаз биотрансформации и уменьшением
времени гексеналового сна. Действие омепразола в условиях патологии не влияет на уровень экскреции с
мочой метаболитов амидопирина, но значительно сокращает продолжительность гексеналового сна в
поздние сроки после интоксикации, что, по-видимому, свидетельствует о восстановлении функции ранее
ингибированных и структурно сохраненных, не поврежденных эпоксидами микросомальных ферментов.
Изучение при острой интоксикации ЭС эффективности клофибрата и омепразола, проведенное нами
ранее, показало, что омепразол проявляет хорошо выраженные детоксицирующий и гепатопротекторный
эффекты, а действие клофибрата проявляется слабо и статистически не достоверно [19]. Возможно, это
связано со способностью клофибрата, помимо индукции ЭГ, достаточно сильно индуцировать и цитохром
Р-450 [28]. Так, известно, что при осуществлении реакций I фазы биотрансформации на этом гемопротеиде
происходит генерация супероксидного аниона О2– [7], синтезируются из линолевой кислоты лейкотоксин и
изолейкотоксин [21, 23], происходит образование эпоксидов из липотропных эндо– и экзогенных
соединений, содержащих в своей структуре двойные связи [7, 10, 30, 31], которые весьма токсичны для
клетки. Лейкотоксин и эпоксиды, например, способны активировать митохондриальную проходимость, что
заканчивается выходом цитохрома С и последующей смертью клетки [21, 23]. Кроме того, имеются
сведения о наличии связи между усилением функционирования микросомальных монооксигеназ и
стимулированием перекисного окисления липидов. Например, индукция с помощью повторных введений
фенобарбитала ферментов микросомального окисления, в том числе цитохрома Р-450, приводит к 2-5кратному увеличению продукции малонового диальдегида [7, 12] и резкому повышению токсичности ЭХГ
[2]. В то же время, в отличие от фенобарбитала, клофибрат наряду с индукцией цитохрома Р-450 [28]
обладает хорошо выраженными антирадикальными и антиокислительными свойствами [6], повышает в
печени активность глутатионпероксидазы, Г-S-Т, ЭГ, увеличивает содержание во фракции цитозоля не
связанных с белками SH-групп [4, 24, 29], что вместе,
несмотря на слабое гепатопротекторное действие,
возможно, и определяет его интегральный ответ, который заключается в увеличении выживаемости
животных при остром смертельном отравлении ЭХГ [2]. К этому можно добавить и то, что цитозольная ЭГ
печени индуцируется клофибратом 5 раз и практически не индуцируется фенобарбиталом [22].
Хорошо выраженные детоксицирующие и гепатопротекторные эффекты у производного бензимидазола
омепразола [2, 19] связаны, на наш взгляд, с одновременной индукцией этим препаратом ЭГ [4] и
снижением активности монооксигеназной системы печени, включая ингибирование ее конечного акцептора
– цитохрома Р-450 [26, 35]. Подтверждением этого предположения служат результаты western
иммуноблоттинг-анализа, которые показали, что аллилтиобензимидазол наряду с индукцией
микросомальной ЭГ и Г-S-Т не только не изменял уровень цитохромов Р-450 1А2, Р-450 2В1/2 и Р-450 2Е1,
но приводил к заметному уменьшению содержания цитохрома Р-450 2С11. Такое действие
аллилтиобензимидазола сопровождалось частичным гепатозащитным и противонекрозным действием при
ацетаминофен-индуцированном поражении печени [27, 33]. С другой стороны, предварительное, до
отравления гепатотоксичными ксенобиотиками, введение индукторов цитохромов Р-450 и Р-448 может
резко потенцировать некрозогенное действие гепатотоксинов за счет повышения образования
свободнорадикальных высокореакционных метаболитов [8], что, возможно, имеет место при использовании
клофибрата, но частично нивелируется за счет его антиоксидантных свойств [6].
ВЫВОДЫ РАБОТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Обобщая материалы настоящих исследований, можно заключить, что при остром токсическом
поражении печени летучими компонентами ЭС происходит угнетение реакций I и II фаз биотрансформации
липотропных соединений.
Флавинат, липин, ацетилцистеин, в несколько меньшей степени кверцетин, применяемые по лечебнопрофилактической схеме, в первые 12 часов после отравления сдерживают развитие нарушений в НАДФНзависимой гидроксилазной системе печени. В более поздние сроки, в условиях увеличившейся
продолжительности гексеналового сна, эффективность этих препаратов, особенно липина, снижается.
Действие липина и флавината больше проявляется в уменьшении отрицательного влияния ЭС на реакции I
фазы метаболизма чужеродных соединений, а ацетилцистеина и кверцетина – II фазы. Влияние
никотинамида на НАДФН-зависимую монооксигеназную гидроксилирующую ферментную систему печени
в условиях развивающейся патологии выражено слабо.
Индуктор ЭГ омепразол снижает активность печеночных оксидаз со смешанной функцией, тогда как
клофибрат индуцирует их активность. Применение клофибрата до острой интоксикации ЭС частично
предупреждало возникающие нарушения в функционировании монооксигеназной системы печени.
Предварительное воздействие омепразолом не оказывало влияния на экскрецию метаболитов амидопирина с
мочой, но значительно уменьшало длительность гексеналового сна в поздние сроки после отравления ЭС.
Полученные нами результаты по исследованию лекарственных препаратов, модифицирующих
метаболизм ксенобиотиков при остром отравлении ЭС, открывают перспективы для поиска новых средств
профилактики и лечения отравлений, в том числе комбинированной фармакотерапии. В этом плане
заслуживают внимания исследования по комбинированному применению ацетилцистеина с липином или
флавинатом при токсическом поражении печени ЭС.
SAMMARY
In the experiments on the white rat-males line Wistar - showed, that in acute toxic liver disease by the flying compounds of the epoxyde
resine ED-20 (ER) occurs oppression of reactions for the first and second phases of biotransformation of lipotropic substances.
Flavinate, lipine, acetylcysteine and quercetine in a bit slighter degree, used according to the treat-preventing scheme in first 12 hours after
poisoning restrain evolving the breach in NADPH-depend hydroxilase system of liver. In later terms, in the conditions of increasing the hecsenal
sliep - the efficacy of these medicines, expecially lipine is decreasing. Action of lipine and flavinate more expressive in decreasing of negative ER
influence on the reactions of the first phase metabolism of foreign substances and acetylcysteine and quercetine - of the second phase. Influence
of nicotinamide on the NADPH-depend monooxihenase hydroxilative enzyme system of liver in the conditions of developed pathology slightly
shown.
The inductor of epoxihydrolase - omeprasol - decrease the activity of liver oxidases with mixes function, while clofibrate inducts this activity.
Using clofibrate before the acute intoxication by ER partialy prevented appearing breaches in the liver monooxihenase system functioning. The
preliminary action of omeprasole hadn’t an influence on the excretion of amidopirine metabolits with urine, but essentially decrease the
protraction of hecsenal sliep in the later terms after the ER poisoning.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Арчаков А.И. Микросомальное окисление. – М.: Наука, 1975. – 328 с.
Высоцкий И.Ю. Изыскание антидотно-лечебных средств при острой интоксикации эпоксидными соединениями // Вісник СумДУ. 1999. - №1(12). - С. 115-124.
3. Высоцкий И.Ю. Патоморфологические критерии эффективности ацетилцистеина и липина при токсическом поражении печени
летучими компонентами эпоксидной смолы ЭД-20 // Вісник СумДУ. - 1999. - №2 (13). - С. 142-149.
4. Высоцкий И.Ю. Фармакологическая регуляция активности ферментов, принимающих участие в метаболизме эпоксидных
соединений // Вісник СумДУ. -2002. - №8(41). - С. 39-48.
5. Высоцкий И.Ю. Эпоксидные смолы: токсикодинамика, фармакотерапия интоксикаций // Вісник СумДУ. - 2002. - №11(44). - С. 1124.
6. Высоцкий И.Ю., Качанова А.А., Высоцкий В.И. Перекисное окисление липидов при острой интоксикации летучими компонентами
эпоксидных смол и его фармакологическая коррекция // Вісник СумДУ. - 2003. - №7(53). - С. 32-40.
7. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. – Л.: Медицина, 1986. – 280 с.
8. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. – К.: Здоров`я, 1989. – 168 с.
9. К методике определения среднесмертельных доз и концентраций химических веществ
/ Б.М. Штабский, М.И. Гжегоцкий, М.Р.
Гжегоцкий и др. // Гиг. и сан. - 1980. - №10. - С. 49-51.
10. Ковалева И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. – М.: Наука,
1985. – 304с.
11. Леоненко О.Б., Попов Т.А. Оценка НАДФН-зависимой монооксигеназной гидроксилирующей ферментной системы печени у
лабораторных животных на уровне целостного организма: Метод. рекомендации МЗ СССР ВНИИГИНТОКС. – К., 1981. – 9с.
1.
2.
12. Лукьянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислородозависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. – М.:
Наука, 1982. – 236с.
13. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков. – Новосибирск: Наука, 1981. – 172 с.
14. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами. – М.: Наука, 1982. – 221 с.
15. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. – М.: Медицина, 1973. – 288 с.
16. Розанова В.Д. Различия скорости детоксикации гексенала и индукции ее фенобарбиталом у крыс-самок в зависимости от стадии
полового цикла // Фармакол. и токсикол. – 1979. – №1. – С. 29-33.
17. Состояние монооксигеназной и антиоксидантной систем при воздействии экстремальных факторов / В.Д. Лукьянчук, И.Ю.
Высоцкий, Л.В. Савченкова и др. // Экология промышленного региона Донбасса: Сб. науч. тр. Луганского мед. ин-та. – Луганск,
1993. – С. 98-102.
18. Тиунов Л.А. Основные механизмы метаболизма ксенобиотиков в организме человека и животных // Итоги науки и техники. Серия
Токсикология. – М.: ВИНИТИ, 1981. –
Т. 12. – С. 5-64.
19. Фармакологічна корекція при токсичному ураженні печінки леткими компонентами епоксидної смоли ЕД-20 / І.Ю. Висоцький, І.О.
Комаревцева, А.А. Качанова,
В.І. Висоцький та ін. // Вісник СумДУ. - 2003. - №7(53). - С. 17-25.
20. Яворовский А.П. Гигиена труда при получении и переработке эпоксидных смол и пластических масс: Дис ... д-ра мед. наук:
14.00.07. - К., 1990. - 494 с.
21. Cellular characterization of leukotoxin diol-induced mitochondrial dysfunction
/ M.F. Sisemore, J. Zheng, J.C. Yang et al. // Arch.
Biochem. Biophys. - 2001. - V. 392, №1. - Р. 32-37.
22. Distribution and inducibility of cytosolic epoxide hydrolase in male Sprague-Dawley rats / L. Schladt, W. Wörner, F. Setiabudi, F. Oesch
// Biochem. Pharmacol. - 1986. - V. 35, №19. – Р. 3309-3316.
23. Draper A.J., Hammock B.D. Identification of CYP2C9 as a human liver microsomal linoleic acid epoxygenase //Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 376, №1. – Р. 199-205.
24. Effect of clofibrate on lipid peroxidation in rats treated with aspirin and 4-pentenoic acid / N. Mitsuo, I. Noriyuki, S. Teruhiko, K. Shoji // J.
Biochem. - 1987. - V. 101, №1. P. 81-88.
25. Fouts J. R. The stimulation and inhibition of hepatic drug-metabolizing enzymes with special reference to effects of environmental
contaminants // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1970. - V. 17, №7. - Р. 804-809.
26. Jensen J.C., Gugler R. Inhibition of human liver cytochrome P-450 by omeprazole // Brit. J. Clin. Pharmacol. - 1986. - V. 21, №3. – Р. 328330.
27. Kim S.G., Lee A.K., Kim N.D. Partial hepatoprotective effects of allylthiobenzimidazole in the absence of cytochrome P4502E1
suppression: effects on epoxide hydrolase, rGSTA2, rGSTA3/5, rGSTM1 and rGSTM2 expression // Xenobiotica. - 1998. - V. 28, №3. – Р.
323-336.
28. Lundgren B., DePierre J.W. Proliferation of peroxisimes and induction of cytosolic and microsomal epoxide hydrolases in different strains of
mice and rats after dietary treatment with clofibrate // Xenobiotica. - 1989. - V. 19, №8. - Р. 867-881.
29. Moody D.E., Loury D.N., Hammock B.D. Epoxide metabolism in the liver of mice treated with clofibrate (ethyl-(chlorophenoxyisobutyrate) a peroxisome proliferator. // Toxicol. and Appl. Pharmacol. - 1985. - V. 78, №3. – Р. 351-362.
30. Oesch F. Enzymic control of metabolically produced epoxides // Microsomes and Drug Oxidations: Proc. 6 th Int. Symp. - London;
Philadelphia, Pa, 1985. - P. 178-189.
31. Oesch F. Significance of various enzymes in the control of reactive metabolites // Arch. Toxicol. - 1987. - V. 60, №1. - Р. 174-178.
32. Omiecinski C.J., Hassett C., Hosagrahara V. Epoxide-hydrolase - polymorphism and role in toxicology // Toxicol. Lett. - 2000. - №112-113.
- P. 365-370.
33. Radioprotective effects of 2-(allylthio)pyrazine an experimental chemopreventive agent: effects on detoxifying enzyme induction / S.G. Kim,
S.Y. Nam, C.W. Kim et al. // Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. - 1998. - V. 101, №3. – Р. 275-288.
34. Soleo L., Strzelczyk R. Xenobiotics and glutathione // G. Ital. Med. Lav. Ergon. - 1999. - V. 21, №4. - Р. 302-308.
35. Zomorodi K., Houston J.B. Selectivity of omeprazole inhibition towards rat liver cytochromes P-450 // Xenobiotica. - 1997. - V. 27, №1. –
Р. 49-58.
Поступила в редакцию 31 октября 2003 г.